DE2922284A1

DE2922284A1 - Verfahren zur verminderung des nitratgehalts von tabak

Info

Publication number: DE2922284A1
Application number: DE19792922284
Authority: DE
Inventors: Vernon Louis Geiss; Lawrence Edmond Gravely; Charles Fred Gregory
Original assignee: Brown and Williamson Tobacco Corp
Current assignee: Brown and Williamson Holdings Inc
Priority date: 1978-06-15
Filing date: 1979-05-31
Publication date: 1980-01-03
Also published as: BE876994A; FR2437795A1; DE2922284C2; GB2028628A; US4556073A; CH655231A5; FR2437795B1; GB2028628B; CA1244363A

Description

- 9 Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verminderung des Nitratgehalts von Tabakmaterialien durch Behandlung des Tabaks mit Kulturen von Mikroorganismen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Behandlung von Tabakmaterialien, um deren Kitratgehalt zu vermindern. Diese ergeben bei der Einarbeitung in ein Tabakrauchprodukt einen Rauch mit vermindertem Gehalt an Stickoxiden und Cyanwasserstoff, ohne daß die günstigen Aroma- und Geschmackseigenschaften oder andere Raucheigenschaften verlorengehen.

Aus verschiedenen Gründen ist es oftmals anzustreben, den Nitratgehalt von Tabak zu vermindern. So haben z.B. in den letzten Jahren Zigaretten mit verminderter Abgabe eine erhebliche Aufnahme beim Verbraucher gefunden. Zahlreiche Techniken sind zur Verminderung der Rauchabgabe verfügbar geworden.

Bei der Entfernung oder Verminderung des Nitratgehalts wurden bei den üblichsten Methoden Chemikalien zur selektiven Nitrat- und lonenentfernung aus Tabakextrakten durch Ionenretardierungs(US-PS 3 847 164) und lonenaustauschertechniken (US-PS 3 616 801) angewendet. Es ist jedoch noch keine Behandlung bekannt, die eine Verminderung des Nitratgehalts von Tabak ermöglicht und bei der Mikroorganismen verwendet werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verminderung des Nitratgehalts von Tabak zur Verfügung zu stellen. Weiterhin soll erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Mediums zur Verfügung gestellt werden, das einen Mikroorganismus enthält und das zum Vermindern des Nitratgehalts von Tabak verwendet werden kann.

Durch die Erfindung wird nun ein Verfahren zur Verminderung des Nitratgehalts von Tabakmaterialien durch Behandlung mit

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Mikroorganismen zur Verfugung gestellt. Bei diesem Verfahren werden die Tabakmaterialien unter kontrollierten Bedingungen der Einwirkung eines Mikroorganismus unterworfen, der durch eine biochemische Reaktion den Gehalt an Nitraten vermindert. So behandelte Tabakmaterialien ergeben bei der Einarbeitung in ein Tabakrauchprodukt einen milden Rauch mit verminderten Stickoxid- und Cyanwasserstoff gehalten, ohne daß Verluste an den gewünschten Aroma-, Geschmacks- oder anderen Raucheigenschaften auftreten.

Die Erfindung baut sich auf der Feststellungauf, daß bestimmte Mikroorganismen in wäßriger Lösung, wenn sie mit Tabak in Kontakt kommen, den Nitratgehalt des Tabaks vermindern. Es ist festgestellt worden, daß bei Tabakmaterialien, die mit einer reinen Kultur voji speziellen Mikroorganismen behandelt werden, der Nitratgehalt der Tabakmaterialien vermindert wird. Hierdurch wird ein Tabakmaterial hergestellt, das beim Einbringen in eine Mischzigarette zu einer Verminderung der Abgabe von Stickoxiden und Cyanwasserstoff beiträgt. Eine bevorzugte Kultur ist z.B. Micrococcus denitrificans [Paracoccus denitrificans Am.Type Culture Collection Acession Nr. 17741, wie in BergeysManual of Determinative Bacteriology, herausgegeben von R.E.Buchanan und N.E.Gibbon, Seiten 438 bis 439, 8. Edition, beschrieben]. Es können aber auch andere Kulturen verwendet werden, wie z.B. Micrococcus halodenitrificans, Alcaligenes faecalis," Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Erwinia carotovora, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri und Thiobacillus denitrificans. Weiterhin können Nitrat enthaltende Verbindungen in Kombination mit den Mikroorganismen eingesetzt werden, wie z.B. Kaliumnitrat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und dergl..

Unter Verwendung der erfindungsgemäß vorgesehenen Kultur ist es zweckmäßig, Burley- oder im Rauchkanal geräucherte Blätt-

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chen oder Stengel zu behandeln und die darin vorhandenen Nitrate zu entfernen oder einen wäßrigen Extrakt eines dieser Materialien herzustellen und die Nitrate zu entfernen und sodann den behandelten Extrakt wieder zu den ursprünglichen Tabakmaterialien zuzusetzen. Durch die Möglichkeit, den Extrakt zu behandeln und ihn sodann wieder zu dem ursprünglichen Tabak zuzusetzen, werden Gewichtsverluste an löslichen Materialien vermieden, die bei der Verwendung von Wasser bei der Extraktion und dessen Verwerfung als Träger zur Entfernung von Nitrat auftreten. Hierdurch werden auch Verluste an anderen erwünschten Tabakkomponenten vermieden, die beim Extrahieren mit Wasser und Verwerfen auftreten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch zur Herstellung von rekonstituierten Tabakprodukten geeignet, bei der der Tabak extrahiert wird und der Extrakt in nachfolgende Prozeßstufen zurückgegeben wird, da dieses (mikrobielle) Enzymsystem wirksam in einem flüssigen System funktioniert. Bei dem Verfahren wird das Nitrat aufgebrochen und in gasförmigen Stickstoff umgewandelt, der an die Atmosphäre freigesetzt wird.

Es wurde festgestellt, daß der Anteil der Nitrat enthaltenden Verbindung im wäßrigen Medium mindestens 0,1 Gew.% des Mediums und vorzugsweise etwa 1% betragen sollte. Obgleich noch höhere prozentuale Mengen der Stickstoff enthaltenden Verbindungen angewendet werden können, bringt eine Erhöhung des Anteils der Nitrat enthaltenden Verbindung auf mehr als 1 Gew.?5 keine nennenswerte Verbesserung der Verminderungseigenschaften der Mikroorganismen mit sich.

Erfindungsgemäß geht man bei einer bevorzugten Methode zur Verminderung des Nitratgehalts des Tabaks so vor, daß man ein wäßriges Medium herstellt, das Mikroorganismen enthält, die Nitrate vermindern bzw. abbauen.

