CS199093B1 - Antiviral agent - Google Patents

Description

Některé nukleosidové deriváty, tj. cukerné deriváty heterocykličkých sloučenin .vykazují antivirální účinek. Tak např· 9-(/^ -D-arabinofuranosyl) adenin (v dalších araA) má výraznou účinnost proti DNK-virúm nebo ribavirin (l-( -D-ribofuranosyl)-l,2,4-triazol-3-karboxamid) má Širokou antivirální účinnost na některé RNK- i DNKviry (Science 177. 705 /1972/; Chemotherapy 21· 505 /1975/·

Náklady na výrobu těchto léčiv vzhledem ke složitosti přípravy Jsou značné a jejich použití Je značně omezeno úzkým rozsahem koncentrací, v nichž mohou být aplikovány vzhledem k jejich toxicitě a odbourávání v organismu·

Tyto nevýhody odstraňuje léčebný prostředek podle vynálezu, Jehož podstatou Je, že Jako aktivní složku obsahuje (S)- nebo (RS)-9-(2,3-dlhydroxypropyl) adenin vzorce I

OH

199 093

Účinné ^- netoxické koncentrace aktivní složky Jsou od 0,1 m^g do 1000 mg/kg živé hmotnosti'při jedné dávce, ' přičemž obsah aktivní složky vzhledem k farmaceutickému nosiči může být v rozsahu 0,1 až 100 % hmotnostních.

Postup ' - přípravy (S)-enantiomeru i -racemické (RS)- formy látky vzorce I (v dalSím S-DHPA - nebo RS-DHPA) Je znám.

Obé sloučeniny mohou být připraveny reakcí l-0-p-toluensulfonyl-2,3-0-isopropyliden-D-(nebo -DL-)-glycerinu vzorce II p-ch₃c₆h₄so₂och₂ch-ch₂ . Y «· ^ЫзС ch₃ se sodnou so^lí ateninu v dimethy^ormamidu při ¹⁰⁰ °C a varem vznikléh^o - meziproduktu, s 8(56 kyselinou octovou (Collection Czech. Chem. Commun. £0, 187 /1975/)· Tak např. ae 11,4 g (40' ' mmol) látky Vzorce II a 7,8- g sodné soli adeninu (50 mmol) zahřívá v dimethyl^formamidu (1⁰° ml^{) 8 h}o^d. na 1°⁰ °C, odpaM se ve va^kuu a zb^ytek kryetaluje z methanolu. Získaný produkt se vaří 1 h s 8056 kyselinou octovou, - odpaří ve vakuu, . odparek odpaří třikrát s 50 - ml- ethanolu a zbytek se - krystaluje z methanolu. Získá se 50 až 60 % (S)nebo (RS)-9-(2,3-dlhydraxypropyl)adeninu. (S)-Fcrma: - - t.t. 202 až 203 °c[očQ25e -35,4° (c=X^{, v}od^a). CKS)-Forma: t.t. 205 až 208 °C. UV-Spektrum ^- (pH 7)J λωχ “ 260- mm, ^£max ’ ¹4⁰°0, ^Amin = ^{- 228}

Podle čs. autorského osvédčení č. 191 - 656 při kterém se (RS)-forma látky I -(RS-DHPA) získá - zahříváním adeninu s 1,2-cyklickým karbonátem glycerinu vzorce -III ®2 - CH - CH2OH

III

a hydroxidem - nebo uhličitanem sodným nebo draselným v dimethylformamidu nebo dioxanu ^při 80 až 140 ^- °C. Tak na^př. směs adentau ⁽1^,35 g, W mmo^l),^- glycerin-^^cykHckéfo karbonátu (III) (2,0 .g), uhličitanu sodného (0,3 -g) s-dimethylformamidu (25_ml) se zahřívá 1 h ve varu, odpaří - ve vakuu o - zbytek v 50 ml vroucí vody se odbarví aktivním uhlím. Po odpaření ve vakuu se zbytek krystalu je z methanolu: - získá se 60 . až 70 % (RS)-formy ^- látk^y I (RS-DHPA^ t.t. 205 - ož 206 °C, W-spe^um (voda)-: = ^-260 nm, £max “ !4000- Biologickou účinnost vykazuje výhradně D-glycero- tj. (S)-forma látky vzorce I, kdežto - L-glycero-, tj. (R)-forma je zcela neúčinná. Vzhledem k tomu, že racemický (RS)-derivát obsahuje 56 % účinné (S)-forny, je řádově stejně účinný jako (S)-enantiomer. (S)-DHPA vzorce I se vyznačuje vysokou antlvirální účinností proti RNK1 DNK-virům o velmi nízkou vlastní toxicitou. Tento účinek je zcela neočekávaný, tím

