BRPI0906435B1 - Anticorpo anti-cd79b quimérico, composto conjugado, formulação farmacêutica, método para determinar a presença da proteína cd79b, ensaio para detectar células de câncer, método para inibir proliferação celular, usos de um anticorpo, de um composto conjugado e de uma formulação farmacêutica, e método para a fabricação de um composto conjugado - Google Patents

Anticorpo anti-cd79b quimérico, composto conjugado, formulação farmacêutica, método para determinar a presença da proteína cd79b, ensaio para detectar células de câncer, método para inibir proliferação celular, usos de um anticorpo, de um composto conjugado e de uma formulação farmacêutica, e método para a fabricação de um composto conjugado Download PDF

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BRPI0906435B1 BRPI0906435-4A BRPI0906435A BRPI0906435B1 BR PI0906435 B1 BRPI0906435 B1 BR PI0906435B1 BR PI0906435 A BRPI0906435 A BR PI0906435A BR PI0906435 B1 BRPI0906435 B1 BR PI0906435B1
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cd79b
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cysteine
cell
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BRPI0906435-4A
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Mark Dennis
David Dornan
Kristi Elkins
Jagath Reddy Junutula
Andrew Polson
Bing Zheng
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Publication date
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Abstract

ANTICORPO ANTI-CD79b QUIMÉRICO, COMPOSTO CONJUGADO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DA PROTEÍNA CD79b, ENSAIO PARA DETECTAR CÉLULAS DE CÂNCER, MÉTODO PARA INIBIR PROLIFERAÇÃO CELULAR, USOS DE UM ANTICORPO, DE UM COMPOSTO CONJUGADO E DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, E MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UM COMPOSTO CONJUGADO. A presente invenção refere-se a anticorpos humanizados e conjugados contra CD79b úteis para o tratamento de tumor hematopoiético em mamíferos e a métodos de uso desses anticorpos para o mesmo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
O presente pedido não provisório depositado sob 37 CFR § 1.53(b) reivindica o benefício sob 35USC § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. Ne de Série 61/025.137 depositado em 31 de janeiro de 2008, Pedido de Patente Provisório U.S. N- de Série 61/032.790 depositado em 29 de fevereiro de 2008 e Pedido de Patente Provisório U.S. N2 de Série 61/054.709 depositado em 20 de maio de 2008, cada um deles aqui 15 incorporado a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a composições de matéria úteis para o tratamento de tumor hematopoiético em mamíferos e a métodos de uso dessas composições de matéria para os mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Tumores malignos (cânceres) são a segunda causa principal de morte nos Estados Unidos, após doença cardíaca (Boring e outros, C.A. Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). O câncer é caracterizado pelo aumento no número de células anormais, ou neoplásticas, derivadas de um tecido normal que 25 proliferam para formar uma massa de tumor, a invasão de tecidos adjacentes por essas células de tumor neoplásticas e a geração de células malignas que eventualmente se espalham através do sangue ou sistema linfático para nós linfáticos regionais e sítios distantes através de um processo chamado metástase. Em um estado canceroso, uma célula prolifera sob condições onde células normais não cresceriam. O câncer se manifesta em uma ampla variedade de formas, caracterizado por graus diferentes de invasividade e agressividade.
Cânceres que envolvem células geradas durante hematopoiese, um processo através do qual elementos celulares de sangue, tais como linfócitos, leucócitos, plaquetas, eritrócitos e células assassinas naturais são gerados, são referidos como cânceres hematopoiéticos. Linfócitos que podem ser encontrados em sangue e tecido linfático e são críticos para resposta imune 10 são caracterizados em duas classes principais de linfócitos: linfócitos B (células B) e linfócitos T (células T), que fazem a mediação de imunidades humoral e mediada por célula, respectivamente.
Células B amadurecem dentro da medula óssea e deixam a medula expressando um anticorpo de ligação a antígeno em sua superfície 15 celular. Quando uma célula B pura primeiro encontra o antígeno para o qual seu anticorpo ligado à membrana é específico, a célula começa a se dividir rapidamente e sua progénie diferencia em células B memórias e células efetoras chamadas "células de plasma". Células B memórias têm um tempo de vida mais longo e continuam a expressar anticorpo ligado à membrana com a 20 mesma especificidade que a célula parental original. Células do plasma não produzem anticorpo ligado à membrana, mas ao invés produzem o anticorpo em uma forma que pode ser secretada. Anticorpos secretados são a molécula efetora principal de imunidade humoral.
As células T amadurecem dentro do timo que provê um ambiente 25 para a proliferação e diferenciação de células T imaturas. Durante a maturação de célula T, as células T sofrem os rearranjos de gene que produzem o receptor de célula T e seleções positiva e negativa que ajudam a determinar o fenótipo de superfície celular da célula T madura. Marcadores de superfície de célula característicos de células T maduras são o complexo CD3:receptor de célula T e um dos correceptores, CD4 ou CD8.
Em tentativas em encontrar alvos celulares eficazes para terapia de câncer, os pesquisadores procuraram identificar polipeptídeos de 5 transmembrana ou de outra maneira associados à membrana que sejam especificamente expressos na superfície de um ou mais tipo(s) particular(es) de célula de câncer comparado com uma ou mais célula(s) não cancerosa(s) normal(ais). Frequentemente, tais polipeptídeos associados à membrana são mais abundantemente expressos na superfície das células de câncer 10 comparado com a superfície de células não cancerosas. A identificação de tais polipeptídeos de antígeno de superfície celular associados a tumor deu origem à habilidade em especificamente se direcionar a células de câncer para destruição através de terapias baseadas em anticorpo. Com relação a isso, é notado que terapia baseada em anticorpo provou ser muito eficaz no 15 tratamento de certos cânceres. Por exemplo, HERCEPTIN® e RITUXAN® (ambos da Genentech, Inc., São Francisco do Sul, Califórnia) são anticorpos que foram usados com sucesso para tratar câncer de mama e Linfoma Não Hodgkin, respectivamente. Mais especificamente, HERCEPTIN® é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de DNA recombinante que se liga 20 seletivamente ao domínio extracelular do proto-oncogene do receptor de fator de crescimento epidermal humano 2 (HER2). Superexpressão da proteína HER2 é observada em 25-30% de cânceres de mama primários. RITUXAN® é um anticorpo monoclonal de murino/humano quimérico geneticamente engenheirado direcionado contra o antígeno CD20 encontrado na superfície de 25 linfócitos B normais e malignos. Ambos esses anticorpos são recombinantemente produzidos em células CHO.
Em outras tentativas em encontrar alvos celulares eficazes para terapia de câncer, os pesquisadores procuraram identificar (1) polipeptídeos não associados à membrana que sejam especificamente produzidos por um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s) de câncer comparado com produzidos por um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s) normal(ais) não cancerosa(s), (2) polípeptídeos que sejam produzidos por células de câncer em um nível de 5 expressão que é significantemente maior do que aquele de uma ou mais célula(s) não cancerosa(s) normal(ais) ou (3) polípeptídeos cuja expressão é especificamente limitada a apenas um único tipo (ou um número muito limitado de tipos diferentes) em ambos os estados canceroso e não canceroso (por exemplo, tecido de próstata normal e tumor de próstata). Tais polípeptídeos 10 podem permanecer intracelularmente localizados ou podem ser secretados pela célula de câncer. Além disso, tais polípeptídeos podem ser expressos não pela célula cancerosa em si, mas ao contrário, pelas células que produzem e/ou secretam polípeptídeos tendo um efeito de potencialização ou de aumento de crescimento sobre células cancerosas. Tais polípeptídeos secretados são 15 frequentemente proteínas que proveem células de câncer com uma vantagem de crescimento sobre células normais e inclui fatores tais como, por exemplo, fatores angiogênicos, fatores de adesão celular, fatores de crescimento e similar. Identificação de antagonistas de tais polípeptídeos não associados à membrana seria esperada servir como agentes terapêuticos eficazes para o tratamento de tais cânceres. Ainda, identificação do padrão de expressão de tais polípeptídeos seria útil para o diagramanóstico de cânceres particulares em mamíferos.
Apesar dos avanços identificados acima em terapia de câncer de mamífero, há uma grande necessidade de agentes terapêuticos adicionais 25 capazes de detectar a presença de tumor em um mamífero e inibir eficazmente crescimento de célula neoplástica, respectivamente. Desta maneira, é um objetivo da presente invenção identificar polípeptídeos, polípeptídeos secretados ou intracelulares, associados à membrana celular, cuja expressão é especifica mente limitada a apenas um único tipo(s) de tecido (ou número muito limitado de tipos diferentes), tecidos hematopoiéticos, em ambos os estados cancerosos e não cancerosos, e ao uso desses polipeptídeos, e seus ácidos nucleicos de codificação, para produzir composições de matéria úteis no tratamento terapêutico e/ou detecção de câncer hematopoiético em mamíferos. CD79 é o componente de sinalização do receptor de célula B consistindo em um heterodímero covalente contendo CD79a (Iga, mb-1) e CD79b (Igβ, B29). CD79a e CD79b podem conter um domínio de imunoglobulina (lg) extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular, um domínio de motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM). CD79 é expresso em células B e em células de Linfoma Não-Hodgkin (NHLs) (Cabezudo e outros, Haematologica, 84:413418 (1999); D'Arena e outros, Am. J. Hematol., 64: 275-281 (2000); Olejniczak e outros, Immunol. Invest, 35: 93-114 (2006)). CD79a e CD79b e slg são todos requeridos para expressão em superfície do CD79 (Matsuuchi e outros, Curr. Opin. Immunol., 13(3): 270-7)). A expressão em superfície média de CD79b em NHLs é similar àquela em células B normais, mas com uma faixa maior (Matsuuchi e outros, Curr. Opin. Immunol., 13(3); 270-7 (2001)).
Dada a expressão de CD79b, é benéfico produzir anticorpos terapêuticos para o antígeno de CD79b que criem antigenicidade mínima ou nenhuma quando administrados a pacientes, especialmente para tratamento crônico. A presente invenção satisfaz essas e outras necessidades. A presente invenção provê anticorpos anti-CD79b que superam as limitações de composições terapêuticas atuais bem como oferecem vantagens adicionais que serão aparentes a partir do relatório descritivo detalhado abaixo.
O uso de conjugados anticorpo-fármaco (ADC), isto é, imunoconjugados, para a aplicação local de agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, fármacos para matar ou inibir células de tumor no tratamento de câncer (Lambert, J. (2005)) Curr. Opinion in Pharmacology, 5:543-; Wu e outros (2005) Nature Biotechnology, 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) Cancer Cell, 3:207212; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research, 19:605-614; Niculescu- Duvaz e Springer (1997) Adv. Drug. Del. Rev., 26:151-172; US 4975278), 5 permite aplicação direcionada da porção de fármaco a tumores, e acúmulo intracelular neles, onde administração sistêmica desses agentes de fármaco não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxidez para células normais bem como as células de tumor que pretendem ser eliminadas (Baldwin e outros (1986) Lancet pp. (15 de março de 1986):603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biologycal and Clinical Applications. A. Pinchera e outros (eds.), pp. 475-506). Esforços para melhorar o índice terapêutico, isto é, eficácia máxima e toxidez mínima, de ADC focaram na seletividade de anticorpos policlonais (Rowland e outros (1986) Cancer Immunol. Immunother, 21:183-87) e anticorpos monoclonais (mAbs) bem como propriedades de ligação a fármaco e de eliminação de fármaco (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology, 5:543-549). Porções de fármaco usadas nos conjugados anticorpo fármaco incluem toxinas de proteína bacteriana tal como toxina da difteria, toxinas de proteína de planta tal com ricina, moléculas pequenas tais como auristatina, geldanamicina (Mandler e outros (2000) J. of the Nat. Cancer Inst., 92(19):1573-1581; Mandler e outros (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters, 10:1025-1028; Mandler e outros (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8618-8623), calicheamicina (Lode e outros (1998) Cancer Res., 58:2928; Hinman e outros (1993) Cancer Res., 53:3336-3342), daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland e outros (1986) supra). As porções de fármaco podem afetar mecanismos citotóxicos ou citostáticos incluindo ligação de tubulina, ligação de DNA ou inibição de topoisomerase. Alguns fármacos citotóxicos tendem a ser inativos ou menos ativos quando conjugados a anticorpos grandes ou ligantes de receptor de proteína.
Os peptídeos auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina (WO 02/088172), foram conjugados como porções de fármaco a: (i) anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y em carcinomas); (ii) cAC10 que é específico para CD30 em males hematológicos (Klussman e outros (2004), Bioconjugate Chemistry, 15(4):765-773; Doronina e outros (2003); Nature Biotechnology, 21(7):778-784; Francisco e outros (2003) Blood, 102(4):1458-1465; US 2004/0018194; (iii) anticorpos anti-CD20 tal como rituxan (WO 04/032828) para o tratamento de cânceres expressando CD20 e distúrbios imunes; (iv) anticorpo anti-EphB2R 2H9 para tratamento de câncer colorretal (Mao e outros (2004) Cancer Research, 64(3):781 -788); anticorpo E- selectina (Bhaskar e outros (2003) Cancer Res., 63:6387-6394); (vi) trastuzumabe (HERCEPTIN®, US 2005/0238649) e (vi) anticorpos anti-CD30 (WO 03/043583). Variantes de auristatina E são descritos na US 5767237 e na US 6124431). Monometil auristatina E conjugada a anticorpos monoclonais é revelada em Senter e outros, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, apresentado em 28 de março de 2004. Análogos de auristatina MMAE e MMAF foram conjugados a vários anticorpos (US 2005/0238649).
Meios convencionais de união, isto é, ligação através de ligações covalentes, de uma porção de fármaco a um anticorpo geralmente leva a uma mistura heterogênea de moléculas onde as porções de fármaco são ligadas a vários sítios no anticorpo. Por exemplo, fármacos citotóxicos foram tipicamente conjugados a anticorpos através dos resíduos lisina frequentemente numerosos de um anticorpo, gerando uma mistura de conjugado anticorpo- fármaco heterogênea. Dependendo das condições de reação, a mistura heterogênea tipicamente contém uma distribuição de anticorpos com a partir de 0 a cerca de 8, ou mais, porções de fármaco ligadas. Ainda, dentro de cada subgrupo de conjugados com uma razão de inteiro particular de porções de 5 fármaco para anticorpo está uma mistura potencialmente heterogênea onde a porção de fármaco é ligada em vários sítios no anticorpo. Métodos analíticos e preparativos podem ser inadequados para separar e caracterizar as moléculas de espécie conjugado anticorpo-fármaco dentro da mistura heterogênea resultante de uma reação de conjugação. Anticorpos são biomoléculas 10 grandes, complexas e estruturalmente diversas, frequentemente com muitos grupos reativos funcionais. Suas reatividades com reagentes ligantes e intermediários tipo fármaco são dependentes de fatores tal como pH, concentração, concentração de sal e cossolventes. Ainda, o processo de conjugação multietapa pode ser não reproduzível devido às dificuldades em 15 controle das condições de reação e caracterização de reagentes e intermediários.
Cisteína tióis são reativas em pH neutro, diferente da maioria das aminas que são protonadas e menos nucleofílicas próximo de pH 7. Uma vez que grupos tióis livres (RSH, sulfidrila) são relativamente reativos, proteínas 20 com resíduos Cisteína frequentemente existem em sua forma oxidada como oligômeros ligados a dissulfeto ou têm grupos dissulfeto internamente em ponte. Proteínas extracelulares geralmente não têm tióis livres (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres, na página 55). Grupos cisteína tiol de anticorpo são geralmente mais reativos, isto 25 é, mais nucleofílicos, com relação a reagentes de conjugação eletrofílicos do que grupos amina ou hidroxila de anticorpo. Resíduos Cisteína foram introduzidos em proteínas através de técnicas de engenharia genética para formar ligações covalentes a ligantes ou formar novas ligações dissulfeto intramoleculares (Better e outros (1994), J. Biol. Chem., 13:9644-9650; Bernhard e outros (1994), Bioconjugate Chem., 5:126-132; Greenwood e outros (1994) Therapeutic Immunology, 1:247-255; Tu e outros (1999), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96:4862-4867; Kanno e outros (2000), J. of Biotechnology, 5 76:207-214; Chmura e outros (2001), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98(15):8480- 8484; US 6248564). No entanto, engenharia em grupos cisteína tiol através da mutação de vários resíduos de aminoácido de uma proteína em aminoácidos de cisteína é potencialmente problemática, particularmente no caso de resíduos não emparelhados (Cys livre) ou aqueles que são relativamente 10 acessíveis para reação ou oxidação. Em soluções concentradas da proteína, seja no periplasma de E. coli, sobrenadantes de cultura ou proteína parcialmente ou completamente purificada, resíduos Cys não emparelhados sobre a superfície da proteína podem emparelhar e oxidar para formar dissulfetos intermoleculares, e então dímeros ou multímeros de proteína.
Formação de dímero de dissulfeto torna o novo Cys não reativo para conjugação a um fármaco, ligante ou outro marcador. Ainda, se a proteína formar oxidativamente uma ligação dissulfeto intramolecular entre o Cys recém- engenheirado e um resíduo Cys existente, ambos os grupos tióis de Cys estão indisponíveis para participação e interações em sítio ativo. Ainda, a proteína 20 pode ser tornada inativa ou não-específica, através de dobra errada ou perda de estrutura terciária (Zhang e outros (2002) Anal. Biochem., 311:1-9).
Anticorpos engenheirados com cisteína foram projetados como fragmentos de anticorpo FAB (tioFab) e expressos como anticorpos monoclonaís IgG (tioMab) de comprimento integral (Junutula, J.R. e outros 25 (2008), J. Immunol. Methods, 332:41-52; US 2007/0092940, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência). Anticorpos TioFab e TioMab foram conjugados através de ligantes nas cisteína tióis recém-introduzidas com reagentes ligantes tiol-reativos e reagentes ligantes de fármaco para preparar conjugados de anticorpo-fármaco (Tio ADC).
Todas as referências mencionadas aqui, incluindo pedidos e publicações de patente, são incorporadas a título de referência em sua totalidade.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção provê anticorpos anti-CD79b ou fragmentos funcionais dos mesmos e seu método de uso no tratamento de tumores hematopoiéticos.
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo que se liga, preferivelmente especificamente, a qualquer um dos polípeptídeos descritos 10 acima ou abaixo. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, incluindo fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, diacorpo, anticorpo de domínio simples, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epitopo 15 antigênico. Os anticorpos da presente invenção podem ser opcionalmente conjugados a um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina incluindo, por exemplo, uma auristatina, um maitansinoide, um derivado de dolostatina ou uma calicheamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similar. Os anticorpos da presente 20 invenção podem ser opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e preferivelmente induzem morte de uma célula à qual eles se ligam. Para propósitos de detecção, os anticorpos da presente invenção podem ser detectavelmente marcados, ligados a um apoio sólido ou similar.
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b 25 humanizado, onde a afinidade monovalente (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para CD79b) ou afinidade em sua forma bivalente do anticorpo para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento IgG para CD79b) é substancialmente a mesma, menor do que ou maior do que a afinidade monovalente ou afinidade em sua forma bivalente, respectivamente, de um anticorpo de murino (por exemplo, afinidade do anticorpo de murino como um fragmento Fab ou como um fragmento IgG para CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab ou como um fragmento IgG para CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada conforme mostrado nas figuras 7A-B (SEQ ID NQ:10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO:14).
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,4 nM, 0,2 nM ou 0,5 nM.
Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é provido, onde o anticorpo compreende pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas do grupo consistindo em: HVR-L1 compreendendo a sequência A1-A15, onde A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO:131); HVR-L2 compreende a sequência B1-B7, onde B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 compreende a sequência C1-C9, onde C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO:133); HVR-H1 compreende a sequência D1-D10, onde D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO:134); HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E18, onde E1-E18 é GÊILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO:135); e HVR-H3 compreendendo a sequência F1-F10, onde F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO:136).
Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é provido, onde o anticorpo compreende pelo menos uma HVR variante onde a sequência de HVR variante compreende modificação de pelo menos um resíduo da sequência mostrada na SEQ ID NO:131, 132, 133, 134, 135 ou 136.
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1- HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC mostrada na figura 15 (SEQ ID NOs:164-166).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC mostrada na figura 15 (SEQ ID NOs:156-158).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1- HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC mostrada na figura 16 (SEQ ID NOs: 183-185).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, 15 HVR2-LC e/ou HVR3-LC mostrada na figura 16 (SEQ ID NOs: 175-177).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1- HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC mostrada na figura 17 (SEQ ID NOs: 202-204).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC mostrada na figura 17 (SEQ ID NOs; 194-196).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1- HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC mostrada na figura 18 (SEQ ID NOs: 221-223).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC mostrada na figura 18 (SEQ ID NOs: 213-215). compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado de SEQ ID NO: 170, 189, 208 ou 227. Em outro aspecto, a invenção inclui um anticorpo anti-CD79b compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado de SEQ ID NO: 169, 188, 207 ou 226.
Em um aspecto, a invenção inclui um anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína compreendendo um ou mais aminoácidos de cisteína livre e uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 251-198. O anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína pode se ligar a um polipeptídeo de CD79b. O anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína pode ser preparado através de um processo compreendendo substituição de um ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo anti-CD79b parental por cisteína.
Em um aspecto, a invenção inclui um anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína compreendendo um ou mais aminoácidos de cisteína livre onde o anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína livre se liga a um polipeptídeo de CD79b e é preparado através de um processo compreendendo substituição de um ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo anti-CD79b parental por cisteína onde o anticorpo parental compreende pelo menos uma sequência de HVR selecionada de: HVR-L1 compreendendo a sequência A1-A15, onde A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO:131)ou KASQSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 137); HVR-L2 compreende a sequência B1-B7, onde B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO.132); HVR-L3 compreende a sequência C1-C9, onde C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO:133); HVR-H1 compreende a sequência D1-D10, onde D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO:134); HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E18, onde E1-E18 é GÊILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO.135); e HVR-H3 compreendendo a sequência F1-F10, onde F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO:136) ou TRRVPIRLDY (SEQ ID NO 138).
O anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epitopo antigênico. Os anticorpos da presente invenção podem ser conjugados a um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina ou maitansinoide. Os anticorpos da presente invenção podem ser opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e preferivelmente inibem o crescimento ou proliferação de ou induzem a morte de uma célula à qual eles se ligam. Para propósitos de diagramanóstico, os anticorpos da presente invenção podem ser detectavelmente marcados, ligados a um apoio sólido ou similar.
Em um aspecto, a invenção provê métodos para fabricação de um anticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção provê um método de fabricação de um anticorpo de CD79b (que, conforme aqui definido, inclui comprimento integral e seus fragmentos), o dito método compreendendo expressão em uma célula hospedeira adequada de um vetor recombinante da invenção codificando o dito anticorpo (ou fragmento do mesmo) e recuperação do dito anticorpo.
Em um aspecto, a invenção é uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo da invenção ou um conjugado anticorpo-fármaco da invenção e um diluente, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. compreendendo um recipiente; e uma composição contida no recipiente, onde a composição compreende um ou mais anticorpos de CD79b da invenção.
Em um aspecto, a invenção provê um estojo compreendendo um primeiro recipiente compreendendo uma composição compreendendo um ou mais anticorpos de CD79b da invenção; e um segundo recipiente compreendendo um tampão.
Em um aspecto, a invenção provê uso de um anticorpo de CD79b da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular.
