HU190347B - Process for preparing glucose isomerase - Google Patents

Description

Eljárás gliikáz-izomerá: előállítására

Λ találmány Streptomyces törzsből történő glükóz-izomeráz előállítási eljárásra vonatkozik.

Ismeretes, hogy a D-glükóz D-fruktózzá történő átalakulása a glükóz-izomeráz enzim által valósul meg, melynek felhasználása mind gyakoribb a nagyfejlettségű országok élelmiszer- és élvezeticikk iparában és a diétás táplálkozásban.

Keményítőépítő enzimek (α-amiláz és glükóamiláz) komplexével kombinációban a glükóz-izomeráz lehetővé teszi glükóz-fruktöz szirupok előállítását keményítőből, közvetlen enzimatikus úton.

Glükóz-izomeráz előállítási eljárás 1957 óta ismeretes, amikorís Marschall R. O. és Kooi E. R. (1957. Science, 125, 3249. sz., 648.) először mutatták be D-glükóz közvetlen átalakítási lehetőségét D-fruktózzá, a 491-es és 492-es számú Pseudomonas hydrophila baktériumtörzs sejtjeinek segítségével. A leggyakoribb Streptomyces-fajok, amely mikroorganizmusokat glükóz-izomeráz előállítására felhasználnak, elsősorban a Str.phaeochromogenes (Strandberg J. W., Smily K. L. 1971. Appl. Microbiol., 21, 4, 588.) és (TsumuraM., Sato T. Ibid., 1129.), a Str.venezuelae (Gratscheva I. M., Mossitschev M. S., Gavristov A. W., Filippov S.

A. , 1977, 542 763. sz. szovjet szerzői tanúsítvány, Bulletin „Oktritija i Isobretenija”, 2. szám.) és (IizukaH., AyukawaY., Suekane M., Kanno M.

1971., 3 622 463-as számú amerikai szabadalom), a Str.griseds (Hsu T. Y., Shon S. C., 1964. Sheng Wu Hua Usuen Yn Sheng Wu Li Hsuen Pao, 4, 342.), a Str.wedmorensis (az 1 361 846-os számú angol szabadalom), a Str.albus (TakasakiY., 49 981-es számú japán szabadalom), a Str.flavovirens, Str.achromogenes, Str.achinatus (Takasaki Y.

1971., a 3 616 221-es számú amerikai szabadalom), a Str.olivocinereus (Heady R. E., Jacaway W. A., a 2 223 864-es számú nyugatnémet szabadalom), a (lizukaH., AyukawaY., Suekane M., Kanno M.

1971., a 3 622 463-as számú amerikai szabadalom) és (Kooi E. R., Smith R. J. 1972. Food Technoi., 26, 9, 57.) a Str.olivaceus (a 2 223 340-es számú nyugatnémet szabadalom) és (a 2 131 984-es számú francia szabadalom) és más fajták. A Streptomyces fajtáin kívül aktív termelők a Proaktinomycetek és az Aktinomycetek más fajtái is: Nocardia, Micromonospora (Horwath R. O., Colé G. W. 1973.,

156 622-es számú francia szabadalom) és (Horwath R. O., Colé G. W., 1973., 2 247 922-es számú nyugatnémet szabadalom), Actinoplanes (Scallet

B. L., Shieh K., Ehrenth a I. 1974. Stárke, 26, 12, 405) és (Shieh K. K., Lee H. A., Donnelly B. J. 1974. a 3 834 988-as számú amerikai szabadalom), Thermoactinomyces, Thermopolyspora (Takasaki Y.

1975., az 50-17 560-as számú japán szabadalom), és ugyanúgy egyes baktériumtörzsek, melyek az alábbi fajtákhoz tartoznak: Aerobacter (Heady R. E., Jacaway W. A., a 2 223 864-es számú nyugatnémet szabadalom), Acetobacter (Lliyd N. E., Lewis L. T., Logan R, M., Patel D. N, 1972., a

694 314-es számú amerikai szabadalom), Lactobacillus (Kent C. Á., Emery A. N. 1973. J. Appl. Chem. and Biotechnoi., 23, 689.), Bacillus (Skot G., Outtrup H. In „5th Int. Ferment. Symp., 4th Int. Spec. Symp., Yeasts, Berlin, Abstr. Pap. Berlin, 1976, 256.), Arthrobacter (Lee C. K., Lawrence E. N., Long Μ. E. 1972., a 3 645 848-as számú amerikai szabadalom), Flavobacterium (a 3 956 066-os számú amerikai szabadalom) stb.