Bei der Herstellung eines wäßrigen Mediums wird eine (erste) Nähragarlösung hergestellt, indem ein handelsübliches Nähr-

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agar zu destilliertem Wasser gegeben wird, wobei die Agarmenge im allgemeinen mindestens 5 g/l beträgt. Bei einer vorgeschlagenen Methode wird hierzu eine Nitrat enthaltende Verbindung, vorzugsweise Kaliumnitrat, in einer Menge von mindestens 0,1 Gew.% Nitrat/Volumeneinheit Wasser und im allgemeinen von etwa 1 Gew.% Nitrat/Volumeneinheit Wasser zugesetzt.

Diese Lösung wird dann als Schrägkultur in Röhrchen oder Gläschen sterilisiert; d.h. Reagenzgläser, die die Nähragarlösung enthalten, werden sodann schräg angeordnet, um eine Schrägoberfläche in einem Autoklaven zu ergeben,und sie werden mindestens 15 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei 121⁰C erhitzt. Das sterilisierte Medium wird sodann für den späteren Gebrauch in einen Kühlschrank gegeben.

Eine zweite Lösung wird hergestellt, die eine Nitrat enthaltende Substanz enthält und die durch die in dem ersten Medium gewachsene Kultur behandelt werden soll. Eine solche zweite Lösung kann eine Nährbrühe sein, die Nitrate enthält und die hergestellt worden ist, indem eine handelsübliche Nährbrühe in destilliertem Wasser aufgelöst worden ist, wobei die Menge der Nährbrühe etwa 5 bis 10 g/l beträgt. Die Konzentration der Nährbrühe kann aber auch vom Fachmann verändert werden, wobei eine einsetzbare Kultur erhalten wird. Diese Lösung wird gleichfalls mindestens 15 Minuten bei mindestens 1,05 atü und 121⁰C oder mehr in einem Autoklaven sterilisiert. Kaliumnitrat oder andere Nitrat enthaltende Verbindungen können zu dieser Lösung vor der Sterilisation gegeben werden.

Ein weiteres Beispiel für eine zweite Lösung ist eine Tabakextraktbrühe, die Nitrate enthält. Die Tabakextraktbrühe wird hergestellt, indem man gewöhnlich etwa 100 g Tabakmaterial,

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z.B. ein im Rauchkanal geräuchertes Burleystengelgemisch, genommen wird, und dieses mit etwa 1000 ml Wasser vermischt wird, wonach dieses Gemisch in einem Autoklaven etwa 30 "bis 60 Minuten "bei mindestens 1,05 atü und 121⁰C oder mehr gekocht wird.

Der resultierende, flüssige Extrakt wird sodann entfernt und das Flüssigkeitsvolumen wird auf die ursprüngliche Menge des Extraktes durch Zugabe von destilliertem Wasser eingestellt. Der Extrakt wird sodann mit Hefeextrakt vermischt, wobei der Anteil des Hefeextrakts im allgemeinen mindestens 0,3 Gew.% des Volumens der Flüssigkeit beträgt. Gewünschtenfalls können jedoch auch größere Hefeextraktmengen verwendet werden. Das Gemisch wird in Kolben abgegeben, die mit Baumwolle zugestöpselt und mindestens 15 Minuten lang bei 1,05 atü oder mehr und 121⁰C oder mehr für die nachfolgende Kulturfortpflanzung sterilisiert werden. Vor der Verwendung zum Wachstum der Kultur wird der pH-Wert mit einer geeigneten Säure oder Base auf etwa 7,2 eingestellt. Der Mikroorganismus, vorzugsweise Micrococcus denitrificans, wird auf den Nähragarschrägkulturen 3 bis 5 Tage bei 5 bis 37°C inkubiert. Das resultierende Wachstum wird sodann zur Inokulierung der Tabakextraktbrühe, deren pH eingestellt worden ist, verwendet. Das Inokulum wird von den Schrägkulturen entfernt, indem die Schrägoberfläche mit einer vorgewählten Menge von destilliertem Wasser gewaschen wird. Die inokulierte Tabakextraktbrühe wird sodann im allgemeinen etwa 24 Stunden bei 5 bis 37°C gerührt, um das Wachstum der Kultur zu fördern.

Das resultierende Inokulum ist sodann zur Verwendung bei der Behandlung von Tabakmaterialien zur Verminderung des Nitratgehalts bereit.

Bei der Behandlung von (festen) Tabakmaterialien wird der pH-Wert des Tabaks mit einem Gemisch aus einer Base und Wasser

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auf etwa 7,0 Ms 7,2 eingestellt. Die Kultur wird sodann mit weiterem Wasser zugesetzt, und der so behandelte Tabak wird gewöhnlich in Kunststoff beutel gebracht, wo der Nitratabbau stattfindet.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Verfahrensweise zur Herstellung des Inokulums bzw. des Impfstoffs.

(a) Nähragar ·*· 1 ,0% Kaliumnitrat

Handelsübliches Nähragar (entwässerte Form) von Difco Laboratories wurde zu destilliertem Wasser im Verhältnis von 23 g/l gegeben. Die 23 g Nähragar enthielten 3 g Rindfleischextrakt, 5 g Pepton und 15 g Agar. Zu dieser Lösung wurde 1 Gew.% Kaliumnitrat/Volumeneinheit Wasser gegeben. Die resultierende Lösung hatte einen End-pH-Wert von 6,8.

Dieses Medium wurde sodann als Schrägkultur in Röhrchen in einem Autoklaven 15 min bei 1,05 atü und 121°C sterilisiert, abgekühlt und für die spätere Verwendung zum Wachstum von Kulturen gekühlt.

(b) Nährbrühe

Eine Lösung von Nährbrühemedien wurde hergestellt, indem entwässerte Nährbrühe von Difco Laboratories in einer Menge von 8 g/l zu destilliertem Wasser gegeben wurde. Die Nährbrühe enthielt 5 g Pepton und 3 g Rindfleischextrakt. Das resultierende, wäßrige Medium wurde sodann 15 min bei 1,05 atü und 121⁰C zum späteren Gebrauch bei dem Wachstum der Kultur sterilisiert.

