NL8006510A - Werkwijze voor het verkrijgen van glucoseisomerase, - Google Patents

Description

N/30.022-Kp/Pf/cs

Werkwijze voor het verkrijgen van glucoseisomerase.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van glucoseisomerase uit een strepto-mycesstam.

Het is bekend, dat door middel van het enzym glu-5 coseisomerase D-glucose wordt omgezet in D-fructose, dat in een aantal ontwikkelde landen een steeds grotere toepassing vindt in de voedselverwerkingsindustrie en dieetvoeding. Glucoseisomerase, in combinatie met een groep araylolitische enzymen (C*-amylase en glucoamylase) , biedt de mogelijkheid om 10 met gebruik van enzymen glucose-fructosesiropen en fructose rechtstreeks uit zetmeel te verkrijgen.

Enkele werkwijzen voor het verkrijgen van glucoseisomerase zijn reeds bekend sinds 1957 toen Marshall en Kooi (29) de mogelijkheid van directe omzetting van D-glucose in 15 D-fructose door middel van cellen van de bacteriestammen Pseudomonas hydrophila 491 en 492 voor de eerste keer aantoonden. Voor het verkrijgen van glucoseisomerase worden microorganis-men van het geslacht streptomyces, in het bijzonder de soorten Str.phaeochromogenes (34, 38), Str. venezuelae (1, 24), 20 Str. griseus (23), Str. wedmorensis (3), Str. albus (35),

Str.- flavovirens, Str. achromogenes, Str. achinatus (36),

Str. olivocinereus (20, 24, 26), Str. achromogenes, Str. oli-vaceus (17, 18) het meest algemeen toegepast. Naast het geslacht streptomyces bestaan andere actieve producenten, als 25 proactinomyces en actinomyces, die tot de geslachten Nocardia, Micromonospora (21, 22), Actinoplanes (30, 31), Thermoactino-myces, Thermopolyspora (37) behoren en ook enkele bacteriestammen van de geslachten Aerobacter (20), Acetobacter (28), Lactobacillus (25), Bacillus (33), Arthrobacter (27), Flavo-30 bacterium (4) en andere.

De bekende werkwijzen voor het verkrijgen van gluco-isomerase hebben een aantal nadelen, die hoofdzakelijk verband houden met het feit, dat de producerende stammen zelden een hoge glucoseisomerase-activiteit vertonen bij een voor het 35 enzym gunstige temperatuur en optimale pH. Bij een temperatuur van het isomerisatieproces lager dan 60-65°C bestaat het gevaar van verontreiniging van de kolonie met microben. Ver- 8006510 - 2 - hoging van de temperatuur tot 90°C vermindert echter de stabiliteit van het enzym, en veroorzaakt kleuring van de siroop en veranderingen van de viscositeit. Voor industriële toepassing is de ungstigste pH tussen 6,5 en 7,0, aangezien bij een 5 pH hoger dan 7,0 een basische isomerisatie van glucose onder vorming van D-psicose en kleuring van de siroop plaatsvindt, en een lager pH (beneden 5,5) de ireeversibele denaturatie van het enzym veroorzaakt.

De uitvinding heeft tot doel een werkwijze te ver-10 schaffen voor het verkrijgen van glucoseisomerase uit een streptomycesstam die een hoge activiteit heeft bij een voor het enzym optimale temperatuur en gunstige pH.

Een stam van Streptomyces 1339, producent van glucoseisomerase, werd geïsoleerd uit Bulgaarse aarde. Voor de 15 ontdekking hiervan werden 874 streptomycesstammen onderzocht. Het onderzoek werd uitgevoerd met behulp van het gemodificeerde synthetische cultuurmedium nr. 1 volgens Krassilnikov, waarbij de selectie bij twee substraatniveaus met gebruik van xylose en xylaan werd verwezenlijkt. Op deze manier werden 18 20 streptomycesstammen ontdekt, die het enzym glucoseisomerase kunnen ontwikkelen en produceren. Van deze stammen bleek Streptomyces 1339 de meeste perspectieven te bieden voor industriële doeleinden. De stam bevond zich onder nummer 144 in de verzameling van het Staatsinstituut voor Geneesmiddelen-25 controle te Bulgarije sinds 29 september 1979 en had de volgende morfologische en biochemische eigenschappen.

Op cultuurmedium 1 met een minerale stikstofbron (naar G.F. Gause en medewerkers) waren de kolonies gewoonlijk ovaalvormig met vormloze randen, plat met een bolrond centrum 30 als een koepel, en een beetje gevouwen. De sporangiën waren spiraalvormig met niet meer dan 1-3 windingen. Op sommige cultuurmedia werden coremia gevormd. De groei was goed. De sporen waren langgerekt met scherpe uiteinden en een onregelmatig oppervlak. Zij waren 0,4-0,9 fm lang en 0,3-0,6 yum 35 breed. De uiteinden hadden duidelijke hoeken. In sommige gevallen waren de sporen in het midden enigszins hol. Zij werden gevormd door fragmentatie. De kolonies waren ovaalvormig met vormloze randen, plat met een bolrond centrum in de vorm van een koepel, een beetje gevouwen, en in sommige gevallen 40 radiaal gesegmenteerd.