Em um aspecto, a invenção provê uso de um artigo de fabricação da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo.
Em um aspecto, a invenção provê uso de um estojo da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular.
Em um aspecto, a invenção provê um método de inibição do crescimento de uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo contato da dita célula com um anticorpo da invenção desta maneira causando uma inibição de crescimento da dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a invenção provê um método para tratamento terapêutico em um mamífero tendo um tumor canceroso compreendendo uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo administrar ao dito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, desta maneira tratando eficazmente o dito mamífero. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a invenção provê um método para tratamento ou 5 prevenção de um distúrbio proliferativo celular associado com expressão aumentada de CD79b, o dito método compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz do anticorpo da invenção, desta maneira tratando ou prevenindo eficazmente o dito distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, o dito distúrbio 10 proliferativo é câncer. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a invenção provê um método para inibição do crescimento de uma célula, onde o crescimento da dita célula é pelo menos em 15 parte dependente do efeito de potencialização de crescimento de CD79b, o dito método compreendendo contato da dita célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desta maneira inibindo o crescimento da dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a invenção provê um método para tratamento terapêutico de um tumor em um mamífero, onde o crescimento do dito tumor é pelo menos em parte dependente de um efeito de potencialização de crescimento de CD79b, o dito método compreendendo contato da dita célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desta maneira 25 tratamento eficazmente o dito tumor. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento. câncer compreendendo administrar a um paciente a formulação farmacêutica compreendendo um imunoconjugado descrito aqui, diluente, carreador ou excipiente aceitável.
Em um aspecto, a invenção provê um método de inibição de proliferação de célula B compreendendo expor uma célula a um imunoconjugado compreendendo um anticorpo da invenção sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b.
Em um aspecto, a invenção provê um método de determinação da presença de CD79b em uma amostra suspeita conter CD79b, o dito método compreendendo expor a dita amostra a um anticorpo da invenção, e determinação da ligação do dito anticorpo a CD79b na dita amostra onde ligação do dito anticorpo a CD79b na dita amostra é indicativo da presença da dita proteína na dita amostra.
Em um aspecto, a invenção provê um método de diagramanóstico de um distúrbio proliferativo celular associado com um aumento em células, tais como células B, expressando CD79b, o método compreendendo contato das células de teste em uma amostra biológica com qualquer um dos anticorpos acima; determinação do nível de anticorpo ligado a células de teste na amostra através de detecção de ligação do anticorpo a CD79b; e comparação do nível de anticorpo ligado às células em uma amostra controle, onde o nível de anticorpo ligado é normalizado para o número de células expressando CD79b nas amostras de teste e controle, e onde um nível maior de anticorpo ligado na amostra de teste comparado com a amostra controle indica a presença de um distúrbio proliferativo celular associado com células expressando CD79b.
Em um aspecto, a invenção provê um método de detecção de CD79b solúvel em sangue ou soro, o método compreendendo contato de uma amostra de teste de sangue ou soro de um mamífero suspeito ter um distúrbio proliferativo de célula B com um anticorpo anti-CD79b da invenção e detecção de um aumento em CD79b solúvel na amostra de teste com relação a uma amostra controle de sangue ou soro de um mamífero normal.
Em um aspecto, a invenção provê um método de ligação de um 5 anticorpo da invenção a uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo contato da dita célula com um anticorpo da invenção. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:1) de um cDNA PRO36249, onde a SEQ ID NO:1 é um clone chamado aqui "DNA225786" (também referido aqui como "CD79b"). A sequência de nucleotídeo codifica CD79b com os códons de início e parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 2 mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO:2) derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO:1 mostrada na figura 1.
A figura 3 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:3) de cadeia leve de IgG anticorpo de murino de CD79b quimérico (chMA79b) (MA79b é um anticorpo anti-CD79b monoclonal de murino). A sequência de 20 nucleotídeo codifica a cadeia leve de chMA79b com os códons de início e parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 4 mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO:4), sem a primeira sequência sinal de 18 aminoácidos, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO:3 mostrada na figura 3. Regiões variáveis são 25 regiões sem sublinhado.
A figura 5 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:5) da cadeia pesada de IgG de anticorpo de murino quimérico (chMA79b) (MA79b é um anticorpo anti-CD79b monoclonal de murino). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia pesada de chMA79b com os códons de início e parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 6 mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO:6), sem a primeira sequência sinal de 18 aminoácidos e a última lisina (K) antes do códon de parada, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO:5 mostrada na figura 5. Regiões variáveis são regiões sem sublinhado.
As figuras 7A-B mostram o alinhamento de sequências das cadeias leves variáveis para o que segue: a sequência consenso para capa I humana de cadeia leve (marcada "huKI"; SEQ ID NO:9) com VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3, VL-FR4 (SEQ ID NOs: 139-142, respectivamente), anticorpo anti- CD79b de murino (marcado como "MA79b"; SEQ ID NQ:10), anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcado como "enxerto huMA79b"; SEQ ID NO:11), variante de anticorpo 17 "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v17), variante de anticorpo 18 "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v18"; SEQ ID NO:188), variante de anticorpo 28 "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v28"; SEQ ID NO:207) e variante de anticorpo 32 "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v32"; SEQ ID NO:226). As posições são numeradas de acordo com Kabat e regiões hipervariáveis (HVRs) enxertadas de MA79b para a estrutura principal de consenso Capa I leve variável estão em caixa.
As figuras 8A-B mostram o alinhamento de sequências das cadeias pesadas variáveis para o que segue: sequência consenso do subgrupo III humana de cadeia pesada (marcada como "humlll"; SEQ ID NO: 13) com VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 e VH-FR4 (SEQ ID NOs: 143-146), anticorpo anti- CD79b de murino (marcado como "MA79b"; SEQ ID NO:14), anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcado como "enxerto de huMA79b"; SEQ ID NO:15) (contendo 71 A, 73T e 78A), variante 17 de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v17"; SEQ ID NO: 170) (contendo 71 A, 73T e 78A), variante de anticorpo 18 "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v18"; SEQ ID NO:189) (contendo 71 A, 73T e 78A), variante de anticorpo 28 "humanizado" enxertado 5 com MA79b (marcada como "huMA79b.v28"; SEQ ID NQ:208) (contendo 71A, 73T e 78A) e variante de anticorpo 32 "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v32"; SEQ ID NO:227) (contendo 71A, 73T e 78A). As posições são marcadas com acordo com Kabat e regiões hipervariáveis (HVRs) enxertadas de MA79b para a estrutura principal de consenso do 10 subgrupo II pesada variável estão em caixa.
A figura 9 mostra várias sequências de HVR de variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (SEQ ID NOs: 17-21) onde cada variante tem uma mudança de aminoácido única em uma HVR única do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (HVR-L1 (SEQ ID NO: 131); HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133)). As sequências das cadeias leves variáveis e cadeias pesadas variáveis fora das mudanças de aminoácido únicas mostradas eram idênticas ao enxerto huMA79b e não são mostradas. Quaisquer mudanças foram observadas em HVR-H1 (SEQ ID NO: 134), HVR-H2 (SEQ ID NO: 135) ou HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) do anticorpo 20 "humanizado" enxertado com MA79b.
A figura 10 mostra várias sequências de HVR de variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (SEQ ID NOs: 22-106), incluindo L2-2 huMA79b (também referida aqui como "L2") e H3-10 huMA79b (também referida como "H3") onde cada variante tem mudanças de aminoácido 25 múltiplas em uma região de HVR única do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133); HVR-H1 (SEQ ID NO:134); a porção de HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) é mostrada na figura 10 como SEQ ID NO: 107). As sequências das cadeias leves variáveis e pesadas variáveis fora das mudanças de aminoácido mostradas eram idênticas ao enxerto huMA79b e não são mostradas. Quaisquer mudanças foram observadas em HVR-L1 (SEQ ID NO: 13) ou HVR-H2 (SEQ ID NO: 135) do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b.
A figura 11 mostra análise Biacore de anticorpos anti-CD79b selecionados, incluindo anticorpo de CD79b de murino (marcado como "MA79b"), anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcado como "enxerto huMA79b") e variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b, incluindo L2-2 huMA79b (52R, 53K, 55G, 56R; SEQ ID NO: 22), H3-10 10 huMA79b (98I, 99R, 100L; SEQ ID NO: 94), H1-6 huMA79b (28P, 30T, 31R, 35N; SEQ ID NO: 57) e L2/H3 huMA79b (mutações L2-2 e H3-10 descritas abaixo) para antígenos designados, incluindo o domínio extracelular de CD79b humano (huCD79ecd), o domínio extracelular de CD79b humano fundido a Fc (huCD79eCd-Fc) e um peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epitopo para 15 MA79b e chMA79b (SEQ ID NO: 16).
A figura 12 mostra análise Biacore de anticorpos antí-CD79b selecionados, incluindo anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcado como "enxerto huMA79b") e variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcado como 1-34 na primeira coluna ou como "toda 20 estrutura principal" na primeira coluna) para o domínio extracelular de CD79b humano (antígeno de huCD79b-ecd). Variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b incluem uma variante "toda estrutura principal" onde resíduos de estrutura principal de murino potencialmente importantes estão presentes e variantes (marcadas 1-34) com combinações de mutações de 25 estrutura principal com ou sem mutações de HVR na cadeia leve variável e na cadeia pesada variável conforme designado. Variante 17 de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (aqui referida como "huMA79b.v17") é marcada como 17 na primeira coluna, variante 18 de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (aqui referida como "huMA79b.v18") é marcada como 18 na primeira coluna, variante 28 de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (aqui referida como nhuMA79b.v17") é marcada como 28 na primeira coluna e variante 32 de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (aqui referida como "huMA79b.v17") é marcada como 32 na primeira coluna. Dobra de ligação bivalente é representada como a Kd da variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b particular (marcada como "Kdvariante")/a Kd do anticorpo MA79b quimérico (chMA79b) (marcado como "KdqUimera"); valores sob a coluna marcados "dobra de ligação bivalente" representam Kdvariante/Kdquimera- Nenhuma ligação detectada é designada na figura como "NBD".
As figuras 13A-B (estruturas principais de consenso pesadas variáveis (VH)) e figura 14 (estruturas principais de consenso leves variáveis (VL)) mostram sequências de estrutura principal de consenso humanas aceitadoras exemplares para uso na prática da presente invenção com identificadores de sequência como segue: (figuras 13A-B) estrutura principal de consenso subgrupo I VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 108), estrutura principal de consenso do subgrupo I VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 109-111), estrutura principal de consenso do subgrupo II VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 112), estrutura principal de consenso do subgrupo II VH humana menos regiões hipervariáveis (SEQ ID NOs: 113-115), estrutura principal de consenso do subgrupo III VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 116), estrutura principal de consenso do subgrupo III VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 117-119), estrutura principal aceitadora VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 120), estrutura principal aceitadora VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 121-122), estrutura principal aceitadora 2 VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 123) e estrutura principal 2 aceitadora VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 124-26) e (figura 14) estrutura principal de consenso do subgrupo I capa de VL humana (SEQ ID NO: 127), estrutura principal de consenso do subgrupo II capa de VL humana (SEQ ID NO: 128), estrutura principal de consenso do subgrupo III capa humana (SEQ ID NO: 129) e estrutura principal de consenso do subgrupo IV capa humana (SEQ ID NO: 130).
As figuras 15A (cadeia leve) e 15B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácido de um anticorpo da invenção (huMA79b.v17). As figura 15A (cadeia leve) e 15B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácido da estrutura principal (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e região Fc (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v17) (SEQ ID NOs: 152-159) (figura 15A) e SEQ ID NOs: 160-168 (figura 15B)). Sequências de aminoácido de comprimento integral (regiões variáveis e constantes) das cadeias leve e pesada de huMAb.v17 são mostradas (SEQ ID NO: 303 (figura 15A) e 304 (figura 15B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. Sequências de aminoácido dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 169) (figura 15A para cadeia leve) e SEQ ID NO: 170 (figura 15B para cadeia pesada).
As figuras 16A (cadeia leve) e 16B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácido de um anticorpo da invenção (huMA79b.v18). As figuras 16A (cadeia leve) e 16B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácido da estrutura principal (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e região Fc (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v18) (SEQ ID NOs: 171-178 (figura 16A) e SEQ ID NOs: 179-187 (figura 15B)). Sequências de aminoácido de comprimento integral (regiões variáveis e constantes) das cadeias leve e pesada de huMA79b.v18 são mostradas (SEQ ID NO: 305 (figura 16A) e 306 (figura 16B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. Sequências de aminoácido dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 188) (figura 16A para cadeia leve) e SEQ ID NO: 189 (figura 16B para cadeia 5 pesada).
As figuras 17A (cadeia leve) e 17B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácido de um anticorpo da invenção (huMA79b.v28). As figuras 17A (cadeia leve) e 18B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácido da estrutura principal (FR), região hipervariável (HVR), primeiro 10 domínio constante (CL ou CH1) e região Fc (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v28) (SEQ ID NOs: 190-197) (figura 17A) e SEQ ID NOs: 198-206 (figura 17B). Sequências de aminoácido de comprimento integral (regiões variáveis e constantes) das cadeias leve e pesada de huMA79b.v28 são mostradas (SEQ ID NO: 307) (figura 17A) e 308 (figura 17B), 15 respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. Sequências de aminoácido dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 207) (figuras 7A-B para cadeia leve) e SEQ ID NO: 208 (figuras 8A-B para cadeia pesada).
As figuras 18A (cadeia leve) e 18B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácido de um anticorpo da invenção (huMA79b.v32). As 20 figuras 18A (cadeia leve) e 18B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácido da estrutura principal (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e região Fc (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v32) (SEQ ID NOs: 209-216) (figura 18A) e SEQ ID NOs: 217-225 (figura 18B). Sequências de aminoácido de comprimento 25 integral (regiões variáveis e constantes) das cadeias leve e pesada de huMA79b.v32 são mostradas (SEQ ID NO: 309 (figura 18A) e 310 (figura 18B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. Sequências de aminoácido dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 226) (figura 18A para cadeia leve) e SEQ ID NO: 227 (figura 18B para cadeia pesada).
A figura 19 mostra o alinhamento das sequências de aminoácido de CD79b de humano (SEQ ID NO: 2), macaco cinomólogo (cino) (SEQ ID NO: 7) e camundongo (SEQ ID NO: 8). CD79bs de humano e cino têm identidade 5 de aminoácido de 85%. A sequência de sinal, peptídeo de teste (o epitopo de 11 aminoácidos para MA79b, chMA79b e anticorpo de CD79b anticino descrito no Exemplo 1: ARSEDRYRNPK (SEQ ID NO: 12)), domínio de transmembrana TM e domínio de motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) são indicados. A região na caixa é a região de CD79b que está ausente 10 na variante unida de CD79b (descrita no Exemplo 1).
A figura 20 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de BJAB-luciferase que mostra que administração de anticorpos anti-CD79b ((a) chMA79b-SMCC-DM1, carga de fármaco era aproximadamente 2,9 (Tabela 9) e (b) huMA79b L2/H3-SMCC- 15 DM1, carga de fármaco era aproximadamente 2,4 (Tabela 9)) a camundongos SCID tendo tumores de célula B significantemente inibiu crescimento de tumor. Controles incluíam Herceptin® (trastuzumabe)-SMCC-DMI (anti-Her2-SMCC- DM1).
A figura 21A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de Granta-519 (Linfoma de Célula do Manto Humano) que mostra a administração de anticorpos anti-CD79b ((a) chMA79b-SMCC-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 3,6 (Tabela 10), (b) huMA79b.v17-SMCC-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 3,4 (Tabela 10), (c) huMA79b.v28-SMCC-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 3,3 ou 3,4 (Tabela 10), (d) huMA79b.v18-SMCC-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 3,4 (Tabela 10) e (e) huMA79b.v32- SMCC-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 2,9 (Tabela 10) a camundongos SCID tendo tumores de célula B humanos significantemente inibiu crescimento de tumor. Controles incluíam Herceptin® (trastuzumabe)- SMCC-DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1). A figura 21B é um gráfico de mudança de peso percentual nos camudnongos de estudo de xenoenxerto de Granta- 519 (figura 21A e Tabela 10) mostrando que não houve nenhuma mudança 5 significante em peso durante os 7 primeiros dias do estudo, "hu" refere-se a anticorpo humanizado e "ch" refere-se a anticorpo quimérico.
A figura 22 mostra fotos de conjugados de anticorpo anti-CD79b engenheirados com cisteína - fármaco (ADC) onde uma porção de fármaco está ligada a um grupo cisteína engenheirado em: a cadeia leve (LC-AD); a 10 cadeia pesada (HC-ADC); e a região Fc (Fc-ADC).
A figura 23 mostra as etapas de: (i) redução de adutos de dissulfeto de cisteína e dissulfetos intercadeia e intracadeia em um anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína (TioMab) com agente de redução TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina); (ii) oxidação parcial, isto é, reoxidação 15 para formar novamente dissulfetos intercadeia e intracadeia, com dhAA (ácido desidroascórbico); e (iii) conjugação do anticorpo reoxidado com um intermediário fármaco-ligante para formar um conjugado de anti-CD79 de cisteína-fármaco.
A figura 24 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 20 229) e (B) sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 228) de anticorpo anti- CD79b engenheirado com cisteína humanizado (tio-huMA79b.v17-HC-A118C), onde uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial alanina 118; posição Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. Uma porção de fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína engenheirado na cadeia pesada. Em 25 cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto em negrito com sublinhado duplo. Sublinhado simples indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões sem sublinhado. A região Fc é marcada por itálico. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 25 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 231) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 230) de anticorpo anti- CD79b engenheirado com cisteína humanizado (tio-huMA79b.v18-HC-A118C), 5 onde uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial alanina 118; posição Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. Uma porção de fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína engenheirado na cadeia pesada. Em cada figura, um aminoácido alterado é mostrado em texto em negrito com sublinhado duplo. Sublinhado simples indica regiões constantes. Regiões 10 variáveis são regiões sem sublinhado. Região Fc é marcada por itálico. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 26 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 233) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 232) de anticorpo anti- 15 CD79b engenheirado com cisteína humanizado (tio-huMA79b.v28-HC-A118C), onde uma alanina na posição EU (alanina na posição sequencial 118; posição Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. Uma porção de fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína engenheirado na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto em negrito com 20 sublinhado duplo. Sublinhado simples indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões sem sublinhado. A região Fc é marcada por itálico. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína, enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 27 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 25 235) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 234) de anticorpo anti- CD79b engenheirado com cisteína (tio-MA79b-LC-V205C), uma valina na posição Kabat 205 (Valina na posição sequencial 209) da cadeia leve foi alterada para uma cisteína. Uma porção de fármaco pode ser ligada a um grupo cisteína engenheirado na cadeia leve. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto em negrito com sublinhado duplo. Sublinhado simples indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões sem sublinhado. A região Fc é marcada por itálico. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína.
A figura 28 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 237) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 236) de anticorpo anti- CD79b engenheirado com cisteína (tio-MA79b-HC-A118C), onde uma alanina na posição EU 118 (alanina na posição sequencial 118; posição Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. Uma porção de fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína engenheirado na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto em negrito com sublinhado duplo. Sublinhado simples indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões sem sublinhado. Região Fc é marcada por itálico. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína.
As figuras 29A-B são gráficos FACS indicando que ligação de conjugados tio-Mab anti-CD79b-ármaco (TDCs) da invenção ligados a CD79B expressa sobre a superfície de células BJAB-luciferase é similar para conjugado (A) variantes de tioMAb LC (V205C) e (B) variantes de tioMAb HC (A118C) de chMA79b com MMAF. Detecção foi com MS anti-humanolgG-PE. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína.
As figuras 30A-D são gráficos FACS indicando que ligação de conjugados tio-MAb anti-CD79b-fármaco (TDCs) da invenção ligados à CD79b expressa sobre a superfície de células BJAB- luciferase é similar para (A) variantes de tioMAb nu (não conjugado) HC (A118C) de huMA79b.v18 e variantes de tioMAb conjugado HC (C118C) de huMA79b.v18 com os conjugados de fármaco diferentes mostrados ((B) MMAF, (C) MMAE e (D) DM1)). Detecção foi com MS anti-humanolgG-PE. "Tio" refere-se a anticorpo I I engenheirado com cisteína enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
As figuras 31A-D são gráficos FACS indicando que ligação de conjugados tioMAb anti-CD79b-fármaco (TDCs) da invenção ligados à CD79b expressa sobre a superfície de células BJAB-luciferase é similar para (A) ariantes de tioMAb nu (não conjugado) HC (A118C) de huMA79b.v28 e variantes de tioMAb conjugado HC (A118C) de huMA79b.v28 com os conjugados de fármaco diferentes mostrados ((B) MMAE, ((C) DM1 e (D) MMAF)). Detecção foi com MS anti-humano-PE. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
As figuras 32A-D são gráficos FACS indicando que ligação de conjugados tioMAb anti-cinoCD79b-fármaco (TDCs) da invenção ligados à CD79b expressa sobre a superfície de células BJAB expressando cinoCD79b é similar para (A) variantes de tioMAb nu (não conjugado) HC (A118C) de anti- cinoCD79b (ch10D10) e variantes de tioMAb conjugado HC (A118C) de anti- cinoCD79b (chIODIO) com os conjugados de fármaco diferentes mostrados (V) MMAE, (C) DM1 e (D) MMAF)). A detecção foi com MS e anti-hulgG-PE. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína.