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(c) Im Rauchkanal geräucherte/Burleystengel-Tabak-Extraktbrühe

Eine im Rauchkanal geräucherte/Burleystengel-Tabak-Extraktbrühe wurde hergestellt, indem 100 g im Rauchkanal geräucherte/Burleystengel zu 1000 ml Wasser gegeben wurden und indem das Gemisch 40 min bei 1,05 atü und 121⁰C im Autoklaven gekocht wurde. Der resultierende Flüssigkeitsextrakt wurde entfernt, und das Flüssigkeitsvolumen wurde auf seine ursprüngliche Menge mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Flüssigkeit wurde sodann mit Hefeextrakt (HE) in einer Menge von 0,5 Gew.% Hefeextrakt/Volumeneinheit Flüssigkeit vermischt, und das Gemisch wurde in Kolben eingefüllt, die mit Baumvrolle zugestöpselt und 15 min bei 1,05 atü und 121⁰C zur nachfolgenden Kulturfortpflanzung sterilisiert wurden.

(<i) Inokulierung der Brühe

Der Mikroorganismus, Micrococcus denitrificans (ATCC-Hinterlegungsnummer 17741), wurde auf den Nähragarschrägkulturen 3 bis 5 Tage bei 30°C inkubiert. Flüssige Medien, z.B. Hährbrühe oder im Rauchkanal geräucherte/Burleystengel-Tabak-Extraktbrühe, wurden im Verhältnis von 2% (Vol/Vol) mit einem sterilen Waschwasser der Kultur von Schrägkulturen inokuliert. Der pH-Wert der Brühe wurde vor der Inokulierung mit Salzsäure oder Natriumhydroxid auf etwa 7,2 bis 7,5 eingestellt. Die Kolben wurden sodann etwa 24 h bei 30⁰C und

160 U/min durchgerührt.
Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Nitratverminderung bzw. den Nitratabbau, die bzw. der in einem im Rauchkanal geräucherten/Burleystengel-Extrakt und im Rauchkanal geräucherten Stengelextrakt erfolgt.

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Micrococcus denitrificans (ATCC-Hinterlegungsnr.17741) wurde in einem gemäß Beispiel 1 hergestellten, im Rauchkanal geräucherten/Burleystengel-Extrakt (+0,5% HE) und in einem im Rauchkanal geräucherten Stengelextrakt, der wie folgt hergestellt worden war, gezüchtet.

15 kg im Rauchkanal geräucherte Stengel wurden mit 240 kg Wasser von 90⁰C während 30 min extrahiert. Der Extrakt wurde zentrifugiert, gesammelt und mit Hefeextrakt in einer Menge von 0,5/£ (Gew./Vol.) versetzt. Das Gemisch wurde 15 min bei 1,05 atü und 121⁰C sterilisiert. Beide Medien wurden nach der pH-Einstellung mit den Waschwässern von 4tägigen Schrägkulturen mit einer Menge von 10% (Vol/Vol) inokuliert und 24 h bei 160 U/min (Drehen) und 30°C in Erlenmeyerkolben (150 ml/ 500 ml Kolben) inkubiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Medium Wachstums- pH NO3

zeit (h) (/Ug7ml)

im Rauchkanal geräucherter/ 0 "-7,5O 2500

Burleystengel-Extrakt 16 8,10 59

+O,5?6 Hefeextrakt 20 8,29 57

24 - 55

im Rauchkanal geräucherter 0 ^ 7,50 716 Stengelextrakt 16 - 699

+0,5% Hefeextrakt 24 7,96 66

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß in beiden Extrakten das Nitrat im wesentlichen abgebaut bzw. vermindert wird.

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt die Effekte der Belüftung der Kulturmasse während des Nitratabbaus unter Verwendung des Mikroorganismus Micrococcus denitrificans.

Eine Kultur von Micrococcus denitrificans (ATCC 17741) wurde auf Nähragar + Λ% ΚΝΟ,-Schrägkulturen gezüchtet und sodann in im Rauchkanal geräucherter/Burleystengel-Extrakt-Brühe

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+ 0,5% Hefeextrakt in Schüttelkolben gemäß Beispiel 1 gezüchtet.

Diese Kultur wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt und als Inokulum bzw. Impfstoff für zwei separate Fermentatoren der gleichen Brühe + 0,5% Hefeextrakt verwendet. Die Wachstumsparameter für die Kultur in jedem Fermentator waren wie folgt.

Fermentator A Fermentator B

Parameter
Medium

im Rauchkanal geräu- im Rauchkanal gecherter/Burleystengelräucherter/Burley-Extrakt + 0,5% HE stengel-Extrakt

+ 0,5% HE

Volumen (1) 8

Rühren (U/min) 300

Belüften (cm3/min) 2000

Temperatur (⁰C) 30

pH-Einstellung/Kontrolle 7,8 Menge des Inokulums(% Vol/Vol) 5 (aus den Kolben)

Kontrollsäure (2N) HCl

Kontrollbase (2N) NaOH

300

O (keine)

7,8

HCl NaOH

Die bei diesen Bedingungen erhaltenen Züchtungsergebnisse sind in der folgenden Zusammenstellung aufgeführt.

Zeit der Probe	Fermentator	pH	A	Fermentator B	pH NO*	6,99 2900
abnahme	(belüftet)			(unbelüftet)	)(x10⁶/ml) (/ug/ml)	8,10 0
	Zellen	6,78	NO-=;	Zellen	0
	(x106/ml)	8,10	/ug7ml	9500	7,84 2590
vor d.Inokulierung	O		2630		7,85 350
Inokulum	,· 9500	7,91	O	90	7,92 34
Stunden nach der		7,82		4500	7,95 34
Inokulierung: 0	370	7,83	2690	-	7,95 34
16	7100	7,82	560	3700	7,97 33
17	—	7,81	0	-	7,94 33
18	8600	7,81	O	3400
19	-	7,75	0	3800
21	10400	0
22,5	9900	0

Diese Kulturen wurden sodann zur Behandlung von Burleytabakblättchen verwendet, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden.

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Belüftetes Inokulum aus d.Fermentator A

Unbelüftetes Inokulum aus d.Fennen-

	nasser Tabak PH	NO₃ *(%r*	tator B	NO* W.
Behandlungszeit (h)			nasser Tabak PH
inokulierter Tabak	7,11 8,27	3,27 0,57		3,41 1,30
0 24 ρ nicht inokulierte Kontrollprobe	7,17 7,60	3,14 3,32	7,52 8,13	2,85 2,90
0 24		7,20 7,49

Alle Behandlungen wurden wie folgt durchgeführt:

90 g (Trockengewicht) Burleyblättchen 20 ml 1N NaOH 116 ml Wasser 134 ml Inokulum

30⁰C in Kunststoffbeuteln mit eingeschränkter Luftverfügbarkeit

Alle Kontrollproben waren wie folgt:

90 g (Trockengewicht) Burleyblättchen 20 ml 1N NaOH 250.ml Wasser kein Inokulum

30°C in Kunststoffbeuteln mit eingeschränkter Luftverfügbarkeit.

