CN109055326B - 一种产类胡萝卜素降解酶的库特氏杆菌 - Google Patents
一种产类胡萝卜素降解酶的库特氏杆菌 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109055326B CN109055326B CN201811023159.XA CN201811023159A CN109055326B CN 109055326 B CN109055326 B CN 109055326B CN 201811023159 A CN201811023159 A CN 201811023159A CN 109055326 B CN109055326 B CN 109055326B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wine
- carotenoid
- medlar
- kurthia
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种类胡萝卜素降解酶,属于微生物发酵技术领域。所述类胡萝卜素降解酶的制备方法包括在液体培养基接种2%库特氏杆菌种子液,30℃‑35℃,pH=3.0‑3.5,140r/min发酵8‑10h得发酵液;将发酵液于4℃,10000r/min离心100‑150min,取上清液,得类胡萝卜素降解酶粗酶液。所述库特氏杆菌为(Kurthia sp)NXUGQ15,保藏编号为CCTCC NO:M2017524。本发明的保藏菌种所产类胡萝卜素降解酶,粗酶液的酶活8.87U/mL,用其处理枸杞渣或枸杞浆,能够增加枸杞酒的挥发香气成分,改善枸杞酒的品质。
Description
技术领域
本发明涉及一种类胡萝卜素降解酶,属于微生物发酵技术领域。
背景技术
众所周知,枸杞具有滋补肝肾,益精明目,治疗腰膝酸痛,眩晕耳鸣,内热消渴,血虚萎黄的功效,因此,人们将枸杞制成枸杞酒做为保健酒。目前枸杞酒制法有浸泡法和发酵法两种。浸泡法一般将整粒枸杞用白酒或黄酒泡制而成,酒度较高,且营养成分并不能充分溶出。发酵法枸杞酒因为不涉及高温加热过程,也较少有氧气参与,不但基本保持了枸杞中的天然营养的成分,而且经过发酵更加有利于人体吸收,是一种非常好的营养保健型果酒。但是,发酵型枸杞酒由于受到原料和加工工艺等因素的影响,质量参差不齐,产品的口感香气普遍不足,还有待于提高。
公开号:101323823的发明《枸杞酒的酿造方法》公开了一种枸杞酒的酿造方法,将破碎去籽的枸杞及熟化后的淀粉质原料中加入糖化发酵酒曲和酒母,在发酵罐中进行发酵;然后将发酵好的醪液进行压榨,酒汁经澄清、杀菌、陈酿、勾兑和过滤后装瓶。采用了淀粉质原料作为发酵的碳源,酿制纯发酵枸杞酒,主要解决的问题为:最大限度地降低生产成本。
公开号:1513970的发明《一种发酵枸杞葡萄酒及酿制方法》公开了一种发酵枸杞酒和发酵葡萄酒勾兑配制方法,这种方法以枸杞和葡萄为原料分开发酵,然后进行配制调配的工艺方法。是以鲜枸杞或干枸杞破碎制成果浆(果汁)发酵制成发酵枸杞酒;白葡萄或红葡萄经破碎制成果汁(果浆)发酵酿制成发酵葡萄酒。发酵枸杞酒与发酵葡萄酒按照(1%-99%): (99%-1%)的比例勾兑配比后调成不同类型的糖度,经过热处理、冷处理、过滤、装瓶、杀菌,制成发酵枸杞葡萄酒。此方法酿制的发酵枸杞葡萄酒,枸杞葡萄香气和谐,口感丰满协调,枸杞味浓郁,典型性突出。
公开号:1104248的发明《一种枸杞酒的酿制方法》公开了一种枸杞酒的酿制方法,该方法包括原料经精选、压榨、发酵、过滤、灭菌,其特征在于鲜枸杞经精选、压榨成枸杞汁后,加入亚硫酸钠硫化后,再加入酵母,加葡萄糖至糖度为22°BX后,投入压力罐内密封发酵,其发酵温度为(20-25)℃,时间为5-8天后,再次添加葡萄糖至糖度为18°BX,再次进行密封发酵,其发酵温度为(15-20)℃,当发酵至罐底沉淀有果渣及酵母、酒液初步澄清,糖度为5°BX以下后,对罐内枸杞液果渣、酵母混合物进行搅拌、加热后,再进行冷却,将枸杞混合物过滤,在过滤所得的枸杞液中加入适量的亚硫酸钠再加入蜂蜜澄清,再次过滤,将过滤液贮于桶内,在温度为10℃左右下贮存2-3个月换桶一次后进行灌装巴氏灭菌,即酿制成枸杞酒,将上述酿制的枸杞液投入一定量的枸杞浸泡液,配制成不同酒度的枸杞酒。
公开号:1782060的发明《一种枸杞酒的酿制方法》公开的枸杞酒的酿制方法:鲜枸杞或干枸杞经分选、清洗,若是干枸杞还要用2-5倍于其重量的水浸泡12-24小时,然后破碎成枸杞浆,用95%(v/v)的脱臭酒精调整酒精度至20-25%(v/v),浸泡10-20天,浸泡期间每天打循环1-4次,完毕后分离出浸泡酒;分离后的鲜枸杞果渣加0.5-2倍鲜枸杞重量的软水;干枸杞果渣加2-5倍干枸杞重量的软水,用蔗糖调整糖度至210-230g/L,用柠檬酸或酒石酸调整总酸至6.0-8.0g/L,调SO2至80-100mg/L,加果胶酶0.2-0.5g/L,添加干酵母0.15-0.3g/L,控制温度在18-30℃发酵,时间5-7天,当比重降至1000g/L以下时,分析残糖<4g/L分离出发酵酒;将浸泡酒和发酵酒混合,再经陈酿、调配、下胶、过滤、除菌、装瓶、包装即为成品。
