NL8006509A - Werkwijze voor het verkrijgen van glucoseisomerase. - Google Patents

Description

N/30.025-Kp/Pf/cs

Werkwijze voor het verkrijgen van glucoseisomerase.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van glucoseisomerase uit een streptomycesstam.

De omzetting van D-glucose in D-fructose met behulp van het enzym glucoseisomerase is bekend, en vindt in 5 een aantal ontwikkelde landen een steeds grotere toepassing in de voedselverwerkingsindustrie en diëetvoedsel. Glucoseisomerase biedt in combinatie met een groep amylolytische enzymen (cx-amylase en glucoamylase) , de gelegenheid tot het rechtstreeks uit zetmeel verkrijgen van glucose-fructose-10 siropen en fructose met behulp van enzymen. Sommige werkwijzen voor het verkrijgen van glucoseisomerase zijn reeds bekend sinds 1957, toen voor de eerste keer de mogelijkheid van de rechtstreekse omzetting van D-glucose in D-fructose door cellen van de bacteriestammen Pseudomonos hydrophila 491 en 15 492 werd aangetoond. Mieroorganismen van het geslacht Strep- tomyces worden het meest algemeen toegepast voor het verkrijgen van glucoseisomerase. Daarbij werd gevonden dat de aanwezigheid van verschillende minerale zouten in het kweekmedium een noodzakelijke voorwaarde voor de biosynthese van het enzym 20 glucoseisomerase is. In de in de literatuur en octrooischrif-ten beschreven cultuurmedia zijn magnesium in de vorm van MgS0^.7H20 en kobalt in de vorm van CoC12-6H20 aanwezig (18). De concentraties, waarin deze zouten aan het kweekmedium worden toegevoegd, hangen af van de soort producerend micro-25 organisme en variëren meestal van 0,02 tot 0,5% voor

MgS0^.7H20 en van 0,005 tot 0,024% voor CoC12.6H20 (14). Bij sommige streptomycessoorten is kobalt absoluut vereist voor de vorming van glucoseisomerase, hoewel de activering wordt toegeschreven aan de magnesium!onen (13, 16, 17).

30 Het is wenselijk dat glucoseisomerase producerende stammen en mutanten worden ontdekt, die in staat zijn in afwezigheid van kobaltionen in het kweekmedium een voldoende hoeveelheid enzym te produceren. Bekend zijn de mutanten van CPC International Ine. (2), alsook enige Artrobactersoorten 35 bestudeerd door R.J. Reynolds Tobacco (9), die niet de aanwezigheid van kobalt vereisen voor de biosynthese van glucoseisomerase.

8 00 6 50 9 - 2 -

De toevoeging van kobalt- en magnesiumionen aan de oplossing van glucose gedurende de isomerisatie beïnvloedt ook in sterke mate de enzymactiviteit. Bewezen werd dat deze metalen cofactoren van het enzym zijn, om welke reden glucose-5 isomerase een metaalenzym kan worden genoemd (3). Daarbij werd gevonden dat ëën molecuul glucoseisomerase afkomstig van

Streptomyces YT5 4,1 kobaltatomen en 33 magnesiumatomen bevat.

2+ 2+

Aangenomen wordt dat de combinatie van Mg en Co met glucoseisomerase noodzakelijk is voor de omzetting van het 10 enzym in zijn actieve vorm. Gedurende dit proces zou een verandering in de conformatie van het enzym plaatsvinden. Sommige auteurs veronderstellen dat de toevoeging van kobalt-ionen, in het bijzonder tesamen met magnesiumionen, de ther-mostabiliteit van glucoseisomerase aanzienlijk verhoogt. (3, 15 10).