Es wird ersichtlich, daß die belüftete Kultur die größte Zellmasse ergab und das Blattabaknitrat am besten abbaute. Jedoch ergab auch die nichtbelüftete Kultur ein großes Ausmaß des Abbaus des Bl^ttabaknitrats. Tabak, der mit Kulturen behandelt worden ist, die bei jedem Satz von Bedingungen gezüchtet worden sind, ist für Tabakprodukte annehmbar.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt den Nitratabbau von inokuliertem Tabak.

2,3 kg Burleytabak wurden mit einer belüfteten Kultur von Micrococcus denitrificans (ATCC 17741) behandelt, die 22 h gemäß Beispiel 3 gezüchtet worden war. Der behandelte Tabak

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wurde bei 30⁰C in einem Kunststoffbeutel unter Verwendung der folgenden Materialien behandelt:

Inokulum (ml) 2880 Tabakgewicht (g) 2270 1N NaOH (ml) 449,5 Leitungswasser(ml)2572

Bei dieser Behandlung wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Behandlungszeit (h) Nasser Tabak

pH

inokulierter Tabak (Tabakgewicht 2270 g)

0 18 21

nicht inokulierte Kontrollprobe (Tabakgewicht 90 g)

0 21

Es wird ersichtlich, daß der Nitratgehalt des behandelten Tabaks von 2,95% auf 1,44% vermindert wurde (51%ige Vermin derung) , während sich der Nitratgehalt der Kontrollprobe nicht vermindert hatte.

Beispiel

6,98	2,95
7,44	1,82
7,58	1,44
7,14	2,78
7,24	3,21

Dieses Beispiel zeigt die Verminderung von Stickoxiden (NOx) und Cyanwasserstoff (HCN) im Rauch eines Tabakproduktes, wenn ein Tabak verwendet wird, der einem Nitratabbau durch den Mikroorganismus MicroQoccus denitrificans unterworfen worden war.

908 g Burleytabakblättchen wurden mit 2864 ml Micrococcus denitrificans vermischt, der in im Rauchkanal geräuchertem/ Burleystengel-Extrakt gemäß Beispiel 1 gezüchtet worden war. Es wurde kein weiteres Wasser zugesetzt und es erfolgte auch keine pH-Einstellung vor der Inokulierung. Der Tabak wurde gründlich gemischt, in einen Kunststoffbeutel eingegeben und 24 h bei 30⁰C inkubiert.

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Behandlungs- Nitrat pH Feuchtigkeit

zeit 7h) (%) (°/o)

0 2,13 7,25 ~ 75

18 1,57 -

24 0,91 7,95 ·~75

Bei dieser Tabakbehandlung diente das flüssige Inokulum zu drei Zwecken:

(1) Einstellung des Anfangstabak-pH-Werts (AusgangspH-Wert bei ^5,8);

(2) Erhöhung der Tabakfeuchtigkeit (Ziel 75%);

(3) Zuführung der Kultur zum Abbau des Nitrats.

Nach der mikrobieilen Behandlung wurden die Burleytabake mit anderen Standardmischungskomponenten vermischt, wobei der Gesamtmischungsnitratgehalt 1,16% im Vergleich zu 1,69% für die nichtbehandelte Kontrollmischung betrug.

Zwei gesonderte Mischungen wurden zu Zigaretten verformt und auf einer Rauchmaschine mit konstantem Vakuum geraucht. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Probe	Mischungs-	Abgabe	pro	Zug	Zug	Nr.
	nitrat(%)	NOx	HCN (/Ui	g)	7, 7,	2 3
unbehandelte Kon trollprobe behandelte Probe	1,69 1,16	40 33	13 11	,5 ,8

Es wird ersichtlich, daß der Anteil der Stickoxide in dem Rauch in der Probe, die den behandelten Tabak enthielt, signifikant vermindert wurde (17,5%). Weiterhin wird die Cyanwasserstoff abgabe in der Probe, die behandelten Tabak enthielt, vermindert (12,6%). Die Abgaben aller anderen Komponenten bleiben praktisch unverändert.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Verminderung von Stickoxiden (NOx) und Cyanwasserstoff (HCN) in einem Tabakprodukt bei Verwen-

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dung eines Tabaks, der einem Nitratabbau durch den Mikroorganismus Micrococcus denitrificans unterworfen waren war. Micrococcus denitrificans (ATCC Nr.17741) wurde gemäß Beispiel 3 gezüchtet (Fermentator "A"-Bedingungen) und 24 h in geschlossenen Kunststoffbeuteln bei 30⁰C zur Behandlung von Burleytabak verwendet. Das Nitrat in dem Wachstumsmedium hatte sich nach 17 h erschöpft.

Es wurden die folgenden Materialmengen verwendet:

Inokulum (ml) 1716

1N NaOH (ml) 270

Wasser (ml) 1555

Tabak (g) 1362

Es wurden folgende Ergebnisse der Tabakbehandlung erhalten: Behandlungs- Nasser Tabak NO_x(%) Feuchtigkeit zeit (h) pH ° (⁰/q)

inokulierter Tabak

0 7,21 2,51 75,7

21 7,70 1,33 73,9

24 - 1,33

luftgetrocknet 8,28 1,41

Nach der Behandlung wurden die Burleyblättchen mit anderen Tabakkomponenten vermischt und zu Zigaretten verformt, die auf einer Rauchmaschine mit konstantem Vakuum geraucht wurden. Ein Kontrollprodukt ohne behandelte Blättchen, das jedoch nichtbehandelte Burleyblättchen enthielt, wurde gleichfalls in der Maschine geraucht. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Probe	Mischungs-	NOx (/u	Abgaben pro Zu	Zug Nr.
	nitrat(%)	61 49	S) HCN (/Ug)	7,04 7,08
Kontrolle Versuch	1,70 1,36	33 30

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die Stickoxide in dem Produkt mit behandeltem Tabak signifikant vermindert worden waren (19,7%). Weiterhin wurde in dem Produkt mit behandeltem Tabak die Cyanwasserstoffabgabe vermindert (9,1%).

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Beispiel

Dieses Beispiel beschreibt die Extraktion von Tabakblättchen mit Wasser zur Entfernung von Nitrat und die Behandlung des
Extrakts mit Micrococcus denitrificans (ATCC Nr.17741), um
daraus das Nitrat zu entfernen, wobei sodann der modifizierte Extrakt zurück in den ursprünglichen Tabak gegeben wird.

