CH648592A5 - Verfahren zur herstellung von glucose-isomerase und deren verwendung zur isomerisierung von glucose zu fructose. - Google Patents

Verfahren zur herstellung von glucose-isomerase und deren verwendung zur isomerisierung von glucose zu fructose. Download PDF

Info

Publication number
CH648592A5
CH648592A5 CH8782/80A CH878280A CH648592A5 CH 648592 A5 CH648592 A5 CH 648592A5 CH 8782/80 A CH8782/80 A CH 8782/80A CH 878280 A CH878280 A CH 878280A CH 648592 A5 CH648592 A5 CH 648592A5
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
glucose
mycelium
growth
gray
fructose
Prior art date
Application number
CH8782/80A
Other languages
English (en)
Inventor
Mitko Stojtschev Dr Med Popov
Galina Michajlovn Dschedscheva
Ivan Ognjanov Todorov
Nelly Stojtscheva Stoeva
Original Assignee
Inst Po Mikrobiologia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Po Mikrobiologia filed Critical Inst Po Mikrobiologia
Publication of CH648592A5 publication Critical patent/CH648592A5/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase unter Verwendung eines Streptomyces-Stammes und die Verwendung der erhaltenen Glucose-Isomerase zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose.
Es ist bekannt, dass das Enzym Glucose-Isomerase die Umwandlung der D-Glucose in D-Fructose verursacht, welche immer häufiger Anwendung in der Nahrungs- und Genussmittelindustrie und der diätischen Ernährung hochentwickelter Länder findet. In Kombination mit einem Komplex von den stärkeabbauenden Enzymen (ct-Amylase und Glucoamylase) ermöglicht die Glucose-Isomerase die Herstellung von Glucose-Fructose-Sirupen auf enzymatischem Wege direkt aus Stärke.
Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase sind seit 1957 bekannt, als zum ersten Mal die Möglichkeit für eine direkte Umwandlung der D-Glucose in D-Fructose durch Zellen des Bakerienstammes Pseudomonas hydrophyla Nrn. 491 und 492 gezeigt wurde. Am häufigsten werden bei der Herstellung von Glucose-Isomerase Microorganismen von der Gattung Streptomyces verwendet. Eine unbedingte Voraussetzung, die bis jetzt für die Biosynthese des Enzyms Glucose-Isomerase festgestellt wurde, ist das Vorhandensein unterschiedlicher Mineralsalze in den für die Kultivierung bestimmten Nährböden. Die in Literatur und Patenten beschriebenen Nährböden enthalten gewöhnlich Magnesiumsalze als MgS04-7H2Û und Kobalt als CoCh-óHiO (18). Die Konzentrationen, in denen diese Salze in den Nährboden für die Kultivierung eingebracht werden, hängen von dem Wesen des Microorganismus-Produzenten ab und variieren meist im Bereich von 0,02 bis 0,5% für MgS04-7H20 und von 0,005 bis 0,024% für CoCh-óH^O (14).
Bei einigen Streptomyces-Arten, die bereits Magnesiumionen zur Aktivierung enthalten, ist die Anwesenheit von Kobalt absolut notwendig, damit eine Glucose-Isomerase-Bil-dung stattfinden kann (13,16, 17).
Es werden Stämme und Mutanten-Produzenten von Glucose-Isomerase gesucht, welche die Fähigkeit besitzen, eine ausreichende Enzymausbeute bei Abwesenheit von Kobaltionen im Kulturnährmedium zu gewährleisten. Es sind dies Mutanten der CIC International Inc. (2) und als Artrobacter-Arten bekannt, von R.J. Reynolds Tobacco erforscht (9), die keine Anwesenheit von Kobalt für die Biosynthese der Glucose-Isomerase erfordern.
Durch Zugeben von Kobalt- und Magnesiumionen zu Glucoselösungen während der Isomerisierung wird die enzy-
