WO2001037628A2 - Verfahren zur gewinnung von biotechnologischen wertstoffen - Google Patents

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Werner Pichler
Wilfried Rähse
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining biotechnological valuable substances from a raw solution, in which the biomass and the water-containing solution containing the valuable substance are separated from one another and the valuable substance solution is concentrated by means of ultrafiltration
  • Biotechnological materials i.e. biotechnologically manufactured products, are used extensively in the pharmaceutical industry and also in the food industry
  • the biotechnological resources include, for example, enzymes that are used in the food industry, for example for the production of dairy products, beverages and baked goods, and also in the textile industry as pickling agents and as tanning agents. Another important area of use for enzymes is washing, auxiliary washing. and cleaning agents.
  • the enzymes are usually obtained using biotechnological processes. However, their isolation from the enzyme raw solutions obtained after production is very time-consuming, since they usually contain a large number of accompanying substances which can only be separated from the enzymes with difficulty
  • European patent application 0 200 032 A2 discloses a process for separating biotechnologically produced valuable materials from a cell suspension, which can be achieved by cross-flow microfiltration using porous polymeric tubes with micropores between 0.3 and 0.5 ⁇ m and a membrane active on them Membrane with micropores> 0.1 ⁇ m, which have a numerical ratio between 0.15 and 0.85 to those of the porous tubes, through or through which the fermentation flows at a speed> 2 m / s and with a pressure difference between Concentrate and permeate side less than 5 bar
  • Another state of the art is the European patent EP 0 564 476 B1, according to which a process for the production of an enzyme granulate is claimed, which is characterized in that the insoluble constituents are first removed from the fermentation broth by microfiltration, the fermentation broth is then concentrated and finally is mixed with a certain aggregate
  • the present invention was accordingly based on the object of providing an improved process for the recovery of biotechnological valuable substances, in which the valuable substances can be obtained in high yield
  • the present invention accordingly relates to a process for obtaining biotechnologically produced valuable substances from culture and / or fermenter solutions, which comprises separating the biomass from a watery solution or dispersion containing the valuable substance and subsequently filtering and concentrating the solution containing valuable substance by means of ultrafiltration , characterized in that the separated solids or solid concentrates are subjected to a washing step, the filtrate from the concentration stage being used as the washing liquid
  • the liquid obtained during the concentration process can not be discarded, but can be circulated.
  • the resulting washing liquid can, after it has been used as washing water for the separated solid concentrate, returned to the ultrafiltration process and can be recovered as washing liquid after concentration of the valuable substance solution.
  • With the ultrafiltration filtrate a multi-stage washing of the biomass can also be achieved
  • Any biological products in the sense of the present invention are to be understood as any products that can be produced by biotechnological processes and are obtained as culture or fermenter solutions, whereby the valuable materials can be obtained from these solutions by filtration processes.
  • Examples are biotechnologically producible pharmaceutical active substances and enzymes
  • the primary enzymes which can be used are the proteases, lipases, amylases and / or cellulases obtained from microorganisms such as bacteria or fungi, proteases produced and / or derived from Bacillus-A en and their mixtures with amylases being preferred obtained in a known manner by fermentation processes from suitable microorganisms, which are described, for example, in the German Offenlegungssch ⁇ fte DE 19 40 488, DE 20 44 161, DE 22 01 803 and DE 21 21 397, the US Pat. Nos. 3,632,957 and 4,264 738 and European patent application EP 006 638 are described.
  • the process according to the invention can be used particularly advantageously for isolating the very active proteases of the so-called second generation, which include, for example, Sav ⁇ nase (R) and enzymes known from international patent application WO 91/2792
  • the broths of extracellular materials of value obtained as raw material solutions in fermentation processes are used to carry out the method according to the invention
  • the insoluble accompanying or solids including the cell number and / or the intact bacteria, hereinafter also referred to as biomass, are separated.
  • suitable salts are the water-soluble Na, K and Ca salts, preferably their haiogenides.
  • These salts can be up to 1% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight, based on the raw material solution
  • the biomass is then separated off using a centrifuge, preferably using a plate separator
  • microfiltration is carried out as stencil filtration.
