Verfahren zur Herstellung von Penicillinen
Die Gewinnung von 6-Amino-penicillansäure aus Fermentationsbrühen und Eluaten von Ionenaustauscher-Harzen mit hoher Ausbeute und ökonomisch tragbaren Aufwand stellt ein schwieriges -Problem dar. Die gewöhnlichen Extraktionsprozesse bei verschiedenen pH-Werten befriedigen nicht, und es sind keine befriedigenden Methoden zur Ausfällung bekannt, wenn diese auf sehr verdünnte Lösungen zur Anwendung gelangen -sollen. Die Gewinnung von 6-Amino-penicillansäure aus Fermentationsbrühen wird ferner durch die Gegenwart verschiedener Verunreinigungen in diesen Brühen kompliziert, worunter einige Penicilline fallen, welche sich während des Fermentationsprozesses gebildet haben.
Weitere Schwierigkeiten bestehen darin, die 6-Amino-penicil- lansäure an Ionenaustauscher-Harzen zu adsorbieren und wieder davon zu eluieren.
Es wurde nun gefunden, dass man aus wässrigen Lösungen der 6-Amino-penicillansäure, beispielsweise aus verdünnten solchen Lösungen, wie Fermentationsbrühen oder Ionenaustauscher-Eluaten, direkt Penicilline herstellen und damit gleichzeitig eine Konzentrierung der Wirksubstanz erreichen kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass eine 6-Amino-penicillansäure enthaltende wässrige Lösung extrahiert -wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren -inerten organischen Lösungsmittel, das mindestens ein sekundäres Amin der Formel
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gelöst enthält, in welcher Formel R ein aliphatischer Rest mit 10 bis 14 Kohlenstoffatomen und R1, R2 und R3 gleiche - oder verschiedene Alkylgruppen mit insgesamt 11 bis 14 Kohlenstoffatomen sind, worauf die die 6-Aminopenicillansäure enthaltende organische Phase mit einem Acylierungsmittel behandelt wird.
-Mit Vorteil wird die Extraktion der wässrigen Lösung der 6-Amino-penicillansäure bei einem pH Wert zwischen 4 und 7 vorgenommen.
Für die Extraktion geeignete organische Lösungsmittel sind beispielsweise Chloroform, Butylacetat und Kerosen.
Eine bevorzugte Gruppe sekundärer Amine sind solche der allgemeinen-Formel
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in welcher Formel Rl, R2 und Rs, wie gesagt, Alkylreste sind, welche insgesamt 11 bis 14 Kohlenstoffatome enthalten. Es eignen sich auch Mischungen derartiger Amine als Zusätze zum Extraktionsmittel.
Zweckmässig werden flüssige Amine oder eine Mischung solcher flüssiger Amine dem Lösungsmittel in Form ihrer freien Basen zugesetzt, oder sie können auch in Form ihrer Salze, z. B. als Chloride, Sulfate, Acetate oder Citrate, verwendet werden. Der Anteil dieser Amine bei der Extraktion liegt mit Vorteil zwischen 0,5 und 10%, vorzugsweise zwischen 1,5 und 5 %, bezogen auf das Gewicht der zu extrahierenden wässrigen Lösung, welche die öAminopenicillansäure enthält.
Die Menge an organischem Lösungsmittel kann in weiten Grenzen variieren. Höhere Konzentrationen an Penicillinen werden natürlich dann erhalten, wenn geringere Volumina an Lösungsmittel bei der Extraktion zur Anwendung gelangen. Die Wirksamkeit der Extraktion wird erhöht durch deren Ausführung im Gegenstrom in mehreren Stufen und unter Einhalten geeigneter Kontaktzeiten, z. B. 30 Minuten.
Vorzugsweise wird bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens bei niedrigeren Temperaturen, z. B. bei 50 C, gearbeitet.
Die Menge der in einer rohen Festsubstanz oder Lösung enthaltenen 6-Amino-penicillansäure kann indirekt gemessen werden, indem sie unter standardisierten Bedingungen mit Phenylacetylchlorid zu Benzylpenicillin (Penicillin G) umgesetzt wird, welches dann durch Vergleich mit einem Standardprodukt von Penicillin G auf Grund seiner antibiotischen Wirksamkeit getestet werden kann.
In den nachfolgenden Beispielen wurden die Amine in flüssiger Form in einem Lösungsmittel bei einer Konzentration von 17 Vol.% der Lösungsmittelphase (das heisst ungefähr 3 Vol.% der zu extrahierenden, wässrigen Lösung) aufgelöst.