Ein Tabakextrakt wurde hergestellt, indem 100 g Burleyblättchen mit 1 1 Wasser vermischt wurden und das Gemisch 2 h bei Raumbedingungen stehengelassen wurde. Zu diesem Zeitpunkt
wurde der Extrakt gesammelt, indem die Flüssigkeit dekantiert wurde und der Tabak zur Entfernung zusätzlicher Flüssigkeit
gepreßt wurde. Der Tabak wurde in Raumluft zum Trocknen ausgebreitet, während der Extrakt (^/700 ml) einer mikrobiellen Behandlung unterworfen wurde.

Eine reife Kultur von Micrococcus denitrificans wurde in einem im Rauchkanal geräucherten/Burleystengel-Extraktmedium,
hergestellt gemäß Beispiel 1, gezüchtet und zu dem Tabakextrakt gegeben, der,wie vorstehend beschrieben, hergestellt worden war. Die Zugabe erfolgte in einer Menge von 10% (Vol/ VoI). Vor der Zugabe der Kultur wurde der pH-Wert des Extrakts auf 7,0+0,1 erhöht. Die Kultur wurde in dem Extrakt in einem Erlenmeyerkolben auf einem Drehschüttler bei 30⁰C inkubiert. Die folgenden chemischen Veränderungen erfolgten während der

18h Inkubationszeit:'

Micrococcus denitrificans-Behandlung NO, ( /ug)
des Burley.blättchen-Extrakts ^D '

Burleyblättchen-Extrakt 1872

reife Micrococcus denitrificans-Kultur 64

Extrakt nach der Behandlung (18 h) 66

Die Werte zeigen, daß das Nitrat durch die Behandlung fast
vollständig abgebaut worden war ( etwa 96%).

Nach der 18stündigen Inkubation \mrde der behandelte Extrakt zurück in den ursprünglich extrahierten Tabak in drei Stufen

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1	,96
O	,72
O	,44

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wegen des großen Volumens des behandelten Extrakts gegeben. Dies erfolgte, indem ein Teil zugesetzt wurde, gründlich vermischt und an der Luft getrocknet wurde, bevor die nächste Zugabe erfolgte. Die folgenden chemischen Veränderungen resultierten von dieser Verfahrensweise:
Tabakanalyse NO^ (%)

Burleyblättchen:
vor der Extraktion
nach der Extraktion
nach Rückgabe des behandelten Extrakts

Die Werte zeigen, daß 77% des Nitrats durch die Micrococcus denitrificans-Behandlung entfernt worden waren.

Die bei dieser Verfahrensweise erhaltenen Tabake waren für Herstellungsprozesse geeignet.

Bei bestimmten Herstellungsverfahren von rekonstituiertem Tabak ist die Stufe der Extraktion der löslichen Tabakstoffe ein integraler Teil des Gesamtprozesses. Wenn es bevorzugt wird, dann kann der resultierende Extrakttabak durch Papierherstellungstechniken zu einer Grundplatte verarbeitet werden, zu dem dann der Extrakt, aus dem das Nitrat durch mikrobielle Behandlung entfernt worden ist, auf normale Weise zurückgegeben wird.

Beispiel 8 .

Dieses Beispiel zeigt einige Unterschiede des Endprodukts, die erhalten werden können, wenn man eine Ultrafiltrationseinrichtung in Verbindung mit der Tabakextraktion der Extraktbehandlung und der Zurückgabe des Extrakts gemäß Beispiel 7 anwendet. Der hierbei verwendete Tabak stammte von der gleichen Quelle wie derjenige des Beispiels 7.

Ein Burleyblättchenextrakt wurde wie in Beispiel 7 hergestellt. Der Extrakt wurde sodann mit einem Filter mit einer

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Porengröße von 0,2 Mikron in einer Amicon Ultrafiltrationsvorrichtung (Modell TCF10) filtriert, bevor der filtrierte Extrakt mit Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 17741) inokuliert und gemäß Beispiel 7 behandelt wurde. Nach der Behandlung wurde der Extrakt erneut filtriert (Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikron), bevor die Zurückführung begonnen wurde. Die auf dem Filter während der ersten Filtration zurückgehaltenen Materialien und das durchgegangene Produkt von der zweiten Filtration wurden zu dem extrahierten Tabak zurückgegeben.

Die durch den Filter während der zweiten Filtration zurückgehaltenen Materialien wurden nicht in den Tabak zurückgegeben. Die folgenden chemischen Veränderungen traten in dem Extrakt auf:

Chemische Veränderungen während der Ultrafiltration NCU und Behandlung mit Micrococcus denitrificans von / „„r,χ Burleytabak ⁽ /^MD

Burleyblättchen-Extrakt 1872

reife Micrococcus denitrificans-Kultur 64

Extrakt nach der Filtration 2028 Extrakt nach der Micrococcus denitrificans-

Behandlung 646

Die folgenden chemischen Veränderungen wurden in dem Tabak während der Extraktion und Behandlung gemessen: Tabakanalyse NO3 (%)

Burleyblättchen

vor der Extraktion . 1,96

nach der Extraktion' 0,72

nach Zurückgabe des behandelten Extrakts 0,85

Diese Ergebnisse zeigen, daß Nitrat aus dem Extrakt durch Micrococcus denitrificans entfernt wird, daß aber im Gegensatz zu Beispiel 7 keine weitere Entfernung von dem extrahierten Tabak während der Rückgabeverfahrensweisen stattfindet. In diesem Beispiel kontaktieren die Mikrobenzellen den Tabak nicht, während in Beispiel 7 die Zellen den Tabak während der Rückgabe kontaktieren und weitere chemische Veränderungen hervorrufen.

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Die hierbei erhaltenen Tabake waren für Herstellungszwecke geeignet.

Andere Filter (mit anderen Porengrößen) können in der ersten Filtrationsstufe (in den Beispielen 7 und 8) verwendet v/erden, um zu verhindern, daß viele der größeren, extrahierten Moleküle der möglichen mikrobiellen Einwirkung ausgesetzt sind. Bei jeder Verwendung ist der resultierende Extrakt weniger modifiziert, und es wird ein weniger stark modifizierter Tabak erhalten.

Beispiel 9

Dieses Beispiel beschreibt die Fähigkeit von Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 19367), Nitrate im Tabak abzubauen.