  • Microfiltration is preferably carried out as cross-flow microfiltration ensures that the solids and micro-organisms, ie the biomass, are completely separated from the valuable substance solution
  • the resulting valuable substance solution contains the produced valuable substances in relatively low concentrations.
  • concentration of this solution can be achieved by ultrafiltration and subsequent evaporation of the solution
  • the biomass separated in the individual separation steps still contains residual amounts of valuable substances.
  • the yield of active valuable substances is increased by subjecting the solid concentrates (biomass) to a washing step, the filtrate from the concentration stage being used as washing liquid
  • washing process has the advantage that even residual amounts of biotechnologically produced valuable materials can be isolated from the separated biomass, which means that the yield of recovered valuable materials can be increased.
  • washing liquid e.g. water
  • the washing liquid is added to isolate the washed-out valuable materials from the valuable material solution obtained in the separation steps and subjected to a concentration process.Therefore, the washing liquid is cycled, which after concentration is obtained as filtrate from the ultrafiltration and used again This cycle approach enables yields of over 90% to be achieved in biotechnologically produced valuable materials
  • the biomass is obtained as a water-containing solid after the washing step according to the invention and can be processed to fertilizers in a manner known per se, usually after sterilization
  • the material concentrate obtained by the process according to the invention can be added to further processing.
  • they are processed into granules which can be easily incorporated into other products
  • the enzyme concentrate obtained is processed further in a preferred embodiment to form enzyme granules.
  • the enzyme concentrates obtained can be mixed with additives and in a manner known per se, for example according to the process described in European patent EP 0 564 476 B1 , are converted into enzyme granules
  • a fermenter batch containing protease as a valuable substance was adjusted to a pH of 7.5 with a 30% CaCl 2 solution.
  • the fermenter slurry thus set had a dry matter content of 16% with a protease activity of 33,000 PE / g, as can be determined according to van Raay, Saran and Verbeek, according to the publication "For the determination of proteolytic activity in enzyme concentrates and detergents, detergents and cleaning agents containing enzymes" in Tenside (1970), Vol. 7, pp. 125-132
  • the remaining biomass contained only 5% of the amount of enzyme initially contained
  • protease was obtained by the process described in EP 0 564 476.
  • the yield was 90%, which was significantly lower than that which was achieved by the process according to the present invention

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur- und/oder Fermenterlösungen beansprucht, welches das Trennen der wasserunlöslichen Feststoffe von der wässerigen, die Wertstoffe enthaltenden Lösung, anschliessendes Filtrieren der erhaltenen Lösung und Aufkonzentrieren der wertstoffhaltigen Lösung mittels Ultrafiltration umfasst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die abgetrennten Feststoffe einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.

Description

Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen Wertstoffen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen Wertstoffen aus einer Rohlosung, worin die Biomasse und die wasseπge, den Wertstoff enthaltende Losung voneinander getrennt werden und die Wertstoff-Losung mittels Ultrafiltration aufkonzentriert wird
Biotechnologische Wertstoffe, d h biotechnologisch hergestellte Produkte, finden eine ausgedehnte industrielle Anwendung in der pharmazeutischen Industrie und auch in der Lebensmittelindustrie