matische Aktivität gleich stark beeinflusst. Es wurde bewiesen, dass diese Metalle Kofaktoren des Enzymes sind, und dass man die Glucose-Isomerase zu den Metall-Enzymen zugehörig betrachten kann (3). Es wurde festgestellt, dass in Glucose-Isomerase von Str. sp. YT Nr. 5 4,1 Kobaltatome und 33 Magnesiumatome in einem Enzymmolekül enthalten sind. Es wird angenommen (3), dass die Verbindung des Mg+ + und Co + + mit der Glucose-Isomerase für deren Umwandlung in die aktive Form notwendig ist. Ebenso wird angenommen, dass während dieses Verfahrens eine Veränderung in der Enzym-Konfiguration zustande kommt. Einige Autoren sind der Meinung, dass durch das Einbringen von Kobaltionen, insbesondere zusammen mit Magnesiumionen, die Thermostabilität der Glucose-Isomerase wesentlich erhöht wird (3, 10).
Die Anwesenheit von grösseren Mengen an Co + + in Fructose-Sirupen ist unerwünscht (5), trotz der Tatsache, dass Co+ + in Spurenmengen für die Ernährung des Menschen notwendig ist (2). Der Gehalt an Kobaltionen im Fructose-Sirup beträgt ungefähr 1 mM (1), doch wurde bewiesen, dass diese Konzentration bestimmte toxische Effekte bei Ratten hervorruft (6). Um die Kobaltionen aus den Glucose-Fructose-Sirupen nach Beendigung des Isomerisationsverfahrens zu entfernen, müssen dieselben unbedingt mit lonenaus-tauschharzen bis zu deren maximaler Abscheidung behandelt werden. Dieser zusätzliche Schritt erfordert die Bereitstellung von industriellen automatisierten Ionenaustauschsystemen. Die Firma Mi-Car International benutzt vollständig automatisierte Ionenaustauschsysteme mit zwei Abteilungen für Kationen-Anionen-Teile (stark saures Kationenaustauschharz Duolite C25-D und schwach alkalisches Anionharz Duolite S-56). Dieses lonenaustauschsystem erfordert eine periodische Regenerierung mit Säuren oder Basen und grosse Mengen an zusätzlichem reinen Wasser. Um das Gehalt an Kobaltionen in den mittels des Ionenaustauschsystems bearbeiteten Glucose-Fructose-Sirupen zu kontrollieren, wird eine Prüfung mit Hilfe eines automatischen Absorptionsspektralpho-tometers durchgeführt, indem man ununterbrochen Proben des Sirupstromes entnimmt, wodurch die Arbeit des Katio-nenaustauschsystems reguliert wird. Bei dieser Bearbeitung müssen die Kobaltionen bis zu einem Niveau von 5 ppb bei 25% S auf wirkungsvolle Weise beseitigt werden (8). Dieses Verfahren erschwert die Herstellung und hat einen negativen Einfluss auf die Wirksamkeit des Verfahrens und den Selbstkostenpreis.
Die Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Glucose-Isomerase unter Verwendung eines Stamm-Produzenten, wobei keine Kobaltionen für die Biosynthese des Enzyms und für die Isomerisierung der D-Glucose in D-Fructose erforderlich sind. Das Verfahren soll auch von wirtschaftlicher Bedeutung sein.
Der Stamm Streptomyces sp. Nr. 765 - Produzent der Glucose-Isomerase wurde aus bulgarischer Erde isoliert. Für dessen Entdeckung wurden 874 Streptomyces-Stämme gesiebt. Die Durchsiebung (Screening) wurde in einem modifizierten synthetischen Nährmedium Nr. 1 nach Krassilnikow durchgeführt, indem man zwei Substratniveaus unter Verwendung von Xylose und Xylan auswählte. Unter diesen Bedingungen wurden 18 Streptomyces-Stämme mit Möglichkeiten für die Entwicklung und Produktion des Enzyms Glucose-Isomerase entdeckt, von denen sich der Stamm Streptomyces sp. Nr. 765 als fähig erwies, das Enzym Glucose-Isomerase in Abwesenheit von Co+ + im Kulturnährmedium zu bilden.
Der Stamm ist im Staatlichen Institut für Kontrolle der Arzneimittel, Boul. Vladimir Zaimov 26, Sofia 1000, Bulgarien, am 29. September 1979 hinterlegt worden und erhielt die Nr. 143. Derselbe weist folgende morphologische und biochemische Eigenschaften auf :
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
648 592
Im Nährmedium Nr. 1 mit einer Stickstoffmineralquelle (nach G.F. Gause und Mitarbeitern) weisen die Kolonien gewöhnlich eine runde Form mit glatten Rändern auf, sie sind in der Mitte gewölbt, angeschwollen und bilden eine Vertiefung, die wie ein kleiner Krater aussieht, und sie sind ebenfalls radial stark gefaltet. Das Wachstum ist gut. Die Sporangien (Sporenbehälter) der jungen Kulturen sind ausgedehnt, monopodial angeordnet mit 3 bis 5 Ringen an den Spiralen, wobei diese bei älteren Kulturen in Form kleiner Besen (Rispen) zusammengedrängt sind.