2+

Alhoewel sporen Co noodzakelijk zijn voor de voeding van de mens (12) , is de aanwezigheid van grotere hoe-2+ veelheden Co in fructosesiropen ongewenst (5). Het gehalte aan Co ionen in de fructosesiroop is circa 1 mM (1). Bewezen 20 is echter dat deze concentratie enige toxische effecten op ratten heeft. Voor de maximale scheiding van de kobaltionen van de van glucoseisomerase afkomstige siropen na afloop van het isomerisatieproces, is het noodzakelijk dat de stammen in de aanwezigheid van ionenwisselende harsen worden gekweekt.

25 Zo moeten in de industrie automatische ionenwisselingssyste-men voor dit bijkomende proces worden ingebouwd. Mi-Car International Company maakt gebruik van volledig geautomatiseerde ionenwisselingssytemen bestaande uit kationen- en anionenwis-selaars, de sterk zure kationenwisselende hars Duolite C25-D 30 en de zwak basische anionenwisselende hars Duolite S-56. Dit ionenwisselingssysteem heeft periodieke regeneratie met zuren of basen en daarbij nog grote hoeveelheden zuiver water, nodig.

Het gehalte aan kobaltionen in de glucose-fructose-35 siropen die in het ionenwisselingssysteem zijn verwerkt, wordt aan de hand van voortdurend uit de productstroom getrokken monsters met behulp van een automatische absorptiespectro- fotometer gecontroleerd. Op deze manier wordt de werking van ci© 2 j het kationenwisselingssysteem geregeld. Hierbij moetenTCo^ -40 ionen zo effectief verwijderd worden, dat de uiteindelijke 8 00 6 50 9

€ I

- 3 - concentratie niet hoger is dan 0,005 d.p.m. in 25% oplossingen van de siropen (8). Deze werkwijze maakt de productie ingewikkeld en beïnvloedt de doelmatigheid van de productie en de basiskosten van het product.

5 De uitvinding heeft tot doel te voorzien in een werkwijze van industrieel belang voor het verkrijgen van glu-coseisomerase uit een producerende bacteriestam, waarbij kobaltionen voor de biosynthese van het enzym en voor de iso-merisatie van D-glucose in D-fructose niet noodzakelijk zijn.

10 De stam Streptomyces 765, producent van glucoseiso- merase, werd geïsoleerd uit Bulgaarse aarde. Daartoe werden 874 streptomycesstammen nauwkeurig onderzocht. Dit onderzoek werd uitgevoerd op het gemodificeerde synthetische cultuur-medium nr. 1 naar Krassilnikov, waarbij met gebruik van xylose 15 en xylaan de selectie bij twee substraatniveaus werd verwezenlijkt. Onder deze omstandigheden werden 18 streptomycesstam-men, die het enzym glucoseisomerase konden ontwikkelen en produceren, ontdekt. Daarbij was de stam Streptomyces 765 die 2+ het enzym glucoseisomerase in afwezigheid van Co in het 20 kweekmedium kon produceren. De stam werd op 29 september 1979 onder nummer 143 in bewaring gegeven bij het Staatsinstituut voor Geneesmiddelencontrole te Bulgarije, en had de volgende morfologische en biochemische eigenschappen:

Op cultuurmedium 1 met een minerale stikstofbron 25 (naar G.F. Gause en medewerkers) waren de kolonies gewoonlijk ovaalvormig met vormloze randen, in het midden bolrond gezwollen met een kraterachtige holte met geprononceerde radiale vouwen.De groei van de kolonie was goed. De sporangiën waren in jonge culturen langgerekt en monopodisch geplaatst 30 en hadden 3-5 windingen, en waren in oudere culturen gecondenseerd tot sorghum. De sporen waren langgerekt met afgeronde uiteinden; bij een vergroting van meer dan 16.000 maal konden op het oppervlak enige haarachtige formaties worden waargenomen. Bij een zwakkere vergroting leken de sporen glad. Hun 35 afmetingen varieerden tussen 0,9-1,2 pm in de lengte en 0,4-0,6 pm in de breedte.