Zu den biotechnologischen Wertstoffen zahlen z B Enzyme, die in der Lebensmittelindustrie, z B zur Herstellung von Milchprodukten, Getranken und Backwaren, und auch in der Textilindustrie als Beizmittel und als Gerbereihilfsstoffe eingesetzt werden Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet von Enzymen sind die Wasch-, Waschhilfs- und Reinigungsmittel Die Gewinnung von Enzymen erfolgt in der Regel über biotechnologische Verfahren Ihre Isolierung aus den nach der Herstellung erhaltenen Enzymrohlosungen ist jedoch sehr auf-wendig, da sie meist eine große Anzahl von Begleitstoffen enthalten, die sich nur mühsam von den Enzymen abtrennen lassen
In der europaischen Patentanmeldung 0 200 032 A2 wird ein Verfahren zur Abtrennung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus einer Zellsuspension offenbart, das sich durch Querstrom-Mikrofiltration unter Verwendung poröser polymerer Rohre mit Mikroporen zwischen 0,3 und 0,5 μm und einer auf diesen liegenden treπnaktiven Membran mit Mikroporen > 0,1 μm, die zu denen der porösen Rohe in einem Zahlenverhaltnis zwischen 0,15 und 0,85 stehen, auszeichnet, über bzw durch die die Fermenteriosung mit einer Geschwindigkeit > 2 m/s strömt und wobei ein Druckunterschied zwischen Konzentrat- und Permeatseite von weniger als 5 bar herrscht Weiteren Stand der Technik stellt das Europaische Patent EP 0 564 476 B1 dar, nach dem ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymgranulats beansprucht wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zunächst die unlöslichen Bestandteile aus der Fermentationsbruhe durch Mikrofiltration entfernt werden, die Fermentationsbruhe anschließend aufkonzentriert und schließlich mit einem bestimmten Zuschlagstoff vermischt wird
Wegen der aufwendigen Herstellung und Isolierung von biotechnologischen Wertstoffen besteht ein standiger Bedarf nach Verbesserung der Verfahren und Erhöhung der Ausbeute dieser Produkte
Der vorliegenden Erfindung lag demgemäß die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen Wertstoffen zur Verfugung zu stellen, worin die Wertstoffe mit hoher Ausbeute erhalten werden können
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine deutliche Verbesserung der Werfst off ausbeute erhalten werden kann, wenn man im Anschluss an die Kultivierung oder Fermentation die durch Separation der Kultur-, bzw Fermenterbruhe abgetrennten Fest-stoffe, bzw Feststoffkonzentrate mit dem Filtrat wascht, welches aus der Aufkonzentrierung der separierten Flüssigkeit erhalten wird Durch das Nachwaschen der abgetrennten Feststoffkonzentrate können dann wasserlösliche Wertstoffe, insbesondere extrazellulare Wertstoffe herausgelost und der Wertstofflosung zugeführt werden
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur- und/ oder Fermenterlosungen, welches das Trennen der Biomasse von einer wasserigen, den Wertstoff enthaltenden Losung bzw Dispersion und anschließendes Filtrieren und Aufkonzentrieren der Wertstoff-haltigen Losung mittels Ultrafiltration umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten Feststoffe oder Feststoffkonzentrate einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflussigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentπerungsstufe verwendet wird
Ein Vorteil ist, dass die bei der Aufkonzentrierung anfallende Flüssigkeit nicht verworfen, sondern im Kreis gefuhrt werden kann Die anfallende Waschflussigkeit kann, nachdem sie als Waschwasser für das abgetrennte Feststoffkonzentrat eingesetzt worden ist, dem Verfahren der Ultrafiltration wieder zugeführt und nach Aufkonzentnerung der Wertstofflosung erneut als Waschflussigkeit gewonnen werden Mit der Kreislaufffahrweise des Filtrates der Ultrafiltration ist auch eine mehrstufige Waschung der Biomasse realisierbar
Als biologische Wertstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beliebige Produkte zu verstehen, die durch biotechnologische Prozessen hergestellt werden können und als Kultur- bzw Fermenterlosungen anfallen, wobei die Wertstoffe aus diesen Losungen durch Filtrationsverfahren gewonnen werden können Beispiele sind biotechnologisch herstellbare pharmazeutische Wirkstoffe sowie Enzyme