Die Sporen sind länglich und weisen abgerundete Enden auf; bei einer Vergrösserung von mehr als 16 OOOmal werden härchenartige Bildungen auf der Oberfläche beobachtet. Bei einer kleinen Vergrösserung sehen die Sporen glatt aus; die Sporengrösse variiert zwischen 0,9-1,2 Mikron in der Länge und 0,4-0,6 Mikron in der Breite.
Die Farbe des Luft- und Substratmyzeliums wurde nach der A.S. Bondarzew-Farbskala und nach der Tresner- und Backus-Skala bestimmt. Bei den unterschiedlichen Nährböden in Anhängigkeit von den Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verändert sich die Farbe des Luftmyzeliums von Weiss (d1), Hellgrau bis Violett (a5 —d3). Im Nährmedium Nr. 1 mit einer Stickstoff-Mineralquelle (nach G.F. Gause und Mitarbeitern) ist die Farbe des Luftmyzeliums hellgrau bis mausgrau (a5 — d3), und in einem Nährmedium mit einer organischen Stickstoffquelle (nach G.F. Gause und Mitarbeitern) ist die Farbe dunkelgrau bis grauviolett (a2 — a3).
In Nährmedien mit unterschiedlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen ist das Luftmyzelium graugrün gefärbt.
Das Substratmyzelium im Nährmedium 1 mit einer Stickstoffmineralquelle (nach G.F. Gause und Mitarbeitern) weist eine Farbe von H eil-taubengrau bis Ultramarin auf (l6 —V1). Im Nährmedium 2 mit einer organischen Stickstoffquelle (nach G.F. Gause und Mitarbeitern) ist das Substratmyzelium ultramarinfarbig (V1), und bei anhaltender Kultivierung geht die Farbe in Schwarz (a1) über.
In Nährmedien mit unterschiedlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen ist das Substratmyzelium dunkelrot bis schwarz gefärbt.
In einem Fleisch-Pepton-Agar-Medium. Wachstum -schwach. Luftmyzelium - rosa, an den Rändern - ziegelrot. Substratmyzelium - ziegelrot.
In einem Kartoffel-Glucose-Agar-Nährmedium. Der Stamm wächst sehr gut. Luftmyzelium - grau-blau gefärbt. Substratmyzelium - blau bis dunkelblau gefärbt.
Im Tschapek-Nährmedium mit Saccharose. Wachstum -schwach. Luftmyzelium - rosa. Substratmyzelium - hell-zie-gelfarbig.
Im Tschapek-Nährmedium mit Glucose. Wachstum -massig. Luftmyzelium - hellblau. Substratmyzelium - farblos, mit einer Schattierung in der Farbe des Luftmyzeliums.
In einem Nährmedium mit Saccharose. Wachstum - gut. Luftmyzelium - himmelblaue Farbe. Substratmyzelium -dunkelblau bis schwarz gefärbt.
In einem Stärke-Agar-Nährmedium. Wachstum - gut. Luftmyzelium - grau. Substratmyzelium - blau.
In einem Stärke-Ammoniak-Nährmedium von Mischu-stin. Wachstum - sehr gut. Luftmyzelium - grau. Substratmyzelium - weinrot bis dunkelweinrot.
In einem synthetischen Nährmedium nach N.A. Krassil-nikow. Wachstum - mässig. Luftmyzelium - hell-aschgrau. Substratmyzelium - rosa-lila.
In einem CPI nach N.A. Krassilnikow. Wachstum - gut. Luftmyzelium - grau-blau. Substratmyzelium - rot-braun. -Dieses Medium enthält in g/1: Glucose: 20,0; Kaliumnitrat: 1,0; K2HP04:0,5; Magnesiumsulfat: 0,5; Natriumchlorid: 0,5: Calciumcarbonat: 1,0 und Eisencarbonat: 0,001.
In einem CPII nach N.A. Krassilnikow. Wachstum -
schwach bis mässig. Luftmyzelium - blau. Substratmyzelium
- dunkelbeige. - Dieses Medium enthält in g/1: Glucose: 10,0; Natriumeitrat: 2,2; K2HPO4: 5,65; KH2PO4: 2,38; Ammoniumsulfat: 1,0; Magnesiumsulfat: 1,0; Zinksulfat: 0,015; Kupfersulfat: 0,064; Eisensulfat: 0,01 und MnCh: 0,0072.
In einem CPIII nach Krassilnikow. Wachstum - gut. Luftmyzelium - grau- bis ultramarinfarbig. Substratmyzelium -weinrot. - Dieses Medium enthält in g/1: Glucose: 10,0; Ammoniumphosphat: 2,0; Natriumchlorid: 2,0; K2HPO4: 1,0; MgS04-7Hi0: 0,5; Calciumchlorid: 0,2; FeS04-7 H2O: 0,02 und ZnS04-7H20:0,01.
