DE1442090B2

DE1442090B2 - Verfahren zur Abtrennung von proteinhaltigen Mikroorganismenzellen in Biosynthese Prozessen

Info

Publication number: DE1442090B2
Application number: DE1442090A
Authority: DE
Inventors: Robert P. Millburn Cahn; John W. Atlantic Highlands Frankenfeld; Philip Troy Hills Zaybekian
Original assignee: Esso Research and Engineering Co
Current assignee: ExxonMobil Technology and Engineering Co
Priority date: 1964-06-10
Filing date: 1965-06-09
Publication date: 1973-10-11
Also published as: FR1474722A; US3427223A; BE679847A; JPS5115112B1; GB1062005A; DE1442090C3; NL6606301A; DE1442090A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von proteinhaltigen Mikroorganismenzellen, die in einem wäßrigen Medium, welches die Zellen eines geeigneten Mikroorganismus als Inokulum sowie einen Kohlenwasserstoff einerseits als auch Sauerstoff und essentielle Zusätze andererseits als Nährstoffquellen enthält, durch Biosynthese gezüchtet wurden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Biosynthesebad eine wäßrige Aufschlämmung der Mikrobenzellen abzieht und mit

1. Phosphorsäure, Metaphosphorsäure, Orthophosphorsäure, Pyrophosphorsäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, niederen alkylsubstituierten Phosphinsäuren, orthophosphoriger Säure metaphosphoriger Säure, Schwefelsäure oder Salpetersäure sowie Mischungen aus zwei oder meh; dieser Säuren, oder

2. einer Mischung von 1. mit einem Salz, welche; ebenfalls einen essentiellen Zellnährstoff darstellt versetzt, und zwar in solchen Mengen, daß der pH-Wert der abgezogenen wäßrigen Lösung auf zwischen etwa 2,5 und etwa 5,5 herabgesetzt wird, die so behandelte wäßrige Aufschlämmung auf eine Temperatur erhitzt, die über der Zellwachstemperatur, aber unterhalb der Temperatur, bei welcher ein nennenswerter Proteinabbau eintritt, und schließlich das Zellmaterial in üblicher Weise von der nährstoffhaltigen wäßrigen Phase abtrennt.

Das Abtrennen kann kontinuierlich oder absatzweise durchgeführt werden. Die Abtrennung der Zellen aus der wäßrigen Lösung erfolgt so, daß man ein Zellmaterial und einen nährstoffhaltigen Rückstand, z. B. als überstehende Lösung oder als Filtrat. erhält. Der nährstoffhaltige Rückstand wird vorzugsweise erneut in einem weiteren Biosyntheseprozeß verwendet und in ein Bad, in dem die Zellen gezüchtet werden, zurückgeleitet. Dabei kann zusätzlich eine basische, vorzugsweise eine stickstoffhaltige Verbindung als Nährstoff dem Biosynthesebad zugeführt werden, und zwar in Mengen, die ausreichen, den pH-Wert des Bades auf einer für das Zellwachstum günstigen Höhe zu halten. Die basische Nährstoffverbindung kann dazu verwendet werden, Schwankungen des pH-Wertes, die gelegentlich bei der Rückführung der sauren Nährstoffverbindung auftreten können, auszugleichen.

Von Vorteil ist es, wenn der pH-Wert der angesäuerten Aufschlämmung vor dem Erhitzen zwischen 2,7 und 4,5 liegt.

Die gegenwärtige Weltknappheit an Proteinen, insbesondere billigen Proteinen, die sowohl der tierischen als auch der menschlichen Ernährung dienen können, ist bekannt. In einem Versuch, diese Proteinknappheit zu vermindern, sind kürzlich verschiedene Biosyntheseprozesse entwickelt worden, mit deren Hilfe lebendes Protein durch Züchtung von Bakterien oder anderen Mikroorganismen auf verschiedenen Wasserstoff und Kohlenstoff enthaltenden Nährböden, insbesondere solchen, die verhältnismäßig billig sind, gewonnen werden kann. Eine der bekannten Methoden der Biosynthese betrifft die Züchtung verschiedener Hefen, Pilze, Algen oder Bakterien auf Kohlenhydrat-Nährböden. Diese Art der Biosynthese verlangt neben der Verwendung verhältnismäßig teurer Nährmaterialien häufig auch die zusätzliche Verwendung ebenfalls kostspieliger Vitamine, Aminosäuren und anderer Zusätze, wenn ein zufriedenstellendes Wachstum der Mikroorganismen erreicht werden soll.
Ein neueres und vielversprechendes Verfahren für die Biosynthese von Protein, welches für Nahrungszwecke verwendet werden kann, ist die Kultur von Mikroorganismen auf aus Erdöl gewonnenen Kohlenwasserstoffen. Diese letztgenannte Methode der Proteinsynthese wird gewöhnlich in einem wäßrigen Bad durchgeführt, welches einen Kohlenwasserstoff als Nährmittel, ein Inokulum der zu züchtenden Bakterien und ein wäßriges Wachstumsmedium sowie Sauerstoff und andere unbedingt notwendige Nährstoffe und

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Wachstumsfaktoren enthält. Bei dieser Art der Proteinsynthese können Erdölkohlenwasserstoffe verwendet werden, welche weniger kostspielig sind als Kohlenhydrate und im allgemeinen nicht die zusätzliche Verwendung teurer Wachstumsfaktoren wie '< Vitamine, Aminosäuren usw. erfordern, damit ein ausreichendes Wachstum der Mikroorganismen gewährleistet ist.

Ein erheblicher Nachteil, der die weitere Verbreitung dieser Protein-Biosynthesen bisher verhindert hat, insbesondere dann, wenn hauptsächlich Kohlenwasserstoffe als Nährsubstanzen verwendet werden, lag darin, daß die so erzeugten Mikroorganismenzellen, insbesondere im Fall gewisser Bakterien, nur sehr klein waren, d. h. eine Größe von 0,5 bis 5,0 Mikron oder darunter aufwiesen. Derartig kleine Mikroorganismenzellen lassen sich nur schwierig von der wäßrigen Lösung, in der sie enthalten sind, und zwar oftmals in nur sehr geringen Konzentrationen von etwa 1 bis 5 Gewichtsprozent, abtrennen. Ein weiterer störender Faktor, der die Kosten für die Abtrennung : der Zellen erhöht, ist die Notwendigkeit der Entfernung \ verhältnismäßig großer Wassermengen, die von den Zellen als anhaftendes und in den Zellen eingeschlossenes Wasser festgehalten werden. Auch die Tatsache, daß die Zellen im allgemeinen pasteurisiert werden müssen, damit sie nicht verderben, erhöht die Kosten bei der Gewinnung derartiger Produkte. Die vorstehend genannten und weitere damit verbundene Faktoren bewirken, daß sich die Gesamtkosten bei der Herstellung und Abtrennung derartiger Mikroorganismen weit erhöhen. Abtrennung und Ent- : Wässerung, d. h. Trocknung, können mehr als 25 °/„ oder mehr der Gesamtkosten für die Herstellung von : Mikroorganismen ausmachen, wenn diese in einer ι Form gewonnen werden sollen, die für hochwertige Protein-Nahrungsmittel und Nahrungszusatzmittel ge- : eignet ist. Es liegt daher auf der Hand, daß eine Verbesserung hinsichtlich der Entwässerung der Mikroorganismen, insbesondere solcher, die einen sehr kleinen Durchmesser aufweisen, vor der Abtrennung und vor dem Trocknen in entscheidendem Maße die Wirtschaftlichkeit derartiger Verfahren zu verbessern vermag.

Gemäß der französischen Patentschrift 1 335 493 wurden die Zellen von Fermentationsbrühen durch Einstellen des pH-Wertes mit Salzsäure auf pH 6, Erhitzen auf bis zu 70° C und Zentrifugieren abgetrennt. In der belgischen Patentschrift 636 176 wird vorgeschlagen, zur Abtrennung von Zellen aus Fermentationsbrühen diese Brühen zu erhitzen, mit Calciumhydroxid und mit Kohlendioxid auf pH 7,5 einzustellen und dann zu filtrieren. Diese Verfahren sind jedoch insofern nachteilig, als sie in den angegebenen pH-Bereichen mit nur geringen Filtrationsgeschwindigkeiten arbeiten können und damit mit hohen Verfahrenskosten arbeiten.

Die vorliegende Erfindung stellt eine erhebliche Verbesserung hinsichtlich der Beschleunigung und Erleichterung bei der Abtrennung und Entwässerung von Mikroorganismenzellen dar, und zwar durch eine rasche Koagulierung der Zellen vor der Abtrennung derselben aus der wäßrigen Umgebung. Bei der vorliegenden Erfindung, kann die Geschwindigkeit, mit der die Mikroorganismenzellen von der wäßrigen Lösung abgetrennt werden können, um mehr als das Zwanzigfache erhöht werden, so daß sich sowohl hinsichtlich der für die Abtrennung notwendigen Zeit als auch hinsichtlich der Apparaturen (die kleiner gehalten werden können) erhebliche Einsparungen ergeben. Die erhebliche Verminderung der für die Abtrennung und Trocknung der Zellen benötigten Zeit ergibt sich dabei in jedem Fall, gleichgültig welche Arbeitsweise im übrigen angewendet wird. Sowohl beim Filtrieren als auch beim Zentrifugieren als auch beim Absitzen ergeben sich erhebliche Zeiteinsparungen. Gleichzeitig ergibt sich durch die Anwendung der vorliegenden Erfindung der Vorteil, daß in derselben Trenn- bzw. Trockenvorrichtung ein wesentlich größeres Volumen der die Zellen enthaltenden Flüssigkeit in der Zeiteinheit behandelt werden kann. Durch Anwendung der vorliegenden Erfindung läßt sich beispielsweise die Filtriergeschwindigkeit auf das Vierfache erhöhen. Auch beim Zentrifugieren lassen sich entsprechende Einsparungen erreichen.

Im einzelnen wird das erfindungsgemäße Verfahren

wie folgt durchgeführt: Aus dem Biosynthese-Medium wird ein wäßriger Strom abgezogen, welcher die Mikroorganismenzellen enthält. Der pH-Wert dieses Stromes wird durch Zugabe der im Patentanspruch 1 genannten Verbindungen herabgesetzt. Anschließend wird die angesäuerte Lösung vor der Einführung in den Abscheider erhitzt, wodurch die Abtrennung der Zellen von dem übrigen Teil, d. h. der angesäuerten Lösung erleichtert wird.

Die Zellen werden aus dem Abscheider entnommen und getrocknet. Der übrige, aus dem Abscheider abgezogene Teil des Materials, d. h. das Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit, welche den zuvor zugefügten sauren Nährstoff enthält, wird dann in das Biosynthesebad zurückgeleitet.
Man setzt das Biosynthesebad an, indem man ein mit Sauerstoff belüftetes Wasserbad mit dem zu züchtenden Mikroorganismus impft. Diesem Bad führt man eine Mischung aus Kohlenwasserstoffen und Kohlenhydraten zu, die als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle für die Mikroorganismen dienen. Außerdem wird ein wäßriges Nährmedium zugeführt, welches die anderen für die Zellvermehrung unerläßlichen Bestandteile enthält. Das zellhaltige Material, welches aus dem Biosynthesebad abgezogen und der Koagulationsbehandlung unterworfen wird, kann eine wäßrige Aufschlämmung oder ein wäßriger Schaum sein. Das bedeutet, daß die Zellen in dem Biosynthesebad selbst durch Schaumflotation oder nach der Entfernung aus dem Bad und vor dem Ansäuern und Erhitzen in dem wäßrigen Medium konzentriert werden können, bevor sie koaguliert werden. Die Schaumflotation vor der Koagulation kann jedoch auch ausgelassen werden und stellt keinen Bestandteil der vorliegenden Erfindung dar. Nach der Entfernung aus dem Biosynthesebad wird das Mikroorganismen, nämlich Bakterien und Hefen, enthaltende wäßrige Medium angesäuert, um den pH-Wert auf etwa 2,5 bis etwa 5,5, vorzugsweise etwa 2,7 bis 4,5, einzustellen. Im Falle eines wäßrigen Materials, welches Micrococcus cerificans enthält, wird der pH-Wert beispielsweise auf etwa 3,0 bis 4,5 eingestellt.

Geeignete Mischungen von nährstoffhaltigen Säuren und Salzen, die verwendet werden können, sind beispielsweise CaCl₂ plus Phosphorsäure, NaCl plus Phosphorsäure, NaCl plus Essigsäure, CaCl₂ plus NaCl plus Phosphorsäure, CaCl₂ plus Essigsäure usw. Außerdem können auch Mischungen von calciumhaltigen Salzen, z. B. CaCl₂, und Phosphorsäuren, z. B. Phosphorsäure selbst, verwendet werden, und zwar in solchen

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Verhältnissen, daß das richtige Ca: PO₄-Verhältnis in beispielsweise saure Hydrolyseprodukte, die zu dem

den Mikroorganismenzellen aufrechterhalten wird. Das Nährwert des Proteins und/oder der Aminosäuren der

Ca-PO₄-Verhältnis in den Zellen sollte zwischen 1 pasteurisierten Mikroorganismenzellen oder anderer

bis 2:1 und vorzugsweise nahe bei 2:1 liegen, um für die Ernährung wichtiger Produkte, die in den

das Calcium-Phosphat-Verhältnis der nicht mehr 5 Zellen enthalten sind, nichts beitragen,

lebenden Mikroorganismen zu erhöhen. Um einen Abbau der Zellen während der Koagu-

Von den im Patentanspruch 1 genannten Säuren lierungsstufe mit Sicherheit zu vermeiden, werden die wird vorzugsweise Phosphorsäure als essentieller Temperaturen, auf welche das angesäuerte zellhaltige Nährstoff für das Zellwachstum verwendet. Diese wäßrige Material erhitzt wird, auf Werte zwischen Säure wird, verglichen mit den übrigen essentiellen io etwa 10° über der Temperatur, bei welcher das Bioanorganischen Nährstoffen, in verhältnismäßig großen synthesebad gehalten wird, und einem Wert unterhalb Mengen zugesetzt. Durch die Zugabe der Phosphorsäure der Temperatur, bei welcher ein Zellabbau eintritt, zu dem das Zellmaterial enthaltenden wäßrigen z.B. etwa 100⁰C oder darunter, eingestellt. Die Medium und durch das Zurückführen des säure- genaue obere und untere Temperaturgrenze hängt haltigen Filtrates nach der Abtrennung des Zeil- 15 von dem jeweiligen Mikroorganismus, der gezüchtet materiales wird ein doppelter Effekt erreicht, da die werden soll, ab. Im allgemeinen wird das angesäuerte Säure einmal zum Koagulieren der Bakterienzellen zellhaltige Material auf eine Temperatur zwischen und zum anderen zum Ersatz des während der Bio- etwa 45 und etwa 90⁰C erhitzt, wobei die Behandsynthese verbauchten Phosphors dient. Weiterhin ist lungsdauer zwischen 1 und 30 Minuten, vorzugsweise es nicht notwendig, das abgetrennte und/oder ge- 20 etwa 1 und 20 Minuten liegt. Erhitzt man beispielstrocknete Zellmaterial einer besonderen Behandlung weise 1 bis 15 Minuten auf Temperaturen zwischen zur Entfernung von absorbierter nährstoffhaltiger etwa 50 und 85° C, so erhält man im Falle der meisten Säure zu unterwerfen, da die letztere den Nährwert Bakterienzellen, einschließlich Micrococcus cerificans, des Zellmaterials erhöht. eine ausgezeichnete Koagulation.

Nach Zugabe der nährstoffhaltigen Säure wird das 25 Im Anschluß an die Koagulierung wird das säureangesäuerte wäßrige Material erhitzt. Man erwärmt haltige Material durch einen geeigneten Abscheider, dabei bis auf eine Temperatur, die über der liegt, z. B. eine Filtriervorrichtung oder eine Zentrifuge gewelche bei der Biosynthese als Züchtungstemperatur leitet, um eine Abtrennung der Mikroorganismenzellen eingehalten wird, aber auf einen Wert, welcher unter von der Flüssigkeit zu erreichen. Die abgetrennten der Temperatur liegt, bei der ein Zellabbau (Protein- 30 Zellen können in eine beliebige Trockenvorrichtung, abbau) eintritt. Die Temperaturen sollen eine Dena- z. B. einen Sprühtrockner, der mit beheizten Gasen turierung des Proteins bewirken, ohne daß dabei ein betrieben wird, weitergeleitet werden, um eine Trock-Abbau und eine Verminderung des Nährwertes der nung und eine vollständige Pasteurisierung der Zellen Proteine eintritt. Das Erwärmen wird so lange fort- zu erreichen. Das getrocknete Zellmaterial kann als gesetzt, bis das Zellmaterial im wesentlichen koaguliert 35 Futterzusatz verwendet werden. Das Trocknen des ist. Das Erwärmen nach dem Ansäuern und vor der Zellmaterials ist jedoch nicht zwingend notwendig. Abtrennung der Zellen ist ein wesentlicher Faktor des Die abgetrennten Zellen können entweder direkt für erfindungsgemäßen Verfahrens, da hierdurch die andere als Ernährungszwecke verwendet werden, Filtrationsgeschwindigkeit wesentlich erhöht und die z. B. bei der Abtrennung von intrazellularen Estern, Verfahrenskosten infolgedessen wesentlich vermindert 40 oder sie können durch andere Behandlungsverfahren werden. Die Erhöhung der Filtrationsgeschwindigkeit als Trocknen pasteurisiert und anschließend als bzw. der Trenngeschwindigkeit ganz allgemein durch Futterzusatzmittel verwendet werden,
die erfindungsgemäße Behandlung fällt insbesondere Wird die Biosynthese durchgeführt, um proteindort ins Gewicht, wo die abzutrennenden Zellen reiche Mikroorganismen für Futterzwecke herzu-Größen von nur etwa 1 bis 2 Mikron oder darunter 45 stellen, so werden die Zellen vor der Verwendung aufweisen. In diesem Zusammenhang ist es auch we- vollständig abgetötet, d. h. pasteurisiert. Üblicherweise sentlich, daß die abgetrennten Zellen einen größeren werden die Zellen durch Erhitzen abgetötet, z. B. in Feststoffgehalt aufweisen, d. h. weniger Restwasser Sprühtrocknern bei geeigneten Temperaturen unter enthalten. Hierdurch werden wiederum die Kosten Einhaltung der erforderlichen Zeitspanne. Die gefür das Trocknen des Zellmaterials verringert, was 50 nauen Temperaturen und Behandlungszeiten hängen besonders ins Gewicht fällt, da die Trocknungsstufe auch hierbei von dem jeweils verwendeten Mikroin dem Verfahren normalerweise die höchsten Kosten Organismus sowie von dem Ausmaß der gewünschten verursacht. Schließlich ergibt sich als weiterer Vorteil Pasteurisierung ab.

noch die Tatsache, daß durch das Erwärmen gleich- Die Abtötungstemperaturen können zwischen 66 zeitig eine teilweise Sterilisation der Mikroorganismen- 55 und 232° C liegen bei Behandlungszeiten von etwa zellen erreicht wird. Die Zellen sind nach der Be- 1 Sekunde bis zu 2 Stunden, wobei die kürzere Behandlung nicht mehr voll lebensfähig, so daß bei der handlungszeit der höheren Temperatur entspricht und eigentlichen Pasteurisierung wesentlich niedrigere Tem- umgekehrt. Im allgemeinen werden Temperaturen peraturen ausreichen. zwischen 116 und 193° C bei Behandlungszeiten zwi-

Wie weiter oben bereits ausgeführt, dürfen Ansäu- 60 sehen 5 Sekunden und 15 Minuten angewendet. Diese ern und Erhitzen nicht so weit geführt werden, daß Temperaturen und Behandlungszeiten reichen aus, ein Abbau der Mikroorganismenzellen eintritt. Unter um die meisten Bakterien vollständig abzutöten, dem Ausdruck »Zellabbau« wird in diesem Zusammen- Überdrucke, z. B. von 2 bis 50 Atm., können angehang verstanden, daß der Molekülaufbau des Zeil- wendet werden, wenn die Pasteurisierung bei niedrigeproteins und wesentlicher Aminosäuren zusammen- 65 ren Temperaturen, z.B. 116 bis 121°C, in der entbricht, wobei es zur Bildung niedermolekularer Pro- sprechenden Zeitspanne durchgeführt wird,
dukte und für Ernährungszwecke weniger wertvoller Werden die Mikroorganismenzellen als Futterzusatz Nebenprodukte kommt. Solche Nebenprodukte sind verwendet, so muß — wie bereits gesagt — Vorsorge

getroffen werden, daß nicht zu hohe Temperaturen angewendet werden, die das Zellprotein abbauen bzw. zersetzen würden. Werden beispielsweise Micrococcus cerificans-Zellen gezüchtet, so liegen die Pasteurisierungstemperaturen zwischen etwa 138 und 177⁰C und die Behandlungszeiten bei etwa 5 bis 90 Sekunden. Für andere Mikroorganismen gelten andere Temperatur-Zeit-Bedingungen, die jeweils durch Versuche festgelegt werden müssen.

Das Filtrat bzw. die überstehende Flüssigkeit, welches bzw. welche die zugesetzte nährstoffhaltige Säure oder das Salz enthalten, wird in das Biosynthesebad zurückgeführt, wobei vorher eine Neutralisation mit einer basischen nährstoffhaltigen Verbindung vorgenommen werden kann oder nicht.

Vor der Rückleitung des Filtrates oder der überstehenden Flüssigkeit, die den sauren Nährstoff enthält, in das Biosynthesebad, wird der pH-Wert so weit erhöht, daß er etwa den Wert erreicht, auf dem das Biosynthesebad während des Zellwachstums gehalten wird. Dies kann erreicht werden, indem man dem Filtrat oder der überstehenden Flüssigkeit eine basische Verbindung zusetzt, die ebenfalls einen essentiellen Zellnährstoff darstellt. Der Nährstoff, der in der basischen Verbindung enthalten ist, kann derselbe oder ein anderer sein, der auch in dem sauren Material enthalten ist. Im allgemeinen enthält das basische Material einen anderen Nährstoff als das saure Material. Am besten sind beide Nährstoffe solche, die in verhältnismäßig großen Mengen für das Zellwachstum benötigt werden, z. B. Phosphor und Stickstoff. Es ist auch möglich, nicht das saure Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit vor der Rückführung in das Biosynthesebad zu neutralisieren, sondern das neutralisierend wirkende Material direkt in das Biosynthesebad einzuführen. Im letzteren Fall dient das dem Biosynthesebad zugesetzte basische Material dazu, überschüssige Säure, die durch die Rückführung des nährstoffhaltigen sauren Materials vorübergehend eingeführt worden ist, zu neutralisieren. Der spezifische pH-Wert, auf den das Biosynthesebad eingestellt wird, hängt im allgemeinen von dem jeweiligen Mikroorganismus ab, der in dem Biosynthesebad gezüchtet werden soll. Dieser Wert läßt sich in beiden vorstehend beschriebenen Fällen erreichen. Darüber hinaus wird die Neutralisation auf einer annähernd kontinuierlichen Basis durchgeführt, um organische Säuren, die von den Mikroorganismen als Nebenprodukte während der Biosynthese erzeugt werden, zu neutralisieren.

Gleichgültig, ob die basische nährstoffhaltige Verbindung der wäßrigen Flüssigkeit vor, gleichzeitig mit oder nach der Rückführung in das Biosynthesebad zugesetzt wird, in jedem Fall sollte die basische Verbindung Stickstoff in für die Mikroorganismen leicht assimilierbarer Form enthalten. Es können für diesen Zweck sowohl organische als auch anorganische basische stickstoffhaltige Verbindungen verwendet werden. Geeignete Stickstoffverbindungen sind beispielsweise die folgenden: Nitrate wie NaNO₃, Ammoniak, Ammoniumhydroxyd, Ammoniumsalze wie Ammoniumnitrat, Diammoniumphosphat, Harnstoff, Purin, Asparagin usw.

Als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle wird für das Zellwachstum ein C₁- bis C₃₀-Kohlenwasserstoff mit einem Aromatengehalt unter 0,5 Gewichtsprozent verwendet. Die Forderung, daß der Aromatengehalt unter 0,5 Gewichtsprozent liegen muß, gilt nur für solche Fälle, in denen die Biosynthese zur Herstellung von Zellmaterial für Futterzwecke durchgeführt wird. Zu den geeigneten verwendbaren C₁- bis C₃₀-Kohlenwasserstoffen gehören die folgenden: gasförmige C₁-bis C₅-Paraffine wie Methan, Ethan, Propan usw., Gase, die die vorstehend aufgezählten Verbindungen enthalten, C₆- bis C₁₀-Leichtbenzine wie niedrigsiedende Kohlenwasserstofföle der C_reH₂«+₂-Reihe, welche Siedepunkte zwischen etwa 95 und 150° C aufweisen, sowie Erdölfraktionen, die diese Produkte enthalten, sowie C₁₁- bis C₃₀-Gasöle mit einem Siedebereich von etwa 190 bis 32O⁰C bzw. die Erdölfraktionen, die diese Substanzen enthalten. Soll die Biosynthese unter Verwendung von Methan und anderen gasförmigen Paraffinen vorgenommen werden, so lassen sich vorzugsweise folgende Klassen von Mikroorganismen einsetzen: Pseudomonaden, Nocardia und Mycobacterium, einschließlich der Gruppen P. methanica, N. corallina und M. paraffinicum. Wird die Biosynthese unter Verwendung von Leichtbenzin durchgeführt, so ist die geeignetste Klasse an Mikroorganismen Pseudomonada, insbesondere P. fluorescens, P. desmolyticum und P. aeruginosa. Es ist jedoch auch möglich, Hefen zu verwenden, z. B.

Rhodotorula, Candida, Hansenula usw. Das am besten im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Kohlenwasserstoffmaterial sind paraffinische C₁₁-C₃₀-Kohlenwasserstoffe, die vorwiegend aus n-Hexadecan bestehen und einen Aromatengehalt unter 0,1 Gewichtsprozent aufweisen. Die Aromaten werden aus den C_u-C₃₀-Paraffinen vor der Einführung in die beimpfte Lösung zur Züchtung des Zellmaterials entfernt. An Stelle der Verwendung einer Mischung von Cj^Cso-Paraffinen mit vorherrschendem Gehalt an n-Hexadecan kann auch konzentriertes oder im wesentlichen reines n-Hexadecan verwendet werden, um aerobe, gram-negative Kokken zu züchten. In diesem Fall lassen sich folgende Bakterien mit Erfolg verwenden: Micrococcus cerificans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Nocardia opaca und Nocardia rubra. In hervorragender Weise geeignet ist das Bakterium Micrococcus cerificans, welches von Kallio et al. isoliert und identifiziert und im Journal of Bacteriology, Band 78, Nr. 3, S. 441 bis 448 (September 1959), beschrieben worden ist. Kulturen dieses Organismus sind bei der amerikanischen Kulturensammelstelle (American Type Culture Collection, 212 M Street, N. W., Washington 7, D. C.) unter der Nr. 14 987 hinterlegt worden.

Beispiel 1

Micrococcus cerificans wird kontinuierlich in einem wäßrigen Biosynthesebad gezüchtet, welches 1,0 Gewichtsprozent n-Hexadecan als Kohlenwasserstoff enthielt.

Ein 7,5 1-Biosynthesegefäß wird mit 41 einer wäßrigen Aufschlämmung, welche 1,0 Gewichtsprozent Micrococcus cerificans-Bakterien als Inokulum enthält, beschickt. Man läßt eine ausreichende Menge Luft durch die geimpfte Aufschlämmung hindurchtreten, um den Sauerstoffbedarf der Bakterien vor der Einführung der Kohlenwasserstoffe und der anorganischen Salze (welche Phosphorsäure- undAmmonium hydroxyd enthalten) zu befriedigen. Die Zusammensetzung des Biosynthesebades in einer beliebigen Stufe der kontinuierlichen Biosynthese ist beispielsweise folgende:

309 541 m 6

Bestandteil g/1

n-Hexadecan 10

H₃PO₄ 5

KCl 1

CaCl₂ 0,5

MgSO₄ · 7 H₂O 0,2

MnSO₄ · 4H₂O 0,2

FeSO₄ · 7H₂O 0,2

NaCl 0,2

NH₄OH in einer Menge, die aus-

reicht, um den pH-Wert bei 7,0 zu

halten.

Die Temperatur in dem Biosynthesebad wird bei 35° C plus/minus 2° C gehalten. Der pH-Wert des Bades soll im wesentlichen neutral sein, nämlich 7,0 plus/minus 0,1, und zwar während des gesamten Verlaufes der Biosynthese. Die Umwandlung der zugeführten Kohlenwasserstoffe in Zellen erfolgt zu 9O°/o oder mehr. Nach einer Verweildauer von etwa 2 Stunden wird kontinuierlich wäßrige Aufschlämmung aus dem Biosynthesebad abgezogen. In den verschiedenen Stufen der Biosynthese werden jeweils

100-ml-Proben der wäßrigen Aufschlämmung entnommen, welche etwa 1 Gewichtsprozent Bakterienzellen neben nicht umgewandelten Kohlenwasserstoffen, anorganischen Salzen, Nährstoffen usw. enthalten. Diese Proben werden vor der weiteren Behandlung in vier Gruppen eingeteilt.

Die erste Gruppe der Proben wird direkt ohne vorherige Koagulation filtriert. Die zweite Gruppe der Proben wird durch Zugabe von Phosphorsäure vor dem Filtrieren auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert. Die dritte Gruppe der Proben wird durch Zugabe von Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und anschließend auf eine Temperatur von 85° C 15 Minuten erhitzt; erst nach dieser Behandlung wird filtriert. Gruppe 4 der Proben wird 15 Minuten auf 85° C erhitzt, aber nicht angesäuert vor dem Erhitzen, und dann filtriert.

Das Filtrieren erfolgt bei allen Proben in einfacher Weise unter Verwendung derselben Filter, nämlich 11cm angefeuchtetem Whatman Nr. 1-Filterpapier. Die durchschnittlichen Filtrationsgeschwindigkeiten der Proben jeder Gruppe sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Gruppe	Säurebehandlung	Wärmebehandlung	pH-Wert zur Zeit der Filtration	Temperatur in Zeit der Filtration in ⁰C	Filtrations geschwindigkeit in ml/Min.
1 2 3 4	nein ja ja nein	nein nein ja ja	7,0 3,5 3,5 7,0	25° 25° 85° 85°	0,53 2,22 10,00 0,16

Aus den vorstehenden Werten ist klar erkennbar, daß durch die erfindungsgemäße Behandlung eine eindeutig höhere Filtrationsgeschwindigkeit (Gruppe 3) ermöglicht wird.

Nach der Filtration wird das Phosphorsäure-haltige Filtrat in das Biosynthesebad zurückgeleitet, um dort den Phosphorgehalt wieder aufzufüllen. Der pH-Wert des Biosynthesebades wird auf etwa 7,0 gehalten, indem man kontinuierlich Ammoniumhydroxyd in der benötigten Menge zuführt.

Beispiel 2 Tabelle II

Micrococcus cerificans-Zellen werden wie im Beispiel 1 angegeben gezüchtet, so daß man eine wäßrige Aufschlämmung erhält, welche annähernd 1 Gewichtsprozent Zellmaterial enthält. 100-ml-Proben dieses Produktes werden abgezogen und in fünf Gruppen eingeteilt, die verschiedenen Koagulationsbehandlungen im Sinne der vorliegenden Erfindung unterworfen werden. Alle Proben wurden mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und anschließend 15 Minuten auf die in der nachstehenden Tabelle II angegebenen Temperaturen erhitzt. Die Proben jeder Gruppe wurden wie im Beispiel 1 angegeben filtriert; die durchschnittliche Filtrationsgeschwindigkeit ist ebenfalls in Tabelle II angegeben.

Gruppe	Temperatur op	Filtrations geschwindigkeit
		ml/Min".
1	50	2,54
2	60	3,9
3	70	4,7
4	80	5,1
5	85	10,0

Beispiel 3

Veränderung des pH-Wertes ohne ausreichendes
Erwärmen.

Micrococcus cerificans-Zellen werden wie im Beispiel 1 angegeben gezüchtet, so daß man eine wäßrige Aufschlämmung mit einem Gehalt von etwa 1 Gewichtsprozent Zellmaterial erhält. Man zieht 100-ml-Proben des so gewonnenen Materials ab und teilt sie in fünf Gruppen für die Filtration ein. Keine der Proben wird erhitzt, vielmehr werden alle Proben bei einer Temperatur von 25° C in der im Beispiel 1 angegebenen Weise filtriert. Diese Temperatur liegt etwa 10° unter der Wachstumstemperatur, die in dem Biosynthesebad aufrechterhalten wird.
Der pH-Wert der Proben aller Gruppen wurde

unter Verwendung von Phosphorsäure auf die in der nachstehenden Tabelle III angegebenen Werte eingestellt. Trotz der großen Unterschiede in den pH-Werten waren die Filtrationsgeschwindigkeiten in allen Fällen niedriger als bei ausreichendem Erwärmen im Anschluß an das Ansäuern.

Tabelle III

	pH-Wert	Filtrations
Gruppe	zur Zeit der	geschwindigkeit
	Filiration	in ml/Min.
1	2,0	0,42
2	3,0	1,7
3	3,5	2,2
4	4,0	1,25
5	5,0	0,63

Tabelle V

Gruppe	pH-Wert bei der Filtration	Filtrationszeit Min.
1	2,0	60
1	2,9	14
1	3,2	7
1	3,3	7
1	3,4	7
1	3,5	7
1	3,6	7
1	3,8	12
2	2,5	90
2	2,9	50
2	3,0	36
2	3,2	7
2	3,3	7
2	3,4	7
2	3,5	7
2	3,6	10
2	4,0	30
unbe-
handelt	7,0	>60
		(am Ende einer Std.
		war nur etwa ¹I₅
		der 25 cm³-Probe
		durch das Filter
		papier hindurch
		gegangen).

wichtsprozent bezogen auf das Gesamtgewicht der Probe) angesäuert, wobei so viel Phosphorsäure verwendet wurde, daß die verschiedenen in Tabelle V für Gruppe 2 angegebenen pH-Werte erreicht wurden. Alle 25-cm³-Proben wurden einfach bei Atmosphärendruck filtriert, und zwar unter Verwendung derselben Filterpapiere, die für die übrigen Proben verwendet wurden. Die durchschnittlichen Filtrationszeiten für jede Probe sind in der vorstehenden Tabelle angegeben.

Die vorstehenden Werte zeigen, daß die Vorteile der verminderten Filtrationszeit auch durch Behandlung mit einer Mischung aus einer nährstoffhaltigen Säure und einem nährstoffhaltigen Salz im Sinne der vorliegenden Erfindung und nicht nur bei Behandlung mit einer nährstoffhaltigen Säure allein erreicht werden können. In beiden Gruppen 1 und 2 war der essentielle Zellnährstoff Phosphor (als Phosphat). In Gruppe 1 waren die Nährstoffe in dem Salz Na⁺ und Cl- und in Gruppe 2 Ca⁺+ und Cl~.

Die Filtrate mit den jeweiligen Nährstoffen wurden dann in das Biosynthesebad zurückgeführt und dort zur Auffrischung der verbrauchten Nährstoffe verwendet, wobei es gleichgültig ist, ob das Biosynthese-

s5 verfahren kontinuierlich oder absatzweise durchgeführt wird.

Beispiel 5

Micrococcus cerificans-Zellen werden wie im Beispiel 1 angegeben gezüchtet, so daß man eine wäßrige Aufschlämmung mit einem Gehalt von 1 bis 2 Gewichtsprozent Zellmaterial erhält, welches jedoch zur Gewinnung der intracellularen Ester und anderer darin enthaltener Chemikalien verwendet wird. Die wäßrige Aufschlämmung des Produktes wird in 7 Probegruppen eingeteilt, an denen die unterschiedliche Wirkung der verschiedenen Koaguliermittel untersucht werden soll. Jede Probe wurde nach Zugabe des Koaguliermittels 10 bis 30 Minuten auf 66 bis 93°C (Dampfbadtemperaturen) unmittelbar vor dem Filtrieren erhitzt. Es wurde dasselbe Filtrierpapier wie in den übrigen Beispielen verwendet. Die verschiedenen Koaguliermittel und deren unterschiedliche Wirkung auf das Zellmaterial sind in Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI Beispiel4

Micrococcus cerificans-Zellen werden wie im Beispiel 1 angegeben gezüchtet, so daß man eine wäßrige Aufschlämmung mit einem Gehalt von 1 bis 2 Gewichtsprozent Zellmaterial (als Trockengewicht gerechnet) erhält. Man zieht mehrere gleiche 25-cm³-Proben aus dem so gewonnenen Produkt ab und teilt die Proben in zwei Gruppen ein. Beide Gruppen werden bei Raumtemperatur angesäuert und vor dem Filtrieren 15 bis 30 Minuten auf 66 bis 93° C erhitzt. Die Proben der Gruppe 1 werden mit einer Mischung aus Phosphorsäure und NaCl auf die in der Tabelle V angegebenen pH-Werte angesäuert. Jede Probe der Gruppe 1 enthielt 0,04 Gewichtsprozent NaCl (bezogen auf das Gesamtgewicht der Probe) plus so viel Phosphorsäure, daß die verschiedenen pH-Werte, die in Tabelle V angegeben sind, erreicht wurden. Die Proben der Gruppe 2 wurden unter Verwendung einer Mischung aus Phosphorsäure und CaCl₂ (0,04 Ge-

Koaguliermittel	+Konzentration++	Wirkung
H₃PO₄	pH: 3,2 —3,6	ausgezeichnet
H₃PO₄-NaCl	0,04 Gewichts
	prozent NaCl;
	pH: 3,2 —3,6	ausgezeichnet
H₃PO₄-CaCl₂	0,04 Gewichts
	prozent CaCl₂;
	pH: 3,2 — 3,7	ausgezeichnet
Essigsäure-NaCl	0,04 Gewichts
	prozent NaCl;
	2,0 Gewichts
	prozent Säure	gut
Essigsäure	2,0 Gewichts
	prozent	mäßig
keine
Behandlung	pH: 7,0	sehr schlecht

Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht der Probe.

So viel Säure wie zur Einstellung des pH-Wertes notwendig ist.

Claims

ü uyu Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von proteinhaltigen Mikroorganismenzellen, die in einem wäßrigen Medium, welches die Zellen eines geeigneten Mikroorganismus als Inokulum sowie einen Kohlenwasserstoff einerseits als auch Sauerstoff und essentielle Zusätze andererseits als Nährstoffquellen enthält, durch Biosynthese gezüchtet wurden, dadurchgekennzeichnet, daß man aus dem Biosynthesebad eine wäßrige Aufschlämmung der Mikrobenzellen abzieht und mit

1. Phosphorsäure, Metaphosphorsäure, Orthophosphorsäure, Pyrophosphorsäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, niederen alkylsubstituierten Phosphinsäuren, orthophosphoriger Säure, metaphosphoriger Säure, Schwefelsäure oder Salpetersäure sowie Mischungen aus zwei oder mehr dieser Säuren, oder

2. einer Mischung von 1. mit einem Salz, welches ebenfalls einen essentiellen Zellnährstoff darstellt, versetzt, und zwar in solchen Mengen, daß der pH-Wert der abgezogenen wäßrigen Lösung auf zwischen etwa 2,5 und etwa 5,5 herabgesetzt wird, die so behandelte wäßrige Aufschlämmung auf eine Temperatur erhitzt, die über der Zellwachstumstemperatur, aber unterhalb der Temperatur liegt, bei welcher ein nennenswerter Proteinabbau eintritt, und schließlich das Zellmaterial in üblicher Weise von der nährstoffhaltigen wäßrigen Phase abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nach der Abtrennung des Zellmaterials erhaltene nährstoffhaltige wäßrige Phase in das wäßrige Nährmedium zurückgeleitet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der angesäuerten Aufschlämmung vor dem Erhitzen zwischen 2,7 und 4,5 liegt.