A figura 33A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em modelo de xenoenxerto de Granta-519 (Linfoma de Célula Manto Humana) que mostra que administração de TDCs anti-CD79b que variaram pela posição da cisteína engenheirada (LC (V205C) ou HC (A118C)) e/ou doses de fármaco diferentes a camundongos SCID tendo tumores de célula B humanos inibiu significantemente crescimento de tumor. Modelos de xenoenxerto tratados com tio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco era aproximadamente 1,9 (Tabela 11), ou tio chMA79b-LC (V205C)- MC-MMAF, a carga de fármaco era aproximadamente 1,8 (Tabela 11), mostraram uma inibição significante de crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluíam hu-anti-HER2-MC-MMAF e tio hu-anti-HER2-HC(A118C)- MC-MMAF e chMA79b-MC-MMAF. A figura 33B é um gráfico de mudança de peso percentual nos camundongos do estudo de xenoenxerto de Granta-519 (figura 33A e Tabela 11) mostrando que não houve nenhuma mudança significante em peso durante os primeiros 14 dias do estudo. "Tio" refere-se a 5 anticorpo engenheirado com cisteína enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 34A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) que mostra que administração de TDCs anti-CD79b conjugados a porções de 10 fármaco de ligação diferentes (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) a camundongos SCID tendo tumores de célula B humanos inibiu significantemente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco era aproximadamente 1,87 (Tabela 12), tio huMA79b.v28-HC (A118C)-BMPEO- 15 DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,85 (Tabela 12), ou tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco era aproximadamente 1,95 (Tabela 12), mostraram uma inibição significante de crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluíam controles anti- HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio hu-anti-HER2- 20 HC(A118C)-MC-MMAF, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controles huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 e tio huMA79b.v28- HC(A118C)) e controles anti-CD22 (tio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC- MMAF). A figura 34B é um gráfico de mudança de peso percentual nos camundongos do estudo de xenoenxerto de BJAB-luciferase (figura 34A e 25 Tabela 12) mostrando que não houve nenhuma mudança significante em peso durante os primeiros 7 dias do estudo. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 35a é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de WSU-DLCL2 (Linfoma de Célula Grande Difuso) que mostra que administração de TDCs anti-CD79b conjugados a porções de fármaco de ligação diferentes (MCvc PAB-MMAE, BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) a camundongos SCID tendo tumores de célula B humanos inibiu significantemente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco era aproximadamente 1,87 (Tabela 13), tio huMA79b.v28- HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,85 (Tabela 13), ou tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco era aproximadamente 1,95 (Tabela 13), mostraram uma inibição significante de crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluíam controles anti- HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controles huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 e tio huMA79b.v28- HC(A118C)) e controles anti-CD22 (tio hu-anti-CD22 (10F4v3)HC(A118C)-MC- MMAF). A figura 35B e um gráfico de mudança de peso percentual nos camundongos do estudo de xenoenxerto de WSU-DLCL2 (figura 35A e Tabela 13) mostrando que não houve nenhuma mudança significante em peso durante os primeiros 7 dias do estudo. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína enquanto ”hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 36 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto DOHH2 (Linfoma Folicular) que mostra que administração de TDCs anti-CD79 conjugados a porções de fármaco de ligação diferentes (BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE) a camundongos SCID tendo tumores de célula B humanos inibiu significantemente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28- BMPEO-DM1 (a carga de fármaco era aproximadamente 1,85 (Tabela 14)), tio huMA79b.v28-MC-MMAF (a carga de fármaco era aproximadamente 1,95 (Tabela 14)) ou tio MA79b-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE (a carga de fármaco era aproximadamente 1,87 (Tabela 14)) mostrou uma inibição significante de crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluíam controles anti- HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controles huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 e tio huMA79b.v28- HC(A118C)) e controles anti-CD22 (tio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC- MMAF). "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 37 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) que mostra que administração de TDCs anti-CD79b conjugados a porções de fármaco de ligação diferentes (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) e/ou administrados em doses diferentes conforme mostrado para camundongos SCID tendo tumores de célula B humanos inibiu significantemente crescimento de tumor. Modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,85 (Tabela 15), tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE, a carga de fármaco era aproximadamente 1,9 (Tabela 15), ou tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco era aproximadamente 1,9 (Tabela 15), mostraram uma inibição significante de crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluíam veículo (tampão sozinho), controles anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE), controles huMA79b.v28 (tio huMA79b.v28-HCA(A118C)) e controles anti-CD22 (tio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 38A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de Granta-619 (Linfoma de Célula Manto Humano) que mostra que administração de TDCs anti-CD79B conjugados a porções de fármaco diferentes (BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) e/ou 5 administrados em doses diferentes conforme mostrado para camundongos SCID tendo tumores de célula B humanos inibiu significantemente crescimento de tumor. Modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(A118C)- BMPEO-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,85 (Tabela 16), ou tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco era 10 aproximadamente 1,95 (Tabela 16), mostraram inibição significante de crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluíam controles anti- HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF). A figura 38B é um gráfico de mudança de peso percentual nos camundongos do estudo de xenoenxerto de Granta-519 (figura 15 38A e Tabela 16) mostrando que não houve nenhuma mudança significante em peso durante os primeiros 14 dias do estudo. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína enquanto "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 39 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de WSU-DLCL2 (Linfoma de Célula 20 Grande Difuso) que mostra que administração de TDCs anti-CD79b conjugados a porções de fármaco de ligação diferentes (BMPEO-DM1, MC- MMAF ou MCvcPAB-MMAE) e/ou administrados em doses diferentes conforme mostrado para camundongos SCID tendo tumores de célula B humanos inibiu significantemente crescimento de tumor. Modelos de xenoenxerto tratados com 25 tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,85 (Tabela 17), tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco era aproximadamente 1,9 (Tabela 17) ou tio huMA79b.v28- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco era aproximadamente 1,9 (Tabela 17), mostraram inibição significante de crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluíam veículo (tampão sozinho) e controles anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC- MMAF, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). "Tio” refere-se a 5 anticorpo engenheirado com cisteína e "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 40 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de Granta-519 humano (Linfoma de Célula Manto Humano) que mostra que administração de TDCs anti-CD79b conjugados a porções de fármaco de ligação diferentes (BMPEO-DM1 ou 10 MCvcPAB-MMAE) e/ou administrados em doses diferentes conforme mostrado a camundongos SCID tendo tumores de célula B humano significantemente inibiu crescimento de tumor. Modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,85 (Tabela 18) ou tio huMA79b.v28-HC(A118C)- 15 MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco era aproximadamente 1,87 (Tabela 18), mostraram inibição significante de crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluíam controles anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO- DM1, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína e "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 41 mostra um gráfico de resultados de ensaio de proliferação de célula in vitro com células de tumor (A) BJAB, (B) Granta-519 ou (C) WSU-DLCL2 tratadas com concentrações variáveis 0,001 a 1.0000 ng de TDC por ml, incluindo: (1) tio hu anti-gD-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE controle, carga de 2,0 MMAE/ab, (2) tio hu anti-gD-HC(A118C)-MC-MMAF 25 controle, carga de 2,1 MMAF/Ab, (3) tio hu anti-gD-HC(A118C)-BMPEO-DM1 controle, carga de 2,1 DM1/Ab, (4) tio huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF, carga de 1,91 MMAF/Ab, (5) tio huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1, carga de 1,8 DM1/Ab e (6) tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, carga de 2,0 MMAE/Ab. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína e "hu" refere-se a anticorpo humanizado. "gD" refere-se à glicoproteína D.
A figura 42 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:238) de cDNA PRO283627, onde a SEQ ID NO:235 é um clone chamado "DNA548455" (também referido aqui como "cino CD79b"). A sequência de nucleotídeo codifica CD79b de cinomólogo com os códons de início e parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 43 mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 239) derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 235 mostrada na figura 42.
A figura 44 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NOI: 240) da cadeia leve de anticorpo anticino CD79b (ch10D10). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia leve de anticorpo anticinoCD79b (ch10D10) com os códons e início e parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 45 mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO:241), sem a primeira sequência de sinal de 18 aminoácidoss, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NQ:240 mostrada na figura 44. As regiões variáveis (SEQ ID NQ:302) são regiões sem sublinhado.
A figura 46 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 242) da cadeia pesada de anticorpo anticino CD79b (ch10D10). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia pesada de anticorpo anticino CD79b (ch10D10) com os códons de início e parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 47 mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 243), sem a primeira sequência sinal de 18 aminoácidos e a última lisina (K) antes do códon de parada, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 242 mostrada na figura 46. As regiões variáveis (SEQ ID NO: 310) são regiões sem sublinhado.
A figura 48 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 245) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 244) de anticorpo anticino CD79b engenheirado com cisteína (Tio-anticinoCD79b-HC-A118C), onde uma alanina na posição EU 118 (alanina na posição sequencial 118; posição Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. O aminoácido D na posição EU 6 (sombreado na figura) da cadeia pesada pode ser alternativamente E. Uma porção de fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína engenheirado na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto em negrito com sublinhado duplo. Sublinhado simples indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões sem sublinhado. A região Fc é marcada por itálico. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína.
A figura 49 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NQ:300) e (B) sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO:299) de anticorpo anticino CD79b engenheirado com cisteína (Tio-anticinoCD79b-LC-V205C), onde uma valina na posição Kabat 205 (posição sequencial Valina 209) da cadeia leve foi alterada para cisteína. O aminoácido na posição EU 6 (sombreado na figura) da cadeia pesada pode ser alternativamente E. Uma porção de fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína engenheirado na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto em negrito com sublinhado duplo. Sublinhado simples indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões sem sublinhado. A região Fc é marcada por itálico. "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína.
A figura 50 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de BJAB-cinoCD79b (células BJAB expressando cinoCD79b) (Linfoma de Burkitt) que mostra que administração de TDCs anti-CD79b conjugados a porções de fármaco ligantes diferentes (BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE) a camundongos SCID tendo tumores de célula B humana significantemente inibiu crescimento de tumor.
Modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO- DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,85 (Tabela 19), tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco era aproximadamente 1,9 (Tabela 19), ou tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB- 5 MMAE, a carga de fármaco era aproximadamente 1,9 (Tabela 19), tio anticino CD79b (ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,8 (Tabela 19), tio anticino CD79b (ch10D10)-HC(A118C)- MC-MMAF, a carga de fármaco era aproximadamente 1,9 (Tabela 19), ou tio anticino CD79b (ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco , 10 era aproximadamente 1,86 (Tabela 19), mostraram inibição de crescimento de tumor significante durante o estudo. Controles incluíam controles anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAE). "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína e "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 51 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de BJAB-cinoCD79b (células BJAB expressando cinoCD79b) (Linfoma de Burtkitt) que mostra que a administração de TDCs anti-CD79b com porção de fármaco ligante BMPEO-DM1 administrados em doses diferentes conforme mostrado, a camundongos SCID 20 tendo tumores de célula B humanos, inibiu significantemente crescimento de tumor. Modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(A118C)- BMPEO-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,85 (Tabela 20), ou tio anticino (ch10D10)-HC(118C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco era aproximadamente 1,8 (Tabela 20), mostram inibição significante de 25 crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluíam controles anti- HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1) e controles huMA79b.v28 (tio huMA79b.v28-HC(A118C) e controles anti-cinoCD79b(ch10D10) (tio anti- cinoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)). "Tio" refere-se a anticorpo engenheirado com cisteína e "hu" refere-se a anticorpo humanizado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS
A invenção provê métodos, composições, estojos e artigos de fabricação para identificação de composições úteis para o tratamento de tumor hematopoiético em mamíferos e a métodos de uso dessas composições de matéria para o mesmo. Detalhes desses métodos, composições, estojos e artigos de fabricação são providos aqui.
I. TÉCNICAS GERAIS
A prática da presente invenção vai empregar, a menos que de outra maneira indicado, técnicas convencionais de Biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, Biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas integralmente na literatura, tal como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook e outros, 1989); "Oligonucleotídeo Synthesis" (M. J. Gait, Ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.l. Freshney, Ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel e outros, Eds., 1987, e atualizações periódicas); "PCR; The Polymerase Chain Reaction", (Mullis e outros, Ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas e outros, 2001).
II. DEFINIÇÕES
Para propósitos de interpretação do presente pedido, as definições que seguem se aplicarão e sempre que apropriado termos usados no singular vão também incluir plural e vice-versa. No caso de qualquer definição descrita conflitar com qualquer documento incorporado aqui a título de referência, a definição mostrada abaixo deve prevalecer.
Um "marcador de superfície de célula B" ou "antígeno de superfície de célula B" aqui é um antígeno expresso na superfície de uma célula B que pode ser direcionado com um antagonista que se liga a ele, incluindo, mas não limitado a, anticorpos para um antígeno de superfície de célula B ou uma forma solúvel de um antígeno de superfície de célula B capaz de antagonizar ligação de um ligante ao antígeno de célula B de ocorrência natural. Marcadores de superfície de célula B exemplares incluem os marcadores de superfície de leucócito CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (quanto a descrições vide The Leukocyte Antigen Facts Book, 2a Edição, 1997, Ed. Barelay e outros, Academic Press, Harcourt Brace & Co., Nova York). Outros marcadores de superfície de célula B incluem RP105, FcRH2, CR2 de célula B, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, BAFF, BLys, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA e 239287. O marcador de superfície de célula B de interesse particular é preferivelmente expresso em células B comparado com outros tecidos de não célula B de um mamífero e pode ser expresso em ambas as células B precursoras e células B maduras.
O termo "CD79b", conforme aqui usado, refere-se a qualquer CD79b nativo de qualquer fonte vertebrada, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, humanos, macaco cinomólogo (cino) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que de outra maneira indicado. CD79b humano é também referido como "PRO36249" (SEQ ID NO:2) e codificado pela sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:1) também referida aqui como "DNA225786". CD79b de cinomólogo é também aqui referido como "cino CD79b" ou "PRO283627" (SEQ ID NO: 239) e codificado pela sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 238) também referida aqui como "DNA548455". O termo "CD79b" também compreende CD79b de "comprimento integral" , sem processamento, bem como qualquer forma de CD79b que resulte do processamento na célula, O termo também compreende variantes de ocorrência natural de CD79b, por exemplo, variantes unidas, variantes alélicas e isoformas. Os polípeptídeos de CD79b descritos aqui podem ser isolados de 5 uma variedade de fontes, tal como de tipos de tecido humano ou de outra fonte, ou preparados através de métodos recombinantes ou sintéticos, Um "polipeptídeo de CD79b de sequência nativa" compreende um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácido de CD79b correspondente derivado da natureza. Tal sequência nativa de polípeptídeos de CD79b pode ser isolada 10 da natureza ou pode ser produzida através de meios recombinantes ou sintéticos. O termo "polipeptídeo de CD79b de sequência nativa" compreende especificamente formas truncadas ou secretadas de ocorrência natural do polipeptídeo de CD79b específico (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas 15 alternativamente unidas) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipeptídeo. Em certas modalidades da invenção, os polípeptídeos de CD79b de sequência nativa descritos aqui são polípeptídeos maduros ou de sequência nativa de comprimento integral compreendendo as sequências de aminoácido de comprimento integral mostradas nas figuras acompanhantes. Códons de 20 início e códons de parada (se indicado) são mostrados em fonte em negrito e sublinhados nas figuras. Resíduos de ácido nucleico indicados como "N" nas figuras acompanhantes são qualquer resíduo de ácido nucleico. No entanto, embora os polípeptídeos de CD79b descritos nas figuras acompanhantes sejam mostrados começar com resíduos metionina designados aqui como 25 posição 1 do aminoácido nas figuras, é concebível e possível que outros resíduos metionina localizados ou a montante ou a jusante da posição de aminoácido 1 nas figuras possam ser empregados como o resíduo de aminoácido de partida para os polípeptídeos de CD79b. "MA79b" ou "anticorpo de CD79b de murino" ou "anticorpo anti- CD79b de murino" é aqui usado para se referir especificamente a anticorpo monoclonal anti-CD79b de murino onde o anticorpo monoclonal anti-CD79b de murino compreende o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 (figuras 7A-B) e o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14 (figuras 8A-B). Anticorpo monoclonal anti-CD79b de murino pode ser comprado de fontes comerciais tal como Biomeda (anticorpo de CD79b anti-humano; Foster City, CA), BDbioscience (anticorpo de CD79b anti-humano; São Diego, CA) ou Ancell (anticorpo de CD79b anti-humano; Bayport, MN) ou gerado de clone de hibridoma 3A2-2E7 American Type Culture Collection (ATCC) de número de designação de depósito HB11413, depositado com ATCC em 20 de julho de 1993. "chMA79b" ou "anticorpo de MA79b quimérico" é usado aqui para se referir especificamente a anticorpo anti-CD79b anti-humano quimérico (conforme previamente descrito no Pedido U.S. Ns 11/462.336 depositado em 3 de agosto de 2006) onde o anticorpo anti-CD79b quimérico compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 4 (figura 4). A cadeia leve de SEQ ID NO: 4 compreende ainda o domínio variável de SEQ ID NO: 10 (figuras 7A-B) e o domínio constante de cadeia leve de lgG1 humana. O anticorpo anti-CD79b quimérico compreende ainda a cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 (figura 6). A cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 compreende ainda o domínio variável de SEQ ID NO: 14 (figuras 8A-B) e o domínio constante de cadeia pesada de lgG1 humana. "anti-cinoCD79b" ou "anticino CD79b" é usado aqui para se referir a anticorpos que se ligam a cino CD79b (SEQ ID NO: 239 da figura 43) (conforme anteriormente descrito no Pedido US N2 11/462.336 depositado em 3 de agosto de 2006). ”anti-cinoCD79b(ch10D10)" ou "ch10D10" é usado aqui para se referir a anticinoCD79b quimérico (conforme anteriormente descrito no
Pedido US N- 11/462.336 depositado em 3 de agosto de 2006) que se liga a cinoCD79b (SEQ ID NO: 239 da figura 43). Anti-cinoCD79b(ch10D10) ou ch10D10 é anticorpo anticinoCD79b quimérico que compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 241 (figura 45). AnticinoCD79b(ch10D10) ou ch10D10 5 compreende ainda a cadeia pesada de SEQ ID NO: 243 (figura 47). "MA79b-enxerto" ou "anticorpo 'humanizado' enxertado com MA79b" ou "enxerto humA79b" é usado aqui para se referir especificamente ao enxerto gerado pelo enxerto de regiões hipervariáveis de anticorpo anti-CD79b de murino (MA79b) em capa I de VL de consenso humana aceitadora (huKI) e 10 VH de consenso do subgrupo III humana (hulll) com R71A, N73T e L78A (Carter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992)) (Vide Exemplo 1A e figuras 7 (SEQ ID NO: 11) e 8 (SEQ ID NO: 15)).
Uma "modificação" de um resíduo/posição de aminoácido, conforme aqui usado, refere-se a uma mudança de uma sequência de 15 aminoácido primária comparado com uma sequência de aminoácido de partida, onde a mudança resulta de uma alteração de sequência envolvendo os ditos resíduo/posições de aminoácido. Por exemplo, modificações típicas incluem substituição do resíduo (ou na dita posição) com outro aminoácido (por exemplo, substituição conservative ou não conservative), inserção de um ou 20 mais (geralmente menos de 5 ou 3) aminoácidos adjacentes ao dito resíduo/posíção e deleção do dito resíduo/posição. Uma "substituição de aminoácido", ou sua variação, refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido existente em uma sequência de aminoácido (de partida) predeterminada com um resíduo de aminoácido diferente. Em geral e 25 preferivelmente, a modificação resulta em alteração em pelo menos uma atividade físico-química do polipeptídeo variante comparado com um polipeptídeo compreendendo a sequências de aminoácido de partida (ou "tipo selvagem"). Por exemplo, no caso de um anticorpo, uma atividade físico- química que é alterada pode ser afinidade de ligação, capacidade de ligação e/ou efeito de ligação sobre uma molécula-alvo.
O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e compreende especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-CD79b simples (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas, de neutralização, anticorpos monoclonais de comprimento completo ou intactos), composições de anticorpo anti-CD79b com especificidade de polipeptídeo, anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada), formados de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpos anti-CD79b de cadeia simples e fragmentos de anticorpos anti-CD79b (vide abaixo), incluindo fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, diacorpos, anticorpos de domínio simples (sdAbs), contanto que eles exibam a atividade biológica ou imunológica desejada. O termo "imunoglobulina" (lg) é usado intercomutavelmente com anticorpo aqui. Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou amadurecido por afinidade.
O termo "anticorpo anti-CD79b" ou "um anticorpo que se liga a CD79b" refere-se a um anticorpo que é capaz de ligação a CD79b com afinidade suficiente de maneira que o anticorpo seja útil como um agente de diagramanóstico e/ou terapêutico em direcionamento a CD79b. Preferivelmente, a extensão de ligação de um anticorpo anti-CD79b a uma proteína não-CD79b, não relacionada, é menos do que cerca de 10% da ligação do anticorpo a CD79b conforme medido, por exemplo, pelo radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a CD79b tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μM, S 100 nM, < 10 nM, < 1 nM ou < 0,1 nM. Em certas modalidades, anticorpo anti-CD79b se liga a um epitopo de CD79b que é conservado dentre CD79b de espécies diferentes.
Um "anticorpo isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam com usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o 5 anticorpo será purificado (1) para mais de 95% em peso de anticorpo conforme determinado através do método Lowry, e, mais preferivelmente, mais de 99% em peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido N-terminal ou interna através do uso de um sequenator de copo giratório ou (3) até homogeneidade através de SDS-PAGE . 10 sob condições de redução ou não redução usando azul Coomassie ou, preferivelmente, fingimento prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Geralmente, no entanto, anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de • 15 purificação.
A unidade de anticorpo de 4 cadeias básicas é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste em 5 da unidade de heterotetrâmero básica junto com um polipeptídeo adicional chamado cadeia J, 20 e então contém 10 sítios de ligação a antígeno, enquanto anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar montagens polivalentes compreendendo 2-5 das unidades de 4 cadeias junto com a cadeia J). No caso I de IgGs, a unidade de 4 cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons.
Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente, i enquanto as duas cadeias H são ligadas uma à outra por uma ou mais ligações dissulfeto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L tem também pontes dissulfeto intercadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem no terminal N um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e y θ quatro domínios CH para isotipos μ e ε. Cada cadeia L tem no terminal N um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. O VL está alinhado com o VH e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada 5 (CH1). Resíduos de aminoácido particulares são acreditados formar uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. O emparelhamento de um VH e um VL juntos forma um sítio de ligação de antígeno simples. Quanto à estrutura e propriedades das classes diferentes de anticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a edição, Daniel 10 P. Stites, Abba I. TerreTristam G., Parslow (Eds.), Appelton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 e Capítulo 6.
A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser designada a um de dois tipos distintos, chamados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes. Dependendo da 15 sequência de aminoácido do domínio constante das cadeias pesadas (CH), imunoglobulinas podem ser designadas a classes ou tipos diferentes. Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, tendo cadeias pesadas designadas α, δ, ε, y θ μ> respectivamente. As classes y e α são divididas mais em subclasses com base em diferenças relativamente pequenas em 20 sequências e função de CH, por exemplo, humanos expressam as subclasses que seguem: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2.
A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere- se aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como "VH". O domínio 25 variável da cadeia leve pode ser referido como "VL". Esses domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os sítios de ligação de antígeno.
O termo "variável" refere-se ao fato que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos. O domínio V faz a mediação de ligação de antígeno e definir especificidade de um anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente em todo o comprimento de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Ao contrário, as regiões V consistem em extensões relativamente invariantes chamadas regiões de estrutura principal (FRs) de 1530 aminoácidos separadas por regiões mais curtas de variabilidade extrema de chamadas "regiões hipervariáveis" que são cada uma de 9-12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativas compreendem cada um quatro FRs, adotando amplamente uma configuração folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam alças conectando, e em alguns casos fazendo parte, da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade intima pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno de anticorpos (vide Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente em ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo em citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC).
Um anticorpo "intacto" é um que compreende um sitio de ligação de antígeno bem como uma CL e pelo menos domínios constantes de cadeia pesada, CH^ CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de 25 sequência nativa humanos) ou sua variante de sequência de aminoácido. Preferivelmente, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras. Um "anticorpo nu" para os presentes propósitos é um anticorpo que não é conjugado a uma porção citotóxica ou radiomarcador. 47 "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente a região de ligação de antígeno ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (vide Patente U.S. N- 5 5.641.870, Exemplo 2; Zapata e outros, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Em uma modalidade, um fragmento de anticorpo compreende um sítio de ligação de antígeno do anticorpo intacto e então retém a habilidade em ligar antígeno.
Digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", e um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflete a habilidade em cristalizar prontamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira junto com o domínio de região variável da cadeia H (VH) e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente com relação à ligação de antígeno, isto é, ele tem um sítio de ligação de antígeno simples. Tratamento com pepsina de um anticorpo dá um fragmento F(ab')2 grande simples que corresponde mais ou menos a dois fragmentos Fab ligados por dissulfeto tendo atividade de ligação de antígeno divalente e é ainda capaz de reticular antígeno. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab por terem poucos resíduos adicionais no terminal carbóxi do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de impedimento de anticorpo. Fab'-SH é a presente designação para Fab' onde o(s) resíduo(s) cisteína(s) dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de impedimento entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.