De kleur van het lucht- en het substraatmycelium werd bepaald volgens de kleurenschaal van A.C. Bondartsev en de schaal van Tresner en Backus. Afhankelijk van de koolstof-40 en stikstofbronnen veranderde op de verschillende cultuur- ο no β Rn o --4 - media de kleur van het luchtmycelium van wit (d1) naar licht- 5 3 grijs tot violet (a -d ). Op het cultuurmedium 1 met een minerale stikstofbron (naar G.F. Gause en medewerkers) was de 5 3 kleur lichtgrijs tot muisgrijs (a -a ) en op een cultuurmedium 5 met een organische stikstofbron (naar G.F. Gause en medewer- 2 3 kers) was de kleur donkergrijs tot grijsviolet (a -a ). Op cultuurmedia met andere koolstof- en stikstofbronnen was het luchtmycelium grijsachtig groen.

Op het cultuurmedium 1 met een minerale stikstofbron 10 (naar G.F. Gause en medewerkers) was het substraatmycelium duifkleurig tot ultramarijn (i6-v1). Op het cultuurmedium 2 met een organische stikstofbron (naar G.F. Gause en medewerkers) is de kleur ultramarijn (v1), maar wordt na langdurige kweek zwart (a1). Op cultuurmedia met andere koolstof- en 15 stikstofbronnen is de kleur van het substraatmycelium van donkerrood tot zwart.

De groei en de kleuren van het lucht- en substraatmycelium op enige substraten worden vermeld in Tabel I.

20 Tabel I

Cultuurmedium Groei Kleur van het Kleur van het luchtmycelium substraatmyce-_lium _ vlees-pepton-agar gering rose, steen- steenrood rood langs de rand aardappel-glucose- zeer goed grijsblauw blauw tot don-agar kerblauw

Tchapek met sucrose gering rose lichtsteenrood

Tchapek met glucose matig lichtblauw kleurloos met een gloed van het luchtmycelium sucrose goed hemelsblauw donkerblauw tot zwart zetmeel-agar goed grijs blauw zetmeel-ammonia naar zeer goed grijs wijnrood tot

Mishustin donkerwijnrood synthetisch medium matig lichtasgrauw roseviolet naar N.A. Krassil- nikov CPI naar N.A. Kras- goed grijsblauw roodbruin silnikov 8 00 6 50 9 - 5 -

Tabel I (vervolg)

Cultuurmedium Groei Kleur van het Kleur van het luchtmycelium substraatmyce-_ lium_ CPU naar N.A. Kras- gering blauw donkercrème silnikov tot matig CPIII naar N.A. Kras- goed grijs tot wijnrood silnikov ultramarijn CPIV naar N.A. Kras- gering lichtgrijs kleurloos met silnikov een gloed van het luchtmycelium CPV naar N.A. Kras- goed grijs donkerviolet silnikov synthetisch medium matig grijs tot donkergrême tot naar Vaxman muisgrijs roodbruin vlees-zetmeel-agar gering wit crème pepton-agar goed grijs kleurloos met een grijze gloed van het luchtmycelium glucose-asparagine- zeer goed grijs tot blauwviolet tot agar ultramarijn donkerblauw glycerine-asparagine- goed ultramarijn donkerviolet agar tot zwart tyrosine goed blauwgrijs, roodbruin ultramarijn tyrosine-caseïne- gering wit crème nitraat-agar glucose-tyrosine- matig crèmegrijs violet agar saccharose-nitraat- goed grijs tot blauw tot don- agar ultramarijn kerblauw glycerol-calcium- goed blauw tot maleaat-agar ultramarijn pepton-rundvlees- matig grijs kleurloos met agar tot goed een grijze gloed van het luchtmycelium havermout-agar matig grijs wijnrood tomaat-agar goed grijs donkerbeige, terracotta loodacetaat-agar gering bruin kleurloos met een gloed van het luchtmycelium enn fi «in o - 6 -

Tabel I (vervolg)

