CH655231A5

CH655231A5 - Verfahren zum herabsetzen des nitratgehaltes von tabak.

Info

Publication number: CH655231A5
Application number: CH5574/79A
Authority: CH
Inventors: Lawrence Edmond Gravely; Vernon Louis Geiss; Charles Fred Gregory
Original assignee: Brown & Williamson Tobacco
Priority date: 1978-06-15
Filing date: 1979-06-14
Publication date: 1986-04-15
Also published as: DE2922284A1; DE2922284C2; BE876994A; US4556073A; GB2028628A; FR2437795A1; GB2028628B; FR2437795B1; CA1244363A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak.

Es ist aus unterschiedlichen Gründen oftmals wünschbar, den Nitratgehalt von Tabak zu verringern. So wurden 60 in den letzten Jahren Zigaretten mit niedrigem Schadstoffge-halt vom Verbraucher immer häufiger akzeptiert. Auch wurde die Nachfrage nach derartigen Zigaretten verstärkt und es kamen verschiedene Techniken zur Anwendung, um solche Schadstoffe zu reduzieren.

65 Im Bestreben, den Nitratgehalt zu reduzieren, umfassten die bekanntesten Verfahren die Verwendung chemischer Stoffe, welche selektiv durch Jonenverzögerungstechniken (US-PS 3 847 164) und Jonenaustauschtechniken (US-

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PS 3 616 801) Nitrat aus Tabakextrakten entfernen. Es ist indessen kein Behandlungsverfahren bekannt geworden, welches die Herabsetzung im Tabak durch die Verwendung von Mikroorganismen einschliesst.

Es soll ein Verfahren zum Behandeln von Tabak geschaffen werden, um dessen Nitratgehalte zu verringern, welcher Tabak, wenn einem Tabakprodukt zugemischt, den Rauch des Produkts mit geringerem Stickoxid und Wasserstoffzya-nid beaufschlagt und dies ohne Verlust von wünschbaren Geschmacks- und Geruchseigenschaften oder anderen Rau-cher-Charakteristiken.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, welches durch den kennzeichnenden Teil des Anspruches 1 offenbart wird.

Die Erfindung wird anschliessend beispielsweise erläutert. Dabei zeigt die Figur einen Verfahrensablauf.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass gewisse Mikroorganismen in wässeriger Lösung Nitrat des Tabaks abbauen, wenn sie mit Tabak in Berührung kommen. Es wurde festgestellt, dass in Tabak, welcher mit einer reinen Kultur eines in einem Nitrat enthaltenden Medium gewachsenen Mikroorganismus geimpft wird, Nitrat abgebaut wird. Dabei wird ein Tabak erhalten, welcher, wenn er in eine Zigarettenmischung von Tabaken beigefügt wird, dazu beiträgt, die Abgabe von Stickoxiden und Was-serstoffzyanid herabzusetzen. Eine Kultur umfasst Micrococcus denitrificans (Paracoccus denitrificans der American Type Culture Collection Accession No. 17 741), wie dies in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, herausgegeben von R. E. Buchanan and N. E. Gibbons, Seiten 438-439, 8. Auflage, beschrieben ist.

Werden aber die Verfahrensschritte (a und b) des Patentanspruchs 1 benutzt, so ist es auch möglich, Kulturen wie Micrococcus halodenitrificans, Alcaligenes faecalis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Erwinia caroto-vora, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Thiobacil-lus denitrificans zu verwenden. Es können ferner Nitrat enthaltende Verbindungen in Kombination mit Mikroorganismen, wie Kaliumnitrat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat u. dgl. verwendet werden.

Wenn eine Kultur gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist es praktisch, Tabakblätter oder -Stengel zu behandeln, und Nitrat darin abzubauen und den behandelten Extrakt auf ursprünglichen Tabak einwirken zu lassen. Die Fähigkeit, den Extrakt zu behandeln und ihn dann wiederum auf den Originaltabak einwirken zu lassen, vermeidet die löslichen Gewichtsverluste, welche bei der Verwendung der Wasserextraktion und von Endlauge als Mittel, um Nitrat abzubauen, auftreten. Dieses Vorgehen vermeidet auch den Verlust anderer wünschbarer Tabakkomponenten, welche bei Wasserextraktion und Endlauge auftreten. Das Verfahren ist auch in rekonstituierten Tabak-Herstellungsanlagen verwendbar, in welchen der Tabak extrahiert und der Extrakt in nachfolgenden Verfahrensschritten zurückgeführt wird, da dieses Enzym- (mikrobiale) System in einem Flüssigkeitssystem sehr wirksam ist. Im Verfahren wird das Nitrat abgebaut in gasförmigen Stickstoff übergeführt, welcher in die Atmosphäre abgelassen wird. Es wurde auch festgestellt, dass die Nitrat enthaltende Verbindung im wässerigen Medium mindestens 0,1 Gew.%, vorzugsweise ungefähr 1 Gew.%, sein muss. Obschon höhere %-Zahlen von Nitrat enthaltendem Material verwendet werden können, bringen steigende Mengen von z.B. über 1 Gew.% keine merkliche Verbesserung im Abbauprozess der Mikroorganismen.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht ein vorzugsweises Verfahren zum Abbauen des Nitratgehalts von

Tabak im Herstellen eines wässerigen Mediums, welches Mikroorganismen enthält und Nitrate abbaut.

Bei der Herstellung eines wässerigen Mediums wird eine Nähragar- (Erst) Lösung hergestellt, indem ein handelsübli-5 ches Nähragar destilliertem Wasser zugefügt wird, wobei die Menge Agar im allgemeinen mindestens 5 g/lt beträgt. In einem vorgeschlagenen Verfahren wird dazu eine Nitrat enthaltende Verbindung beigegeben, vorzugsweise Kaliumnitrat im Verhältnis von mindestens 0,1 Gew.% Nitrat pro io Volumen Wasser und im allgemeinen ungefähr 1 Gew.% von Nitrat pro Volumeneinheit Wasser.

Diese Lösung wird dann in geneigten Röhrchen sterilisiert. Es werden m.a. W. Reagenzröhrchen, sog. Teströhr-chen, welche den Agarnährboden enthalten, geneigt sterili-is sert, um eine geneigte Oberfläche des Nährbodens zu ergeben. Dies erfolgt in einem Autoklaven während mindestens 15 min bei mindestens 1,03 • 10s Pa Überdruck und bei mindestens 121 C. Der sterilisierte Nährboden wird dann in einem Kühlschrank zur späteren Verwendung gelagert.