8006510 - 3 -

De kleur van het lucht- en substraatmycelium werd bepaald volgens de kleurenschaal van A.S. Bondartsev en de schaal van Tresner-Backus.

Bij de verschillende cultuurmedia veranderde de 5 kleur van het luchtmycelium afhankelijk van de koolstof- en stikstofbronnen van lichtgrijs tot donkergrijs (a -a ). Op het cultuurmedium 1 met een minerale stikstofbron (naar G.F. Gause en medewerkers) was de kleur muisgrijs (a^) tot donkergrijs (a^) en op het cultuurmedium 2 met een organische stik-

O

10 stofbron (naar G.F. Gause) was de kleur donkergrijs (a ). Op cultuurmedia met andere koolstof- en stikstofbronnen was het luchtmycelium grijs tot donkergrijs).

Op het cultuurmedium 1 met een minerale stikstof- bron (naar G.F. Gause en medewerkers) was het substraatmyce- 5 2 15 lium licht citroenkleurig tot geeloranje (d -d ). Op het cultuurmedium 2 met een organische stikstofbron (naar G.F. Gause en medewerkers) was het substraatmycelium goudgeel en werd na 7 7 langdurig kweken bijna kastanjebruin (m -o ). Op cultuurmedia met verschillende koolstof- en stikstofbronnen was het sub-20 straatmycelium van geel tot gelig grijsgroen.

De groei en de kleuren van het lucht- en substraatmycelium in verschillende groeimedia worden in Tabel I vermeld.

25 Tabel I

Cultuurmedium Groei Kleur van het Kleur van het luchtmycelium substraatmyce- _lium_ vlees-pepton-agar gering wit (zeer kleurloos weinig) 30 aardappel-glucose- zeer goed grijs tot don- licht- tot don- agar kergrijs kerbruin; geel aan de randen van de kolonie? geel pigment in het midden.

35 Tchapek met sucrose matig lichtgrijs beige

Tchapek met glucose matig grijsachtig crèmekleurig met sucrose goed grijs geel zetmeel-agar matig lichtgrijs, citroengeel, lichtasgrauw geel zetmeel-ammonia goed grijs tot don- lichtgeel tot 40 naar Mishustin kergrijs geel ft fl 0 R f Ω - 4 -

Tabel I (vervolg)

Cultuurmedium Groei Kleur van het Kleur van het luchtmycelium substraatmyce-__lium_ synthetisch medium gering beigegrijs geel ^ naar Krassilnikov CPI naar N.A. Kras- goed melkgrijs, gelig grijs- silnikov blauwgrijs groen CPU naar N.A. Kras- goed grijs, met crêmegrijs silnikov witte afschei ding 10 CPIII naar Krassil- goed grijs citroengeel, nikov geel CPIV naar N.A. Kras- matig lichtgrijs, crème silnikov grijsachtig CPV naar N.A. Kras- gering wit beige, donker- silnikov crème 15 synthetisch medium matig wit, met geel tot naar Vaxman grijze vlek- oranje ken vlees-zetmeel-agar matig grijs geel pepton-agar goed grijs tot don- kleurloos met kergrijs een gloed van het luchtmyce- 20 lium glucose-asparagine- matig lichtgrijs crèmegeel agar glycerine-asparagine- goed lichtgrijs, donkergeel agar grijs na ver oudering 25 tyrosine-agar matig grijs, in som- donkergeel tot mige kolonies oranje tot grijsachtig geel tyrosine-casexne- matig asgrauw geel nitraat-agar __ glucose-tyrosine- goed crêmegrijs geelbruin agar tot grijs saccharose-nitraat- matig grijs crèmegeel agar glycerol-calcium- goed lichtgrijs geeloranje maleaat-agar tot grijs peptine-rundvlees- goed grijs kleurloos tot agar beige havermout-agar zeer goed grijs lichtgeel tomaat-agar goed donkergrijs terracotta loodacetaat-agar gering grijsachtig geelbruin 8006510 - 5 -

Tabel I (vervolg)

Cultuurmedium Groei Kleur van het Kleur van het luchtmycelium substraatmyce-_ lium_ 5 ijzer-pepton-agar matig muisgrijs kleurloos met een grijze gloed van het luchtmycelium gist-mout-agar goed grijs oranje 10 De stam vertoonde geringe weerstand tegenover toe nemende concentratie van natriumchloride in het medium. De maximum concentratie was 4%, waarbij de groei van de stam gering was, en de kleur van het luchtmycelium wit was en van het substraatmycelium geel was. Een concentratie hoger dan 1% 15 had een negatieve invloed op de mate van sporevorming.