公开号:1265420的发明《一种枸杞酒的酿制方法》公开的枸杞酒的酿制方法:将分选好的枸杞置入柠檬酸及亚硫酸钠混合液中热烫,热烫后的枸杞先经破碎后,再加入软水浸泡,枸杞和软水以7:3(体积比)装罐,用二氧化硫和果胶酶处理,调整成分 后静置,接种发酵,经前发酵和后发酵后,分离出发酵酒贮存待用,经分选破碎的枸杞置入95%脱臭食用酒精中浸泡30天左右分离,制得浸泡酒,将浸泡酒和发酵酒按1:4(体积比)勾兑调配,贮存一段时间后,经下胶过滤,除菌过滤后装瓶。
公开号:1077744的发明《枸杞发酵酒制备方法》公开的枸杞发酵酒的制备方法:将枸杞经去杂冲洗,热浸提,破碎,过滤,加辅料,灭菌,冷却,前期发酵,净化处理,过滤,陈酿,制坛,调配,过滤等工序而制得枸杞发酵酒,具体工艺为:a:将枸杞果去杂冲洗,用 65℃-75℃热水浸提1.5-2.5小时,粉碎过滤后将其剩余物再次放入65℃-75℃热水中,浸提 0.8-1.2小时后进行第二次过滤,b:将a项二次过滤后的剩余物粉碎,经再次过滤后弃其滤渣,c:在b项的滤液中加入20%白糖辅料,d:将c项制得的溶液在95℃-100℃温度下灭菌 20-25秒,冷却到65℃-70℃,放入酒坛,继续冷却到30℃-32℃,e:在28℃-30℃条件下将 d项制得的溶液进行前期发酵6-8天,再在室温条件下进行后期发酵9-11天,f:将e项制得的溶液进行净化处理,加入明胶(按10mL溶液0.008g明胶的比例加入),下胶14-16天过滤, g:将f项制得的溶液陈酿3-5个月,倒坛,在50℃-60℃条件下放置10-20天,在零下2℃-4 4℃条件下放置5-7天,过滤,滤液存放1个月,h:将g项制得的滤液加入调味剂及滋补药进行调配,i:将h项制得的溶液过滤,灭菌,即为成品。
由现有技术技术的公开我们发现:在枸杞酒生产中常用的酶仅为果胶酶,目的主要为酶解果肉以提高出汁率,最终提高出酒率,其他酶在发酵枸杞酒中的应用并未见报道。而枸杞中含量非常丰富的类胡萝卜素,经过微生物发酵后,由于类胡萝卜素不溶于水,很大一部分在发酵结束果渣分离时被除去,一部分在酿造过程中被降解而损失,最终枸杞酒中类胡萝卜素含量并不高。
宁夏枸杞历史悠久的传统品牌、文化优势历史己有数百年,中宁县是国务院命名的“中国枸杞之乡”,宁夏枸杞被《中国药典》列为药食品同源食品,这是其他任何省区都无法比拟的。
2017年国家1号文件明确提出,“加强新食品原料、药食同源食品开发和应用”“加强现代生物和营养强化技术研究,挖掘开发具有保健的功能的食品”,为了响应国家号召,开发功能保健食品,发展宁夏优势特色枸杞资源,提升枸杞保健酒的品质,找到一种类胡萝卜素降解酶的制备方法,是本发明所要解决的技术问题。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种类胡萝卜素降解酶,采用分离得到的一株类胡萝卜素降解菌,制备类胡萝卜素降解酶,利用类胡萝卜素不稳定,受光、氧、热、生物酶等易降解产生降异戊二烯类香气化合物的特性,使其产生大量的C9-、C10-、C13-和C15-降异戊二烯类化合物(norisoprenoids),这些物质是具有挥发性的芳香化合物,这些化合物因为感官阈值较低,对食品具有积极的贡献。枸杞富含的类胡萝卜素主要包括β-胡萝卜素、玉米黄素、玉米黄素双棕榈酸酯,且其中以玉米黄素双棕榈酸酯最多,约为类胡萝卜素总量的77.5%。但是在酿造酒时,由于不溶于水,大部分流失于枸杞渣中,造成很大的浪费。本发明的类胡萝卜素降解酶能够降解枸杞渣或枸杞浆中不溶于水的类胡萝卜素,使所含大量的类胡萝卜素降解,使枸杞酒中产生大量的芳香化合物,起到增加酒香气的作用,提高枸杞酒的品质。当然,本发明的类胡萝卜素不限于发酵枸杞酒的提香,还可以用于其他食品以及饲料、化妆品等多个领域。
传统的发酵工艺,由于枸杞中类胡萝卜素不溶于水,大量的类胡萝卜素被枸杞渣带走,本发明方法制得的类胡萝卜素降解酶能够降解枸杞渣或浆中的类胡萝卜素,使产生降异戊二烯类香气物质,能够显著提高酒香。改善了枸杞酒香气,提高了枸杞酒品质,创新了枸杞酒酿造工艺。
降异戊二烯类化合物(norisoprenoids)是一类由类胡萝卜素降解产生的具有特殊香气的物质,并且该类物质具有较低的嗅觉阈值,因而少量存在就可对食品的风味产生较大的感官影响。食品中含有9、10、11和13个碳原子的降异戊二烯类化合物大多由类胡萝卜素降解产生,如β-大马酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等,均具有良好的风味。降异戊二烯类化合物是葡萄等新鲜果蔬的主要呈香物质之一,也是影响果酒香气品质的重要化合物。果酒香气成分中已探明的降异戊二烯类化合物有:β-紫罗兰酮、异佛尔酮、柠檬烯、藏红花醛、香叶基丙酮、二氢-β-紫罗兰酮、β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、甲基庚烯酮、β-环柠檬醛、2-庚烯醛、二氢茉莉酮、α-环柠檬醛、异香叶醇、2,5,6-三甲基-4-庚烯-3-酮、2,4-壬二烯醛、3-癸酮、2-壬烯醛、2,2,6-三甲基环烯酮等19种降戊二烯类化合物,香气特征见表3。
