CN110786534B - 一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然香料的开发及烟草制品领域，具体涉及一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法，烟草原料或烟草原料的提取物中添加产类胡萝卜素的微生物或产类胡萝卜素的微生物的发酵衍生物，发酵提取发酵物。利用高产类胡萝卜素的微生物对烟梗、烟末及低次烟草等香气前体不足的原料或原料的提取物进行发酵处理，以补充原料本身类胡萝卜素类香气前体的含量，解决原料本身类胡萝卜素类香气前体的不足，再通过后续的醇化或氧化(酶解氧化或化学氧化)工艺，降解原料中类胡萝卜素香气前体以提高烟草提取物中香气成分的含量，解决烟草提取物香气不足的问题。条件易控，简便易操作，原料易得，成本低，具有较好的市场价值和经济效益。

Description

一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法

技术领域

本发明属于天然香料的开发及烟草制品领域，具体涉及一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法。

背景技术

安全与健康问题是社会生活中越来越受到关注的问题，因此降低卷烟产品或电子烟油产品中焦油等有害致癌物的含量是烟草类产品开发的必要趋势。然而，传统降焦手段会在降低焦油等有害物质含量的同时也大幅降低了烟气中香气组分的含量，难以迎合消费者对吸烟满足感。通过，外加香料来补偿烟草香气是一种行之有效的手段。

目前，烟草提取物是烟草香气补偿的重要方式，现有的烟草提取通常来自烟草加工的脚料、废料或者一些低次烟草的提取。但是，由于这些原料本身烟草香气不足，因此，经常采取发酵、酶处理、美拉德反应等方式提供烟草提取的香气。

例如，专利CN 102068032 A中公开了一种利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法，在其所公开的技术方案中利用白地霉产脂肪酶特性，利用白地霉发酵方式降解烟籽中存在的大量油脂，将高级脂肪酸转化为低级脂肪酸或小分子有机酸，从而提高烟籽提取物香料中挥发性有机酸类香组份的含量，提高提取物的香气。文献《废弃上部鲜烟叶美拉德反应制备特色烟用香料》(来源：doi:10.16768/j.issn.1004-874X.2017.09.016，广东农业科学，2017，44(9)：100-105)中公开了一种利用美拉德反应处理大田废弃烟叶提取浸膏，以提高浸膏香气的技术方案，在其技术方案中，120℃加热180min与pH＝12.0强碱性条件下，加速了烟叶提取物内香气组分前体的热解与反应，进而增加了香气组成的产生与释放。专利CN 1732812A中公开了一种利用多种生物酶增强和改善烟草浸膏香气的方法，在其所公开的技术方案中果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖苷酶及上述几种酶的复配被用于改善烟草浸膏的香气，其设计原理是利用上述酶或者其复配将烟叶中所含有糖苷类香气前体水解成致香成分和小分子糖类物质，从而增强和改善烟草浸膏的香气，同时也可将烟草提取物(浸膏)中含有的果胶或纤维素等大分子水解成对增强和改善烟草浸膏香气有用的小分子物质。一种利用废次烟叶制备烟草浸膏的方法(CN105852189)公开了一种利用纤维素酶和枯草杆菌蛋白酶酶降解烟草废末，并通过分子蒸馏方式浓缩获得烟草提取物浸膏，在其公开的方案中纤维素酶及蛋白酶使得大分子的纤维素、蛋白质分解成易于产生香气的小分子的糖和氨基酸，从而增强了提取物的烟草香气。

