CH618707A5

CH618707A5 -

Info

Publication number: CH618707A5
Application number: CH1395075A
Authority: CH
Inventors: Federico Arcamone; Alberto Bargiotti; Giuseppe Cassinelli; Aurelio Di Marco
Original assignee: Farmaceutici Italia
Priority date: 1974-10-29
Filing date: 1975-10-28
Publication date: 1980-08-15
Also published as: FR2289203A1; YU37119B; GB1470860A; JPS6056720B2; SE7512005L; DK146803B; YU293381A; AT340591B; US4025623A; DK482175A; NL7512489A; YU269575A; BE834939A; ES442144A1; JPS5168561A; SU646913A3; SE423996B; DE2548087A1; ZA756732B; CA1046509A

Description

618707

2

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von 4'-Epi-6'-hydroxydaunomy-

OH

Vv

OH

f 1.

OH

COCH,

'•■OH

(II)

dadurch gekennzeichnet, dass Daunomycinon in einem organischen Lösungsmittel und in Anwesenheit eines Säurekatalysators mit l,2,3-Trideoxy-4,6-di-0-(p-nitroben-zoyl)-3-trifluoracetamido-L-arabino-hex-l-en-pyranose der 25 Formel

(III)

unter Bildung des geschützten glycosidischen a-7-0-[4',6'-Di- Herstellung von 4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin der Formel O-^-nitrobenzoy^-S'-trifluoracetamido-L-arabinoJ-daunomy- 45 cinons reagieren gelassen wird, aus welch letzterem nach alkalischer Behandlung zur Entfernung der Schutzgruppen das gewünschte Produkt als Hydrochlorid gewonnen wird.

so

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein "Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumorglycosids 4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin. Der naheliegende, jedoch nicht patenthindernde Stand der Technik ist zum Beispiel enthalten in US-PS 3 784 541 (8. Jan,, 1974) Culbertson et al., US-PS 3 803 124 (9. Apr., 1974) Arcamone et al., und Pigman «The Carbohydrates» - Academic Press Inc. New York, N. Y., Seiten 208-213.

Die neue, erfindungsgemass erhältliche Verbindung zeigt sowohl in vivo als auch in vitro antimitotische Wirksamkeit und ist daher als therapeutisches Mittel zur Behandlung von Tumor- und Viruserkrankungefi bei Menschen verwendbar.

Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur

55

«0

65

durch Kondensation von Daunomycinon der Formel

3

618 707

0C1Î3 0

COCH. '••OH

(II)

mit l,2,3-Trideoxy-4,6-di-0-(p-nitrobenzoyl)-3-trifluor- acetamido-L-arabino-hex-l-en-pyranose der Formel

(III)

unter Bildung der Glycosidbindung. Durch die Entfernung der so gebildet wird und das ß-Anomer in der Reaktionsmischung

Schutzgruppen am Zuckerrest wird die biologisch aktive Verbindung der Formel (I) erhalten, die als Hydrochlorid isoliert wird. Es ist sehr wichtig, dass nach den Bedingungen des erfin-dungesgemässen Verfahrens praktisch lediglich das a-Glycosid

HO

nur in sehr geringer Menge vorhanden ist.

Die reaktive geschützte Verbindung (ni), die mit Daunomycinon (II) kondensiert wird, ist ein neues Zwischenprodukt, das von 3-Amino-2,3-dideoxy-L-arabinohexose der Formel

OH

(VI)

HO

stammt. Dieser Aminozucker war bisher in der L-Reihe unbekannt und wurde zum ersten Mal erfindungsgemäss nach folgender Verfahrensweise erhalten. L-Glucose wurde nach in der Literatur für das D-Isomer bekannten Verfahrensweisen (G. N. Bollenback «Methods in Carbohydrate Chemstry» II,

326,1963, Acad. Press.; L. F. Wiggins, ibid, II, 188,1963; 45 A. C. Richardson «Carbohydrate Research, 4, 422 [1967]) in dasMethyl-3-azido-4,6-0-benzyliden~2,3-dideoxy-a-L-arabi-nohexopyranosid der Formel

OCH

(VII)

übergeführt. Diese Verbindung wird durch katalytische Hydrierung in das 3-Aminoderivat der Formel

0CH„

(VIII)

618 707

4

übergeführt. Nach Entfernung des Benzylidensubstituenten durch Verwendung von methanolischem Chlorwasserstoff wird einMethyl-3-amino-2,3-dideoxy-a-L-arabinohexopyranosid der Formel

OCH.

(IX)

erhalten, das bisher auch in der D-Reihe unbekannt war, welches durch Säurebehandlung in die gewünschte Verbindung (VI) übergeführt wird, die als Hydrochlorid isoliert wird.

