CH672796A5

CH672796A5 -

Info

Publication number: CH672796A5
Application number: CH6700/83A
Authority: CH
Inventors: Joanne Martinis; Richard M Bartholomew; Gary S David; Thomas H Adams; James M Frincke
Original assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1982-04-12
Filing date: 1983-04-12
Publication date: 1989-12-29
Also published as: GB2169921B; GB8530309D0; GB2128631A; ES521370A0; ES537257A0; ES8604424A1; JPH0753600A; ES533930A0; ES8504461A1; GB2128631B; JPH0753119B2; FI834529A; ES8603080A1; GB8530310D0; ATA901883A; GB2167086B; GB2168998A; ES8606655A1; CA1213229A; ES8506091A1

Description

BESCHREIBUNG Diese Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines Polydomes und von hybriden monoklonalen Antikörpern, welche duale Spezifitäten haben. Sie bezieht sich ebenfalls auf die erhaltenen Hybridome und die hybriden monoklonalen Antikörper.

Die Antigen-Antikörper-Reaktion wurde routinemässig schon in einer Vielzahl von praktischen Anwendungen ausgewertet und wird in breiter Weise erforscht, um ihren Wert in anderen, wie in jetzt noch unerprobten Verwendungszwecken, einzuführen. Z.B. können Serumantikörper, welche durch die Immunreaktion eines Wuts-liers auf ein Immunogen erhalten werden, in Affinitätsrei-nigungsverfahren zur Isolierung des Immunogens aus Lösungen, in welchen es nur in minimalen Mengen vorhanden ist, verwendet werden.

Unter anderen Umständen, wenn das Imm unogen ein mit einer Krankheit verbundenes Antigen ist, kann seine Gegenwart im Patientenserum oder in einer anderen Körperflüssigkeit unter Verwendung des Immunoassay oder immunometrischen Techniken nachgewiesen werden. Z.B. ist der Nachweis von HBsAg unter Verwendung der radioimmunometrischen Technik eines der geläufigsten der gewählten Verfahren. In einem anderen Zusammenhang werden die Antikörper zu Ferridin, die aus weissen Neuseeland-Kaninchen erhalten wurden und mit 131I markiert wurden, als vielversprechend für die Behandlung von Lebertumoren geschildert. (Siehe Order et al, International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics, 6, 703 [1980].)

Serum-Antikörper, z.B. diejenigen, die von Kaninchen, murinen Spezies oder anderen Säugetieren, sind in der Natur «poly-klonal», da das Immunsystem des Wirts stimuliert wird, um eine Mischung von spezifischen Antikörpern, gerichtet auf verschiedene antigenische Determinanten oder Epitope am Immunogen, auf welches der Wirt reagiert, gerichtet sind, herzustellen. Die einzelnen Antikörper, welche die Mischung bilden, sind alle das Produkt eines B-Zellen-Klones; darüberhinaus sekretiertjede B-Zelle nur ein Antikörper-Spezies. Der Antikörper, welcher durch ein Klon erzeugt wurde, unterscheidet sich von einem Antikörper gegen das gleiche Antigen, welches durch ein anderes Klon erzeugt wurde dadurch, dass es mindestens einen kleinen Unterschied zwischen seiner Peptidsequenz und derjenigen des anderen Antikörpers hat. Somit ist tatsächlich jedes Antikörper-Spezies ein unterschiedliches Molekül und die Unterschiede in der Peptidsequenz zwischen verschiedenen Spezies verursachen ihre allgemeinen Spezifitäten wie auch die einzelnen Epitope sie erkennen und ihre Affinitäten für das Antigen.

Eine einzelne B-Zelle kann nicht unbestimmt unter Verwendung der bis anhin erhältlichen Zellkulturtechniken gezüchtet werden, um Antikörper-Spezies, die als reine Verbindung ausgeschieden werden, zu erhalten. Kürzlich entdeckten und beschrieben Köhler und Milstein jedoch ein Verfahren, durch welches ein monoklonaler Antikörper günstig als Sekretionsprodukt einer Hybridzelle, welche als «Hybridom» bezeichnet wurde, erhalten werden kann. (G.Kohler und C.Milstein, Nature, 256,495 [1975].) Im Grunde umfasst das Verfahren die Fusion von Milzzellen, die einer immunisierten Maus entnommen wurden, mit Mäuse-Myelomzellen, um das Hybridom zu bilden.

Myelom-Zellen, welche kein eigenes Immunoglobulin oder Teile davon erzeugen oder ausscheiden, sind bevorzugt. Zellkulturen, die durch Klonen eines einzelnen Hybridoms erhalten wurden, scheiden identische Antikörper-Moleküle aus, welche anschliessend leicht als reine chemische Verbindungen erhalten werden können. Diese Technik steht im Gegensatz zu den üblichen Antikörperherstellungen, beispielsweise aus Serum, wo jeder Antikörper nur ein einzelner aus den Komponenten einer im wesentlichen unauftrennbaren Antikörper-Mischung von verwandten, jedoch chemisch unterscheidbaren Verbindungen ist.

Da er eine reine Verbindung ist, hat der monoklonale Antikörper eine konstante Spezifität für ein bestimmtes Zentrum am Antigenmolekül und eine gut definierte Affinität. Somit können Klone von verschiedenen Hybridomen einem «Screening» unterworfen werden, um dasjenige auszuwählen, welches den monoklonalen Antikörper mit den am meisten erwünschten Eigenschaften für eine gegebene Anwendung erzeugt. Die Unsterblichkeit der Hybridome garantiert eine nahezu unbegrenzte Versorgung mit den ausgeschiedenen Antikörpern, und vermindert Probleme im Zusammenhang mit dem Wechsel des Antikörper-Types und der Gesamtaffinität von Tier zu Tier, welche zur Herstellung von Serum-Antikörpern verwendet werden. Monoklonale Antikörper, die von Hybridomen erhalten werden, sind für die praktische Anwendung in Diagnostik-Kits. Eine Auswahl solcher Kits ist bei Hybritech, Inc. erhältlich.

Normalerweise weist ein Antikörpermolekül eine einzige Spezifität auf, welche gegen das Immunogen, gegen welches das

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Immunsystem des Wirts durch Bildung des Antikörpers reagiert hat, gerichtet ist. Der Antikörper ist aus zwei identischen Hälften zusammengesetzt, jede davon umfasst ein schweres und leichtes Kettenpaar, und jedes von ihnen erkennt die gleiche antigenische Determinante des anderen. Nachstehend ist die Anordnung der schweren (H) und leichten Kette (L) in einem Antikörpermolekül dargestellt.

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Eine -S-S-Disulfidbrücke, welche die zwei Schwere-Ketten zusammen an der Stelle der Çystein-Reste verbindet, kann üblicherweise selektiv in vitro durch eine milde Reduktion gespalten werden, und die halben Moleküle werden durch eine anschliessende Ansäuerung dissoziert. Die halben Moleküle können dann rekombiniert (renatuiert) werden, wieder in vitro, bei neutralen pH, die Wiedervereinigung findet statt durch eine nicht-kovalente Wechselwirkung.

Wenn Antikörper von verschiedenen Spezifitäten einer selektiven Spaltung der Disulfidbrücken zwischen den schweren Ketten unterworfen werden und Bedingungen für die anschliessende Renaturierung geschaffen werden, kann die Wiedervereinigung zwischen den halben Molekülen zufallig so stattfinden, dass eine Population von Antikörpern erzeugt wird, wovon mindestens einige Hybride sind, in welchen eine Hälfte des Antikörpermoleküls der einen Spezifität kombiniert ist mit einer Hälfte eines Antikörper-Moleküls von verschiedener Spezifität. Z.B. ist in Nisonoff et al, «The Antibody Molecule», Academic Press, New York (1975), auf den S. 260-261 eine in vitro Herstellung eines polyklonalen Antiköiperhybrides eines Kaninchen-Antiovalbu-min und Anti-BGG-Antikörpers beschrieben. Hybride monoklonale Antikörper sind ebenfalls erhalten worden unter Verwendung eines analogen Verfahrens. Siehe D. M. Kranz et al, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 5807 (1981). Mindestens theoretisch wird der hybride Antikörper eine duale Spezifität in der einen Hälfte des Antikörpers aufweisen, welche die eine antigenische Determinante oder Epitop erkennen und binden wird, während die andere Hälfte ein verschiedenes Epitop am gleichen oder an einem verschiedenen Antigen erkennen wird.

Obschon die hybriden Antikörper in der Weise wie oben beschrieben erhalten werden können, sind die Ausbeuten oft sehr tief, die verwendeten Reaktionen machen es schwierig, sie zu reproduzieren und die hybriden Antikörper erleiden üblicherweise eine signifikante irreversible Denaturierung. Eine solche Denaturierung kann die Immunoreaktivität reduzieren und es wäre zu erwarten, dass verschiedene metabolistischen Charakteristika in vivo erhalten werden. Als Resultat bleibt der hybride Antikörper heute zum grössten Teil eine Laboratoriumskuriosität, welche schwierig zu erhalten ist.

Antikörper mit dualer Spezifität können ebenfalls hergestellt werden durch Konjugierung von Paaren von intakten Antikörpern, monoklonale oder andere, unter Verwendung verschiedener Kupplungs- oder Vernetzungsmittel, wie Protein A (von Staphylo-coccus aureus), Carbodiimid und bifunktionelle Verbindungen, wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat, um Dimere oder höhere Antiköiper-Multimere zu erhalten, von welchen jedes Mitglied des Antikörper-Paares seine Spezifität beisteuert. Z.B. haben Mandoche et al die Bildung von multivalenten Antikörpern beschrieben, welche duale Spezifitäten haben, durch eine aufeinanderfolgende Reaktion von Antikörpern mit Protein A, von welchem gezeigt worden ist, dass es fähig ist, in vitro Zell-oberflächen-Antigene zu ermitteln. Siehe J. Immunological Methods, 42, 355, (1981). Gemäss ihrer Methode, können Anti-5 körper mit einer Spezifität an das Oberflächen-Antigen gebunden werden und die anderen an einen Rest, welcher den Nachweis erlaubt.

Die Synthese von Antikörpern mit dualer Spezifität durch die vorhergehenden Techniken ist kompliziert und deshalb wurde io keine kommerzielle Anwendung von ihnen gemacht. Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind folgende:

a) Verfahren zur Herstellung eines Polydoms gemäss Anspruch 1,10 und 27

b) Verfahren zur Herstellung von hybriden Antikörpern mit 15 anderer Spezifität gemäss Anspruch 28.

Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem ein neues vollständig biologisches Verfahren fur die zuverlässige Herstellung hybrider monoklonaler Antikörper in guten Ausbeuten, ohne Denaturierung zur Verfugung. In dieser Beschreibung wird der 20 «hybrider Antikörper» verwendet, um ein einziges Antikörper-Molekül zu bezeichnen, welches zwei verschiedene Spezifitäten hat. Die individuellen Spezifitäten können auf die antigenischen Determinanten an zwei verschiedenen Antigenen oder auf verschiedene antigenische Determinanten (Epitope) am gleichen 25 Antigen gerichtet sein. Darüber hinaus umfasst der Ausdruck «Antigen», falls nichts anderes angegeben ist, ebenfalls Haptene.