综上可知，现有的改善烟草提取物的香气技术方案原理大多数是基于通过化学、热解、酶解或者生物发酵等处理手段，提高烟草中大分子的香气前体物质分解，从而增加小分子香气成分的含量，继而改善烟草香气。然而，由于为了提高经济效益，降低成本，市场上多数烟草提取物均来自于低次烟草或者烟末、烟叶碎片、烟梗等卷烟生产下脚料作为原料。然而，这类原料本身品质低于一般烟叶，其中所含有的大分子的香气前体物质含量本身就不足，这使得现有的技术方案，无法弥补这类原料自身香气前体含量不足的缺陷。因此，部分现有技术方案中会在烟草中添加来自于其他植物的提取物，作为增强剂，以补充低次烟草或者烟末、烟叶碎片、烟梗等卷烟生产下脚料本身大分子香气物质含量不足的缺陷。例如，一种烟草增香用烟草浸膏及其制备方法(CN 109619642 A)在利用酿酒酵母发酵烟末之前，添加了来自于杜仲的提取物，以弥补绿原酸等清香组分前体的不足。一种天然烟草增香剂的制备方法及其应用(CN102936535A)则是以合欢花提取物作为弥补烟草本身香气不足的增香剂。然而，由于植物种植周期长、香原料物质含量丰度低等因素影响，植物提取物的价格非常昂贵。因此，弥补低次烟草、烟末、烟叶碎片、烟梗等卷烟生产下脚料等低成原料烟草本香不足问题，是制备高品质香气烟草提取物的关键问题，其解决手段具有重要的市场价值和经济效益。

发明内容

针对于现有烟草提取物增香手段中难以弥补自身原料中大分子香料前体不足的问题，本发明提供一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法。

类胡萝卜素是烟叶中的重要大分子色素，其降解产物是许多重要烟草本香类香气物质，是烟草香气成分的重要前体物质。烟叶中的类胡萝卜素主要包括β-胡萝卜素、新黄质、叶黄素、紫黄质四种，其结构如图1所示。这四种类胡萝卜素在烟叶的干燥、醇化、加热燃烧过程中被微生物、酶及氧化裂解成大量小分子香气物质，包括异佛尔酮、4-酮异佛尔酮、氧化异佛尔酮、烟酮(巨豆三烯酮)、β-二氢大马酮、β-环柠檬醛、藏红花醛、二氢猕猴桃内酯、四氢猕猴桃内酯、ɑ-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、3-酮基-ɑ-紫罗兰醇、ɑ-紫罗兰醇、β-紫罗兰醇、3-酮基二氢紫罗兰酮、大马士酮、3-羟基-β-突厥酮、4-酮基-β-紫罗兰酮等数十中(部分烟草胡萝卜素降解产物结构如图2所示)。类胡萝卜素的降解产物香味阈值低、对烟叶香气贡献率大。例如，β-紫罗兰酮类及其衍生物是烟草中非常重要和含量较高的香味物质。二氢猕猴桃内酯、四氢猕猴桃内酯是烟草中重要的本香化合物，还具有优雅的果香感。烟酮(又称巨豆三烯酮，具有4个同分异构体)能增加烟感、改善烟香和吃味、掩盖杂气，令烟香更柔和丰满，在白肋烟浓缩物中，含有将近10％的烟酮类化学物。此外，异佛尔酮及大马酮与烟草本香的甘甜香气直接相关。然而，在一些非叶片部位如烟末、烟梗等边角废料植物部分，或者低次烟草中植物组织本身含有的类胡萝卜素细胞色素本身低于正常烟草叶片内的色素含量。因此在以这些烟草边角料部分或者品质较低的烟叶为提取原料的烟草提取物中香气品质不够高。

本发明提供一种解决烟梗、烟末及低次烟草中本身香气前体不足的问题，以提升烟草提取物的香气。本发明的技术构思为，利用高产类胡萝卜素的微生物对烟梗、烟末及低次烟草等香气前体不足的原料或原料的提取物进行发酵处理，以补充原料本身类胡萝卜素类香气前体的含量，解决原料本身类胡萝卜素类香气前体的不足，再通过后续的醇化或氧化(酶解氧化或化学氧化)工艺，降解原料中类胡萝卜素香气前体以提高烟草提取物中香气成分的含量，解决烟草提取物香气不足的问题。

作为替代方案，产类胡萝卜素的微生物除微生物自身外，还可以是微生物的发酵衍生物，如发酵液、菌体、溶胞提取物或胡萝卜素发酵粗提物，发酵后再通过醇化或氧化(酶解氧化或化学氧化)工艺降解类胡萝卜素以增加香气降解物的含量。

