CN110079466B - 一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用 - Google Patents

一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用方法及发酵工艺。该菌株为汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT‑1，已于2018年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018683。利用本发明菌株，以莲子为原料，经过糊化、液化、糖化、蛋白水解等预处理步骤后进行30℃发酵；先经10h振荡好氧发酵，再经24h静置发酵，最后经离心、硅藻土过滤后得到过滤型的莲子酒。经过气相色谱‑质谱联用仪检测，莲子酒中含有苯乙醇、3‑甲硫基丙醇乙酸酯和苯乙醇乙酸酯等风味物质，色泽、香味和口感怡人。本发明在国内外首次通过汉逊酵母发酵制备得到风味良好的过滤型莲子酒，极具开发应用潜力。

Description

一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用。
背景技术
莲子的营养价值较高，它含有丰富的蛋白质、脂肪和碳水化合物。每100g干莲子中含有19.5g蛋白质、1.7g脂肪、58.9g糖类、0.23mg维生素B1、0.05mg维生素B2、7.0mg维生素H、2.8mg维生素E、550mg磷、87mg钙、14.5mg钾、9mg锰、3.2mg锌。磷可以帮助机体进行蛋白质、脂肪、糖类代谢和酸碱平衡；莲子中的钾元素含量位居所有动植物食品前列，对维持肌肉的兴奋性、心跳规律和各种代谢有着重要作用。此外，莲子中还含有丰富的磷脂、生物碱和类黄酮等营养保健成分。
莲子具有很高的保健价值，是滋补元气的珍品。早在汉朝，《神农本草经》便将其奉为上品，认为莲子味甘、涩，性平，具有镇静安神、补中益气、养心益肾、健脾养胃、清腑润脏、聪耳明、湿肠止泻的功效，可用于病后或产后脾胃虚弱的治疗。莲子有养心安详的功效，中老年人特别是脑力劳动者经常食用，可以健脑、增强记忆力、提高工作效率，并能预防老年痴呆症的发生。从莲子芯中提出的莲芯碱结晶，具有降压功效；莲子芯味道苦，却有显著的强心作用，能扩张外周血管，降低血压；莲子芯还有很好的去心火功效，可以治疗口舌生疮，并有助于睡眠。中医认为，莲子有益心补肾、健脾止泻、固精安神的作用。莲子适宜体质虚弱、心慌、失眠、多梦和遗精者食用；适宜脾虚气虚、慢性腹泻的人食用；适宜癌症病人及其放疗化疗后食用；适宜妇女脾肾亏虚、白带过多的人食用；对于久病、产后或老年体虚者，莲子更是常用营养佳品。
莲子在我国有着悠久的种植和食用历史，资源十分丰富，其营养保健价值广为人知，是农产品深加工及保健食品的优良资源。大力发展莲子深加工，对于充分利用我国莲子资源、扩大其产品用途、改善人们膳食结构、提高农民收入有着较大的经济及现实意义。目前的莲子加工产品有莲子汁饮料、莲子蜜饯、混合型营养莲子糊、莲子泥、莲子酱、莲子罐头、莲子软糖、以及蒸馏型莲子酒等。
蒸馏型莲子酒属于白酒的一种，由于蒸馏作用，产品中只含有挥发性组分(主要为水、乙醇及微量的酯类、其他醇类等物质)，而莲子中上述的大量营养成分没有被保留；另外，蒸馏型莲子酒中乙醇含量过高，不适合于大多数妇女及年老体弱者饮用。目前国内外还没有关于过滤型莲子酒的报道，更没有商业化的产品。研究开发过滤型莲子酒具有重要实际应用价值，筛选合适的酵母菌种是这项技术的关键。
发明内容
针对上述现状，本发明提供一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用方法及发酵工艺。
本发明提供的汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为CCTCC M2018683，保藏日期为2018年10月15日。
本发明提供一株汉逊酵母，并利用这株汉逊酵母发酵制备莲子酒。通过对本发明菌株的18S rDNA进行测序，并将本发明菌株的18S rDNA序列与NCBI数据库中已收录的酵母菌株的18S rDNA序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的18S rDNA序列与已知汉逊酵母(Hanseniaspora)属菌株的18S rDNA序列的同源性大于99％。本发明菌株的18SrDNA序列已提交到GenBank数据库中，登录号为MK886519。
采用本发明提供的汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1，在莲子酒发酵中的应用方法及发酵工艺涉及的实施步骤如下：
步骤1)原料预处理：将莲子粉碎，用60目的筛子筛分，取筛得的细组分加入水，配成30％(质量比)的莲子粉悬浊物；用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，边搅拌边升温至80℃，糊化作用20min；待温度降低至70℃，加入α-淀粉酶液化1h，α-淀粉酶的加入量为10U/g；液化结束，降低温度至60℃，用盐酸溶液调节pH至4.5，加入γ-淀粉酶糖化4h，γ-淀粉酶的加入量为400U/g；待温度降至42℃，用氢氧化钠溶液调节pH至8.5，加入中性蛋白酶水解作用5h，中性蛋白酶的加入量为4000U/g；
步骤2)菌种活化：将本发明提供的菌株汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1划线接种到YEPD固体培养基上，置于30℃的恒温箱中培养8–12h，至菌落生长丰满，所述YEPD固体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖、17g琼脂粉；
步骤3)制备液体种子：用接种环挑取步骤2)获得的菌落，接种到YEPD液体培养基中，采用体积为250mL的玻璃三角瓶，装液量为50mL，置于30℃的摇床中，120rpm培养9–11h，所述YEPD液体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖；
步骤4)莲子发酵：将步骤3)所得汉逊酵母液体种子按照5％的接种量接入到步骤1)所得的水解物中进行30℃发酵，采用体积为100mL的玻璃三角瓶，每瓶装有40g水解物，并补加30g无菌水，瓶口用带有砂芯的硅胶塞塞住；三角瓶首先在转速为120rpm的摇床中发酵10h，然后静置发酵24h；
步骤5)获得莲子酒并检测：将步骤4)所得的发酵醪液以9000rpm离心10min，取上清用硅藻土过滤，得到莲子酒；取5.0g莲子酒，用1.6g的二氯甲烷萃取，将有机相12000rpm离心10min后采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测，以正己醇为内标，采用TG-SQC型(0.25mm×0.25μm)色谱柱，柱温以40℃保持3min，然后以10℃/min升至260℃，并在260℃保持5min，进样口温度设置为220℃，以氦气作为载气，质谱离子源采用70eV电子轰击模式，扫描范围设置为20-400amu。