Erfindüngsgemäss werden hybride Antikörper mit einer dualen Spezifität erhalten durch Fusion eines Hybridoma, vorzugsweise einem selektiv zerstörbaren Hybridom, welches einen Anti-301 korper gegen eine vorgewählte antigenische Determinate ausscheidet mit einem fusionierbaren B-Lymphocyten oder einem zweiten Hybridom, der B-Lymphocyt oder das zweite Hybridom scheidet einen zweiten Antikörper gegen eine verschiedene antigenische Determinante aus, wobei eine zweite Generation Hybri-35 dorn (nachfolgend «Polydom») gebildet wird. Hier verwendet bedeutet der Ausdruck «selektiv zerstörbares Hybridom» ein Hybridom, welchem die Fähigkeit des Überlebens im Medium, in welchem das Polydom kultiviert wird, fehlt oder mindestens vorwiegend fehlt. Es wurde unerwarteterWeise gefunden, dass das 4o Polydom im Gegensatz zum Mutterhybridom oder zum B-Lym-phocytus, von welchem es abgeleitet wurde, eine Population von identischen Antikörpern mit einer einzigen Spezifität ausscheidet, wobei das Polydom zusätzlich einen hohen Prozentsatz eines monoklonalen hybriden Antikörpers mit einer dualen Spezifität 45 ausscheidet. Dual bedeutet die Fähigkeit, dass der Antikörper die antigenischen Determinanten, welche durch die individuellen Antikörper, die durch die Mutterzellen erzeugt wurden, erkennen kann und in der Lage ist, sich mit beiden Determinanten gleichzeitig zu verbinden. Die hybriden, monoklonalen Antikörper, die 5o auf diese Weise erhalten wurden, sind nicht der unerwünschten Denaturierung unterworfen, welche die Hybride, die durch die Verfahren der chemischen Rekombination von Antikörper-Halbmolekülen erhalten wurden charakterisiert Darüber hinaus - erlaubt das erfindungsgemässe Verfahren, dass das Hybrid zuver-55 lässig und in grossen Mengen erhalten wird.

Die erfindüngsgemäss erhaltenen Antikörper sind nützlich für Immunodiagnose- und Immunotherapieverfahren. Im allgemeinen verwenden diese Verfahren einen monoklonalen Antikörper oder polyklonalen Antikörper mit einer ersten Spezifität gegen ein 6o Zielantigen und einer zweiten Spezifität gegen eine Substanz, z.B. ein anderes Antigen oder Hapten oder welches eine Diagnose auf Grund des Zielantigens erlaubt oder welches die Freigabe desselben erlaubt, oder selbst ein Mittel ist, welches letal für das Zielantigen oder das Gewebe, welches mit ihm verbunden ist, wirkt. 65 Durch eine geeignete Auswahl der Mutterzellen kann somit gemäss der vorliegenden Erfindung ein Polydom erhalten werden, welches einen Antikörper ausscheidet, der eine Spezifität für ein Zielantigen und eine zweite Spezifität für einen in der Diagnostik

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oder Therapie nützlichen Rest hat. Alternativ können Antikörper-Halbmoleküle unter Verwendung von in vitro-chemischen Mitteln rekombiniert werden oder einzelne unversehrte monospezifische Antikörper durch chemische Mittel gekuppelt oder vernetzt werden, um Antikörper-Multimere (welche dimer, trimer oder höher Multimer sein können) mit einer dualen Spezifität zu erhalten und welche die gleiche oder ähnliche Nützlichkeit wie hybride monoklonale Antikörper mit der gleichen dualen Spezifität haben, die gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellt sind.

In der vorliegenden Beschreibung umfassen die Antikörper auch Antikörperfragmente, die immunochemische Eigenschaften haben, wie Fab- oder F(ab)2-Fragmente.

Die Art und Weise, in welcher diese und andere Gegenstände zugänglich sind, wird aus der Betrachtung in der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen ersichtlich.

Wie oben angegeben, benötigt das Verfahren zur Gewinnung eines hybriden monoklonalen Antikörpers gemäss der vorliegenden Erfindung als einen Ursprung ein Hybridom und vorzugsweise ein selektiv zerstörbares Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine vorgewählte antigenische Determinante oder Epitop, ausscheidet. Die Verwendung eines selektiv zerstörbaren Hybridoms als Ursprung, hat den Vorteil, dass es verhindert, dass die Zellen, die durch Fusion der selektiv zerstörbaren Hybridome mit B-Lymphocyten oder einem zweiten Hybridom erhalten werden, d.h. das Polydom durch eine Population des Mutterhybridoms überwachsen wird, wenn die Zellen, die durch den Fusionsprozess erhalten werden, kultiviert werden, und dass ein Mittel zur Verfügung steht durch welches die Polydom-zellen von den Mutterhybridomzellen isoliert werden können.

Selektiv zerstörbare Hybridome, die in der Erfindung nützlich sind, sind aus Hybridomen erhältlich, die einen Antikörper ausscheiden, der eine der gewünschten Spezifitäten aufweist und sind durch das klassische Kohler-Milstein-Verfahren, d.h. Hybridome, die durch Fusion einer Myelom-Zelle und eines B-Lymphocyten, wie diejenigen der Milzzellen von Mäusen erhältlich.

Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Hybridom einem Rückauswahlverfahren unterworfen, um die Hybridome zu erhalten, welche selektiv zerstörbar sind.

Allgemein ist die selektive Zerstörbarkeit erhältlich durch Rückauswahl eines Hybridoms, welchem eine genetische Komponente fehlt, welche für sein Überleben in einem gewählten Medium nötig ist und in welchem Medium das Polydom wegen dem genetischen Beitrag von Fusionspartner des selektiv zerstörbaren Hybridoms, d. h. dem B-Lymphoçyten oder zweiten Hybridom, durch Fusion gezüchtet werden kann.

Das gegenwärtig bevorzugte Rückauswahlverfahren umfasst die Kultivierung eines Hybridoms, welches einen Antikörper ausscheidet, der eine der gewünschten Spezifitäten, die dem Hybridantikörper einverleibt werden sollen, aufweist, in einem Wachstumsmedium, das 8-Azaguanin enthält. In solch einem Medium fehlt jeder Zelle, welche 8-Azaguanin aufnimmt, und somit wachsen kann, das Enzym Hypoxanthinguanin-phosphoribosyl-trans-ferase (HPRT). Klone von Zellen, welchen dieses Enzym fehlt, können nicht wachsen in einem Medium, welches Hypoxanthin-aminopterin-thymidin (HAT) enthält. Folglich können diese nun selektiv in diesem Medium zerstört werden.

Ein sehr ähnliches Rückauswahlverfahren umfasst das Züchten der Hybridome, welche den gewünschten Antikörper ausscheiden, in einem Medium, das 6-Thioguanin, ein weiteres analoges von Guanin, welches für die Zelle toxisch ist, falls es in die DNA einverleibt wird, enthält. Wiederum fehlt gewissen Zellen, welche in diesem Medium wachsen werden, das HPRT-Enzym, und Klone dieser Zellen werden notwendigerweise für das HAT-Medium empfindlich sein.

Ein weiteres Rückauswahlverfahren, das verwendet werden kann, umfasst die Züchtung von Zellen des ausgewählten Hybri-domzellstammes in einem Medium, das eines der Thyminanalo-gen 5-Bromuracyl-deoxyribose (BUdR) oder 2-Aminopurin enthält. Nur diesen Zellen, welchen das Enzym Thymidin-kinase (TK) fehlt, können in einem Medium, welches einen dieser beiden Inhibitoren enthält, wachsen. Wie im Falle der Zellen, welchen das Enzym HPRT fehlt, werden die Zellen, welchen TK fehlt,

nicht in einem HAT-Medium wachsen.

Ein anderes Verfahren für die Gewinnung eines selektiv zerstörbaren Mutterhybridoms umfasst die irreversible Enzym-Hemmung unter Verwendung von metabolischen Inhibitoren. Unter diesen ist der sogenannte K^-Inhibitor bevorzugt. Diese Inhibitoren sind Analoge der Enzym-Substrate, welche durch das Zielenzym in ein hochreaktives Molekül umgewandelt werden, welches mit dem Enzym in seinem aktiven Zentrum reagiert, wobei die irreversible Hemmung des Enzymes resultiert. Z.B. hemmt die Behandlung des selektiven Hybridoms mit einem Analogen von Glutamin, wie Azaserin oder 5-Diazo-5-oxa-L-norleucin (DON) das Enzym Formyl-glycinamid-ribonucleotid-amidotransferase irreversibel durch Bildung einer kovalenten Bindung mit einem Cysteinrest im aktiven Zentrum des Enzyms. Diese Hemmung wird letztlich den Tod der Zelle zur Folge haben. Das Hybridom kann jedoch durch eine Fusion mit der zweiten Mutterzelle des Polydoms, welche das nötige Enzym liefert, gerettet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das selektiv zerstörbare Hybridom mit einem komplementären B-Lymphocytus verschmolzen, lypischerweise aus Milzzellen von einem Wirt, welcher vorher mit einem Antigen immunisiert worden ist, welches ein an ein Trägerprotein gebundenes Hapten sein kann, um im Wirt eine Immunreaktion zu erzeugen, welche Antikörper produziert, die die zweite Spezifität aufweisen, die im hybriden Antikörper erwünscht ist. Der Wirt ist üblicherweise eine Maus, es können jedoch Kaninchenarten oder andere Tiere und auch Menschen verwendet werden, obschon eine Interspezies-Verschmelzung eine niedere Ordnung von Stabilität ergeben kann. Das Verfahren zur Immunisierung solch eines Wirts ist natürlich wohl bekannt und Einzelheiten brauchen hier nicht angegeben zu werden.

Die Fusion des selektiv zerstörbaren Hybridoms mit dem B-Lymphocyten zur Gewinnung des Polydoms kann durchgeführt werden, indem zwei Gruppen von Zellen kombiniert werden in einem Medium, welches als Mittel bekannt ist zur Förderung der Zellfusion, wie Polyethylenglykol oder Sendi virus, gemäss bekannten Methoden.

Nach der Fusion werden die Zellen in ein Medium, wie das HAT-Medium, zur Kultivierung übergeführt. Die B-Lymphocyten überleben nur eine kurze Zeitperiode und die Mutter-Hybridom-Zellen können nicht wachsen im Medium. Die Population der Polydome jedoch, die als Ergebnis der Fusion gebildet wurde, kann wegen der Komplementierung des Mutterhybridoms durch den B-Lymphocytus, z.B. durch genetisches Mitwirken der Fähigkeit, fehlende Enzyme, wie HPRT oder TK zu machen, oder des direkten Mitwirkens eines inhibierten Enzyms im Mutter-Hybridom, im Medium gezüchtet werden. Klone von einzelnen Polydo-men werden kultiviert und einem Screening unterworfen, um diejenigen auszuwählen, welche Antikörper ausscheiden, die die gewünschte duale Spezifität haben. Klone von Polydomen, deren Antikörper die gewünschte duale Spezifität aufweisen, werden einem weiteren Screening unterworfen, um diejenigen auszuwählen, deren Spezifität, d.h. diejenige, die von den B-Lymphocyten erhalten wurde, und deren Affinität am meisten gewünscht werden.