Micrococcus denitrificans (ATCC-Hinterlegungsnr. 19367) wurde in einer im Rauchkanal geräucherten/Burleystengel-Extrakt-Brühe (+0,5% HE), hergestellt gemäß Beispiel 1, gezüchtet. Die Kontroll- und Versuchskulturbrühen wurden vor dem Gebrauch mit 2,4 ml 1N NaOH/Kolben auf einen pH-Wert von ungefähr 7,2 eingestellt. Alle Kolben wurden 24 h bei 30°C und 160 U/min inkubiert. Diejenigen Kolben, die für das Zellwachstum verwendet wurden, wurden mit Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 19367) in einer Menge von 2% (Vol/Vol) inokuliert. Die nachfolgende Tabelle zeigt den Nitratabbau durch diese Kultur.

Satz 1 Zeit (h) pH NO^/Ug/ml)

Kontrοlibruhe (nicht inokuliert)

0 7,28 2251

6 7,19 2281

24 7,18 2025

Versuchsbrühe (inokuliert)

0 7,19 1975

6 7,10 2031

24 8,18 51

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Micrococcus denitrificans wurde in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, gezüchtet und chemische Analysen wurden in verschiedenen Zwischenzeitintervallen durchgeführt, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Satz 2 Zeit (h) pH NO^Cy

Kontrollbrühe(nicht inokuliert)

0 7,28 2251

6 7,19 2281

24 7,18 2025

Versuchsbrühe (inokuliert)

0 7,22 2226

18 7,92 1605

24 8,17 0

Die Versuchskulturen der Sätze 1 und 2 wurden dazu verwendet, um Burleyblättchen 24 h bei 30⁰C in Kunststoffbeuteln wie folgt zu behandeln:

Materialien für die Behandlung

	Tabak (g) 1N NH/,0H(ml)	Wasser(ml)	Inokulum(ml)
behandelt Kontrolle	50 10,3 50 10,3	69,5 139,7	70,2 0
	Behandlungszeit (h)	pH	NO, (90
Satz 1
behandelt	0 24	7,34 7,28	2,91 1,07
Kontrolle	0 24	7,48 7,09	2,87 2,58
Satz 2
behandelt	0 24	7,49 7,43	3,10 1,86
Kontrolle	0 24	7,43 7,04	3,32 3,61

Es wird ersichtlich, daß Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 19367) bis zu 63% des Nitrats in Burleyblättchen abbaute, während bei dem Kontrolltabak eine geringe Verminderung des Nitrats festzustellen war.

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Beispiel 10

Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit von Micrococcus denitrificans (ATCC-Hinterlegungs-Nr. 17741) zur Entfernung von Nitrat aus einem Extrakt eines rekonstituierten Tabakgemisches.

Ein wäßriger Extrakt wurde wie folgt hergestellt. 150 g rekonstituierter Tabak wurden in 1 1 Wasser etwa 1 min in einem Waringmischer aufgeschlämmt. Das Gemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur gehalten, und sodann wurde die Flüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt und zu dem ursprünglichen Volumen zurückgebracht, um 15 min bei 121⁰C und 1,05 atü sterilisiert zu werden. Hefeextrakt (HE) wurde in einer Menge von 0,5% (Gew./Vol.) vor der Sterilisation zugesetzt. Im Rauchkanal geräucherter/Burleystengel-Extrakt (mit einem Zusatz von 0,5% Hefeextrakt, hergestellt gemäß Beispiel 1) wurde als Standardextrakt verwendet. Der pH-Wert der Brühe wurde eingestellt, bevor der Standard (Kontrolle)-Extrakt und der Versuchsextrakt mit Micrococcus denitrificans inokuliert wurde. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Standardextrakt Wachstumszeit (h) NO^ (/ug/ml) pH

0 1896 7,37

24 0 8,07

i Versuchs extrakt Wachstumszeit (h) ' NO^ ( /ug/ml) pH

0 2220 - 7,31

24 2256 6,95

48 227 7,95

Diese Werte zeigen, daß die Kultur das Nitrat eines Extrakts von rekonstituierten Tabaken wirksam abbauen kann.

Beispiel 11

Dieses Beispiel zeigt die Effekte von aerobischen und anaerobisehen Tabakbehandlungen.

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Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 17741) wurde in einer im Rauchkanal geräucherten/Burleystengel-Extrakt-Brühe mit zugesetztem 0,5% Hefeextrakt 24 h lang in einem Versuchsfermentator (New Brunswick Scientific Fermentor MF 214) unter folgenden Bedingungen gezüchtet:

Parameter

Rühren (U/min)	300
Belüften (cm⁵/min)	0
Medium: im Rauchkanal geräucherter/ Burleys tengel-Extrakt	+0,5?£ HE
Volumen des Mediums (l)	8
Temperatur (⁰C)	30
Ausgangs-pH-Wert (nichtkontrolliert)	7,8
Inokulierungsrate {%)	5
Inokulierungsalter (h)	24
Antischaummittel (Dow Chemical)	p-1200
Die Kultur war am Beginn und nach 24	h durch folgende Vierte
charakterisiert:
Zeit (h) NO^ (/ug/ml)	7,74 8,20
0 2169 24 52

Nach 24 h wurde die Kultur zur Behandlung von Burleytabak unter aerobischen und anaerobischen Bedingungen verwendet, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Aerobe Behandlungen

	*	pH	Zeit l	0	\|y^^_ VyDy	lh)	7,03 7,65	24	NO₃W
		7,20 7,59				3,27 1,81
	6,93 7,49	PH		3,79 1,61
Kontrolle Behandlung	3,39 7,41 3,39 7,92 Anaerobe Behandlungen
Kontrolle Behandlung	3,39 3,39

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2S22284

Alle Tabake hatten einen Feuchtigkeitsgehalt von ungefähr 75% und sie wurden 24 h bei 3O⁰C in Kunststoffbeuteln gelagert. Die anaerob erfolgenden Behandlungen wurden in BBL (Baltimore Biological Laboratories)-Standzylindern für anaerobe Systeme "Gaspak" unter· Verwendung von BBL-Katalysator zur Bindung von Luftsauerstoff durchgeführt.

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die Erfindung unter anaeroben Bedingungen und unter Bedingungen, wenn eine Verfügbarkeit von Sauerstoff nicht kontrolliert wird, durchgeführt werden kann.

Beispiel 12

Dieses Beispiel zeigt den Effekt der Behandlung von Tabak mit Zellen sowie der überstehenden Flüssigkeit vom Zellwachstum.

Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 17741) wurde in Kolben mit im Rauchkanal geräucherter /Bur leystengel-Extrakt-Brühe. unter Zusatz von 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, hergestellt gemäß Beispiel 1(c), gezüchtet. Die Inokulierung des Kolbens und die Inkubation erfolgten wie in Beispiel 1 (d) . Am Ende der Wachstumsperiode wurde die Kultur gemäß Fig. 1 behandelt.