20 Es wird eine zweite Lösung hergestellt, welche eine Nitrat enthaltende Verbindung enthält. Diese wird durch die auf dem ersten Medium gezogenen Kulturen behandelt. Eine derartige zweite Lösung kann eine Nitrate enthaltende Nährbrühe sein, welche durch Auflösung eines im Handel 25 erhältlichen Nährproduktes in destilliertem Wasser erhalten wird, wobei die Menge des Nährmittels ungefähr 5-10 g pro Liter beträgt. Der Fachmann kann die Nährlösungskonzentration ändern, um zweckmässige Kulturen zu erhalten. Diese Lösung wird ebenfalls während mindestens 15 min bei 30 mindestens 1,03 • 10s Pa Überdruck und 121 °C oder mehr in einem Autoklaven sterilisiert. Kaliumnitrat oder andere Nitrat enthaltende Verbindungen können zu dieser Lösung beigegeben werden, bevor sie sterilisiert wird.

35 Ein anderes Beispiel einer derartigen zweiten Lösung ist eine Tabakextrakt-Kraftbrühe, welche Nitrate enthält. Die Tabakextraktbrühe wird hergestellt, indem normalerweise ungefähr 100 g Tabakmaterial, z.B. eine rauchgasbehandelte (geräucherte) Burley-Stengelmischung mit ungefähr 1000 ml 40 Wasser gemischt wird und dann die Mischung in einem Autoklaven während 30 bis 60 min bei mindestens 1,03 • 10s Pa Überdruck und mindestens 121 °C gekocht wird.

Der sich ergebende Flüssigkeitsextrakt wird dann abgeschüttet und das Flüssigkeitsvolumen durch Zugabe von de-45 stilliertem Wasser auf die ursprüngliche Extraktmenge gebracht. Der Extrakt wird hierauf mit Hefeextrakt gemischt, wobei der Hefeextrakt im allgemeinen mindestens 0,3 Gew.%) pro Volumen Flüssigkeit enthält. Es können indessen auch höhere Gehalte von Hefeextrakten verwendet so werden. Die Mischung wird in Flaschen abgefüllt, mit Baumwoll-Wattebauschen verschlossen und während mindestens 15 min bei 1,03 • 105 Pa Überdruck oder höher und 121 °C oder höher sterilisiert. Sie dient dem anschliessenden Züchten von Kulturen. Vor der Verwendung als Nährboden 55 wird der pH-Wert mit entsprechender Säure- oder Basezugabe auf ungefähr 7,2 eingestellt.

Der Mikroorganismus, Micrococcus denitrificans, wird auf den Agarnährboden, welcher die Nitrat enthaltende Ver-6o bindung aufweist, geimpft und während 3-5 Tagen bei 5 C bis 37 CC gehalten. Die dann gewachsene Kolonie wird zum Impfen der pH-justierten Tabakextraktbrühe verwendet, wobei der Impfstoff durch Waschen der geneigten Nährbodenoberfläche mit einer vorbestimmten Menge sterilen, de-65 stillierten Wassers erhalten wird. Die geimpfte Tabakextraktbrühe wird dann während im allgemeinen 24 Std. bei ungefähr 5-37 C geschüttelt, um das Wachstum der beigegebenen Mikroorganismen zu fördern.

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Der daraus resultierende Impfstoff ist dann zum Behandeln einer zusätzlichen Tabakmenge gebrauchsfertig, um deren Nitratgehalt zu senken.

Bei der Behandlung festen Tabakmaterials wird der pH-Wert des Tabaks mit einer Lauge/Wassermischung auf ungefähr 7,0-7,2 eingestellt. Die Kultur wird dann mit zusätzlichem Wasser zugesetzt und der so behandelte Tabak in den Kunststoffbeutel gebracht, wo sich Nitrat abbaut.

Die Erfindung wird anschliessend beispielsweise erläutert.

Beispiel 1

Das folgende Beispiel zeigt das Vorgehen beim Herstellen einer Impflösung.

(a) Agarnährboden + 1,0% Kaliumnitrat

Handelsüblich hergestellter Agarnährboden (in dehydrierter Form) von den Difco Laboratorien wurde zu destilliertem Wasser im Verhältnis von 23 g/Liter zugegeben. Die 23 g des Agarnährstoffes enthielten 3 g Rindfleischextrakt, 5 g Pepton und 15 g Agar. Zu dieser Lösung wurde 1 Gew.% Kaliumnitrat pro Volumen Wasser zugegeben. Die erhaltene Lösung hatte einen End-pH-Wert von 6,8.

Dieses Produkt wurde dann in geneigten Röhrchen in einem Autoklaven während 15 min bei 1,03 • 105 Pa Überdruck und 121 °C sterilisiert, anschliessend gekühlt und zum späteren Ziehen von Kulturen bereitgehalten.

(b) Nährbrühe

Es wurde eine Lösung einer Nährbrühe durch Beigabe von dehydratierter Nährbrühe von Difco Laboratorien in einer Menge von 8 g pro Liter destilliertem Wasser hergestellt. Die Nährbrühe enthielt 5 g Pepton und 3 g Rindfleischextrakt. Die erhaltene wässerige Lösung wurde dann während 15 min bei 1,05 atü und 121 °C zwecks späteren Gebrauchs zum Herstellen von Kulturen sterilisiert.

(c) Rauchgasbehandelte Burley-Stengel-Tabakextraktbrühe

Eine rauchgasbehandelte Burley-Stengel-Tabakextrakt-

brühe wurde durch Beigabe von 100 g rauchgasbehandelten Burley-Stengeln zu 1000 ml Wasser hergestellt und in einem Autoklaven für 40 min bei 1,03 • 105 Pa Überdruck und 121 °C gekocht. Der erhaltene Extrakt wurde abgeschüttet und das Flüssigkeitsvolumen mit destilliertem Wasser auf den ursprünglichen Ausgangswert gebracht. Die Flüssigkeit wurde dann mit Hefeextrakt (YE) im Verhältnis von 0,5 Gew.%) Hefeextrakt pro Volumen Flüssigkeit gemischt und die Mischung in Flaschen abgefüllt, welche dann mit Wattebauschen verschlossen und während 15 min bei 1,03 ■ 105 Pa Überdruck und 121 °C als Nährboden für Kulturen sterilisiert wurde.

(d) Brüheimpfung

Die Mikroorganismen, Micrococcus denitrificans (American Type Culture Collection Accession Number 17 741), werden auf die geneigte Oberfläche des Agarnährbodens aufgeimpft und während 3-5 Tagen bei 30 C belassen.

Das flüssige Medium, beispielsweise Nährlösung oder rauchgasbehandelte Burley-Stengel-Tabakextraktbrühe, wird mit einer aus der sterilen Wasserwaschung der Nährbodenoberfläche erhaltenen Brühe mit einer 2% (v/v) Rate (Menge) inokuliert. Der pH-Wert der Brühe vor der Inokulation wird mit Salzsäure oder Natriumhydroxid auf einen Wert von 7,2 bis 7,5 eingestellt. Die Flaschen werden dann während ungefähr 24 Std. bei 30 rC und 160 Umdrehungen pro min rotiert.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt den Abbau von Nitrat, welcher sich bei rauchgasbehandeltem Burley-Stengelextrakt und rauch-gasbehandeltem Stengelextrakt ergibt.