本发明对枸杞酒工艺的改进,利用类胡萝卜素的降解,增加枸杞酒的风味物质。本发明制得的酶用于枸杞酒的酿造,经过检测增加了降异戊二烯类化合物含量以及种类,它们主要是β-紫罗兰酮、2,2,6-三甲基环己酮(TCH)、异佛尔酮,香叶基丙酮、二氢-β-紫罗兰酮、香叶醇、藏红花醛、β-环柠檬醛、柠檬烯、假紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯。以及壬醛、戊酸戊酯、葵酸乙酯。这些物质的味阈值低,为枸杞酒感官评价起到了很好的作用。
该枸杞酒羰基化合物含量增多,相对峰面积占总成分的5.78%,高于旧工艺的4.23%;其中含量较高的是3-十一酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛、藏红花醛和二氢-β -紫罗兰酮,相对含量较高的β-紫罗兰酮3.136%,β-环柠檬醛3.615%,它们具有特殊水果香气。
酯类化合物相对峰面积为14.08%,高于现有工艺的11.03%,是枸杞酒中含量较多的芳香物质。占总成分的13.68%,高于现有工艺的10.73%,对枸杞酒香气贡献较大,葵酸乙酯和戊酸戊酯也是重要的降解产物,具有梨香和香蕉的香味;二氢猕猴桃内酯、丙酮香叶酯是类胡萝卜素降解的中间产物,也是含量较高的酯类之一,水果和花香味突出。
一种类胡萝卜素降解酶,由包括如下步骤的方法制备:
①库特氏杆菌液的制备
液体培养基(g/L):硝酸钠3、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5、氯化钾0.5、硫酸铁0.01、蔗糖30、YNB合成培养基(无氨基酵母氮源培养基)6.7、β-胡萝卜素15;pH=3.2。
②扩大培养
取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ151环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min 下培养10-12h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10-12h→3000mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10-12h→菌液浓度达到106cfu/ml→库特氏杆菌种子液;
③发酵
液体培养基→接种库特氏杆菌种子液2%体积百分数→30℃-35℃,pH=3.0-3.5,140r/min 发酵8-10h→发酵液;
④类胡萝卜素降解酶制备
发酵液→4℃,10000r/min离心100-150min→取上清液→类胡萝卜素降解酶粗酶液。
所述所述类胡萝卜素降解酶的制备方法,还可以包括:将粗酶液经冷冻、干燥、浓缩并利用透析法初步纯化后,得类胡萝卜素降解酶。
所述库特氏杆菌为(Kurthia sp)NXUGQ15,保藏编号为CCTCC NO:M2017524;
本发明同时提供一种类胡萝卜素降解酶,酶活高,粗酶液的酶活8.87U/mL,产酶较好。
所述库特氏杆菌菌株的分离及获得
从枸杞汁中分离得到可以降解类胡萝卜素的菌种,并经紫外诱变筛选出库特氏杆菌菌株 NXUGQ15(Kurthia sp),利用该株菌产生的类胡萝卜素降解酶,降解枸杞浆中的类胡萝卜素,改进枸杞酒酿造工艺,提高枸杞酒品质。该菌出发菌株由张惠玲从宁夏百瑞源枸杞股份有限公司种植基地的枸杞汁中分离得到。
库特氏杆菌菌株NXUGQ15(Kurthia sp),保藏编号CCTCC NO:M2017524,于2017年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉),地址:中国.武汉.武汉大学。该菌能够降解β-胡萝卜素,最佳生长温度为35-37℃,pH=2-3;该菌所产生的降解酶耐受温度为70-90℃,最佳酶反应pH=1-3。该菌产类胡萝卜素降解酶时间短,酶活高,粗酶液的酶活8.87U/mL,优于出发菌GQ-16。
所述库特氏杆菌菌株的鉴定
初步鉴定:于液体培养基培养48h后,利用显微镜进行镜检,在油镜下观察其形态。结果表明菌株NXUGQ15为革兰氏阳性杆状细菌,无芽孢。
分子生物学鉴定:采用16S-23S rDNA ISR多态性与序列分析,构建其系统进化树见附图 2。由系统进化树可知,基于16rDNA区序列系统发育树,菌株NXUGQ15(Kurthia sp)与佐氏库特氏菌聚在一起,说明菌株NXUGQ15(Kurthia sp)与佐氏库特氏菌为同一物种,即菌株NXUGQ15(Kurthia sp)为库特氏菌。
库特氏杆菌对类胡萝卜素的降解
