CH642543A5

CH642543A5 - Medicines with antiviral action

Info

Publication number: CH642543A5
Application number: CH1083178A
Authority: CH
Inventors: Antonin Holy; Erik Declercq
Original assignee: Ceskoslovenska Akademie Ved; Stichting Rega V Z W
Priority date: 1977-10-20
Filing date: 1978-10-19
Publication date: 1984-04-30
Also published as: JPS6140206B2; CS199095B1; DE2845762C2; CS199093B1; JPS5480427A; DE2845762A1

Description

642 543

2

PATENT ANSPRÜCH E 1. Heilmittel mit antiviraler Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass es ausser einem inerten Träger als aktive Komponente (S)- oder (RS)-9-(2,3-Dihydroxypropyl)-adenin der Formel I

NH,

ci

■N

J

(I)

N I

CH_-CH-CHo0H OH

enthält.

2. Heilmittel gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als weitere aktive Komponente 9-(ß-D-Ara-binofuranosyl)-adenin der Formel II

enthält.

3. Heilmittel gemäss Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Verbindung der Formel I und die Verbindung der Formel II im Verhältnis von 1 : 1 bis 1000: 1 enthält.

(II)

ausgeprägte Wirksamkeit gegenüber den DNS-Viren und Ribavirin, l-(ß-D-Ribofuranosyl)-l,2,4-triazol-3-carbox-amid, weist breite antivirale Wirksamkeit gegenüber einigen RNS- und DNS-Viren auf [Science 177, 705 (1972); Chemo-s therapy 21, 505 (1975)]. Die Herstellung dieser Mittel ist jedoch relativ schwierig und die Produktion daher sehr teuer. Die Verwendung ist ausserdem durch die geringe therapeutische Breite (Verhältnis der wirksamen Dosis zur toxischen Dosis) und infolge ihres Abbaus im Organismus stark einge-lo schränkt.

Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, dass (S)- und/oder (RS)-9-(2.3-Dihydroxypropyl)-adenin der Formel I

(I)

CH„-CH-CHo0H 1 I ^

OH

ein wertvolles antivirales Heilmittel ist, wenn man es in un-25 toxischer Konzentration von 0,1 bis 1000 mg pro kg Körpergewicht anwendet. Die Erfindung betrifft demnach Heilmittel mit antiviraler Wirkung, die (S)- oder (RS)-9-(2,3-Di-hydroxypropyl)-adenin der Formel I, vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 100 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des pharmazeutischen Trägers, enthalten. Bevorzugte erfin-dungsgemässe Heilmittel enthalten ausser mindestens einer Verbindung der Formel I als weitere aktive Komponente 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin der Formel II, insbesondere in einer Menge von 1:1 bis 1000 :1 der Verbindung der 35 Formel I zur Verbindung der Formel II.

Verfahren zur Herstellung des (S)-Enantiomeren und der razemischen (RS)-Form der Verbindung der Formel I (im folgenden S-DHPA oder RS-DHPA genannt) sind bekannt. Beide Verbindungen können durch Umsetzung von 1-O-p-40 ToluolsuIfonyl-2,3-I-isopropyliden-D (oder -DL-)-glycerin der Formel III

p-CH _C CH . SO _OCH-CH-CH _ c 3642 2| { 2

3a

45

o V

Es ist bekannt, dass einige Derivate von Nukleosiden, d.h. Zuckerderivate von heterocyclischen Verbindungen, antivirale Wirkung aufweisen.. Beispielsweise hat 9-(ß-D-Ara-binofuranosyl)-adenin (im folgenden auch als araA bezeichnet) der Formel II

H3c

/ /\

(III)

CH-

mit dem Natriumsalz des Adenins in Dimethylformamid bei 100 °C und durch Kochen des entstandenen Zwischenproduktes mit 80%iger Essigsäure hergestellt werden 55 [Czech. Chem. Commun. 40,187 (1975)].

Nach dem tschechoslowakischen Urheberschein a.o. 191 656 wird die (RS)-Form der Verbindung I (RS-DHPA) . durch Erhitzen von Adenin mit 1,2-cyclischem Carbonat des Glycerins der Formel IV

(II)

60

CH2-CH-CH2OH

0

65

\

/

(IV)

0

3

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mit Natrium- oder Kaliumhydroxyd oder -carbonat in Dimethylformamid oderDioxan bei 100 bis 140 C gewonnen.

Ausschliesslich die D-Glycero-, d.h. (S)-Form der Verbindung der Formel I, weist biologische Wirksamkeit auf, wohingegen die L-Glycero-, d.h. (R)-Form vollkommen unwirksam ist. Die Wirksamkeit des racemischen (RS)-Deri-vats beruht auf seinem Gehalt von 50% an wirksamer (S)-Form.

