CH621799A5 - - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von 4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin-Hydrochlorid der Formel ho co-ch2oh

(v)

dadurch gekennzeichnet, dass 4/-Epi-6/-hydroxydaunomycin der Formel

1 0 oh c - ch, *-oh

(I)

- 4' NH

in einem organischen Lösungsmittelgemisch mit einer Lösung von Brom in Chloroform unter Bildung des 14-Brom-4'-Epi-6'-hydroxydaunomycins der Formel

GOCH Br ho

•oh

(IV)

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reagieren gelassen wird und dieses Zwischenprodukt einer kontrollierten Hydrolyse mit einer wässrigen Natriumformiatlö-sung unterworfen wird, worauf das gewünschte Produkt als Hydrochlorid isoliert wird.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumorglycosids 4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin. Der naheliegende, jedoch nicht patenthindernde Stand der Technik ist z.B. enthalten in US-PS 3 784 541 (8. Jan. 1974) Culbertson et al., US-PS 3 803 124 (9. Apr. 1974) Arcamone et al., und Pigman «The Carbohydrates» - Academic Press Inc. New York, N. Y., Seiten 208-213.

Die neue, erfindungsgemäss erhältliche Verbindung zeigt sowohl in vivo als auch in vitro antimitotische Wirksamkeit und ist daher als therapeutisches Mittel zur Behandlung von Tumor- und Viruserkrankungen bei Menschen verwendbar.

Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Herstellung von 4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin der Formel ho co-cii oh »oh

(v)

Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass 4'- Epi-6'-hydroxydaunomycin der Formel in einem organischen Lösungsmittelgemisch mit einer Lösung von Brom in Chloroform unter Bildung des 14-Brom-4 -epi-6 -hydroxydaunomycin der Formel

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4

HO

COCH^Br

(IV)

reagieren gelassen wird und dieses Zwischenprodukt einer kontrollierten Hydrolyse mit einer wässrigen Natriumformiat-lösung unterworfen wird, worauf das gewünschte Produkt als 25 Hydrochlorid isoliert wird.

Beispiel 1

0,25 g 4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin (I) wurden in einer Mischung aus 3,5 ml Methylalkohol und 10 ml wasserfreiem . 30 Dioxan gelöst und unter Rühren mit 0,9 ml einer Lösung von 0,88 g Brom in 10 ml Chloroform behandelt. Die Reaktionsmischung wurde nach einer Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren in 75 ml Äthyläther gegossen. Das rohe 14-Brom-4'-epi-6'-hydroxydaunomycin wurde abfiltriert und in einer 35 Mischung aus 5 ml Aceton und 5 ml 0,25N Bromwasserstoffsäure gelöst. Nach 12 Stunden bei Raumtemperatur wurde die saure Lösung zuerst mit Chloroform extrahiert, um die Agly-cone zu entfernen, und dann mit n-Butanol extrahiert. Es wurde mehrere Male extrahiert, bis das gesamte gefärbte 40 Material in die organische Schicht übergegangen war. Nach Entfernen des n-Butanols im Vakuum wurden 0,27 g 14-Bromderivat erhalten. Dieses Produkt wurde in 10 ml Wasser gelöst und mit 0,5 g Natriumformiat behandelt.

Nach 48 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reak- « tionsmischung im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 30 ml einer Mischung aus Chloroform-Methanol (2:1, bezogen auf das Volumen) gelöst und mit 10 ml einer 1 %igen wässerigen NaHCCb-Lösung gewaschen. Die wässerige Phase wurde oftmals mit Chloroform extrahiert, bis das so gesamte gefärbte Material in das organische Lösungsmittel übergegangen war. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Äquivalent IN Salzsäure in wasserfreiem Methanol ss behandelt. Durch Zusetzen von 10 Volumina Äthyläther wurden 0,125 g 4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin (V) als Hydrochlorid erhalten, Fp. 180°C (Zers.), [a]&° = +216° (c = 0,01 in CH3OH), chromatographisches Rf aus Kieselgel-HF-Platten (Merck) unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Chloro- «« form-Methanol-Wasser (130:60:10, bezogen auf das Volumen) : 0,5.

