Verfahren zur Herstellung von Penicillinen
Die Gewinnung von 6-Amino-penicillansäure aus Fermentationsbrühen und Eluaten von Ionenaustauscher-Harzen mit hoher Ausbeute und ökonomisch tragbaren Aufwand stellt ein schwieriges -Problem dar. Die gewöhnlichen Extraktionsprozesse bei verschiedenen pH-Werten befriedigen nicht, und es sind keine befriedigenden Methoden zur Ausfällung bekannt, wenn diese auf sehr verdünnte Lösungen zur Anwendung gelangen -sollen. Die Gewinnung von 6-Amino-penicillansäure aus Fermentationsbrühen wird ferner durch die Gegenwart verschiedener Verunreinigungen in diesen Brühen kompliziert, worunter einige Penicilline fallen, welche sich während des Fermentationsprozesses gebildet haben.
Weitere Schwierigkeiten bestehen darin, die 6-Amino-penicil- lansäure an Ionenaustauscher-Harzen zu adsorbieren und wieder davon zu eluieren.
Es wurde nun gefunden, dass man aus wässrigen Lösungen der 6-Amino-penicillansäure, beispielsweise aus verdünnten solchen Lösungen, wie Fermentationsbrühen oder Ionenaustauscher-Eluaten, direkt Penicilline herstellen und damit gleichzeitig eine Konzentrierung der Wirksubstanz erreichen kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass eine 6-Amino-penicillansäure enthaltende wässrige Lösung extrahiert -wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren -inerten organischen Lösungsmittel, das mindestens ein sekundäres Amin der Formel
EMI1.1
gelöst enthält, in welcher Formel R ein aliphatischer Rest mit 10 bis 14 Kohlenstoffatomen und R1, R2 und R3 gleiche - oder verschiedene Alkylgruppen mit insgesamt 11 bis 14 Kohlenstoffatomen sind, worauf die die 6-Aminopenicillansäure enthaltende organische Phase mit einem Acylierungsmittel behandelt wird.
-Mit Vorteil wird die Extraktion der wässrigen Lösung der 6-Amino-penicillansäure bei einem pH Wert zwischen 4 und 7 vorgenommen.
Für die Extraktion geeignete organische Lösungsmittel sind beispielsweise Chloroform, Butylacetat und Kerosen.
Eine bevorzugte Gruppe sekundärer Amine sind solche der allgemeinen-Formel
EMI1.2
in welcher Formel Rl, R2 und Rs, wie gesagt, Alkylreste sind, welche insgesamt 11 bis 14 Kohlenstoffatome enthalten. Es eignen sich auch Mischungen derartiger Amine als Zusätze zum Extraktionsmittel.
Zweckmässig werden flüssige Amine oder eine Mischung solcher flüssiger Amine dem Lösungsmittel in Form ihrer freien Basen zugesetzt, oder sie können auch in Form ihrer Salze, z. B. als Chloride, Sulfate, Acetate oder Citrate, verwendet werden. Der Anteil dieser Amine bei der Extraktion liegt mit Vorteil zwischen 0,5 und 10%, vorzugsweise zwischen 1,5 und 5 %, bezogen auf das Gewicht der zu extrahierenden wässrigen Lösung, welche die öAminopenicillansäure enthält.
Die Menge an organischem Lösungsmittel kann in weiten Grenzen variieren. Höhere Konzentrationen an Penicillinen werden natürlich dann erhalten, wenn geringere Volumina an Lösungsmittel bei der Extraktion zur Anwendung gelangen. Die Wirksamkeit der Extraktion wird erhöht durch deren Ausführung im Gegenstrom in mehreren Stufen und unter Einhalten geeigneter Kontaktzeiten, z. B. 30 Minuten.
Vorzugsweise wird bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens bei niedrigeren Temperaturen, z. B. bei 50 C, gearbeitet.
Die Menge der in einer rohen Festsubstanz oder Lösung enthaltenen 6-Amino-penicillansäure kann indirekt gemessen werden, indem sie unter standardisierten Bedingungen mit Phenylacetylchlorid zu Benzylpenicillin (Penicillin G) umgesetzt wird, welches dann durch Vergleich mit einem Standardprodukt von Penicillin G auf Grund seiner antibiotischen Wirksamkeit getestet werden kann.
In den nachfolgenden Beispielen wurden die Amine in flüssiger Form in einem Lösungsmittel bei einer Konzentration von 17 Vol.% der Lösungsmittelphase (das heisst ungefähr 3 Vol.% der zu extrahierenden, wässrigen Lösung) aufgelöst.
Verwendet wurde hierbei eine Mischung sekundärer Amine der allgemeinen Formel
EMI2.1
worin Rl, R2 und R3 Alkylreste bedeuten, die insgesamt 11 bis 14 Kohlenstoffatome enthalten. Die verwendete Mischung war eine klare bernsteinfarbene Lösung mit folgenden physikalischen Eigenschaften:
Viskosität bei 250 C = 70 cps; spezifisches Gewicht bei 200 C = 0,845;
Brechungsindex bei 250 C = 1,467;
Destillationsbereich bei 10 mm: bis 1600 C = 4%, von 160 bis 210 C = 5%, von 210 bis 2200 C = 74 %, oberhalb 2200 C = 17%.