Cultuurmedium Groei Kleur van het Kleur van het luchtmycelium substraatmyce-_lium_ ijzer-pepton-agar goed grijs kleurloos met een grijze gloed van het luchtmycelium gist-mout-agar matig grijs, muis- donkercrème grijs

De stam vertoonde geringe tolerantie tegenover toenemende concentraties van natriumchloride in het medium. De maximale concentratie was 4%, waarbij de groei van de stam gering was, de kleur van het luchtmycelium lichtblauw en van het substraatmycelium donkerblauw was. Een hogere concentratie dan 2% NaCl had een negatieve invloed op de mate van sporevorming.

De stam coaguleerde vetloze melk, maar condenseerde gelatine niet. De stam groeide goed op een sucrosemedium, maar inverteerde sucrose niet. De stam groeide zeer goed op een zetmeel-agar en hydrolyseerde zetmeel tevens goed. De stam ontleedde cellulose niet, maar reduceerde nitraten tot nitrieten. De stam maaktewaterstofsulfide vrij. De stam groeide op aardappels. Hemolyse was negatief, tyrosinase was positief. De stam vormde melanoïden.

Op een uitgangscultuurmedium van Pridham en Gottlieb bleek de groei goed in de aanwezigheid van de volgende koolstofbronnen: glucose, fructose, lactose, levulose, xylose, mannose, cellulose, galactose, mannitol, inositol, arabinose, dextrine, ribose en glycerol. De stam absorbeerde op kleine schaal salicin, maar groeide niet op een cultuurmedium met sorbitol, sucrose en raffinose. Afhankelijk van de koolstof-bron werden enige verschillen in de pigmentatie van het luchten het substraatmycelium waargenomen.

De groei van de stam was goed op een gemodificeerd uitgangscultuurmedium van Pridham en Gottlieb met de volgende stikstof bronnen: NH^Cl, (NH^ )2^4/ (NH^^HPO^, (NH4)H2P04 en carbamide. De groei was matig op een cultuurmedium met NH^NOg en Na2HP04· De stam groeide in het geheel niet op een cultuurmedium met NaNO^ en NaN02· Een zeer goede groei van de stam werd waargenomen op cultuurmedia met de volgende amino- * 800 6 50 9 v c- - 7 - zuren: glutaminezuur, asparaginezuur, alanine, valine en asparagine. De groei was matig op een cultuurmedium met leucine, cystine, proline, hydroxyproline, fenylalanine en tyrosine. Afhankelijk van de stikstofbron werden enige verschillen in 5 de pigmentatie van het lucht- en het substraatmycelium waargenomen .

In sommige eigenschappen lijkt de stam Strepto-myces 765 op Streptomyces coelicolor uit de Gray-serie naar Bergey's, 1974 (Actinomyces coelicolor van de Coelicolorgroep 10 naar N.A. Krassilnikov, 1970). Deze onderscheidt zich echter in enige morfologisch-cultuurlijke en fysiologisch-bioche-mische eigenschappen, zoals blijkt uit de soortbeschrijving door Bergey's (1974) en N.A. Krassilnikov (1970). Streptomyces coelicolor heeft bijvoorbeeld spiralen met 1 tot 3 win-15 dingen, condenseert langzaam gelatine en peptoniseert vetloze melk. Zijn tyrosinase is negatief. Hieruit blijkt, dat de Streptomycesstam nr. 765 niet identiek is met de gelijkenis vertonende Streptomyces coelicolor (Actinomyces coelicolor) en wordt daarom hier aangeduid als Streptomyces 765 uit de 20 Gray-serie naar Bergey's (1974) en de Coelicolor-groep naar N.A. Krassilnikov (1970).

De producentstam werd in erlenmeyerkolven van 500 ml bevattende 50 ml gistingscultuurmediura gedurende 36 tot 96 h bij een temperatuur van 24 tot 36°C in een schudapparaat met 25 180-320 t.p.m. gekweekt, terwijl de pH bij het begin van de kweek tussen-6,5 en 9,0 was.

