DE3735534A1 - Biotechnisches verfahren zur herstellung von invertase - Google Patents

Biotechnisches verfahren zur herstellung von invertase

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung des Enzyms Invertase aus aktiver Backhefe, das vorzugsweise in der Lebensmittelindustrie eingesetzt wird.
Es sind eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Invertase aus Hefen bekannt.
Im wesentlichen sind die Verfahren durch folgende Arbeitsschritte gekennzeichnet:
  • - Aufschluß der Hefezellen zur Freisetzung der Invertase
    - Trennung der Invertase von den Zellbestandteilen
    - Konzentrierung und Reinigung der invertasehaltigen Lösung
    - Stabilisierung der Invertase
So ist z. B. bekannt, die Zellzerstörung mittels organischer Lösungsmittel, z. B. mit Toluen durchzuführen. Nach Beendigung der Plasmolyse/Autolyse erfolgt eine Trennung der nicht gelösten Hefezellen z. B. durch Filterpressen. Nach einer entsprechenden pH-Wert Einstellung des Autolysates erfolgt die Invertasegewinnung über eine mehrmals durchzuführende Acetonfällung. Nach weiteren Trenn- und Löseschritten wird die gewonnene Invertaselösung z. B. mittels Vakuumverdampfer von Lösungsmittelresten befreit und aufkonzentriert. Anschließend wird mit Glycerol stabilisiert (Waldschmidt - Leitz, E. und Balls, A. K. in Handbuch der Lebensmittelchemie Bd. II/2. Teil, Springer Verlag Berlin 1935, S. 734-738).
Die Nachteile dieses Verfahrens bestehen vor allem darin, daß mitunter Rückstände des giftigen Toluens in der Invertaselösung verbleiben, der Zellaufschluß langwierig ist, was die Gefahr der Verkeimung erhöht, und die erreichten Ausbeuten und Aktivitäten gering sind, wobei der Energieaufwand relativ hoch ist.
Auch die zusätzliche Behandlung des durch den Toluenzusatz erhaltene Autolysats mittels Papain sowie durch weitere Maßnahmen wie Adsorption an Aluminiumhydroxyd oder Calciumphosphat, Elution mit Laktatlösung, Wasser oder Saccharoselösung, Fällung mit Alkohol oder Pikratlösung, Dialyse und sonstige Reinigungsoperationen führen zu keiner wesentlichen Effektivierung des Verfahrens (Hartmeier, W. Gordian, 78, 320-324 (1978)).
Ein weiteres bekanntes Verfahren wurde in dem DD-PS 1401 beschrieben.
Nach der üblichen Hefezüchtung wird eine Wirkstoffanreicherung (Hexosidasen) in der Hefemasse vorgenommen. Es folgt eine Aufkonzentrierung durch Separation mit anschließendem Zusatz freisetzend wirkender Stoffe wie Grünmalz bzw. dessen diastatischen Wirkstoffe einschließlich Cytase.
Die Zellzerstörung erfolgt durch Ultraschalleinwirkung auf die rotierende Hefemasse. Nach der Freisetzung der Hefeinhaltsstoffe erfolgt die Trennung der Invertaselösung von den Zelltrümmern und sonstigen festen Bestandteilen durch Separation. Die Reinigung des Zellsaftes wird mit Hilfe von schwach saurem Austauscherharz vorgenommen.
Der Nachteil dieses Verfahrens besteht vor allem darin, daß der hohe technisch-technologische Aufwand und die damit verbundene komplizierte Verfahrensführung sowie der hohe Energieaufwand und der relativ hohe Zeitaufwand zur Freisetzung der Hefeinhaltsstoffe verbunden mit der zu geringen Ausbeute bzw. erreichbaren Aktivität der gewonnenen Invertase es unrentabel machen.
Bekannt ist weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung von löslicher Invertase aus Hefe so wie in der DE-PS 26 626 beschrieben.