O fragmento Fc compreende as porções carbóxi-terminais de ambas as cadeias H unidas por dissulfetos. As funções efetoras de anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, região que é também a parte reconhecida pelos receptores Fc (FcR) encontrados em certos tipos de célula. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de 5 reconhecimento e ligação de antígeno completo. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação não covalente, firme. Em uma espécie de Fv de cadeia simples (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve podem ser covalentemente ligados por um ligante de peptídeo flexível de 10 maneira que as cadeias leve e pesada podem se associar em uma estrutura "dimérica" análoga àquela em uma espécie de FV de duas cadeias. A partir da dobra desses dois domínios emanam seis alças hipervariáveis (3 alças de cada cadeia H e L) que contribuem para os resíduos de aminoácido para ligação de antígeno e conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No 15 entanto, mesmo um domínio variável simples (ou metade de um Fv compreendendo três CDRs específicas para um antígeno) tem a habilidade em reconhecer e ligar antígeno, embora em uma afinidade menor do que o sítio de ligação inteiro. "Fv de cadeia simples" também abreviado como "sFv" ou "scFv" 20 são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo VH e V|_ conectados em uma cadeia de polipeptídeo simples. Preferivelmente, o polipeptídeo de sFv compreende ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que sFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv vide Pluckthun no The Pharmacology of
Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore Eds., Springer-Verlag, Nova York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação a antígeno, fragmentos que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). OS fragmentos de anticorpo pequenos são preparados através de construção de fragmentos Fv (vide parágrafo anterior) com ligantes curtos cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL de maneira que emparelhamento intercadeia mas não intracadeia dos domínios V é obtido, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento tendo dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv "de cruzamento" onde os domínios VH e VLdos dois anticorpos estão presentes em cadeias de polipeptídeo diferentes. Diacorpos são descritos mais integralmente na, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; Hudson e outros, Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos são também descritos em Hudson e outros, Nat. Med., 9:129-134 (2003).
O termo "anticorpo monoclonal" conforme aqui usado refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto pelas possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um sítio antigênico único. Ainda, em contraste com preparações de anticorpo monoclonal que incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um determinante único no antígeno. Em adição à sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos pelo fato de que eles podem ser sintetizados sem contaminação por outros anticorpos. O modificador "monoclonal" não deve ser considerado como requerendo produção do anticorpo através nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem ser preparados através da metodologia de hibridoma primeiro descrita por Kohler e outros, Nature, 256:495 (1975) ou podem ser feitos usando métodos de DNA recombinante em células bacterianas, de animal ou planta eucarióticas, (vide, por exemplo, Patente U.S. N2 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem 5 ser também isolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson e outros, Nature, 352:624-628 (1991) e Marks e outros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os presentes anticorpos monoclonais incluem anticorpos "quiméricos" onde uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou . 10 homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia é idêntico a ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos ■ 15 de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (vide Patente U.S. N2 4.816.567; e Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos "primatizados" compreendendo sequências de ligação de antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, 20 Macaco do Velho Mundo, Ape, etc) e sequências de região constante humanas.
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, roedor) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada do anticorpo não humano. Para a maior parte, anticorpos humanizados são 25 imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) onde resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade de anticorpo desejadas. Em alguns casos, resíduos de região de estrutura principal (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Ainda, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente 5 ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado vai compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, onde todas ou substancialmente todas das alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou 10 substancialmente todas das FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado vai também compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes vide Jones e outros, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann e 15 outros, Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Estrutura. Biol., 2:593596 (1992). Vide também os artigos de revisão que seguem e referências citadas neles: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994). 20 "Tio" quando usado aqui para se referir a um anticorpo refere-se a
um anticorpo engenheirado com cisteína enquanto "hu” quando usado aqui para se referir a um anticorpo refere-se a um anticorpo humanizado.
Um "anticorpo humanizado" é um que possui uma sequência de aminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um 25 humano e/ou foi feito usando qualquer uma das técnicas para fabricação de anticorpos humanos conforme aqui descrito. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação de antígeno não humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas no campo incluindo bibliotecas de exposição de fago. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks e outros, J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos são métodos descritos em Cole e outros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner e outros, J. Immunol., 147(1 ):86-95 (1991). Vide também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001). Anticorpos humanos podem ser preparados através da administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta à provocação de antígeno, mas cujos loci endógenos foram desabilitados, por exemplo, xenocamundongos imunizados (vide, por exemplo, Patentes U.S. N— 6.075.181 e 6.150.584 com relação à tecnologia XENOMOUSE®). Vide também, por exemplo, Li e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 103:3557-3562 (2006) com relação a anticorpos humanos gerados através de uma tecnologia de hibridoma de célula B humana.
O termo "região hipervariável", "HVR" ou "HV" quando usado aqui refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas. Em geral, anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). Várias deüneações de região hipervariável estão em uso e são compreendidas aqui. As Regiões de Determinação de Complementaridade Kabat (CDRs) são baseadas em variabilidade de sequência e são as mais geralmente usadas (Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Chothia refere-se, ao contrário, à localização das alças estruturais (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). O final da alça CDR-H1 de Chothia quando numerada usando a convenção de numeração Kabat varia entre H32 e H34 dependendo do comprimento da alça (isto é porque o esquema de numeração Kabat localiza as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estiver presente, a alça termina em 32; se apenas 35A estiver presente, a alça termina em 33; se 5 ambas as 35A e 35B estiverem presentes, a alça termina em 34). As regiões hipervariáveis de AbM representam um compromisso entre as CDRs Kabat e alças estruturais de Chothia e são usadas pelo software de modelagem de anticorpo AbM da Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis "de contato" são baseadas em uma análise das estruturas de cristal complexas disponíveis. Os 10 resíduos de cada uma dessas regiões hipervariáveis são mencionados abaixo.
Figure img0001
Regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hipervariáveis estendidas" como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL e 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 25 94-102 ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat e outros, supra, para cada uma dessas definições.
Resíduos de "estrutura principal" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável outros que não os resíduos da região hipervariável aqui definidos.
O termo "numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat" ou "numeração de posição de aminoácido como em Kabat", e suas variações, refere-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis 5 de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpo em Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institute of Healht, Bethesda, MD (1991). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondendo a um encurtamento 10 de, ou inserção em, uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma inserção de aminoácido simples (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc, de acordo com Kabat) após o resíduo FR de cadeia pesada 82. A numeração Kabat de 15 resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo através de alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat "padrão".
O sistema de numeração Kabat é geralmente usado quando se referindo a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 20 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat e outros, Sequences of Immunological Interest, 5aEd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O "sistema de numeração EU" ou "índice EU" é geralmente usado quando se referindo a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina (por exemplo, o 25 índice EU relatado em Kabat e outros, supra). O "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração de resíduo do anticorpo EU de lgG1 humano. A menos que de outra maneira aqui declarado, referência a números de resíduo no domínio variável de anticorpos significa numeração de resíduo através do sistema de numeração Kabat. A menos que de outra maneira aqui declarado, referência a números de resíduo no domínio constante de anticorpos significa numeração de resíduo através do sistema de numeração EU (por exemplo, vide Pedido de Patente Provisório Norte-americano N2 60/640.323, figuras para 5 numeração EU).
Um anticorpo "maduro em afinidade" é um com uma ou mais alterações em uma ou mais HVRs do mesmo que resultam em um aperfeiçoamento na afinidade do anticorpo quanto a antígeno, comparado com um anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Anticorpos 10 maduros em afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou até mesmo picomolares para o antígeno-alvo. Anticorpos maduros em afinidade são produzidos através de procedimentos conhecidos na técnica. Marks e outros, Bio/Technology, 10:779-783 (1992) descrevem a maturação de afinidade através de embaralhamento de domínios VH e VL. Mutagênese aleatória de 15 HVR e/ou resíduos de estrutura principal é descrita por: Barbas e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3809-3813 (1994); Schier e outros, Gene 169:147-155 (1995); Yelton e outros, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson e outros, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins e outros, J. Mol. Biol. 226:889896 (1992). 20 Um anticorpo "de bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é um que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno que ele se liga, Anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno.
Um "anticorpo antagonista", conforme aqui usado, é um anticorpo 25 que imita pelo menos uma das atividades funcionais de um polipeptídeo de interesse.
Um "anticorpo dependente da espécie", por exemplo, um anticorpo IgE anti-humano de mamífero, é um anticorpo que tem uma afinidade de ligação mais forte com um antígeno de uma primeira espécie de mamífero do que ele tem para um homólogo daquele antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente de espécie "se liga especificamente" a um antígeno humano (isto é, tem um valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais do que cerca de 1 x 10'7, preferivelmente não mais do que cerca de 1 x 10’8 e mais preferivelmente não mais do que cerca de 1 x 1CT9 M), mas tem uma afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humana que é pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes, mais fraca do que sua afinidade de ligação para o antígeno humano. O anticorpo dependente da espécie pode ser qualquer um dos vários tipos de anticorpos conforme acima definido, mas preferivelmente é um anticorpo humanizado ou humano. "Afinidade de ligação" refere-se em geral à resistência do total da soma de interações não covalentes entre um sítio de ligação único de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu par de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que de outra maneira indicado, conforme aqui usado, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para o seu par Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (Kd). Afinidade pode ser medida através de métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos aqui. Anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam a antígeno lentamente e tendem a dissociar prontamente, enquanto anticorpos de afinidade alta geralmente se ligam ao antígeno mais rápido e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos de medição de afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer uma das quais pode ser usada para propósitos da presente invenção. Modalidades ilustrativas específicas são descritas a seguir. "Ou melhor" quando usado aqui para se referir à afinidade de ligação refere-se a uma ligação mais forte entre uma molécula e seu par de ligação. "Ou melhor" quando usado aqui refere-se a uma ligação mais forte, representada por um valor Kd numérico menor. Por exemplo, um anticorpo que tem uma afinidade para um antígeno de "0,6 nM ou melhor", a afinidade do anticorpo para o antígeno é <0,6 nM, isto é, 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM, etc, ou qualquer valor menos do que 0,6 nM.
Em uma modalidade, a "Kd" ou o "valor Kd" de acordo com a presente invenção é medida através de um ensaio de ligação de antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno é descrito pelo ensaio que segue que mede afinidade de ligação de solução de Fab a antígeno através de equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (12ol) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado, então captura do antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen e outros (1999), J. Mol. Biol., 293:865-881). Para estabelecer condições para o ensaio, placas de microtitulação (Dynex) são revestidas da noite para o dia com 5 μg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (PH 9,6) e subsequentemente bloqueadas com 2% (p/v) de albumina de soro bovino em PBS por duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não absorvente (Nunc N2 269620), [1z5l]-antígeno 100 pM ou 26 pM são misturados com diluições seriais de um Fab de interesse (por exemplo, de acordo com a avaliação de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta e outros (1997), Cancer Res., 57:4593-4599). O Fab de interesse é então incubado da noite para o dia; no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo, 65 horas) para assegurar que equilíbrio seja atingido. Desta maneira, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação em temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com Tween-20 0,1% em PBS. Quando as placas são secas, 150 μl/cavidade de cintilante (MicroScint-20; Packard) são adicionados, e as placas 5 são contadas em um contador Topcount gamma (Packard) por dez minutos.
Concentrações de cada Fab que dão menos do que ou igual a 20% de ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitivos.
De acordo com outra modalidade, a Kd ou valor Kd é medido usando ensaios de ressonância de plasmon de superfície usando um BIAcore®- 2000 ou BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25° C com lascas CM5 de antígeno imobilizado em ~10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de A/-etil-/V-(3-dimetilaminopropil)- carbodi-imida (EDC) e /V-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, em 5 ug/ml (-0,2 uM) antes da injeção em uma taxa de fluxo de 5 ul/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Seguindo a injeção de antígeno, etanolamina 1 M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais duplas de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com Tween-20 0,05% (PBST) a 25° C em uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 ul/ml. Taxas de associação (Kon) θ taxas de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo de ligação Langmuir um-para-um simples (BIAcore Evaluation Software versão 3.2) através de ajuste simultâneo do sensorgrama de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a razão kOff/kOn. Vide, por exemplo, Chen, Y. e outros (1999), J. Mol. Biol., 293:865-881. Se a taxa on exceder 105 M’1 S’1 pelo ensaio de ressonância de plasmon de superfície acima, então a taxa on pode ser determinada usando uma técnica de extinção fluorescente que mede o aumento ou diminuição em intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passa banda 16 nm) a 25° C de um anticorpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de 5 concentrações altas de antígeno conforme medido em um espectrômetro, tal como um espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou um espectrômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho vermelho de agitação.
Uma "taxa on" ou "taxa de associação" ou "kon" de acordo com a 10 presente invenção pode ser também determinada com a mesma técnica de ressonância de plasmon de superfície descrita acima usando um BIAcore® 2000 ou um BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) conforme acima descrito.
A expressão "substancialmente similar" ou "substancialmente 15 igual", conforme aqui usado, significa um grau suficientemente alto entre dois valores numéricos (geralmente um associado com um anticorpo da invenção e o outro associado com um anticorpo de referência/comparador) de maneira que um versado na técnica consideraria que diferença entre os dois valores seria de pouca ou nenhuma significância biológica e/ou estatística dentro do 20 contexto da característica biológica medida pelos ditos valores (por exemplo, valores Kd). A diferença entre os ditos dois valores é preferivelmente menos do que cerca de 50%, preferivelmente menos do que cerca de 40%, preferivelmente menos do que cerca de 30%, preferivelmente menos do que cerca de 20%, preferivelmente menos do que cerca de 10% como uma função 25 do valor para o anticorpo de referência/comparador.
A expressão "substancialmente reduzido" ou "substancialmente diferente", conforme aqui usado, significa um grau suficientemente alto de diferença entre dois valores numéricos (geralmente um associado com um anticorpo da invenção e o outro associado com um anticorpo de referência/comparador) de maneira que um versado na técnica consideraria que diferença entre os dois valores seria de significância estatística dentro do contexto da característica biológica medida pelos ditos valores (por exemplo, 5 valores Kd, resposta HAMA). A diferença entre os ditos dois valores é preferivelmente maior do que cerca de 10%, preferivelmente maior do que cerca de 20%, preferivelmente maior do que cerca de 30%, preferivelmente maior do que cerca de 40%, preferivelmente maior do que cerca de 50% como uma função do valor para o anticorpo de referência/comparador.
Um "antígeno" é um antígeno predeterminado ao qual um anticorpo pode seletivamente se ligar. O antígeno-alvo pode ser polipeptídeo, carboidrato, ácido nucleico, lipídeo, hapteno ou outro composto de ocorrência natural ou sintético. Preferivelmente, o antígeno-alvo é um polipeptídeo.
Uma "estrutura principal humana aceitadora" para os presentes 15 propósitos é uma estrutura principal compreendendo a sequência de aminoácido de uma estrutura principal de VL ou VH derivada de uma estrutura principal de imunoglobulina humana ou de uma estrutura principal de consenso humana. Uma estrutura principal humana aceitadora "derivada de" uma estrutura principal de imunoglobulina humana ou estrutura principal de 20 consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácido da mesma ou pode conter mudanças de sequência de aminoácido preexistentes. Onde mudanças de aminoácido preexistentes estiverem presentes, preferivelmente não mais do que 5 e preferivelmente 4 ou menos, ou 3 ou menos, mudanças de aminoácido preexistentes estão presentes. Onde 25 mudanças de aminoácido preexistentes estiverem presentes em um VH, preferivelmente essas mudanças são as únicas lá, em três, duas ou uma das posições 71H, 73H e 78H. Por exemplo, os resíduos de aminoácido nessas posições podem ser 71 A, 73T e/ou 78A. Em uma modalidade, uma estrutura principal humana aceitadora de VL é idêntica em sequência à sequência da estrutura principal de imunoglobulina humana de VL ou sequência de estrutura principal de consenso humana.
Uma "estrutura principal de consenso humana" é uma estrutura 5 que representa o resíduo de aminoácido de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de estrutura principal de VL ou VL de imunoglobulina humana. Em geral, a seleção de sequências de VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Em geral, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat e outros. Em uma 10 modalidade, para a VL, o subgrupo é um subgrupo capa I como em Kabat e outros. Em uma modalidade, para a VH, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat e outros.
Uma "estrutura principal de consenso de subgrupo III de VH" compreende a sequência de consenso obtida das sequências de aminoácido 15 em subgrupo III pesada variável de Kabat e outros. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da estrutura principal de consenso do subgrupo III de VH compreende pelo menos uma porção ou toda de cada uma das sequências que seguem: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143)-H1- WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144)-H2- RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145)-H3- WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
Uma "estrutura principal de consenso de subgrupo I de VL" compreende a sequência de consenso obtida das sequências de aminoácido em subgrupo I capa leve variável de Kabat e outros. Em uma modalidade, a 25 sequência de aminoácido da estrutura principal de consenso do subgrupo I de VL compreende pelo menos uma porção ou toda de cada uma das sequências que seguem: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 139)-L1- WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 140)-L2- GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 141)-L3- FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 142).
Uma "estrutura principal humana não modificada" é uma estrutura 5 principal humana que tem a mesma sequência de aminoácido que a estrutura principal humana aceitadora, por exemplo, sem a(s) substituição(ões) de aminoácido não humano na estrutura principal humana aceitadora.
Uma "região hipervariável alterada" para os presentes propósitos é uma região hipervariável compreendendo uma ou mais substituição(ões) de 10 aminoácido (por exemplo, uma a cerca de 16) nela.
Uma "região hipervariável não modificada" para os presentes propósitos é uma região hipervariável tendo a mesma sequência de aminoácido que o anticorpo não humano do qual ela é derivada, isto é, uma que não tem uma ou mais substituições de aminoácido na mesma.
Um anticorpo "que liga" um antígeno de interesse, por exemplo, um alvo de antígeno de polipeptídeo associado a tumor, é um que se liga ao antígeno com afinidade suficiente de maneira que o anticorpo seja útil como um agente terapêutico em direcionamento a uma célula ou tecido expressando o antígeno, e não reage com cruzamento significantemente com outras 20 proteínas. Em tais modalidades, a extensão de ligação do anticorpo a uma proteína "não alvo" será menos do que cerca de 10% da ligação do anticorpo à sua proteína-alvo particular conforme determinado através de análise de seleção de célula ativada por fluorescência (FACS) ou radioimunoensaio (RIA). Com relação à ligação de um anticorpo a uma molécula-alvo, o termo "ligação 25 específica" ou "liga especificamente a" ou "é específico para" um polipeptídeo particular ou um epitopo em um alvo de polipeptídeo particular significa ligação que é mensurável diferente de uma interação não específica. Ligação específica pode ser medida, por exemplo, através da determinação da ligação de uma molécula comparado com ligação de uma molécula controle, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação. Por exemplo, ligação específica pode ser determinada através de competição com uma molécula controle que é similar ao alvo, por exemplo, um 5 excesso de alvo não marcado. Neste caso, ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda for competitivamente inibida por alvo não marcado em excesso. O termo "ligação específica" ou "se liga especificamente" ou "é específico para" um polipeptídeo ou um epitopo particular em um alvo de polipeptídeo particular conforme aqui usado pode ser exibido, por exemplo, por 10 uma molécula tendo uma Kd para o alvo de pelo menos cerca de 10’4 M, alternativamente pelo menos cerca de 10'5 M, alternativamente pelo menos cerca de 10’6 M, alternativamente pelo menos cerca de 10'7 M, alternativamente pelo menos cerca de 10'8 M, alternativamente pelo menos cerca de 10‘9 M, altemativamente pelo menos cerca de IO'10 M, 15 alternativamente pelo menos cerca de 10'11, alternativamente pelo menos cerca de 10'12 ou mais. Em uma modalidade, o termo "ligação específica" refere-se à ligação onde uma molécula se liga a um polipeptídeo ou epitopo particular em um polipeptídeo particular sem substancialmente de ligar a qualquer outro polipeptídeo ou epitopo de polipeptídeo.
Um anticorpo que "inibe o crescimento de células de tumor expressando um polipeptídeo de CD79b" ou um anticorpo "inibidor de crescimento" é um que resulta em inibição de crescimento mensurável de células de câncer expressando ou superexpressando o polipeptídeo de CD79b apropriado. O polipeptídeo de CD79b pode ser um polipeptídeo de 25 transmembrana expresso sobre a superfície de uma célula de câncer ou pode ser um polipeptídeo que é produzido e secretado por uma célula de câncer. Anticorpos anti-CD79b inibidores de crescimento preferidos inibem crescimento de células de tumor expressando CD79b em mais de 20%, preferivelmente de a partir de cerca de 20% a cerca de 50% e mais preferivelmente ainda em mais de 50% (por exemplo, de a partir de cerca de 50% a cerca de 100%) comparado com o controle apropriado, o controle sendo tipicamente células de tumor não tratadas com o anticorpo sendo testado. Em uma modalidade, inibição de crescimento pode ser medida em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,1 a 30 μg/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura de célula, onde a inibição de crescimento é determinada 1-10 dias após exposição das células de tumor ao anticorpo. Inibição de crescimento de células de tumor in vivo pode ser determinada de várias maneiras tal como é descrito na seção de Exemplos Experimentais abaixo. O anticorpo é inibidor de crescimento in vivo se administração do anticorpo anti-79b em cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal resultar em redução em tamanho de tumor ou proliferação de célula de tumor dentro de cerca de 5 dias a 3 meses da primeira administração do anticorpo, preferivelmente dentro de cerca de 5 a 30 dias.
Um anticorpo que "induz apoptose" é um que induz morte de célula programada conforme determinado através da ligação de anexina V, fragmentação de DNA, reticulação celular, dilatação de retículo endoplásmico, fragmentação celular e/ou formação de vesículas de membrana (chamados corpos apoptóticos). A célula é geralmente uma que superexpressa um polipeptídeo de CD79b. Preferivelmente a célula é uma célula de tumor, por exemplo, uma célula hematopoiética, tal como uma célula B, célula T, basófilo, eosinófilo, neutrófilo, monócito, plaqueta ou eritrócito. Vários métodos estão disponíveis para avaliação de eventos celulares associados com apoptose. Por exemplo, translocação de fosfatidil serina (PS) (Phosphatidyl serine) pode ser medida através de ligação de anexina; fragmentação de DNA pode ser avaliada através de DNA laddering; e condensação nuclear/cromatina junto com fragmentação de DNA pode ser avaliada através de qualquer aumento em células hipodiploides. Preferivelmente, o anticorpo que induz apoptose é um que resulta em cerca de 2 a 50 vezes, preferivelmente cerca de 5 a 50 vezes, e mais preferivelmente cerca de 10 a 50 vezes, indução de ligação de anexina com relação à célula não tratada em ensaio de ligação de anexina.