产类胡萝卜素的微生物包括红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、发夫酵母(Phaffia)、微球菌属(Micrococcal)或雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)等微生物细胞，具有合成类胡萝卜素的能力，其中红酵母属和红球藻属菌株已广泛应用于类胡萝卜素的工业生产合成。微生物细胞合成的类胡萝卜素包括β-胡萝卜素(β-carotene)、番茄红素(Lycopene)、红酵母红素(Torularhodin)、角黄素(canthaxanthin)、变胞藻黄素等，其结构如图3所示。

本发明上述的技术构思方案，条件易控，简便易操作，原料易得，成本低，具有较好的市场价值和经济效益。

本发明的技术方案为，一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法，步骤包括：烟草原料或烟草原料的提取物中添加产类胡萝卜素的微生物或产类胡萝卜素的微生物的发酵衍生物，发酵提取发酵物。烟草原料或烟草原料的提取物经产类胡萝卜素的微生物或产类胡萝卜素的微生物的发酵衍生物的发酵提取，增加其内烟草香气前体类胡萝卜素的含量，尤其适用于改善烟草香气前体含量低的烟梗、烟末及低次烟草及其提取物。

作为优选实施例，烟草原料的提取物中添加产类胡萝卜素的微生物或产类胡萝卜素的微生物的发酵衍生物，发酵提取发酵物。

烟草原料或烟草原料的提取物中添加产类胡萝卜素的微生物或产类胡萝卜素的微生物的发酵衍生物，发酵提取1-3次，合并发酵物；优选发酵提取1-2次，合并发酵物；每次发酵提取，产类胡萝卜素的微生物或产类胡萝卜素的微生物的发酵衍生物的添加量为烟草原料或烟草原料的提取物的0.1％-10％，优选为0.5％-10％。

还包括对发酵物进行氧化处理或醇化处理。氧化处理或醇化处理，可使发酵生成的香气前体类胡萝卜素分解产生香气分子，增加烟草提取物中香气分子的含量，改善烟草提取物的香气。所述氧化处理为酶化氧化或化学氧化，酶化氧化为在发酵物中添加具有氧化活性的酶，使得发酵物中类胡萝卜素氧化分解生成香气分子，所述具有氧化活性的酶为漆酶；化学氧化为发酵物中类胡萝卜素在臭氧及氧自由基氛围中氧化分解生成香气分子。所述醇化处理为类胡萝卜素在酿酒酵母的作用下分解生成香气分子。

所述产类胡萝卜素的微生物的发酵衍生物包括产类胡萝卜素的微生物经发酵所得的发酵液、菌体、溶胞提取物或类胡萝卜素发酵粗提物中任意的一种或组合。

所述产类胡萝卜素的微生物为红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、发夫酵母(Phaffia)、微球菌属(Micrococcal)或雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中任意一种或多种。