In einem CPIV nach N.A. Krassilnikow. Wachstum -schwach. Luftmyzelium - hellgrau. Substratmyzelium - farblos, mit einer Schattierung der Farbe des Luftmyzeliums. -Dieses Medium enthält in g/1: Saccharose: 20,0; Kaliumnitrat: 0,1 ; Magnesiumsulfat: 0,05; HCl: 0,07; KH2PO4: 0,1 und Calciumnitrat: 0,25.
In einem CPV nach Krassilnikow. Wachstum - gut. Luftmyzelium - grau gefärbt. Substratmyzelium - dunkellilafarbig. - Dieses Medium enthält in g/1: Stärke: 20,0; Kaliumnitrat: 0,1 ; MgS04-7 H2O: 0,05; Natriumchlorid: 0,5; KH2PO4: 0,01 und K2HPO4: 1,0.
In einem synthetischen Nährboden nach Wachsmann. Wachstum - mässig. Luftmyzelium - grau bis mausgrau. Substratmyzelium - dunkelbeige bis rot-braun.
In einem Fleisch-Stärke-Agar-Medium. Wachstum -schwach. Luftmyzelium - weiss. Substratmyzelium - beige.
In Pepton-Agar. Wachstum - gut. Luftmyzelium - grau. Substratmyzelium - farblos, mit einer grauen Schattierung des Luftmyzeliums.
In Glucose-Asparagin-Agar. Wachstum - gut, bzw. sehr gut. Luftmyzelium - grau bis ultramarin. Substratmyzelium -blau-violett bis dunkelgrau.
In Glycerin-Asparagin-Agar. Wachstum - gut. Luftmyzelium - ultramarinfarbig. Substratmyzelium - dunkellila bis schwarz.
In einem Tyrosin-Nährboden. Wachstum - gut. Luftmyzelium - blaugrau bis ultramarin. Sustratmyzelium - rotbraun.
In einem Tyrosin-Kasein-Nitrat-Agar. Wachstum -schwach. Luftmyzelium - weiss. Substratmyzelium - beige (cremefarbig).
In einem Glucose-Tyrosin-Agar. Wachstum - mässig. Luftmyzelium - cremefarbig bis grau. Substratmyzelium -violett.
In einem Saccharose-Nitrat-Agar. Wachstum - gut. Luftmyzelium - grau bis ultrmarin. Sustratmyzelium - blau bis dunkelblau.
In einem Glycerin-Calcium-Malat-Agar. Wachstum - gut. Luftmyzelium von blau- bis ultramarinfarbig. Substratmyzelium - dunkellila.
In einem Pepton-Rinder-Agar. Wachstum - mässig. Luftmyzelium - grau. Substratmyzelium - farblos, mit einer grauen Schattierung des Luftmyzeliums.
In einem Hafer-Agar. Wachstum - mässig. Luftmyzelium
- grau. Substratmyzelium - weinrot.
In einem Tomaten-Agar. Wachstum - gut. Luftmyzelium -grau. Substratmyzelium - dunkelbeige, terrakottafarbig.
In einem Blei-Acetat-Agar. Wachstum - schwach. Luftmyzelium -braun. Substratmyzelium - farblos, mit einer Nuance in Grau des Luftmyzeliums.
In einem Eisen-Pepton-Agar. Wachstum - gut. Luftmyzelium - grau. Substratmyzelium - farblos, mit einer grauen Nuance des Luftmyzeliums.
In Hefe-Malz-Agar. Wachstum - mässig. Luftmyzelium -grau bis mausgrau. Substratmyzelium - dunkelcremefarbig.
Toleranz des Stammes gegenüber NaCl - derselbe weist
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
648 592
4
eine geringe Toleranz in bezug auf die Konzentration von Natriumchlorid im Nährmedium auf. Die maximale Konzentration beträgt 4%. Das Wachstum des Stammes bei dieser Konzentration ist schwach. Luftmyzelium - hellblau. Substratmyzelium - dunkelblau. Eine grössere NaCl-Konzentra-tion, die mehr als 2% beträgt, wirkt sich negativ auf die Sporenbildung aus.
Koagulierte entfettete Milch. Gelatine wird nicht verflüssigt. Wächst gut auf einem Saccharose-Nährmedium, Saccharose wird aber nicht invertiert. Wächst sehr gut in Stärke-Agar und hydrolysiert auch Stärke gut. Zellulose wird nicht zersetzt. Reduziert Nitrat zu Nitrit. Sondert Schwefelwasserstoff ab. Wächst auf Kartoffeln. Hämolyse - negativ, Tyrosinase -positiv; bildet Melanoide.
In einem Grundnährmedium von Pridham und Gottlieb wird ein gutes Wachstum mit folgenden Kohlenstoffquellen festgestellt; Glucose, Fructose, Lactose, Lävulose, Xylose, Mannose, Zellobiose, Galaktose, Mannit, Inosit, Arabiose, Dextrin, Ribose und Glycerin.
Adsorbiert Salizin schwach.
