CH632164A5

CH632164A5 - Verfahren zur herstellung einer stabilen thymosinfraktion 5 und so erhaltene thymosinfraktion 5.

Info

Publication number: CH632164A5
Application number: CH51178A
Authority: CH
Inventors: Weldon Courtney Mcgregor; Harold Leon Newmark; Armin Hermann Ramel
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1977-02-22
Filing date: 1978-01-18
Publication date: 1982-09-30
Also published as: SE444647B; PH13858A; DK78378A; DE2807202C2; NZ186489A; NL7801422A; IT7819791A0; DE2807202A1; NL189281C; BE864139A; IT1092337B; FR2380782A1; FR2380782B1; IE46409B1; GB1546027A; AU516946B2; AT363177B; IE780335L; US4082737A; ZA78890B

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines festen, stabilen, endo-toxin- und pyrogenfreien Thymosinfraktion 5-Präparates, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) eine wässrige, mit einem flüchtigen, schwach basischen Puffer auf ein pH von 7-8 gepufferte Lösung der Thymosinfraktion 5 durch eine Membran mit einer Molekulargewicht-Ausschlussgrenze von 10 000 ultrafiltriert,

(b) dem Permeat ein phenolisches antimikrobielles Mittel sowie eine Puffersubstanz, die bei der Rekonstitution einen pH-Wert von 7-8 garantiert, zusetzt und

(c) das Permeat lyophilisiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung der Thymosinfraktion 5 mit Ammoniumbicarbonat gepuffert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des verwendeten Ammoniumbi-carbonates 0,1-0,5 M ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als phenolisches antimikrobielles Mittel Phenol verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Puffersubstanz in Verfahrensschritt (b) Natriumbicarbonat verwendet.

6. Festes, stabiles, endotoxin- und pyrogenfreies Thymosinfraktion 5-Präparat, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Hauptbestandteil die Thymosinfraktion 5 und als Nebenbestandteile eine geringe aber wirksame Menge eines phenolischen antibakteriellen Mittels und einer Puffersubstanz, die bei der Rekonstitution einen pH-Wert von 7-8 garantiert, enthält.

7. Präparat gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es als Puffersubstanz Natriumbicarbonat enthält.

8. Präparat gemäss einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass es als antimikrobielles Mittel Phenol enthält.

Die Thymosinfraktion 5 ist ein Proteingemisch mit Hormonaktivität, das bei der Regulation der zellgebundenen Immunität eine Rolle spielt. Ein Verfahren zur Herstellung der Thymosinfraktion 5 ist in der US-Patentschrift Nr. 4 010 148 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird bereits von einer Ultrafiltration Gebrauch gemacht, jedoch ist das Endprodukt noch nicht völlig endotoxin- und pyrogenfrei wegen der sich noch anschliessenden Verfahrensmassnah-men.

Die Anwendung der Ultrafiltration zur Entfernung von Pyrogenen aus injizierbaren Arzneimittelpräparaten ist bereits bekannt (vgl. z.B. C.A. 79,129041z [1973]; C.A. 80, 112675g [1974]; C.A. 83,168487b [1975]). Zusätzlich haben Rubio und Lopez (Appi. Microbiol. 23,211 [1972]) die Reinigung von Endotoxinen aus Pseudomonas aeruginosa unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewicht-Ausschlussgrenze von 100 000 beschrieben. Über die Konzentration des Endotoxins im Permeat wurde allerdings nichts berichtet.

Es wird allgemein angenommen, dass die meisten Pyro-gene bakterielle Endotoxine sind und zwar Komplexe von Proteinen, Phospholipiden und Lipopolysacchariden mit einem Molekulargewicht von 1 — 20 x 10®. Obwohl gezeigt werden konnte, dass der Lipopolysaccharidanteil beispielsweise von Salmonella sp.- Endotoxin ein Molekulargewicht von etwa 3350 besitzt, haben diese Lipopolysaccharide eine ausgesprochene Tendenz zur Aggregation, so dass unter normalen Laborbedingungen das scheinbare Molekulargewicht von Endotoxinen und/oder Lipopolysacchariden wesentlich 5 höher ist.

Es wurde nun gefunden und stellt einen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar, dass Endotoxine und Pyrogene dadurch praktisch vollständig aus Lösungen der gereinigten Thymosinfraktion 5 entfernt werden können, dass man als io letzten Verfahrensschritt eine Ultrafiltration durchführt. Verwendet man bei dieser Ultrafiltration eine Membran mit einer vom Hersteller mit 10 000 angegebenen Molekulargewicht-Ausschlussgrenze, so können die Bestandteile der Thymosinfraktion 5 diese Membran passieren, während die i5 Endotoxine zurückgehalten werden.

Wiederholt konnte gezeigt werden, dass die Bestandteile der Thymosinfraktion 5 im Anschluss an eine Entsalzung an einer Säule in aggregierter Form vorlagen. Diese Aggregate konnten eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 2o 10 000 nicht mehr passieren, obwohl dies in einem vorangegangenen Verfahrensschritt noch der Fall war. Die Aggregate konnten zerbrochen werden durch Erhöhung der Ionenstärke mittels verschiedener Salze bei pH 7 oder darüber. Für das vorliegende Verfahren wurde Ammoniumbi-25 carbonat gewählt, weil damit ein pH-Wert von 8 erhalten wird, bei dem die Thymosinfraktion 5 leicht löslich ist und das Salz bei der Lyophilisation verdampft. Die routinemäs-sig verwendete Konzentration betrug 0,1-0,5 M, wobei das Salz direkt dem Säuleneluat zugesetzt wurde. Bei niedriger 30 Ionenstärke, d.h. ohne den Zusatz eines Salzes, betrug der Proteinverlust während der Ultrafiltration bis zu 50% und der Aktivitätsverlust 100%.