De isomerisatie van glucose tot fructose door middel van glucoseisomerase uit de stam Streptomyces 765 kan worden uitgevoerd door een directe behandeling met vers mycelium 30 (afgescheiden door een centrifugebehandeling bij 12.000 t.p.m. en driemaal gewassen met een 0,05 M fosfaatbuffer met pH 7,0), met gedroogd mycelium (lucht- of acetongedroogde cellen)., met een oplossing van het enzym (verkregen door supersonische desintegratie of autolyse van celmateriaal gevolgd door af-35 scheiding van de bovenstaande vloeistof door een centrifugebehandeling bij 15.000 t.p.m.), of met een cultuurlijk centri-fugaat bevattende extracellulair isomerase of immobiel gemaakte cellen op een harde drager.

De in het reactiemengsel gevormde fructose werd be-40 paald volgens de cysteïne-carbasolmethode (4), waarbij de ac- ft π fl Rn o - 8 - tiviteit van de stam wordt uitgedrukt in mg fructose per ml cultuurvloeistof of in internationale glucoseisomerase eenheden (GIU). Een GIü is gelijk aan de hoeveelheid enzym, die bij 70°C en een pH van 7,0 in een 1 M oplossing van glucose 5 in een 0,05 M fosfaatbuffer bevattende 2.10-^ M MgS04.7H20 in één minuut 1 pmol glucose in 1 jumol fructose omzet.

De werkwijze volgens de uitvinding heeft de volgende voordelen: De stam Streptomyces 765 produceert in afwezigheid van kobaltionen in het gistingsmedium het enzym glucose-10 isomerase. Het verkregen enzym zet in afwezigheid van kobaltionen in het isomerisatiemengsel D-glucose in D-fructose om, waardoor het technologisch proces aanzienlijk vereenvoudigd wordt en het gebruik van ionenwisselingssystemen voor de afscheiding van kobalt uit de fructose bevattende siropen niet 15 noodzakelijk is. Vergeleken met de uit de octrooiliteratuur bekende stammen, microörganismen en mutant-producenten van glucoseisomerase, die niet de aanwezigheid van kobaltionen in het kweekmedium en in de isomerisatiemengsels vereisen, (2a, b, c; 9a, b), overtreft Streptomyces 765 deze in glucose-20 isomeraseactiviteit, door een gunstig pH-optimum (7,0) en een hogere optimale temperatuur (80°C) van het enzym, en door een aanzienlijkge thermostabiliteit tussen 40 en 70°C.

De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden: 25

Voorbeeld I.

De producentstam werd bewaard in reageerbuizen met aflopend agar op cultuurmedia met de volgende samenstelling: 1. Xylose-cultuurmedium: 30 xylose 20 g agar 20 g KN03 1,0 g K2HP04 0,5 g

MgS04.7H20 0,5 g 35 NaCl 0,5 g

CaC03 1,0 g

FeS04 0,001 g water tot aan 1 1 800 6 50 9 - 9 - 2. Aardappel-glucose-agar: aardappelextract van 300 g gekookte aardappels glucose 10 g agar 20 g 5 water tot aan 1 1

Bij voorkeur werd de stam afwisselend bewaard op beide cul-tuurmedia.