In einer weiteren Ausführungsform wird das Polydom durch Verschmelzen von selektiv zerstörbaren Hybridomen unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, mit einem zweiten Hybridom, welches ebenfalls selektiv zerstörbar ist, gewonnen. Das zweite Mutter-Hybridom wird in gleicher Weise wie das erste erhalten, d.h. durch das Verfahren der Rückauswahl, irreversible Enzym-Inhibierung oder anderen geeigneten Techniken. In einem solchen Fall muss das zweite Hybridom fähig sein, das erste zu

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komplementieren. Wenn beispielsweise dem ersten selektiv zerstörbaren Hybridom das Enzym HPRT fehlt, muss das zweite fähig sein, dem Polydom ein Gen beizutragen, welches das Polydom befähigt, HPRT zu erkennen. Wenn dem zweiten selektiv zerstörbaren Hybridom das Enzym TK fehlt, muss in ähnlicher Weise ein Gen fur TK dem Polydom beigesteuert werden. Eine ähnliche Komplementierung muss zwischen den zwei Hybridomen vorhanden sein, wenn die irreversible Hemmung eines Enzyms durchgeführt wird, um ihm eine selektive Zerstörbarkeit zu verleihen. Es ist ebenfalls möglich, als ein Mutterhybridom ein Hybridom zu verwenden, das einem Rückauswahlprozess unterworfen wurde, und als anderes ein Hybridom zu verwenden, welches dem Prozess der Enzyminhibierung unterworfen worden ist.

Die Verwendung von komplementären selektiv zerstörbaren Hybridomen als Urzellen für die Polydome hat den Vorteil, dass beide Urzellen ausgewählt werden können auf Basis der Spezifitäten und Affinitäten des monoklonalen Antikörpers, den sie erzeugen, und im Fall der Fusionen eines einzelnen Hybridomes mit B-Lymphocyten kann keine Vorfusionsauswahl unter den B-Lymphocyten vorgenommen werden, um diejenigen zu gewinnen, welche einen Antikörper der gewünschten Spezifität und Affinität erzeugen.

Die Fusion der zwei selektiv zerstörbaren Hybridome kann durchgeführt werden unter Verwendung von Polyethylenglykol oder unter Verwendung anderer Fusionsmittel, wieder gemäss bekannten Methoden. Nach der Fusion werden die Zellen in das Wachstumsmedium transferiert, worin die beiden Urzellen nicht wachsen können, aber jedoch worin die aus der Fusion resultierenden Polydome die Fähigkeit des Wachstums haben wegen den komplementären Beiträgen der Urzellen.

Bis hier haben wir die Auswahlverfahren diskutiert, zur Gewinnung von selektiv zerstörbaren Hybridomen für die Verwendung als beide der Hybridom-Partner in einer Hybridom-Hybridom-Fusion, um ein Polydom zu bilden. Die Notwendigkeit der selektiven Zerstörbarkeit für die Hybridomurzelle kann jedoch vermieden werden, indem der ersten Hybridomurzelle eine dominante und eine rezessive Markierung verliehen wird. Die gegenwärtig bevorzugte Methode ist die HAT-Ouabain-Auswahl. Die Droge Ouabain ist ein spezifischer Inhibitor, der Na+-K+-aktivierte ATPase der Plasmamembrane. Dieses Enzym ist verantwortlich für die Einführung von K+ in eine Zelle und für die Ausführung von Na+ aus der Zelle. Zellen von Hybridomen, welche vorher rückausgewählt wurden, um ihnen selektive Zerstörbarkeit zu verleihen, z.B. HAT-Empfindlichkeit, werden im Ouabain-Medium gezüchtet, um Ouabain-resistente Zellen auszuwählen. Klone dieser Zellen sind HAT-empfmdlich, jedoch Ouabain-resi-stent. Im Gegensatz dazu, sind die Hybridome, die für die Fusion damit ausgewählt wurden, Ouabain-empfindlich, können jedoch in HAT überleben und wachsen. Alternativ kann die Auswahl auf Ouabain-Resistenz zerst am Muttermyelomstamm oder an den davon abgeleiteten Hybridomen, gefolgt durch Rückauswahl oder andere Techniken, um selektive Zerstörbarkeit zu verleihen, durchgeführt werden.

Zellen, die durch Fusion von zwei Hybridomen in Polyethylenglykol oder anderen Fusionsmitteln erhalten wurden, werden in das HAT-Medium, welches Ouabain in einer für das zweite Mutterhybridom letalen Konzentration enthält, transferiert. Die selektiv zerstörbaren Hybridomurzellen können im HAT-Medium, welchem z.B. HPRT oder ein anderes Enzym fehlt,

nicht überleben, obgleich sie Ouabain-resistent sind. Die Poly-domzellen können jedoch im Medium wachsen, da sie die Enzyme und die Ouabain-Resistenz besitzen, welche für das Überleben nötig sind. Die vorhergehende Methode hat den Vorteil, dass es möglich ist, ein Polydom zu erhalten, durch direktes Verschmelzen eines selektiv zerstörbaren Mutterhybridoms, welches einen Antikörper mit einer der im Hybrid gewünschten Spezifitäten ausscheidet, mit einem zweiten, «off the shelf»-Hybri-dom, welches einen Antikörper, der die andere im Hybrid gewünschte Spezifität hat und keine Verwendung von Techniken für die Verleihung der selektiven Zerstörbarkeit am zweiten Mutter-Hybridom erfordert.

Noch eine andere Technik für die Gewinnung eines Polydoms, welches eine universelle Urzelle verwendet, d.h. eine, welche eine positive und eine negative Markierung aufweist, welche mit jedem «off the shelf»-Hybridom verschmolzen werden kann, umfasst die Verwendung von rekombinierendem DNA-Vektoren, welche verschiedene drogenresistente Markierungen aufweisen. Z.B. kann SV40, das ein Gen für Neomycin trägt, verwendet werden.

Eine gegenwärtig bevorzugte universelle Urzelle ist eine, welche HAT-empfindliches-Neomycin resistent ist. Die gewählte Urzelle ist rückausgewählt auf HAT-Empfindlichkeit und dann transfektiert mit einem SV40-Rektor, welcher ein Gen für Neomy-cin-Resistenz trägt. Dieses Verfahren kann ebenfalls umgekehrt werden, wobei die Transfektion zuerst durchgeführt wird. Das erhaltene Hybridom kann in Gegenwart von Neomycin, welches normalerweise für Säugetierzellen toxisch ist, wachsen, stirbt jedoch in Gegenwart von HAT. Off-the-Shelf-Hybridome jedoch wachsen in HAT, sterben jedoch in Gegenwart von Neomycin. Die Produkte der Fusion der Urzellen überleben folglich in Gegenwart von HAT und Neomycin. Während die Verwendung von Vektoren zur Übertragung der Neomycin-Resistenz gegenwärtig bevorzugt wird, können Vektoren, welche Gene tragen, die resistent gegen andere Drogen an Säugetierzellen verleihen, ebenfalls verwendet werden.

Wenn es sogar gegenwärtig bevorzugt wird, ist es nicht essentiell für das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von Polydomen aus Paaren von Hybridomen, dass mindestens einer der Urzellen-Stämme selektiv zerstörbar ist. Es fallt unter den Bereich der Erfindung, ein Paar von Hybridomen zu verschmelzen, von welchen keines selektiv zerstörbar ist, welche aber Antikörper ausscheiden, die eine der gewünschten Spezifitäten des Hybrides aufweisen, in Gegenwart eines geeigneten Fusionsmittels, gefolgt durch Unterklonen aller Zellen, bevor die Population der unverschmolzenen Mutter-Hybridome sich in einem solchen Ausmass vermehrt, dass das Screening der Subklone zur Identifizierung der Polydome nicht praktisch ist. Die Subklone werden anschliessend einem Screening unterworfen, um solche zu erhalten, welche Antikörper mit einer dualen Spezifität ausscheiden.

Dieses Verfahren passt am besten zu den erhaltenen Polydomen, wenn die Fusion-Frequenz der Urzellstämme hoch ist. In jedem Fall und insbesondere wenn die Zellfusionsfrequenz niedrig ist, können die Zellen, erhalten von der Fusion von Hybridomen, deren monoklonale Antikörper gegen verschiedene Antigene gerichtet sind, einem Screening unterworfen werden unter Verwendung eines Çytofluorographen, um die Polydome zu identifizieren. Um dies durchzuführen, werden Proben der zwei Antigene mit verschiedenen fluoreszierenden Resten versehen, deren Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen auftritt. Z.B. kann einer mit Fluoreszein und der andere mit Rhodamin markiert werden. Die Population der Zellen der Fusion, welche vorzugsweise über Nacht kultiviert worden sind oder während einer anderen passenden Periode um ihre Anzahl zu erhöhen, werden mit zwei markierten Antigenen inkubiert. Die Zellen werden dann einem Screening unterworfen unter Verwendung des Çytofluorographen. Diese Zelle, welche nur bei einer der beiden Wellenlängen fluoreszieren, sind diejenigen der Zell-Stämme von den Mutterhybridomen. Wenn jedoch Zellen bei beiden Wellenlängen fluoreszieren, sind Polydome, welche isoliert und untergeklont werden können.

In einer noch anderen Ausführungsform kann ein Polydom hergestellt werden direkt durch Entfernung des Nukleus eines ersten Hybridoms, welches einen monoklonalen Antikörper, welcher eine der im Hybrid gewünschte Spezifität aufweist, ausscheidet und Einfügung in das Citoplasma eines zweiten Hybridoms, welches einen monoklonalen Antikörper mit der zweiten

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gewünschten Spezifität ausscheidet. Selbstverständlich braucht keine der Mutterhybridome selektiv zerstörbar zu sein, um in diesem Verfahren verwendet zu werden. Nach der Einfügung des Kernmaterials wird die Zelle geklont, um eine Population des Polydomes zu erhalten.

Wir haben gefunden, dass ungleich der Mutterhybridome oder B-Lymphocyten, welche einen einzigen Antikörper ausscheiden, die Polydomzellen, erhalten gemäss unserer Erfindung, eine Mischung von Antikörpern, von denen mindestens eines ein Hybrid-Antikörper mit dualer Spezifität ist, ausscheiden. Ebenfalls produziert werden durch die Polydome verhältnismässig kleinere Anteile von Antikörpern der gleichen Spezifität wie diejenigen, die durch die Urzellen produziert werden, die zur Gewinnung des Polydomes verwendet werden. Das Verhältnis des Hybrides zum monospezifischen Antikörper beträgt etwa 2:1:1, welches das erwartete ist, wenn die Polydome gleiche Anteile aller möglichen (H)-Ketten produziert, wie sie durch die Urzellen, welche im Polydom selber in zufälliger Anordnung kombiniert sind.