A glükóz-izomeráz előállítására vonatkozó ismert eljárások egy sor hátránnyal járnak, melyek főképpen azzal vannak kapcsolatban, hogy a törzstermelők magas glükóz-izomeráz aktivitást csak az enzim kedvező hőmérséklet- és pH-optimuma mellett adnak. Ha az izomerizációs folyamat hőmérséklete alacsonyabb 60-65 °C-nál, az a telep mikrobiológiai szennyeződésének veszélyéhez vezet. A hőmérsékletet 90 °C-ig emelve, csökkenti az enzim stabilitását, a szirup elszíneződését és viszkozitásának megváltozását idézi elő. Az ipari méretekben történő felhasználásra tekintettel a legkedvezőbb a 6,5-7,0 közötti pH-érték, mivel 7,0 fölötti pH-értéknél a glükóz D-pepszikóze képződése közben alkálikusan izomerizálódik és a szirup elszínezödik; kis pH-érték pedig (5,5 alatt) az enzim irreverzibilis denaturálódását idézi elő.

A találmány feladata glükóz-izomeráz előállítási eljárás kidolgozása Streptomyces-törzsből nagy aktivitással, az enzim magas hőmérsékleti és kedvező pH-optimumánál.

Az 1339-es spec. számú Streptomyces-törzset - a glükóz - izomeráz termelőjét bolgár talajból izoláltuk. Ezért a felfedezésért 874 Streptomyces-törzset vizsgáltunk át. A rostálást a Krassilnikow szerinti

I. számú modifikált szintetikus tápközegben végeztük, ahol a szelekciót xilóz és xilán igénybevételével két szubsztrát szinten valósítottuk meg. Ezek között a viszonyok között 18 Streptomyces-törzset fedeztünk fel, melyek a glükóz-izomeráz enzim termelésének fejlesztésére hajlandóságot mutattak, ezek közül különösen az 1339-es számú Streptomyces-törzs mutatkozott perspektivikusan is ipari célú felhasználásra alkalmasnak. A törzset az Állami Gyógyszerellenőrző Intézet, Boul. VI. Saimov 26.,

1979. szeptember 29-én 144-es számmal vette lajstromba, és az alábbi morfológiai és biokémiai jellemzőket mutatta ki:

Nitrogénforrás-tartalmú, I-es számú tápközegben (G. F. Gause és munkatársai szerint) a telepek rendszerint oválisak, alaktalan szélűek, laposak, egy középen domború, kupolaszerű, enyhén ráncos felületű centrummal. A spóratömlők spirálisak, max. 1-3 gyűrűcskével. A növekedés jó. A spórák hosszúkásak, élesen tagolt szélüek és egyenetlen felületűek, 0,4-0,9 mikrométer a hosszúságuk és 0,3-0,6 mikrométer a szélességük. A szélek jól meghatározott szögűek. Más esetekben a spóra közepe kissé mélyített. Közvetlen sejtmagosztódással (fragmentációval) képződnek. A telepek oválisak, alaktalan szélűek, laposak, domború, gömbboltozat alakú középponttal, könnyen ráncolódók, egyes esetekben sugarasan tagoltak. A lég- és szubsztrátmicéliumok színét az A. S. Bondarzew és a Tresner-Backus skála szerint határoztuk meg. A szén- és nitrogénforrástól függően a különböző tápközegeknél a légmicéliumok színe a világosszürkétől a sötétszürkéig változik (a⁴-a²). A nitrogénforrás-tartalmú, 1-es számú tápközegben

190 347 (G. F. Gause és munkatársai szerint) a légmicélium egérszürke (a⁴) sötétszürkéig (a²), és a szerves nitrogénforrás-tartalmú 2-es tápközegben (G. F. Gause szerint) - sötétszürke (a²).