199 093 spíše, že další obdobné sloučeniny, bu³ deriváty adeninu's jinou alifatickou složkou, např. (R3)-2-hydroxypropyl, 2-hydroxyethyl, 2-aminoethyl, . -DL-alanyl-, (S)-3,4-dihydroxybutyl, (RS)-3,4-dihydroxybutyl, (RS)-threo-2.3.4-trlhydro:yybttyl. (RS)-3,5-dihydroxypentyl, 3-hydroxypropyl a 1,3-dihydroxy-2-propyl nebo-2,3-dihydroxypropylderiváty jiných heterocyklických basí, např. hypoxanthinu, uracilu, . cytosinu a thyminu žádnou významnou antivirální účinnost až do koncentrace 100 jjg/ml nevykazjí. Z ostatních příbuzných sloučenin má uvedený ' araA účinek omezený na DNK-viry a uvedený ribavirin je vysoce cytotoxický.

Výhodou ^předmětnáho ^léčiva je Jeho zna^čn^á sM^st, kter^á umořuje a-teri^zac! neu^trálních, slabá kyselých nebo slabě alkalických roztoků za zvýSené teploty, jeho prakticky neomezená stálost v pevném stavu a konečně i Jeho dostupnost, zvláště u racemického derivátu (RS)-DHPA.

Další výhodou je jeho poměrně Jednoduchá příprava a nízké výrobní náklady. Pro průmyslovou výrobu ee jedná o řádově nižší . výrobní náklady ve srovnání s přípravou výše uvedených známých antivirálních preparátů.

Farmaceutické preparáty s obsahem (S)-DHPA nebo (RS)-DHPA jako aktivní složky mohou mít formu pudrů, suspenzí, roztoků, sprayů, emulzí, mastí a krémů a mohou být použity pro -parenterální (intravenosní, intradermální, intramuskulární, intrathekální ap.) aplikace nebo pro orální, rektální, intravaginální a intranasální podání nebo lokální aplikace (lese kožní, slizniční, oční ap.). - Tyto . preparáty je možno připravit smíšením nebo rozpuštěním účinné látky nebo účinných látek s farmaceuticky použitelnými nosiči k takovým účelům používanými, např. vodnými nebo nevodnými -rozpouštědly, stabilizátory, emulgátory, látkami stabilizujícími suspenze, smáčedly sp., vhodnými sditivy (např. polyethylenglykoly) a v případě potřeby 1 s barvivý nebo ' aromatizujícími látkami. Preparáty mohou- obsahovat různou koncentraci aktivní složky podle povahy -podání a podle povahy onemocnění, nejméně vSak 0,1 % a nejvýše 100' % hmotnostních.

V. dalším Je biologická účinnost (S)-DHPA a (RS)-DHPA osvětlena . v příkladech, aniž se tím jakkoliv omezuje.

Příklad 1

An^tivir^áln^{í úči}nnost ^(S)-^DHPA na lánových kultur^ách

Buňky v ^ka^ždé ku^uře ^byly in^fikovány ston^obkem dávky viru ^potřebné k infek^ci % buněk a 1 h po infekci byl přidán (S)-DHPA v koncentraci 0-40 <ug/ml (v některých případech až 200«^/βΙ). Pro každou kombianci hostitelských buněk a viru byla stanovena

IDjO* koncentrace (S)-DHPA potřebná k 50% potlačení cytopathického ' účinku viru stanoveného kontrolním pokusem (podle L.J. Rosenthal, I.L. Schechmalster, Tissue