Verwendet wurde hierbei eine Mischung sekundärer Amine der allgemeinen Formel
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worin Rl, R2 und R3 Alkylreste bedeuten, die insgesamt 11 bis 14 Kohlenstoffatome enthalten. Die verwendete Mischung war eine klare bernsteinfarbene Lösung mit folgenden physikalischen Eigenschaften:
Viskosität bei 250 C = 70 cps; spezifisches Gewicht bei 200 C = 0,845;
Brechungsindex bei 250 C = 1,467;
Destillationsbereich bei 10 mm: bis 1600 C = 4%, von 160 bis 210 C = 5%, von 210 bis 2200 C = 74 %, oberhalb 2200 C = 17%.
Beispiel I
500 mg 6-Amino-penicillansäure wurden in Wasser gelöst. Das Wasser wurde hiernach extrahiert mit zweimal je 1/5 seines Volumens, enthaltend das obengenannte Gemisch von Aminen in Gegenwart von 0, 5 Vol. % Benzaldehyd. Die Chloroformextrakte wurden zusammengegeben und in zwei Teile geteilt.
Zum einen dieser Teile wurde eine äquimolekulare Menge 2,6-Dimethoxy-benzoylchlorid, berechnet auf die vorhandene Menge 6-Amino-penicillansäure, zugegeben, während zum andern Teil die Sfach molare Menge zugesetzt wurde. Nach 1 Stunde wurde die Menge an 2, 6-Dimethoxy-phenylpenicillin bestimmt unter Verwendung der üblichen Tüpfelplatten-Testmethode mit Ausnahme, dass als Testorganismus ein penicillinresistenter Staphylococcus verwendet wurde.
Die Bestimmung ergab, dass die Reaktion mit einem Moläquivalent des Säurechlorids 153 mg 2,t-Di- methoxy-phenylpenicillin produzierte, während die Reaktion mit 5 Molen 162 mg (einen geringen tÇber- schuss) erzeugte. Mit einem Mol Säurechlorid beträgt die Ausbeute demnach 153 mg Penicillin aus 250 mg 6-Amino-penicillansäure. Dies entspricht einer Ausbeute von insgesamt 33 % des theoretisch möglichen Wertes. Hierbei wurden beim Schritt der Abtrennung mit Chloroform 60 % Ausbeute erhalten, während die Acylierung 55 % der theoretischen Ausbeute ergab.
Durch Papierchromatographie wurde ebenfalls die Gegenwart von 2,6-Dimethoxy-phenylpenicillin bestätigt und ferner nachgewiesen, dass lediglich sehr geringe Mengen nicht umgesetzte 6-Amino-penici11an- säure zurückgeblieben waren.
Beispiel 2
Eine Fermentationsbrühe aus Penicillium chrysogenum, enthaltend 6-Amino-penicillansäure mit einem Wirkungswert von 800 ug/ml, wurde extrahiert unter Verwendung von 1/5 ihres Volumens an einer Mischung von Chloroform, den vorgängig genannten Aminen, und 2,5 Vol.% Benzaldehyd beim pH-Wert von ungefähr 5. Der Chloroformextrakt (6,2 Liter) wurde filtriert und ergab eine klare Lösung. Die letztere wurde in zwei gleiche Teile geteilt.
Teil a):
6,5 ml trockenes Triäthylamin wurden hinzugegeben und hierauf eine Lösung von 4,64 g = 1 Äquivalent 2,6-Dimethoxy-benzoylchlorid in 100 ml trockenem alkoholfreiem Chloroform unter Rühren hinzugefügt. Nachdem eine Stunde lang gerührt worden war, wurden 1500 ml Wasser zugesetzt und hierauf genügend 40 % ige Natriumhydroxydlösung, um den pH-Wert der wässrigen Schicht auf 9 zu bringen. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht vereinigt mit einer geringen Menge (1500 ml) Waschwasser der Chloroformschicht. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden mit 250 ml Chloroform geschüttelt, nachdem sie mit 100 ml n Salzsäure auf einen pH-Bereich von 2,5 bis 3,0 angesäuert worden waren.
Die Schichten wurden getrennt und die Chloroformschicht mit genügend normaler Natrium bicarbonatlösung geschüttelt, um eine wässrige Schicht von pH 7,2 zu ergeben. Die Schichten wurden erneut getrennt und der Bicarbonatextrakt bei niedriger Temperatur und vermindertem Druck eingedampft, wobei eine lederfarbene, feste Substanz zurückblieb, welche das Natriumsalz des 2,6-Di- methoxy-phenylpenicillins in fester Form enthielt.