Beispiel I
500 mg 6-Amino-penicillansäure wurden in Wasser gelöst. Das Wasser wurde hiernach extrahiert mit zweimal je 1/5 seines Volumens, enthaltend das obengenannte Gemisch von Aminen in Gegenwart von 0, 5 Vol. % Benzaldehyd. Die Chloroformextrakte wurden zusammengegeben und in zwei Teile geteilt.
Zum einen dieser Teile wurde eine äquimolekulare Menge 2,6-Dimethoxy-benzoylchlorid, berechnet auf die vorhandene Menge 6-Amino-penicillansäure, zugegeben, während zum andern Teil die Sfach molare Menge zugesetzt wurde. Nach 1 Stunde wurde die Menge an 2, 6-Dimethoxy-phenylpenicillin bestimmt unter Verwendung der üblichen Tüpfelplatten-Testmethode mit Ausnahme, dass als Testorganismus ein penicillinresistenter Staphylococcus verwendet wurde.
Die Bestimmung ergab, dass die Reaktion mit einem Moläquivalent des Säurechlorids 153 mg 2,t-Di- methoxy-phenylpenicillin produzierte, während die Reaktion mit 5 Molen 162 mg (einen geringen tÇber- schuss) erzeugte. Mit einem Mol Säurechlorid beträgt die Ausbeute demnach 153 mg Penicillin aus 250 mg 6-Amino-penicillansäure. Dies entspricht einer Ausbeute von insgesamt 33 % des theoretisch möglichen Wertes. Hierbei wurden beim Schritt der Abtrennung mit Chloroform 60 % Ausbeute erhalten, während die Acylierung 55 % der theoretischen Ausbeute ergab.
Durch Papierchromatographie wurde ebenfalls die Gegenwart von 2,6-Dimethoxy-phenylpenicillin bestätigt und ferner nachgewiesen, dass lediglich sehr geringe Mengen nicht umgesetzte 6-Amino-penici11an- säure zurückgeblieben waren.
Beispiel 2
Eine Fermentationsbrühe aus Penicillium chrysogenum, enthaltend 6-Amino-penicillansäure mit einem Wirkungswert von 800 ug/ml, wurde extrahiert unter Verwendung von 1/5 ihres Volumens an einer Mischung von Chloroform, den vorgängig genannten Aminen, und 2,5 Vol.% Benzaldehyd beim pH-Wert von ungefähr 5. Der Chloroformextrakt (6,2 Liter) wurde filtriert und ergab eine klare Lösung. Die letztere wurde in zwei gleiche Teile geteilt.
Teil a):
6,5 ml trockenes Triäthylamin wurden hinzugegeben und hierauf eine Lösung von 4,64 g = 1 Äquivalent 2,6-Dimethoxy-benzoylchlorid in 100 ml trockenem alkoholfreiem Chloroform unter Rühren hinzugefügt. Nachdem eine Stunde lang gerührt worden war, wurden 1500 ml Wasser zugesetzt und hierauf genügend 40 % ige Natriumhydroxydlösung, um den pH-Wert der wässrigen Schicht auf 9 zu bringen. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht vereinigt mit einer geringen Menge (1500 ml) Waschwasser der Chloroformschicht. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden mit 250 ml Chloroform geschüttelt, nachdem sie mit 100 ml n Salzsäure auf einen pH-Bereich von 2,5 bis 3,0 angesäuert worden waren.
Die Schichten wurden getrennt und die Chloroformschicht mit genügend normaler Natrium bicarbonatlösung geschüttelt, um eine wässrige Schicht von pH 7,2 zu ergeben. Die Schichten wurden erneut getrennt und der Bicarbonatextrakt bei niedriger Temperatur und vermindertem Druck eingedampft, wobei eine lederfarbene, feste Substanz zurückblieb, welche das Natriumsalz des 2,6-Di- methoxy-phenylpenicillins in fester Form enthielt.
Erhalten wurden 6,2 g von einer Reinheit von 20 %, das heisst 12,5 % Ausbeute.
Teil b):
32,4 ml trockenes Triäthylamin wurden hinzugegeben und hernach unter Rühren eine Lösung von 23,2 g = 5 Äquivalente 2, 6-Dimethoxy-benzoyl- chlorid in 100 ml alkoholfreiem Chloroform zugesetzt. Nachdem eine Stunde lang gerührt worden war, wurden 1500 ml Wasser zugefügt und hiernach genügend 40% ige Natriumhydroxydlösung, um den pH-Wert der wässrigen Schicht auf 9 zu bringen.
Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde vereinigt mit einer geringen Menge (1500 ml) Waschwasser der Chloroformschicht. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden mit 600 ml Athylacetat geschüttelt, nachdem sie mit 100 ml n Salzsäure auf den pH-Wert 3 angesäuert worden waren. Die Schichten wurden vereinigt und die Äthylacetatschicht mit genügend n Natriumbicarbonat (54 ml) geschüttelt, um den pH-Wert der wässrigen Schicht auf 7,2 zu bringen. Die Schichten wurden erneut getrennt und der Bicarbonatextrakt bei niedrigerer Temperatur und vermindertem Druck eingedampft, wobei eine lederfarbene feste Substanz zurückblieb, weIche das 2,6-Dimethoxy-phenylpenicillin enthielt. Erhalten wurden 8,2 g von einer Reinheit von 10%, das heisst 8, 5 % Ausbeute.