(S)-DHPA der Formel I weist hohe antivirale Wirksamkeit gegenüber den RNS- und DNS-Viren und sehr niedrige Toxizität auf. Diese Wirkung ist ganz unerwartet, umso mehr als andere ähnliche Verbindungen, beispielsweise Derivate des Adenins mit anderer aliphatischer Komponente, z. B. (RS)-2-Hydroxypropyl-, 2-Hydroxyethyl-, 2-Amino-ethyl-, ß-DL-Alamyl-, (S)-3,4-Dihydroxybutyl-, (RS)-3,4-Dihydroxybutyl-, (RS)-threo-2,3,4-Trihydroxybutyl-, (RS)-3,5-Dihydroxypentyl-, 3-Hydroxypropyl-und 1,3-Di-hydroxy-2-propyl- oder 2,3-Dihydroxypropylderivate von anderen heterocyclischen Basen, z. B. Hypoxanthin, Uracil, Cytosin und Thymin bis zu einer Konzentration von 100 (ig/ ml keine bedeutende antivirale Wirksamkeit aufweisen. Von anderen bekannten ähnlichen Verbindungen haben wie erwähnt araA (auf DNS-Viren beschränkte Wirkung) und Ribavirin antivirale Wirksamkeit. Letzteres wirkt aber hoch cytotoxisch.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in der Kombination der genannten (S)- oder (RS)-Form der aktiven Komponente der Formel I mit 9-(ß-D-Arabinofura-nosyl)-adenin der Formel II

OH

und zwar vorzugsweise im Verhältnis von 1 : 1 bis 1000: 1 der Verbindung der Formel I zu der Verbindung der Formel II.

(S)-DHPA wirkt als starker Inhibitor der Adenosin-Desaminase, des in Zellen, Geweben und Körperflüssig-keiten sehr verbreiteten Enzyms. Dabei dient (S)-DHPA oder (RS)-DHPA weder als Substrat der Adenosin-Desami-nase der Bakterienzellen (Escherichia coli, Salmonella ty-phimurium) noch der Kaninchennieren. Die Adenosin-Des-aminase desaminiert beispielsweise das araA (II) zum unwirksamen Derivat von Hypoxanthin [Ann. N.Y. Acad. Sei. 284, 60 (1977)] und beschränkt so seine Verwendung als Vi-rostaticum. Die Verbindung S-DHPA und RS-DHPA inhibiert diesen Prozess und wirkt deshalb synergistisch mit araA, d.h. ähnlich wie z. B. CO-Viridarabin [(R)-3-(2-Des-oxy-ß-D-erythro-pentafuranosyl)-6,6,7,8-tetrahydro-imidazo-(4,5d)-l,3-diazepin-8-ol]; [siehe Ann. N.Y. Acad. Sei. 284,9 (1977) und 284, 60 (1977); siehe weiter die Tabelle 2].

Der Vorteil des erfindungsgemässen Heilmittels liegt in seiner beträchtlichen Stabilität, welche die Sterilisation von neutralen, schwach sauren oder schwach basischen Lösungen bei erhöhter Temperatur ermöglicht, in seiner praktisch unbeschränkten Stabilität in festem Zustand und schliesslich in seiner leichten Zugänglichkeit, besonders bei dem racemischen Derivat (RS)-DHPA.

Ein weiterer Vorteil besteht in seinem relativ einfachen Herstellungsverfahren und den niedrigen Produktionskosten, insbesondere im Vergleich mit den erwähnten bekannten antiviralen Präparaten.

Pharmazeutische Präparate mit einem Gehalt an (S)-DHPA oder (RS)-DHPA, gegebenenfalls in Kombination mit araA, als aktiver Komponente können in Form von Pudern, Suspensionen, Lösungen, Spray-Emulsionen, Salben und Cremes für parenterale (intravenöse, intradermale, intramuskuläre, intrathecale u.ä.) Applikationen oder für. orale, rectale, intravaginale und intranasale Dosierung oder lokale Applikation (Haut-, Schleimhaut-, Augen-Laesis u.ä.) verwendet werden. Diese Präparate kann man durch Vermischen oder Auflösen des wirksamen Stoffes bzw. der wirksamen Stoffe mit den pharmazeutisch verwendbaren Trägern, z.B. mit wässrigen oder nichtwässrigen Lösungsmitteln, Stabilisatoren, Emulgatoren, Dispergatoren, Benetzungsmitteln u.ä., geeigneten Additiva (z. B. Polyethylen-glykol) und erforderlichenfalls auch mit Farbmitteln oder aromatisierenden Stoffen herstellen. Die Präparate können verschiedene Konzentration der aktiven Komponente je nach der Art der Dosierung und nach der Art der Erkrankung, mindestens aber 0,1 Gew.-% und höchstens 100 Gew.-% enthalten.