Erhalten wurden 6,2 g von einer Reinheit von 20 %, das heisst 12,5 % Ausbeute.
Teil b):
32,4 ml trockenes Triäthylamin wurden hinzugegeben und hernach unter Rühren eine Lösung von 23,2 g = 5 Äquivalente 2, 6-Dimethoxy-benzoyl- chlorid in 100 ml alkoholfreiem Chloroform zugesetzt. Nachdem eine Stunde lang gerührt worden war, wurden 1500 ml Wasser zugefügt und hiernach genügend 40% ige Natriumhydroxydlösung, um den pH-Wert der wässrigen Schicht auf 9 zu bringen.
Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde vereinigt mit einer geringen Menge (1500 ml) Waschwasser der Chloroformschicht. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden mit 600 ml Athylacetat geschüttelt, nachdem sie mit 100 ml n Salzsäure auf den pH-Wert 3 angesäuert worden waren. Die Schichten wurden vereinigt und die Äthylacetatschicht mit genügend n Natriumbicarbonat (54 ml) geschüttelt, um den pH-Wert der wässrigen Schicht auf 7,2 zu bringen. Die Schichten wurden erneut getrennt und der Bicarbonatextrakt bei niedrigerer Temperatur und vermindertem Druck eingedampft, wobei eine lederfarbene feste Substanz zurückblieb, weIche das 2,6-Dimethoxy-phenylpenicillin enthielt. Erhalten wurden 8,2 g von einer Reinheit von 10%, das heisst 8, 5 % Ausbeute.
Process for the production of penicillins
Obtaining 6-aminopenicillanic acid from fermentation broths and eluates from ion exchange resins with high yield and economically viable expense is a difficult problem. The usual extraction processes at different pH values are unsatisfactory and no satisfactory methods of precipitation are known if these are to be used on very dilute solutions. The recovery of 6-aminopenicillanic acid from fermentation broths is further complicated by the presence of various impurities in these broths, including some penicillins which have formed during the fermentation process.
There are further difficulties in adsorbing the 6-amino penicillanic acid on ion exchange resins and in eluting it again.
It has now been found that penicillins can be produced directly from aqueous solutions of 6-aminopenicillanic acid, for example from dilute solutions such as fermentation broths or ion-exchange eluates, and a concentration of the active substance can thus be achieved at the same time.
The process according to the invention is characterized in that an aqueous solution containing 6-amino-penicillanic acid is extracted with a water-immiscible -inert organic solvent, the at least one secondary amine of the formula
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contains dissolved, in which formula R is an aliphatic radical with 10 to 14 carbon atoms and R1, R2 and R3 are identical or different alkyl groups with a total of 11 to 14 carbon atoms, whereupon the organic phase containing the 6-aminopenicillanic acid is treated with an acylating agent.
-The extraction of the aqueous solution of 6-amino-penicillanic acid is advantageously carried out at a pH between 4 and 7.
Organic solvents suitable for the extraction are, for example, chloroform, butyl acetate and kerosene.
A preferred group of secondary amines are those of the general formula
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in which formula Rl, R2 and Rs, as said, are alkyl radicals which contain a total of 11 to 14 carbon atoms. Mixtures of such amines are also suitable as additives to the extractant.
Liquid amines or a mixture of such liquid amines are expediently added to the solvent in the form of their free bases, or they can also be added in the form of their salts, e.g. B. as chlorides, sulfates, acetates or citrates can be used. The proportion of these amines in the extraction is advantageously between 0.5 and 10%, preferably between 1.5 and 5%, based on the weight of the aqueous solution to be extracted, which contains the aminopenicillanic acid.
The amount of organic solvent can vary within wide limits. Higher concentrations of penicillins are of course obtained when lower volumes of solvent are used in the extraction. The effectiveness of the extraction is increased by carrying it out in countercurrent in several stages and by observing suitable contact times, e.g. B. 30 minutes.
Preferably, when carrying out the process according to the invention at lower temperatures, e.g. B. at 50 C worked.
The amount of 6-amino-penicillanic acid contained in a raw solid substance or solution can be measured indirectly by converting it under standardized conditions with phenylacetyl chloride to benzylpenicillin (penicillin G), which is then compared with a standard product of penicillin G due to its antibiotic properties Effectiveness can be tested.