Dieses Verfahren ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß durch die Einwirkung von Cellulasen, Proteasen und Lipasen auf die Hefezellen sich die Plasmolyse und Autolyse vollzieht. Als Ausgangshefe wird sprühgetrocknete Hefe, die anschließend resuspendiert wird, eingesetzt. Nach erfolgter Plasmolyse/Autolyse erfolgt die Abtrennung der unlöslichen Zellfragmente und anschließend wird das Filtrat in Hefeextrakt und Invertase mittels Ultrafiltration getrennt. Danach erfolgt eine Stabilisierung bzw. Standardisierung der Invertase mittels Glycerol- oder Sorbitollösung. Auch bei diesem Verfahren zeigt sich, daß der Energieaufwand relativ hoch ist. Die Aufschlußzeiten sind ebenfalls nach wie vor hoch (8-20 h), was zur Verkeimung und damit zu Aktivitätsverlusten führen kann. Außerdem besteht beim Einsatz der Sprühtrocknung der Hefe und der damit verbundenen hohen Temperaturführung (bis 240°C) die Gefahr der partiellen Inaktivierung des Enzyms.
In den DD-PS 110 425 und 116 135 werden Verfahren zur Gewinnung von Hefeextrakten, Hefeglycan, Hefeproteinisolate mit herabgesetztem Nucleinsäuregehalt beschrieben.
Die Hefezellen (Bier- oder Backhefe) werden danach in bekannter Weise z. B. durch Hochdruckhomogenisieren, Zerreiben in einer Sand- oder Kolloimühle, Zerkleinern mittels Schallwellen, wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen, lytische Enzyme und dergleichen aufgeschlossen. Es folgt eine Wärmebehandlung zwecks Abtrennung der Nucleinsäure vom Protein.
Danach erfolgt eine nicht näher beschriebene Abtrennung der unslöslichen Proteinproduktfraktion von der löslichen Fraktion. Die Gewinnung des Hefeextraktes, Hefeglycans und Hefeproteinisolates mit herabgesetztem Nucleinsäuregehalt erfolgt durch Zentrifugieren, Vakuumkonzentration und Trocknen.
Diese Verfahren dienen in erster Linie der Gewinnung von Hefeproteinisolaten mit herabgesetztem Nucleinsäuregehalt, Hefeglycanen und Hefeextrakten.
Die Verfahrensschritte ähneln im wesentlichen zwar denen, die bei der Invertasegewinnung angewandt werden, es wurden jedoch in den Erfindungen keine Hinweise für eine Übertragbarkeit der vorgeschlagenen Lehre auf die Gewinnung von Invertase gegeben.
Insbesondere das vorzugsweise vorgeschlagene Hochdruckhomogenisierungsverfahren zur Zellzertrümmerung und die vorgeschlagenen Wärmebehandlungsverfahren lassen Zweifel an einer effektiven Invertaseherstellung aufkommen.
In der DE-PS 26 39 129 werden Verfahren zur Abtrennung von Enzymen beschrieben, bei denen die Enzyme durch Aufschließen z. B. von Bierhefezellen und/oder Behandeln mit Detergentien solubilisiert werden und mit den Zelltrümmern bzw. Zellen zwischen verschiedenen Phasen eines wäßrigen Mehrphasensystems mit einem Gehalt an mindestens einem Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierte Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrrolidone und Polysaccharide gebildeten Gruppen und mindestens einem anorganischen Salz oder mit einem Gehalt an mindestens zwei Hochmolekularen verteilt wird und anschließend die Phasen voneinander z. B. durch Fällung, Ultrafiltration, Dialyse, Gelpermeation, Adsorbtion, Ionenaustausch oder Elektrophorese getrennt werden.