利用本发明所述汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1，采用上述发酵方法制备得到的莲子酒，经过GC-MS检测，莲子酒中的特征风味物质为苯乙醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、苯乙醇乙酸酯，含量分别为25mg/L、6.5mg/L、6.5mg/L。乙醇含量测得3.5％，比较适合女士和老人等消费者。苯乙醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯和苯乙醇乙酸酯是安全的食品香料，赋予莲子酒玫瑰花香、酯香、水果香等悦人的香气。采用本发明方法制备的过滤型莲子酒，呈金黄色，色泽诱人，十分清亮，具有诱人的香气；莲子酒入口有莲子的清香，并带有淡淡的酸味和苦味，口感上佳。
附图说明
图1是汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1CCTCC M 2018683在光学显微镜下观察的照片；
图2是由汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1CCTCC M 2018683发酵制备的莲子酒经GC-MS测得的苯乙醇的质谱图；图3是由汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1CCTCC M 2018683发酵制备的莲子酒经GC-MS测得的3-甲硫基丙醇乙酸酯的质谱图；图4是由汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1CCTCC M 2018683发酵制备的莲子酒经GC-MS测得的苯乙醇乙酸酯的质谱图。
具体实施方式
实施例1：菌株富集筛选与分离纯化
1.1环境样品采集
从本地超市购得几种不同品种的苹果。
1.2菌株初筛
将购买的苹果切成小块，用料理机打碎成糊状，转移至250mL的三角瓶中，用封口膜封口，室温下(约25℃)自然发酵48h。将上述样品加入到无菌水中，快速搅拌并自然沉降10min，然后取上清液适当稀释后涂布到YEPD固体培养基上，在30℃培养8–12h。挑取单菌落，经多次划线分离纯化得到纯的菌株。所述YEPD固体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖、17g琼脂粉。
1.3菌株复筛
将上述实验得到的纯的菌株，接种到复筛培养基中，在30℃摇瓶培养24h，用GC-MS检测产物，得到能产生良好风味物质的菌株。所述复筛培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖。
经过复筛，发现1个菌株产生的物质香味清香怡人，将此菌株命名为PT-1，即为本发明菌株。将得到的目的菌株采用斜面传代法、低温甘油法、低温真空干燥法等常规方法保存备用。
实施例2：菌株鉴定与保藏
本发明提供一株汉逊酵母，并利用这株汉逊酵母发酵制备莲子酒。通过对本发明菌株的18S rDNA进行测序，并将本发明菌株的18S rDNA序列与NCBI数据库中已收录的酵母菌株的18S rDNA序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的18S rDNA序列与已知汉逊酵母(Hanseniaspora)属菌株的18S rDNA序列的同源性大于99％。本发明菌株的18SrDNA序列已提交到GenBank数据库中，登录号为MK886519。
本发明菌株汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1已于2018年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018683。
实施例3：采用汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1在莲子酒发酵中的应用方法及发酵工艺
3.1原料预处理
将莲子粉碎，用60目的筛子筛分，取筛得的细组分加入水，配成30％(质量比)的莲子粉悬浊物。用16％的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，边搅拌边升温至80℃，糊化作用20min。待温度降低至70℃，加入α-淀粉酶液化1h，α-淀粉酶的加入量为10U/g干淀粉。液化结束，降低温度至60℃，用盐酸溶液调节pH至4.5，加入γ-淀粉酶为400U/g干淀粉进行糖化，糖化时间为4h。待温度降至42℃，调节pH至8.5，加入中性蛋白酶4000U/g，水解作用5h。
3.2活化菌株
将本发明提供的菌株汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1划线接种到YEPD固体培养基上，置于30℃的恒温箱中培养8–12h，至菌落生长丰满。所述YEPD固体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖、17g琼脂粉。
3.3制备液体种子
用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到YEPD液体培养基中。采用体积为250mL的摇瓶，装液量为50mL，置于30℃的摇床中，120rpm培养9–11h。所述YEPD液体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖。
3.4莲子发酵
将上述第三步获得的液体种子按5％体积比接种到经过上述第一步处理得到的水解物中进行发酵。发酵采用体积为100mL的玻璃三角瓶，每瓶装有40g水解物，并补加30g无菌水，三角瓶瓶口用带有砂芯的硅胶塞塞住，砂芯中有微孔可以通气，但能防止空气中的杂菌污染。三角瓶先在30℃、转速为120rpm的摇床中发酵10h；然后静置，30℃继续发酵24h，结束发酵。成熟的发酵醪液以9000rpm离心10min，取上清用硅藻土过滤，得到莲子酒。
3.5莲子酒的检测
取5g上述第四步获得的莲子酒，用1.6g二氯甲烷萃取，将有机相(下层)12000rpm离心10min，取纯净的有机相进行气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测发酵产物。具体方法为：用正己醇作为内标，采用TG-SQC型(0.25mm×0.25μm)色谱柱，柱温以40℃保持3min，然后以10℃/min升至260℃，并在260℃保持5min。进样口的温度为220℃，载气为氦气，MS采用70eV电子轰击模式，扫描范围20-400amu。
利用本发明所述汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1，采用上述发酵方法制备得到的莲子酒，经过GC-MS检测，莲子酒中的特征风味物质为苯乙醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、苯乙醇乙酸酯，含量分别为25mg/L、6.5mg/L、6.5mg/L。乙醇含量测得3.5％，比较适合女士和老人等消费者。苯乙醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯和苯乙醇乙酸酯是安全的食品香料，赋予莲子酒玫瑰花香、酯香、水果香等悦人的香气。采用本发明方法制备的过滤型莲子酒，呈金黄色，色泽诱人，十分清亮，具有诱人的香气；莲子酒入口有莲子的清香，并带有淡淡的酸味和苦味，口感上佳。