Biologische Wirksamkeit Materialien und Methoden In vitro-Studien HeLa-Zellen wurden der aktiven Verbindung 2-8-24 Stunden ausgesetzt, worauf die Verbindung entfernt und die

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Zellen auf 5 mm Falcon-Kunststoffscheiben (200 Zellen pro Platte) in Wachstumsmedium gesät wurden. Die Koloniezahl wurde 5 Tage später mikroskopisch festgestellt. Mausembryo-fibroblaste (MEF) wurden auf 35 mm Falcon-Kunststoffscheiben aufgelegt, 24 Stunden später mit Moloney-Sarkomvirus (MSV) infiziert und 3 Tage lang mit unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindungen behandelt. Die Anzahl der Herde an transformierten Zellen wurde 5 Tage nach der Infektion mikroskopisch festgestellt. Nichtinfizierte MEF wurden auf ähnliche Weise behandelt; am Ende des Versuches wurden die Zellen in einem Hämozytometer gezählt. Bei allen Versuchen wurden die Zellen in einem 5 %igen C02-Inkubator bei 37°C bebrütet.

Die Verbindung wurde in destilliertem Wasser gelöst und dann im Kulturmedium verdünnt.

Die Ergebnisse sind als IDso (Hemmungsdosis 50%) angegeben, berechnet auf Basis beeinflusster Zellen.

In vivo-Studien

Die Antitumorwirksamkeit der zu untersuchenden Verbindung wurde an Bauchwassersucht-Sarkom 180 getestet. 3 Monate alte Mäuse vom Stamm CD 1 wurden verwendet. Bauchwassersucht-Sarkom 180-Zellen wurden intraperitoneal eingeführt (106 Zellen pro Maus). Die Verbindung wurde in destilliertem Wasser gelöst, dann in einer Ringer-Lösung verdünnt und 1 Tag nach der Tumorimplantation intraperitoneal verabreicht (10 ml/kg Körpergewicht).

Die Toxizität wurde durch makroskopische Autopsie, hauptsächlich als Reduktion der Milzgrösse, bewertet. Ein Vergleich der Wirksamkeit der Verbindungen im verwendeten Dosisbereich mit unbehandelten Kontrollen basierte auf der maximalen Zunahme der mittleren Überlebenszeit. Die Anzahl der lange Zeit überlebenden Tiere (LTS) bezieht sich auf tumorfreie Mäuse am Ende des Versuches (60 Tage).

Ergebnisse

Die Wirksamkeit der untersuchten Verbindung im Vergleich mit der bezüglichen Stammverbindung Adriamycin auf den getesteten «in vitro »-Systemen ist in Tabelle I angegeben. Die Verbindung zeigt auf HeLa-Zellen, auf MSV-Herde und auf MEF-Proliferation eine geringere Wirksamkeit als die Stammverbindung.

Der bei Bauchwassersucht-Sarkom 180 beobachtete Effekt ist in Tabelle II angegeben. Die optimale Antitumordosis (d. h. die Dosis, bei der maximaler Antitumoreffekt gefunden wurde) betrug 10 mg pro kg für das getestete neue Derivat.

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Bei der optimalen Dosis war die Antitumorwirksamkeit, beurteilt durch Zunahme der Lebensdauer der behandelten Mäuse im Vergleich zu Kontrollen, niedriger als jene, die nach Behandlung mit Adriamycin beobachtet worden war.

Was die Toxizität betrifft, ein wichtiges und oft bestimmen- 5

des Element, das nach längerer Behandlung mit hohen kumulativen Dosen von Antitumorantibiotika in Betracht gezogen werden muss, kann beobachtet werden, dass das neue getestete Derivat mit Sicherheit weniger toxisch ist als die Stammverbindung.

Tabelle I

«In vitro »-Wirksamkeit von 4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin und 4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin. IDso (ng/ml)

Laboratoriumscode

Verbindung

HeLa-Zellen klonierende

Wirksamkeit

MSV-Herd-bildung

MEF-

Proliferation

Zeit des den Verbindungen Ausgesetztseins (Std.)

2

8

24

72

72

IMI 31

Adriamycin °

4 '-Epi-6 ' -hy droxyadriamycin

280 900

110 1000

18 1000

2,5 25

7 50

0 = Mittelwerte verschiedener Versuche

Tabellen

Wirksamkeit von 4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin und 4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin auf Bauchwassersucht-Sarkom 180 *

Laboratoriumscode Verbindung

Dosis (mg/kg)

T/C °

%

LTS +

Tox **

0,5

142

1/10

1

183

25/159

Adriamycin n

2

210

30/125

5

243

27/125

7/125

10

212

18/139

18/139

7,5

143

1/10

IMI 31 4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin

10

162

2/10

15 134 2/10 nicht toxisch in einer Dosis von 15 mg/kg

* = 1 Behandlung i.p. am 1. Tag

° = mittlere Überlebenszeit in % gegenüber Kontrollen + = lange Zeit Überlebende bei 60 Tagen

** = Mäuse, die aufgrund toxischer Wirkungen starben, gegenüber der Gesamtzahl D = Durchschnittswerte einer Anzahl von Versuchen

Die optimalen Dosen sind unterstrichen.

B