Culture, str. 510, Academie Prese, Nev York 1973). Výsledky těchto pokusů ' jsou uvedeny v ' Tabulce I. Je zřejmé, že některé viry na příklad vakcinie, herpes simplex typu 1 a 2,

199 093 spalničky, vesikulární stomatitls jsou vůči (S)-DHPA velmi citlivé, kdežto jiné jako poliomyelltis, Coxsackie,Sindbis nejsou ovlivněny. Inhibiční účinek cytopathogenního působení viru v - přítomnosti (S)-DHPA je důsledkem snížení nárůstu viru: souvislé jednovrstevné kultury lidských kožních fibroblastů (HSP-bunky) v Petriho miskách byly očkovány virem vesikulární stomatitidy (VSV-virus) (4,5 log^Q 0010^//0,5 ml/mlska) a po 1 h při 37 °C vystaveny látce (S)-DHPA (lOO<ug/ml) (CCXD^q je dávka min.- potřebná k infekci 5^0ti % bun^ěk). Kuitury ^{byly i}n^ku^bován^y pM ³7 °^C, v různých SsovýS intarvataS ^- zmrazený na -7⁰ °^C a ^titr viru v buněčných homogentoeS stanoven toorbou ^pla^{ků -} na L-929 myěích fibrobtastach. Údaje obr. ^{1 d}o^kumen^tuj^í sdný podes^{- tit}ru viru při . ^/nú. ⁽S⁾-D^HpA ve srovnání в kontrolním pokusem, a to o čtyři řády po 48 h od infekce virem.

Příklad 2

Antivirální účinek (S)-DHPA in vivo byl ověřen metodou podle J. Gen. Virol. - , 359 (1969) a J. Clin. Invest. 42, 1565 (1970): 20 dní staré NMRI myší samice - (prům. hmotnost 15 g) byly infikovány intranasálně VSV-virem (2,5 log^ OCID^^/O^Ol ml/myš) a potom byl opakovaně intraperitonálně aplikován (S)-DHPA (2 mg/nyš, 133 mg/kg) v intervalech lh, 1 den až 4 dny po infekci. Výsledky Jsou uvedeny v obr. 2 pro 14 následujících dní. Opakované dávky - (S)-DHPA působí výrazné prodloužení přežití (67 % proti 37,5 % u kontrolní skupiny); rozdíl v obou skupinách , je patrný Již 9 dní po infekci. Od čtrnáctého dnu po infekci nebylo zaznamenáno další úmrtí v obou skupinách. Tyto pokusy byly provedeny s různými dávkami (S)-DHPA opakované dávky 0,08 mg/myč (5,4 mg/kg) byly neúčinné, kdežto opakované dávky 0,4 mg/myš (27 mg/kg) vyvolávají signifikantní prodloužení přežití oproti kontrolní skupině (55 % proti 37,5 %). Toxicita (S)-DHPA: Všechna pokusná zvířata přežila opakované , dávky do 100 mg/kg/den - po dobu 3 až 5 dnů bez,Jakékoliv známky onemocnění.

(S)-DHPA Je tedy velmi málo toxický.

Příklad 3

Stanovení účinné koncentrace (RS)-DHPA v *krevním séru po intraperitoneální a perorál- , ní aplikaci myčím. Dvěma skupinám po 20 myších samicích NMRI o průměrné hmotnosti 12 g byl^o jednorá^zově podán^o * po ¹0 mg (RS)-DHPA v ⁰,2 ml fyztotogickSo roztoku ^buS intoaperitoneálně* nebo* perorálně. Vzorky krve byly odebírány v časech 0, 20, 40, 80, 160 a 320 *^min^ut po ^aplikaci a antivir^áln^{í úč}inek bevního s^éra ^ьу. stanoven na tatóových ^ku^lturách lidských kožních- fibroblastů infikovaných virem vesikulární,stomatitidy (viz Příklad 1). Koncentrace (RS)-DHPA v séru byly vypočteny - ze , zředění séra, potřebného k dosažení 50% inhibice viru podle vzorce c =.f . . id₅₀, kde - - C Je koncentrace (RS)-DHPA v krevním séru, f Je zředění séra potřebné k dosažení

