DE3735534A1 - Biotechnisches verfahren zur herstellung von invertase - Google Patents
Biotechnisches verfahren zur herstellung von invertaseInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein biotechnisches Verfahren
zur Herstellung des Enzyms Invertase aus aktiver Backhefe,
das vorzugsweise in der Lebensmittelindustrie eingesetzt
wird.
Es sind eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von
Invertase aus Hefen bekannt.
Im wesentlichen sind die Verfahren durch folgende Arbeitsschritte
gekennzeichnet:
- - Aufschluß der Hefezellen zur Freisetzung der Invertase
- Trennung der Invertase von den Zellbestandteilen
- Konzentrierung und Reinigung der invertasehaltigen Lösung
- Stabilisierung der Invertase
So ist z. B. bekannt, die Zellzerstörung mittels organischer
Lösungsmittel, z. B. mit Toluen durchzuführen. Nach
Beendigung der Plasmolyse/Autolyse erfolgt eine Trennung
der nicht gelösten Hefezellen z. B. durch Filterpressen.
Nach einer entsprechenden pH-Wert Einstellung des Autolysates
erfolgt die Invertasegewinnung über eine mehrmals
durchzuführende Acetonfällung. Nach weiteren Trenn- und
Löseschritten wird die gewonnene Invertaselösung z. B.
mittels Vakuumverdampfer von Lösungsmittelresten befreit
und aufkonzentriert. Anschließend wird mit Glycerol stabilisiert
(Waldschmidt - Leitz, E. und Balls, A. K. in Handbuch
der Lebensmittelchemie Bd. II/2. Teil, Springer Verlag Berlin
1935, S. 734-738).
Die Nachteile dieses Verfahrens bestehen vor allem darin, daß
mitunter Rückstände des giftigen Toluens in der Invertaselösung
verbleiben, der Zellaufschluß langwierig ist, was
die Gefahr der Verkeimung erhöht, und die erreichten Ausbeuten
und Aktivitäten gering sind, wobei der Energieaufwand
relativ hoch ist.
Auch die zusätzliche Behandlung des durch den Toluenzusatz
erhaltene Autolysats mittels Papain sowie durch weitere
Maßnahmen wie Adsorption an Aluminiumhydroxyd oder Calciumphosphat,
Elution mit Laktatlösung, Wasser oder Saccharoselösung,
Fällung mit Alkohol oder Pikratlösung, Dialyse und
sonstige Reinigungsoperationen führen zu keiner wesentlichen
Effektivierung des Verfahrens (Hartmeier, W. Gordian,
78, 320-324 (1978)).
Ein weiteres bekanntes Verfahren wurde in dem DD-PS 1401
beschrieben.
Nach der üblichen Hefezüchtung wird eine Wirkstoffanreicherung
(Hexosidasen) in der Hefemasse vorgenommen. Es
folgt eine Aufkonzentrierung durch Separation mit anschließendem
Zusatz freisetzend wirkender Stoffe wie
Grünmalz bzw. dessen diastatischen Wirkstoffe einschließlich
Cytase.
Die Zellzerstörung erfolgt durch Ultraschalleinwirkung auf
die rotierende Hefemasse. Nach der Freisetzung der Hefeinhaltsstoffe
erfolgt die Trennung der Invertaselösung von den
Zelltrümmern und sonstigen festen Bestandteilen durch Separation.
Die Reinigung des Zellsaftes wird mit Hilfe von
schwach saurem Austauscherharz vorgenommen.
Der Nachteil dieses Verfahrens besteht vor allem darin, daß
der hohe technisch-technologische Aufwand und die damit verbundene
komplizierte Verfahrensführung sowie der hohe Energieaufwand
und der relativ hohe Zeitaufwand zur Freisetzung
der Hefeinhaltsstoffe verbunden mit der zu geringen Ausbeute
bzw. erreichbaren Aktivität der gewonnenen Invertase es
unrentabel machen.
Bekannt ist weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung von löslicher
Invertase aus Hefe so wie in der DE-PS 26 626 beschrieben.