Wächst nicht in Nährböden mit Sorbit, Saccharose und Raffinose. Es werden auch Unterschiede in bezug auf die Pigmentierung des Luft- und Substratmyzeliums in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle beobachtet.
In einem modifizierten Grundnährboden von Pridham und Gottlieb wird ein gutes Wachstum des Stammes mit folgenden Stickstoffquellen festgestellt: NH-iCl; (NH.O2SO4; (NH.O2HPO4; NH4H2PO4 und Carbamid.
Ein mässiges Wachstum weist der Stamm in einen Nährmedium mit NH4NO3 und Na2HPC>4 auf; in einem Nährmedium mit NaNCh und NaNCh wächst der Stamm überhaupt nicht.
In Nährmedien mit folgenden Aminosäuren, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Valin und Asparagin, wird ein sehr gutes Wachstum des Stammes beobachtet. Der letztere weist ein mässiges Wachstum in Nährmedien mit Leucin, Zystin, Prolin, Hydroxyprolin, Phenylalanin und Tyrosin auf. Es werden Unterschiede in bezug auf die Pigmentierung des Luft- und Substratmyzeliums in Abhängigkeit von der Stickstoffquelle beobachtet.
Einige Merkmale von Streptomyces Stamm Nr. 765 sind denjenigen von Streptomyces coelicolor ähnlich, welcher zu der Gray-Serie nach Bergey's - 1974 (Actinomyces coelicolor von der Gruppe Coelicolor nach N.A. Krassilnikow - 1970) gehört. Der letztere unterscheidet sich in einigen kultur-mor-phologischen und physiologisch-biochemischen Eigenschaften, die in der Species-Charakteristik - Bergey's (1974) und N.A. Krassilnikow (1970) - beschrieben sind. Streptomyces coelicolor weist z.B. 1 bis 3 Ringe an den Spiralen auf, verflüssigt Gelatine nur langsam, peptonisiert entfettete Milch, Tyrosinase - negative. Folglich ist der Stamm Streptomyces sp. Nr. 765 mit dem ihm ähnlichen Streptomyces coelicolor (Actinomyces coelicolor) nicht identisch und er wird daher der Gray-Serie nach Bergey's (1974) und der Coelicolor-Gruppe nach N.A. Krassilnikow (1970) zugeschrieben.
Der Stamm-Produzent, z.B. in 50-ml-Fermentations-Nähr-medium in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben enthalten, wird während 36 bis 72 Stunden bei einer Temperatur von 24 bis 36 °C und einem Anfangs-pH-Wert zwischen 6,5 und 9,0, vorzugsweise auf einer Schüttelmaschine mit 180-320 U/min, kultiviert.
Die Isomerisierung der Glucose zu Fructose mit GlucoSe-Isomerase vom Stamm Streptomyces sp. Nr. 765 kann durch direkte Behandlung mit frischem Myzelium (ausgeschieden durch Zentrifugieren bei 12 000 U/min und dreimaligem Spülen mit 0,05 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0) oder mit getrocknetem Myzelium (lufttrockene oder aceton-trockene Zellen) durchgeführt werden; ebenfalls mit'einer enzymatischen Lösung, hergestellt durch Zersetzung mittels Ultraschall oder Autolyse des Zellenmaterials und Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren bei 15 000 U/min, mit einem Kulturzentrifugat, extrazellulare Isomerase enthaltend, oder sich auf einem festen Träger befindliche immobilisierte Zellen.
Die im Reaktionsgemisch gebildete Fructose wird nach dem Cystein-Carbasol-Verfahren (4) bestimmt, und die Stammaktivität wird in mg Fructose pro ml Kulturflüssigkeit oder in internationalen Glucose-Isomerase-Einheiten (GIU) ausgedrückt. Dabei ist eine GIU die Enzymmenge, welche bei 70 °C und einem pH-Wert 7,0, IM Glucoselösung in 0,05 M Phosphtpuffer und 2.10"2 M MgS04-7H2Ü in einer Minute 1 a mol Glucose in 1 u mol Fructose umwandelt.
Die Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens sind die folgenden:
Der Stamm Streptomyces sp. Nr. 765 produziert das Enzym Glucose-Isomerase in Abwesenheit von Kobaltionen im Fermentationsmedium. Das entstandene Enzym wandelt die D-Glucose in D-Fructose in Abwesenheit von Kobaltionen im Isomerisierungsgemisch um, wodurch das technologische Verfahren wesentlich vereinfacht wird; die Benutzung von Ionenaustauschsystemen zur Ausscheidung von Kobalt aus den Fructose enthaltenden Sirupen ist nicht mehr erforderlich. Verglichen mit bekannten Mikroorganismen und Mutanten, die sich zur Herstellung von Glucose-Isomerase eignen und wobei keine Kobaltionen im Kulturnährmedium und in dem Isomerisierungsgemisch vorhanden sein müssen (2a, b, c; 9a, b), übertrifft Streptomyces sp. 765 die bekannte Mikroorganismen in bezug auf seine Glucose-Isomerase-Aktivität, sein günstiges pH-Optimum (7,0), des weiteren in bezug auf das höhere Temperaturoptimum (80°) des Enzyms und eine wesentliche Thermostabilität zwischen 40 und 70 °C.
1. Xylose-Nährmedium Xylose 20 g Agar 20 g KNOj 1,0 g K2HPO4 0,5 g MgS04-7H20 0,5 g NaCl 0,5 g CaCOs 1,0 g FeSÜ4 0,001 g Wasser bis zu 1 Liter
2. Kartoffel-Glucose-Agar
Kartoffelauszug von 300 g gekochten Kartoffeln
Glucose 10,0g
Agar 20,0 g
Wasser bis zu 1 Liter.
Empfehlenswert ist es bei der Aufrechterhaltung des Stammes beide Nährmedien abwechselnd zu gebrauchen.
Beispiel 1
Zu einem gut aufgekeimten Material einer 10-15tägigen Kultur im Nährmedium 1 oder 2 (vorzugsweise 1) werden 6 ml Inokulations-Nährmedium der folgenden Zuammenset-zung gegeben: Xylose - 1%, Rinderextrakt - 2%,
MgSÛ4-7H20 -0,1 °/o, K2HPO4 - 0,3%.
Es wird ein Abspülen der Zellenmasse vorgenommen, wonach das Reagenzglas auf einem Schüttelapparat während 24 Stunden bei 30 °C und 240 U/min bewegt wird. Mit dieser auf diese Weise vorbereiteten Kultur wird ein Inokulationsmedium folgender Zusammensetzung beimpft: Xylose - l°o,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
Maisextrakt - 3,0% (bei Trockenmasse), MgSOWHsO - 0,1%, KaH P04 - 0,25%, Agar - 0,1 %.
Die Kultivierung wird in einem 50-ml-Fermentations-Nährmedium enthaltendem 500-ml-Erlenmeyerkolben während 60 Stunden bei einer Temperatur von 30 °C auf einer 5 Schüttelvorrichtung mit 240 U/min durchgeführt. Der Anfangs-pH-Wert der Kultivierung beträgt 8,5.
Bei der 60stündigen Kultivierung des Stammes Streptomyces sp. 765 erhält man 160 bis 240 g feuchte Biomasse pro 1 1 Kulturflüssigkeit. io
Beispiel 2
Die Isomerisierung der Glucose zu Fructose mittels Glucose-Isomerase vom Stamm Streptomyces sp. Nr. 765 wird bei einer Temperatur von 70 ° C, einem pH-Wert 7,0 in Anwe- is senheit von MgS04-7H20 bei einer Konzentration von 1.10—2 M und einer Substratkonzentration von 1 M durchgeführt. Die Aktivität des Stammes Streptomyces sp. Nr. 765 beträgt 75-130 mg Fructose pro ml Kulturflüssigkeit oder 7000-12 000 GIU pro 1 Kulturflüssigkeit. 20
Literatur
1. Cotter W.P., Lloyd N.E., Hinman
C.W. 1971. Patent 3 623 953, 25
USA.
2. a) CPC Internatinonal Inc. 1975.
Britisch Patent 1 411 763.
b) CPC International Inc. 1975.
British Patent 1 411 764. 30
c) CPC International Inc. 1975.
British Patent 1 411 765.
3. Danno G. Ibid. 1971,35,7,997.
4. Dishe Z., Borenfreund E. 1951. J.
Biol. Chem., 192, 583.
648 592
5. Jacobziner H., Raybin H.W.
1961. Arch. Pediat. 78, 200.
6. Levy H., Levinson V., Shade A.
1950. Arch. Biochem., 27, 34.
7. Marschall R.O., Kooi E.R. 1957.
Science, 125, Nr. 3249, 648.
8. Mi-Car International Inc.
Isomerized Syrup Process. 1975.
MFG Information.
9. a) RJ. Reynolds Tobacco Co.
1973. British Patent 1 328 970.
b) RJ. Reynolds Tobacco Co.
1974. British Patent 1 362 365.
10. Sargio S., Kare L. 1975. Appi.
Microbiol., 29, 6, 745.
11. Somers E. 1974. J. Food Sei., 39,
215.
12. Schraeder H.A., Nason A.P.,
Tipton I.H. 1967. J. Chronic Dis.,
20, 869.
13. Stradberg G.W., Smiley K.L.
1971. App. Microb., 21, 588.
14. Takasaki Y. Ibid. 1966,30,12,
1247.
15. Takasaki Y., Kosogu Z.,
Kanbayasi A. 1969. Agr. Biol.
Chem., 33, 11, 1527.
16. Takasaki Y., Kosogu Y. 1969.
Academic Press Inc. New York.
p. 561
17. Tsumura N., Hagi M., Sato T.
1967. Agr. Biol. Chem., 31,902.
18. Yamanaka K. 1961. Agr. Biol.
Chem., 25, 4, 272.
G