In der vorgeschlagenen Lehre wird zwar davon gesprochen, daß beliebige Enzyme gewonnen werden können, konkret wird aber nur auf Pullulanasen bzw. Maltasen bezug genommen. Die mit dem vorgeschlagenen Verfahren erreichten Ergebnisse hinsichtlich Aktivitäten und Ausbeuten im Verhältnis zum notwendigen Mittelaufwand können jedoch nicht befriedigen.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein energieökonomisches biotechnisches Verfahren zur Herstellung von hochaktiver und hochreiner Invertase aus Backhefe zu entwickeln, in dem keine organischen Lösungsmittel oder andere Chemikalien und/oder Enzyme verwendet und kurze Herstellungszeiten erreicht werden. Weiterhin soll das Verfahren durch den Einsatz entsprechender Ausrüstungen leicht beherrschbar und unkompliziert sein sowie kontinuierlich arbeiten können, wobei gleichzeitig eine hohe Ausbeute an konzentrierter Invertase erreicht werden soll und die anfallenden Abfall- bzw. Nebenprodukte weiter verarbeitet werden können.
Die Hefezellen einer aktiven Backhefesuspension mit einer Hefetrockensubstanz (HTS) von ca. 10% und einer Temperatur von 8-15°C werden in einer Spindelmühle kontinuierlich aufgebrochen, wobei die eingesetzten Mikroglaskugeln einen Durchmesser von 0,5-1,2 mm aufweisen und die Drehzahl der Rührwelle 2500-4000 U/min beträgt. In einem nachfolgenden Separator erfolgt kontinuierlich die Grobtrennung zwischen Zelltrümmer und invertasehaltiger Lösung. Um Enzymausbeuteverluste zu vermeiden, wird vor der Entschlammung der Zulauf der Suspension gestoppt und der Rotor ca. 5 min mit Wasser gespült, wobei der Schlammraum erst dann entleert wird, wenn am Produktauslauf des Separators klares Wasser austritt.
Die anschließende kontinuierliche Klärfiltration der invertasehaltigen Lösung erfolgt über einen Schichtenfilter, wobei die Filterschichten eine Durchlässigkeit von 425- 475 l/h · m2 aufweisen. Die Klarseiten der Filterschichten werden dabei zusätzlich mit Filterpapier unterlegt, wobei die Filterschichten vor Beginn der Filtration ca. 20 min gewässert werden. Die Druckdifferenz zwischen Filterein- und -ausgang darf während der Filtration nicht größer als 200-250 kPa sein.
Der Schichtenfilter ist so geschaltet, daß neben dem Filtrationsprozeß ein Kreislauf möglich ist, so daß die Entstehung eines Überdruckes, der zur Beschädigung der Filterplatten führen kann, vermieden wird. Der durch die Kreislauffahrweise verbleibende Rest der zu klärenden Invertaselösung wird erneut der Separation unterzogen.
Die Reinigung, Aufkonzentrierung und Entkeimung der Invertaselösung erfolgt über eine kombinierte Ultra- und Mikrofiltrationsanlage. Die Ultrafiltrationstrenneinheit ist zu der Mikrofiltrationstrenneinheit so angeordnet, daß zunächst die Lösung über die Ultrafiltrationstrenneinheit gereinigt und aufkonzentriert und danach zur Entkeimung über die Mikrofiltrationstrenneinheit geleitet wird.
Die Durchlässigkeit der in der Ultrafiltrationstrenneinheit eingesetzten UF Membranen beträgt 80-140 l/h · m2, wobei der Eingangsdruck ca. 0,15-0,4 und der Ausgangsdruck ca. 0,1- 0,3 MPa beträgt. Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität der Flachmembranen werden zwischen Membranen und Filterableitplatten Stützgewebe, beispielsweise Vliesmaterial eingesetzt.
Die Invertaselösung wird durch die Ultrafiltrationstrenneinheit auf ca. 1/10 eingeengt. Zur weiteren Reinigung des Invertaselösungskonzentrates erfolgt eine zusätzliche Diafiltration über die Ultrafiltrationstrenneinheit. Das Konzentrat wird dabei im Verhältnis 1 : 1 mit Wasser verdünnt und solange im Kreislauf diafiltriert bis das Ausgangsvolumen an Konzentrat wieder erreicht ist.