将菌株NXUGQ15(Kurthia sp)分别接种到玉米黄素为唯一碳源的液体培养基、β-胡萝卜素为唯一碳源的液体培养基、玉米黄素双棕榈酸酯为唯一碳源的液体培养基中,进行繁殖代谢。48h后取5ml发酵液于20ml顶空瓶,进行固相顶空微萃取及GC-MS测定。测定条件为:
样品的固相微萃取
取样品枸杞酒8ml于20ml顶空瓶中,加入2.0g氯化钠,并加入8μL 2-辛醇溶液,恒温磁力搅拌器上40℃平衡10min,插入CAR/DVB/PDMS纤维头40℃吸附15min,GC解吸5min,用于GC-MS分析。
气相色谱质谱工作条件
色谱条件为:色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm),载气为He,体积流量为1mL/min,进样口温度为250℃。程序升温:40℃保持3min,以5℃/min的升温速度升至120℃,再以8℃/min的升温速度升至230℃,保持10min。灯丝流量为0.20mA。质谱条件为:EI电离源,电子能量为70eV,检测器电压为350V。扫描范围为20~450AMU,离子源温度为200℃。
有益效果
本发明诱变获得能够降解枸杞类胡萝卜素的降解菌库特氏杆菌菌株NXUGQ15(Kurthia sp)(保藏号CCTCC NO:M2017524)。相比出发菌提高了降解类胡萝卜素的能力,且发酵产类胡萝卜素降解酶时间短,酶活高,粗酶液的酶活8.87U/mL,产酶较好。
创新了枸杞酒新工艺
本发明创新了枸杞酒的发酵工艺,利用保藏菌种产的类胡萝卜素降解酶,处理枸杞渣或枸杞浆,能够增加枸杞酒的挥发香气成分,改善枸杞酒的品质,提高枸杞酒市场竞争力。同时减少了发酵枸杞酒产生的废弃物,减少浪费,降低了后续处理的难度,节能环保,具有很高的推广价值。
附图说明
图1-本发明类胡萝卜素降解酶的制备方法工艺流程图;
图2-本发明库特氏杆菌系统进化树图;
图3-采用本发明类胡萝卜素降解酶提香的枸杞酒的感官品评结果图;
图中:酒样1为利用库特氏杆菌处理枸杞渣后放回枸杞酒中所得增香枸杞酒;酒样2为采用高压降解枸杞渣放回枸杞酒中所得增香枸杞酒;酒样3为利用本发明类胡萝卜素降解酶提香所得增香枸杞酒。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
库特氏杆菌菌株的分离及获得
从枸杞汁中分离得到可以降解类胡萝卜素的菌种,并经紫外诱变筛选出库特氏杆菌菌株 NXUGQ15(Kurthia sp),利用该株菌产生的类胡萝卜素降解酶,降解枸杞浆中的类胡萝卜素,改进枸杞酒酿造工艺,提高枸杞酒品质。该菌出发菌株由张惠玲从宁夏百瑞源枸杞股份有限公司种植基地的枸杞汁中分离得到。
库特氏杆菌菌株NXUGQ15(Kurthia sp),保藏编号CCTCC NO:M2017524,于2017年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉),地址:中国.武汉.武汉大学。该菌能够降解β-胡萝卜素,最佳生长温度为35-37℃,pH=2-3;该菌所产生的降解酶耐受温度为70-90℃,最佳酶反应pH=1-3。该菌产类胡萝卜素降解酶时间短,酶活高,粗酶液的酶活8.87U/mL,优于出发菌GQ-16。
所述库特氏杆菌菌株的鉴定
初步鉴定:于液体培养基培养48h后,利用显微镜进行镜检,在油镜下观察其形态。结果表明菌株NXUGQ15为革兰氏阳性杆状细菌,无芽孢。
分子生物学鉴定:采用16S-23S rDNA ISR多态性与序列分析,构建其系统进化树见附图 2。由系统进化树可知,基于16rDNA区序列系统发育树,菌株NXUGQ15(Kurthia sp)与佐氏库特氏菌聚在一起,说明菌株NXUGQ15(Kurthia sp)与佐氏库特氏菌为同一物种,即菌株NXUGQ15(Kurthia sp)为库特氏菌。
库特氏杆菌对类胡萝卜素的降解
将菌株NXUGQ15(Kurthia sp)分别接种到玉米黄素为唯一碳源的液体培养基、β-胡萝卜素为唯一碳源的液体培养基、玉米黄素双棕榈酸酯为唯一碳源的液体培养基中,进行繁殖代谢。48h后取5ml发酵液于20ml顶空瓶,进行固相顶空微萃取及GC-MS测定。测定条件为:
样品的固相微萃取
取样品枸杞酒8ml于20ml顶空瓶中,加入2.0g氯化钠,并加入8μL 2-辛醇溶液,恒温磁力搅拌器上40℃平衡10min,插入CAR/DVB/PDMS纤维头40℃吸附15min,GC解吸5min,用于GC-MS分析。
气相色谱质谱工作条件
色谱条件为:色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm),载气为He,体积流量为1mL/min,进样口温度为250℃。程序升温:40℃保持3min,以5℃/min的升温速度升至120℃,再以8℃/min的升温速度升至230℃,保持10min。灯丝流量为0.20mA。质谱条件为:EI电离源,电子能量为70eV,检测器电压为350V。扫描范围为20~450AMU,离子源温度为200℃。
库特氏杆菌菌株的选育