Különböző szén- és nitrogénforrás-tartalmú tápközegekben a légmicélium szürkétől sötétszürkéig változik.

A nitrogénforrás-tartalmú, 1-es számú tápközegben (G. F. Gause és munkatársai szerint) a szubsztrátmicélium színe világos citromsárgától narancssárgáig (d’-d²) változik. A szerves nitrogénforrástartalmú, 2-es tápközegben (G. F. Gause és munkatársai szerint) a szubsztrátmicélium aranysárga, és tartós kultiválás hatására gesztenyebarnába megy át (m⁷-o⁷).

Különböző szén- és nitrogénforrás-tartalmú tápközegekben a szubsztrátmicélium a sárgától a sárgás-szürkés-zöldig változik.

Hús-pepton-agar-agar tápközegben a növekedés gyenge, a levegőmicélium fehér, nagyon gyér; a szubsztrátmicélium színtelen.

Burgonya-glükóz-agar-agar tápközeg: a növekedés nagyon jó. A légmicélium szürke-sötétszürke. A szubsztrátmicélium világosbarna-sötétbarna, a telepek szélén sárga. Középen a pigment sárga.

Tschapek-tápközeg szacharózzal: a növekedés közepes, a légmicélium világoskék, a szubsztrátmicélium beige.

Tschapek-féle tápközeg glükózzal: a növekedés mérsékelt, a légmicélium szürkés, a szubsztrátmicélium beige.

Tápközeg szacharózzal: növekedés jó, légmicélium szürke, szubsztrátmicélium sárga.

Keményítő-agar-agar tápközeg: növekedés közepes, légmicélium világosszürke, világos hamuszín; szubsztrátmicélium sárga-citromsárga.

Mischustin-féle keményítő-ammónia tápközeg: növekedés jó, légmicélium szürke-sötétszürke, szubsztrátmicélium sárga, világossárga.

N. A. Krassilnikow-féle szintetikus tápközeg: növekedés gyengétől közepesig, légmicélium beige-szürke; szubsztrátmicélium sárga.

N. A. Krassilnikow-féle CP I: növekedés jó, légmicélium tejszürke-kékesszürke; szubsztrátmicélium: sárga-szürke-zöld.

N. A. Krassilnikow-féle CP II: növekedés jó, légmicélium szürke, elkülönülő fehér exsudatum; szubsztrátmicélium beige-szürke.

N. A. Krassilnikow-féle CP III: növekedés jó, légmicélium szürke, szubsztrátmicélium sárga, citromsárga.

N. A. Krassilnikow-féle CP IV: növekedés közepes, légmicélium világosszürke, szürkés; szubsztrátmicélium krémszínű.

N. A. Krassilnikow-féle CP V: növekedés gyenge, légmicélium fehér; szubsztrátmicélium beige, sötét-krémszínű.

Wachsmann-féle szintetikus tápközeg: növekedés mérsékelt, légmicélium fehér, néhány helyen szürke; szubsztrátmicélium sárgától narancssárgáig változik.

Hús-keményítő-agar-agar tápközeg: növekedés mérsékelt, légmicélium szürke; szubsztrátmicélium sárga.

Pepton-agar-agarban: növekedés jó, légmicélium szürke-sötétszürke, szubsztrátmicélium színtelen, légmicélium-ámyalattal.

Glükóz-aszparagin-agar-agarban: növekedés jó, légmicélium világosszürke; szubsztrátmicélium sárga-krémszínű.

Glicerin-aszparagin-agar-agarban: növekedés jó, légmicélium világosszürke, idővel szürkébe megy át. Szubsztrátmicélium sötétsárga.

Tirozin-tápközegben: növekedés közepes, légmicélium szürke, egyes telepeknél szürkéssárga; szubsztrátmicélium sötétsárga-narancsszínű.

Tirozin-kazein-nitrát-agar-agarban: növekedés közepes, légmicélium hamuszürke, szubsztrátmicélium sárga.

Glükóz-tirozin-agar-agarban: növekedés jó, légmicélium krémszínű szürkétől szürkéig; szubsztrátmicélium: sárgásbarna.

Szacharóz-nitrát-agar-agarban: növekedés közepes, légmicélium szürke, szubsztrátmicélium krémszínű sárga.