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Fig. 1

Kultur

Aufteilung

Tabakbe- Zentrifugieren (10 000 U/min während 15 min handlung ^ unter Verwendung eines Kopfes

vom GSA-Typ in einer Sorvall Zellpell'ets \ RC2-B-Zentrifuge)

überstehendes Produkt

Aufteilung

I ,

Aufteilung

Millipore (0,22/um)

Filtration

Mrftm Wasser resüspendiert

Mi s chen/Susp endieren

Tabakbehandlung

Inokulierung von frischem im Rauchkanal

Inokulierung
von frischem
im Rauchkanal
geräuchertem/
Burleyextrakt

Tabakbehandlung

Burleyextrakt

Inkubation

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Bei den in der Figur dargestellten Verfahrensweisen wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Tabelle I

Kulturherstellun^	Zeit (h)	NO^ ( /ug/ml) 1618 1550	0,55^ HE
	0 24	1575 36	JEi- 7,13 7,04
	0 24	0 34 36	7,20 8,02
Im Rauchkanal geräucherte/Burl ey-Extrakt-Brühe mit	resuspendierte Zellen überstehendes Produkt filtriertes überstehendes Produkt		8,18 8,15 8,26

Kontrolle (nicht inokuliert)
inokuliert

Die resuspendierten Zellen und das filtrierte überstehende Produkt wurden zur Inokulierung von gesonderten, frischen Kolben mit im Rauchkanal geräucherter/Burley-Extrakt-Brühe mit 10 ml/Kolben (250 ml Extrakt/500 ml Kolben) verwendet. Es wurde 24 h bei 30°C und 160 U/min inkubiert- Der Extrakt wurde gemäß Beispiel 1 hergestellt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle II

Zeit (h) H0^(/ug/ml) pji

resuspendierte Zellen 0 1530 7,00

24 0 8,11

filtriertes überstehen- 0 1576 7,11 des Produkt 24 1464 6,99

Die resuspendierten Zellen, die ursprüngliche Kultur, das filtrierte überstehende Produkt und das nichtfiltrierte überstehende Produkt wurden alle gesondert zur Behandlung von 50 g-Proben von im Rauchkanal geräucherten/Burleystengeln mit etwa 75% Feuchtigkeit über einen Zeitraum von 24 h bei 30°C in Kunststoffbeuteln verwendet. Bei einer Kontrollprobe wurde der pH-Wert eingestellt und es wurde ohne Inokulum mit Wasser behandelt.

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Tabelle III Zur Tabakbehandlung zugesetzte Materialien

Tabak, behandelt mit:	Steriles, de stilliertes Wasser (ml)	1N NaOH Base (ml)	Inokulum (ml)
	140,2	9,8	keines
Kontrolle (nichts)	96,1	9,8	44,1
ursprünglicher Kultur	96,1	9,8	44,1
resuspendierten Zellen	96,1	9,8	44,1
überstehendem Produkt	96,1	9,8	44,1
filtr.überst.Produkt

Die folgenden Ergebnisse wurden bei diesen Tabakbehandlungen erhalten:

Tabakbehandlungen
Kontrolle (kein Inokulum)
ursprüngliche Kultur
resuspendierte Zellen
überstehendes Produkt
filtr.überst.Produkt

Tabelle IV

Zeit (h)

0 24

24

0 24

24

NO₃ (%)	pH
4,57 4,65	6,97 7,09
4,41 2,86	7,18 7,59
4,52 0,94	7,01 7,65
4,45 4,38	7,27 7,13
4,41 4,48	7,07 7,15

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die überstehende Flüssigkeit,in der die Kultur gezüchtet wird, keine genügende Kultur zum Abbau von Nitraten in Tabak ergibt.

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Claims

31. Mai 1979 P 13 889

BRQWH & WILLIAMSON TOBACCO CORPORATION 1600 West Hill Street, Louisville, Kentucky 40232, USA

Vdriahren zur Verminderung des Nitratgehalts von Tabak

Patentansprüche

1. Verfahren zur Verminderung des Nitratgehalts von Tabak, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Tabak mit einem wäßrigen Medium kontaktiert, das einen Mikroorganismus enthält, der den Nitratgehalt des Tabaks vermindert bzw. abbaut, und daß man

(b) den Tabak mit dem Mikroorganismus etwa 18 Stunden bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 37°C in Kontakt hält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium eine Nitrat enthaltende Verbindung enthält.

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitratverbindung aus der Gruppe Kaliumnitrat, Natriumnitrat und Ammoniumnitrat ausgewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der Nitratverbindung im Bereich von etwa 0,1 bis 1,0 Gev.% des wäßrigen Mediums liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micrococcus denitrificans verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontaktierung bei einem pH-Wert von etwa 7,0
bis 9,5 durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das wäßrige Medium dadurch herstellt, daß man

(a) mindestens 5 Gew.96 Nähragar zu Wasser unter
Bildung einer ersten Lösung gibt;

(b) 0,1 bis 1,0 Gew.Ji einer Nitratverbindung zu
dieser ersten Lösung zusetzt;

(c) diese erste Lösung sterilisiert, indem man sie mindestens 15 Minuten lang bei 1,05 atü (15 psig) und 121⁰C behandelt;

(d) Micrococtjus denitrifican3 zu dem sterilisierten Medium zusetzt und den Micrococcus denitrificans 3 bia 5 Tage lang bei etwa ßßr bis &6°C inkubieren läßt; und daß nan

(e) resultierendes Wachstum von dem Medium ent-

fernt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Steril! si er ung des ersten Mediums in einem Reagenzglas auf einer Schrägkultur durchführt, wobei eine
Schrägoberfläche für das Wachstum vorgesehen ist.

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9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Tabakextraktbrühe herstellt, indem man

(a) Tabakmaterial zu Wasser unter Bildung einer zweiten Lösung gibt;

(b) diese zweite Lösung in einem Gefäß mindestens 40 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei einer Temperatur von mindestens 121⁰C kocht;

(c) die gekochte, zweite Lösung mit Wasser auf ungefähr ihr ursprüngliches Volumen einstellt;

(d) Hefeextrakt in einer Menge von etwa 0,1 bis 2,0 Gew.96 Extrakt/Volumeneinheit zumischt;

(e) diese zweite Lösung mindestens 15 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 pslg) und bei einer Temperatur von mindestens 121⁰C sterilisiert; und daß man

(f) das resultierende Wachstum von der Nähragar-Nitrat-Verbindung zu der sterilisierten zweiten Lösung zusetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufrechterhaltung des Tabaks in Kontakt mit dem Mikroorganismus in Abwesenheit von freiem Sauerstoff vornimmt .