Um anticorpo que "induz morte celular" é um que faz com que uma célula viável se torne não viável. A célula é uma que expressa um polipeptídeo de CD79b e é de um tipo de célula que expressa ou superexpressa especificamente um polipeptídeo de CD79b. A célula pode ser célula não cancerosa ou célula normal do tipo de célula particular. O 10 polipeptídeo de CD79b pode ser um polipeptídeo de transmembrana expresso sobre a superfície de uma célula de câncer ou pode ser um polipeptídeo que é produzido e secretado por uma célula de câncer. A célula pode ser uma célula de câncer, por exemplo, uma célula B ou célula T. Morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de complemento e células efetoras in vivo para 15 distinguir morte celular induzida por citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) ou citotoxidez dependente de complemento (CDC) (Complement Dependent cytotoxicity). Então, o ensaio quanto à morte celular pode ser realizado usando soro inativado por calor (isto é, na ausência de complemento) e na ausência de 20 células efetoras imunes. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir morte celular, perda de integridade de membrana conforme avaliado pela absorção de iodeto de propídio (PI) (Propidium Iodide), azul tripano (vide Moore e outros, Cytotechnology, 17:1-11 (1995)) ou 7AAD pode ser avaliada com relação a células não tratadas. Anticorpos de indução de morte celular 25 preferidos são aqueles que induzem absorção de PI no ensaio de absorção de PI em células BT474. "Funções efetoras" de anticorpo refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo, e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação de C1q e citotoxidez dependente de complemento; ligação do receptor de Fc; citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; sub-regulagem de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B); e ativação de célula B.
O termo "região Fc" aqui é usado para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina, incluindo regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada da imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida se estender de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, para o seu terminal carboxila. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou engenheirando recombinantemente o ácido nucleico codificando uma cadeia pesada do anticorpo. Desta maneira, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpo com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpo sem quaisquer resíduos K447 removidos e populações de anticorpo tendo uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.
Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc de sequência nativa. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação de C1q; CDC; ligação ao receptor de Fc; ADCC; fagocitose; sub-regulagem de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conforme descrito, por exemplo, em definições aqui.
Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de lgG1 humana de sequência nativa (alotipos não-A e A); região Fc de lgG2 humana de sequência nativa; região Fc de lgG3 humana de sequência nativa; e região Fc de lgG4 humana de sequência nativa bem como suas variantes de ocorrência natural.
Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácido que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, preferivelmente uma ou mais substituição(ões) de aminoácido. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de a partir de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácido e preferivelmente de a partir de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A presente região Fc variante vai preferivelmente possuir pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com ela, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com ela. "Citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxidez onde lg secretada ligada a receptores de Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Assassinas Naturais (NK) (Natural Killer), neutrófilos e macrófagos) permite que essas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula-alvo carregando antígeno e subsequentemente matem a célula-alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente requeridos para tal morte. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam FcyRIII apenas, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. Expressão de Fc em células hematopoiéticas é sumarizada na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, 5 Aπnu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio ADCC in vitro, tal como aquele descrito na Patente U.S. N° 5.500.362 ou 5.821.337, pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) (Peripheral Blood Mononuclear Cells') e células Assassinas 10 Naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito em Clynes e outros (USA) 95:652-656 (1998). "Receptor de Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência 15 nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente unidas desses receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácido 20 similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplásmicos. O receptor FcyRIIA de ativação contém um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) em seu domínio citoplásmico. O receptor FcyRIIB de inibição contém um motivo de inibição baseado em tirosina imunorreceptora (ITIM) 25 (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif) em seu domínio citoplásmico. (Vide revisão M. em Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991); Capel e outros, Immunomethods, 4:25-34 (1994); e Haas e outros, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são compreendidos pelo termo "FcR" aqui. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer e outros, J. Immunol., 117:587 (1976) e Kim e outros, J. Immunol., 24:249 (1994)), Ligação a FcRn humano in vivo e meia-vida no soro de polipeptídeos de ligação de afinidade alta para FcRn humano podem ser ensaiadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens de célula humana transfectadas expressando FcRn ou em primatas aos quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. O WO 2004/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpo com ligação aperfeiçoada ou menor a FcRs. Vide também, por exemplo, Shields e outros, J. Biol. Chem., 9(2):6591-6604 (2001). "Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferivelmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que fazem a mediação de ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com células PBMCs e NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, de sangue. "Citotoxidez dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula-alvo na presença de complemento. Ativação do curso de complemento clássico é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados ao seu antígeno cognato. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro e outros, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizado. Variantes de polipeptídeo com sequências de aminoácido de região Fc alteradas (polípeptídeos com uma região Fc variante) e capacidade de ligação de C1q aumentada ou diminuída são descritas, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.194.551 B1 e no WO 1999/51642. Vide também, por exemplo, Idusogie e 5 outros, J. Immunol., 164:4178-4148 (2000).
O termo "anticorpo compreendendo região Fc" refere-se a um anticorpo que compreende uma região Fc. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou através de engenharia 10 recombinante do ácido nucleico codificando o anticorpo. Desta maneira, uma composição compreendendo um anticorpo tendo uma região Fc de acordo com a presente invenção pode compreender um anticorpo com K447, com todos os K447 removidos ou uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.
O "domínio extracelular" ou "ECD" de polipeptídeo de CD79b 15 refere-se a uma forma do polipeptídeo de CD79b que é essencialmente livre dos domínios de transmembrana e citoplásmico. Geralmente, um ECD de polipeptídeo de CD79b terá menos do que 1% de tais domínios de transmembrana e/ou citoplásmicos e preferivelmente terá menos do que 0,5% de tais domínios. Será compreendido que quaisquer domínios de 20 transmembrana identificados para os polípeptídeos de CD79b da presente invenção são identificados de acordo com critérios rotineiramente empregados na técnica para identificação daquele tipo de domínio hidrofóbico. Os limites máximos de um domínio de transmembrana podem variar, no entanto, mais provavelmente em não mais do que 5 aminoácidos em qualquer extremidade 25 do domínio como inicialmente identificado aqui. Opcionalmente, desta maneira, um domínio extracelular de um polipeptídeo de CD79b pode conter de a partir de cerca de 5 ou menos aminoácidos em qualquer lado do limite do domínio de transmembrana/domínio extracelular conforme identificado nos Exemplos ou relatório e tais polipeptídeos, com ou sem o peptídeo de sinal associado, e ácido nucleico codificando-os, são compreendidos pela presente invenção.
A localização aproximada dos "peptídeos de sinal" do polipeptídeo de CD79b descrito aqui pode ser mostrada no presente relatório e/ou figuras acompanhantes. É notado, no entanto, que o limite C-terminal de um peptídeo de sinal pode variar, no entanto, provavelmente em não mais do que cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite C-terminal do peptídeo de sinal conforme inicialmente aqui identificado, onde o limite C-terminal do peptídeo de sinal pode ser identificado de acordo com critérios rotineiramente empregados na técnica para identificação daquele tipo de elemento de sequência de aminoácido (por exemplo, Nielsen e outros, Prot. Eng., 10:1-6 (1997) e von Heinje e outros, Nucl. Acids Res., 14:4683-4690 (1986)). Além disso, é também reconhecido que, em alguns casos, clivagem de uma sequência de sinal de um polipeptídeo secretado não é totalmente uniforme, resultando em mais de uma espécie secretada. Esses polipeptídeos maduros, onde o peptídeo de sinal é clivado dentro de não mais do que cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite C-terminal do peptídeo de sinal conforme identificado aqui, e os polinucleotídeos codificando-os, são compreendidos pela presente invenção. "Variante de polipeptídeo de CD79b" significa um polipeptídeo de CD79b, preferivelmente um polipeptídeo de CD79b ativo, conforme aqui definido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de polipeptídeo de CD79b de sequência nativa de comprimento integral conforme aqui descrito, uma sequência de polipeptídeo de CD79b sem o peptídeo de sinal conforme aqui descrito, um domínio extracelular de um polipeptídeo de CD79b, com ou sem o peptídeo de sinal, conforme aqui descrito ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo de CD79b de comprimento integral conforme aqui descrito (tais como aqueles codificados por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência de codificação completa para um polipeptídeo de CD79b de comprimento integral). Tais variantes de polipeptídeo de CD79b incluem, por exemplo, polipeptídeos onde um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados, ou deletados, no terminal N ou C da sequência de aminoácido 5 nativa de comprimento integral. Geralmente, uma variante de polipeptídeo de CD79b terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácido, com uma sequência de * 10 polipeptídeo de CD79b de sequência nativa de comprimento integral conforme aqui descrito, uma sequência de polipeptídeo de CD79b sem o peptídeo de sinal conforme aqui descrito, um domínio extracelular de um polipeptídeo de CD79b, com ou sem o peptídeo de sinal, conforme descrito aqui ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de polipeptídeo de 15 CD79b de comprimento integral conforme aqui descrito. Geralmente, polipeptídeos variantes de CD79b são de pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 20 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de comprimento ou mais. Opcionalmente, polipeptídeos variantes de CD79b não terão mais do que uma substituição de aminoácido conservative comparado com a sequência de polipeptídeo de CD79b nativa, alternativamente não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 25 substituições de aminoácido conservativas comparado com a sequência de polipeptídeo de CD79b nativa. "Porcentagem de identidade de sequência de aminoácido (%)" com relação a uma sequência de peptídeo ou polipeptídeo, isto é, sequências de polipeptídeo de CD79b identificadas aqui, é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência de peptídeo ou polipeptídeo específica, isto é, sequência de polipeptídeo de CD79b, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para obter a identidade de sequência percentual máxima, e não considerando quaisquer substituições conservatives como parte da identidade de sequência. Alinhamento para propósitos de determinação da identidade de sequência de aminoácido percentual pode ser obtido de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software de computador publicamente disponível tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medição de alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter alinhamento máximo no comprimento inteiro das sequências sendo comparadas. Para os presentes propósitos, no entanto, valores de % de identidade de sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2, onde o código-fonte completo para o programa ALIGN-2 é provido na Tabela 1 abaixo. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc., e o código-fonte mostrado na Tabela 1 abaixo foi depositado com documentação do usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde ele está registrado sob o U.S. Copyrigty Registration Ns TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível da Genentech, Inc., Sul de São Francisco, Califórnia ou pode ser compilado do código-fonte provido na Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema de operação UNIX, preferivelmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações de sequência de aminoácido, a % de identidade de sequência de aminoácido de uma dada sequência de aminoácido A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácido B (que pode alternativamente ser expressa como 5 uma dada sequência de aminoácido A que tem ou compreende certa % de identidade de sequência de aminoácido para, com ou contra uma dada sequência de aminoácido B) é calculada como segue: 100 vezes a fração X/Y onde X é o número de resíduos de aminoácido classificados como combinações idênticas pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 10 no alinhamento deste programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Será compreendido que onde o comprimento de sequência de aminoácido A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácido B, a % de identidade de sequência de aminoácido de A para B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácido de B para A. 15 "Polinucleotídeo de variante de CD79b" ou "sequência de ácido nucleico de variante de CD79b" significa uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de CD79b, preferivelmente um polipeptídeo de CD79b ativo, conforme aqui definido e que tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de ácido nucleico com uma sequência de ácido 20 nucleico codificando uma sequência de polipeptídeo de CD79b de sequência nativa de comprimento integral conforme aqui descrito, uma sequência de polipeptídeo de CD79b de sequência nativa de comprimento integral sem o peptídeo de sinal conforme aqui descrito, um domínio extracelular de um polipeptídeo de CD79b, com ou sem o peptídeo de sinal, conforme aqui 25 descrito ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo de CD79b de comprimento integral conforme aqui descrito (tais como aqueles codificados por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência de codificação completa para um polipeptídeo de CD79b de comprimento integral). Geralmente, um polinucleotídeo variante de CD79b terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de polipeptídeo de CD79b de sequência nativa de comprimento integral conforme aqui descrito, uma sequência de polipeptídeo de CD79b de sequência nativa de comprimento integral sem o peptídeo de sinal conforme aqui descrito, um domínio extracelular de um polipeptídeo de CD79b, com ou sem a sequência de sinal, conforme aqui descrito ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo de CD79b de comprimento integral conforme aqui descrito. Variantes não compreendem a sequência de nucleotídeo nativa. Geralmente, polinucleotídeos variantes de CD79b são pelo menos de 5 nucleotídeos de comprimento, alternativa mente pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ou 1000 nucleotídeos de comprimento, onde neste contexto o termo "cerca de" significa o comprimento da sequência de nucleotídeo referido mais ou menos 10% deste comprimento referido. "Porcentagem (%) de identidade de sequência de ácido nucleico" com relação às sequências de ácido nucleico codificando CD79b identificadas aqui é definida como a porcentagem de nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticas aos nucleotídeos na sequência de ácido nucleico de CD79b de interesse, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para obter identidade de sequência percentual máxima. Alinhamento para propósitos de determinação de identidade de ácido nucleico percentual pode ser obtido de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software de computador publicamente disponível tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Para os presentes propósitos, no entanto, % de valores de identidade de sequência de ácido nucleico são geradas usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2, onde o código-fonte completo para o programa ALIGN-2 é provido na Tabela 1 abaixo. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc., e o código-fonte mostrado na Tabela 1 abaixo foi depositado com documentação do usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde ele está registrado sob o U.S. Copyrigty Registration No. TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível da Genentech, Inc., Sul de São Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado do código-fonte provido na Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema de operação UNIX, preferivelmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações de sequência de aminoácido, a % de identidade de sequência de aminoácido de uma dada sequência de aminoácido C para, com ou contra uma dada sequência de aminoácido D (que pode alternativamente ser expressa como uma dada sequência de aminoácido C que tem ou compreende certa % de identidade de sequência de aminoácido para, com ou contra uma dada sequência de aminoácido D) é calculada como segue: 100 vezes a fração W/Z onde W é o número de resíduos de aminoácido classificados como combinações idênticas pelo programa de alinhamento de sequência 5 ALIGN-2 no alinhamento deste programa de C e D, e onde Z é o número total de resíduos de aminoácido em D. Será compreendido que onde o comprimento de sequência de ácido nucleico C não for igual ao comprimento da sequência de ácido nucleico D, a % de identidade de sequência de ácido nucleico de C para D não será igual à % de identidade de sequência de ácido nucleico de D 10 para C. A menos que de outra maneira especificamente declarado, todos os valores de identidade de sequência de ácido nucleico % usados aqui são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior usando o programa de computador ALIGN-2.
Em outras modalidades, polinucleotídeos de variante de CD79b 15 são moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo de CD79b e que são capazes de hibridizar, preferivelmente sob condições de hibridização adstringentes e de lavagem, para sequências de nucleotídeos codificando um polipeptídeo de CD79b de comprimento integral conforme aqui descrito. Polipeptídeos de variante de CD79b podem ser aqueles que são codificados 20 por um polinucleotídeo de variante de CD79b.
O termo "região de codificação de comprimento integral" quando usado com referência a um ácido nucleico codificando um polipeptídeo de D79b refere-se à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de CD79b de comprimento integral da invenção (que é frequentemente mostrada 25 entre os códons de início e parada, inclusive dos mesmos, nas figuras acompanhantes). O termo "região de codificação de comprimento integral" quando usado com referência a um ácido nucleico depositado na ATCC refere- se à porção de codificação de polipeptídeo de CD79b do cDNA que está inserida no vetor depositado com a ATCC (que é frequentemente mostrada entre os códons de início e parada, inclusive dos mesmos, nas figuras acompanhantes (códons de início e parada estão em negrito e sublinhados nas 5 figuras)). "Isolado", quando usado para descrever os vários polipeptídeos de CD79b descritos aqui, significa polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que tipicamente 10 interfeririam com usos terapêuticos para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o polipeptídeo será purificado (1) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido N- terminal ou interna através do uso de um sequenator de copo giratório ou (2) 15 até homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições de não redução ou redução usando azul Coomassie ou, preferivelmente, fingimento prata. Polipeptídeo isolado inclui polipeptídeo in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo de CD79b não estará presente. Geralmente, no entanto, polipeptídeo isolado 20 será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.
Um ácido nucleico de codificação de polipeptídeo de CD79b "isolado" ou outro ácido nucleico de codificação de polipeptídeo é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual ela é normalmente 25 associada na fonte natural do ácido nucleico de codificação de polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo isolada é outra que não na forma ou ajuste que ela é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo isoladas então são distinguidas da molécula de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo específica como ela existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo isolada inclui moléculas de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo contidas em células que expressam geralmente o polipeptídeo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em um local cromossomal diferente daquele de células naturais.
O termo "sequências controle" refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências controle que são adequadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação de ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas utilizar promotores, sinais de poliadenilação e aumentadores.
Ácido nucleico está "operavelmente ligado" quando ele está localizado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou líder secretor está operavelmente ligado a DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou aumentador está operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomo está operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar tradução. Em geral, "operavelmente ligado” significa que as sequências de DNA sendo ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguas e em fase de leitura. No entanto, aumentadores não têm que ser contíguos. A ligação é realizada através de ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordo com prática convencional. "Adstringência" de reações de hibridização é prontamente determinável por um versado na técnica, e geralmente é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturas 5 maiores para anelamento apropriado, enquanto sondas mais curtas precisam de temperaturas menores. A hibridização geralmente depende da habilidade do DNA desnaturado em reanelar quando filamentos complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de homologia desejada entre a sonda e a sequência de hibridização, . 10 maior a temperatura relativa que pode ser usada. Como resultado, acontece que temperaturas relativas maiores tenderiam a tornar as condições de reação mais adstringentes, enquanto temperaturas menores menos. Para detalhes adicionais e explicação de adstringência de reações de hibridização vide Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience 15 Publishers (1995). "Condições adstringentes" ou "condições de alta adstringência", conforme aqui definido, podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam resistência iônica baixa e alta temperatura para lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecil sulfato de 20 sódio 0,1% a 50° C; (2) empregam durante a hibridização um agente de desnaturação, tal como formamida, por exemplo, formamida 50% (v/v) com albumina de soro bovino 0,1%/Ficoll 0,1 %/polivinilpirrolidona 0,1%/tampão de fosfato de sódio 50 mM em pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42° C; ou (3) hibridização da noite para o dia em uma solução 25 que emprega formamida 50%, 5 x SSC (NaCI 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonificado (50 μg/ml), SDS 0,1% e dextrano sulfato 10% a 42° C, com uma lavagem de 10 minutos a 42° C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) seguido por uma lavagem de alta adstringência de 10 minutos de EDTA contendo 0,1 x SSC a 55° C. "Condições moderadamente adstringentes" podem ser identificadas conforme descrito por Sambrook e outros, Molecular Cloning: A 5 Laboratory Manual, Nova York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de condições de solução de lavagem e hibridização (por exemplo, temperatura, resistência iônica e % de SDS) menos adstringentes do que aquelas descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente adstringentes é incubação da noite para o dia a 37° C em uma solução 10 compreendendo: formamida 20%, 5 x SSC (NaCI 150 mM, citrato de trissódio 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de 5 x Denhardt, dextrano sulfato 10% e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1 x SSC em cerca de 37-50° C. O versado na técnica vai reconhecer como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc, 15 conforme necessário para acomodar fatores tal como comprimento da sonda e similar.
O termo "marcado com epitopo" quando usado aqui refere-se a um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo de CD79b ou anticorpo anti-CD79b fundido a um "polipeptídeo de marcação". O polipeptídeo 20 de marcação tem resíduos suficientes para prover um epitopo contra o qual um anticorpo pode ser feito, ainda que seja curto o suficiente de maneira que ele não interfira com atividade do polipeptídeo ao qual ele está fundido. O polipeptídeo de marcação é também preferivelmente realmente único de maneira que o anticorpo não reage com cruzamento substancialmente com 25 outros epitopos. Polipeptídeos de marcação adequados geralmente têm pelo menos seis resíduos de aminoácido e geralmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácido (preferivelmente entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácido). "Ativo" ou "atividade" para os presentes propósitos refere-se à(s) forma(s) de um polipeptídeo de CD79b que retêm uma atividade biológica e/ou imunológica de CD79b nativo ou de ocorrência natural, onde atividade "biológica" refere-se a uma função biológica (ou inibidora ou estimuladora) causada por um CD79b nativo ou de ocorrência natural outra que não a habilidade em induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuído por um CD79b nativo ou de ocorrência natural e uma atividade "imunológica" refere-se à habilidade em induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuído por um CD79b nativo ou de ocorrência natural.
O termo "antagonista" é usado no sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que bloqueie, iniba ou neutralize parcialmente ou totalmente uma atividade biológica de um polipeptídeo de CD79b nativo. De uma maneira similar, o termo "antagonista" é usado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que imite uma atividade biológica de um polipeptídeo de CD79b nativo. Moléculas agonistas e antagonistas adequadas incluem especificamente anticorpos agonistas ou antagonistas ou fragmentos de anticorpo, fragmentos ou variantes de sequência de aminoácido de polípeptídeos de CD79b nativos, peptídeos, oligonucleotídeos de antessenso, moléculas orgânicas pequenas, etc. Métodos para identificação de agonistas ou antagonistas de um polipeptídeo de CD79b podem compreender contato de um polipeptídeo de CD79b com uma molécula agonista ou antagonista candidata e medição de uma mudança detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas com o polipeptídeo de CD79b. "Purificado" significa que uma molécula está presente em uma amostra em uma concentração de pelo menos 95% em peso ou pelo menos 98% em peso da amostra onde ela está contida. ácido nucleico que é separada de pelo menos outra molécula de ácido nucleico com a qual ela está geralmente associada, por exemplo, em seu ambiente natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada inclui ainda uma molécula de ácido nucleico contida em células que expressam geralmente a molécula de 5 ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomalmente ou em um local cromossomal que é diferente de sua localização cromossomal natural.
O termo "vetor", conforme aqui usado, pretende se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual „ 10 ela foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor de fago. Outro tipo de vetor é um vetor virai, onde segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma virai. Certos vetores são capazes de replicação autossomal em uma célula 15 hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não epissomais) podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira e então são replicados junto com o genoma do hospedeiro. 20 Além disso, certos vetores são capazes de direcionamento da expressão de genes aos quais eles estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores recombinantes"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão frequentemente na forma de plasmídeos. No 25 presente relatório, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercomutavelmente uma vez que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. intercomutavelmente, refere-se a polímeros de nucleotídeos em qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado a um 5 polímero através de DNA ou RNA polimerase ou através de uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, modificação da estrutura de nucleotídeo pode ser feita antes ou após montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não 10 nucleotídeo. Um polinucleotídeo pode ser modificado mais após síntese, tal como através de conjugação com um marcador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, metil 15 fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc), aquelas contendo porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, p-L-lisina, etc), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc), aquelas contendo 20 quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc), aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Ainda, qualquer um dos grupos hidroxila comumente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por 25 grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos de proteção padrão ou ativado para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais ou pode ser conjugado a apoios sólidos ou semissólidos. OH terminal 5' e 3' pode ser fosforilado ou substituído com aminas ou porções de grupo de capeamento orgânico de a partir de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas podem ser também derivatizadas para grupos de proteção padrão. Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 5 2'-O-alil-, 2'-fluor- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos tal como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoeptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleoddeo abásicos tal como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos.
Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, modalidades onde fosfato é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR.sub.2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OU', CO ou CH.sub.2 ("formacetal"), onde cada R ou R' é independentemente H ou alquila substituída ou não substituída (1-20 C.) opcionalmente contendo uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição acima se aplica a todos os polinucleotídeos referidos aqui, incluindo RNA e DNA. "Oligonucleotídeo", conforme aqui usado, geralmente refere-se a polinucleotídeos curtos, geralmente de filamento simples,, geralmente 20 sintéticos, que são geralmente, mas não necessariamente, de menos do que cerca de 200 nucleotídeos de comprimento. Os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos é igualmente e integralmente aplicável a oligonucleotídeos.
Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se a ou descrevem a 25 condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, cânceres hematopoiéticos ou cânceres relacionados a sangue, tais como linfoma, leucemia, mieloma ou males linfoides, mas também cânceres do baço e cânceres dos nós linfáticos e também carcinoma, blastoma e sarcoma. Exemplos mais particulares de câncer incluem cânceres associados à célula B, incluindo, por exemplo, linfomas de graus alto, intermediário e baixo (incluindo linfomas de célula B tais como, por exemplo, linfoma de célula B de tecido linfoide associado à mucosa e Linfoma Não Hodgkin (NHL), linfoma da célula do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula grande difusa, linfoma folicular e linfoma de Hodgkin e linfomas de célula T) e leucemias (incluindo leucemia secundária, leucemia linfocítica crônica (CLL), tal como leucemia de célula B (CD5 + linfócitos B), leucemia mieloide, tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide, tal como leucemia linfoblástica aguda (ALL) e mielodisplasia) e outros cânceres hematológicos e/ou associados à célula B ou célula T. Também estão incluídos cânceres de células hematopoiéticas adicionais, incluindo leucócitos polimorfonucleares, tais como basófilos, eosinófilos, neutrófilos e monócitos, células dendríticas, plaquetas, eritrócitos e células assassinas naturais. Também estão incluídos distúrbios prol iterativos de célula B cancerosos selecionados do que segue: linfoma, Linfoma Não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHCI agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto. As origens de cânceres de célula B incluem como segue: origens de linfoma de célula B de zona marginal em células B de memória em zona marginal, linfoma folicular e linfoma de célula B grande difuso se originam em centrócitos na zona leve de centros germinais, leucemia linfocítica crônica e leucemia linfocítica pequena se originam em células B1 (CD5+), linfoma de célula do manto se origina em células B puras na zona do manto e linfoma de Burkitt se origina em centroblastos na zona escura de centros germinais. Tecidos que incluem células hematopoiéticas referidos aqui como "tecidos de célula hematopoiética" incluem tecidos do timo e medula óssea e linfoides periféricos, tais como baço, nós linfáticos, tecidos linfoides associados com mucosa, tais como tecidos linfoides associados ao intestino, emplastros de Peyer e tecidos do apêndice e 5 linfoide associados com outra mucosa, por exemplo, os revestimentos bronquiais. Exemplos particulares adicionais de tais cânceres incluem câncer de célula escamosa, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gastrintestinal, 10 câncer pancreático, glioma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de colo, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer da vulva, câncer da tireoide, carcinoma hepático, leucemia e outros distúrbios proliferativos, e 15 vários tipos de câncer de cabeça e pescoço.
Um "mal de célula B" aqui inclui Linfoma Não Hodgkin (NHL), incluindo NHL de grau baixo/folicular, NHL linfocítico pequeno (SL) {Small Lymphocytic), NHL de grau intermediário/folicular, NHL difuso de grau intermediário, NHL imunoblástico de grau alto, NHL linfoblástico de grau alto, 20 NHL de célula não clivada pequena de grau alto, NHL de doença volumosa, linfoma de célula do manto, linfoma relacionado à AIDS e Macroglobulinemia de Waldenstrom, Linfoma Não Hodgkin (NHL), doença de Hodgkin predominante de linfócito (LPHD), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia linfocítica crônica (CLL), NHL indolente incluindo NHL indolente relapsado e 25 NHL indolente refratário a rituximabe; leucemia, incluindo leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de célula pilosa, leucemia mieloblástica crônica; linfoma de célula do manto; e outros males hematológicos. Tais males podem ser tratados com anticorpos direcionados contra marcadores de superfície de célula B, tal como CD79b. Tais doenças são compreendidas aqui para serem tratadas através da administração de um anticorpo direcionado contra um marcador de superfície de célula B, tal como CD79b, e inclui a administração de um anticorpo não conjugado ("nu") ou um 5 anticorpo conjugado a um agente citotóxico conforme descrito aqui. Tais doenças são também compreendidas aqui para serem tratadas através de terapia de combinação incluindo um anticorpo anti-CD79b ou conjugado de anticorpo anti-CD79b-fármaco da invenção em combinação com outro anticorpo ou conjugado de anticorpo fármaco, outro agente citotóxico, radiação 10 ou outro tratamento simultaneamente administrado ou em série. Em método de tratamento exemplar da invenção, um anticorpo anti-CD79b da invenção é administrado em combinação com um anticorpo anti-CD20, imunoglobulina ou, seu fragmento de ligação a CD20, ou junto ou sequencialmente. O anticorpo anti-CD20 pode ser um anticorpo nu ou um conjugado de anticorpo fármaco.
Em uma modalidade da terapia de combinação, o anticorpo anti-CD79b é um anticorpo da presente invenção e o anticorpo anti-CD20 é Rituxan® (rituximabe).
O termo "Linfoma Não Hodgkin" ou "NHL", conforme aqui usado, refere-se a um câncer do sistema linfático outros que não linfomas de Hodgkin. 20 Linfomas de Hodgkin podem ser geralmente distinguidos de Linfomas Não Hodgkin pela presença de células Reed-Sternberg em linfomas de Hodgkin e a ausência das ditas células em Linfomas Não Hodgkin. Exemplos de Linfomas Não Hodgkin compreendidos pelo termo conforme aqui usado incluem qualquer um que seria identificado como tal por um versado na técnica (por exemplo, um 25 oncologista ou patologista) de acordo com esquemas de classificação conhecidos na técnica, tal como o esquema Revised European-American Lynphoma (REAL) conforme descrito em Color Atlas of Clinical Hematology (3a edição), A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (Eds.) (Harcourt Publishers, Ltd., 2000). Vide, em particular, as listas nas figuras 11.57, 11.58 e 11.59. Exemplos mais específicos incluem, mas não estão limitados a, NHL relapsado ou refratário, NHL de grau baixo de linha de frente, NHL de estágio lll/IV, NHL resistente â quimioterapia, leucemia linfoblástica B precursora e/ou linfoma, linfoma linfocítico pequeno, leucemia linfocítica crônica de célula B e/ou leucemia pró-linfocítica e/ou linfoma linfocítico pequeno, linfoma pró-linfocítico de célula B, imunocitoma e/ou linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de célula B da zona marginal, lingoma da zona marginal esplénico, linfoma mATL - zona marginal extranodal, linfoma de zona marginal nodal, leucemia de célula pilosa, plasmacitoma e/ou mieloma de célula do plasma, linfoma de grau baixo/folicular, NHL de grau intermediário/folicular, linfoma da célula do manto, linfoma do centro do folículo (folicular), NHL difuso de grau intermediário, linfoma de célula B grande difuso, NHL agressivo (incluindo NHL de linha de frente agressivo e NHL relapsado agressivo), NHL relapsando após ou refratário a transplante de célula tronco autóloga, linfoma de cleula B grande mediastinal primária, linfoma de efusão primário, NHL imunoblástico de grau alto, NHL linfoblástico de grau alto, NHL de célula não-clivada pequena de grau alto, NHL de doença volumosa, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica granular grande precursora (periférica), mycosis fungoides e/ou síndrome de Sezary, linfomas de pele (cutâneos), linfoma de célula grande anaplástico, linfoma angiocêntrico.
Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiara de tratamento com uma substância/molécula ou método da invenção. Isto inclui distúrbios ou doenças crônicos e agudos incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitantes de distúrbios a serem tratados aqui incluem condições cancerosas tais como tumores malignos e benignos; males de não leucemias e linfoides; distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos e outros glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocoélicos; e distúrbios inflamatórios, imunológicos e outros relacionados com angiogênese. Distúrbios incluem condições cancerosas tais como distúrbios proliferativos de célula B e/ou tumores de célula B, por exemplo, linfoma, Linfoma Não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
Os termos "distúrbio proliferativo celular" e "distúrbio proliferative" referem-se a distúrbios que são associados com algum grau de proliferação de célula anormal. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular é câncer. "Tumor", conforme aqui usado, refere-se a todo crescimento e proliferação de célula neoplástica, seja maligno ou benigno, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.
Uma "doença autoimune" aqui é uma doença ou distúrbio que surge de e direcionado contra os tecidos ou órgãos do próprio indivíduo ou um cossegregado ou sua manifestação ou condição resultante do mesmo. Em muitos desses distúrbios autoimunes e inflamatórios, vários marcadores clínicos e de laboratório podem existir, incluindo, mas não limitado a, hipergamaglobulinemia, níveis altos de autoanticorpos, depósitos de complexo antígeno-anticorpo, benefício de tratamentos com corticosteroides ou imunossupressivos e agregados de célula linfoide em tecidos afetados. Sem ser limitado a nenhuma teoria com relação à doença autoimune mediada por célula B, acredita-se que células B demonstrem um efeito patogênico em doenças autoimunes humanas através de uma multiplicidade de cursos mecanísticos, incluindo produção de autoanticorpo, formação de complexo imune, ativação de células dendrítica e T, síntese de citocina, liberação de quimiocina direta e provisão de um ninho para neo-linfogênese ectópica. Cada um desses cursos pode participar para graus diferentes na patologia de doenças autoimunes. "Doença autoimune" pode ser uma doença específica de órgão (isto é, a resposta imune é especificamente direcionada contra um sistema de 5 órgão tal como o sistema endócrino, o sistema hematopoiético, a pele, o sistema cardiopulmonar, os sistemas gastrintestinal e do fígado, o sistema renal, a tireoide, os ouvidos, o sistema neuromuscular, o sistema nervoso central, etc) ou uma doença sistêmica que pode afetar sistemas de órgão múltiplos (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatoide, 10 poliomiosite, etc). Tais doenças preferidas incluem distúrbios reumatológicos autoimunes (tais como, por exemplo, artrite reumatoide, síndrome de Sjõgren, escleroderma, lúpus tal como SLE e nefrite de lúpus, poliomiosite/dermatomiosite, crioglobulinemia, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo e artrite psoriática), distúrbios gastrintestinal e do fígado 15 autoimunes (tais como, por exemplo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), gastrite autoimune e anemia perniciosa, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária e doença celíaca), vasculite (tais como, por exemplo, vasculite negativa para ANCA e vasculite associada a ANCA, incluindo vasculite de 20 Churg-Strauss, granulomatose de Wegener e poliangiite microscópica), distúrbios neurológicos autoimunes (tais como, por exemplo, esclerose múltipla, síndrome de opsoclonus mioclonus, miastenia grave, neuromielite óptica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e polineuropatias autoimunes), distúrbios renais (tais como, por exemplo, glomerulonefrite, 25 síndrome de Goodpasture e doença de Berger), distúrbios dermatológicos autoimunes (tais como, por exemplo, psoríase, urticária, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso e lúpus eritematoso cutâneo), distúrbios hematológicos (tais como, por exemplo, trombocitopenia púrpura, trombocitopenía púrpura trombótica, púrpura pós-transfusão e anemia hemolítica autoimune), aterosclerose, uveíte, doenças do ouvido autoimunes (tais como, por exemplo, doença do ouvido interno e perda da audição), doença de Behcet, síndrome de Raynaud, transplante de órgão e distúrbios endócrinos autoimunes (tais como, 5 por exemplo, doenças autoimunes relacionadas com diabetes tal como diabetes mellitus insulino-dependente (IDDM) {Insulin-Dependent Diabetes Mellitus), doença de Addison e doença da tireoide autoimune (por exemplo, doença de Grave e tiroidite). Com mais preferência tais doenças incluem, por exemplo, artrite reumatoide, colite ulcerativa, vasculite associada com ANCA, 10 lúpus, esclerose múltipla, síndrome de Sjõgren, doença de Grave, IDDM, anemia perniciosa, tiroidite e glomerulonefrite.
Exemplos específicos de outras doenças autoimunes conforme aqui definido, que em alguns casos compreendem aquelas listadas acima, incluem, mas não estão limitadas a, artrite (aguda e crônica, artrite reumatoide 15 incluindo artrite reumatoide de início juvenil e estágios tal como sinovite reumatoide, gota ou artrite gotosa, artrite imunológica aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite induzida por colágeno tipo II, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, doença de Still, artrite vertebral, osteoartrite, artrite crônica progrediente, artrite deformante, 20 políartrite crônica primária, artrite reativa, artrite menopausal, artrite de depleção de estrogênio e espondilite anquilosante/artrite reumatoide), doença linfoproliferativa autoimune, doenças da pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase tal como psoríase de placa, psoríase gutata, psoríase pustular e psoríase das unhas, atopia incluindo doenças atópicas tal como febre do feno e 25 síndrome de Job, dermatite incluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite exfoliativa, dermatite alérgica, dermatite de contato, urticária, dermatite herpetiforme, dermatite numular, dermatite seborréica, dermatite não específica, dermatite de contato irritante primária e dermatite atópica, síndrome de hiper IgM ligada a x, doenças inflamatórias intraoculares alérgicas, urticária tal como urticária alérgica crônica e urticaria idiopática crônica, incluindo urticária autoimune crônica, miosite, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidermal tóxica, 5 escleroderma (incluindo escleroderma sistêmico), esclerose tal como esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) (Multiple Sclerosis) tal como MS espino- óptica, MS progressiva primária (PMMS) (Primary Progressive MS) e MS remitente relapsante (RRMS) (Relapsing Remitting MS), esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminata, esclerose 10 atáxica, neuromielite óptica (NMO) (Neuromyelitis óptica), doença inflamatória do intestino (IBD) (Inflammatory bowel disease) (por exemplo, doença de Crohn, doenças gastrintestinais autoimune-mediadas, inflamação gastrintestinal, colite tal como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrosante e colite 15 transmural, e doença inflamatória do intestino autoimune), inflamação do intestino, poliderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, síndrome do desconforto respiratório, incluindo síndrome do desconforto respiratório adulto ou agudo (ARDS) (Adult ou Acute Respiratory Distress Syndrome), meningite, inflamação de toda ou parte da úvea, irite, 20 coroidite e distúrbio hematológico autoimune, doença enxerto-versus- hospedeiro, angioedema tal como angioedema hereditário, dano ao nervo craniano como em meningite, herpes gestacional, penfigoide gestacional, pruritis scroti, falência ovariana prematura autoimune, perda de audição repentina devido a uma condição autoimune, doenças mediadas por IgE tais 25 como anafilaxia e rinites alérgica e atópica, encefalite tal como encefalite de
Rasmussen e encefalite límbica e/ou do tronco cerebral, uveíte, tal como uveíte anterior, uveíte anterior aguda, uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíte posterior ou uveíte autoimune, glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica tal como glomerulonefrite crônica ou aguda tal como GN primária, GN imunomediada, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN membranosa idiopática ou nefropatia membranosa idiopática, GN proliferativa membrano- ou membranosa (MPGN), incluindo Tipo I e Tipo II, e GN rapidamente progressiva (RPGN), nefrite proliferativa, falência endócrina poliglandular autoimune, balanite incluindo balanite circunscrita plasmacelular, balanopostite, eritema anular centrífugo, eritema discrômico perstans, eritema multiforme, granuloma anular, líquen nítido, líquen esclerose e atrófico, líquen simplex crônico, líquen espinuloso, líquen plano, ictiose lamelar, hiperqueratose epidermolítica, queratose pré- maligna, pioderma gangrenoso, condições e respostas alérgicas, alergias alimentares, alergias a fármaco, alergias a inseto, distúrbios alérgicos raros tal como mastocitose, reação alérgica, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, eczema asteatótico, eczema disidrótico, e eczema palmoplantar vesicular, asma tal como bronquial, asma bronquial e asma autoimune, condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, reações imunes contra antígenos estranhos tais como grupos sanguíneos A-B-0 fetais durante gravidez, doença inflamatória pulmonar crônica, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócito, lúpus, incluindo nefrite de lúpus, cerebrite de lúpus, lúpus pediátrico, lúpus não renal, lúpus extrarrenal, lúpus discoide e lúpus eritematoso discoide, lúpus alopecia, SLE, tal como SLE cutâneo e SLE subagudo cutâneo, síndrome do lúpus neonatal (NLE) (Neonatal Lupus Syndrome), e lúpus eritematoso disseminado, diabetes mellitus de início na juventude (Tipo I), incluindo EDDM pediátrica, diabetes mellitus de início na fase adulta (diabetes Tipo II), diabetes autoimune, diabetes idiopática insípida, retinopatia diabética, nefropatia diabética, colite diabética, distúrbio de artéria grande diabética, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatoide, agranulocitose, vasculitide (incluindo vasculite de vaso grande tal como polimialgia reumática e arterite de célula gigante (Takayasu), vasculite de vaso meio tal como doença de Kawasaki e poliarterite nodosa/periarterite nodosa, imunovasculite, vasculite do SNC, vasculite cutânea, vasculite por hipersensibilidade, vasculite necrosante tal como vasculite necrosante fibrinoide e vasculite necrosante sistêmica, vasculite negativa para ANCA e vasculite associada com ANCA tal como síndrome Churg-Strauss (CSS) (Churg-Strauss syndrome), granulomatose de Wegener e poliangiite microscópica), arterite temporal, anemia aplástica, anemia aplástica autoimune, anemia positiva para Coombs, anemia de Diamond Blackfan , anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA) (Autoimmune Hemolytic Anemia), anemia perniciosa , doença de Addison, anemia ou aplasia de célula vermelha pura (PRCA) (Pure Red Cell Anemia ou Aplasia), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia(s) autoimune(s), citopenia tal como pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo diapedese de leucócito, distúrbios inflamatórios do SNC, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, síndrome da lesão de órgão múltipla tais como aquelas secundárias à septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença de membrana de base antiglomerular, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, motoneurite, neurite alérgica, doença/síndrome de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjõgren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide ou pênfigo tal como pênfigo bolhoso, penfigoide cicatricial (membrana mucosa), penfigoide da pele, pênfigo vulgar, pênfigo paraconplástico, pênfigo foliaceus, pênfigo mucoso-penfigoide da membrana, e pênfigo eritematoso, epidermólise bolhosa adquirida, inflamação ocular, preferivelmente inflamação ocular alérgica tal como conjuntivite alérgica, doença bolhosa IgA linear, inflamação conjuntival autoimune-induzida, poliendocrinopatias autoimunes, doença ou síndrome de Reiter, lesão termal devido a uma condição autoimune, pré-eclâmpsia, um distúrbio complexo autoimune tal como nefrite complexa autoimune, nefrite mediada por anticorpo, 5 distúrbios neuroinflamatórios, polineuropatias, neuropatia crônica tais como polineuropatías de IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (conforme desenvolvido por pacientes com infarto do miocárdio, por exemplo), incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) (Thrombotic Thrombocytopenic Purpura), púrpura pós-transfusão (PTP) (Post-transfusion 10 Purpura), trombocitopenia induzida por heparina e trombocitopenia autoimune ou imunomediada incluindo, por exemplo, trombocitopenia púrpura idiopática (ITP) (Idiopathic Thrombocytopenic Purpura) incluidno ITP crônica ou aguda, esclerite tal como cerato-esclerite idiopática, episclerite, doença autoimune dos testículos e ovário incluindo orquite e ooforite autoimunes, hipotiroidismo 15 primário, hipoparatiroidismo, doenças endócritas autoimunes incluindo tiroidite tal como tiroidite autoimune, doença e Hashimoto, tiroidite crônica (tiroidite de Hashimoto), ou tiroidite subaguda, doença da tiroide autoimune, hipotiroidismo ídiopático, doença de Grave, doença do olho de Grave (oftalmopatia ou oftalmopatia associada à tireoide), síndromes poliglandulares tais como 20 síndromes poliglandulras autoimunes, por exemplo, tipo I (ou síndromes de endocrinopatia poliglanduar), síndromes paraneoplásticas, incluindo síndromes paraneoplásticas neurológicas tal como miastenia grave de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, síndrome do homem rígido ou pessoa rígida, encefalomielite tal como encefalomietile alérgica ou encefalomielite alérgida e 25 encefalomielite alérgica experimental (EAE) (Experimental Allergic
Encephalomyelitis), miastenia grave tal como miastenia grave associada com timoma, degeneração cerebelar, neuromiotonia, síndrome de opsoclonus ou opsoclonus myoclonus (OMS) e neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite lupoide, hepatite de célula gigante, hepatite ativa crônica ou hepatite ativa crônica autoimune, pneumonite tal como pneumonite intersticial linfoide (LIP) (Lymphoid Interstitial Pneumonitis), bronquiolite obliterante (não-transplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barré, doença de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopática, dermatose de IgA linear, dermatose neutrofílica febril aguda, dermatose pustular subcorneal, dermatose acantolítica transiente, cirrose tal como cirrose biliar primária e pneumocirrose, síndrome da enteropatia autoimune, doença Celíaca ou Coelíaca, esprue celíaco (enteropatia de glúten), esprue refratário, esprue idiopático, crioglobulinemia tal como crioglobulinemia mista, esclerose amiotrófica lateral (ALS (Amylotrophic Lateral Sclerosis)-, doença de Lou Gehrig), doença da artéria coronária, doença do ouvido autoimune tal como doença do ouvido interno autoimune (AIED) (Autoimmune Inner Ear Disease), perda da audição autoimune, policondrite tai como policondrite refratária ou relapsada ou relapsante, proteinose alveolar pulmonar, queratite tal como síndrome de Cogan/queratite intersticial não sifilítica, paralisia de Bell, doença/síndrome de Sweet, rosácea autoimune, dor associada ao zoster, amiloidose, uma linfocitose não cancerosa, uma linfocitose primária, que inclui linfocitose de célula B monoclonal (por exemplo, gamopatia monoclonal benigna e gamopatia monoclonal de significância indeterminada ( MGUS) (Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance), neuropatia periférica, síndrome paraneoplástica, canalopatias tal como epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica e canalopatias do SNC, autismo, miopatia inflamatória, glomeruloesclerose focal ou segmentai ou focal segmental (FSGS) (Focal Segmental Glomerulosclerosis), oftalmopatia endócrina, uveorretinite, coriorretinite, distúrbio hepatológíco autoimune, fibromialgia, falência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças desmielinantes tais como doenças desmielinantes autoimunes e polineuropatia desmielinante inflamatória crônica. Síndrome de Dressier, alopeia areata, alopecia totalis, síndrome CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismotilite esofageal, esclerodactilia e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina e feminina, por exemplo, devido a anticorpos antiespermatozoide, doença do tecido conectivo misto, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão do criador de passarinho, angiite granulomatosa alérgica, angiite linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite tal como alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, reação de transfucao, leprosia, malária, doenças parasíticas tal como leishmaniose, kypanosomiasis, esquistossomíase, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose endomiocardial, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, mediastinite fibrosante, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevado diutino, eritroblastose fetal, faciite eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flaríase, ciclite tal como ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociclite (aguda ou crônica), ou ciclite de Fuch, púrpura Henoch-Schonlein, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), SCID, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), infecção por ecovírus, sepse (síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS)), endotexemia, pancreatite, tiroxicose, infecção por parvovirus, infecção pelo vírus da rubéola, síndromes pós- vacinação, infecção por rubéola congênita, infecção pelo vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, falência gonadal autoimune, coreia de Sydenham, nefrite pós-estreptococcal, tromboangeíte obliterante, tirotoxicose, tabes dorsal, corioidite, polimialgia de célula gigante, pneumonite de hipersensibilidade crônica, conjuntivite, tal como catarata vernal, queratoconjuntivite seca e queratoconjuntivite epidêmica, síndrome da nefrite idiopática, nefropatia de mudança mínima, lesão familiar e isquemia-reperfusão benigna, reperfusão de órgão de transplante, autoimunidade retinal, inflamação da junta, bronquite, doença das vias aéares/pulmonar obstrutiva crônica, silicose, afta, estomatite aftosa, distúrbios arterioscleróticos (insuficiência vascular cerebral) tal como encefalopatia arteriosclerótica e retinopatia arteriosclerótica, aspermiogênese, hemólise autoimune, doença de Boeck, crioglobulinemia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodoso leproso, paralisia facial idiopática, síndrome da fadiga crônica, febre reumátia, doença de Hamman-Rich, perda de audição senso- neural, hemoglobinúria paroxismática, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversa, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simpática (sympathetic ophthalmitis), oftalmite neonatal, neurite óptica, orquite granulomatosa, pancreatite, polirradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tiroidite de Quervain, atrofia do baço adquirida, timoma não-maligno, timite linfofolicular, vitiligo, síndrome do choque tóxico, envenenamento alimentar, condições envolvendo infiltração de células T, deficiência de adesão de leucócito, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda ou retardada mediada por cítocinas e linfócitos T, doenças envolvendo diapedese do leucócito, síndrome da lesão do órgão múltipla, doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana de base antiglomerular, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, doenças reumáticas, doença de tecido conectivo misto, síndrome nefrótica, insulite, falência poliendócrina, síndromes poliglandulares autoimunes, incluindo síndrome poliglandular tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de início na idade adulta (AOIH) (Adult-onset idiopathic Hypoparathyroidismo), cardiomiopatia tal como cardiomiopatia dilatada, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), hemocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, sinusite etmoidal, frontal, maxilar ou esfenoide, sinusite alérgica, um distúrbio relacionado a eosinófilo tal como eosifilia, eosinofilia de infiltração pulmonar, síndrome da eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma ou granulomas contendo eosinófilos, anafilaxia, espondiloartropatias, espondiloartrites soronegativas, doença autoimune poliendócrina, colangite esclerosante, episclera, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transiente da infância, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome da ataxia telangiectasia, angiectase, distúrbios autoimunes associados com doença do colágeno, reumatismo tal como artrorreumatismo crônico, linfadenite, redução na resposta da pressão sanguínea, disfunção vascular, lesão de tecido, isquêmica cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral e doença acompanhamento vascularização, distúrbios de hipersensibilidade alérgica, glomerulonefrites, lesão por reperfusão, distúrbio de reperfusão isquêmica, lesão por reperfusão de tecido miocardial ou outros, traqueobronquite Jinfomatosa, dermatose inflamatória, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, falência de órgão múltipla, doenças bolhosas, necrose cortical renal, meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, distúrbios inflamatórios ocular e orbital, síndromes associadas à transfusão de granulócíto, toxidez induzida por citocina, narcolepsia, inflamação séria aguda, inflamação intratável crônica, pielite, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulite e endometriose. Tais doenças são compreendidas aqui para serem tratadas através da administração de um anticorpo que se liga a um marcador de superfície de célula B, tal como CD79b, e inclui a administração de um anticorpo não conjugado ("nu") ou um anticorpo conjugado a um agente citotóxico conforme aqui descrito. Tais doenças são também compreendidas aqui para serem tratadas através de terapia de combinação incluindo um anticorpo anti-CD79b ou conjugado de anticorpo anti-CD79B-fármaco da invenção em combinação com outro anticorpo ou conjugado de anticorpo fármaco, outro agente citotóxico, radiação ou outro tratamento administrado simultaneamente ou em série. "Tratando" ou "tratamento" ou "alívio" refere-se a ambos o tratamento terapêutico e as medidas profiláticas ou de prevenção, onde o objetivo é prevenir ou diminuir (deixar mais lenta) a condição ou o distúrbio patológico alvo. Aqueles com necessidade de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio bem como aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles em quem o distúrbio deve ser prevenido. Um indivíduo ou mamífero é tratado "com sucesso" para um câncer expressando peptídeo de CD79b se, após receber uma quantidade terapêutica de um anticorpo anti-CD79b de acordo com os métodos da presente invenção, o paciente mostrar redução observável e/ou mensurável em ou ausência de um ou mais do que segue: redução no número de células de câncer ou ausência das células de câncer; redução no tamanho do tumor; inibição (isto é, diminuição até certo ponto e preferivelmente parada) de infiltração de célula de câncer nos órgãos periféricos incluindo o espalhamento de câncer em tecido mole e osso; inibição (isto é, diminuição até certo ponto e preferivelmente parada) de metástase de tumor; inibição, até certo ponto, de crescimento de tumor; e/ou alívio até certo ponto, de um ou mais dos sintomas associados com o câncer específico; morbidez e mortalidade reduzidas, e aperfeiçoamento em questões de qualidade de vida. Até o ponto que o anticorpo anti-CD79b pode prevenir crescimento e/ou morte de células de câncer existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Redução desses sinais ou sintomas pode ser também sentida pelo paciente.