Als Enzyme kommen in erster Linie die aus Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilzen, gewonnenen Proteasen, Lipasen, Amylasen und/ oder Cellulasen in Frage, wobei von Bacillus-A en erzeugte und/oder abgeleitete Proteasen sowie ihre Gemische mit Amylasen bevorzugt sind Sie werden in an sich bekannter Weise durch Fermentationsprozesse aus geeigneten Mikroorganismen gewonnen, die zum Beispiel in den deutschen Offenlegungsschπften DE 19 40 488, DE 20 44 161 , DE 22 01 803 und DE 21 21 397, den US-amerikanischen Patentschriften US 3 632 957 und US 4 264 738 sowie der europaischen Patentanmeldung EP 006 638 beschrieben sind Besonders vorteilhaft kann das erfindungsgemaße Verfahren zur Isolierung der sehr aktiven Proteasen der sogenannten zweiten Generation verwendet werden, zu denen beispielsweise Savιnase(R) und aus der internationalen Patentanmeldung WO 91/2792 bekannte Enzyme gehören
Üblicherweise werden zur Durchfuhrung des erfindungsgemaßen Verfahrens die als Wertstoffrohlosungen bei Fermentationsprozessen anfallenden Brühen extrazellularer Wertstoffe eingesetzt
In einer ersten Verfahrensstufe werden die unlöslichen Begleit- oder Feststoffe einschließlich der Zeltrummer und/ oder der intakten Bakterien, im Folgenden auch Biomasse genannt, abgetrennt Dazu hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn man der Wertstoffrohlosung wasserlösliche Alkali- und/oder Erdalkalisalze zusetzt Beispiele für geeignete Salze sind die wasserlöslichen Na-, K- und Ca-Salze, vorzugsweise deren Haiogenide Diese Salze können insbesondere in einer Menge bis zu 1 Gew-%, vorzugsweise von 0,1 bis 1 Gew -%, bezogen auf die Wertstoffrohlosung, zugesetzt werden
Anschließend erfolgt die Abtrennung der Biomasse mittels einer Zentrifuge, vorzugsweise über einen Tellerseparator
Eine Verbesserung des Abtrennens der unlöslichen Biomasse kann dadurch erreicht werden, daß in einem nächsten Verfahrensschritt die in der Zentrifuge abgetrennte Flüssigkeit einer Mikrofiltration unterzogen wird In einer möglichen Ausfuhruπgsform wird die Mikrofiltration als Stenifiltration durchgeführt Die Mikrofiltration wird bevorzugt als Querstrom-Mikrofiltration durchgeführt Durch die Mikrofiltration wird gewährleistet, dass die Feststoffe und Mikro-organismen, d h die Biomasse, vollständig von der Wertstofflosung abgetrennt werden
Die anfallende Wertstofflosung enthalt die hergestellten Wertstoffe in relativ niedrigen Konzentrationen Das Aufkonzentrieren dieser Losung kann durch Ultrafiltration und anschließendes Eindampfen der Losung erreicht werden
Wie bereits oben ausgeführt wurde, enthalt die in den einzelnen Trennschritten abgetrennte Biomasse noch Restmengen an Wertstoffen Erfindungsgemaß wird die Ausbeute an aktiven Wertstoffen dadurch erhöht, dass die Feststoffkonzentrate (Biomasse) einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflussigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentπerungsstufe verwendet wird
Dieser Waschprozess hat den Vorteil, dass auch Restmengen an biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus der abgetrennten Biomasse isoliert werden können, wodurch die Ausbeute an gewonnenen Wertstoffen erhöht werden kann Dadurch, dass als Waschflussigkeit das bei der Ultrafiltration anfallende Filtrat eingesetzt wird, ist es nicht erforderlich, zusätzliche Waschflussigkeit, z B Wasser, aus externen Quellen zuzufügen Die Waschflussigkeit wird zur Isolierung der ausgewaschenen Wertstoffe der in den Trennschritten erhaltenen Wertstofflosung zugeführt und einer Aufkonzentnerung unterworfen Es erfolgt also eine Kreislaufffahrweise der Waschflussigkeit, die nach Aufkonzentration als Filtrat aus der Ultrafiltration gewonnen und wieder eingesetzt wird Durch diese Kreislaufffahrweise können Ausbeuten an biotechnologisch hergestellten Wert-stoffen von über 90% erreicht werden
Die Biomasse wird nach dem erfindungsgemaßen Waschschritt als wasserhaltiger Feststoff erhalten und kann in an sich bekannter Weise, üblicherweise nach einer Sterilisation, zu Düngemitteln verarbeitet werden
Das nach dem erfindungsgemaßen Verfahren erhaltene Wertstoffkonzentrat kann der weiteren Verarbeitung zugefugt werden In einer bevorzugten Ausfuhrungsform werden sie zu Granulaten verarbeitet, die sich gut in andere Produkte einarbeiten lassen