De stam peptoniseerde vetloze melk, waarbij de reactie in het begin zuur was en na enige tijd omsloeg naar basisch. Verder verwaterde de stam gelatine en groeide zeer goed op een sucrosemedium, zonder echter de sucrose te inver-20 teren. De stam groeide ook zeer goed op een zetmeel-agar en hydrolyseerde zetmeel goed. Aan de andere kant werd cellulose niet ontleed door de stam en werden nitraten niet tot nitrie-ten gereduceerd. De stam maakte waterstofsulfide vrij en groeide op aardappels. De hemolyse was positief, terwijl de 25 tyrosinase negatief was. Een goede groei werd waargenomen op het uitgangscultuurmedium van Pridham en Gottlieb in de aanwezigheid van de volgende koolstofbronnen: glucose, fructose, levulose, xylose, maltose, cellobiose, galactose, mannitol, arabinose, dextrose, ribose en glycerol. De stam absorbeerde 30 op kleine schaal salicin, maar absorbeerde niet andere koolstof bronnen, als lactose, sorbitol, inositol, sucrose en raf-finose. Afhankelijk van de koolstofbron werden enige verschillen in de pigmentatie van het lucht- en substraatmycelium waargenomen.

35 Verder bleek dat op een gemodificeerd uitgangscul tuurmedium van Pridham en Gottlieb de groei van de stam goed was in aanwezigheid van de volgende stikstofbronnen: NH^Cl, (NH4)2S04, (NH4)2HP04, (NH4)H2P04, NH4N03, Na2HP04 en carbamide. De groei was echter matig op een cultuurmedium met 40 NaNO^, terwijl de stam niet groeide op een cultuurmedium met - 6 -

NaNC>2. Een zeer goede groei van de stam werd waargenomen op cultuurmedia met de volgende aminozuren: asparaginezuur, asparagine, proline, cystine, en tyrosine. De groei was matig op een cultuurmedium met valine, hydroxyproline, fenylalanine, 5 leucine of alanine, terwijl de stam niet groeide op een cultuurmedium met glutaminezuur. Afhankelijk van de stikstofbron werden enige verschillen in de pgimentatie van het lucht- en substraatmycelium waargenomen.

In sommige eigenschappen lijkt de streptomycesstam 10 op Streptomyces griseoflavus van de Gray-serie volgens

Bergey's (1974) of Actinomyces griseoflavus van de Flavus-groep volgens N.A. Krassilnikov (1970). Deze onderscheidt zich echter in een aantal morfologisch-cultuurlijke en fysio-logisch-biochemische eigenschappen, zoals uit de soortbe-15 schrijving door Bergey's (1974) en N.A. Krassilnikov (1970) blijkt. Zo heeft Streptomyces griseoflavus bijvoorbeeld langgerekte staaf- en ovaalvormige sporen met een gelijkmatig oppervlak; en vertoont tolerantie tegenover NaCl concentraties van 7 tot 10%. Streptomyces griseoflavus hydrolyseert zetmeel 20 zwak en absorbeert sucrose en sorbitol, maar niet galactose. Darom is de streptomycesstam nr. 1339 niet identiek met de gelijkenis vertonende Streptomyces griseoflavus (Actinomyces griseoflavus), en wordt de stam aangeduid met Streptomyces 1339 behorende tot de Gray-serie volgens Bergey's (1974) en 25 de Flavus-groep volgens N.A. Krassilnikov (1970).

De producentstam werd in erlenmeyerkolven van 500 ml bevattende 50 ml gistingscultuurmedium gedurende 36 tot 96 h bij een temperatuur van 24 tot 36°C in een schud-machine met 180-320 t.p.m. gekweekt, terwijl de pH bij het 30 begin van de kweek 6,5 tot 9,0 was.

De isomerisatie van glucose tot fructose met behulp van glucoseisomerase uit de stam Streptomyces 1339 is uitvoerbaar door een directe behandeling met vers mycelium (afgescheiden in een centrifugebehandeling met 12.000 t.p.m. en 35 driemaal gewassen met een 0,05 M fosfaatbuffer met pH 7,0), met gedroogd mycelium (lucht- of aceton-gedroogde cellen), met een oplossing van het enzym (verkregen door supersonische desintegratie of autolyse van celmateriaal gevolgd door afscheiding van de bovenstaande vloeistof na een centrifugebe-40 handeling bij 15.000 t.p.m.), of met een cultuurcentrifugaat 8006510 - 7 - bevattende extracellulair isomerase of immobiel gemaakte cellen op een harde drager.