5 Micrococcus denitrificans (Am. Type Culture Collection Accession Number 17 741) wurde in rauchgasbehandeltem Burley-Stengelextrakt (+ 0,5% YE) gezogen, wie dies gemäss Beispiel 1 erläutert ist sowie in rauchgasbehandeltem Stengelextrakt folgenderweise zugerichtet:

6,8 kg rauchgasbehandelter Stengel wurden in 109 kg Wasser bei 90 °C während 30 min extrahiert. Der Extrakt wurde abzentrifugiert, gesammelt und Hefeextrakt in einer Menge von 0,5% Gewicht/Vol. zugesetzt. Die Mischung ls wurde während 15 min bei 1,03 • 105 Pa Überdruck und 121 C sterilisiert.

Beide Medien wurden, nachdem ihr pH-Wert eingestellt war, mit vier Tage alter abgewaschener Kultur mit einer 20 Menge von 10%) (v/v) geimpft und bei 160 Umdrehungen/ min und 30 °C während 24 Std. in Erlenmeyer-Kolben (250 ml/500 ml Flaschenvolumen) inkubiert.

Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammen-25 gestellt:

Medium Inkubationszeit N03

30 (Std.) pH (|ig/ml)

Rauchgasbehandelter Burley-Stengel-Extrakt

+ 0,5%) Hefeextrakt 0 ~7,50 2500

35 16 8,10 59

20 8,29 57

24 - — 55

Rauchgasbehandelter Stengel-Extrakt

40 +0,5% Hefeextrakt 0 ~7,50 716

16 — 699

24 7,96 66

45

Es ist ersichtlich, dass das Nitrat in beiden Extrakten im wesentlichen abgebaut wurde.

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Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Wirkungen der Belüftung der 55 Kulturmasse während des Nitratabbaues bei Verwendung von Micrococcus denitrificans-Kulturen.

Eine Kultur Micrococcus denitrificans (ATCC 17 741) wurde auf Nähragar + 1% KN03 Schrägflächen gezogen 60 und dann in rauchgasbehandelter Burley-Stengel-Extrakt-brühe mit 0,5% Hefeextrakt in Schüttelflaschen gemäss Beispiel 1 gezogen.

Diese Kultur wurde in zwei gleiche Teile geteilt und als Impfstoff für zwei unterschiedliche Fermentatoren derselben 65 Brühe +0,5% Hefeextrakt verwendet.

Die Wachstumsparameter für die Kultur in jedem Fer-mentator waren:

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Parameter

Fermentator A

Fermentator B

Medium

Volumen (Liter)

Bewegung (Umdrehung/min) Belüftung (cc/min) Temperatur (C) pH Einstellung/Prüfung Impfmenge (% v/v)

(aus den Flaschen) Säurekontrolle (2N) Laugenköntrolle (2N)

Rauchgasbehandelter Burley-

Stengel-Extrakt

+0,5% YE

8

300 2000 30 7,8 5

HCL NaOH

Rauchgasbehandelter Burley-Stengel-Extrakt +0,5% YE

8

300 0 (Keine)

30 7,8 5

HCL NaOH

Die Wachstumsresultate der Kultur unter diesen Bedingungen wird anschliessend angeführt.

Fermentator A Fermentator B

(Belüftet) (Unbelüftet)

Wirkzeit

Zellen

no3

Zellen

no3

(X106/ml)

PH

(Hg/ml)

(X106/ml)

pH

(Hg/ml)

Vor der Impfung

0

6,78

2630

0

6,99

2900

Impfstoff

9 500

8,10

0

9500

8,10

0

0 Std. nach Impfung

370

7,91

2690

90

7,84

2590

16 Std. nach Impfung

7 100

7,82

560

4 500

7,85

350

17 Std.-nach Impfung

—

7,83

0

—

7,92

34

18 Std. nach Impfung

8600

7,82

0

3700

7,95

34

19 Std. nach Impfung

—

7,81

0

—

7,95

34

21 Std. nach Impfung

10 400

7,81

0

3400

7,97

33

22,5 Std. nach Impfung

9 900

7,75

0

3800

7,94

33

Diese Kulturen wurden dann zur Behandlung von Burley-Blatt-Tabak mit den folgenden Resultaten verwendet:

Belüftete Impflösung Unbelüftete Impflösung aus dem Fermentator A aus dem Fermentator B

Behandlungszeit Nasser Tabak N03 Nasser Tabak N03

(Std.) (pH) (%) (pH) (%)

Geimpfter Tabak 1

0 7,11

24 8,27

Nicht geimpfter Tabak 2 0 7.17

24 7,60

1 Alle Behandlungen wurden wie folgt durchgeführt: 90 gm Trockengewicht des Burley-Blatt-Tabaks 20 ml IN NaOH 116 ml H20 134 ml Impflösung

30'C in Kunststoff-Beuteln mit gedrosselter Luftzufuhr

3,27 7,52 " 3,41

0,57 8,13 1,30

3,14 7,20 2,85

3,32 7,49 2,90

2 Alle Tests wurden wie folgt ausgeführt: 90 gm Trockengewicht Burley-Blatt-Tabak 20 ml IN NaOH 250 ml H20 Keine Impflösung

Bei 30'C in Plastikbeuteln mit gedrosselter Luftzufuhr

Es geht daraus hervor, dass die belüftete Kultur am meisten Zellmasse produzierte und die Tabakblätter bezüglich Nitrat am besten abbaute. Die nicht belüftete Kultur baute indessen auch eine grosse Menge Nitrate des Tabakblattes ab. Tabak, welcher unter den angegebenen Bedingungen behandelt wurde, kann für Tabakprodukte verwendet werden und zwar für beide erwähnten Fälle.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt den Nitratabbau eines geimpften Tabaks.

«s Fünf Pfund (2,26 kg) Burley-Tabak wurden mit einer bt lüfteten Kultur von Micrococcus denitrificans (ATCC 17 741) während 22 Std.. wie im Beispiel 3 beschrieben, behandelt. Der behandelte Tabak wurde bei 30 °C in einem

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Kunststoffbeutel unter Verwendung folgenden Materials als Haufware, verpackt:

Impflösung (ml) - 2 880

Tabakgewicht (gm) - 2 270

IN NaOH (ml)-449,5

Leitungswasser (ml) - 2 572

Die Behandlungsresultate waren die folgenden:

Behandlungszeit (Std.)