Claims (3)

648 592 PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase, dadurch gekennzeichnet, dass man den Enzyme produzierenden Stamm Streptomyces sp. Nr. 765 36 bis 72 Stunden lang in einem Nährmedium, das den Induktor Xylose enthält, bei einer Temperatur von 24 bis 36 °C und einem Anfangs-pH-Wert von 6,5 bis 9,0 kultiviert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium 1,0 bis 2,0% Xylose, 1,5 bis 4,0% Maisextrakt, bezogen auf die Trockenmasse und 0,25-1,0% Natri-umacetat enthält.
3. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 erhaltenen Glucose-Isomerase zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose, dadurch gekennzeichnet, dass man die Isomerisierung der Glucose zur Fructose bei einer Temperatur von 50 bis 90 °C und einem pH-Wert von 6,0 bis 9,0 in Anwesenheit von MgSC>4 • 7HîO mit einer Konzentration von 1.10 ~4 bis 1.10-2M und einer Substratkonzentration von 0,1 bis 3 M durchführt.
CH8782/80A 1979-11-29 1980-11-26 Verfahren zur herstellung von glucose-isomerase und deren verwendung zur isomerisierung von glucose zu fructose. CH648592A5 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG7945720A BG32192A1 (en) 1979-11-29 1979-11-29 Method for obtaining of glucoseisomerase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CH648592A5 true CH648592A5 (de) 1985-03-29