Dieses Verfahren ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet,
daß durch die Einwirkung von Cellulasen, Proteasen und
Lipasen auf die Hefezellen sich die Plasmolyse und Autolyse
vollzieht. Als Ausgangshefe wird sprühgetrocknete Hefe, die
anschließend resuspendiert wird, eingesetzt. Nach erfolgter
Plasmolyse/Autolyse erfolgt die Abtrennung der unlöslichen
Zellfragmente und anschließend wird das Filtrat in Hefeextrakt
und Invertase mittels Ultrafiltration getrennt. Danach
erfolgt eine Stabilisierung bzw. Standardisierung der
Invertase mittels Glycerol- oder Sorbitollösung. Auch bei
diesem Verfahren zeigt sich, daß der Energieaufwand relativ
hoch ist. Die Aufschlußzeiten sind ebenfalls nach wie vor
hoch (8-20 h), was zur Verkeimung und damit zu Aktivitätsverlusten
führen kann. Außerdem besteht beim Einsatz der
Sprühtrocknung der Hefe und der damit verbundenen hohen
Temperaturführung (bis 240°C) die Gefahr der partiellen
Inaktivierung des Enzyms.
In den DD-PS 110 425 und 116 135 werden Verfahren zur Gewinnung
von Hefeextrakten, Hefeglycan, Hefeproteinisolate
mit herabgesetztem Nucleinsäuregehalt beschrieben.
Die Hefezellen (Bier- oder Backhefe) werden danach in bekannter
Weise z. B. durch Hochdruckhomogenisieren, Zerreiben
in einer Sand- oder Kolloimühle, Zerkleinern
mittels Schallwellen, wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen,
lytische Enzyme und dergleichen aufgeschlossen. Es folgt
eine Wärmebehandlung zwecks Abtrennung der Nucleinsäure
vom Protein.
Danach erfolgt eine nicht näher beschriebene Abtrennung der
unslöslichen Proteinproduktfraktion von der löslichen Fraktion.
Die Gewinnung des Hefeextraktes, Hefeglycans und Hefeproteinisolates
mit herabgesetztem Nucleinsäuregehalt erfolgt
durch Zentrifugieren, Vakuumkonzentration und
Trocknen.
Diese Verfahren dienen in erster Linie der Gewinnung von
Hefeproteinisolaten mit herabgesetztem Nucleinsäuregehalt,
Hefeglycanen und Hefeextrakten.
Die Verfahrensschritte ähneln im wesentlichen zwar denen,
die bei der Invertasegewinnung angewandt werden, es wurden
jedoch in den Erfindungen keine Hinweise für eine Übertragbarkeit
der vorgeschlagenen Lehre auf die Gewinnung
von Invertase gegeben.
Insbesondere das vorzugsweise vorgeschlagene Hochdruckhomogenisierungsverfahren
zur Zellzertrümmerung und die
vorgeschlagenen Wärmebehandlungsverfahren lassen Zweifel
an einer effektiven Invertaseherstellung aufkommen.
In der DE-PS 26 39 129 werden Verfahren zur Abtrennung von
Enzymen beschrieben, bei denen die Enzyme durch Aufschließen
z. B. von Bierhefezellen und/oder Behandeln mit Detergentien
solubilisiert werden und mit den Zelltrümmern bzw. Zellen
zwischen verschiedenen Phasen eines wäßrigen Mehrphasensystems
mit einem Gehalt an mindestens einem Hochmolekularen
aus der durch gegebenenfalls substituierte Polyalkohole,
Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrrolidone und
Polysaccharide gebildeten Gruppen und mindestens einem
anorganischen Salz oder mit einem Gehalt an mindestens
zwei Hochmolekularen verteilt wird und anschließend die
Phasen voneinander z. B. durch Fällung, Ultrafiltration,
Dialyse, Gelpermeation, Adsorbtion, Ionenaustausch oder
Elektrophorese getrennt werden.
In der vorgeschlagenen Lehre wird zwar davon gesprochen,
daß beliebige Enzyme gewonnen werden können, konkret wird
aber nur auf Pullulanasen bzw. Maltasen bezug genommen.