Die Verbindung (VI) wird mit Trifluoracetanhydrid und anschliessend mit einem niederen aliphatischen Alkohol behandelt, wobei das N-Trifluoracetylderivat der Formel

HO

OH

(X)

erhalten wird, das schliesslich mit p-Nitrobenzoylchlorid in Pyridin umgesetzt und danach einer milden alkalischen Behandlung unterzogen wird, wobei l,2,3-Trideoxy-4,6-di-0-(p-nitrobenzoyl)-3-trifluoracetamido-L-arabino-hex-l-en-pyr-anose (HI) in guten Ausbeuten erhalten wird.

Herstellung des Zwischenproduktes 1,2,3-Trideoxy-4,6-di-0-(p-nitrobenzoyl)-3-trifhioracetamido-L-arabino-hex-l-en-pyranose (IH) 2,85 g Methyl-3-azido-4,6-0-benzyliden-2,3-dideoxy-a-L-arabino-hexopyranosid (VII) wurden in 40 ml wasserfreiem Methanol gelöst und bei 4,2 kp/cm2 bei Raumtemperatur in Anwesenheit von Raney-Nickel 3 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Der Rückstand wurde aus Äthylacetat kristallisiert, wobei 2,17 g Methyl-3-amino-4,6-0-benzyliden-2,3-dideoxy-a-L-arabino-hexopyranosid (VIII) erhalten wurden.

Fp. 95-96°C, [a]g> = -86° (c = 0,5 CHCb). Ausbeute 84%. NMR (CDCb): 1,3-2,3 ô (m, 2H, C(2)H2), 1,4 ô (breites s, 2H, NH2), 3,2-4,4 ô (Multipletts, 5H, C(3)H, c(4)H, C(5)H, c(6)H2), 3,37 ô (s, 3H, CHsO), 4,76 ô (dd, J= 3,5 Hz und J < 1Hz, 1H, C(l)H), 5,57 ô (s, IH),

O

+

25

HsCe' O

+ +

m/e 149 (CéH5-CH= O-CH2-CHO), m/e 105 (CeHs-CÖ).

2,15 g der Verbindung (VIII) wurden in 40 ml 0,5 N methanolischem Chlorwasserstoff gelöst und die Mischung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde auf das halbe Volumen eingeengt, wasserfreier Äther wurde zugesetzt und die erhaltenen Kristalle abgenutscht und mit ein wenig trockenem Äther gewaschen, wobei 1,5 g Methyl-3-amino-2,3-dideoxy-a-L-arabino-hexopyranosid (IX) erhalten wurden, Fp. 120°C (Zers.); [aß0 = -92°(c = 0,4H2O). Ausbeute 87 %.

NMR (D2O): 1,5-2,5 ô (m, 2H, C(2)H2), 3,2-4,0 ô (Multipletts, 5H, C(3)H, C(4)H, C(5)H, C(6)H2), 3,41 ô (s, 3H, CHsO-), 4,98 ô (dd, J= 3Hz und J= 1,5 Hz, 1H, C(l)H). Massespektrum: m/e 178 (M+l), m/e 146 (M—31), m/e 86

+ 321 +

(H2N= CH-CH= CH-OCHs), m/e 72 (H2N= CH-CH2

-CHO), m/e 59 (H2N= CH-CH-OH), m/e 44 (

30

1,5 g Aminoglycosid (IX) wurden 5 Stunden lang in N Salzsäure am Rückfluss gehalten. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur mit Amberlite IR 45 (OH-)-Harz geschüt-35 telt, bis der pH-Wert 5 betrug. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum auf das halbe Volumen eingedampft und dann gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde aus Metha-nol-Äthylacetat kristallisiert, wobei 1,33 g 3-Amino-2,3-dideoxy-L-arabino-hexose (VI) als Hydrochlorid erhalten 40 wurden, Fp. 155-157°C (Zers.). [a]g> = —55° (c = 0,5 H2O). Ausbeute 95%.

NMR (D2O): 1,7-2,7 ô (m, 2H, C(2)H2), 3,3-4,1 ô (Multipletts, 5H, C(3)H, C(4)H, C(5)H, C(6)H2), 5,06 ô 45 (dd, J = 10 Hz und J = 2 Hz, 0,4H, C(l)Hax), 5,46 ô (breites s, W1/2H = 7 Hz, 0,6H, C(l)Häq).