Die erfindungsgemässen Heilmittel kann man zur ärztlichen Behandlung von Virenerkrankungen wie Vaccinia, Herpes simplex-1, Herpes simplex-2, Masern, vesikuläre Stomatitis u.ä. verwenden.

Im weiteren wird in den Beispielen die biologische Wirksamkeit von (S)-DHPA, (RS)-DHPA und ihrer Kombination mit araA erläutert.

Beispiel 1

Antivirale Wirksamkeit von (S)-DHPA auf Gewebekulturen

Die Zellen in jeder Kultur wurden durch hundertfache Dosis des Virus, die zur Infektion von 50% Zellen (CCID50) nötig ist, infiziert und eine Stunde nach der Infektion wurde (S)-DHPA in einer Konzentration von 0 bis 40 (ig/ml (in einigen Fällen bis 200 jig/ml) zugegeben. Für jede Kombination von Wirtszellen und Virus wurde ID50 bestimmt, d.i. die Konzentration von (S)-DHPA, welche zur 50%igen Hemmung der cytopathischen Wirkung des Virus, die durch den Kontrollversuch bestimmt wurde, nötig ist (nach L. J. Rosen thaï, I.L. Schechmaister, «Tissue Culture», S. 510, Academic Press, New York 1973). Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 1 angeführt. Es ist offensichtlich, dass einige Viren, z.B. Vaccinia, Herpes simplex Typ 1 und 2, Masern, vesikuläre Stomatitis, gegenüber (S)-DHPA sehr empfindlich sind, wogegen andere wie Poliomyelitis, Cox-sackia, Sindbis unbeeinflusst bleiben. Die inhibierende Wirkung des cytopathogenen Einflusses des Virus in Gegenwart von (S)-DHPA ist die Folge der Erniedrigung des Wachstums des Virus; kontinuelle einschichtige Kulturen von menschlichen Hautfibroblasten (HSF-Zellen) in den Petri-.Schalen wurden mit dem Virus der vesikulären Stomatitis (VSV-Virus) (4,5 log10CCIDSo/0,5 ml/Schale) geimpft und nach einer Stunde bei 37 °C dem Stoff (S)-DHPA (100 ng/ ml) ausgesetzt. Die Kulturen wurden bei 37 °C inkubiert, in verschiedenen Zeitintervallen auf — 70-°C eingefroren, und der Titer des Virus in Zellenhomogenaten wurde durch Bildung von Plaquen auf L-929 Mausfibroblasten bestimmt. Die Werte der Fig. 1 dokumentieren den starken Abfall des Titers des Virus bei 100 jig/ml (S)-DHPA im Vergleich mit

5

10

15

20

25

30

35

40

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50

55

60

65

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4

dem Kontrollversuch, und zwar um 4 Ordnungen nach 48 Stunden nach der Virusinfektion.

Beispiel 2

Antivirale Wirkung von (S)-DHPA in vivo Wurde durch die Methode nach J. Gen. Virol. 5, 359 (1969) und J. Clin. Invest. 49,1565 (1970) verifiziert: 20 Tage alte NMRI Mausweibchen (durchschnittl. Gew. =15 g) wurden intranasal durch VSV-Virus (2,5 Iog]0CCID50/0,01 ml/ Maus) infiziert und anschliessend wurde (S)-DHPA (2 mg/ Maus, 133 mg/kg) wiederholt intraperitoneal in Intervallen je 1 Stunde, 1 Tag bis 4 Tage nach Infektion appliziert. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 für 14 folgende Tage angeführt. Wiederholte Dosierungen von (S)-DHPA verursachen beträchtliche Verlängerung des Überlebens (67% gegen 37,5% bei der Kontrollgruppe); der Unterschied in beiden Gruppen ist schon 9 Tage nach der Infektion bemerkbar. Seit dem 14. Tage nach der Infektion wurde in beiden Gruppen kein weiterer Todesfall registriert. Diese Versuche wurden mit verschiedenen Dosierungen von (S)-DHPA durchgeführt; wiederholte Dosierungen 0,08 mg/Maus (5,4 mg/kg) waren unwirksam, wogegen wiederholte Dosierungen 0,4 mg/Maus (27 mg/kg) signifikante Verlängerung des Überlebens gegenüber der Kontrollgruppe (55% gegen 37,5%) hervorrufen.