(1)发明人于2016年1月从枸杞汁中分离并鉴定,得到了1株可以降解类胡萝卜素的菌种,为库特氏杆菌菌株GQ-16。为了提高其降解类胡萝卜素的降解能力,对该菌进行了诱变,详见如下:
(2)诱变库特氏菌GQ-16
以库特氏菌GQ-16作为出发菌株,进行诱变选育,目的提高产酶活性缩短发酵时间。
实验如下:
紫外诱变:
取出发菌株一环,接入到液体培养基中,35℃条件下培养5-6h,至对数期中期。将菌悬液稀释至浓度为105CFU/mL。通过预实验以致死率80%为条件,获得最佳照射时间与照射距离。将菌悬液均匀涂布于液体培养基上,放置于30W的紫外灯下距离25cm,照射5min,辐照处理后,用黑布包裹培养基在35℃-37℃条件下,培养8-12h,筛选生长快而且菌落形态好的菌株20株,然后经过发酵性能测试实验,筛选性能优良的菌株5株,分别命名为NXUGQ15、NXUGQ46、NXUGQ7、NXUGQ18、NXUGQ39,分别提取各个酶进行枸杞酒发酵,通过测定发酵时间来鉴定其发酵性能高低。发酵时间越短,表示发酵性能越好结果见表1。
微波诱变:
取5mL菌悬液于直径9cm的培养皿内,通过预实验以致死率80%为条件,选用最大功率700W、脉冲功率2450MHz家用微波炉进行照射5s,在冰上快速冷却5s,重复此步骤,取上述处理液0.5mL均匀涂布于固体培养基上,用黑布包裹培养基在35℃-37℃条件下,培养8-12h。筛选生长快而且菌落形态好的菌株20株,然后经过发酵性能测试实验,筛选性能优良的菌株5株,分别命名为W-NXUGQ-5、W-NXUGQ-26、W-NXUGQ-1、W-NXUGQ-18、W-NXUGQ-35,分别提取各个酶进行枸杞酒发酵,通过测定发酵时间来鉴定其发酵性能高低。发酵时间越短,表示发酵性能越好结果见表2。
酶活定义:1g酶粉或1mL酶液在50℃、pH 3.5条件下,1h分解类胡萝卜素的量为一个酶活单位(U)。粗酶液的酶活计算公式如下:
式中:Y为酶作用降解类胡萝卜素的质量.mg;N为样品稀释倍数;2为测定酶活力时取了反应液的1/2;t为反应所用时间.h。
紫外诱变处理以及微波诱变处理对菌株产酶(类胡萝卜素降解酶)的影响结果分别见表1及表2。
表1紫外诱变处理
编号 | NXUGQ 15 | NXUGQ46 | NXUGQ 7 | NXUGQ 18 | NXUGQ39 | 出发菌GQ-16 |
酶活U/mL | 8.87 | 7.90 | 8.46 | 8.84 | 8.12 | 6.32 |
发酵时间 | 8h | 13h | 10h | 12h | 11h | 10h |
表2微波诱变处理
编号 | W-NXUGQ-5 | W-NXUGQ-26 | W-NXUGQ-1 | W-NXUGQ-18 | W-NXUGQ-35 | 出发菌GQ-16 |
酶活U/mL | 7.87 | 7.89 | 7.46 | 8.05 | 8.12 | 6.32 |
发酵时间 | 11h | 8h | 10h | 10h | 14h | 10h |
由以上两表可以看出,紫外诱变处理的5株菌中NXUGQ 15最好,微波诱变处理5株菌中 W-NXUGQ-5最好,
分别用两株菌进行稳定性试验15次,通过比较发现NXUGQ 15比较稳定,相比出发菌提高了降解类胡萝卜素的能力,且发酵产类胡萝卜素降解酶时间短,酶活高,粗酶液的酶活 8.87U/mL,产酶较好。选择该菌种,最终命名为NXUGQ15,即库特氏杆菌菌株NXUGQ15(Kurthia sp),并进行菌种保藏。
实施例2
一种类胡萝卜素降解酶,由包括如下步骤的方法制备:
①库特氏杆菌液的制备
液体培养基(g/L):硝酸钠3、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5、氯化钾0.5、硫酸铁0.01、蔗糖30、YNB合成培养基(无氨基酵母氮源培养基)6.7、β-胡萝卜素15;pH=3.2。
②扩大培养
取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ151环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min 下培养11h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养11h→3000mL液体培养基35-37℃、 130r/min下培养11h→菌液浓度达到106cfu/ml→库特氏杆菌种子液;
③发酵
液体培养基→接种库特氏杆菌种子液2%→33℃,pH=3.3,140r/min发酵9h→发酵液;
④类胡萝卜素降解酶制备
发酵液→4℃,10000r/min离心120min→取上清液→类胡萝卜素降解酶粗酶液;将粗酶液经冷冻、干燥、浓缩并利用透析法初步纯化后,得类胡萝卜素降解酶。
所述库特氏杆菌为(Kurthia sp)NXUGQ15,保藏编号为CCTCC NO:M2017524。