Zu einer Suspension von 1,25 g der Verbindung (VI) in trockenem Äther wurden 7,6 ml Trifluoracetanhydrid unter 50 Kühlen und Rühren zugesetzt. Die Mischimg wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und die erhaltene klare Lösung im Vakuum eingedampft. Der feste Rückstand wurde in 120 ml wasserfreiem Methanol gelöst und 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten. Nach Entfernen des Lösungs-55 mittels wurde der Rückstand aus Aceton-Chloroform kristallisiert, wobei 1,72 g 2,3-Dideoxy-3-trifhioracetamido-L-arabi-nohexose (X) erhalten wurden, Fp. 177°C, [a]g> = —58° (c = 0,5 in Dioxan). Ausbeute 90%.

60 Massespektrum: m/e 242 (M-OH), m/e 169

fVc/"

), 7,2-7,7 ô (m, 5H, CöHs).

65

O-

(CF3-

HO

i-C-NH- A

O

+

Massespektrum: m/e 265 (M+), m/e 234 (M-OCH3), m/e 162 m/e 155 (HO-CH-CH— NH-COCF3), m/e 140

5

618 707

+ . 4-

(CF3-CO N<J ), m/ell4(CF3-CO—NHs).

H

s

1,1 g der Verbindung (X) wurden in kleinen Portionen während 30 Minuten unter Rühren und bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 3,17 g p-Nitrobenzoylchlorid in 30 ml trockenem Pyridin zugesetzt und das Rühren bei Raumtemperatur 20 Stunden lang fortgesetzt. Zu der auf 0°C gekühlten i« Lösung wurde eine eiskalte Lösung von 1,44 g Natriumhydro-gencarbonat in 20 ml Wasser zugesetzt und die Mischung schliesslich in 350 ml Eiswasser gegossen.

Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxyd getrocknet. Das trockene Produkt is wurde schliesslich aus Dichlormethan-Äther kristallisiert,

wobei 2,3 g der gewünschten l,2,3-Trideoxy-4,6-di-0-(p-nitrobenzoyl)-3-trifluoracetamido-L-arabino-hex-l-en-pyra-nose (HI) erhalten wurden, Fp. 214-215°C, [a]è° = —117° (c = 0,5 in CHQ3). Ausbeute 95%. 20

NMR (CDCb—DMSO-ds 3:1): 4,3-5,6 ô (Multipletts, 4H, C(3)H, C(4)H, C(5)H, C(2)H), 4,52 ô (breites s, W1/2H, 2H, C(6)H2), 6,57 ô (breites s, W1/2H = 5 Hz, 1H, C(l)H), 8,21 ô (s, 4H, aromatisch), 8,35 ô (s, 4H, aromatisch), 9,27 ô (s,

IH, NH). Beispiel 25

200 mg Daunomycinon (H) wurden in 100 ml wasserfreiem Benzol gelöst und zu der Lösung wurden 540 mg 1,2,3-Tride-oxy-4,6-di-0-(p-nitrobenzoyl)-3-trifluoracetamido-L-arabino-hex-1 -enpyranose (in) und 20 mg p-Toluolsulfonsäure zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 20 Stunden lang bei 55°C 30 gerührt und nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der gebildete Niederschlag filtriert und aus Äthanol kristallisiert, wobei 340 mg geschütztes a-7-0-[4/,6/-Di-0-(p-nitro-ben-zoyl)-3'-trifluoracetamido-L-arabino]-daunomycinon erhalten wurden, Fp. 282°C, [a]g> = + 260° ± 5° (c = 0,05 in CHCb). 35 Das geschützte Glycosid wurde in 20 ml Dioxan gelöst und nach Abkühlen auf 0°C mit 0,2 N wässrigem Natriumhydroxyd behandelt. Nach einer Stunde bei 0°C wurde der pH-Wert der Lösung mit IN Salzsäure auf 4,5 eingestellt und das Dioxan im Vakuum abgedampft. Die erhaltene wässrige Lösung wurde nach Waschen mit Chloroform mit 0,2 N wässrigem Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und dann mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. 45

Ein Äquivalent methanolischer Chlorwasserstoff wurde zugesetzt, wobei 160 mg 4'-Epi-6/-hydroxydaunomycin als Hydrochlorid erhalten wurden, Fp. 199-201°C, [a]g> = +388° ± 5° (c = 0,05 in CTfcOH), Ausbeute 56%.