Nach dieser Ultra- und Diafiltration wird die gereinigte Invertasekonzentratlösung zur Abtrennung der in der Lösung enthaltenen denaturierten Proteine sowie Mikroorganismen über die Mikrofiltrationstrenneinheit geleitet. Der Porendurchmesser des eingesetzten Mikrofiltermaterials beträgt 0,2 µm, wobei der Eingangsdruck 0,3 MPa nicht überschreiten soll. Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität des eingesetzten Filtermaterials wird, wie bei der Ultrafiltrationstrenneinheit beschrieben, ein Stützgewebe eingesetzt.
Mit der anschließenden, an sich bekannten, Stabilisierung wird die Lösung auf eine Aktivität von ca. 1500 U · ml-1 eingestellt und lagerfähig gemacht.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Invertasepräparaten hoher spezifischer Aktivität (400-800 U/mg) für die, für analytische Zwecke, ein besonderes Interesse besteht, in dem die Diafiltration in der oben beschriebenen Weise 3-8mal wiederholt wird.
Die nach der vorgenannten Verfahrensweise erreichte Ausbeute an glycerolstabilisierter Invertaselösung beträgt 75% bezogen auf die eingesetzte aktive Backhefe.
Ausführungsbeispiel
Mit Hilfe einer Skizze soll das Ausführungsbeispiel erläutert werden.
120 kg bei 2-4°C gelagerte aktive Backhefe (HTS 30- 33%) wird mit 240 l Wasser in einem Misch- und Temperierbehälter 1 angesetzt. Nach ca. 30 min entsteht eine homogene Hefesuspension mit einer HTS von 10-15%, die bei einer Temperatur zwischen 10-12°C gehalten wird.
Die gekühlte Suspension wird danach über eine Dosierpumpe 2 einer kontinuierlich arbeitenden Spindelmühle 3 zugeführt. Der Aufschluß der Hefezellen erfolgt dabei in einem wassergekühlten ca. 3 l-Mahltopf, der mit ca. 2400 g Mikroglaskugeln von 0,8 bis 1 mm gefüllt ist. Die Drehzahl der Rührwelle beträgt ca. 3000 U/min und der Suspensionsdurchsatz 16 l/h. Die aufgeschlossene Hefesuspension läuft über den oberen Auslauf des Mahltopfes in einen Misch- und Temperierbehälter 4. Über eine Dosierpumpe 5 wird die Suspension einem Separator 6 zugeführt. Hier wird der überwiegende Teil der Zelltrümmer von der invertasehaltigen Lösung abgetrennt. Aus dem Produktablauf des Separators 6 läuft die von den Zelltrümmern weitgehend befreite Phase in einen Zwischenbehälter 7. Die Zulaufgeschwindigkeit der zu separierenden Suspension beträgt ca. 50 l/h. Der Separator 6 ist dabei jeweils nach ca. 0,75 h zu entschlammen. Um größere Enzymausbeuteverluste zu vermeiden, wird vor der Entschlammung der Zulauf der Hefesuspension gestoppt und der Rotor solange mit Wasser gespült, bis am Produktauslauf klares Wasser austritt. Dann wird das Steuerwasser eingeschaltet und der Schlamm entleert.
Aus dem Zwischenbehälter 7 wird die invertasehaltige Lösung mit Hilfe einer Dosierpumpe 8 zu einem Schichtenfilter 9 zum Zwecke der Klärfiltration geführt.
Die Klärung erfolgt durch die Verwendung von Filterschichten vom Typ KP-10 A (40 × 40 cm) mit einer Durchlässigkeit von ca. 450 l/h · m2.
Um die Filtratqualität zu erhöhen, wird die Klarseite der Filterschichten mit Filterpapier Niederschlag 291 (40 × 40 cm) unterlegt. Die eingelegten Filterschichten werden vor Beginn der Filtration ca. 20 min gewässert.