Claims (4)

1.汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M 2018683。
2.权利要求1所述的汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1 CCTCC M 2018683在制备莲子酒中的应用。
3.一种制备莲子酒的方法，其特征在于：该方法以莲子为原料，经过原料预处理，加入权利要求1所述的汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1进行发酵制备莲子酒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤1)原料预处理：将莲子粉碎，用60目的筛子筛分，取筛得的细组分加入水，配成质量比为30％的莲子粉悬浊物；用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，边搅拌边升温至80℃，糊化作用20min；待温度降低至70℃，加入α-淀粉酶液化1h，α-淀粉酶的加入量为10U/g；液化结束，降低温度至60℃，用盐酸溶液调节pH至4.5，加入γ-淀粉酶糖化4h，γ-淀粉酶的加入量为400U/g；待温度降至42℃，用氢氧化钠溶液调节pH至8.5，加入中性蛋白酶水解作用5h，中性蛋白酶的加入量为4000U/g；
步骤2)菌种活化：将本发明提供的菌株汉逊酵母Hanseniaspora sp.PT-1划线接种到YEPD固体培养基上，置于30℃的恒温箱中培养8–12h，至菌落生长丰满，所述YEPD固体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖、17g琼脂粉；
步骤3)制备液体种子：用接种环挑取步骤2)获得的菌落，接种到YEPD液体培养基中，采用体积为250mL的玻璃三角瓶，装液量为50mL，置于30℃的摇床中，120rpm培养9–11h，所述YEPD液体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖；
步骤4)莲子发酵：将步骤3)所得汉逊酵母液体种子按照5％的接种量接入到步骤1)所得的水解物中进行30℃发酵，采用体积为100mL的玻璃三角瓶，每瓶装有40g水解物，并补加30g无菌水，瓶口用带有砂芯的硅胶塞塞住；三角瓶首先在转速为120rpm的摇床中发酵10h，然后静置发酵24h；
步骤5)获得莲子酒并检测：将步骤4)所得的发酵醪液以9000rpm离心10min，取上清用硅藻土过滤，得到莲子酒；取5.0g莲子酒，用1.6g的二氯甲烷萃取，将有机相12000rpm离心10min后采用气相色谱-质谱联用仪检测，以正己醇为内标，采用规格为0.25mm×0.25μm的TG-SQC型色谱柱，柱温以40℃保持3min，然后以10℃/min升至260℃，并在260℃保持5min，进样口温度设置为220℃，以氦气作为载气，质谱离子源采用70eV电子轰击模式，扫描范围设置为20-400amu。
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