Glicerin-kálcium-maláta-agar-agarban: növekedés jó, légmicélium világosszürke-szürke; szubsztrátmicélium narancssárga.

Pepton-marhahús-agar-agarban: növekedés jó, légmicélium szürke, szubsztrátmicélium színtelentől krémszínűig.

Zab-agar-agarban: növekedés nagyon jó; légmicélium szürke, szubsztrátmicélium világossárga.

Paradicsom-agar-agarban: növekedés jó, légmicélium sötétszürke, szubsztrátmicélium terrakottaszínű.

ólomacetát-agar-agarban: növekedés gyenge, légmicélium szürkés szubsztrátmicélium sárgásbarna.

Vas-pepton-agar-agarban: növekedés mérsékelt, légmicélium egérszürke; szubsztrátmicélium színtelen_; a légmicélium szürkés árnyalatával.

Elesztő-maláta-agar-agarban: növekedés jó, légmicélium szürke, szubsztrátmicélium narancsszínű.

A törzsek toleranciája NaCl-ra vonatkoztatva ugyanazt a kis toleranciát mutatja tápközegben, NaCI-koncentrációval szemben. A maximális koncentráció 4%. A törzsek növekedése ilyen koncentráció mellett gyenge. A légmicélium fehér. A szubsztrátmicélium sárga. 1%-nál nagyobb NaCI-koncentráció negatív hatással van a spóraképződésre.

A zsírtalanított tej peptonizálása. A peptonizálás kezdetén a reakció savas, melyből bizonyos idő után a reakció lúgossá válik.

Zselatin folyósítása. Szacharóz tápközegben igen jól növekszik, de a szacharóz nem invertál. Nagyon jól növekszik keményítő-agar-agarban és a keményítő jól hidrolizál. A cellulózt nem bontja. A nitrátot nem redukálja nitritté. Kénhidrogént választ ki. Nő burgonyában. A hemolízis pozitív. A tirizináz negatív.

A Pridham és Gottlieb-féle tápközegben nagyon jó növekedés figyelhető meg a következő szénforrásokkal: glükóz, fruktóz, levulóz, xilóz, maltóz, cellobióz, galaktóz, mannit, arabinóz, dextrin, ribóz és glicerin.

A szalicint gyengén abszorbeálja.

Olyan szénforrásokat, mint a laktóz, szorbit, inozit, szacharóz és rafinóz - nem asszimilál.

-3190 347

A szénforrásoktól függően különbségek figyelhetők meg a lég- és szubsztrátmicéliumok elszíneződésében.

Egy Pridham és Gottlieb-féle modifikált alaptápközegben a törzsek igen jó fejlődését állapítottuk meg az alábbi nitrogénforrásokkal: NH₄C1, (NH₄)₂SO₄, (NH₄)₂HPO₄, NH₄H₂PO₄, NH₄NO₃, Na₂HPO₄ és karbamid.

A törzs mérsékelt fejlődést mutat NaNO₃ tartalmú tápközegben. NaNO₂ tartalmú tápközegben ez a törzs nem növekszik.

Megfigyelhető, vagyis megállapítható, hogy a törzs nagyon jól növekszik az alábbi aminósavas tápközegekben: aszparaginsav, aszparagin, prolin, cisztin, tirozin. Mérsékelt növekedést mutat a törzs valin, hidroxiprolin, fenilalanin, leucín, alanin tartalmú tápközegekben. A törzs glutaminsavas tápközegben nem fejlődik.

A nitrogén források függvényében különbségek mutatkoznak a lég- és szubsztrátmicéliumok színeződésében.