Die Polydome können in vitro kultiviert oder in vivo genetisch kompatibeln Tieren oder in Nacktmäusen gezüchtet werden, um grosse Mengen des hybriden Antikörpers zu erhalten, welcher aus dem Kulturmedium oder der aszitischen Flüssigkeit des Tieres nach bekannten Verfahren gewonnen wird. Siehe z.B. die Protokolle in «Monoclonal Antibodies», herausgegeben durch Kennett et al, Plenum Press, New York (1980) auf den S. 363-418.

Die Mischung von Antikörpern, die durch das Polydom produziert wird, kann aufgetrennt werden, um das Hybrid zu erhalten. Z. B. erlaubt die aufeinanderfolgende Affinitätschromatographie gegen das erste und dann gegen das andere Antigen, für welches das Hybrid spezifisch ist, seine Trennung von den monospezifischen Antikörperverunreinigungen. Wir haben auch gefunden, dass einfache Ionenaustauschchromatographie und Elektro-phoresetechniken mindestens unter gewissen Umständen ebenfalls verwendet werden können. Nötigenfalls könnte der Ladungsunterschied für den Ionenaustausch eines der Merkmale des Antikörpers sein, welches bei der Auswahl der Urzellenstämme in Betracht gezogen wird.

Beispiel 1

Ein hybrider monoklonaler Antikörper mit einer dualen Spezifität für das Hepatitis B Oberflächenantigen (HBsAg) und für die Prostansäure-phosphatase (PAP) wurde gemäss vorliegender Erfindung in folgender Weise hergestellt:

Ein Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper gegen PAP ausscheidet, wurde in HAT-Medium während einer Woche gezüchtet und dann transferiert und gezüchtet in einem nicht selektiven Medium. Nach verschiedenen Zeitabschnitten des Wachstums unter nicht selektiven Bedingungen, wurden 2 ml Aliquote von Zellen in ein Medium gegeben, welches 10 ~4 M 8-Azaguanin enthielt, welches die Zellen vom Wachstum abhielt, indem 8-Azaguanin anstelle von Guanin in ihre DNA eingebaut wurde. Die Zellen, denen das HPRT-Enzym fehlte, überlebten und wuchsen in diesem Medium und diese Zellen überlebten notwendigerweise nicht in HAT.

Klone, welche im 8-Azaguanin-haltigen Medium wuchsen, wurden auf HAT-Empfindlichkeit und auf Anti-PAP-Produktion getestet. Ein Klon, welches noch Anti-PAP produzierte und eine HAT-Empfindlichkeit aufwies, mit einer Umkehr-Sequenz von weniger als 4 x 10~8, wurde untergeklont. Alle Subklone verhielten sich wie die Mutterklone.

Zellen eines der HAT-empfmdlichen Subklone wurden in Polyethylenglykol mit Milzzellen, die von Balb/c-Mäusen, die mit HBsAg hyperimmunisiert waren, verschmolzen, um Polydome zu erhalten, unter Verwendung der Fusionstechnik von Gerhard. Siehe «Monoclonal Antibodies», oben erwähnt, auf S. 370. Die Fusion erzeugte 220 Polydome, welche einem Screening unterworfen wurden, um diejenigen ausgeschiedenen Antikörper zu bestimmen, welche eine Spezifität für PAP und auch für HBsAg zeigten. Klone von zwei solchen Polydomen wurden bestimmt, um den Antikörper zu produzieren und anschliessend Aszites, welche beide Spezifitäten zeigten.

Subklone der beiden Polydome setzten die Produktion von Aszites, welche beide Spezifitäten zeigten fort, und ergaben dreifache Bande auf einer Orstein-Davies-PAGE, wie diejenigen der Mutterklone. Der Aszites beider Klone konnte 125I-HBaAg und auch 125I-PAP in Radioimmunoassays binden und ergaben Ka-Werte von etwa 109 für jedes, was somit auf die Bildung von Antikörpern mit zwei Spezifitäten hinwies.

Die Daten in der untenstehenden Tabelle 1 zeigen die erhaltenen Resultate der Immunoassays unter Verwendung der Aszites von einem Klon von einer der Polydome verglichen mit Aszites von Hybridomen, die monoklonale Antikörper ausscheiden, bzw. gegen IgE (verwendet als Kontrolle), PAP und HBsAg, unter Verwendung von immobilisiertem HBsAg als feste Phase und eine Anzahl von radiomarkierten Antigenen als lösliche Phase.

Eine 200 |il Probe der Aszites des Polydoms und jedem der drei Hybridome wurden alle über Nacht mit 12 Polystyrolkugeln, an welche HBsAg gebunden war, inkubiert. Die HBsAg-Kugeln wurden erhalten von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois. Nach dem Waschen wurde die dreifache Probe während 4 h mit 100 000 cpm des angegebenen I25I-markierten Antigens inkubiert. Nach einer zweiten Waschung wurden die Kugeln gezählt, um den Anteil des markierten Antigens, welches an die Kugeln gebunden war, zu bestimmen. In einem Satz der Versuche, worin radiomarkiertes PAP als das Lösungsphasenantigen verwendet wurde, wurde zum Antigen, bevor es mit den Kugeln inkubiert wurde, Anti-PAP zugegeben. Der Antikörper zu PAP, der für diesen Zweck verwendet wurde, ist der monoklonale Antikörper, der durch das parentale Hybridom, welches zur Herstellung des Polydoms verwendet wurde, produziert wurde, und ist somit gegen das gleiche PAP-Epitop, wie dies vom hybriden Antikörper erwartet wurde.

Tabelle 1

Resultate der Radioassays, die die Gegenwart von Hybridantikörper mit dualer Spezifität in Polydom-Aszites demonstrieren

Spezifität cpm cpm cpm *PAP+

cpm der Aszites

*HBsAg

*PAP

anti-PAP

*IgE

anti-IgE

15,340

2,145

2,930

3,290

anti-PAP

16,280

2,956

3,128

3,180

anti-HBsAg

73,02

2,973

2,870

3,330

vermutete

Dual-Spezifität

78,900

82,533

2,936

3,143

* mit 125I-markiertem Antigen

Die Daten in Tabelle 1 zeigen an, dass nur die von nicht spezifischer Bindung erwartete Strahlung bei den Anti-PAP-Aszites gemessen wurde, wenn man sie mit denjenigen der IgE-Kontrolle vergleicht. Die Aszites, die den HBsAg-Antikörper enthalten, die andererseits wie erwartet an das markierte HBsAg-Antigen gebunden waren, jedoch eine nicht spezifische Bindung zeigten, wenn die anderen markierten Antigene getestet wurden. Die Aszites vom Polydom-Klon jedoch banden markiertes HBsAg und auch markiertes PAP, dem ersteren wird die Gegenwart von etwas nicht hybridem monospezifischen Antikörper für HBsAg in den Aszites zugeschrieben, und dem letzteren wird ein Hybrid, welches das HBsAg an der Kugel binden und überbrücken kann und den Spuren von markierten PAP in der Lösung zugeschrieben. Der Versuch, in welchem eine Mischung von markiertem PAP und Anti-PAP vom Mutterhybridom verwendet wurde, bestätigt, dass die Anti-PAP-Spezifität des Hybrides für das gleiche Epitop ist wie der von der Urzelle ausgeschiedene Antikörper, da wegen

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der Hemmung der Bindung des markierten PAP zum Hybridantikörper durch den Mutterantikörper, nur Hintergrundstrahlung beobachtet wird.

Zur Analyse der Aszites vom Polydomklon, die in den vergleichenden Radioassays verwendet wurden, wurde unter Verwendung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und der Immunoelektrophorese (IEP) durchgeführt. Beide zeigten die Gegenwart von mindestens drei Antiköiperspezies an. Die DEAE-Ionenaustauschchromatographie in präparativem Massstab ergab drei gut getrennte Peaks, der mittlere von ihnen hatte eine Schulter. Jeder der Peaks war homogen und wurde durch PAGE und IEP analysiert und jedes entsprach einem der Bänder der ursprünglichen Aszites.

Das Material, das jedem der DEAE-Peaks entsprach, wurde auf die Antigen-Bindung unter Verwendung, von radiomarkiertem HBsAg und PAP geprüft. Der erste Peak band HBsAg, jedoch nicht PAP. Der mittlere Peak und seine Schulter banden HBsAg und auch PAP und der letzte Peak band nur PAP. Somit ist der mittlere Peak der hybride Antikörper, der eine duale Spezifität zu HBsAg und PAP aufweist und mindestens zwei Subspezies enthält.

Der hybride Antikörper, der als mittlerer Peak der DEAE-Chromatographie erhalten wurde, wurde mit I25I radiomarkiert. Nach der Markierung sollten 85 Prozent des markierten Antikörpers an PAP gebunden sein und 88 Prozent am HBsAg. Die Affinität des Hybrides für PAP wurde wenig tiefer ermittelt, als diejenige des monoklonalen Antikörpers für PAP, erzeugt durch den Urzellenstamm. Der Unterschied in der Affinität war etwa der gleiche wie derjenige der von uns zwischen dem monoklonalen Antikörper und seinem Fab-Fragment beobachtet wurde.

Die DEAE-Chromatographie zeigt, dass die hybriden Antikörper mehr als 50 Prozent Antikörper enthalten, die durch Polydom erzeugt wurden und sich grob dem Verhältnis 2:1:1 nähern, wie aus statistischen Gründen vorhergesagt, wenn das Polydom alle möglichen schweren Ketten des Antikörpers synthetisiert, d. h. diejenigen, die eine PAP- oder HBsAg-Spezifität haben, die in der Zelle auf zufalliger Basis kombiniert werden, um den hybriden Antikörper zu bilden, dem in kleineren Anteilen die zwei monospezifischen Antikörper beigemischt sind, die die gleiche Spezifität aufweisen, wie diejenigen, die durch die Urzellen produziert wurden. Die Existenz von Subspezies des hybriden Antikörpers lässt schliessen, dass sie sich in der Zusammensetzung ihrer leichten Kette unterscheiden können.

Beispiel 2

Die hybriden monoklonalen Antikörper, die eine duale Spezifität für humanes IgD und Prolactin haben, wurden gemäss der vorliegenden Erfindung durch die Fusion von zwei Hybridomen hergestellt, eines davon wurde so konstruiert, dass es zwei auswählbare genetische Markierungen enthält: Empfindlichkeit auf HAT-Medium und Resistenz auf Ouabain. Dieses doppelt markierte Hybridom oder sogenannte «universelle Urzelle» konnte dann mit jedem anderen Hybridom fusioniert werden. Die erhaltenen Polydome wuchsen in Gegenwart von HAT und Ouabain, während jede nicht fusionierte Urzelle starb. Die Vorteile der Verwendung einer «universellen Urzelle» sind anderswo hierhin beschrieben worden. Zur Konstruktion einer solchen universellen Urzelle wurden beide auswählbaren Markierungen während der ursprünglichen Konstruktion des Hybridoms eingeführt. Zur Gewinnung dieses Urzellenstamms wurde das weitverbreitet erhältliche HAT empfindliche Mäusemyelom P3.653 ausgewählt, für eine zweite genetische Markierung, die Ouabain-Resistenz durch Einführung von 1 mM Ouabain in das Wachstumsmedium. Während die meisten Zellen abstarben, haben sich annäherungsweise 1/100 000 Zellen durch eine zufallige Mutation die Resistenz gegen die Droge angeeignet und überlebten und vermehrten sich somit, um eine neue Myelom-Population zu bilden, die HAT empfindlich und Ouabain-resistent war.