Aan goed gerijpt materiaal van een 10-15 dagen oude cultuur op cultuurmedium 1 of 2, bij voorkeur cultuurmedium 1/ 10 werd 6 ml entcultuurmedium met de volgende samenstelling toe gevoegd: xylose 1% rundvleesextract 2%

MgS04.7H20 0,1% 15 K2HP04 0,3%

De celmassa werd uitgewassen, waarna de reageerbuis gedurende 24 h bij 30°C in een schudapparaat bij 240 t.p.m. werd geplaatst. Van een aldus behandelde cultuur werd een weinig verspreid over een entmedium met de volgende samenstelling: 20 xylose 1% maisextract 3% (droog gewicht)

MgS04.7H20 k2hpo4 agar 25 Na een kweek van 60 h onder bovengenoemde omstandigheden werd 5% van de entstof toegevoegd aan een gistingscultuurmedium met de volgende samenstelling: xylose 1% maïsextract 3,0% (droog gewicht) 30 natriumacetaat 0,5%

De kweek werd in erlenmeyerkolven van 500 ml bevat tende 50 ml gistingscultuurmedium gedurende 60 h bij 30°C uitgevoerd in een schudapparaat bij 240 t.p.m. De pH bij het begin van de kweek was 8,5.

35 Na een kweek van Streptomyces 765 gedurende 60 h werd 160-240 g vochtige biomassa per 1 cultuurvloeistof verkregen .

Voorbeeld II.

40 De isomerisatie van glucose tot fructose met behulp 800 6 50 9 - 10 - van glucoseisomerase uit de stam Streptomyces 765 werd bij een temperatuur van 70°C, een pH van 7,0 in de aanwezigheid _2 van MgS04.7H20 met een concentratie van 2.10 M, terwijl de concentratie van het substraat 1 M was, uitgevoerd.

5 De activiteit van de stam Streptomyces 765 was 75-130 mg fructose per ml cultuurvloeistof of 7.000-12.000 GIü per 1 cultuurvloeistof.

REFERENTIES: 10 1. Amerikaans octrooischrift 3.623.953.

2. a/ Brits octrooischrift 1.411.763. b/ Brits octrooischrift 1.411.764. c/ Brits octrooischrift 1.411.765.

3. Agr. Biol. Chem., 35, 7, 997, (1971).

15 4. J. Biol. Chem., 192, 583, (1951).

5. Arch. Pediat. 78, 200, (1961).

6. Arch. Biochem., 27, 34, (1950).

7. Science, 125, 3249, 648, (1957).

8. Mi-Car International Inc. Isomerized Syrup process, 1975, 20 MFG Information.

9. a/ Brits octrooischrift 1.328.970.

b/ Brits octrooischrift 1.362.365.

10. Appl. Microbiol., 29, 6, 745, (1975).

11. J. Food Sci., 39, 215, (1974).

25 12. J. Chronic. Dis., 20, 869,(1967).

13. Appl. Microb., 21, 588, (1971).

14. Agr-, Biol. Chem. , 30, 12, 1247, (1966).

15. Agr. Biol. Chem., 33, 11, 1527, (1969).

16. Takasaki Y., Kosogu Y. 1969. Academie Press Inc. N.Y.

30 p. 561.

17. Agr. Biol. Chem., 31, 902, (1967).

18. Agr. Biol. Chem., 25, 4, 272, (1961).

8 00 6 50 9

Claims (2)

1. Werkwijze voor het verkrijgen van glucoseisomerase, met het kenmerk, dat de enzymproducerende stam Streptomyces 765 met het registratienummer 143 van het Staatsinstituut voor Geneesmiddelencontrole gedurende 36-72 h in een 5 cultuurmedium met xylose als een inductor wordt gekweekt, terwijl de temperatuur tussen 24 ei> 36°C wordt gehouden en de pH bij het begin van de kweek tussen 6,5 en 9,0 bedraagt; de iso-merisatietemperatuur tussen 50 en 90°C is en de pH tussen 6,0 en 9,0 is in de aanwezigheid van MgSO^^^O in concentraties 10 van 1,10 ^ tot 1.10 ^ M en bij een concentratie van het substraat van 0,1 tot 3 M.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gebruikte cultuurmedium de volgende samenstelling heeft: 15 xylose 1,0 - 2,0% maïsextract 1,5 - 4,0% (droog gewicht) natriumacetaat 0,25- 1,0%. 800 6 50 9