Os parâmetros acima para avaliação de tratamento bem sucesso e aperfeiçoamento da doença são prontamente mensuráveis através de procedimentos de rotina familiares a um médico. Para terapia de câncer, eficácia pode ser medida, por exemplo, através da avaliação do tempo para progressão de doença (TTP) (Time Disease Progression) e/ou determinação da taxa de resposta (RR) (Response Rate). Metástase pode ser determinada através de testes de estagiamento e por varredura óssea e testes quanto a nível de cálcio e outras enzimas para determinar o espalhamento para o osso. Varreduras de CT podem ser também feitas para procurar espalhamento para a pélvis e nós linfáticos na área. Raios X do tórax e medição de níveis de enzima do fígado através de métodos conhecidos são usados para procurar por metástase para os pulmões e fígado, respectivamente. Outros métodos de rotina para monitoramento da doença incluem ultrassonografia transretal (TRUS) (Transrectal ultrasonography) e biopsia de agulha transretal (TRNB) (Transrectal Needle Biopsy).
Para câncer de bexiga, que é um câncer mais localizado, métodos para determinação de progressão de doença incluem avaliação citológica urinária através de cistoscopia, monitoramento quanto à presença de sangue na urina, visualização do trato urotelial através de sonografia ou um pileograma intravenoso, tomografia computadorizada (Computed Tomography) e imagem por ressonância magnética (MRI) (Magnetic Resonance Imaging). A presença de metástases distantes pode ser avaliada através de CT do abdômen, raios X do tórax ou imagem de radionuclídeo do esqueleto.
Administração "crônica" refere-se à administração do(s) agente(s) em um modo contínuo oposto a um modo agudo, de maneira a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo prolongado. Administração "intermitente" é tratamento que não é consecutivamente feito sem interrupção, mas ao contrário é de natureza cíclica.
Um "indivíduo" é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais de fazenda (tais como vacas), animais de esporte, animais de estimação (tais como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Em certas modalidades, um mamífero é um humano. "Mamífero" para propósitos do tratamento de alívio dos sintomas de um câncer,refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e animais de zoológico, esporte e de estimação, tais como cachorros, gatos, gados, cavalos, ovelha, porcos, cabras, coelhos, etc. Preferivelmente, o mamífero é humano.
Administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administrações simultânea (concomitante) e consecutiva em qualquer ordem. "Carreadores" conforme aqui usado incluem carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos para a célula ou mamífero sendo exposto a eles nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente o carreador fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada com pH aquoso. Exemplos de carreadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextranos; agentes de quelação tal como EDTA; alcoóis de açúcar tal como manitol ou sorbitol;, contraíons de formação de sal tal como sódio; e/ou tensoativos não-iônicos tal como TWEEN®, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS®
Por "fase sólida" ou "apoio sólido" quer dizer uma matriz não aquosa à qual um anticorpo da presente invenção pode aderir ou ligar.
Exemplos de fases sólidas compreendidas aqui incluem aqueles formadas parcialmente ou totalmente de vidro (por exemplo, vidro de poro controlado), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil álcool e silicones. Em certas modalidades, dependendo do contexto, a fase 5 sólida pode compreender a cavidade de uma placa de ensaio; em outras ela é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia por afinidade). Este termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas separadas, tais como aquelas descritas na Patente U.S. Ns 4.275.149.
Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de vários 10 tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo que é útil para aplicação de um fármaco (tal como um anticorpo de CD79b) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são geralmente dispostos em uma formação bicamada, similar à disposição de lipídeo de membranas biológicas.
Uma molécula "pequena" ou molécula de organismo "pequena" é 15 definida aqui ter um peso molecular abaixo de cerca de 500 Daltons.
Um "indivíduo", "sujeito" ou "paciente" é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero, mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais de fazenda (tais como vacas), animais de esporte, animais de estimação (tais como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e 20 ratos. Em certas modalidades, um mamífero é humano.
O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que está em tal forma de maneira a permitir que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contenha quaisquer componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos a um indivíduo ao qual a 25 formulação deve ser administrada. Tal formulação pode ser estéril. Uma formulação "estéril" é livre de todos os microorganismos vivos e seus esporos.
Uma "quantidade eficaz" de um anticorpo conforme aqui descrito é uma quantidade suficiente para realizar um propósito especificamente declarado. Uma "quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamente e de uma maneira de rotina, em relação ao propósito declarado.
O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou outro fármaco eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio em um indivíduo ou mamífero. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células de câncer; reduzir o tamanho do tumor, inibir (isto é, deixar mais lenta até certo ponto e preferivelmente parar) infiltração de célula de câncer em órgãos periféricos; inibir (isto é, deixar mais lenta até certo ponto e preferivelmente parar) metástase de tumor; inibir, até certo ponto, crescimento de tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Vide a definição aqui de "tratando". Até o ponto que o fármaco possa prevenir crescimento e/ou matar células de câncer existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes do ou em um estágio anterior de doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menos do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
Uma "quantidade inibidora de crescimento" de um anticorpo anti- CD79b é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, especialmente tumor, por exemplo, célula de câncer, ou in vitro ou in vivo. Uma "quantidade inibidora de crescimento" de um anticorpo anti-CD79b para propósito de inibição de crescimento de célula neoplástica pode ser determinada empiricamente e de uma maneira de rotina.
Uma "quantidade citotóxica" de um anticorpo anti-CD79b é uma quantidade capaz de causar a destruição de uma célula, especialmente tumor, por exemplo, célula de câncer, ou in vitro ou in vivo. Uma "quantidade citotóxica" de um anticorpo anti-CD79b para propósito de inibição de crescimento de célula neoplástica pode ser determinada empiricamente e de uma maneira de rotina.
Uma "célula expressando CD79b" é uma célula que expressa um polipeptídeo de CD79b endógeno ou transferido ou na superfície da célula ou em uma forma secretada. Um "câncer expressando CD79b" é um câncer compreendendo células que têm um polipeptídeo de CD79b presente na superfície da célula ou que produzem e secretam polipeptídeo de CD79b. Um "câncer expressando CD79b" produz opcionalmente níveis suficientes de polipeptídeo de CD79b sobre a superfície de células do mesmo, de maneira que um anticorpo anti-CD79b pode se ligar ao mesmo e ter um efeito terapêutico com relação ao câncer. Em outra modalidade, um "câncer expressando CD79b" produz e secreta opcionalmente níveis suficientes de polipeptídeo de CD79b, de maneira que um antagonista de anticorpo anti- CD79b pode se ligar ao mesmo e ter um efeito terapêutico com relação ao câncer. Com relação ao último, o antagonista pode ser um oligonucleotídeo de antessenso que reduz, inibe ou previne produção e secreção do polipeptídeo de CD79b secretado por células de tumor. Um câncer que "expressa em excesso" um polipeptídeo de CD79b é um que tem níveis significantemente maiores de polipeptídeo de CD79b na superfície celular do mesmo, ou produz e secreta, comparado com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal expressão em excesso pode ser causada por amplificação de gene ou através de transcrição ou tradução aumentada. A expressão em excesso de polipeptídeo de CD79b pode ser determinada em um ensaio de detecção ou prognóstico através da avaliação dos níveis aumentados da proteína de CD79b presente sobre a superfície de uma célula ou secretada pela célula (por exemplo, através de um ensaio imunoistoquímico usando anticorpos anti- CD79b preparados contra um polipeptídeo de CD79b isolado que pode ser preparado usando tecnologia de DNA recombinante a partir de um ácido nucleico isolado codificando o polipeptídeo de CD79b; análise FACS, etc). Alternativamente, ou adicionalmente, uma pessoa pode medir os níveis de 5 ácido nucleico ou mRNA codificando polipeptídeo de CD79b na célula, por exemplo, através de hibridização in situ fluorescente usando uma sonda baseada em ácido nucleico correspondendo a um ácido nucleico codificando CD79b ou o seu complemento. (FISH; vide WO98/45479 publicado em outubro de 1998), técnicas de Southern blotting, Northern blotting ou reação em cadeia 10 da polimerase (PCR), tal como PCR quantitativa de tempo real (RT-PCR). Uma pessoa pode também estudar expressão em excesso de polipeptídeo de CD79b através da medição de antígeno disperso em um fluido biológico tal como soro, por exemplo, usando ensaios baseados em anticorpo (vide também, por exemplo, Patente U.S. N- 4.933.294 depositada em 12 de junho 15 de 1990; WO91/05264 publicado em 18 de abril de 1991; Patente U.S. Ns 5.401.638 depositada em 28 de março de 1995; e Sias e outros, J. Immunol. Methods., 132:73-80 (1990)). À parte os exemplos acima, vários ensaios in vivo estão disponíveis ao praticante versado. Por exemplo, uma pessoa pode expor células dentro do corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmente 20 marcado com um marcador detectável, por exemplo, um isótopo radioativo, e ligação do anticorpo a células no paciente pode ser avaliada, por exemplo, através de varredura externa quanto à radioatividade ou através da análise de uma biópsia obtida de um paciente previamente exposto ao anticorpo.
Conforme aqui usado, o termo "imunoadesina" designa moléculas 25 tipo anticorpo que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, a imunoadesão compreende uma fusão de uma sequência de aminoácido com a especificidade de ligação desejada que é outra que não o sítio de reconhecimento e ligação de antígeno de um anticorpo (isto é, é "heterólogo"), e uma sequência de domínio constante da imunoglobulina. A parte adesina de uma molécula de imunoadesão tipicamente é uma sequência de aminoácido contígua compreendendo pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou um ligante. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como subtipo lgG-1, lgG-2, lgG-3 ou lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.
A palavra "marcador" quando usada aqui refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado diretamente ou indiretamente ao anticorpo de maneira a gerar um anticorpo "marcado". O marcador pode ser detectável por si só (por exemplo, marcadores de radioisótopo ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimátíco, pode catalisar alteração químicas de um composto ou composição de substrato que é detectável.
O termo "agente citotóxico" conforme aqui usado refere-se a um substrato que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, por exemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes de intercalação, enzimas e fragmentos dos mesmos, tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes, e os vários agentes antitumor ou anticâncer descritos abaixo. Outros agentes citotóxicos são descritos abaixo. Um agente tumoricidal causa destruição de células de tumor.
Uma "toxina" é qualquer substância capaz de ter um efeito prejudicial sobre o crescimento ou proliferação de uma célula.
Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de câncer, sem importar o mecanismo de ação. Classes de agentes quimioterapêuticos incluem, as não estão limitados a: agentes de alquilação, antimetabolitos, alcaloides de planta de veneno de veio, antibióticos citotóxicos/antitumor, inibidores de topoisomerase, anticorpos, fotossensibilizadores e inibidores de cinase. Agentes quimioterapêuticos incluem compostos usados em "terapia direcionada" e quimioterapia convencional. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem: erlotinibe (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi- Aventis), 5-FU (fluoruracila, 5-fluoruracila, CAS No. 51-21-8), gemcitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), cisplatina (cisdiamina, dicloroplatina(ll), CAS No. 15663-27-1), carboplatina (CAS No. 4157594-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomida (4-metil-5-oxo- 2,3,4,6,8-pentazabiciclo [4.3.0] nona-2,7,9-trieno- 9-carboxamida, CAS Ns 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoxifeno ((Z)-2-[4- (1,2-difenilbut-1-enil)fenoxi]-A/,/V-dimetil-etanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), e doxorrubicina (ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD e rapamicina.
Mais exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem: oxaliplatina (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomibe (VELCADE®, Millennium Farm.), sutente (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinibe mesilato (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (inibidor de Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (inibidor de Mek, AZD6244, Array BioFarma, Astra Zeneca), SF-1126 (inibidor de PI3K, Semafore Farmaceuticals), BEZ-235 (inibidor de PI3K, Novartis), XL-147 (inibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrante (FASLODEX®, AstraZeneca), leucovorina (ácido folínico), rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinibe (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnibe (SARASAR®, SCH 66336, Schering Plough), sorafenibe (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinibe (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecano (GAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnibe (ZARNESTRA®, Johnson & Johnson), ABRAXANE® (Sem Cremofor), formulações de paclitaxel em nanopartícula engenheiradas de albumina (American Farmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanibe (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), cloranmbucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopanibe (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCITA®, Telik), tiotepa e ciclosfosfamida (CITOXAN®, NEOSAR®); alquil sulfonatos tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoimina s e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW- 2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; nitrogênio mostardas tais como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato do óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uracil mostarda; nitrosoureioas tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enediina (por exemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gama 11, caliqueamicina ômegall (Angew Chem. Inti. Ed. Engl. (1994) 33:183186); dinemicina, dinemicin A; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enodiina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, 5 detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, icina quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, 10 tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos tal como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos do ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de piridina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, 15 didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; anti-adrenaiss tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositores de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucil; 20 bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de elliptinio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamete; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil hidrazida; procarbazina; 25 complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OU); razoxana; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2,,-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretana; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosideo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos d eplatina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etoposideo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristine; vinorrelbina (NAVELBINE®); novantrona; teniposideo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®, Roche); ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); retinoides tal como ácido retinoico; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e derivados de qualquer um dos acima.
Também incluídos na definição de "agente quimioterapêutico" estão: (i) agentes anti-hormonais que agem pare regular ou inibir ação de hormônio sobre tumores tais como antiestrogênios e moduladores de receptor de estrogênio seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula produção de estrogênio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimina, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer); formestanie, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) e ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrogênios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo de 1,3-dioxolano neucleosídeo citosina); (iv) inibidores de proteína cinase tais como inibidores de MEK (WO 2007/044515); (v) inibidores de lipídeo cinase; (vi) oligonucleotídeos de antessenso, particularmente aqueles que inibem expressão de genes em cursos de sinalização implicados em proliferação celular aberrante, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, tal como oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas tais como inibidores de expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYME®) e inibidores de expressão de HER2; (viii) vacinas tais como vacinas de terapia de gene, por exemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® e VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inibidores de topoisomerase 1 tal como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes antiangiogênicos tal como bevacizumabe (AVASTIN®, Genentech); e sais 5 farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e derivados de qualquer um dos acima.
Também incluídos na definição de "agente quimoterapêutico" estão anticorpos terapêuticos tais como alemtuzumabe (Campath), bevacizumabe (AVASTIN®, Genentech); cetuximabe (ERBITUX®, Inclone); panitumumabe (VECTIBIX®, Amgen), rituximabe (RITUXAN®, 10 Genentech/Biogen Idee.), pertuzumabe (OMNITARG®, 2C4, Genentech), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomabe (Bexxar, Corixia) e o conjugado anticorpo-fármaco gemtuzumabe ozogamicin (MYLOTARG®, Wyeth).
Um "agente inibidor de crescimento" quando usado aqui refere-se 15 a um composto ou composição que inibe crescimento de uma célula, especialmente uma célula de câncer expressando CD79b, ou in vitro ou in vivo. Então, o agente inibidor de crescimento pode ser um que reduz significantemente a porcentagem de células expressando CD79v em fase S. Exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem agentes que 20 bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local outro que não fase S), tais como agentes que induzem parada da fase G1 e da fase M. Bloqueadores de fase M clássicos incluem vincas (vincristina e vinblastina), taxanos, e inibidores de topoisomerase II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposídeo e bleomicina. Esses agentes que param G1 25 também se manifestam em parada da fase S, por exemplo, agentes de alquilação de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluoruracila e ara-C. Informação adicional pode ser encontrada no The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami e outros (WB Saunders: Fliladélfia, 1995), especialmente p. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anticâncer ambos derivados da árvore yew. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone- 5 Poulenc Rorer), derivado da yew Europeia, é um análogo semissintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a montagem de microtúbulos de dímeros de tubulina e estabilizam microtúbulos através da prevenção de despolimerização, que resulta na inibição de mitose em células.
A "doxorrubicina" é um antibiótico antraciclina. O nome químico completo da doxorrubicina é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo- hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetra-hidro-6,8,11-tri-hidróxi-8-(hidroxiacetil)-1- metóxi-5,12-naftacenodiona.
O termo "citocina" é um termo genérico de proteínas liberadas por 15 uma população de célula que agem sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas e hormônios de polipeptídeo tradicionais. Incluídas dentre as citocinas estão hormônio do crescimento tal como hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionila e hormônio do crescimento bovino; 20 hormônio paratireoide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteína tal como hormônio de estimulação de folículo (FSH), hormônio de estimulação da tireoide (TSH) e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; pró-lactina; lactogênio placental; fatores-α e β de necrose de tumor; substância de inibição 25 de muleriana; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento do nervo tal como NGF-β; fator de crescimento de plaqueta; fatores de crescimento transformantes (TGFs) tai como TGF-α e TGF-β; fatores de crescimeπto-l e II tipo insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutores; interferons tais como interferon-α, -β e -y; fatores de estimulação de colônia (CSFs) tal como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito- macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-SCF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL11, IL-12; um fator de necrose de tumor tai como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e ligante kit (KL). Conforme aqui usado, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas da sequência nativa.
O termo "bula" é usado para se referir a instruções geralmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informação sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contra- indicações e/ou perigos com relação ao uso de tais produtos terapêuticos.
O termo "metabólito intracelular" refere-se a um composto resultante de um processo ou reação metabólica dentro de uma célula em um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). O processo ou reação metabólica pode ser um processo enzimático, tal como clivagem proteolítica de um ligante de peptídeo do ADC, ou hidrólise de um grupo funcional tal como uma hidrazona, éster ou amida. Metabolites intracelulares incluem, mas não estão limitados a, anticorpos e fármacos livres que sofreram divagem intracelular após entrada, difusão, absorção ou transporte para uma célula.
Os termos "intracelularmente clivado" e "clivagem intracelular" referem-se a um processo ou reação metabólica dentro de uma célula ou conjugado anticorpo-fármaco (ADC), com o que a ligação covalente, isto é, ligante, entre a porção de fármaco (D) e o anticorpo (Ab) é quebrada, resultando na dissociação de fármaco livre do anticorpo dentro da célula. As porções clivadas do ADC são então metabolites intracelulares.
O termo "biodisponibilidade" refere-se à disponibilidade sistêmica (isto é níveis no sangue/plasma) de uma dada quantidade de fármaco administrada a um paciente. Biodisponibilidade é um termo absoluto que indica medição de ambos o tempo (taxa) e a quantidade (extensão) de fármaco que atinge a circulação geral a partir de uma forma de dosagem administrada.
O termo "atividade citotóxica" refere-se a um efeito de morte celular, citostático ou inibidor de crescimento de um ADC ou um metabolito intracelular de um ADC. Atividade citotóxica pode ser expressa como o valor IC50, que é a concentração (molar ou massa) por volume unitário no qual metade das células sobrevive.