优选地，所述产类胡萝卜素的微生物为深红酵母、红法夫酵母、粘红酵母、胶红酵母、海洋红酵母、圆红冬孢酵母、红酵母或锁掷酵母中任意一种或多种。

所述烟草原料包括烟叶、烟梗、烟末或者低次烟草等。

所述烟草原料的提取物为烟叶、烟梗、烟末或者低次烟草等的提取物，可以为提取液也可以为提取浸膏。

附图说明

图1为烟叶中含有的类胡萝卜素类色素的化学结构示意图。

图2为烟叶中的类胡萝卜素降解产物的化学结构示意图。

图3为微生物合成的类胡萝卜素类色素的化学结构示意图。

图4为实施例1深红酵母发酵7天烟草浸膏中关键香气组成的GC-MS检测图谱。

图5为实施例1深红酵母发酵7天并漆酶氧化处理的烟草浸膏中关键香气组成GC-MS检测图谱。

具体实施方式

实施例1利用深红酵母改善烟草浸膏香气

以由烟末、烟梗等烟草废料所提取的烟草浸膏为出发原料，以深红酵母Rhodotorula rubra CICC 32918(来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京市朝阳区)为产类胡萝卜素微生物，对烟草浸膏进行发酵处理。其发酵方法首先为以将深红酵母CICC 32918接种于200mL液体种子培养基中(培养基为葡萄糖40g/L、蛋白胨7g/L、酵母膏3g/L、Ca₂Cl 0.2g/L、维生素B₂ 3.5mg/L)，于30℃下震荡培养24h作为种子液；之后将培养好的深红酵母按照5％接种量接入烟草浸膏中，静置于25℃培养箱内发酵7天和14天。将发酵后的烟草浸膏，取出部分后，按照1％添加量加入漆酶(食品级，10-40万酶活，南极德居生物工程有限公司生产)于35℃下进行进一步氧化处理12h。将发酵的烟草浸膏提取物利用GC-MS进行检测，检测条件为：谱柱HP-5MS弹性石英毛细管柱(60m×0.25mm×0.25mm)，载气HE，恒流模式，柱流速1.2mL/min；进样口温度270℃，分流比10:1，进样量2μl；升温程序：初始温度60℃，保持2.5min，以2℃/min升至170℃，再以4℃/min升至60℃，保持50min。

以发酵处理前烟草浸膏中关键香气成分的浓度计为100％，其相对浓度为(样品中成分的浓度/原始浸膏中成分的浓度×100％)。原始浸膏在利用深红酵母发酵处理之后的关键成分含量变化如表1所列。可发现原始浸膏在经过深红酵母发酵后，其类胡萝卜素降解产物大马酮、烟酮(含四种同分异构体)含量明显升高。同时。但发酵后的浸膏样品通过漆酶的作用处理氧化后，浸膏中的类胡萝卜素降解产物大马酮、烟酮和叶绿素降解产物新植二烯含量还可以进一步提高(GC-MS图谱见附图4和图5所示)，同时漆酶的氧化作用还降低了刺激性的烟碱(尼古丁)的含量，在降低刺激性的同时，增加了烟草提取物的香气组成。

表1深红酵母发酵处理烟草提物关键香气成分相对浓度变化

样品	尼古丁	大马酮	烟酮
				原始浸膏	100％	100％	100％
发酵7天	308.7％	325.9％	178.2％
				发酵7天后氧化处理	5.3％	253.3％	142.4％
发酵14天	239.2％	474.9％	115.3％
				发酵14天后氧化处理	5.6％	1114.1％	229.3％

实施例2利用胶红酵母改善烟草提取物香气

本实施例以胶红酵母SICC 2.506(Rhodotorula mucilaginosa，四川省微生物资源平台菌种保藏中心)为产类胡萝卜素的微生物，对烟草提取物提取原料进行发酵处理，后进行提取。菌株购自标准品信息网(菌株信息：http://www.gbw.org.cn/atcc/cicc/82312.html)。

从斜面培养基中接入到含有80mL的YPD液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min培养24h作为，然后8000rpm离心10钟，将离心分离获得的胶红酵母泥作为接种用菌种。烟草提取物的提取过程为称取烟末、烟梗25g到500mL的三角瓶中，按固液比1∶5加入蒸馏水，瓶口以橡胶塞密封，在80℃巴氏灭菌蒸煮30min，之后冷却至4℃保持20min。加入烟末重量0.5％的胶红酵母泥，同时加入0.5％w/v白砂糖和0.5％w/v酵母粉搅拌均匀后用封口膜密封，在25℃的培养箱中静止培养20天。将发酵后的烟末、烟梗取出倒入1000ml圆底烧瓶，加入95％乙醇300mL，加热50℃并冷凝回流提取1.5h，冷却后用300目网筛过滤，收集提取液。余渣继续按上述方法进行第二次提取，过滤收集第二次提取液。合并两次提取液，在旋转蒸发器上浓缩，浓缩温度55±2℃，得到比重为1.35的浓缩物，作为样品1。同时另取25g未经胶红酵母发酵处理的处理的烟末、烟梗按照相同提取方法进行提取，获得比重为1.34的浓缩物作为对照样1。另外取25g经由上述胶红酵母发酵后的烟末、烟梗，用在湿度60％，温度25℃的密封紫外箱中利用40W紫外灯辐照24h，利用紫外辐照中产生的臭氧及氧自由基对发酵后的烟末、烟梗进行氧化处理，之后按照上述相同的提取工艺进行提取，获得比重为1.35的浓缩提取物，作为样品2。将上述制得的烟草浸膏，按烟丝重量的万分之二用量，用75％乙醇溶解，均匀地喷洒到空白烟丝中，将烟丝制成卷烟进行评吸。评吸在按照《卷烟感官技术要求》进行卷烟感官评定，评定采用综合评定法处理评分结果，以对卷烟感官质量作出科学、公正、准确的判断，评分标准见表2。评定结果如表3所示，通过胶红酵母发酵处理后提取的烟草浸膏加在烟草香气特征方面有明显的提升。该提升来自于胶红酵母产生的类胡萝卜素类使得香气前体含量增加。