Die mit dem vorgeschlagenen Verfahren erreichten Ergebnisse
hinsichtlich Aktivitäten und Ausbeuten im Verhältnis zum
notwendigen Mittelaufwand können jedoch nicht befriedigen.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein energieökonomisches
biotechnisches Verfahren zur Herstellung
von hochaktiver und hochreiner Invertase aus Backhefe zu
entwickeln, in dem keine organischen Lösungsmittel oder
andere Chemikalien und/oder Enzyme verwendet und kurze
Herstellungszeiten erreicht werden. Weiterhin soll das
Verfahren durch den Einsatz entsprechender Ausrüstungen
leicht beherrschbar und unkompliziert sein sowie kontinuierlich
arbeiten können, wobei gleichzeitig eine hohe Ausbeute
an konzentrierter Invertase erreicht werden soll und die anfallenden
Abfall- bzw. Nebenprodukte weiter verarbeitet
werden können.
Die Hefezellen einer aktiven Backhefesuspension mit einer
Hefetrockensubstanz (HTS) von ca. 10% und einer Temperatur
von 8-15°C werden in einer Spindelmühle kontinuierlich
aufgebrochen, wobei die eingesetzten Mikroglaskugeln einen
Durchmesser von 0,5-1,2 mm aufweisen und die Drehzahl
der Rührwelle 2500-4000 U/min beträgt. In einem nachfolgenden
Separator erfolgt kontinuierlich die Grobtrennung
zwischen Zelltrümmer und invertasehaltiger Lösung.
Um Enzymausbeuteverluste zu vermeiden, wird vor der Entschlammung
der Zulauf der Suspension gestoppt und der Rotor
ca. 5 min mit Wasser gespült, wobei der Schlammraum erst
dann entleert wird, wenn am Produktauslauf des Separators
klares Wasser austritt.
Die anschließende kontinuierliche Klärfiltration der invertasehaltigen
Lösung erfolgt über einen Schichtenfilter, wobei
die Filterschichten eine Durchlässigkeit von 425-
475 l/h · m2 aufweisen. Die Klarseiten der Filterschichten
werden dabei zusätzlich mit Filterpapier unterlegt, wobei
die Filterschichten vor Beginn der Filtration ca. 20 min
gewässert werden. Die Druckdifferenz zwischen Filterein-
und -ausgang darf während der Filtration nicht größer als
200-250 kPa sein.
Der Schichtenfilter ist so geschaltet, daß neben dem
Filtrationsprozeß ein Kreislauf möglich ist, so daß die
Entstehung eines Überdruckes, der zur Beschädigung der
Filterplatten führen kann, vermieden wird. Der durch die
Kreislauffahrweise verbleibende Rest der zu klärenden
Invertaselösung wird erneut der Separation unterzogen.
Die Reinigung, Aufkonzentrierung und Entkeimung der
Invertaselösung erfolgt über eine kombinierte Ultra-
und Mikrofiltrationsanlage. Die Ultrafiltrationstrenneinheit
ist zu der Mikrofiltrationstrenneinheit so angeordnet,
daß zunächst die Lösung über die Ultrafiltrationstrenneinheit
gereinigt und aufkonzentriert und danach zur
Entkeimung über die Mikrofiltrationstrenneinheit geleitet
wird.
Die Durchlässigkeit der in der Ultrafiltrationstrenneinheit
eingesetzten UF Membranen beträgt 80-140 l/h · m2, wobei der
Eingangsdruck ca. 0,15-0,4 und der Ausgangsdruck ca. 0,1-
0,3 MPa beträgt. Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität
der Flachmembranen werden zwischen Membranen und Filterableitplatten
Stützgewebe, beispielsweise Vliesmaterial
eingesetzt.
Die Invertaselösung wird durch die Ultrafiltrationstrenneinheit
auf ca. 1/10 eingeengt. Zur weiteren Reinigung des
Invertaselösungskonzentrates erfolgt eine zusätzliche
Diafiltration über die Ultrafiltrationstrenneinheit. Das
Konzentrat wird dabei im Verhältnis 1 : 1 mit Wasser verdünnt
und solange im Kreislauf diafiltriert bis das Ausgangsvolumen
an Konzentrat wieder erreicht ist.