Die Filtrationsgeschwindigkeit wird auf ca. 80-100 l/h eingestellt. Die max. Durckdifferenz zwischen Filterein- und -ausgang darf dabei nicht größer als 200 bzw. 250 kPa sein.
Der Schichtenfilter 9 ist dabei so geschaltet, daß neben dem Filtrationsprozeß ein Mediumkreislauf vorhanden ist, so daß die Entstehung eines Überdruckes, der zum vorzeitigen Zerstören des Filtermaterials führen kann, vermieden wird.
Der durch die Kreislauffahrweise verbleibende Rückstand der zu klärenden, invertasehaltigen Lösung wird nach der abgeschlossenen Klärfiltration erneut dem Separator 6 zugeführt.
Die weiter zu verarbeitende Lösung wird in einen Zwischenbehälter 10 überführt. Die weitere Reinigung, Aufkonzentrierung und Entkeimung der invertasehaltigen Lösung erfolgt in einer speziellen, kombinierten Ultra-Mikrofiltrationslage 11.
Das auf einem Gestell befindliche Plattenpaket wird mit 5 m2 Filterfläche für die Ultrafiltration und 4 m2 für die Mikrofiltration benutzt. Für die Ultrafiltrationstrenneinheit 12 werden UF-Membranen mit einer Durchlässigkeit von 80-140 l/h · m2 vom Typ CAM-UF-120-CP (VEB Zellstoff- und Zellwollwerke Wittenberge) eingesetzt. Dieser Typ sichert eine Selektivität bezogen auf Invertase von mehr als 99%. Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität wird zusätzlich zwischen Membran und Filterableitplatte ein Stützgewebe aus Vliesmaterial angeordnet.
Die Mikrofiltrationseinheit 13 ist mit Kernspurmikrofilter aus Polyester (ZfK AdW Rossendorf) mit einem Porendurchmesser von 0,2 µm bespannt. Auch dieses Filtermaterial wird zur Erhöhung der Stabilität mit Vliesmaterial gestützt.
Aus dem Zwischenbehälter 10 wird die invertasehaltige Lösung mit Hilfe einer Dosierpumpe 14 durch einen Doppelrohrkühler 15 in die Ultrafiltrationseinheit 12 gepumpt. Die Lösung wird nach dem Überströmungsprinzip über die Filterplatten geführt, wobei Moleküle mit einem Molgewicht größer als 150 000 zurückgehalten werden.
Die Permeatablaufgeschwindigkeit liegt dabei bei ca. 80- 140 l/h bei einem Ausgangsdruck von 0,1-0,3 MPa. Die Invertaseaktivität im Permeat liegt dabei unter 0,5%.
Die nach der Klärfiltration erhaltene Lösung wird durch die Ultrafiltration auf 1/10 des Volumens eingeengt. Das nach der Ultrafiltration erhaltene Konzentrat wird anschließend mit Wasser im Verhältnis 1 : 1 verdünnt und zum Zweck einer weiteren Reinigung im Kreislauf über die Ultrafiltrationstrenneinheit 12 diafiltriert, bis das Ausgangsvolumen des Konzentrates wieder erreicht ist.
Durch die Blockierung des Ultrafiltrationskreislaufes wird das im Zwischenbehälter 10 befindliche ultra- bzw. diafiltrierte Konzentrat über eine Dosierpumpe 16 über den Kühler 15 zur Mikrofiltrationseinheit 13 befördert.
Dort werden die im Konzentrat enthaltenen denaturierten Proteine sowie Mikroorganismen, die die Produktqualität beeinträchtigen, abgetrennt. Die vorgenannte aktive Filterfläche wird auf einen Durchsatz von ca. 20 l/h eingestellt, wobei der Eingangsdruck nicht größer als 0,3 MPa sein soll.
Die gereinigte, aufkonzentrierte und entkeimte Invertaselösung wird in einen Misch- und Temperierbehälter 17 eingebracht und dort mit Glycerol im Verhältnis 1 : 1 vermischt und damit stabilisiert. Die Ausbeute der stabilisierten Invertaselösung beträgt 90 kg (75% bezogen auf eingesetzte aktive Backhefe).
Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen
 1 Misch- und Temperierbehälter
 2 Dosierpumpe
 3 Spindelmühle
 4 Misch- und Temperierbehälter
 5 Dosierpumpe
 6 Separator
 7 Zwischenbehälter
 8 Dosierpumpe
 9 Schichtenfilter
10 Zwischenbehälter
11 Ultra-Mikrofiltrationsanlage
12 Ultrafiltrationstrenneinheit
13 Mikrofiltrationseinheit
14 Dosierpumpe
15 Doppelrohrkühler
16 Dosierpumpe
17 Misch- und Temperierbehälter

Claims (1)

  1. Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Invertase aus aktiver Backhefe, indem aktive Backhefe mit einer Hefetrockensubstanz (HTS) von 30-33% mit Hilfe von Wasser auf eine HTS von ca. 10% suspendiert und auf eine Temperatur von 10-12°C eingestellt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefezellen dieser Suspension in einer an sich bekannten Spindelmühle 3 mit Hilfe von Mikroglaskugeln mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,2 mm und einer Rührwellendrehzahl von 2500-4000 U/min kontinuierlich aufgebrochen werden, danach in einem an sich bekannten Separator 6 eine invertasehaltige Lösung gewonnen wird, wobei vor der Entschlammung der Zulauf der Suspension gestoppt und der Rotor solange mit Wasser gespült wird, bis am Produktauslauf klares Wasser austritt, danach die Lösung einer an sich bekannten Klärfiltration mit Hilfe eines Schichtenfilters 9 unterzogen wird, wobei die Filterschichten eine Durchlässigkeit von 425-475 l/h · m2 aufweisen, die Klarseiten der Filterschichten zusätzlich mit Filterpapier unterlegt sind und vor Beginn der Klärfiltration diese Filterschichten ca. 20 min mit Wasser gewässert werden, wobei die Druckdifferenz zwischen Filterein- und -ausgang während der Filtration nicht größer als 200-250 kPa ist, der Schichtenfilter so geschaltet wird, daß neben dem Filtrationsprozeß eine Kreislauffahrweise möglich ist und der verbleibende Rest der zu klärenden Invertaselösung erneut der Separation unterzogen wird, danach die Lösung einer kombinierten Ultra- und Mikrofiltrationsanlage 11 derart zugeführt wird, daß zunächst die Lösung die Ultrafiltrationstrenneinheit 12 durchläuft, im Kreislauf einer Diafiltration unterzogen und danach über die Mikrofiltrationstrenneinheit 13 geführt wird, wobei die Durchlässigkeit der in der Ultrafiltrationstrenneinheit eingesetzten UF-Membranen 80-140 l/h · m2, der Eingangsdruck 0,15-0,4 und der Ausgangsdruck 0,1- 0,3 MPa beträgt, zwischen Membranen und Filterableitplatten Stützgewebe beispielsweise Vliesmaterial angeordnet ist, die Lösung zunächst durch die Ultrafiltrationstrenneinheit 12 auf ca. 1/10 eingeengt, danach das Konzentrat im Verhältnis 1 : 1 mit Wasser verdünnt und solange im Kreislauf diafiltriert wird, bis das Ausgangsvolumen an Konzentrat wieder erreicht ist, danach die gereinigte Invertasekonzentratlösung über die Mikrofiltrationstrenneinheit 13 geleitet wird, wobei der Porendurchmesser des eingesetzten Mikrofiltrationsmaterials 0,2 µm beträgt und der Eingangsdruck nicht größer als 0,3 MPa und das Filtermaterial wie bei der Ultrafiltrationstrenneinheit 12 mit einem Stützgewebe versehen ist und anschließend die Invertasekonzentratlösung in an sich bekannter Weise stabilisiert, standardisiert und konfektioniert wird.
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