Darüberhinaus wurde gefunden, dass damit eine vollständige und reproduzierbare Entfernung der Endotoxine 35 und Pyrogene gewährleistet ist, das Ultrafiltrationsgerät vor jedem Einsatz sorgfaltig gereinigt und entgiftet werden muss. Es wurden daher auch jedesmal die Filtrationspatronen zunächst mit 1-2 M Natriumchloridlösung und dann mit destilliertem Wasser gewaschen bevor sie in Natriumhypo-40 chloritlösung (100 ppm) aufbewahrt wurden. Unmittelbar vor der Benutzimg wurden die Patronen sowie Vorfilter und Zuleitungen über Nacht in 1 %iger wässriger Natronlauge gewässert.

Während nach diesem Verfahren eine sterile, endotoxin-45 und pyrogenfreie Lösung der Thymosinfraktion 5 erhalten wird, stellt dies noch keine für die Aufbewahrung und klinische Anwendung des Präparates geeignete Form dar. So war es bisher notwendig, das Material unter aseptischen Bedingungen in sterile Ampullen abzufüllen und in gefrorenem so Zustand (in Trockeneis) zu versenden. Bis zur tatsächlichen Verwendung musste es weiter in Trockeneis aufbewahrt werden. Das Auftauen unmittelbar vor der Anwendung war zeitaufwendig und unbequem. Ausserdem bestand stets die Gefahr, dass durch unbeabsichtigtes Erwärmen während des 55 Versandes oder der Lagerung das Wachstum doch noch vorhandener Mikroorganismen angeregt wurde, da die zu einem hohen Prozentsatz aus Polypeptiden bestehende Thymosinfraktion 5 einen ausgezeichneten Nährboden darstellt.

Erfindungsgemäss wurde nun weiter gefunden, dass die 60 Thymosinfraktion 5 nach der Entfernung der Endotoxine und Pyrogene durch Ultrafiltration in eine feste, stabile Form übergeführt werden kann. Dies kann durch Lyophilisation der sterilen Lösung, die aseptisch auf sterile Ampullen verteilt wurde, geschehen. Überraschenderweise wurde dabei 65 gefunden, dass sich bei Zusatz eines phenolischen antimi-krobiellen Mittels zur Thymosinfraktion 5 vor der Lyophilisation später das gesamte antimikrobielle Mittel im Lyophilisat wiederfindet, obgleich derartige Mittel flüchtig sind

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und zu erwarten wäre, dass sie mit dem Lösungsmittel zugleich entfernt werden. Geeignete derartige phenolische Mittel sind Phenol, Kresole und physiologisch verträgliche Ester der p-Hydroxybenzoesäure, wie der Methyl- oder der Pro-pylester. Besonders bevorzugt als antimikrobielles Mittel ist Phenol. Das feste, stabile Thymosinfraktion 5-Präparat kann 0,5-25 Gew.-% und wird vorzugsweise 5-20 Gew.-% des antimikrobiellen Mittels enthalten.

Die Thymosinfraktion 5 enthält ein Gemisch von Polypeptiden mit einem isoelektrischen Punkt unterhalb pH 6, die, zwecks optimaler Auflösung bei minimaler Reizung des Gewebes der der Injektion, zweckmässigerweise bei einem pH-Wert, der genügend weit über dem des isoelektrischen Punktes liegt, gelöst werden. Um den für die Rekonstitution geeigneten pH-Wert zu gewährleisten, wird dem erfindungs-gemässen Präparat eine Puffersubstanz zugesetzt. Eine hierfür geeignete Puffersubstanz ist Natriumbicarbonat, das in genügender Menge zugesetzt wird, um der Lösung einen pH-Wert von 7-8 zu geben.

In einer bevorzugten Ausführungsform wurden 30-40 Liter entsalztes wässriges Säuleneluat mit einem Gehalt von

1-2 mg Thymosinfraktion 5 pro ml in einem, wie vorstehend beschrieben, sorgfaltig gereinigten Hohlfiber-Ultrafiltra-tionsgerät (Amicon DC-30) unter Verwendung von drei PM-10-Patronen mit einer Molekulargewicht-Ausschlussgrenze 5 von 10 000 der Ultrafiltration unterworfen. Die Ausgangslösung wurde mit einem flüchtigen, schwach basischen Puffer, z.B. Ammoniumacetat oder, vorzugsweise, Ammonium-bicarbonat (0,1-0,5 M), gepuffert, wodurch ihr nicht nur der richtige pH-Wert, sondern auch die erforderliche lonen-io stärke verliehen wurde. Der Gehalt der Lösung an Endotoxinen vor der Ultrafiltration betrug mehr als 1 mg/ml, während im Ultrafiltrationseluat nach Lyophilisation selbst bei einer Proteinkonzentration von 20 mg/ml mit dem Limu-lus-Lysat-Assay keine Endotoxine mehr nachgewiesen wer-15 den konnten. Darüberhinaus war der im Kaninchen-Fieber-Test ermittelte Pyrogengehalt des Permeats akzeptabel.

Dem Permeat wurden pro Thymosinfraktion 5 4,5 mg Phenol zugesetzt und die sterile, gepufferte Lösung wurde 20 nach Abfüllung in sterile Gefässe lyophilisiert (Endtemperatur 20-30 °C bei einem Vakuum von 10-20 n Hg).