Nach dieser Ultra- und Diafiltration wird die gereinigte
Invertasekonzentratlösung zur Abtrennung der in der
Lösung enthaltenen denaturierten Proteine sowie Mikroorganismen
über die Mikrofiltrationstrenneinheit geleitet.
Der Porendurchmesser des eingesetzten Mikrofiltermaterials
beträgt 0,2 µm, wobei der Eingangsdruck 0,3 MPa nicht
überschreiten soll. Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität
des eingesetzten Filtermaterials wird, wie bei der
Ultrafiltrationstrenneinheit beschrieben, ein Stützgewebe
eingesetzt.
Mit der anschließenden, an sich bekannten, Stabilisierung
wird die Lösung auf eine Aktivität von ca. 1500 U · ml-1
eingestellt und lagerfähig gemacht.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur
Herstellung von Invertasepräparaten hoher spezifischer
Aktivität (400-800 U/mg) für die, für analytische Zwecke,
ein besonderes Interesse besteht, in dem die Diafiltration
in der oben beschriebenen Weise 3-8mal wiederholt wird.
Die nach der vorgenannten Verfahrensweise erreichte Ausbeute
an glycerolstabilisierter Invertaselösung beträgt 75% bezogen
auf die eingesetzte aktive Backhefe.
Mit Hilfe einer Skizze soll das Ausführungsbeispiel erläutert werden.
120 kg bei 2-4°C gelagerte aktive Backhefe (HTS 30-
33%) wird mit 240 l Wasser in einem Misch- und Temperierbehälter
1 angesetzt. Nach ca. 30 min entsteht eine homogene
Hefesuspension mit einer HTS von 10-15%, die bei einer
Temperatur zwischen 10-12°C gehalten wird.
Die gekühlte Suspension wird danach über eine Dosierpumpe 2
einer kontinuierlich arbeitenden Spindelmühle 3 zugeführt.
Der Aufschluß der Hefezellen erfolgt dabei in einem wassergekühlten
ca. 3 l-Mahltopf, der mit ca. 2400 g Mikroglaskugeln
von 0,8 bis 1 mm gefüllt ist. Die Drehzahl der Rührwelle
beträgt ca. 3000 U/min und der Suspensionsdurchsatz
16 l/h. Die aufgeschlossene Hefesuspension läuft über den
oberen Auslauf des Mahltopfes in einen Misch- und Temperierbehälter
4. Über eine Dosierpumpe 5 wird die Suspension
einem Separator 6 zugeführt. Hier wird der überwiegende
Teil der Zelltrümmer von der invertasehaltigen Lösung
abgetrennt. Aus dem Produktablauf des Separators 6 läuft
die von den Zelltrümmern weitgehend befreite Phase in einen
Zwischenbehälter 7. Die Zulaufgeschwindigkeit der zu separierenden
Suspension beträgt ca. 50 l/h. Der Separator 6 ist
dabei jeweils nach ca. 0,75 h zu entschlammen. Um größere
Enzymausbeuteverluste zu vermeiden, wird vor der Entschlammung
der Zulauf der Hefesuspension gestoppt und der
Rotor solange mit Wasser gespült, bis am Produktauslauf
klares Wasser austritt. Dann wird das Steuerwasser eingeschaltet
und der Schlamm entleert.
Aus dem Zwischenbehälter 7 wird die invertasehaltige Lösung
mit Hilfe einer Dosierpumpe 8 zu einem Schichtenfilter 9
zum Zwecke der Klärfiltration geführt.
Die Klärung erfolgt durch die Verwendung von Filterschichten
vom Typ KP-10 A (40 × 40 cm) mit einer Durchlässigkeit von
ca. 450 l/h · m2.
Um die Filtratqualität zu erhöhen, wird die Klarseite der
Filterschichten mit Filterpapier Niederschlag 291 (40 ×
40 cm) unterlegt. Die eingelegten Filterschichten werden
vor Beginn der Filtration ca. 20 min gewässert.
Die Filtrationsgeschwindigkeit wird auf ca. 80-100 l/h
eingestellt. Die max. Durckdifferenz zwischen Filterein-
und -ausgang darf dabei nicht größer als 200 bzw. 250 kPa
sein.