Az 1339-es számú Streptomyces-törzs hasonló egyes tulajdonságok tekintetében a Streptomyces griseoflavushoz, amely a Bergey's-féle (1974) Grayszériához - az N. A. Krassilnikow - 1970-szerinti Elavus-csoport Actinomyces griseoflavusához tartozik. Ez utóbbi egy sor kultúra-morfológiai és fiziológiai-biokémiai tulajdonságban különbözik, melyek a Bergey's (1974) és N. A; Krassilnikow (1970)-féle Species-jellemzőkben vannak leírva. A Streptomyces griseoflavusnak például hosszúkás, pálcika alakú és ovális, fényes felületű spórái vannak, NaCl-dal szemben 7-10%-os toleranciát (tűrést) mutatnak. A keményítőt gyengén hidrolizálja. A szacharózt és a szorbitot abszorbeálja, de a galaktózt nem. Következésképpen az 1339-es számú Streptomyces-törzs nem azonosítható a hozzá közelálló Streptomyces griseoflavussal (Actinomyces griseoflavus), s ezért ezt a Bergey's-féle Grayszéria (1974) és az N. A. Krassilnikow-féle Flavuscsoport (1970) 1339-es számú Streptomycesének tulajdonítjuk.

A termelő törzset 50 ml fermentációs tápközeget tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 36-96 óra alatt, 24—36 °C hőmérsékleten, a kultiválás kezdetén 6,5-9 közötti pH-értéken, egy ISO-320/perc fordulatszámú rázógépen kultiváljuk. A glükóz fruktózzá történő átalakítását az 1339-es számú Streptomyces-törzsből képződő glükóz-izomerázzal előállíthatjuk direkt kezelés útján friss micéliummal (melyet 12 000 fordulat/perces centrifugálással kicsapattunk és 0,05 M-os, 7,0-es pH-értékű foszfátpufferrel háromszor átmostunk) vagy szárított micéliummal (légszárítású vagy acelonszárítású sejtek); enzimes oldattal, melyet a sejtanyag ultrahanggal vagy autolízissel történő bontása és a szupernatánsoktól 15 000 fordulat/perces centrifugálással történő elkülönítése útján állítunk elő; vagy centrifugátum tenyészettel, mely extra sejtekből álló izomerázokat vagy szilárd hordozón immobilizált sejteket tartalmaz.

A reakcióelegyben képződött fruktózt a ciszteinkarbazol-eljárás szerint határozzuk meg (Dische Z., Borenfreund E. 1951. J. Bioi. Chem., 192, 583), a törzsaktivitást mg fruktóz/ml tenyészfolyadék4 bán vagy nemzetközi glükóz-ízomeráz-egységben (GIU) adjuk meg. Ebben az esetben egy GIU az az enzimmennyiség, mely 70 °C-on, 7,0 pH értéknél, 1 M glükózoldatot, 1 · 10* M CoCl₂ · 6H₂O-t és 1 · 10'² M MgS0₄ · 7H₂O-t tartalmazó 0,05 M-os foszfátpufferben 1 perc alatt 1 pmol glükózt 1 pmol fruktózzá átalakít.

A találmány szerinti eljárás előnyei a következők: a glükóz-izomeráz előállítására az 1339-es Streptomyces-törzset használjuk, mely az enzim nagy bioszintetikus lehetőségeit mutatja (12 000-20 000 GIU/1), mely 4-20-szorosan meghaladja a szabadalmi irodalomban ismert termelő törzsek aktivitását, (3 616 221-es számú amerikai szabadalom; 3 834 988-as számú amerikai szabadalom; 1 376 787-es számú angol szabadalom;

451 273-as számú angol szabadalom; 1 284 218as számú angol szabadalom; 534 490-es számú szovjet szabadalom; 534 491-es számú szovjet szabadalom ; 542 763-as számú szovjet szabadalom;

119 713-as számú nyugatnémet szabadalom; 2 247 922-es számú nyugatnémet szabadalom; 2 018 518-as számú nyugatnémet szabadalom; 1 934 461-es számú nyugatnémet szabadalom.) Az így kapott enzimet magas hőmérsékleti optimum (70 °C), az izomerizációs elegyben a Co^{+ +} (1 · 10 ‘*M)ésMg⁺⁺ (1 · 10'² M) kis optimumkoncentrációja, kedvező pH-optimum (7,0) és 40-65 °C között jelentős hőmérsékleti stabilizáció jellemzi.

A találmányt az alábbi példák segítségével mutatjuk be:

/. Példa

A termelő törzset kémcsövekben kedvező agaragaron tartjuk, a tápközegek az alábbi összetételűek:

1. Xilóz-tápközeg: xilóz 20 g, agar-agar 20 g, KNO₃ 1,0 g, K₂HPO₄ 0,5 g, MgSO₄ · 7H₂O 0,5 g, NaCl 0,5 g, CaCO₃ 1,0 g, FeSO₄ 0,001 g és víz 1 literre való feltöltéséig.

2. Burgonya-glükóz-agar-agar: burgonyakivonat 300 g főtt burgonyából, glükóz 10 g, agar-agar 20 g és víz 21-re való feltöltésig.

Előnyös a törzsek megőrzése érdekében a két tápközeget felváltva használni.

Az 1-es vagy 2-es tápközegben (előnyösebb az

1-es) lévő 10-15 napos tenyészet jól fejlett anyagához 6 ml, alábbi összetételű inokulációs tápközeget adunk: xilóz 1,0%, tripton 2,0%, MgSO₄ · 7H₂O 0,1%, K₂HPO₄ 0,25%.

Végezetül a sejtmassza leöblítése következik, amelynél a kémcsövet egy rázógépen 24 órán keresztül, 30 °C-on 240 fordulat/perc sebességgel mozgatjuk. Az ily módon keletkezett tenyészetet a következő összetételű inokulációs közegbe helyezzük: xilóz 1,0%, kukoricakivonat 3,0% (szárazanyagnak megfelelően), MgS0₄ · 7H₂O 0,1%, K₂HPO₄ 0,25%, agar-agar 0,1%.

A fent ismertetett feltételek szerinti 60 órás kultiválás úján a fermentációs tápközeget az alábbi öszszetételű 5%-os inokulummal oltjuk be: xilóz 1,0%, kukoricakivonat 3,0% (szárazanyagnak megfelelő-41

190 347 en), MgS0₄ · 7H₂O 0,1%, KC1 0,0075%, CoCl₂ • 6H₂Ö 0,024%. A kultiválást egy 50 ml fermentációs tápközeget tartalmazó, 500 ml-es Erlenmeyerlombikban 60 óra alatt, 30 °C-on, 240 fordulat/perces rázógépen végezzük el. A kultiválás kezdeti pH-értéke 8,5.

Az 1339-es számú Streptomyces-tőrzs 60 órás kultiválása esetén 140-220 g nedves biomassza állítható elő, 1 liter tenyésztőfolyadékra számítva.

2. Példa

A glükóz fruktózzá történő átalakítását az 1339es számú Streptomyces-törzsből képződő glükózizomeráz segítségével 70 ’C-on, 7,0 pH-értéken, 1IO’⁴M CoC12 -6H2O, 110’²M MgSO4 · • 7H₂O és 1 M-os szubsztrátkoncentráció jelenlétében végezzük.

Az 1339-es számú Streptomyces-tőrzs aktivitása 130-215 mg fruktóz (1 ml tenyésztőfolyadék vagy 12 000-20 000 GIU) 1 liter tenyésztőfolyadék.

Claims (2)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás glükóz-izomeráz előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1339. szám alatt a Bolgár Álla⁵ mi Gyógyszerellenőrző Intézetnél 1979. szeptember 29-én letétbe helyezett Streptomyces-törzset 36-72 óra hosszat xilózt tartalmazó tápközegben tenyésztjük, miközben a hőmérsékletet 24 és 36 ’C között, és tápközeg pH-ját a tenyésztés elején 6,5 ¹⁰ és 9,0 között tartjuk, majd 50 és 80’C közötti hőmérsékleten, 6,0 és 9,0 közötti pH-értéknél, 5 · I0 ⁵-1 · 10 ’mól kobalt-klorid-hexahidrát,

   1 · 10^-4—1 · 10'¹ mól magnézium-szulfát-heptahidrát jelenlétében 0,1-3 mól szubsztrátkoncentráció mellett izomerizációt hajtunk végre.
2. 2. Azl. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy 1,0-2,0% xilózt,

   1,5 4,0% (szárazsúlyra számítva) kukorica-kivona₂₀ tót, 0,05-0,2% magnézium-szulfát-heptahidrátot, 0,005-0,01% kálium-kloridot és 0,008-0,036% kobalt-klorid-hexahidrátot tartalmazó tápközeget használunk.