将本发明的类胡萝卜素降解酶按照如下步骤对枸杞酒提香:枸杞打浆,添加类胡萝卜素降解酶,添加量为4%,在60℃反应4h,过滤除渣后,取枸杞清汁,加入加入50ml/L果胶酶,50ml/L浓度为6%的液体亚硫酸,用白砂糖调整糖度为22%,pH为3.3-3.5,接种2%酵母活化液在25-28℃下发酵至残糖小于4g/L,发酵结束,低温陈酿,得到增香枸杞酒。
所述酵母活化液制备方法包括如下步骤:
斜面试管酵母取一环→10mL麦芽汁液体培养基25-28℃培养36h→50mL50%麦芽汁+50%枸杞汁质量百分比的液体培养基25-28℃培养36h→取10mL接种在100mL枸杞汁中25-28℃下培养36h→全部倒入1000mL枸杞汁中22-25℃下培养36h→获得菌液浓度达到107cfu/ml的菌液,即得酵母活化液→待用。
对实施例2制备的枸杞酒进行风味物质测定以及感官品评。结果见表3、表4及附图3。
实施例3
一种类胡萝卜素降解酶,由包括如下步骤的方法制备:
①库特氏杆菌液的制备
液体培养基(g/L):硝酸钠3、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5、氯化钾0.5、硫酸铁0.01、蔗糖30、YNB合成培养基(无氨基酵母氮源培养基)6.7、β-胡萝卜素15;pH=3.2。
②扩大培养
取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ151环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min 下培养10h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10h→3000mL液体培养基35-37℃、 130r/min下培养10h→菌液浓度达到106cfu/ml→库特氏杆菌种子液;
③发酵
液体培养基→接种库特氏杆菌种子液2%→30℃-32℃,pH=3.0-3.2,140r/min发酵10h →发酵液;
④类胡萝卜素降解酶制备
发酵液→4℃,10000r/min离心100min→取上清液→类胡萝卜素降解酶粗酶液。
所述库特氏杆菌为(Kurthia sp)NXUGQ15,保藏编号为CCTCC NO:M2017524。
实施例4
一种类胡萝卜素降解酶,由包括如下步骤的方法制备:
①库特氏杆菌液的制备
液体培养基(g/L):硝酸钠3、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5、氯化钾0.5、硫酸铁0.01、蔗糖30、YNB合成培养基(无氨基酵母氮源培养基)6.7、β-胡萝卜素15;pH=3.2。
②扩大培养
取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ151环→10mL液体培养基36-37℃、130r/min 下培养12h→100mL液体培养基36-37℃、130r/min下培养12h→3000mL液体培养基36-37℃、 130r/min下培养12h→菌液浓度达到106cfu/ml→库特氏杆菌种子液;
③发酵
液体培养基→接种库特氏杆菌种子液2%→34℃-35℃,pH=3.4-3.5,140r/min发酵10h →发酵液;
④类胡萝卜素降解酶制备
发酵液→4℃,10000r/min离心150min→取上清液→类胡萝卜素降解酶粗酶液,将粗酶液经冷冻、干燥、浓缩并利用透析法初步纯化后,得类胡萝卜素降解酶。
所述库特氏杆菌为(Kurthia sp)NXUGQ15,保藏编号为CCTCC NO:M2017524。
试验例
风味物质测定
降异戊二烯类化合物的萃取:利用顶空固相微萃取(HS-SPME)法进行香气富集,取一个 20mL顶空瓶,用无菌移液管加8mL待分析的枸杞汁或枸杞酒样和2.0g NaCl,于40℃恒温磁力搅拌器上平衡10min,插入CAR/DVB/PDMS纤维头40℃吸附15min,GC解吸5min,用于GC-MS分析。
气相色谱质谱工作条件
色谱条件为:色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm),程序升温:40℃保持3min,以5℃/min的升温速度升至120℃,再以8℃/min的升温速度升至230℃,保持10min。载气为He,体积流量为1mL/min,进样口温度为250℃。质谱条件为:EI电离源,电子能量为 70eV,灯丝流量为0.20mA。检测器电压为350V。扫描范围为20~450AMU,离子源温度为200℃。
分析方法:
(1)类胡萝卜素的分析方法
分别由标准曲线计算出处理前和各单因素处理后的类胡萝卜素的含量。代入下式中计算出各类胡萝卜素的降解率。
降解率(%)=[(处理前含量-处理后含量)/处理前含量]×100%
(2)降异戊二烯化合物的分析方法
根据化合物的结构特征,与NIST谱库中标准化合物的图谱进行比较,根据离子流图确定出其相对含量。
将采用本发明类胡萝卜素降解酶提香方法与另两种方法制备的枸杞酒挥发香气成分比较,以传统工艺发酵的枸杞酒为对照:
方法Ⅰ:采用NXUGQ15(Kurthia sp)菌直接发酵枸杞渣,使类胡萝卜素降解,将渣回放枸杞酒中,使降解产物降异戊二烯化合物溶入酒中,过滤取酒。