De in het reactiemengsel gevormde fructose werd bepaald volgens de cysteïnecarbazolmethode (19) . De activiteit 5 van de stam wordt uitgedrukt in mg fructose per ml cultuur-vloeistof of in internationale glucoseisomerase-eenheden (GIU). Eén GIU is gelijk aan de hoeveelheid van het enzym, die bij 70°C en een pH van 7,0 in een 1 M oplossing van glucose in een 0,05 M fosfaatbuffer met 1.10 ^ M CoC^.öE^O en 1.10 2 M 10 MgS0^.7H20, in één minuut 1 /umol glucose in 1 /umol fructose omzet.

De werkwijze volgens de uitvinding heeft de volgende voordelen: De streptomycesstam 1339, waarmee glucoseisomer-ase verkregen wordt, bezit een hoog vermogen tot de biosynthe-15 se van het enzym (12.000-20.000 GIU), hetgeen 4 tot 20 maal zo groot is als de activiteit van de bekende producentstammen (5, 6). Het verkregen enzym kent een hoge optimale temperatuur (79°C) bij lage optimale concentraties van Co2+ (1.10-½) en 2+ -2

Mg (1.10 M) in het isomerisatiemengsel. Het enzym heeft 20 een gunstig pH-optimum (7,0) en een aanzienlijke thermosta-biliteit tussen 40 en 65°C.

De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.

25 Voorbeeld I.

De producentstam werd in reageerbuizen met aflopende agar bewaard op cultuurmedia met de volgende samenstelling: 1. Xylose cultuurmedium: xylose 20 g 30 agar 20 g KN03 1,0 g K2HP04 0,5 g

MgS04.7H20 0,5 g

NaCl 0,5 g 35 CaC03 1,0 g

FeS04 0,001 g water tot aan 1 1 8006510 - 8 - 2. Aardappel-glucose-agar:

Aardappelextract van 300 g gekookte aardappels, glucose 10 g agar 20 g 5 water tot aan 2 1

Bi j voorkeur worden voor het bewaren van de stam beide cul-tuurmedia afwisselend gebruikt.

Aan een goed gerijpt materiaal na kweek gedurende 10-15 dagen op cultuurmedium 1 of 2 (bij voorkeur cultuur-10 medium 1), werd 6 ml entcultuurmedium toegevoegd met de volgende samenstelling: xylose 1,0% trypton 2,0%

MgS04.7H20 0,1% 15 K2HP04 0,25%

Na wassen van de celmassa werd de reageerbuis gedurende 24 h bij 30°C in een schudapparaat met 240 t.p.m. geplaatst. De zo behandelde entcultuur werd op een medium met de volgende samenstelling gebracht: 20 xylose 1,0% maïsextract 3,0% (droog gewicht)

MgS04.7H20 0,1% K2HP04 0,25% agar 0,1% 25 Na een kweek van 60 h onder bovengenoemde omstandigheden werd 5% van de entstof toegevoegd aan een gistingscultuurmedium met de volgende samenstelling: xylose 1% maïsextract 3,0% (droog gewicht) 30 MgS04.7H20 0,1% KC1 0,0075%

CoC12.6H20 0,024%

De kweek werd uitgevoerd in erlenmeyerkolven van 500 ml bevattende 50 ml gistingscultuurmedium gedurende 60 h bij 30°C 35 in een schudapparaat met 240 t.p.m. uitgevoerd. De pH bij het begin van de kweek was 8,5. Na gedurende 60 h kweken van Streptomyces 1339 werd 140-220 g vochtige biomassa per liter cultuurvloeistof verkregen.

8 00 6 5 1 0

Claims (2)

1. Werkwijze voor het verkrijgen van glucoseisomerase, met het kenmerk/ dat de enzymproducerende stam Streptomyces 1339/ registratienummer 144 van het Staatsinstituut voor Geneesmiddelencontrole te Bulgarije, gedurende 5 36-72 h in een cultuurmedium met xylose als indicator wordt gekweekt, waarbij de temperatuur tussen 24 en 36°C wordt gehouden, de pH bij het begin van de kweek tussen 6,5 en 9,0 bedraagt, de isomerisatietemperatuur tussen 50 en 80°C is, de pH in de aanwezigheid van CoCl2.6H20 tussen 6,0 en 9,0 is 10 en de concentratie van het substraat tussen 0,1 en 3 M is.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gebruikte cultuurmedium de volgende samenstelling heeft: xylose 1,0% - 2,0% 15 malsextract 1,5% - 4,0% (droog gewicht) MgS04.7H20 0,05% - 0,2% KC1 0,005% - 0,01% CoCl2.6H20 0,008% - 0,036%. 8006510