50% inhibice viru a je experimentální hodnota - koncentrace (RS)-DHPA vyvolávající

50% inhibicí viru za pokusných podmínek (2O%u/m)· Všechna stanovení jsou průměrem vzorků ze tří mši· Výsledky pokusu jsou uvedeny v tabulce 3. V tabulce 1 je doložena antlvirální aktivita (S)-9-(2,3-dihydroxypropyl) adeninu ve tkáňových kulturách·

V tabulce 2 je uvedena hladina (RS)-DHPA v krevním seru m^í po íntraperítoneální a.perorální aplikaci· ,

Na obr· 1 je znázorněn graf vyjaddájící inhibiění účinek (S)-DHPA na nárůst víru vesikulární stomtitidy v lidských kožních fibr oblastech· ' Na ose y je znázorněn tltr viru (logjQ PFJ/m), kde PFU je jednotka tvorby plaků; na ose x je znázorněna doba po infekci v hodinách; -·- konnrola, -O- po aplikaci (S)-DHPA; na obr· 2 je znázorněn graf vyjadřující artivirální účinek (S)-DHPA na meších infikovaných intranasálně virem veeikulární storn^^ay; na ose x je znázorněn počet dní po infekci; na ose y je vynesena celková úmtnost v %; -·- konnrola, -0- (S)-DHPA; na obr· 3 je znázorněna graficky závislost štěpení araA adenosindeaminasou v přítomnooti (S)-SHPA; na ose x je znázorněna koncennrace (S)-DHPA v %g/ml, na ose y pokles absorbance při A= 265 nm; -·- 50 nmol araA, -0- 100 nmol araA; na obr· 4 Dixonův diagram závislosti’štěpení araA adenosindeaminasou v přítomnosti . (S)-DHPA; na ose x je znázorněna koncentrace (S)-DHPA v %iu/mL_t na ose y převrácená hodnota počáteční rychlosti štěpení (1/V); Kj = inhibiční konstanta; -·- 50 nmol araA, -0- 100 nmol araA·

Tabulka - 1

A^nt^i^v-irá^l^zí aktivita (S)-9-(2,3-dihydroxyprspyl) adeninu ve tkáňových kulturách

Virus DNKviry:	Buňky	i^d50 Q^m.)
Vakcinie	PRK	10 až- 20
Vakcinie	HSF	10 až 20
Herpes simplex- 1 kmen KOS .	PRK	10
Herpes simplex- 1 kmen KOS	HSF	20
Herpes simplex- 2 kmen 333	PRK	4 až 10
Herpes simplex- 2 kmen 333	HSF	7 až 20
RNKvvry:
Veeikulární stomaaitis	PRK	7 až 10
Veeikulární Atomarnis	HSF	2 až 7
VcelkU-ámí sto^^tis	HeLa	>200
Polissnyeltie-1	•HSF	>200
Poliomeeit is-1	HeLa	>200
Coxsackie B-4	HeLa	>200

б

199 093

Coxsackie B-4	Věro	>200
Spalničky		Věro	4 až 40
Sindbis		BHK	>200
Zkratky i
PRK.....	přímokultura králičích ledvin; HSF .	···· lidské kožní fibroblasty:

Věro.....kontinuální linie buněk opičích ledvin; BHK.....kontinuální linie buněk ledvin křečka.

Tabulka 2

Hladina (RS)-DHPA v krevním aeru nyěí po intraperitoneální a perorální aplikaci

бае (min)	Koncentrace (RS)-DHPA (jpg/ml séra) po aplikaci
intraperitoneální	perorální
0	100	100
20	1200	1800
40	800	600
80	400	400
160	200	400
320	200	400

P ft E D Μ £ T VYNÍLBZU

Claims (4)

1. P ft E D Μ £ T VYNÍLBZU

   Léčebný prostředek a antivirálníв účinkem, vysnačený tím, že jako aktivní (S)- nebo (RS)-9-(
2. 2,
3. 3-dihydroxypropyl) adenin vsorce I složku
4. 4 výkresy (I)

   199 093

   1--1--1---1--1--1—I—i—г г/

   О 5 6 7 8 9 1011 121314

   Obr. 3

   Obr. 2