Nasser Tabak pH N03 (%) 10

Geimpfter Tabak (2270 gm Tabakgewicht)

0 6,98

18 7,44

21 7,58

Ungeimpfter Testtabak (90 gm Tabakgewicht)

0 7,14

21 7,24

2,95 1,82 1,44

2,78 3,21

Aus diesen Zahlen geht hervor, dass der Nitratgehalt des behandelten Tabaks von 2,95% auf 1,44% (eine 51%-ige Abnahme) sank, während der Nitratgehalt des Vergleichsmusters nicht abnahm.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Abnahme von Stickoxiden (NOx) und Wasserstoffcyanid (HCN) im Rauch eines Tabakproduktes bei Verwendung eines Tabaks, welcher dem

Nitratabbau durch Mikroorganismen der Art Micrococcus denitrificans ausgesetzt wurde.

908 g Burley-Blatt-Tabak wurden mit 2864 ml Micrococcus denitrificans, die im rauchgasbehandelten Burley-Stengel-Extrakt gezogen wurden, gemäss Beispiel 1 gemischt. Es wurde kein zusätzliches Wasser beigesetzt und vor der Impfung kein pH-Wert eingestellt. Der Tabak wurde sorgfaltig gemischt und in einen Plastikbeutel gebracht, um bei 30 C während 24 Std. inkubiert zu werden,

Behandlungszeit (Std.) Nitrat (%) pH

Feuchtigkeit (%)

0

15 18 24

2,13.

1,57

0,91

7,25 7,95

'75 -75

In dieser Täbakbehandlung diente die Impfflüssigkeit drei Dingen: __ __

20 (1) Der Anpassung des Ausgangs-pH-Wertes des Tabaks (pH bei ~ 5,8 als Ausgangswert).

(2) Erhöhung der Tabakfeuchtigkeit (Ziel 75%)

(3) Zusatz von Kulturen, um Nitrat abzubauen.

Nach der mikrobialen Behandlung wurden die Burley-

25 Tabake mit anderen Standard-Mischungskomponenten gemischt, wobei in der Mischung der totale Nitratgehalt 1,16% betrug, verglichen mit 1,69% in der nicht behandelten Kontrollmischung.

Die einzelnen Mischungen wurden zu Zigaretten verar-30 beitet und unter konstantem Zug in einer Rauchermaschine geraucht.

Die Resultate waren:

Per Rauchzug

Muster ' Mischung NOx HCN Züge

Nitrat (%) (ng) (ng)

Unbehandelte Testmischung 1,69 40 13,5 7,2

Behandelte Mischung 1,16 33 11,8 7,3

j ' .... -

Daraus geht hervor, dass die Stickoxide im Rauch in demjenigen Muster, welches behandelten Tabak enthielt, merklich reduziert wurden (17,5%). Auch in dem behandelten Tabak enthaltenden Muster wurde der Wasserstoffzya-nidgehalt verringert (12,6%>). Alle anderen anfallenden Komponenten blieben praktisch unverändert.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Abnahme von Stickoxiden (NOx) und Wasserstoffcyanid (HCN) in einem Tabakprodukt, in welchem der verwendete Tabak einem Nitratabbau durch Mikroorganismen Micrococcus denitrificans unterworfen worden war.

45 Micrococcus denitrificans (ATCC No, 17 741) wurde, wie im Beispiel 3 erläutert, gezüchtet (Fermentator «A» Be-dindungen) und verwendet, um Burley-Tabak während 24 Std. in geschlossenen Plastikbeuteln bei 30 °C zu behandeln. Das Nitrat im gezogenen Medium war in 17 Std. verarmt, so Die folgenden Mengen Material wurden verwendet: Impfstoff (ml) - 1 716 IN NaOH (ml)-270 Wasser (ml)- 1 555 Tabak (gm)-1 362 55 Die Tabak-Behandlungsresultate waren wie folgt:

Behandlungszeit (Std.) Nasser Tabak N03 Feuchtigkeit (%)

pH (%)

Geimpfter Tabak

0 7,21 2,51 75,7

21 7,70 1,33 73,9

24 •• 1,33 —

Luftgetrocknet 8,28 1,41 —

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Nach der Behandlung wurde der Burley-Blatt-Tabak mit andern Tabakkomponenten verschnitten und zu Zigaretten verarbeitet, um anschliessend mit konstantem Zug in einer Rauchermaschine geraucht zu werden. Ein Kontrollprodukt ohne behandelten Blatt-Tabak, welches aber unbehandelten Burley-Blatt-Tabak enthielt, wurde ebenfalls mittels der Maschine geraucht.

Die Resultate waren:

Mischung Per Zug angefallene Stoffe

Beispiel Nitrat (%) NOx (ng) HCN (|ig) Züge

Kontrolle 1,70 61 33 7,04

Versuch 1,36 49 30 7,08

Aus diesen Daten geht hervor, dass im Produkt, welches den behandelten Tabak enthielt, Stickoxide wesentlich reduziert wurden (19,7%). Auch Wasserstoffcyanid wurde in dem behandelten Tabak enthaltenden Produkt verringert (9,1%).

Beispiel 7

Dieses Beispiel zeigt das Verfahren zum Extrahieren von Blatt-Tabak mit Wasser, um Nitrat abzubauen, wobei der Extrakt mit Micrococcus denitrificans (ATCC No. 17 741) behandelt wurde, um das darin vorhandene Nitrat abzubauen und dann den veränderten Extrakt in die Originaltabakmenge zurückzuführen.

Ein Tabakextrakt wurde dadurch erhalten, dass man 100 g eines Burley-Blatt-Tabaks mit einem Liter Wasser mischte und bei Raumbedingungen während 2 Std. stehen Hess. Dann wurde der Extrakt durch Dekantieren der Flüssigkeit gesammelt und der Tabak gepresst, um die zusätzliche Flüssigkeit aus diesem auszupressen. Der Tabak wurde zum Trocknen in Raumluft ausgebreitet, während der Extrakt (cirka 700 ml) einer mikrobialen Behandlung unterworfen wurde.

Eine reife Kultur von Micrococcus denitrificans wurde auf rauchgasbehandeltem Burley-Stengel-Extrakt gezogen und, wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, und dann dem Tabakextrakt, wie dies im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist, im Verhältnis von 10% (v/v) beigegeben. Vor der Zugabe der Kultur wurde der pH-Wert auf 7,0 + 0,1 angehoben. Die Kultur wurde im Extrakt in einem Erlenmeyer-Kolben mit einem Drehrührer bei 30 °C inkubiert. Die folgenden chemischen Änderungen stellten sich während der 18 Std. dauernden Inkubationszeit ein:

Micrococcus denitrificans-Behandlung von Burley-Blattextrakt

N03 (ng/ml)

Burley-Blattextrakt 1872

Reife Micrococcus denitrificans-Kultur 64

Extrakt nach der Behandlung ( 18 Std.) 66

Die Daten zeigen, dass durch diese Behandlung Nitrat im wesentlichen vollständig abgebaut wurde (~ 96%).

Nach 18 Std. Inkubationszeit wurde der behandelte Extrakt zum ursprünglich extrahierten Tabak zurückgeschüttet und zwar infolge des grossen Volumen behandelten Extraktes in drei Stufen.

Dies wurde dadurch vollzogen, dass ein Teil zugegeben wurde, behutsam gemischt und luftgetrocknet vor der nächsten Zugabe. Die folgenden chemischen Änderungen ergaben sich aus diesem Verfahren:

Tabak-Analyse

N03 (%)

Burley-Blatt-Tabak vor der Extraktion 1,96

Burley-Blatt-Tabak nach der Extraktion 0,72

Burley-Blatt-Tabak nach der Behandlung i5 mit behandeltem, rückgeführtem Extrakt 0,44

Die Daten zeigen, dass 77% des Nitrats durch die Micrococcus denitrificans-Behandlung abgebaut war.

Die aus diesem Verfahren resultierenden Tabake wurden zur Herstellung von Typ-Bearbeitungen verwendet. 20 In gewissen, rekonstituierten Tabakherstellungsverfahren stellt der Schritt des Extrahierens löslicher Tabaksubstanzen einen integralen Teil des ganzen Behandlungsverfah-rens dar. Es wäre möglich, den sich ergebenden, extrahierten Tabak im Sinne der Papierherstellungstechniken in einem 25 Grundbogen zu erstellen, welchem der Extrakt, in dem Nitrat durch mikrobiale Behandlung abgebaut wurde, in üblicher Weise beigefügt werden könnte.

Beispiel 8

30 Dieses Beispiel zeigt einige Unterschiede im Endprodukt, welche sich einstellen können, wenn im Zusammenhang mit der Tabakextraktion eine Ultrafiltrations-Anlage verwendet wird, wobei die Extraktbehandlung und die Rückführung des Extraktes wie im Beispiel 7 erfolgen. Der in diesem Bei-3S spiel verwendete Tabak stammte aus derselben Quelle wie derjenige gemäss Beispiel 7.

Ein Burley-Blattextrakt wurde, wie im Beispiel 7, hergestellt. Der Extrakt wurde dann vor der Impfung mit einem Filter von 0,2 Mikron Porengrösse in einer Amicon-Ultra-40 filtrations-Anlage (Modell TCF10) behandelt, wonach der gefilterte Extrakt mit Micrococcus denitrificans (ATCC No. 17 741) behandelt wurde, wie dies im Beispiel 7 beschrieben ist. Als nachfolgende Behandlung wurde der Extrakt wiederum gefiltert (0,2 Mikron Filterporengrösse) bevor er zum 45 Tabak zurückversetzt wurde. Das vom Filter zurückgehaltene Material der ersten Filtration und das durch den Filter durchgegangene Material von der zweiten Filtration wurden in den extrahierten Tabak zurückgegeben.

Das durch den Filter während der zweiten Filtration zu-50 rückgehaltene Material wurde nicht in den Tabak zurückgegeben. Die folgenden chemischen Veränderungen ergaben sich in diesem Extrakt:

55 Chemische Veränderungen durch Ultrafiltration und Micrococcus denitrificans-Behandlung von Burley-Tabak

N03 (ng/ml)

Burley-Blattextrakt 1872

Reife Micrococcus denitrificans-Kultur 64

60 Extrakt nach der Filterung 2028

Extrakt nach der Micrococcus denitrificans-Behandlung 646

Im Tabak wurden während der Extraktion und der Behandlung die folgenden chemischen Veränderungen festge-65 stellt:

Tabak-Analyse - Burley-Blatt-Tabak N03 (%)

Vor der Extraktion 1,96

655 231

Nach der Extraktion 0,72

Nach der Rückführung von behandeltem Extrakt 0,85

Diese Resultate zeigen, dass Nitrat im Extrakt durch Micrococcus denitrificans abgebaut wird, dass sich jedoch, im Gegensatz zum Beispiel 7, kein weiterer Abbau aus dem extrahierten Tabak ergab. In diesem Beispiel kommen während der Rückführverfahren die Kulturzellen nicht mit dem Tabak in Berührung, wogegen im Beispiel 7 die Zellen mit dem Tabak während der Rückführung in Berührung kamen und weitere chemische Veränderungen zur Folge hatten.

Die Tabake, welche aus diesem Verfahren resultierten, wurden zur Herstellung von Typ-Operationen verwendet.

Andere Filter (mit anderen Porengrössen) können für die erste Filtrierung (in Beispielen 7 und 8) verwendet werden, um viele der grösseren extrahierten Moleküle davon abzuhalten, wesentlichem mikrobialem Einfluss ausgesetzt zu werden. Wenn verwendet, würde der resultierende Extrakt weniger verändert sein und es würde daraus ein weniger veränderter Tabak resultieren.

Beispiel 9

Dieses Beispiel zeigt die Beweglichkeit der Micrococcus denitrificans (ATCC Accession No. 19 367) bezüglich Abbau von Nitraten in Tabak.

Micrococcus denitrificans (ATCC Accession No. 19 367) wurde in rauchgasbehandelter Burley-Stengel-Extraktbrühe (+ 0,5% YE) gezogen und behandelt, wie in Beispiel 1 angegeben. Kontroll- und experimentelle Kulturbrühen wurden vor der Verwendung, zwar unter Zuhilfenahme von 2,4 ml von IN NaOH/Flasche auf einen pH-Wert von ~ 7,2 eingestellt. Alle Flaschen wurden bei 30 °C und 160 U/min während 24 Std. inkubiert. Jene Flaschen zum Züchten der Zellen wurden mit einer Menge von 2% (v/v) mit Micrococcus denitrificans (ATCC No. 19 367) geimpft.

Die folgende Tabelle zeigte den Nitratabbau durch diese Kultur:

Satz 1

Zeit (Std.)

pH

N03 ((ig/ml)

s Kontrollbrühe (Nicht geimpft) 0 6

24

10 Versuchsbrühe (Geimpft)

0 6

24

20

7,28 7,19 7,18

7,19 7,10 8,18

2251 2281 2025

1975 2031 51

Micrococcus denitrificans wurde in der gleichen Brühe, wie oben beschrieben, als Kultur gezogen und in verschiedenen Zwischenzeiten chemische Analysen mit den folgenden Resultaten vorgenommen:

Satz 2

Zeit (Std.)

pH

N03 (ng/ml)

25 Kontrollbrühe (Nicht geimpft)

0 6

24

30 Experimentelle Brühe (Geimpft)

0 18 24

35

7,28 7,19 7,18

7,22 7,92 8,17

2251 2281 2025

2226 1605 0

Die experimentellen Kulturen von den Sätzen 1 und 2 wurden verwendet, um Burley-Blatt-Tabak während 24 Std. bei 30 °C in Plastikbeuteln wie folgt zu behandeln:

Behandelte Materialien

Tabak (gm) lNNH40H(ml) Wasser (ml) Impfung (ml)

Behandelt

50

10,3

69,5

Test

50

10,3

139,7

Behandlungszeit

pH

NO3 (%)

Satz 1

Behandelt

OStd.

7,34

2,91

24 Std.

7,28

1,07

Test

OStd.

7,48

2,87

24 Std.

7,09

2,58

Satz 2

OStd.

7,49

3,10

Behandelt

24 Std.

7,43

1,86

Test

OStd.

7,43

3,32

24 Std.

7,04

3,61

Daraus ist ersichtlich, dass Micrococcus denitrificans (ATCC No. 19 367) bis 63% des Nitrats im Burley-Blatt-Tabak abbaute, während der Kontrolltabak geringe Abnahme des Nitrates zeigte.

Beispiel 10

Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit von Micrococcus denitrificans (ATCC Accession No. 17 741) bezüglich des

Abbaus von Nitrat aus einem Extrakt einer rekonstituierten Tabakmischung.

Es wurde ein Wasserextrakt auf die folgende Weise hergestellt:

65 150 g rekonstituierten Tabakes wurde in einem Liter Wasser während ungefähr 1 min in einem Warin-Mischer gemischt. Die Mischung wurde während 10 min bei Raumtemperatur gehalten, wonach die Flüssigkeit abzentrifugiert und

655 231

10

der Rest bis zum ursprünglichen Volumen ergänzt wurde, um bei 121 °C und 1,03 • 105 Pa Überdruck während 15 min sterilisiert zu werden. Hefeextrakt (YE) wurde vor der Sterilisation in einer Menge von 0,5% (Gewicht pro Volumen) beigegeben. Für den Standard-Extrakt wurde rauchgasbehandelter Burley-Stengelextrakt (mit 0,5% Hefeextrakt und wie im Beispiel 1 behandelt) verwendet. Der pH-Wert der Brühe wurde vor der Vornahme der Impfung justiert. Der Standard- (Kontroll-) Extrakt und der experimentelle Extrakt wurden mit Micrococcus denitrificans geimpft.

Es ergaben sich die folgenden Resultate:

Normal-Extrakt

Wachstumszeit (Std.) N03 (fig/ml)

pH

0 1896

7,37

24 0

8,07

: Experimenteller Extrakt

Wachstumszeit (Std.) N03 (|xg/ml)

pH

0 2220 7,31

24 2256 6,95

48 227 7,95

Es ist daraus ersichtlich, dass die Kultur tatsächlich Nitrat eines Extraktes aus rekonstituierten Tabaken abbauen kann.

Test 6,93 3,39

Behandlung 7,49 3,39

Alle Tabake wiesen eine Feuchtigkeit von ungefähr 75% auf. Sie waren bei 30 °C während 24 Std. in Plastikbeuteln gelagert worden. Anaerobe Behandlungen wurden in BBL (Baltimore Biological Laboratories) ausgeführt, wobei «Gaspak» anaerobe System-Flaschen mit BBL-Katalysatoren verwendet wurden, um den atmosphärischen Sauerstoff zu binden.

Es ist daraus ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung sowohl unter anaeroben Verhältnissen als auch in Anwesenheit von Sauerstoff in unkontrollierter Menge ausgeführt werden kann.

Beispiel 12

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der Tabakbehandlung, wenn sie mit Kulturzellen oder mit sog. Faulwasser bzw. Faulbrühe aus der Zellenzucht durchgeführt wird.

Micrococcus denitrificans (ATCC No. 17 741) wurde in Flaschen mit rauchgasbehandelter Burley-Stengel-Extrakt-brühe und 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt behandelt und zwar wie dies im Beispiel I (c) angegeben ist. Die FlaschenBeispiel 11

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung von aeroben und anaeroben Tabakbehandlungen.

Micrococcus denitrificans (ATCC No. 17 741) wurde in s rauchgasbehandelter Burley-Stengel-Extraktbrühe mit 0,5% zugeführtem Hefeextrakt während 24 Std. in einem «New Brunswick Scientific Fermentor» (MF 214) unter den folgenden Bedingungen behandelt:

io Parameter

Rührung (U/min)

300

Belüftung (cc/min)

0

Rauchgasbehandelter Burley-

Stengelextrakt

+0,5% YE

Medium-Volumen (Liter)

8

Temperatur ( °C)

30

Ausgangs-pH (unkontrolliert)

7,8

Impfstoffmenge (%)

5

Impfdauer (Std.)

24

Antischaummittel (Dow Chemical)

p-1200

Zu Beginn und nach 24 Std. wurde die Kultur wie folgt charakterisiert.

N03 pH

(Hg/ml)

0 2169 7,74

24 52 8,20

30 Nach 24 Std. war die Kultur, um Burley-Tabak unter aeroben und anaeroben Bedingungen zu behandeln, verbraucht. Es ergaben sich die folgenden Resultate:

(%) no3

3,27 1,81

7,03 3,79 7,65 1,61

impfung und Inkubation wurden gemäss Beispiel 1 (d) aus-50 geführt. Am Ende der Behandlungszeit wurde die Kultur, wie dies die Figur zeigt, behandelt.

Das folgende resultierte aus den Verfahrensschritten, welche diese Figur zeigt.

55

Tabelle 1: Kultur-Vorbehandlung

Rauchgasbehandelte Burley-Extraktbrühe mit 0,5% YE

Zeit (Std.) N03 pH (Hg/ml)

1618 7,13

1550 7,04

1575 7,20

36 8,02

0 8,18

34 8,15

36 8,26

Zeit 25 (Std.)

Aerobe Behandlungen

Zeit (Std.)

0 24

pH (%) n03 pH

Test 7,20 3,39 7,41

Behandlung 7,59 3,39 7,92

Anaerobe Behandlungen

Kontrolle

0

(Nicht geimpft)

24

Geimpft

0

24

Wiederaufgelöste Zellen

Faulwasser

Gefiltertes Faulwasser

11

655 23t

Wiederaufgelöste Zellen und gefiltertes Faulwasser wurden zum Impfen von getrennten frischen Flaschen von rauchgasbehandelter Burley-Extraktbrühe mit 10 ml/Flasche verwendet (250 ml Extrakt/500 ml Flasche) und diese wurden bei 30 °C während 24 Std. bei 160 U/min unkubiert. Der Extrakt wurde wie im Beispiel 1 hergestellt. Es ergab sich folgendes:

Tabelle 2

Zeit (Std.) N03 pH

(ltg/ml)

Wiederaufgelöste Zellen

0

1530

- 7,0Q ,.

24

0

8,11

Gefiltertes Faulwasser

0

1576

7,11

24

1464

6,99

Die wiederaufgelösten Zellen, die Original-Kultur, das gefilterte Faulwasser und das ungefilterte Faulwasser wurden alle getrennt verwendet, um 50 g Muster von rauchgasbehandeltem Burley-Stengeltabak mit ungefähr 75% Feuchtigkeit während 24 Std. bei 30 °C in Plastikbeuteln zu behandeln. Ein Prüfmuster wurde bezüglich pH-Wert eingestellt und mit Wasser, aber ohne Impfung, behandelt.

Tabelle 3:

Für die Tabakbehandlungen zugegebene Materialien

Tabak behandelt durch: Steriles IN NaOH Impfung destilliertes Base (ml) (ml) Wasser (ml)

140,2 9,8 Keine

96,1 9,8 44,1

Aus diesen Tabakbehandlungen ergaben sich die folgen-den Resultate (Tabelle 4): :

Tabelle 4: Tabakbehandlung

Zeit (Std.) N03(%) pH

20 Kontrolle (Keine Impfung)

0

4,57

6,97

24 :

4,65

7,09

Originalkultur

0

4,41

7,18

24

2,86

7,59

Wiederaufgelöste Zellen

0

4,52

7,01

25

24

0,94

7,65

Faulwasser

0

4,45

7,27

24

4,38

7,13

Gefiltertes Faulwasser

0

4,41

7,07

24

4,48

7,15

Aus den vorstehenden Zahlen ergibt sich, dass das Faulwasser, in welchem die Kultur gezogen worden war, nicht mehr genügend Kulturen besitzt, um die Nitrate im Tabak abzubauen.

Kontrolle (Keine) Originalkultur Wiederaufgelöste Zellen Faulwasser Gefiltertes Faulwasser

60

s

1 Blatt Zeichnungen

Claims

655 231

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak, gekennzeichnet entweder durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) Zusammenbringen von Tabak mit einem wässerigen Medium, welches Mikroorganismen enthält, die Nitrat des Tabaks abzubauen in der Lage sind, und b) Belassen dieses Tabaks unter der Einwirkung der Mikroorganismen während ungefähr 18 Std. und bei einer Temperatur zwischen 5 und 37 °C, oder durch die Schritte aa) Mischen des Tabaks in einer wässerigen Lösung,

ab) Entfernen des Tabaks aus der wässerigen Lösung, wobei eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt und dann entweder fortfahrt mit ac) Zusetzen von Micrococcus denitrificans zur Brühe,

ad) Inkubieren der Micrococcus denitrificans,

ae) Zusetzen der inkubierten Micrococcus denitrificans in dieser Brühe zum Tabak oder mit bc) Abfiltrieren der Tabak-Extraktbrühe durch eine semipermeable Membran, um einen ersten Rückstand zurückzuhalten und den Durchgang von vorbestimmten Extrakt-Komponenten zur Bildung eines ersten Durchganges zu sichern, und bd) dass man dieses erste Durchgangsprodukt mit Micrococcus denitrificans behandelt, um Nitrat abzubauen.
2. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

a) Zusammenbringen von Tabak mit einem wässerigen Medium, welches Mikroorganismen enthält, die Nitrat des Tabaks abzubauen in der Lage sind, und b) Belassen dieses Tabaks unter der Einwirkung der Mikroorganismen während ungefähr 18 Std. und bei einer Temperatur zwischen 5 und 37 °C, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das wässerige Medium eine Nitrat enthaltende Verbindung aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese Nitratverbindung aus der Gruppe Kaliumnitrat, Natriumnitrat oder Ammoniumnitrat gewählt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nitratverbindung 0,1 bis 1,0 Gew.% des wässerigen Mediums beträgt
5. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

a) Zusammenbringen von Tabak mit einem wässerigen Medium, welches Mikroorganismen enthält, die Nitrat des Tabaks abzubauen in der Lage sind, und b) Belassen dieses Tabaks unter der Einwirkung der Mikroorganismen während ungefähr 18 Std. und bei einer Temperatur zwischen 5 und 37 ~C,

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen Micrococcus denitrificans sind.
6. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrungsschritten:

a) Zusammenbringen von Tabak mit einem wässerigen Medium, welches Mikroorganismen enthält, die Nitrat des Tabaks abzubauen in der Lage sind, und b) Belassen dieses Tabaks unter der Einwirkung der Mikroorganismen während ungefähr 18 Std. und bei einer Temperatur zwischen 5 und 37 C, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dieser mikrobiologische Einfluss bei einem pH-Wert von 7,0 bis 9,5 erfolgt.
7. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

a) Zusammenbringen von Tabak mit einem wässerigen Medium, welches Mikroorganismen enthält, die Nitrat des Tabaks abzubauen in der Lage sind, und b) Belassen dieses Tabaks unter der Einwirkung der Mikroorganismen während ungefähr 18 Std., und bei einer

Temperatur zwischen 5 und 37 C, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das wässerige Medium auf folgende Weise hergestellt wird:

a) Man mischt mindestens 5 Gew.% Nähragar mit Was-s ser, um eine erste Lösung zu erhalten,

b) man gibt dieser ersten Lösung 0,1 bis 1,0 Gew. % einer Nitrat enthaltenden Verbindung bei,

c) man sterilisiert diese erste Lösung, indem man sie bei mindestens 1,03 • 105 Pa Überdruck bei 121 °C oder mehr io während einer Zeitdauer von mindestens 15 min sterilisiert,

d) man gibt diesem sterilisierten Medium Micrococcus denitrificans bei und züchtet diese während einer Zeit von 3 bis 5 Tagen bei 5 bis 37 C und e) man entfernt die so erhaltene Kolonie oder Kultur 15 vom Medium.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man das Sterilisieren des ersten Mediums in einem geneigten Teströhrchen durchführt, wobei die geneigte Oberfläche des Mediums als Kulturzuchtfläche dient. 20 9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man ferner eine Tabakextraktbrühe wie folgt erzeugt:

a) Zusetzen von Tabak in Wasser, um eine zweite Lösung zu bilden,

b) Kochen dieser zweiten Lösung in einem Gefäss wäh-25 rend mindestens 40 min bei mindestens 1,03 • 105 Pa Überdruck und einer Temperatur von mindestens 121 °C,

c) Ergänzen der zweiten, gekochten Lösung mit Wasser auf ungefähr das ursprüngliche Volumen,

d) Zumischen von Hefeextrakt in der Menge von 0,1 bis 30 2 Gew% pro Volumenextrakt,

e) Sterilisieren der zweiten Lösung während mindestens 15 min bei mindestens 1,03 • 10s Pa Überdruck bei einer Temperatur von mindestens 121 C und f) Zusetzen der resultierenden Kultur vom Agarnitratbo-35 den zu dieser zweiten sterilisierten Lösung.
10. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

a) Zusammenbringen von Tabak mit einem wässerigen Medium, welches Mikroorganismen enthält, die Nitrat des

40 Tabaks abzubauen in der Lage sind, und b) Belassen dieses Tabaks unter der Einwirkung der Mikroorganismen während ungefähr 18 Std. und bei einer Temperatur zwischen 5 und 37 C,

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den 45 Tabak mit diesen Mikroorganismen in Abwesenheit von freiem Sauerstoff hält.
11. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

a) Zusammenbringen von Tabak mit einem wässerigen so Medium, welches Mikroorganismen enthält, die Nitrat des

Tabaks abzubauen in der Lage sind, und b) Belassen dieses Tabaks unter der Einwirkung der Mikroorganismen während ungefähr 18 Std., und bei einer Temperatur zwischen 5 und 37 C,

55 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Tabak mit den Mikroorganismen in Anwesenheit von Sauerstoffhält.
12. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

60 aa) Mischen des Tabaks in einer wässerigen Lösung,

ab) Entfernen des Tabaks aus der wässerigen Lösung, wobei eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt und dann fortfährt mit ac) Zusetzen von Micrococcus denitrificans zur Brühe, 65 ad) Inkubieren der Micrococcus denitrificans,

ae) Zusetzen der inkubierten Micrococcus denitrificans in dieser Brühe zum Tabak,

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mikro

3

655 23î

biologische Medium durch folgende Schritte hergestellt wird:

a) Mischen von mindestens 5 Gew.% Nähragar mit Wasser zu einer ersten Lösung,

b) Zusetzen von 0,5 bis 1 Gew.% einer Nitrat enthaltenden Verbindung in diese erste Lösung,

c) Sterilisieren dieser ersten Lösung, indem man sie bei mindestens 1,03 • 105 Pa Überdruck und mindestens 121 °C während einer Zeitdauer von mindestens 15 min behandelt,

d) Zusetzen von Micrococcus denitrificans in diese erste Lösung, belassen während einer Inkubationszeit von 3 bis 5 Tagen bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C oder von 5 bis 37 °C.

13/Verfahrennach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nitrat enthaltende Verbindung Kaliumnitrat ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Sterilisation des ersten Mediums in einem geneigten Teströhrchen erfolgt, und dass man die geneigte Oberfläche des Mediums als Impffläche benützt.
15. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

aa) Mischen des Tabaks in einer wässerigen Lösung,

ab) Entfernen des Tabaks aus der wässerigen Lösung, wobei eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt und dann fortfährt mit ac) Zusetzen von Micrococcus denitrificans zur Brühe,

ad) Inkubieren der Micrococcus denitrificans,

ae) Zusetzen der inkubierten Micrococcus denitrificans in dieser Brühe zum Tabak,

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässerige Lösung Wasser ist.
16. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

aa) Mischen des Tabaks in einer wässerigen Lösung,

ab) Entfernen des Tabaks aus der wässerigen Lösung, wobei eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt und dann entweder fortfährt mit ac) Zusetzen von Micrococcus denitrificans zur Brühe,

ad) Inkubieren der Micrococcus denitrificans,

ae) Zusetzen der inkubierten Micrococcus denitrificans in dieser Brühe zum Tabak,

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Brühe nach dem Schritt (ab) sterilisiert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Sterilisieren während mindestens 15 min bei einem Druck von mindestens 1,03-10s Pa Überdruck und einer Temperatur von mindestens 121 °C erfolgt.
18. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

aa) Mischen des Tabaks in einer wässerigen Lösung,

ab) Entfernen des Tabaks aus der wässerigen Lösung, wobei eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt und dann fortfährt mit ac) Zusetzen von Micrococcus denitrificans zur Brühe,

ad) Inkubieren der Micrococcus denitrificans,

ae) Zusetzen der inkubierten Micrococcus denitrificans in dieser Brühe zum Tabak,

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Zugabe der Micrococcus denitrificans Hefeextrakt zur Brühe gegeben wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Hefeextrakt in einer Menge von 0,1 bis

2,0 Gew.% dieser Brühe beigegeben wird.
20. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

aa) Mischen des Tabaks in einer wässerigen Lösung,

ab) Entfernen des Tabaks aus der wässerigen Lösung, wobei eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt und dann fortfährt mit ac) Zusetzen von Micrococcus denitrificans zur Brühe,

5 ad) Inkubieren der Micrococcus denitrificans,

ae) Zusetzen der inkubierten Micrococcus denitrificans in dieser Brühe zum Tabak,

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren ein Bewegen der Lösung umfasst.

io 21. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes von Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

aa) Mischen des Tabaks in einer wässerigen Lösung,

ab) Entfernen des Tabaks aus der wässerigen Lösung, • wobei eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt und dann fort-

i5 fährt mit ac) Zusetzen von Micrococcus denitrificans zur Brühe,

ad) Inkubieren der Micrococcus denitrificans,

ae) Zusetzen der inkubierten Micrococcus denitrificans in dieser Brühe zum Tabak,

20 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Brühe vor der Zugabe von Micrococcus denitrificans zwischen 7,0 und 9,5 eingestellt wird.
22. Verfahren zum Herabsetzen des Nitratgehaltes in Tabak mit den folgenden Verfahrensschritten:

25 aa) Mischen von Tabak in einer wässerigen Lösung,

ab) Entfernen des Tabaks aus der wässerigen Lösung, wobei eine Tabak-Extraktbrühe zurückbleibt,

bc) Abfiltrieren der Tabak-Extraktbrühe durch eine semipermeable Membran, um einen ersten Rückstand zurück-

30 zuhalten und den Durchgang von vorbestimmten Extrakt-Komponenten zur Bildung eines ersten Durchganges zu sichern, und bd) dass man dieses erste Durchgangsprodukt mit Micrococcus denitrificans behandelt, um Nitrat abzubauen,

35 nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

be) dass man das erste, behandelte Durchgangsprodukt durch eine weitere semipermeable Membran filtert, um davon einen zweiten Anteil, welcher die Micrococcus denitrifi-

40 cans einschliesst, zurückzuhalten und den Rest durch die Membrane durchgehen zu lassen, um ein zweites Durchgangsprodukt zu geben,

bf) dass man dieses zweite Durchgangsprodukt mit dem ersten zurückgehaltenen Produkt mischt und

45 bg) dass man die Mischung aus dem zweiten durchgegangenen und dem ersten zurückgehaltenen Produkt dem im Schritt ab abgeschiedenen Tabak zumischt.
23. Tabak, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-6,10,11,15-22.

50

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