Werden beispielsweise Enzyme durch das erfindungsgemaße Verfahren gewonnen, so wird das erhaltene Enzymkonzentrat in einer bevorzugten Ausfuhrungsform zu Enzymgranulaten weiterverarbeitet Die erhaltenen Enzymkonzentrate können mit Zuschlagsstoffen vermischt und in an sich bekannter Weise, z B nach dem in dem europaischen Patent EP 0 564 476 B1 beschriebenen Verfahren, in Enzymgranulate überfuhrt werden
Beispiel
Eine Fermentercharge, die Protease als Wertstoff enthielt, wurde mit einer 30 %ιgen CaCI2-Losung auf den pH-Wert von 7,5 eingestellt Der so eingestellte Fermenterbrei wies einen Trockensubstanzgehalt von 16 % bei einer Proteaseaktivitat von 33 000 PE/g auf, wie sie nach van Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veroffenlichung „Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spul- und Remi-gungsmitteln" in Tenside (1970), Bd 7, S 125 - 132, bestimmbar ist
Bei einer Produkttemperatur von 20 °C wurden 6 m3 des eingestellten Fermenterbreies in einem Tellerseparator der Fa Westfa a, Typ HFA 65, in eine Klarphase (4,5 m3) und eine die Biomasse enthaltende, schwere Phase (1 ,5 m3) aufgetrennt Die Klarphase enthielt dabei den Wertstoff in gelöster Form In einer nachgeschalteten Ultrafiltration wurde die Enzymlosung auf ein Volumen von ca 6,5 % einkonzentriert Das Filtrat der Ultrafiltration enthielt die ge-losten Salze und an Enzymaktivitat 600 PE/g Enzym Mit diesem Filtrat wurde das Sediment der Separatorstufe aufgeschlammt und erneut zentπfugiert Der Klarlauf wurde ebenfalls der Ultrafiltration zugeführt
Die verbliebene Biomasse enthielt nur noch 5 % der anfangs enthaltenen Enzymmenge
In diesem Beispiel wurde eine Ausbeute von 95 % Enzym erreicht
Start 6 m3 eingestellter Fermenterbrei mit 33 000 PE/g
Ende 0,39 m3 Konzentrat der Ultrafiltration mit 535 000 PE/g
Ausbeute Enzym 95 %
Als Vergleich wurde Protease nach dem in der EP 0 564 476 beschriebenen Verfahren gewonnen Die Ausbeute betrug 90 %, war also deutlich geringer als die, die mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht wurde

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur- und/oder Fermenterlosungen, welches das Trennen der wasserunlöslichen Feststoffe von der wasserigen, die Wertstoffe enthaltenden Losung, anschließendes Filtrieren der erhaltenen Losung und Aufkonzentrieren der Wertstoff-haltigen Losung mittels Ultrafiltration umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten Feststoffe einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als
Waschflussigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentπerungsstufe verwendet wird
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die biotechnologisch hergestellten Wertstoffe Enzyme sind
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Protease ist
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Wertstoffrohlosung wasserlösliche Alkali- und/oder Erdalkahsalze zugesetzt werden
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlöslichen Bestandteile und die Feststoffe in einem ersten Trennschritt mittels einer Zentrifuge getrennt werden
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die im ersten Trennschritt abgetrennte Flüssigkeit einer Mikrofiltration, vorzugsweise einer Querstrom-Mikrofiltration, unterzogen wird
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die nach dem Waschschritt anfallende Flüssigkeit der wasserigen Wertstofflosung vor der Aufkonzentnerung zugeführt wird Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die nach einem Waschschritt anfallende Flüssigkeit nach dem Aufkonzentrieren erneut, ein oder mehrmals, als Waschlosung verwendet wird
Verwendung der nach dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8 erhaltenen Wertstofflosung zur Herstellung von Wertstoffgranulaten
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die
Wertstoffgranulate Enzymgranulate sind
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymgranulate in Wasch-, Waschhilfs- und Reinigungsmittel eingearbeitet werden
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