Dieses HAT-empfindliche, Ouabain-resistente Myelom wurde dann fusioniert mit Milzzellen, erhalten von Balb/c-Mäusen, die mit IgD hyperimmunisiert wurden unter Verwendung der vorher erwähnten Technik von Gerhard. Hybride wurden im HAT-Medium (ohne Ouabain) ausgewählt und die Klone wurden einem Screening unterworfen zur Herstellung des gegen IgD gerichteten monoklonalen Antikörpers. Unter den positiven Klonen wurde für weitere Studien eines ausgewählt, das IgG gegen IgD produzierte. Diese Klone wurden auf das Verhalten des Merkmals der Ouabain-Resistenz geprüft, durch Zugabe von 1 mM Ouabain zum Wachstumsmedium. Etwa ein Drittel der Zellen haben diese genetische Markierung beibehalten. Als die Kultur exponentiell im Ouabain wuchs, wurden die Zellen subge-klont. Ouabain-resistente Subklone wurden auf die fortlaufende Produktion des monoklonalen Anti-IgD-Antikörpers geprüft. Eines der Subklone wurde weiter rückausgewählt, gemäss dem Verfahren des Beispiels 1, um eine Population von Zellen zu erhalten, die empfindlich auf HAT war. Dieses Subklon wurde während zwei Wochen unter nicht selektiven Bedingungen gezüchtet und dann in ein Medium, das 6-Thioguanin enthielt, gegeben. Wie vorher bemerkt, ist der Mechanismus der Reaktion des 6-Thioguanin ähnlich zu deijenigen des 8-Azaguanins. Zellen, welche 6-Thioguanin in ihre DNA anstelle von Guanin einbauen, wachsten nicht. Zellen, welchen das HPRT-Enzym fehlt, verwenden das 6-Thioguanin aus dem Medium nicht und können somit wachsen, sind aber konsequenterweise HAT-empfindlich. Diese Population des rückausgewählten Subklons wurde dann selber in einem Medium mit 6-Thioguanin und Ouabain subgeklont. Die Subklone wurden auf fortgesetzte Produktion des monoklonalen Anti-IgD-Antikörpers getestet. Ein Klon, welches alle die gewünschten Charakteristiken zeigte, wuchs in Ouabain und 6-Thioguanin ebenso wie die Produktion des monoklonalen Anti-IgD für die sogenannte «universelle Urzelle» ausgewählt wurde. Diese universelle Urzelle konnte dann mit jedem anderen HAT-resistenten, Ouabain empfindlichen Hybridom fusioniert werden, um ein Polydom herzustellen, welches einen hybriden Antikörper darstellt, dessen eine Spezifität das Anti-IgD war. Für diesen Zweck wählten wir ursprünglich ein Mäusehybridom, welches einen monoklonalen Antikörper ausschied, der gegen Prolactin gerichtet war. Der Antiprolactin-monoklonale-Antikörper ist von der gleichen Unterklasse (IgGi) wie das Anti-IgD, das durch den Urzellenstamm zum Ausdruck kommt und welches leicht von diesem Antikörper durch Ornstein-Davis-Gele getrennt werden kann. Eine solche Trennung weist auf grosse Ladungsunterschiede auf den Antikörpern hin und sollte die leichte Isolierung eines hybriden Antikörpers durch DEAE-Sephadex-Chromato-graphie erlauben.

107-Zellen dieses HAT-empfindlichen, Ouabain empfindlichen Zellstammes wurde in Polyethylenglykol mit 107-Antiprolac-tin produzierenden Zellen fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden zerst 3 Tage im HAT-Medium gezüchtet, dann wieder versorgt mit HAT + Ouabain-Medium für 3 Tage und schliesslich wieder in das HAT-Medium gegeben. Mehr als 600 Klone gingen aus dieser Fusion hervor: 66 Klone wurden zufallig für die Analyse ausgewählt. Von diesen Klonen zeigten 66 Anti-IgD- und auch Anti-Prolactin-Aktivität.

Diese Klon-Überstände wurden auf die Gegenwart von hybriden Antikörpern durch den folgenden Versuch getestet. Ein Poly-styrolkügelchen, welches mit einem anderen Antiprolactin-mono-klonalen-Antiköiper beschichtet war, wurde während 5 h mit 200 ul einer 100 mg/ml Prolactinlösung inkubiert. Der verwendete Antikörper bindet das Prolactin an einem ausgeprägten Zentrum von demjenigen Antikörper, der durch den fusionierten Hybridomzellstamm produziert wurde. Das Kügelchen wurde gewaschen, dann über Nacht mit dem Klonüberstand inkubiert. Am nächsten Tag folgten verschiedene Waschungen, mit 125I markiertes IgD wurde zugegeben. Der hybride Antikörper, welcher an das Kügelchen durch einen funktionellen Arm gebunden war,

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konnte die radiomarkierten IgD mit der freien Anti-IgD-Funktionalität binden, während kein Antikörper des Urtyps IgD-IgD oder Prolactin-Prolactin diese Brücke zwischen dem Prolactinkü-gelchen und dem i25I-IgD-Tracer bilden konnte. Resultate eines typischen Tests für Klone, welche hybride, bifunktionelle Antikörper produzieren, werden in der folgenden Tabelle 2 dargestellt:

Tabelle 2

Resultate der immunometrischen Tests zeigen die Gegenwart von hybriden Antikörpern, die eine duale Spezifität für IgD und Prolactin haben, in ausgewählten Polydom-Überständen und Aszites.

Klonat Nr. cpm125I-IgD tracergebunden

1 15339

2 16337

3 22886

4 23356

5 24434 Anti-IgD 9357 Anti-Prolactin 8721

21 der 36 Klone zeigten eine ausgeprägte bifunktronelle Aktivität in diesem Test. Es wurde die Reaktion von Aszites gebildet von zwei bisher erhältlichen Klonen im bifunktionellen Test gezeigt. Diese Aszites enthalten Antikörper, welche auf den Ornstein-Davis-Gelen in drei unterscheidbare Bänder getrennt werden können: Zwei Bänder stimmen exakt mit den Antikörpern, die durch die Mutter-Hybridome erzeugt wurden, überein (Anti-IgD und Anti-Prolactin). Das dritte Band wanderte zwischen den Bändern der parentalen monoklonalen Antikörper wie dies vom hybriden Antikörper erwartet wurde.

Dass, ein hybrides monoklonales Antikörper gegen IgD und Frolactim eine dosierte Reaktion zeigt im Test, der die Daten der Tabelle 2 lieferte,, wird! durch die Daten die® Tabelle 3 unter Verwendung des Antikörpers die» Klonat Nr. 2 und als Kontrolle AntSköiper der Urzelli-Stämme (EAnti-IgD* und Anti-Prolactin).

Tabelle 3

Resultate? von-Tests^ die-hybridfe Antikörper und variierende Anteile von Prolactin verwenden;

Prolactiir

Hybrid-

Anti-

ng/ml

Antikörper

IgDl

Prolactin1

0

8010

6847

8020

10

9169

7982

7405

50

13558

7783

8314

100

17599

7654

7844

i: emp von I2SF-FgE. gebunden

Diese Baten) zeigen, dass; dar Anteil von Prolactin, der durch dëffiftyMdten Antikörper gebunden ist, dosisempfindlich ist, wie dbr Anteil dés markierten IgD, das gebunden ist mit der Dosis des prol'actms zunimmt. Im Gegensatz dazu wurde Dosisempfindlichkeit festgestellt bei der Verwendung der Mutterantikörper gegen IgD und Prolactin, so wie sie auch keine Brücke zwischen Prolactin, das an das Kügelchen gebunden ist, und dem markierten IgD bilden können. Somit kann der hybride Antikörper als Komponente eines Tests für Prolactin verwendet werden. Das Massschneidern anderer hybrider Antikörper ergibt ähnliche Möglichkeiten für andere Tests.

Beispiel 3

Durch eine ähnliche Technik wie in Beispiel 2, wird ein universelles Mutterhybridom erzeugt, welches einen monoklonalen

Antikörper der gegen das Hapten-Arsenat-Arsenat-Dimer gerichtet ist, und das sowohl Ouabain-resistent wie auch HAT-empfind-lich ist. Dieses Hybridom wurde mit einem Hybridom fusioniert, welches einen monoklonalen Antikörper ausscheidet mit einer 5 Spezifität für das carcinoembrionische Antigen (CEA), das sowohl durch embrionische Gewebe wie auch durch verschiedene Typen von Carcinomen gekennzeichnet ist. Es wurden wiederum mehr als 600 Klonen von der Fusion erhalten. Von 72 Klonen, getestet aus der Fähigkeit CEA und Arsenal zu binden, hatten 69 io beide Bindungsaktivitäten. Diejenigen Klone, welche die grösste Bindungsaktivität aufwiesen, wurden für das enzymgebundene Immunoadsorbens-Test (ELISA) des hybriden Antikörpers ausgewählt. Für jeden Test wurde eine CEA-Lösung (600 ng oder 250 ng), in jeder Vertiefung einer Kunststoff-Mikrotiter-Platte mit 15 96 Vertiefungen über Nacht adsorbiert. Am nächsten Tag wurde das unadsorbierte Material mit PBS-Tween 20 aus den Vertiefungen ausgewaschen. Die Klonüberstände wurden zugegeben und 2—Vi- h bei 35 0 C inkubiert und dann vor der Platte gewaschen. CEA-CEÄ- und CEA-Arsenat-Antikörper bleibt auf der Platte 20 gebunden über das adsorbierte Antigen. Das zweite Antigen, Arsensäure-gekuppelt an das enzymalkalische Phosphatase, wurde während 3 h bei 35 °C in die Vertiefungen gegeben. Nach einer weiteren Waschung mit PSB-Tween wurde ein Chromagensubstrat für alkalische Phosphase, Para-nitrophenylphosphat in 25 die Vertiefungen gegeben und während 48 h farbentwickelt. Die Absorbtion in jeder Vertiefung wurde bei 410 rnn gemessen. Falls im Klonüberstand vorhanden, lässt der Hybridantikörper, der an das adsorbierte CEA an der Platte über eine Funktionalität gebunden ist, die andere frei, um die Arsensäure an die alkalische 3o Phosphatase zu binden. Die Farbe vom Chromagensubstrat wird nur entwickelt, wenn die an die Arsensäure gekuppelte alkalische Phosphatase gebunden war. In diesem Test zeigten 3 von 12 Überständen Antikörperaktivität, wie in Tabelle 4 angegeben.