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufrechterhaltung des Tabaks in Kontakt mit dem Mikroorganismus in Anwesenheit von Sauerstoff vornimmt.

12. Verfahren zur Herstellung eines mikrobielle Substanzen enthaltenden Mediums zur Verwendung bei der Verminderung des Nitratgehalts von damit zu behandelnden Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) mindestens 5 Gew.% Nähragar zu Wasser unter Bildung einer ersten Lösung gibt;

(b) 0,5 bis 1,0 Gew.% einer Nitrat enthaltenden Verbindung zu der ersten Lösung zusetzt;

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(c) diese erste Lösung sterilisiert, indem man sie mindestens 15 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) auf mindestens 121⁰C erhitzt;und

(d) Micrococcus denitrificans zu dem ersten Medium zusetzt und diese erste Lösung etwa 3 bis 5 Tage lang bei etwa ,20 bis AO⁰C inkubieren läßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitrat enthaltende Verbindung Kaliumnitrat ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sterilisierung des ersten Mediums innerhalb eines Reagenzglases auf einer Schrägkultur vornimmt, wobei eine Schrägoberfläche für das Wachstum vorgesehen ist.

15. Verfahren zur Verminderung des Nitratgehalts von Tabak, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Tabak in eine wäßrige Lösung einmischt;

(b) den Tabak aus der wäßrigen Lösung herausnimmt, wodurch eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt;

(c) Micrococcus denitrificans zu der Brühe zusetzt;

(d) den Micrococcus denitrificans inkubiert; und

(e) den inkubierten Micrococcus denitrificans in der Brühe zu dem Tabak zusetzt.

16. Verfahren naph Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßrige Lösung Wasser verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Brühe nach der Stufe (b) sterilisiert.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sterilisation mindestens 15 Minuten lang bei einem Druck von mindestens 1,05 atü (15 psig) und einer Temperatur von mindestens 121⁰C vornimmt.

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19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Hefeextrakt zu der Brühe vor der Zugabe von Micrococcus denitrificans zusetzt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des Hefeextraktes etwa 0,1 bis 2,0 Gew.% der Brühe beträgt.

21. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Inkubierung rührt.

22. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Brühe vor der Zugabe von Micrococcus denitrificans- auf 7,0 bis 9,5 einstellt.

23. Verfahren zur Verminderung des Nitratgehalts von Tabak, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Tabak in eine wäßrige Lösung einmischt;

(b) den Tabak aus der wäßrigen Lösung entfernt, wodurch eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt;

(c) die Tabakextraktbrühe durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein erstes Retentionsprodukt zurückgehalten wird und der Durchtritt von vorgewählten Extraktkomponenten gestattet wird, wodurch ein erstes durchgegangenes Produkt erhalten wird, und daß man

(d) das erste durchgegangene Produkt, das die vorgewählten Extraktkomponenten enthält, mit Micrococcus denitrificans zur Entfernung von Nitrat behandelt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man

(e) das erste, behandelte, durchgegangene Produkt durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein zweites Reten-

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tionsprodukt zurückgehalten wird, das den Micrococcus denitrificans enthält,und daß der Durchtritt des behandelten Extrakt gestattet wird, wobei der behandelte Extrakt ein zweites durchgegangenes Produkt darstellt;

(f) das zweite durchgegangene Produkt mit dem ersten Retentionsprodukt vermischt; und daß man

(g) das Gemisch aus zweitem durchgegangenem Produkt und erstem Retentionsprodukt zu dem in der Stufe (b) herausgenommenem Tabak zusetzt.

25. Tabakprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß es durch ein Verfahren zur Verminderung des Nitratgehalts von Tabak erhalten worden ist, bei dem man

(a) Tabak mit einem wäßrigen Medium kontaktiert, das einen Mikroorganismus enthält, der den Nitratgehalt des Tabaks vermindert bzw. abbaut, und daß man

(b) den Tabak mit dem Mikroorganismus etwa 18 Stunden bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 37 C in Kontakt hält.

26. Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium eine Nitrat enthaltende Verbindung enthält.

27. Produkt nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitratverbindung aus der Gruppe Kaliumnitrat, Natriumnitrat und Ammoniumnitrat ausgewählt ist.

28. Produkt nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der Nitratverbindung im Bereich von etwa 0,1 bis 1,0 Gew.% des wäßrigen Mediums liegt.

29. Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micrococcus denitrificans verwendet.

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30. Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontaktierung bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 9,5 durchführt.

31. Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man das wäßrige Medium dadurch herstellt, daß man

(a) mindestens 5 Gew.% Nähragar zu Wasser unter Bildung einer ersten Lösung gibt;

(b) 0,1 bis 1,0 Gew.% einer Kitratverbindung zu dieser ersten Lösung zusetzt;

(c) diese erste Lösung sterilisiert, indem man sie mindestens 15 Minuten lang bei 1,05 atü (15 psig) und 121⁰C behandelt;

(d) Micrococcus denitrificans zu dem sterilisierten Medium zusetzt und^den Micrococcus.denitrificans 3 bis 5 Tage lang bei etwa ?ß bis 40°C inkubieren läßt;und daß man

(e) resultierendes Wachstum von dem Medium entfernt.

32. Produkt nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sterilisierung des ersten Mediums in einem Reagenzglas auf einer Schrägkultur durchführt, wobei eine Schrägoberfläche für das Wachstum vorgesehen ist.

33. Produkt nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Tabakextraktbrühe herstellt, indem man

(a) Tabakmaterial zu Wasser unter Bildung einer zweiten Lösung gibt;

(b) diese zweite Lösung in einem Gefäß mindestens 40 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei einer Temperatur von mindestens 121⁰C kocht;

(c) die gekochte, zweite Lösung mit Wasser auf ungefähr ihr ursprüngliches Volumen einstellt;

(d) Hefeextrakt in einer Menge von etwa 0,1 bis 2,0 Gew.% Extrakt/Volumeneinheit zumischt;

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(e) diese zweite Lösung mindestens 15 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei einer Temperatur von mindestens 121⁰C sterilisiert; und daß man

(f) das resultierende Wachstum von der Nähragar-Nitratverbindung zu der sterilisierten zweiten Lösung zusetzt.

34. Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufrechterhaltung des Tabaks in Kontakt mit dem Mikroorganismus in Abwesenheit von freiem Sauerstoff vornimmt.

35· Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufrechterhaltung des Tabaks in Kontakt mit dem Mikroorganismus in Anwesenheit von Sauerstoff vornimmt.

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