方法Ⅱ(本发明方法):采用NXUGQ15(Kurthia sp)菌,经过发酵培养菌液,收集该菌产生的类胡萝卜素降解酶,将降解酶加入枸杞浆中进行酶解,然后发酵制备枸杞酒,使降解产物降异戊二烯化合物溶入酒中,过滤取酒。
方法Ⅲ:对枸杞渣采用在121℃灭菌20min高压处理,使枸杞渣中类胡萝卜素降解,然后再将其浸于枸杞酒中0.5-1h,使降异戊二烯化合物溶解酒中,过滤取酒。
以传统工艺发酵的枸杞酒为对照,分别采用方法Ⅰ、方法Ⅱ、方法Ⅲ进行枸杞酒的增香,制得的枸杞酒主要挥发香气成分及相对含量比较结果见表3:
表3不同工艺枸杞酒中主要挥发香气成分及相对含量
注:“nd”表示未检出。
由上表可以得出结论:由方法Ⅰ、方法Ⅱ、方法Ⅲ增香后的枸杞酒的主要挥发香气成分均远高于传统工艺制备的枸杞酒,并增加了九种类胡萝卜素香气物质,其中方法Ⅱ,也即本发明方法制备的枸杞酒尤为突出。
三种方法制备的枸杞酒中降异戊二烯类化合物含量比较
以传统工艺发酵的枸杞酒为对照,分别采用方法Ⅰ、方法Ⅱ、方法Ⅲ进行枸杞酒的增香,制得的枸杞酒中降异戊二烯类化合物进行比较,结果见表4
表4不同工艺制备的枸杞酒中降异戊二烯类化合物比较(峰面积)
降异戊二烯 | 传统工艺枸杞酒 | 方法Ⅰ | 方法Ⅱ | 方法Ⅲ |
甲基庚烯酮 | 3.28 | 3.45 | 3.88 | 3.35 |
2,4-壬二烯醛 | 5.01 | 9.33 | 10.17 | 6.94 |
二氢-β-紫罗兰酮 | 0.25 | 3.27 | 4.13 | 1.12 |
β-紫罗兰酮 | 0.19 | 4.41 | 7.54 | 6.73 |
二氢茉莉酮 | 2.91 | 1.76 | 3.33 | 2.25 |
藏红花醛 | 1.01 | 2.11 | 2.52 | 1.89 |
壬醛 | nd | 6.48 | 2.13 | 3.32 |
α-环柠檬醛 | 3.10 | 3.33 | 4.21 | 2.66 |
β-环柠檬醛 | 5.20 | 6.37 | 9.64 | 5.47 |
香叶基丙酮 | 7.88 | 12.59 | 14.86 | 9.84 |
2,2,6-三甲基环己酮 | 1.41 | 6.14 | 6.77 | 5.73 |
柠檬烯 | nd | nd | 2.06 | 1.11 |
辛酸 | 0.27 | 1.27 | 9.82 | 6.38 |
癸酸 | 1.33 | 2.21 | 1.42 | 1.25 |
丙酮香叶酯 | nd | 0.01 | nd | nd |
二氢猕猴桃内酯 | 0.09 | 2.09 | 3.42 | 1.02 |
由表4可知采用本发明类胡萝卜素降解酶处理枸杞浆后,制备的枸杞酒中降异戊二烯类化合物含量远高于传统工艺制备的枸杞酒,也高于高压处理工艺,以及利用保藏菌种处理枸杞渣制备的枸杞酒。
香气对照参照表:
表5枸杞酒中部分降异戊二烯类化合物的香气特征
按照下表的感官品评方法,对本发明方法Ⅱ、方法Ⅰ、方法Ⅲ三种不同方法制备的枸杞酒进行感官品评,品评结果绘制感官品评风玫瑰图,见附图3
表6枸杞发酵酒感官评分表
通过对三种酒样中降戊二烯类化合物的测定并结合感官品评,发现本发明库特氏菌提取的类胡萝卜素降解酶辅助发酵枸杞酒,香气和口感均为最佳。采用库特氏菌酶辅助发酵,首先一方面不仅可以提高类胡萝卜素的降解率,从而产生更多的降戊二烯香气成分。另一方面,避免了库特氏菌自身的代谢活动产生其他代谢产物影响酒体的协调性。其次,生物酶使用反应温度低,避免了因高温加热而对酒体造成不良风味。
本发明在枸杞酒酿造的过程中,将枸杞浆采用库特氏菌酶进行降解处理,能够改进枸杞酒的酿造工艺,提高枸杞酒香气。并且可以适度的进行高压灭菌,或者采用库特氏菌处理枸杞渣,从而几种提香方法进行组合,均可以显著提高发酵枸杞酒的香气。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,上述各实施方式还可以做出组合和改进,当然也可以将本发明公开的几种制备方法进行重新组合,以及工艺步骤的增减、重组,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种产类胡萝卜素降解酶的库特氏杆菌,其特征在于,所述库特氏杆菌为(Kurthia sp. )NXUGQ15,保藏编号为CCTCC NO:M2017524。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811023159.XA CN109055326B (zh) | 2018-09-04 | 2018-09-04 | 一种产类胡萝卜素降解酶的库特氏杆菌 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811023159.XA CN109055326B (zh) | 2018-09-04 | 2018-09-04 | 一种产类胡萝卜素降解酶的库特氏杆菌 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109055326A CN109055326A (zh) | 2018-12-21 |