35 Tabelle 4

Demonstration des hybriden Antikörpers mit dualer Spezifität durch den enzymgebundenen Ikimunoadsorptions-(ELISÄ-)Test

Klon Nr.

Absorption bei 490' nm 600 ng CEA/Fügung

Absorption bei 490 nm 250 ng CEA-Verfugung

1

0,087, 0,105

0,022, 0,060

2

0,082, 0,054

0,023, 0,033

3

0,011, 0,017

0,041, 0,036

Anti

arsenat

0,010, 0,006

0,006,0,005

so Die vorliegende Erfindung liefert ebenfalls Methoden für die Immunodiagnose und die Immunotherapie, unter Verwendung von Antikörpern mit einer dualen Spezifität, z. B. von Hybridantikörpern, die wie oben beschrieben erhalten wurden, oder aus Antikörperhalbmolekülen durch die bekannte Technik von Niso-55 noff et al, wie oben angegeben oder Antikörpermultimere, erhalten durch Kupplung oder Vernetzung individuell monospezifischer Antiköiper. Vorzugsweise ist der Antikörper mit einer dualen Spezifität, der in diesen Methoden verwendet wird, ein hybrider Antikörper, der gemäss der vorliegenden Erfindung herge-60 stellt wurde, wie auch ein Antikörper, der zuverlässig als eine wesentlich reine Substanz erhalten werden kann und keine Denaturierung erleidet und welcher eine einheitliche Spezifität und Affinität für das Antigen aufweist.

Im Fall der Immunodiagnoseanwendungen ist eine der Spezi-65 fitäten des Hybrides oder des anderen Antikörpers einer dualen Spezifität gegen das Zielantigen gerichtet, dessen Ermittlung gewünscht ist und die andere gegen ein anderes Antigen, welches ein Hapten oder eine andere molekulare Gattung sein kann, die

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die Diagnose erlaubt. Z.B. sollte ein fur die Immunohistologie nützlicher Antikörper eine erste Spezifität für ein verdächtiges Antigen haben, beispielsweise ein Antigen, das mit einem Tumor assoziiert ist, wie CEA, PAP oder Ferritin und eine zweite Spezifität gegen ein Hapten oder Antigen welches an einer Farbreaktion teilnimmt, wie ein Enzvm. welches eine Farbreaktion in Gegenwart eines passenden Substrates auslöst. Unter den geeigneten Enzymen, auf welche die zweite Spezifität des Antikörpers gerichtet sein kann, ist die Prostansäurephosphatase (PAP) Pferde-Radieschen-Peroxidase, Glukoseoxidase und alkalische Phosphatase.

Zur Durchführung der histologischen Prüfung wird eine Gewebsektion zuerst mit dem Antikörper von dualer Spezifität behandelt. Vorher kann das Hybrid bereits mit einem Enzym verbunden sein, welches die Farbreaktion katalisiert. Ist dies nicht der Fall, wird die Sektion dann mit einer zweiten Lösung behandelt, die das Enzym enthält und nach gebührender Inkubation gespült und dann mit einem Substrat behandelt, welches in Gegenwart des Enzyms einem Farbwechsel unterworfen ist. Die Bildung der Farbe, die durch das Enzym und das Substrat in der Gewebeprobe erzeugt wird, ist ein positives Kennzeichen der Gegenwart des Zielantigens im Gewebe. Es wurde gefunden, dass der hybride Antikörper gegen HBsAg und PAP, dessen Herstellung hier beschrieben ist, an HBsAg auf einem Testsubstrat (Poly-slyrolkugeln) und an PAP in einem simultanen Färbeversuch unter Verwendung von p-Nitrophenyl-phosphat als Enzymsubstrat, gebunden wird. Nach der Inkubation des hybriden Antikörpers mit PAP und des HBsAg verursacht die Zugabe des p-Nitro-phenylphosphates, dass die Kugeln dem charakteristischen Farbwechsel von gelb bis braun unterworfen werden. Wie im Beispiel angegeben, kann der Antikörper mit dualer Spezifität ebenfalls in Immunoassays und immunometrischen Tests verwendet werden. Wird der Hybridantikörper gegen HBsAg und PAP, dessen Herstellung oben beschrieben ist, verwendet, kann ein immunometri-scher Test für HBsAg an einem immobilisierten monoklonalen Antikörper für HBsAg als feste Phase durchgeführt werden, um HBsAg aus einem Serum oder einer anderen flüssigen Probe, von der vermutet wird, dass sie das Antigen enthält, zu extrahieren. Die Probe wird inkubiert mit einer Kugel, Kügelchen, Reagenzglas oder einem anderen Substrat, welches die Anti-HBsAg an ihre Oberfläche gebunden hat oder damit beschichtet ist. Der Inkubation der Serumprobe kann eine Inkubation mit einer Lösung des Hybrides folgen, simultan durchgeführt werden oder vorausgehen. In jedem Fall, wenn HBsAg in der Probe vorhanden ist, wird das Resultat die Bildung eines Sandwiches des immobilisierten Antikörpers HBsAg, falls in der Probe vorhanden, und des hybriden Antikörpers sein. Als Teil des Tests wird PAP erlaubt, sich mit dem hybriden Antikörper zu binden. Dies kann gemacht werden während odernach der Bildung des Sandwiches, oder alternativ im Antikörper-PAP-Komplex durchgeführt werden. Nach der Bildung des Sandwiches, wird die feste Phase gewaschen, um den Probenrest und den ungebundenen Hybridantikörper zu entfernen und dann mit einer Lösung, die ein Substrat, wie p-Nitrophenyl-phosphat oder a-Naphtol-phosphat enthält, in Kontakt gebracht, und welche einem Farbwechsel in Gegenwart von PAP unterworfen ist. Das Auftreten des Farbwechsels bestätigt die Gegenwart des Zielantigens in der Probe.

In solch einem Test, der das polyklonale Anti-HBsAg-Kügel-chen eines kommerziellen Kits für die Diagnose von HBsAg, hergestellt durch Abbott Laboratories of North Chicago, Illinois (im Handel unter dem Namen «Aushia»), werden Proben mit verschiedenen Anteilen von HBsAg mit den Kügelchen inkubiert. Die Proben sind die positiven und negativen Kontrollen des kommerziellen Kits und zwei Proben, die durch Verdünnen der positiven Kontrollen mit negativen Kontrollen in den Verhältnissen ein Teil negative Kontrolle : zwei Teile positive Kontrolle oder zwei Teile negative Kontrolle : ein Teil positive Kontrolle.

Nach der Inkubation der Beispiele mit den Kügelchen, um

HBsAg zu binden, wurde das Kügelchen gewaschen und mit dem hybriden Antikörper, der auf HBsAg und PAP reaktiv ist, inkubiert. Dies erlaubt die Bildung eines Sandwiches aus immobilisiertem Antikörper : Antigen : und hybridem Antikörper. Das Kügelchen wurde wieder gewaschen und mit einer Lösung von PAP inkubiert. Dieser Inkubation folgte ein weiteres Waschen und das Kügelchen wurde mit dem Substrat a-Naphthol-phosphat inkubiert. PAP entfernt Phosphat auf enzymatische Weise. Nach einer zweckmässigen Inkubation wurde das Substrat vom Kügelchen entfernt und zu ihm wurde ein Indikator Fast Garnet GBC-Salz gegeben, welcher in Gegenwart des enzymati-schen Reaktionsprodukts von klar zu einem rötlichen Purpur umschlägt. Es wurde ein Farbwechsel beobachtet, was die Gegenwart von HBsAg in den Proben bestätigte. In den Proben wurde die Absorption bei 570 nm gemessen und diese Daten sind in der Tabelle 5 unten dargestellt.

Tabelle 5

HBsAg-Konzentration Absorption

(% von Positiv-Kontrolle) 570 nm

0 .031

34 .166

67 .243

100 .379

Diese Daten zeigen eine Dosis-Empfindlichkeit mit der Änderung in der HBsAg-Konzentration, welche erwartet wird, wenn der hybride Antikörper eine Brücke zwischen dem HBsAg, das an die Kugel gebunden ist, und dem PAP bildet. Dies zeigt in weiterer Weise die Nützlichkeit eines hybriden Antikörpers in einem Immunoassay.

Ermittlungsmittel, die verschieden sind von enzymatisch katalysierten Reaktionen sind ebenfalls möglich. Z.B. kann die zweite Spezifität des Hybrides oder anderen Antikörpers mit einer dualen Spezifität gegen ein Hapten oder Antigen gerichtet sein, welches radiomarkiert ist oder welches fluoreszierend ist oder welches als Sandwich durch andere passende Mittel ermittelt werden kann. Ein bevorzugtes Verfahren, welches einen hybriden Antikörper oder einen anderen Antikörper mit einer zweifachen Spezifität in einem Immunoassay verwendet, beruht auf dem Phänomen des Fluoreszenz-Quenching. In einem solchen Test ist eine Spezifität des Antikörpers gegen ein Zielantigen gerichtet und die andere gegen beispielsweise ein Hapten, welches ein fluoreszierendes Chromophores trägt, gerichtet. Das Chromophore ist entweder an das Hapten gebunden oder ist in geeigneten Fallen das ~ Hapten selbst.

Der Test wird durchgeführt, indem der Antikörper mit Serum oder einer anderen Probe, in welcher das Zielantigen vermutet wird, inkubiert, zu welchem eine vorbestimmte Menge des Zielantigens, in welches eine vorgegebene Menge des Zielantigens, markiert mit einem Quenching-Chromophoren zugegeben worden ist. Das markierte Antigen konkurriert nun mit dem Zielantigen der Probe, falls vorhanden, da das Antikörperbindungszentrum spezifisch für das Zielantigen ist. Vor, während oder nach dieser Inkubation wird eine Menge des Haptens, welche das fluoreszierende Chromophore trägt, mit dem Antikörper inkubiert und bindet am anderen Bindungszentrum.

Die zwei Chromophoren werden so ausgewählt, dass der erste von ihnen bei einer Wellenlänge fluoresziert, die durch das andere absorbiert (gequencht) werden kann, wenn sie nahe genug beieinander liegen, so dass das Photon, das durch das fluoreszierende emitiert wird, durch den Quentcher aufgefangen werden kann. Um dies zu tun, sollten die zwei Chlorophore innerhalb von 100 Angström und vorzugsweise innerhalb von etwa 50 Angström entfernt sein. Dieses Positionieren wird erzielt, wenn das fluoreszierende Chromophore am einen Antikörperbindungszentrum

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gebunden ist und das Quentching-Chromophore über das zugegebene Antigen am anderen gebunden ist. Ein passendes Paar von Chromophoren umfasst Fluorescein als fluoreszierendes Chromophores und Rhodamin als Quentching-Chromophores.