表2烟叶感官评价标准

表3发酵处理后浸膏的加香烟叶的感官评价结果

实施例3在烟草浸膏中添加微生物类胡萝卜素提取物改善烟草提取物香气

将来源于烟末和烟梗粉末的提取浓缩液100g分别储存在醇化罐中，同时直接加入不同的微生物类胡萝卜素提取物2g，在45℃温度条件下不停搅拌，醇化5天。利用GC-MS对纯化后烟草浸膏的关键香气成分进行分析。

本实施例中加入的微生物类胡萝卜素提取物包括：

样品1：红法夫酵母发酵提取物，食品级，10:1比例提取物，购自西安优硕生物科技有限公司

样品2：雨生红球藻提取物，食品级，10:1比例提取物，购自西安优硕生物科技有限公司

样品3：圆红冬孢酵母胞溶物，自制备，其制备方法是将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CCTCC AY 207027(购于中国典型培养物保藏中心)，接种于液体培养基中(培养基为葡萄糖40g/L、蛋白胨7g/L、酵母膏3g/L、Ca₂Cl 0.2g/L、维生素B₂3.5mg/L)，于30℃下震荡培养48h，之后离心8000rpm弃除上层的培养基收集菌体；之后加入去离子水重悬菌体后，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，后利用喷雾干燥法干燥成圆红冬孢酵母胞溶物。

本实施例烟草浸膏关键香气成分浓度变化结果如表4所示，结果显示在加入了含有微生物类胡萝卜素的微生物抽提物后，烟草浸膏在醇后其类胡萝卜素降解产物的关键香气成分大马酮和烟酮的含量都大幅增加，高于空白对照。

表4烟草浸膏关键香气成分相对浓度变化

样品	尼古丁	大马酮	烟酮
				醇化前的浸膏	100％	100％	100％
未加入微生物类胡萝卜素提取物	84.3％	113.5％	121.3％
				样品1	56.37％	305.24％	250.10％
样品2	86.73％	248.17％	184.77％
				样品3	85.49％	306.82％	274.42％

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (6)

1.一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法，其特征在于，在烟草原料或烟草原料的提取物中添加产类胡萝卜素的微生物发酵，还包括对发酵物进行添加漆酶酶促氧化处理步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在烟草原料或烟草原料的提取物添加的产类胡萝卜素的微生物替换为产类胡萝卜素的微生物的发酵衍生物或提取物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述产类胡萝卜素的微生物的发酵衍生物包括产类胡萝卜素的微生物经发酵所得的发酵液、菌体、溶胞提取物或类胡萝卜素发酵粗提物中任意的一种或组合。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述产类胡萝卜素的微生物为红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、发夫酵母(Phaffia)、微球菌属(Micrococcal)或雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中任意一种或多种。

5.根据权利要求4所述的方法其特征在于，所述产类胡萝卜素的微生物为圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CCTCC AY 207027，胶红酵母SICC 2 .506，深红酵母CICC32918中任意一种或多种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草原料包括烟叶、烟梗、烟末或者低次烟草；所述烟草原料的提取物为烟叶、烟梗、烟末或者低次烟草的提取物。

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