Family

ID=3906780

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CH8782/80A CH648592A5 (de) 1979-11-29 1980-11-26 Verfahren zur herstellung von glucose-isomerase und deren verwendung zur isomerisierung von glucose zu fructose.

Country Status (15)

Country Link
JP (1) JPS56131383A (de)
AT (1) AT378204B (de)
BE (1) BE886407A (de)
BG (1) BG32192A1 (de)
CA (1) CA1171010A (de)
CH (1) CH648592A5 (de)
DD (2) DD161153A3 (de)
DE (1) DE3044357A1 (de)
DK (1) DK151270C (de)
ES (1) ES497272A0 (de)
FR (1) FR2473549B1 (de)
GB (1) GB2063884B (de)
IT (1) IT1145317B (de)
NL (1) NL8006509A (de)
YU (1) YU297780A (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3224024C2 (de) * 1982-06-28 1986-09-11 Uop Inc., Des Plaines, Ill. Verfahren zur Immobilisierung von Glucoseisomerase und immobilisiertes Glucoseisomerase-System

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1103394A (en) * 1965-05-11 1968-02-14 Agency Ind Science Techn A method of manufacturing syrup containing fructose from glucose by the use of an enzymatic process
IL38715A (en) * 1971-04-22 1974-11-29 Miles Lab Production of glucose isomerase
BE788843A (fr) * 1971-09-17 1973-03-15 Cpc International Inc Production de preparations enzymatiques d'isomerase de xylose (dextrose)
US3957587A (en) * 1973-11-21 1976-05-18 Cpc International Inc. Production of xylose (dextrose) isomerase enzyme preparations

Also Published As

Publication number Publication date
GB2063884A (en) 1981-06-10
NL8006509A (nl) 1981-07-01
JPS56131383A (en) 1981-10-14
BE886407A (fr) 1981-03-16
ES8406088A1 (es) 1984-07-01
BG32192A1 (en) 1982-06-15
AT378204B (de) 1985-07-10
ATA573680A (de) 1984-11-15
ES497272A0 (es) 1984-07-01
FR2473549B1 (fr) 1985-07-05
DK503480A (da) 1981-05-30
IT8050273A0 (it) 1980-11-28
DD161153A3 (de) 1985-02-27
DE3044357A1 (de) 1981-07-02
CA1171010A (en) 1984-07-17
FR2473549A1 (fr) 1981-07-17
GB2063884B (en) 1983-04-20
IT1145317B (it) 1986-11-05
DD161124A3 (de) 1985-01-09
DK151270C (da) 1988-05-16
DK151270B (da) 1987-11-16
YU297780A (en) 1983-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2161164B2 (de) Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen und Verwendung des proteinhaltigen Produkts
DE3018767A1 (de) Verfahren zur herstellung von isopenicillin n unter verwendung eines zellfreien pilzkultur-extraktes
DE2614114B2 (de) Verfahren zur Herstellung von Kreatininamidohydrolase
US4226941A (en) Process for the optical resolution of d,l-2-amino-4-methylphosphinobutyric acid
DE3307607C2 (de)
DE3884295T2 (de) Säure-Urease und ihre Herstellung.
DE2313546A1 (de) Mikrobielle protease und verfahren zu ihrer herstellung
GB2031896A (en) A process for the optical resolution of D,L-2-amino-4- methylphosphinobutyric acid
DE3600563C2 (de)
DE3027380A1 (de) Herstellung eines cephalosporins durch fermentierung
DE3714544A1 (de) Glucosedehydrogenase und verfahren zu deren herstellung
DE2502706A1 (de) Verfahren zur herstellung von 7-amino-cephem-verbindungen
DE3024915C2 (de)
DE2637671C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Kreatinin-Desimidase auf mikrobiologischem Wege
EP0145798B1 (de) Bacillus subtilis DSM 2704 und Verfahren zur Herstellung von Alpha-Amylase
CH648592A5 (de) Verfahren zur herstellung von glucose-isomerase und deren verwendung zur isomerisierung von glucose zu fructose.
DE4032287C2 (de)
DE3123808C2 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Typtophan oder einem seiner Derivate
DE2164018A1 (de) Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Uricase
DE2107461A1 (de) Verfahren zum Herstellen von alkali schem Dextranase Enzym
DE2241091C3 (de)
DE3018584A1 (de) Verfahren zur herstellung von d- alpha -aminosaeuren
DE3728321A1 (de) Verfahren zur herstellung von carnitin, l-carnitinamid-hydrolase und verfahren zu ihrer gewinnung
KR0136299B1 (ko) 미생물세포벽 용해효소와 그의 생산 미생물
US4348481A (en) Method of obtaining glucose isomerase

Legal Events

Date Code Title Description
PL Patent ceased
PL Patent ceased