Die gemessene Fluoreszenz ändert sich umgekehrt mit dem Anteil des nativen Antigens in der Probe, da bei Abwesenheit des nativen Antigens das gesamte Antigen, das an den Antikörper gebunden ist, durch das Quentchingchromophore markiert ist, und in diejenige Position gebracht wird, in welcher die Fluoreszenz durch das Chromophore, welches durch das Hapten getragen wird, absorbiert wird. Der Vergleich der gemessenen Fluoreszenzen mit denjenigen der Kontrollproben, die einen bekannten Anteil am Antigen enthalten, erlaubt eine qualitative und quantitative Bestimmung der Gegenwart von Antigen in der Probe.

Diese Art von Immunoassay kann beispielsweise dazu verwendet werden, in Serum den Spiegel von Drogen, wie Dilantin, zu bestimmen, die streng überwacht werden müssen. In solch , einem Test wäre das Zielantigen natürlich Dilantin. Es ist für den fachkundigen naheliegend, dass dieses Verfahren ebenfalls zur Ermittlung anderer Antigene, die im besonderen ebenfalls tumorassoziierte Antigene umfassen, verwendet werden kann.

Ein weiteres bevorzugtes Verfahren, welches hybride Antikörper oder andere Antikörper mit dualer Spezifität verwendet, ist ein Immunoassay, der auf einer enzymatischen Reaktion beruht. In einem gegenwärtig bevorzugten Verfahren ist eine der Antikör-perspezifitäten natürlich auf das Zielantigen und die andere auf ein Enzym oder ein Hapten, an welches ein Enzym gebunden ist gerichtet.

Der Test wird durchgeführt durch Inkubation des Antikörpers mit einer Probe mit dem vermuteten Zielantigen, in welche eine vorbestimmte Menge des Zielantigens gegeben worden ist, welches modifiziert ist duch Bindung an eine Substanz, welche mit 5 dem Enzym in Wechselwirkung tritt, um eine nachweisbare Substanz zu erzeugen oder den Nachweis zu erzeugen oder den Nachweis der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes in einer anderen Weise erlaubt. Die Nachweismethode kann beispielsweise Fluorimetrie, Lumineszenz, Spectrophotometrie oder io ähnliches sein.

In einem alternativen Verfahren kann das zugegebene Zielantigen das Enzym an sich gebunden haben, wobei der Antikörper eine seiner Spezifitäten gerichtet hat gegen die Substanz, welche mit dem Enzym in Wechselwirkung tritt oder gegen ein Hapten, 15 an welches die Substanz gebunden ist.

Diese Substanz, welche mit dem En2ym in Wechselwirkung tritt, kann selber ein weiteres Enzym sein. In einem solchen Fall katalisiert eines der Enzyme die Herstellung eines Produktes, welche vom anderen benötigt wird. Wenn der Antikörper das zugege-20 bene Zielantigen, an welches eines der Enzyme gebunden ist und auch das andere Enzym bindet, wird folglich das Produkt der ersten enzymatischen Reaktion in der Nähe des zweiten Enzyms gebildet und kann eine Reaktion eingehen, die durch das letzte Enzym katalysiert wird, bevor eine ausgeprägte Diffusion des Pro-25 duktes in das umgebende Medium stattfinden kann.

Ein Beispiel eines solchen Verfahrens verwendet die zwei Enzyme Hexokinase (HK) und Glukose-6-phosphat-dehydroge-nase (G-6-PDH) nach dem folgenden Reaktionsschema.

HK

(1) Adenosintriphosphat + Glukose

(ATP)

Adenosindiphosphat + Glukose-6-phosphat (ADP)

(2) Glukose-6-phosphat + Nicotinaraid-adenin-dinucleotid

(NAD+)

6-6-PDH

^Glukonolacton-6-phosphat + Dihydronicotinamid-

adenin-dinucleotid (NADH)

Unter Ausnutzung dieses Reaktionsschemas hat das zugegebene Zielantigen entweder HK oder aber G-6-PDH an sich gebunden und der hybride Antikörper hat eine seiner Spezifitäten gegen das andere gerichtet (oder auf ein Hapten, welches es trägt). Die Probe wird zugegeben, zusätzlich zum hybriden Antikörper und demvorbestimmten Anteil des enzymmarkierten Antigens, Glukose, ATP und dem Coenzym NAD+. Der hybride Antikörper hat vorzugsweise das andere Enzym schon an sich gebunden. Andererseits kann dieses Enzym zur Probe mit anderen Reagenzien zugegeben werden.

Während der Inkubation konkurrenziert das enzymmarkierte Antigen das native Antigen, falls vorhanden, in der Probe, für eines der aktiven Bindungszentren des hybriden Antikörpers. Das andere Enzym ist oder wird an das zweite Bindungszentrum gebunden. Dies erlaubt die Bindung von Glukose-6-phosphat, katalysiert durch HK, wobei in nächster Nähe G-6-PDH vorhanden ist. Das letztere wandelt das Glukose-6-phosphat in Gluko-nol-lacton-6-phosphat um, ein Resultat, das begleitet wird durch die Reduktion von NAD+ zu NADH. Das NADH absorbiert stark bei 340 nm und kann somit spektrophotometrisch nachgewiesen werden. Der Anteil des geformten NADH variiert umge-50 kehrt mit dem Anteil des nativen Antigens in der Probe, d.h.

seine höchste Produktion kommt vor, wenn kein Zielantigen in der Probe festgestellt werden kann. Der Vergleich des Anteils des NADH, gebildet durch die Kontrollprobe, erlaubt eine qualitative und quantitative Bestimmung der Anwesenheit des Antigens in 55 der Probe.

Diese Art von Test kann verwendet werden zur Kontrolle des Spiegels von Dilantin oder anderen Drogen im Serum. In solchen Fällen ist die Droge das Zielantigen. Ein solcher Test kann jedoch auch verwendet werden, um andere Serumantigene nachzuweisen, 60 wie solche, die mit Tumoren oder anderen Krankheiten verbunden sind. Die in vivo Immunodiagnose kann ebenfalls durchgeführt werden unter Verwendung eines hybriden oder anderen Antikörpers mit dualer Spezifität. Der Antikörper, der die erste Spezifität gegen ein Zielantigen, wie ein tumorassoziiertes Anti-65 gen, gerichtet hat und die zweite gegen ein Hapten gerichtet hat, an welches ein geeignetes Radionuklid gebunden ist, vorzugsweise eines, welches y-Strahlen aussendet, wird zuerst dem Wirtsorganismus verabreicht. Nachdem genügend Zeit verstrichen ist, wäh-

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rend der Antikörper das Zielzentrum lokalisiert hat und es dem ungebundenen Antikörper ermöglicht wurde, sich aus dem gesunden Gewebe des Wirtsorganismus zu entfernen, wird das Hapten, welches das Radionuklid trägt, verabreicht und durch den lokalisierten Antikörper gebunden.

Nach einem passenden Zeitraum, um dem ungebundenen Hapten zu erlauben sich aus dem Wirtsorganismus auszuscheiden, wird die Abtastung des Wirtsorganismus mit einer passenden Kamera durchgeführt, um zu bestimmen, ob Gebiete vorhanden sind, in welchen die Strahlung konzentriert worden ist. Falls solche vorhanden sind, bestätigt die Anwesenheit des Zielantigens im Wirtsorganismus und seine Lage kann bestimmt werden.

Dieses Verfahren hat verschiedene Vorteile gegenüber demjenigen, welches den monospezifischen Antikörper verwendet, der gegen das Zielantigen gerichtet ist, an welches das Radionuklid direkt gebunden ist. In solchen Fallen muss das Radionuklid eine Halbwertzeit haben, die lange genug ist, dass eine genügende Quantität erhalten bleibt nach Ablauf der nötigen Zeit für die hauptsächliche Lokalisierung des Antikörpers am Zielzentrum. Darüber hinaus kann während dieses Verfahrens der Antikörper für eine Zeitspanne in der Leber oder in einem anderen NichtZiel-Gewebe zurückbleiben, wobei diese dann der durch den Antikörper gebrachten Strahlung ausgesetzt sind.

Das Verfahren erlaubt andererseits die Verwendung von Radionukliden mit einer kürzeren Halbwertzeit als diejenigen, welche mit monospezifischen Antikörpern verwendet werden. Da das Hapten tragende Radionuklid, das ein verhältnismässig kleiner Partikel ist, eine hohe in vivo Mobilität aufweist und sich schnell durch den Wirtsorganismus bewegt, und den lokalisierten Antikörper am Zielzentrum zu binden vermag oder den Körper, ohne wesentliche Zeit im Nicht-Ziel-Gewebe zu verbringen^, befreit. Aus diesen Gründen können Isotope mitniedriger Halbwertzeit in Mengen verabreicht werden, die minimale Risiken für das gesunde Gewebe bilden, sogar wenn sie im'wesentlichen. Überschuss verabreicht werden.

Das Hapten ist vorzugsweise ein Mittel, an welches das Radionuklid direkt gebunden werden kann oder welches einen Komplex bilden kann mit dem Radionuklid Eihs chelktbild'endés Mittel für das Radionuklid, das an ein Hapten gebunden isf4, kann für den letztgenannten Zweck verwendet werden. Die Fachkundigen werden wahrnehmen, dass eine weite Varietät von chelatbil-denden Mitteln und Radionukliden für diesen Zweck geeignet sind. Phenylarsenat, an welches Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als chelatbildendes Mittel gebunden ist, ist ein passendes Hapten. Ein Radionuklid für die Verwendung mit diesem Hapten ist inIn.

Der Antikörper mit dualer Spezifität kann ebenfalls in der Immunotherapie verwendet werden, indem er so konstruiert wird, dass er eine Spezifität gegen ein krankheitsgebundenes Antigen hat und die andere gegen ein Hapten, welches ein letales Mittel ist oder an ein solches gebunden ist, wobei das Mittel letal für das

Antigen oder kranke Gewebe, mit welchem das Antigen assoziiert ist, und welches zu zerstören gewünscht wird. Z.B. kann der Antikörper eine Spezifität gegen ein tumorassoziiertes Antigen, wie PAP, carcinoembrionisches Antigen (CEA), Ferritin oder andere 5 solcher Antigene und eine zweite Spezifität gerichtet auf ein Hapten haben, an welches ein Radionuklid gebunden ist, vorzugsweise eines welches a oder y-Strahlung aussendet oder eines, welches eine Ricin-A-Kette oder ein anderes Toxin oder Droge enthält. Unter solchen Drogen können Gelonin, a-Amanitin, io Diphterietoxin A, Methotrexat, Dichlormethatrexat, Daunomycin und Chlorombucil. Wenn das Toxin oder die Droge selbst als Hapten funktionieren können, braucht es nicht an einen anderen Rest gebunden zu werden.