In the following examples, the amines were dissolved in liquid form in a solvent at a concentration of 17% by volume of the solvent phase (that is to say approximately 3% by volume of the aqueous solution to be extracted).
A mixture of secondary amines of the general formula was used here
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wherein Rl, R2 and R3 denote alkyl radicals which contain a total of 11 to 14 carbon atoms. The mixture used was a clear amber solution with the following physical properties:
Viscosity at 250 C = 70 cps; specific gravity at 200 C = 0.845;
Refractive index at 250 C = 1.467;
Distillation range at 10 mm: up to 1600 C = 4%, from 160 to 210 C = 5%, from 210 to 2200 C = 74%, above 2200 C = 17%.
Example I.
500 mg of 6-aminopenicillanic acid were dissolved in water. The water was then extracted twice with 1/5 of its volume each time, containing the above-mentioned mixture of amines in the presence of 0.5% by volume of benzaldehyde. The chloroform extracts were combined and divided into two parts.
An equimolecular amount of 2,6-dimethoxy-benzoyl chloride, calculated on the amount of 6-aminopenicillanic acid present, was added to one of these parts, while the half-molar amount was added to the other part. After 1 hour, the amount of 2,6-dimethoxyphenylpenicillin was determined using the usual spot test method with the exception that a penicillin-resistant Staphylococcus was used as the test organism.
The determination showed that the reaction with one molar equivalent of the acid chloride produced 153 mg of 2, t-dimethoxyphenylpenicillin, while the reaction with 5 mols produced 162 mg (a slight excess). With one mole of acid chloride, the yield is accordingly 153 mg penicillin from 250 mg 6-aminopenicillanic acid. This corresponds to a total yield of 33% of the theoretically possible value. In the separation step with chloroform, a yield of 60% was obtained, while the acylation gave 55% of the theoretical yield.
The presence of 2,6-dimethoxyphenylpenicillin was also confirmed by paper chromatography and it was also demonstrated that only very small amounts of unreacted 6-amino-penicillic acid remained.
Example 2
A fermentation broth from Penicillium chrysogenum containing 6-amino-penicillanic acid with an activity value of 800 µg / ml was extracted using 1/5 of its volume of a mixture of chloroform, the aforementioned amines, and 2.5% by volume of benzaldehyde at about pH 5. The chloroform extract (6.2 liters) was filtered to give a clear solution. The latter was divided into two equal parts.
Part A):
6.5 ml of dry triethylamine were added and a solution of 4.64 g = 1 equivalent of 2,6-dimethoxy-benzoyl chloride in 100 ml of dry, alcohol-free chloroform was then added with stirring. After stirring for one hour, 1500 ml of water was added followed by enough 40% sodium hydroxide solution to bring the pH of the aqueous layer to 9. The layers were separated and the aqueous layer was combined with a small amount (1500 ml) of washing water of the chloroform layer. The combined aqueous extracts were shaken with 250 ml of chloroform after they had been acidified to a pH range of 2.5 to 3.0 with 100 ml of N hydrochloric acid.
The layers were separated and the chloroform layer shaken with enough normal sodium bicarbonate solution to give an aqueous layer of pH 7.2. The layers were separated again and the bicarbonate extract was evaporated at low temperature and reduced pressure, leaving a buff-colored, solid substance which contained the sodium salt of 2,6-dimethoxyphenylpenicillin in solid form.
6.2 g of a purity of 20%, that is to say 12.5% yield, were obtained.
Part B):
32.4 ml of dry triethylamine were added and then a solution of 23.2 g = 5 equivalents of 2,6-dimethoxy-benzoyl chloride in 100 ml of alcohol-free chloroform was added with stirring. After stirring for one hour, 1,500 ml of water was added followed by enough 40% sodium hydroxide solution to bring the pH of the aqueous layer to 9.
The layers were separated and the aqueous layer was combined with a small amount (1500 ml) of washing water of the chloroform layer. The combined aqueous extracts were shaken with 600 ml of ethyl acetate after they had been acidified to pH 3 with 100 ml of N hydrochloric acid. The layers were combined and the ethyl acetate layer shaken with enough sodium bicarbonate (54 ml) to bring the pH of the aqueous layer to 7.2. The layers were separated again and the bicarbonate extract was evaporated at lower temperature and reduced pressure, leaving a buff-colored solid substance containing the 2,6-dimethoxyphenylpenicillin. 8.2 g of a purity of 10% were obtained, that is to say an 8.5% yield.