Der Schichtenfilter 9 ist dabei so geschaltet, daß neben
dem Filtrationsprozeß ein Mediumkreislauf vorhanden ist,
so daß die Entstehung eines Überdruckes, der zum vorzeitigen
Zerstören des Filtermaterials führen kann, vermieden wird.
Der durch die Kreislauffahrweise verbleibende Rückstand der
zu klärenden, invertasehaltigen Lösung wird nach der abgeschlossenen
Klärfiltration erneut dem Separator 6 zugeführt.
Die weiter zu verarbeitende Lösung wird in einen Zwischenbehälter
10 überführt. Die weitere Reinigung, Aufkonzentrierung
und Entkeimung der invertasehaltigen Lösung erfolgt
in einer speziellen, kombinierten Ultra-Mikrofiltrationslage
11.
Das auf einem Gestell befindliche Plattenpaket wird mit
5 m2 Filterfläche für die Ultrafiltration und 4 m2 für die
Mikrofiltration benutzt. Für die Ultrafiltrationstrenneinheit
12 werden UF-Membranen mit einer Durchlässigkeit von
80-140 l/h · m2 vom Typ CAM-UF-120-CP (VEB Zellstoff- und
Zellwollwerke Wittenberge) eingesetzt. Dieser Typ sichert
eine Selektivität bezogen auf Invertase von mehr als 99%.
Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität wird zusätzlich
zwischen Membran und Filterableitplatte ein Stützgewebe
aus Vliesmaterial angeordnet.
Die Mikrofiltrationseinheit 13 ist mit Kernspurmikrofilter
aus Polyester (ZfK AdW Rossendorf) mit einem Porendurchmesser
von 0,2 µm bespannt. Auch dieses Filtermaterial wird
zur Erhöhung der Stabilität mit Vliesmaterial gestützt.
Aus dem Zwischenbehälter 10 wird die invertasehaltige
Lösung mit Hilfe einer Dosierpumpe 14 durch einen Doppelrohrkühler
15 in die Ultrafiltrationseinheit 12 gepumpt.
Die Lösung wird nach dem Überströmungsprinzip über die
Filterplatten geführt, wobei Moleküle mit einem Molgewicht
größer als 150 000 zurückgehalten werden.
Die Permeatablaufgeschwindigkeit liegt dabei bei ca. 80-
140 l/h bei einem Ausgangsdruck von 0,1-0,3 MPa. Die
Invertaseaktivität im Permeat liegt dabei unter 0,5%.
Die nach der Klärfiltration erhaltene Lösung wird durch
die Ultrafiltration auf 1/10 des Volumens eingeengt. Das
nach der Ultrafiltration erhaltene Konzentrat wird anschließend
mit Wasser im Verhältnis 1 : 1 verdünnt und zum
Zweck einer weiteren Reinigung im Kreislauf über die
Ultrafiltrationstrenneinheit 12 diafiltriert, bis das
Ausgangsvolumen des Konzentrates wieder erreicht ist.
Durch die Blockierung des Ultrafiltrationskreislaufes wird
das im Zwischenbehälter 10 befindliche ultra- bzw. diafiltrierte
Konzentrat über eine Dosierpumpe 16 über den
Kühler 15 zur Mikrofiltrationseinheit 13 befördert.
Dort werden die im Konzentrat enthaltenen denaturierten
Proteine sowie Mikroorganismen, die die Produktqualität
beeinträchtigen, abgetrennt. Die vorgenannte aktive Filterfläche
wird auf einen Durchsatz von ca. 20 l/h eingestellt,
wobei der Eingangsdruck nicht größer als 0,3 MPa
sein soll.
Die gereinigte, aufkonzentrierte und entkeimte Invertaselösung
wird in einen Misch- und Temperierbehälter 17
eingebracht und dort mit Glycerol im Verhältnis 1 : 1 vermischt
und damit stabilisiert. Die Ausbeute der stabilisierten
Invertaselösung beträgt 90 kg (75% bezogen auf
eingesetzte aktive Backhefe).
Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen
1 Misch- und Temperierbehälter
2 Dosierpumpe
3 Spindelmühle
4 Misch- und Temperierbehälter
5 Dosierpumpe
6 Separator
7 Zwischenbehälter
8 Dosierpumpe
9 Schichtenfilter
10 Zwischenbehälter
11 Ultra-Mikrofiltrationsanlage
12 Ultrafiltrationstrenneinheit
13 Mikrofiltrationseinheit
14 Dosierpumpe
15 Doppelrohrkühler
16 Dosierpumpe
17 Misch- und Temperierbehälter
2 Dosierpumpe
3 Spindelmühle
4 Misch- und Temperierbehälter
5 Dosierpumpe
6 Separator
7 Zwischenbehälter
8 Dosierpumpe
9 Schichtenfilter
10 Zwischenbehälter
11 Ultra-Mikrofiltrationsanlage
12 Ultrafiltrationstrenneinheit
13 Mikrofiltrationseinheit
14 Dosierpumpe
15 Doppelrohrkühler
16 Dosierpumpe
17 Misch- und Temperierbehälter
Claims (1)
- Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Invertase aus aktiver Backhefe, indem aktive Backhefe mit einer Hefetrockensubstanz (HTS) von 30-33% mit Hilfe von Wasser auf eine HTS von ca. 10% suspendiert und auf eine Temperatur von 10-12°C eingestellt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefezellen dieser Suspension in einer an sich bekannten Spindelmühle 3 mit Hilfe von Mikroglaskugeln mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,2 mm und einer Rührwellendrehzahl von 2500-4000 U/min kontinuierlich aufgebrochen werden, danach in einem an sich bekannten Separator 6 eine invertasehaltige Lösung gewonnen wird, wobei vor der Entschlammung der Zulauf der Suspension gestoppt und der Rotor solange mit Wasser gespült wird, bis am Produktauslauf klares Wasser austritt, danach die Lösung einer an sich bekannten Klärfiltration mit Hilfe eines Schichtenfilters 9 unterzogen wird, wobei die Filterschichten eine Durchlässigkeit von 425-475 l/h · m2 aufweisen, die Klarseiten der Filterschichten zusätzlich mit Filterpapier unterlegt sind und vor Beginn der Klärfiltration diese Filterschichten ca. 20 min mit Wasser gewässert werden, wobei die Druckdifferenz zwischen Filterein- und -ausgang während der Filtration nicht größer als 200-250 kPa ist, der Schichtenfilter so geschaltet wird, daß neben dem Filtrationsprozeß eine Kreislauffahrweise möglich ist und der verbleibende Rest der zu klärenden Invertaselösung erneut der Separation unterzogen wird, danach die Lösung einer kombinierten Ultra- und Mikrofiltrationsanlage 11 derart zugeführt wird, daß zunächst die Lösung die Ultrafiltrationstrenneinheit 12 durchläuft, im Kreislauf einer Diafiltration unterzogen und danach über die Mikrofiltrationstrenneinheit 13 geführt wird, wobei die Durchlässigkeit der in der Ultrafiltrationstrenneinheit eingesetzten UF-Membranen 80-140 l/h · m2, der Eingangsdruck 0,15-0,4 und der Ausgangsdruck 0,1- 0,3 MPa beträgt, zwischen Membranen und Filterableitplatten Stützgewebe beispielsweise Vliesmaterial angeordnet ist, die Lösung zunächst durch die Ultrafiltrationstrenneinheit 12 auf ca. 1/10 eingeengt, danach das Konzentrat im Verhältnis 1 : 1 mit Wasser verdünnt und solange im Kreislauf diafiltriert wird, bis das Ausgangsvolumen an Konzentrat wieder erreicht ist, danach die gereinigte Invertasekonzentratlösung über die Mikrofiltrationstrenneinheit 13 geleitet wird, wobei der Porendurchmesser des eingesetzten Mikrofiltrationsmaterials 0,2 µm beträgt und der Eingangsdruck nicht größer als 0,3 MPa und das Filtermaterial wie bei der Ultrafiltrationstrenneinheit 12 mit einem Stützgewebe versehen ist und anschließend die Invertasekonzentratlösung in an sich bekannter Weise stabilisiert, standardisiert und konfektioniert wird.
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