Toxizität von (S)-DHPA Alle Versuchstiere überlebten wiederholte Dosierungen bis zu 1000 mg/kg/Tag innerhalb von 3 bis 5 Tagen ohne irgendwelche Erkrankungszeichen. (S)-DHPA ist dementsprechend sehr wenig toxisch.

Beispiel 3

Antivirale Wirkung der Kombination von (S)-DHPA und araA

Zusammenhängende einschichtige primäre Zellenkulturen aus Kaninchennieren (PRK-Zellen) in Petri-Schalen wurden mit dem Virus Vacciniae (4,5 log10CCID50/0,5 ml/ Schale) innerhalb von 1 Stunde bei 37 °C geimpft und danach der Wirkung von (S)-DHPA, araA oder der Kombination von beiden Stoffen, und zwar in Konzentrationen 1 bis 100 ng/ml ausgesetzt. Die Kulturen wurden bei 37 ÖC inkubiert und der Titer des Virus wurde in verschiedenen Zeitintervallen durch die Plaque-Technik auf den PRK-Zellen auf dieselbe Weise wie für Virus der vesikulären Stomatitis und L-929 Mausfibroblaste, wie in Beispiel 1 angeführt wurde, bestimmt. Die in der Tabelle 2 angeführten Angaben weisen daraufhin, dass die Kombination von (S)-DHPA (30 (ig/ml) und araA (3 jig/ml) einen grösseren Abfall des Vi-rustiters als beliebiger Stoff der beiden wirksamen Verbindungen von sich selbst verursacht (sie ist ungefähr um 3 Ordnungen wirksamer).

Beispiel 4

Die hemmende Wirkung von (S)-DHPA auf die Desaminie-

rung von araA durch die Adenosin-Desaminase der Darmschleimhaut

Es wurde die Methode nach Biochem. J. 152,681 (1975), welche in der spektrophotometrischen Messung der Absorptionsabnahme von araA bei X — 265 nm beruht, verwendet. Für 50 nmol araA A265 = 0,11, für 100 nmol araA A265 = 0,16. Die Ergebnisse werden in Fig. 3 und 4 angeführt, wo sie dokumentieren, dass die Spaltungsverzögerung von araA durch (S)-DHPA der Konzentration von (S)-DHPA proportional ist.

Beispiel 5

Bestimmung der wirksamen Konzentration von (RS)-DHPA

im

Blutserum nach der intraperitonealen bzw. peroralen s Applikation an Mäuse

Zwei Gruppen je 20 Mäuseweibchen NMRI mit durchschnittlichem Gewicht von 12 g wurden einmal je 10 mg (RS)-DHPA in 0,2 ml physiologischer Lösung entweder intraperitoneal oder peroral verabreicht. Die Blutproben wur-lo den in den Intervallen 0, 20,40,80,160 und 320 Minuten nach der Applikation abgenommen und die antivirale Wirkung des Blutserums wurde auf den Gewebekulturen von menschlichen Hautfibroblasten, welche mit dem Virus der vesikulären Stomatitis (siehe Beispiel 1) infiziert wurden, be-is stimmt. Die Konzentrationen an (RS)-DHPA im Serum wurde aus der Verdünnung des Serums, welche zur Erreichung der 50%iger Inhibition nötig war, nach der Formel C = f • IDS0 berechnet, wo C die Konzentration von (RS)-DHPA in Blutserum, f die Verdünnung des Serums, welche 20 zur 50%iger Virusinhibition nötig war, und ID50 der experimentelle Wert der Konzentration von (RS)-DHPA, welche 50%ige Virusinhibition unter den Versuchsbedingungen hervorruft (20 ng/ml), bedeuten. Alle Angaben sind Durchschnittswerte der Proben aus 3 Mäusen. Die Ergebnisse des 25 Versuches sind in Tabelle 3 angeführt.

Anhand der vier folgenden Beispiele wird das erfindungs-gemässe Heilmittel mit antiviraler Wirkung erläutert:

30 Ol. Paraffin Vaselina alba (RS)-DHPA

35 Ung. Ambiderman (RS)-DHPA

Ung. Ambiderman 40 (RS)-DHPA

Präparat 1 2,75 Gew.-Teile 21,00 Gew.-Teile 1,25 Gew.-Teile

Präparat 2 47,50 Gew.-Teile 2,50 Gew.-Teile

Präparat 3 47,50 Gew.-Teile 2,50 Gew.-Teile

Präparat 4 Lösung (solutia) 9-(RS)-(2,3-Dihydroxypropyl)-adenin Zitronensäure 45 Sorbit Alkohol med.