CN109055326B true CN109055326B (zh) | 2021-10-01 |
Family
ID=64759219
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811023159.XA Active CN109055326B (zh) | 2018-09-04 | 2018-09-04 | 一种产类胡萝卜素降解酶的库特氏杆菌 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109055326B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114774374B (zh) * | 2022-04-22 | 2023-08-22 | 内蒙古昆明卷烟有限责任公司 | 一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用 |
CN114854625B (zh) * | 2022-04-22 | 2023-07-25 | 内蒙古昆明卷烟有限责任公司 | 一种伤口埃希氏菌及其制备类胡萝卜素降解酶的方法 |
-
2018
- 2018-09-04 CN CN201811023159.XA patent/CN109055326B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
一株降解β-胡萝卜素细菌的分离鉴定及产酶条件优化;李金鹏等;《中国酿造》;20161225;第35卷(第12期);全文 * |
库特氏杆菌β-类胡萝卜素降解酶的酶学性质;李金鹏等;《中国食品添加剂》;20170430;第60页左栏第1段 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109055326A (zh) | 2018-12-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110786534A (zh) | 一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法 | |
CN107475015B (zh) | 一种红心火龙果和白心火龙果复合果酒及其制备方法 | |
CN106190691A (zh) | 一种甘蔗百香果酒的生产方法 | |
CN109055326B (zh) | 一种产类胡萝卜素降解酶的库特氏杆菌 | |
CN109593630B (zh) | 一种发酵型无核黄皮果醋及其制备方法与应用 | |
CN112553091A (zh) | 一种非酿酒酵母及用该酵母增加蓝莓果酒香味的发酵方法 | |
CN114231381B (zh) | 一种混菌复合发酵刺梨果醋的制备方法 | |
CN108531335B (zh) | 一种增加蓝莓酒发酵香的酿造方法 | |
CN110693063A (zh) | 一种烟用蓝莓提取物的制备方法 | |
CN109266624B (zh) | 一种类胡萝卜素降解酶的制备方法 | |
CN109182043B (zh) | 发酵枸杞渣及增香枸杞酒的制备方法 | |
CN109181976B (zh) | 一种低度青梅酒及其生产方法 | |
CN108893235B (zh) | 一种提高发酵型枸杞酒香气的方法及增香枸杞酒 | |
CN110643465A (zh) | 一种电子束处理催陈枸杞干酒的方法 | |
CN109182023B (zh) | 一种发酵枸杞渣及增香枸杞酒 | |
CN109136040B (zh) | 一种提高发酵型枸杞酒香气的方法 | |
CN106222055A (zh) | 一种多菌种共固定化发酵番木瓜醋及其制备方法 | |
CN110679934A (zh) | 一种含叶黄素的清肝明目的酵素及其制备方法 | |
CN108048275A (zh) | 一种以黑糖和多依果制备多依发酵酒的方法 | |
CN115627239B (zh) | 一株降硫酵母菌及其在果蔬脱硫中的应用 | |
CN114276882B (zh) | 一种高香红茶酒的制备方法 | |
CN110079466B (zh) | 一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用 | |
CN108949479B (zh) | 一种后熟青梅酒的生产方法 | |
CN107118914B (zh) | 一种猕猴桃酒和猕猴桃脆片的加工方法 | |
CN106085712A (zh) | 一种双菌种共固定化发酵番木瓜酒及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |