DE3915616C1 - - Google Patents

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DE3915616C1
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invertase
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yeast
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DE3915616A
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Helmut Dr. Hustedt
Kay Dipl.-Ing. Buentemeyer
Karl-Heinz Dipl.-Ing. Kroner
Bernhard 3300 Braunschweig De Boerner
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Description

Invertase ist in verschiedenen Hefen intrazellulär enthalten. Um das Enzym, welches in der Lebensmittelindustrie im technischen Maßstab eingesetzt wird, zu gewinnen, müssen die Hefezellen aufgeschlossen werden. Daran schließt sich eine Abtrennung der Zelltrümmer und unerwünschter Proteine an.
Invertase zeichnet sich durch eine überdurchschnittliche Beständigkeit gegenüber Hitze und niedrigen pH-Werten aus. Davon ausgehend ist bereits ein Verfahren zur Invertase-Gewinnung vorgeschlagen worden, bei dem bei einem pH von 5,0 eine Hitzebehandlung durchgeführt wird, die jedoch einen Aufreinigungsfaktor von nur 2 ergibt. Es verwundert daher nicht, daß sich die in der Praxis betriebene Invertase-Gewinnung nicht dieses bereits 1967 vorgeschlagenen Verfahrens bedient (1). Vielmehr sieht die klassische Invertase-Aufarbeitung zwei Acetonfällungsschritte vor; vgl. beispielsweise Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie (2).
Ähnlich verläuft auch ein in einem japanischen Patent (3) vorgeschlagenes Verfahrens:
Hier wird nach 30stündiger Zell-Lyse und Säurebehandlung bei pH 4,5 filtriert, dann eine Aceton-Fällung durchgeführt und schließlich extrahiert. Diesem Verfahren sehr ähnlich ist auch ein von anderen Autoren vorgeschlagenes Verfahren (4).
Die Erfinder haben nun den nach Meinung der Fachwelt nicht weiterführenden und daher aufgegebenen Stand der Technik wieder aufgegriffen und dabei festgestellt, daß man überraschend hohe Aufreinigungsfaktoren erzielen und zusätzlich leichter durch Zentrifugation klären kann, wenn man besonders Maßnahmen beachtet.
Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Gewinnung von Invertase aus Hefe oder einem Mikroorganismus, der die genetische Information zur Bildung von Bierhefe - oder Bäckerhefe - Invertase enthält, vorgeschlagen, bei dem man die Hefezellen aufschließt, die aufgeschlossene Zellsuspension im stark sauren Milieu einer Hitzebehandlung unterwirft und die denaturierten unerwünschten Proteine mit den Zelltrümmern bevorzugt durch Zentrifugation abtrennt und danach gegebenenfalls die Invertase isoliert, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man
  • - die aufgeschlossene Zellsuspension bei einem pH-Wert kleiner 4,5
  • - einer Hitzebehandlung bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 60°C unterwirft, oder daß man
  • - die aufgeschlossene Zellsuspension einer Säurebehandlung bei einem pH-Wert kleiner/gleich 4,0 ohne Hitzebehandlung unterwirft.
Vorzugsweise arbeitet man bei einem pH im Bereich von 3,0 bis 4,2 und bei einer Temperatur im Bereich von 45 bis 50°C bei der Hitzebehandlung, mit besonderer Bevorzugung des pH-Bereichs 3,8 bis 4,2 und einer Temperatur von 48 bis 50°C.
Als Hefen bieten sich Bierhefe, Bäckerhefe oder davon abgeleitete Hefen oder Mikroorganismen an, die die genetische Information zur Bildung von Bierhefe - oder Bäckerhefe - Invertase enthalten.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können z. B. bei nachfolgender Zentrifugation nahezu partikelfreie Überstände erzeugt werden. Ein weiterer Vorteil ist darin zu sehen, daß nahezu chemikalienfrei gearbeitet werden kann. Die Behandlung kann mit lebensmittelgerechten Säuren erfolgen, beispielsweise Phosphorsäure oder Essigsäure. Unerwünschte Begleitenzyme können nahezu vollständig desaktiviert werden.
Nachstehend wird die Erfindung beispielhaft näher erläutert.
Ausgangsmaterial
Als Rohmaterial wurde frische, kommerziell erhältliche Bäckerhefe verwendet, die in 25-kg-Beuteln bezogen wurde. Das Material enthielt in inhomogener Verteilung geringe Mengen an Kieselgur, die von der Zellernte stammten.
Zellaufschluß
Die Hefe wurde in einem ¹/₁₀molaren Dikaliumhydrogenphosphatpuffer suspendiert. Die Suspension hatte einen pH-Wert von ungefähr 7,25. Danach wurde in einem Hochdruckhomogenisator bis zur Freisetzung von etwa 75 g Protein/kg Zellfeuchtmasse aufgeschlossen. Der Aufschluß erfolgte jeweils durch drei Homogenisatorpassagen mit 550 bar. Das Homogenisat wurde direkt nach Verlassen des Homogenisators in einem kontinuierlichen Wärmeaustauscher auf etwa 15°C gekühlt.
Säurebehandlung
Die aufgeschlossene Zellsuspension wurde in einem Rührbehälter mit Phosphorsäure oder mit Essigsäure durch Titrieren jeweils auf einen pH-Wert von 4 eingestellt. Die titrierte Suspension wurde etwa eine halbe Stunde lang bei einer Rührerleistung von etwa 4 kW/m³ gerührt.
Wärmebehandlung
Die Wärmebehandlung wurde in einer kontinuierlichen Hitzedenaturierungsanlage durchgeführt, und zwar in einem statischen Rohrmischerwärmeaustauscher, der für eine schnelle und gleichmäßige Erwärmung bei geringen Temperaturspitzen sorgte.
Durch die Verweilzeitverteilung ergab sich eine mittlere Behandlungsdauer von 10 Minuten mit einer Mindestdauer von 9 Minuten und einer Höchstdauer von 11 Minuten für 70% des Produktes. Dabei betrug die Temperatur des Produkts am Ausgang des Erhitzers etwa 51°C (0,5°C Regelabweichung). In der Haltestrecke kühlte sich das Produkt auf eine Ausgangstemperatur von 44°C ab, die nach 10 Minuten erreicht wurde. Danach erfolgte in einem zweiten Wärmeaustauscher eine Abkühlung auf etwa 15°C.
Verdünnung
Eine 0,05molare Acetatpufferlösung wurde mit 2,5molarer Kalilauge auf einen pH-Wert von 4 titriert. Mit diesem Puffer wurde die wärmebehandelte Suspension auf einen Gehalt von 10% Zellfeuchtmasse verdünnt.
Zentrifugation
Die verdünnte Suspension wurde mit Hilfe eines Tellerseparators aufgearbeitet (1500 m² äquivalente Klärfläche). Der Separator wurde diskontinuierlich entschlammt, wobei 17,6 Vol.-% der Suspension als Sediment abgetrennt wurden. Dabei ergab sich ein Enzymverlust in ähnlicher Höhe. Der Durchsatz betrug 36 l/h.
Ultrafiltration
Zum Aufkonzentrieren wurde der Separatorrückstand einer Ultrafiltration unterworfen. Dazu wurde ein Ultrafiltrationsmodul aus Polysulphon-Material einer Fläche von 0,8 m² benutzt. Da Invertase ein Molekulargewicht von 270 000 Dalton besitzt, wird mit einer Ultrafiltrationsmembran einer Porengröße von 100 000 Dalton ein hinreichender Rückhalt erzielt. Bei einer transmembranen Druckdifferenz von 1 bar und einem Retentatfluß von 370 l/h wurde ein durchschnittlicher Filtratstrom von 60 l/h m² bis 75 l/h m² erreicht. Das Permeat besaß eine Invertaseaktivität von etwa 3 U/ml, was einem Produktverlust von 4% gleichkam. Das Produkt konnte mit dem gewählten Versuchsaufbau um einen Faktor von 14,75 aufkonzentriert werden, wobei etwa 50 l Separatorüberstand aufgearbeitet wurden.
Weitere Einzelheiten sind der folgenden Tabelle 1 zu entnehmen.
Die nachfolgenden Abb. 1 bis 7 und Tabelle 2 belegen und erläutern die Erfindung weitergehend.
Tabelle 1
Invertase-Aufarbeitung gemäß Beschreibung - Analytische Daten einer Präparation ausgehend von 5 kg Zellfeuchtmasse/Bäckerhefe
Tabelle 2
pH-Stabilität und Anreicherung von Bierhefe-Invertase im stark sauren Bereich (Aufschluß als 20% Suspension) ohne Wärmebehandlung
Literatur
1) N. P. Neumann und J. O. Lampen, Biochemistry 6 (1967), 468-475
2) H. Vetter et al. "Enzyme", in: Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie, Bd. 10, S. 475-561. Verlag Chemie, Weinheim, 1975
3) S. Takai et al., Japan. Patent, JP 45/9824 [70/9824], 9. April 1970
4) E. Matulaityte und V. Avizienis, Matr. Biokhim. Konf. Pribalt. Resp. B. SSR, 5th, Volume 2, 14-15, Editor I. K. Sibul, Akad. Nauk. Est. SSR: Tallin, UDSSR

Claims (4)

1. Verfahren zur Gewinnung von Invertase aus Hefe oder einem Mikroorganismus, der die genetische Information zur Bildung von Bäckerhefe- oder Bierhefe-Invertase enthält, bei dem man die Zellen aufschließt, die aufgeschlossene Zellsuspension im sauren Milieu ggf. einer Hitzebehandlung unterwirft und die denaturierten unerwünschten Proteine mit den Zelltrümmern abtrennt und danach gegebenenfalls die Invertase isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • - die aufgeschlossene Zellsuspension bei einem pH kleiner 4,5
  • - einer Hitzebehandlung bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 60°C unterwirft, oder daß man
  • - die aufgeschlossene Zellsuspension einer Säurebehandlung bei einem pH-Wert kleiner/gleich 4,0 ohne Hitzebehandlung unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die aufgeschlossene Zellsuspension bei einem pH im Bereich von 3,0 bis 4,2 der Hitzebehandlung unterwirft.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die aufgeschlossene Zellsuspension bei einem pH im Bereich von 3,8 bis 4,2 der Hitzebehandlung unterwirft.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die aufgeschlossene Zellsuspension einer Hitzebehandlung im Bereich von 45 bis 50°C und insbesondere 48 bis 50°C unterwirft.
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