Aqua destillata

500 mg 100 mg 1000 mg 2,5 ml ad 10 ml

In der Tabelle 1 wird die antivirale Aktivität von (S)-9-5o (2,3-Dihydroxypropyl)-adenin in den Gewebekulturen nachgewiesen, und in der Tabelle 2 wird der Synergismus der antiviralen Wirkung von (S)-9-(2,3-Dihydroxypropyl)-adenin und 9-(ß-D-arabinofuranosyl)-adenin auf die primären Zellenkulturen von durch Virus Vacciniae infizierten Kanin-55 chennieren angeführt.

In der Tabelle 3 wird das Niveau von (RS)-DHPA in Blutserum der Mäuse nach der intraperitonealen und peroralen Applikation angegeben.

Fig. 1 zeigt die graphische Darstellung der inhibierenden 60 Wirkung von (S)-DHPA auf das Wachstum des Virus der vesikulären Stomatitis in den menschlichen Hautfibroblasten; auf der Y-Achse wird der Virustiter (log10PFU/ml) angegeben, wo PFU die Einheit der Plaquenbildung bedeutet; auf der X-Achse wird die Zeit nach der Infektion in Stunden 65 angegeben; -O- Kontrolle, nach der Applikation von (S)-DHPA; Fig. 3 zeigt graphisch die Abhängigkeit der Spaltung von araA durch Adenosin-Desaminase in Gegenwart von (S)-DHPA; auf der X-Achse wird die Konzentration

5

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von (S)-DHPA in ng/'ml, auf der Y-Achse die Absorptionsabnahme bei X —265 nm angegeben; -O- 50 nmol araA,

100 nmol araA; in Fig. 4 wird Dixon's Diagramm der Abhängigkeit der Spaltung von araA durch Adenosin-Desaminase in Gegenwart von (S)-DHPA veranschaulicht; auf der X-Achse wird die Konzentration von (S)-DHPA in [igj ml, auf der Y-Achse der Kehrwert der anfänglichen Spaltungsgeschwindigkeit (1/V) angegeben; Kt = Inhibitionskonstante; -O- 50 nmol araA, 100 nmol araA.

Tabelle 1

Antivirale Aktivität von (S)-9-(2,3-Dihydroxypropyl)-adenin in den Gewebekulturen

Virus Zellen IDS0 ((xg/ml)

DNS-Viren:

Vaccinia

PRK

10-20

Vaccinia

HSF

10-20

Herpes simplex-1 Stamm KOS

PRK

10

Herpes simplex-1 Stamm KOS

HSF

20

Herpes simplex-2 Stamm 333

PRK

4-10

Herpes simplex-2 Stamm 333

HSF

7-20

RNS-Viren:

Vesiculäre Stomatitis

PRK

7-10

Vesiculäre Stomatitis

HSF

2-7

Vesiculäre Stomatitis

HeLa

> 200

Poliomyelitis-1

HSF

> 200

Poliomyelitis-1

HeLa

> 200

Coxsackia B-4

HeLa

> 200

Coxsackia B-4

Vero

> 200

Masern

Vero

<M0

Sindbis

BHK

> 200

Abkürzungen:

PRK primäre Kultur von Kaninchennieren;

HSF menschliche Hautfibroblasten;

Vero kontinuelle Zellenlinie von Affennieren:

BHK kontinuelle Zellenlinie von neugeborenen Hamsternieren.

Tabelle 2

Synergismus der antiviralen Wirkung von (S)-9-(2,3-Di-hydroxypropyl)-adenin und 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin auf die durch Virus Vacciniae infizierten primären Zel-5 lenkulturen der Kaninchennieren

Heilmittel Virustiter (logi0PFU/ml)

Zeit nach der Infektion (Tage)

12 3

1. Kontrolle (mit dem Heilmittel 3,6 5,0 5,3 nicht inkubiert)

2. (S)-DHPA (30 jig/ml)

3. araA (3 (ig/ml)

4. (S)-DHPA (30 ng/ml) + araA (3 ng/ml)

Tabelle 3

Gehalt von (RS)-DHPA im Blutserum von Mäusen nach der peritonealen und peroralen Applikation

30 Zeit (min) Konzentration von (RS)-DHPA nach der Appli kation (fxg/ml Serum)

intraperitoneal peroral

100 100

1200 1800

800 600

400 400

200 400

0

35 20

40 80 160 320

3,6

4,9

5,4

2,1

4,0

5,0

2,0

1,8

2,1

20

S

4 Blatt Zeichnungen