Falls ein Radionuklid als letales Mittel zu verwenden ist, 15 genau wie in der Situation, wo sie für die in vivo-Immunodia-gnose zu verwenden sind, kann das Hapten das Radionuklid direkt an sich gebunden haben oder das Hapten kann ein chelatbildendes Mittel, welches einen Komplex mit dem Radionuklid bilden kann, sein oder an ein solches gebunden sein. In einem 20 solchen Fall wird das Hybrid oder der andere Antikörper von dualer Spezifität dem erkrankten Wirtsorganismus verabreicht und das Zentrum des affektierten Gewebes lokalisiert, und dem Wirtsorganismus erlaubt, sich vom Überschuss zu befreien,

gefolgt von einer Verabreichung des Haptens, welches an den 25 Antikörper gebunden wird, wo er auch lokalisiert ist Dies erlaubt die Verwendung eines Radionuklids mit einer kurzen Halbwertszeit, welche das Risiko der Beeinträchtigung von gesundem Gewebe minimalisiert, sogar wenn das Radionuklid tragende Hapten in einem wesentlichen Überschuss verabreicht wird, da 3o dieser Überschuss rasch aus dem Körper entfernt wird, und nicht in wesentlichen Mengen im gesunden Gewebe lokalisiert werden kann, wegen der verhältnismässig kleinen Grösse des Haptens. Es eliminiert oder reduziert ebenfalls die Möglichkeit, dass zirkulierendes Zielantigen Antikörper, welche eine für das Gewebe letale 35 Substanz tragen, gebunden werden und es in gesundes Gewebe überführt, wie-es vorkommen kann, wenn das letale Mittel direkt an einen monospeziffschen Antikörper gebunden ist, welcher gegen das Zielantigen gerichtet ist.

Ein Beispiel eines Haptens, an welches ein Radionuklid direkt 40- gebunden ist, ist 6-211At-astatö-2-methyl-1,4-naphthochinol-bis(dinatrium-phosphat), welches im «International Journal of Applied1 Radiation and Isotopes», 33,75 (1982) beschrieben ist. Das 2r'r-A6isfiefn Emittervoiï cc-Sfeahluiig.. Der fachkundige wird erkennen,, däss- es eirre Anzahl von passenden Radionukliden gibt, 45 welche direkt! an Haptene gebunden werden können odermit einem Hapten kompîeÂft werden können mit jedsm Mittel der weiten Vielfalt der chelatbildendëiî. Mittel. ^ Die vorhergehende Beschreibung enthäl't gegenwärtigbevorzugte Ausführungsformen. Varianten sind möglich (Shne Abweii-50 chung vom Bereich der Erfindung, welche nur durch die beigefiig-ten Ansprüche begrenzt wird.

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines Polydomes, welches einen hybriden monoklonalen Antikörper, der eine duale Spezifität hat, erzeugt, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine erste antigenische Determinante erzeugt, mit einem B-Lymphocyten, welcher einen monoklonalen Antikörper gegen eine zweite antigenische Determinante ausscheidet, in Gegenwart eines fusionsfördernden Mittels fusioniert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Hybridom selektiv zerstörbar ist.
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, worin das Hybridom rückausgewählt wurde, um Zellen zu erhalten, die empfindlich auf ein Medium sind, worin das Polydom kultiviert werden kann.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Rückauswahl durchgeführt wurde durch Kultivierung von Zellen eines Hybridoms in einem Medium, welches ein Glied der Gruppe, bestehend aus 8-Azaguanin, 6-Thioguanin, 5-Bromuracyl-deoxyribose oder 2-Aminopurin enthält, wobei Hybridomzellen erhalten werden, die empfindlich sind auf ein Medium, welches Hypoxanthin-aminopterin-thymidin enthält.
5. Verfahren gemäss Anspruch 2, worin das genannte selektiv zerstörbare Hybridom erhalten wurde durch irreversible Enzymhemmung.
6. Verfahren gemäss Anspruch 5, worin die Hemmung erhalten wurde, durch Verwendung eines metabolischen Inhibitors.
7. Verfahren gemäss Anspruch 6, worin der Inhibitor ein K^-Inhibitor ist.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, worin der K^-Inhibitor ausgewählt ist aus Azaserin oder 5-Diazo-5-oxa-L-norleucin.
9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der B-Lymphocyt eine Säugetier-Milz-Zelle ist.
10. Verfahren zur Herstellung eines Polydomes, welches einen hybriden monoklonalen Antikörper, der eine duale Spezifität hat, ausscheidet, dadurch gekennzeichnet, dass ein erstes Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine erste antigenische Determinante ausscheidet, mit einem zweiten Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine zweite antigenische Determinante ausscheidet, in Gegenwart eines Fusionsförderers fusioniert wird.
11. Verfahren gemäss Anspruch 10, worin das erste und das zweite Hybridom selektiv zerstörbar sind.
12. Verfahren gemäss Anspruch 11, worin mindestens eines der Hybridome rückausgewählt wurde, um Zellen zu erhalten, welche empfindlich sind auf ein Medium, in welchem das Polydom kultiviert werden kann.
13. Verfahren gemäss Anspruch 12, worin beide Hybridome rückausgewählt wurden.
14. Verfahren gemäss Anspruch 11, worin die Rückauswahl durchgeführt wurde durch Kultivierung von Zellen des Hybrido-mes in einem Medium, das 8-Azaguanin, 6-Thioguanin, 5-Brom-uracyl oder 2-Aminopurin enthält, wobei Hybridomzellen erhalten werden, welche empfindlich sind auf ein Medium, das Hypo-xanthin-aminopterin-thymidin enthält.
15. Verfahren gemäss Anspruch 10, worin die genannten selektiv zerstörbaren Hybridome durch irreversible Enzymhemmung erhalten wurden.
16. Verfahren gemäss Anspruch 15, worin die Hemmung durch einen metabolischen Inhibitor erhalten wurde.
17. Verfahren gemäss Anspruch 16, worin der Inhibitor ein Kcaflnhibitor ist.
18. Verfahren gemäss Anspruch 17, worin der Inhibitor ausgewählt ist aus Azaserin oder 5-Diazo-5-oxa-L-norleucin.
19. Verfahren gemäss Anspruch 10, worin nur das erste Hybridom selektiv zerstörbar ist.
20. Verfahren gemäss Anspruch 19, worin das selektiv zerstörbare Hybridom ausgewählt wird, um ihm die Fähigkeit zu verleihen, in einem Medium, welches für die anderen Hybridome letal ist, zu überleben.
21. Verfahren gemäss Anspruch 20, worin das selektiv zerstörbare Hybridom resistent ist gegen ein Medium, das Ouabain enthält.

5 22. Verfahren gemäss Anspruch 21, worin das Hybridom rückausgewählt wurde, um Zellen zu erhalten, die empfindlich sind auf ein Medium, worin das Polydom kultiviert werden kann.
23. Verfahren gemäss Anspruch 22, worin die Rückauswahl durchgeführt wurde durch Kultivierung von Zellen des Hybri-lo doms in einem Medium, welches ein Glied, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 8-Azaguanin, 6-Ihioguanin, 5-Bromuracyl-deoxyribose oder 2-Aminopurin enthält, wobei Hybridomzellen erhalten wurden, die empfindlich auf ein Medium sind, welches Hypoxanthin-aminopterin-thymidin enthält. 15 24. Verfahren gemäss Anspruch 21, worin das selektiv zerstörbare Hybridom erhalten wurde durch irreversible Enzymhemmung.
25. Verfahren gemäss Anspruch 24, worin die Hemmung erhalten wurde durch Verwendung eines metabolischen Inhibi-

20 tors.
26. Verfahren gemäss Anspruch 25, worin der Inhibitor ein Kcat-Inhibitor ist.
27. Verfahren zur Herstellung eines Polydoms, welches einen hybriden, monoklonalen Antikörper mit einer dualen Spezifität

25 ausscheidet, dadurch gekennzeichnet, dass der Nucleus aus einer ersten Hybridomzelle, welche einen monoklonalen Antikörper gegen eine erste antigenische Determinante erzeugt, entfernt wird und dieser Nucleus in das Citoplasma eines zweiten Hybridoms, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine zweite anti-30 genische Determinante erzeugt, eingesetzt wird.
28. Verfahren zur Herstellung eines hybriden monoklonalen Antikörpers, der eine duale Spezifität hat, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper aus Zellen eines Polydoms isoliert wird, welches Polydom gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprü-

35 che 1-27 erhalten wurde.
29. Polydom, das einen hybriden monoklonalen Antikörper mit einer dualen Spezifität erzeugt, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.
30. Polydom gemäss Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, 40 dass es einen hybriden Antikörper als Komponente einer

Mischung von Antikörpern erzeugt.
31. Polydom gemäss Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die erzeugte Mischung von Antikörpern den hybriden Antikörper und zwei Spezies von monospezifischen Antikörpern ent-

45 hält.
32. Polydom gemäss Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass der ausgeschiedene hybride Antikörper von zwei Subspezies umfasst wird.
33. Hybrider, monoklonaler Antikörper mit einer dualen Speso zifität, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 28.
34. Antikörper gemäss Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass eine der dualen Spezifitäten gegen ein Zielantigen und die andere gegen eine Substanz gerichtet ist, welche die Diagnose des Zielantigens erlaubt.

55 35. Antikörper gemäss Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz, welche die Diagnose erlaubt, radiomarkiert ist oder mit einem Radionuklid, einem fluoreszierenden Teil oder mit einem Enzym markiert ist.
36. Antikörper gemäss Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, 60 dass die Substanz ein Hapten ist.
37. Antikörper gemäss Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz radiomarkiert ist, wobei das Radionuklid direkt an das Hapten gebunden ist.
38. Antikörper gemäss Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, 65 dass eine der Spezifitäten gegen ein Zielantigen und die andere gegen ein Hapten gerichtet ist, wobei das Hapten ein letales Mittel für das Antigen oder fur das assoziierte Gewebe ist oder an ein solches gebunden ist.

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39. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das letale Mittel ein Radionuklid oder ein Gewebetoxin ist.
40. Hybrider Antikörper gemäss Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Radionuklid mittels eines Chelatie-rungsmittels an das Hapten gebunden ist.
41. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss einem der Ansprüche 35, 36, 37 oder 40, dadurch gekennzeichnet, dass das Radiolabel ein Gamma-Strahlungs-Emitter ist.
42. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz fluoreszierend ist.
43. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Hapten fluoreszierend ist.
44. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass der fluoreszierende Rest an das Hapten gebunden ist.
45. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz, welche eine Diagnose erlaubt, ein Enzym ist.
46. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym an das Hapten gebunden ist.
47. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss einem der Ansprüche 34 bis 37 und 40 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielantigen ein mit einem Leiden assoziiertes Antigen ist.
48. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein tumor-assoziiertes Antigen ist.
49. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Radionuklid direkt an das Hapten gebunden ist.
50. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Radionuklid an das Hapten mittels eines Chelatierungsmittels gebunden ist.
51. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss einem der Ansprüche 39, 49 oder 50, dadurch gekennzeichnet, dass das Radionuklid ein a- oder ß-Strahlungs-Emitter ist.
52. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das letale Mittel ein Gewebetoxin ist.
53. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebetoxin in einer Ricin A-Kette ist.
54. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss einem der Ansprüche 38, 39,49, 50, 51, 52 oder 53, dadurch gekennzeichnet, dass das Ziel-Antigen ein mit einem Leiden assoziiertes Antigen ist.
55. Hybrider, monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein tumor-assoziiertes Antigen ist.