50

Biologische Wirksamkeit Materialien und Methoden In vitro-Studien HeLa-Zellen wurden den aktiven Verbindungen 2-8-24 Stunden ausgesetzt, worauf die Verbindungen entfernt und die 55

40

Zellen auf 5 mm Falcon-Kunststoffscheiben (200 Zellen pro Platte) in Wachstumsmedium gesät wurden. Die Koloniezahl wurde 5 Tage später mikroskopisch festgestellt. Mausembryo-fibroblaste (MEF) wurden auf 35 mm Falcon-Kunststoffscheiben aufgelegt, 24 Stunden später mit Moloney-Sarkomvirus (MSV) infiziert und 3 Tage lang mit unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindungen behandelt. Die Anzahl der Herde an transformierten Zellen wurde 5 Tage nach der Infektion mikroskopisch festgestellt. Nichtinfizierte MEF wurden auf ähnliche Weise behandelt; am Ende des Versuches wurden die Zellen in einem Hämozytometer gezählt. Bei allen Versuchen wurden die Zellen in einem 5 %igen C02-Inkubator bei 37°C bebrütet.

Die Verbindungen wurden in destilliertem Wasser gelöst und dann im Kulturmedium verdünnt.

Die Ergebnisse sind als IDso (Hemmungsdosis 50%) angegeben, berechnet auf Basis beeinflusster Zellen.

In vivo-Studien

Die Antitumorwirksamkeit der zu untersuchenden Verbindung wurde an Bauchwassersucht-Sarkom 180 getestet. 3 Monate alte Mäuse vom Stamm CD 1 wurden verwendet. Bauchwassersucht-Sarkom 180-Zellen wurden intraperitoneal eingeführt (106 Zellen pro Maus). Die Verbindung wurde in destilliertem Wasser gelöst, dann in einer Ringer-Lösung verdünnt und 1 Tag nach der Tumorimplantation intraperitoneal verabreicht (10 ml/kg Körpergewicht).

Die Toxizität wurde durch makroskopische Autopsie, hauptsächlich als Reduktion der Milzgrösse, bewertet. Ein Vergleich der Wirksamkeit der Verbindungen im verwendeten Dosisbereich mit unbehandelten Kontrollen basierte auf der maximalen Zunahme der mittleren Überlebenszeit. Die Anzahl der lange Zeit überlebenden Tiere (LTS) bezieht sich auf tumorfreie Mäuse am Ende der Versuche (60 Tage).

Ergebnisse

Die Wirksamkeit der untersuchten Verbindung im Vergleich mit der bezüglichen Stammverbindungen Daunomycin auf den getesteten «in vitro»-Systemen ist in Tabelle I angegeben. Die Verbindung zeigt auf HeLA-Zellen, auf MSV-Herde und auf MEF-Proliferation eine geringere Wirksamkeit als die Stammverbindung.

Der bei Bauchwassersucht-Sarkom 180 beobachtete Effekt ist in Tabelle II angegeben. Die optimale Antitumordosis (d.h. die Dosis, bei der maximaler Antitumoreffekt gefunden wurde) betrug 10 mg pro kg für das getestete neue Derivat.

Bei der optimalen Dosis war die Antitumorwirksamkeit, beurteilt durch Zunahme der Lebensdauer der behandelten Mäuse im Vergleich zu Kontrollen, niedriger als jene, die nach Behandlung mit Daunomycin beobachtet worden war.

Was die Toxizität betrifft, ein wichtiges und oft bestimmendes Element, das nach längerer Behandlung mit hohen kumulativen Dosen von Antitumorantibiotika in Betracht gezogen werden muss, kann beobachtet werden, dass das neue getestete Derivat mit Sicherheit weniger toxisch ist als die Stammverbindung.

Tabelle I

«In vitro»-Wirksamkeit von 4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin. ID50 (ng/ml)

Laborato

Verbindung

HeLa-Zellen

MSV-Herd-

MEF-

riumscode klonierende Wirksamkeit bildung

Proliferation

Zeit des den Verbindungen

Ausgesetztseins (Std.)

2

8

24

72

Daunomycin 0

30

13

3

5,5

9

IMI 23

4 ' -Epi-6 ' -hydroxydaunomycin

I*

1300

100

250

: = nicht aktiv bei der getesteten maximalen Dosis (10 (ig/ml) ' = Mittelwerte verschiedener Versuche

618 707

6

Tabellen

Wirksamkeit von 4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin auf Bauchwassersucht-Sarkom 180*

Laborato- Verbindung riumscode

Dosis (mg/kg)

T/C°

%

LTS+

Tox**

0,5

146

3/20

1

172

8/55

Daunomycin P

2

192

11/68

5

176

14/50

8

78

7/10

IMI 23 4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin

2

100

10

167

50

137

1/10

* - =1 Behandlung i. p. am 1. Tag ° = mittlere Überlebenszeit in % gegenüber Kontrollen + = lange Zeit Überlebende bei 60 Tagen

** = Mäuse, die auf Grund toxischer Wirkungen starben, gegenüber der Gesamtzahl □ = Durchschnittswerte einer Anzahl von Versuchen Die optimalen Dosen sind unterstrichen.

B