O termo "alquila" conforme aqui usado refere-se a um radical hidrocarbono monovalente de cadeia linear ou ramificada saturado de um a doze átomos de carbono (Ci-C12), onde o radical alquila pode ser opcionalmente substituído independentemente com um ou mais substituintes descritos abaixo. Em outra modalidade, um radical alquila é de um a oito 15 átomos de carbono (C-i-Cg) ou um a seis átomos de carbono (Ci-C6). Exemplos de grupos alquila incluem, mas não estão limitados a, metila (Me, -CH3), etila (Et, -CH2CH3), 1-propila (n-Pr, n-propila, -CH2CH2CH3), 2-propila (i-Pr, i-propila, -CH(CH3)2), 1-butila (n-Bu, n-butila, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1 -propila (i-Bu, i- butila, -CH2CH(CH3)2), 2-butila (s-Bu, s-butila, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2- 20 propila (t-Bu, t-butila, -C(CH3)3), 1-pentila (n-pentila, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2- pentila (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentila (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butila (- C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butila (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butila (- CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butila (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexila (- CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexila (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexila (- 25 CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentila (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2- pentila (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentila (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentila (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentil (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butil (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butil (-CH(CH3)C(CH3)3, 1- heptila, 1-octila e similar.
O termo "alquenila" refere-se a urn radical hidrocarbono monovalente de cadeia linear ou ramificada de dois a oito átomos de carbono (C2-C8) com pelo menos um sítio de insaturação, isto é, uma ligação dupla sp2, carbono-carbono, onde o radical alquenila pode ser opcionalmente substituído independentemente com um ou mais substituintes descritos aqui e inclui radicais tendo orientações "cis’1 e "trans" ou, alternativamente, orientações "E" e "Z". Exemplos incluem, mas não estão limitados a, etilenila ou vinila (- CH=CH2), alila (-CH2CH=CH2) e similar.
O termo "alquinila" refere-se a um radical hidrocarbono monovalente linear ou ramificado de dois a oito átomos de carbono (C2-C8) com pelo menos um sítio de insaturação, isto é, uma ligação tripla sp, carbono- carbono, onde o radical alquinila pode ser opcionalmente substituído independentemente com um ou mais substituintes descritos aqui. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, etinila (-C=CH), propinila (propargila, -CH2C=CH) e similar.
Os termos "carbociclo", "carbociclila", "anel carbocíclico" e "cicloalquila" referem-se a um anel monovalente não aromático, saturado ou parcialmente insaturado tendo 3 a 12 átomos de carbono (C3-Ci2) como um anel monocíclico ou 7 a 12 átomos de carbono como um anel bicíclico. Carbociclos bicíclicos tendo 7 a 12 átomos podem ser dispostos, por exemplo, como um sistema [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6] e carbociclos bicíclicos tendo 9 ou 10 átomos no anel podem ser dispostos como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6], ou sistemas em ponte tal como biciclo[2.2.1]heptano, biciclo[2.2.2]octano e biciclo[3.2.2]nonano. Exemplos de carbociclos monocíclicos incluem, mas não estão limitados a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, 1-ciclopent-1-enila, 1- ciclopent-2-enila, 1-ciclopent-3-enila, ciclo-hexila, 1-ciclohex-1-enila, 1-ciclo- hex-2-enila, 1-ciclo-hex-3-enila, ciclo-hexadienila, cicloeptila, ciclo-octila, ciclononila, ciclodecila, cicloundecila, ciclododecila e similar. "Arila" significa um radical hidrocarbono aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (Ce-C2o) derivado através da remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono único de um sistema de anel aromático 5 parental. Alguns grupos arila são representados nas estruturas exemplares "Ar". Arila inclui radicais bicíclicos compreendendo um anel aromático fundido a um anel saturado, parcialmente insaturado, ou anel carbocíclico aromático, grupos arila típicos incluem, mas não estão limitados a, radicais derivados de benzeno (fenila), benzenos substituídos, naftaleno, antraceno, bifenila, indenila, 10 indanila, 1,2-di-hidronaftaleno, 1,2,3,4-tetra-hidronaftila e similar. Grupos arila são opcionalmente substituídos independentemente com um ou mais substituintes descritos aqui.
Os termos "heterociclo", "heterociclila" e "anel heterocíclico" são usados intercomutavemente aqui e referem-se a um radical carbocíclico 15 saturado ou parcialmente insaturado (isto é, tendo uma ou mais ligações duplas e/ou triplas dentro do anel) de 3 a 20 átomos no anel onde pelo menos um átomo no anel é um heteroátomo selecionado de nitrogênio, oxigênio, fósforo e enxofre, o restante dos átomos no anel sendo C, onde um ou mais átomos no anel são opcionalmente substituídos independentemente com um 20 ou mais substituintes descritos abaixo. Um heterociclo pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 4 heteroátomos selecionados de N, O, P e S) ou um bíciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 6 heteroátomos selecionados de N, O, P e S), por exemplo, um sistema bíciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. Heterociclos são 25 descritos em Paquette, Leo, A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nova York, 1968), particularmente capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; "The Chemistry of Heterocycles Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nova York, 1950 até o momento), em particular Volumes 13, 14, 16, 19 e 28; e J. Am. Chem. Soc.. (1960), 82:5566. "Heterociclila" também inclui radicais onde radicais heterociclo são fundidos com um anel saturado, parcialmente insaturado, ou anel aromático carbocíclico ou heterocíclico. Exemplos de anéis heterocíclicos incluem, mas não estão limitados a, pirrolidinila, tetra-hidrofuranila, di-hidrofuranila, tetra-hidrotienila, tetra-hidropiranila, di-hidropiranila, tetra-hidrotiopiranila, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanila, piperazinila, homopiperazinila, azetidinila, oxetanila, tietanila, homopiperidinila, oxepanila, tiepanila, oxazepinila, diazepinila, tiazepinila, 2-pirrolidinila, 3-pirrolidinila, índolinila, 2H-piranila, 4H-piranila, dioxanila, 1,3-dioxolanila, pirazolinila, ditianila, ditiolanila, di-hidropiranila, di- hidrotienila, di-hidrofuranila, pirazolidinilimidazolinila, imidazolidinila, 3- azabiciclo[3.1.0]hexanila, 3-azabiciclo[4.1.0]heptanila, azabiciclo[2.2.2]hexanila, 3H-indolil quinazolinila e N-piridil ureias. Porções espiro estão também incluídas no escopo da presente definição. Exemplos de um grupo heterocíclico onde 2 átomos de carbono no anel são substituídos com porções oxo (=O) são pirimidinonila e 1,1-dioxo-tiomorfolinila. Os presentes grupos heterociclo são opcionalmente substituídos independentemente com um ou mais substituintes descritos aqui.
O termo "heteroarila" refere-se a um radical aromático monovalente de anéis de 5, 6 ou 7 membros e inclui sistemas de anel fundido (pelo menos um dos quais é aromático) de 5-20 átomos, contendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Exemplos de grupos heteroarila são piridinila (incluindo, por exemplo, 2-hidroxipiridinila), imidazolila, imidazopirídinila, pirimidinila (incluindo, por exemplo, 4-hidroxipirimidinila), pirazolila, triazolila, pirazinila, tetrazolila, furila, tienila, isoxazolila, tiazolila, oxazolila, isotiazolila, pirrolila, quinolinila, isoquinolinila, indolila, benzimidazolila, benzofuranila, cinolinila, indazolíla, indolizinila, ftalazinila, piridazinila, triazínila, isoindolila, pteridinila, purinila, oxadiazolila, triazolila, tiadiazolila, furazanila, benzofurazanila, benzotiofenila, benzotiazolila, benzoxazolila, quinazolinila, quinoxalinila, naftiridinila e furopiridinila. Grupos heteroarila são opcionalmente substituídos independentemente com um ou mais substituintes descritos aqui.
Os grupos heterociclos ou heteroarilas podem ser ligados a carbono (ligados por carbono) ou nitrogênio (ligados por nitrogênio) onde tal for possível. A título de exemplo e não limitação, heterociclos ou heteroarilas ligados por carbono são ligados na posição 2, 3, 4, 5 ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5 ou 6 de uma piridazina, posição 2, 4, 5 ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5 ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4 ou 5 de um furano, tetra- hidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetra-hidropirrol, posição 2, 4 ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4 ou 5 de um isoxazol, pirazol ou isotiazol, posição 2 ou 3 de uma aziridina, posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina, posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma quinolina ou posição 1,3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma isoquinolina.
A título de exemplo e não limitação, heterociclos ou heteroarilas ligados por nitrogênio são ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posição 2 de um isoindol, ou isoindolina, posição 4 de uma morfolina e posição 9 de um carbazol ou β-carbolina. "Alquileno" refere-se a uma cadeia saturada, ramificada ou reta ou radical hidrocarbono cíclico de 1-18 átomos de carbono e tendo dois centros de radical monovalente derivados pela reação de dois átomos de hidrogênio dos mesmos ou dois átomos de carbono diferentes de um alcano parental. Radicais alquileno típicos incluem, mas não estão limitados a: metileno (-CH2-)1,2-etil (- CH2CH2-), 1,3-propil (-CH2CH2CH2-), 1,4-butil (-CH2CH2CH2CH2-) e similar.
Um "C1-C10 alquileno" é um grupo hidrocarbono saturado, de cadeia reta, da fórmula -(CH2)I-IO-- Exemplos de um Ci-C10 alquileno incluem metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, noninelo e decaleno. "Alquenileno" refere-se a um radical hidrocarbono de cadeia reta ou ramificada ou cíclico, insaturado, de 2-18 átomos de carbono e tendo dois centros de radical monovalente derivados através da remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou dois átomos de carbono diferentes de um alceno parental. Radicais alquenileno típicos incluem, mas não estão limitados a: 1,2- etileno (-CH=CH-). "Alquinileno" refere-se a um radical hidrocarbono ramificado ou de cadeia reta ou cíclico, insaturado, de 2-18 átomos de carbono e tendo dois centros de radical monovalente derivados através da remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou dois átomos de carbono diferentes de uma alcina parental. Radicais alquinileno típicos incluem, mas não estão limitados a: acetileno (-CsC-), propargila (-CH2C=C) e 4-pentiniia (-CH2CH2CH2C=C).
Um "arileno" é um grupo arila que tem duas ligações covalentes e pode estar na configuração orto, meta ou para conforme mostrado nas estruturas que seguem:
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onde o grupo fenila pode ser não substituído ou substituídos com até quatro grupos incluindo, mas não limitado a, -C-i-C8 alquila, -O-(Ci-C8 alquila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OU’, -C(O)NH2 , -C(O)NHR', - C(O)N(R’)2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogênio, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado de H, -Ci-C8 alquila e arila. 'Arilalquila" refere-se a um radical alquila acíclico onde um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído com um radical arila. Grupos arilalquila típicos incluem, mas não estão limitados a, benzila, 2-feniletan-1 -ila, 2-fenileten-1-ila, naftilmetila, 2-naftiletan-1-ila, 2-naftileten-1-ila, naftobenzila, 2- naftofeniletan-1-íla e similar. O grupo arilalquila compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a porção alquila, incluindo grupos alcanila, alquenila ou alquinila, do grupo arialquila é de 1 a 6 átomos de carbono e a porção arila é de 5 a 14 átomos de carbono. "Heteroarilalquila" refere-se a um radical alquila acíclico onde um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído com um radical heteroarila. Grupos heteroarilalquila típicos incluem, mas não estão limitados a, 2- benzimidazolilmetila, 2-furiletila e similar. O grupo heteroarilalquila compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a porção alquila, incluindo grupo alcanila, alquenila ou alquinila, do grupo heteroarilalquila é de 1 a 6 átomos de carbono e a porção heteroarila é de 5 a 14 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S. A porção heteroarila do grupo heteroarilalquila pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono ou um biciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6],
O termo "profármaco" conforme usado no presente pedido refere- se a uma forma precursora ou derivada de um composto da invenção que pode ser menos citotóxica para células comparado com o composto ou fármaco parental e é capaz de ser enzimaticamente ou hidroliticamente ativado ou convertido na forma parental mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615° Meeting Belfast (1986) e Stella e outros, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drugs Delivery", Directed Drugs Delivery, Borchardt e outros (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Os profármacos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, profármacos contendo fosfato, profármacos contendo tiofosfato, profármacos contendo sulfato, profármacos contendo peptídeo, profármacos modificados com D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos contendo β-lactama, profármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída, profármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorcitosina e outros profármacos 5-fluoruridila que podem ser convertidos no fármaco livre citotóxico mais ativo. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivatizados em uma forma de profármaco para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, compostos da invenção e agente quimioterapêuticos tal como acima descrito.
Um "metabolite" é um produto produzido através do metabolismo no corpo de um composto especificado ou sal do mesmo. Metabolites de um composto podem ser identificados usando técnicas de rotina conhecidas no campo e suas atividades determinadas usando testes tais como aqueles descritos aqui. Tais produtos podem resultar, por exemplo, da oxidação, redução, hidrólise, amidação, desaminação, esterificação, desesterificação, clivagem enzimática, e similar, do composto administrado. Desta maneira, a invenção inclui metabolites de compostos da invenção, incluindo compostos produzidos através de um processo compreendendo contato de um composto da presente invenção com um mamífero por um período de tempo suficiente para dar um produto metabólico do mesmo.
Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo que é útil para aplicação de um fármaco a um mamífero. Os componentes do lipossoma são geralmente dispostos em uma formação em bicamada, similar à disposição do lipídeo de membranas biológicas. "Ligante" refere-se a uma porção química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que liga covalentemente um anticorpo a uma porção de fármaco. Em várias modalidades, ligantes incluem um radical divalente tal como uma alquildiíla, uma arildííla, uma heteroarildiíla, porções tal como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades de repetição de alquilóxi (por exemplo, polietilenóxi, PEG, polimetilenóxi) e alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine®); e éster e amida diácidos Incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida.
O termo "quiral" refere-se a moléculas que têm a propriedade de não superposição do par de imagem de espelho, enquanto o termo "aquiral" refere-se a moléculas que são superpostas em seu par de imagem de espelho.
O termo "estereoisômeros" refere-se a compostos que têm constituição química idêntica, mas diferem com relação à disposição dos átomos ou grupos em espaço. "Diastereômero" refere-se a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens de espelho umas das outras. Diastereômeros têm propriedades físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais e reatividades. Misturas de diastereômeros podem ser separadas sob procedimentos analíticos de alta resolução tais como eletroforese e cromatografia. "Enantiômeros" refere-se a dois estereoisômeros de um composto que são imagens de espelho não-superpostas um do outro.
Definições e convenções estereoquímicas usadas aqui geralmente seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nova York; e Eliel, E. e Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nova York. Muitos compostos orgânicos existem em formas opticamente ativas, isto é, eles têm a habilidade em girar o plano de luz plano-polarizada. Ao descrever um composto optícamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S, são usados para denotar a configuração absoluta da molécula sobre seu(s) centro(s) quiral(ais). Os prefixos d e I ou (+) e (-) são empregados para designar o sinal de rotação de luz plano-polarizada pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levogiratório. Um composto prefixado com (=) ou d é dextrogiratório. Para uma dada estrutura química, esses estereoisômeros são idênticos exceto pelo fato de que eles são imagens de espelho uns dos outros. Um estereoisômero específico pode ser também referido como um enantiômero, e uma mistura de tais isômeros é frequentemente chamada uma mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiômeros é referida como uma mistura racêmica ou um racemato, que pode ocorrer onde não houve nenhuma estereosseleção ou estereoespecificidade em uma reação ou processo químico. Os termos "mistura racêmica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, destituídas de atividade óptica.
O termo "tautômero" ou "forma tautomérica" refere-se a isômeros estruturais de energias diferentes que são interconversíveis através de uma barreira de energia baixa. Por exemplo, tautômeros de próton (também conhecidos como tautômeros prototrópicos) incluem interconversão através de migração de um próton, tais como isomerizações ceto-enol e imino-enamina. Tautômeros de valência incluem interconversões através de reorganização de alguns dos elétrons de ligação.
A expressão "sal farmaceuticamente aceitável, conforme aqui usado, refere-se a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um composto da invenção. Sais exemplares incluem, mas não estão limitados a, sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, bezoato, glutamato, metanossulfonato, "mesilato", etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato e pamoato (isto é, 1,1'-metileno-bis(2- hidroxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula tal como um íon de acetato, um íon de succinato ou outro contraíon. O contraíon pode ser qualquer porção orgânica ou inorgânica que estabilize a carga no composto parental. Ainda, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais de um átomo carregado em sua estrutura. Casos onde átomos carregados múltiplos são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter contraíons múltiplos. Desta maneira, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/o um ou mais contraíon.
Se o composto da invenção for uma base, o sal farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado através de qualquer método adequado disponível na técnica, por exemplo, tratamento da base livre com ácido inorgânico, tal como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanossulfônico, ácido fosfórico e similar, ou com um ácido orgânico, tal como ácido acético, ácido trifluoracético, ácido maléico, ácido sucinico ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malônico, ácido pirúvido, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, um ácido piranosidila, tal como ácido glucurônico ou ácido galacturônico, um alfa hidróxi ácido, tal como ácido cítrico ou ácido tartárico, um aminoácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico, um ácido aromático tal como um ácido benzoico ou ácido cinâmico, um ácido sulfônico, tal como ácido p-toluenossulfônico ou ácido etanossulfônico ou similar.
Se o composto da invenção for um ácido, o sal farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado através de qualquer método adequado, por exemplo, tratamento do ácido livre com uma base inorgânica ou orgânica, tal como uma amina (primária, secundária ou terciária), um hidróxido de metal alcalino ou hidróxido de metal alcalinoterroso ou similar. Exemplos ilustrativos de sais adequados incluem, mas não estão limitados a, sais orgânicos derivados de aminácidos, tais como glicina e arginina, amónia, aminas primária, secundária e terciária, e aminas cíclicas, tais como piperidina, morfolina e piperazina, e sais inorgânicos derivados de sódio, cálcio, potássio, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, alumínio e lítio.
A expressão "farmaceuticamente aceitável" indica que a substância ou composição deve ser quimicamente e/ou toxicologicamente compatível com os outros ingredientes compreendendo uma formulação e/ou o mamífero sendo tratado com a mesma.
Um "solvato" refere-se a uma associação ou complexo de uma ou mais moléculas solventes e um composto da invenção. Exemplos de solventes que formam solvatos incluem, mas não estão limitados a, água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etila, ácido acético e etanolamina. O termo "hidrato" refere-se ao complexo onde a molécula solvente é água.
O termo "grupo de proteção" refere-se a um substituinte que é geralmente empregado para bloquear ou proteger uma funcionalidade particular enquanto reagindo com outros grupos funcionais no composto. Por exemplo, um grupo de "proteção amino" é um substituinte ligado a um grupo amino que bloqueia ou protege a funcionalidade amino no composto. Grupos de proteção amino adequados incluem acetila, trifluoracetila, t-butoxicarbonila (BOC), benziloxicarbonila (CBZ) e 9-fluorenilmetilenoxicarbonila (Fmoc). Similarmente, um "grupo de proteção hidróxi" refere-se a um substituinte de um grupo hidróxi que bloqueia ou protege a funcionalidade hidróxi. Grupos de proteção adequados incluem acetila e silila. Um "grupo de proteção carbóxi" refere-se a um substituinte do grupo carbóxi que bloqueia ou protege a funcionalidade carbóxi. Grupos de proteção carbóxi comuns incluem fenilsulfoniletila, cianoetila, 2-(trimetilsilil)etila, 2-(trimetilsilil)etoximetila, 2-(p- toluenossulfonil)etila, 2-(p-nitrofenilsulfenil)etila, 2-(difenilfosfino)-etila, nitroetila e similar. Para uma descrição geral de grupos de proteção e seu uso vide T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nova York, 1991. "Grupo de saída" refere-se a um grupo funcional que pode ser substituído por outro grupo funcional. Certos grupos de saída são bem conhecidos na técnica e exemplos incluem, mas não estão limitados a, haleto (por exemplo, cloro, bromo, iodo), metanossulfonila (mesila), p- toluenossulfonila(tosila), trifluormetilsulfonila (triflato) e trifluormetilsulfonato. ABREVIAÇÕES COMPONENTES LIGANTES: MC = 6-maleimidocaproíla Val-Cit ou "vc" = valina-citrulina (um dipeptídeo exemplar em um ligante clivável de protease) Citrulina = ácido 2-amino-5-ureido pentanoico PAB = p-aminobenziloxicarbonila (um exemplo de um composto ligante "auto immolativo") Me-Val-Cit = N-metil-valina-citrulina (onde a ligação do peptídeo ligante foi modificada para prevenir sua clivagem por catepsina B) MC(PEG)6-OH = maleimido-polietileno glicol (pode ser ligado a anticorpo cisteínas) FÁRMACOS CITOTÓXICOS: MMAE = mono-metil auristatina E (MW 718) MMAF = variante de auristatina E (MMAE) com uma fenilalanina no terminal C do fármaco (MW 731,5) MMAF-DMAEA = MMAF com DMAEA (dimetilaminoetilamina) em uma ligação amida à fenilalanina C-terminal (MW 801,5) MMAF-TEG = MMAF com tetraetileno glicol esterificado para a fenilalaπina MMAF-NtBu = N-t-butila, ligada a uma amida ao terminal C de MMAF DM1 = N(2’)-desacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina DM3 = N(2')-desacetil-N2-(4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina DM4 = N(2’)-desacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)- maitansina Abreviações adicionais são como segue: AE é auristatina E, Boc é /V-(t-butoxicarbonila), cit é citrulina, dap é dolaproina, DCC é 1,3-diciclo- hexilcarbodiimida, DCM é diclorometano, DEA é dietilamina, DEAD é dietilazodicarboxilato, DEPC é dietilfosforilcianidato, DIAD é diisopropilazodicarboxilato, DIEA é /V,A/-diisopropiletilamina, dil é dolaisoleucina, DMA é dimetilacetamida, DMAP é 4-dimetilaminopiridina, DME é etilenoglicol dimetil éter (ou 1,2-dimetoxietanol), DMF é N,N- dimetilformamida, DMSO é dimetilsulfóxido, doe é dolafenina, dov é N,N- dimetilvalina, DTNB é ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)t DTPA é ácido dietilenotriaminopentaacético, DTT é ditiotreitol, EDCI é cloridrato de 1-(3- dimetilaminopopil)-3-etilcarbodi-imida, EEDQ é 2-etóxi-1-etoxicarbonil-1,2-di- hidroquinolina, ES-MS é espectrometria de massa por eletropulverização, EtOAc é acetato de etila, Fmoc é A/-(9-fluorenilmetoxicarbonila), gly é glicina, HATU é hexafluorfosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,/V,/V', N, tetrametilurônio, HOBt é 1-hidroxibenzotriazol, HPLC é cromatografia liquida de alta pressão, ile é isoleucina, lys é lisina, McCN (CH3CN) é acetonitrila, MeOH é metanol, Mtr é 4-anisildifenilmetila (ou 4-metoxitritila), nor é (7S,2R)-(+)- norefedrina, PBS é solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4), PEG é polietileno glicol, Ph é fenila, Pnp é p-nitrofenila, MC é 6-maleimidocaproíla, phe é L-fenilalanina, PyBrop é hexafluorfosfato de bromo tr/s-pirrolidino fosfônio, SEC é cromatografia de exclusão de tamanho, Su é succinimida, TFA é ácido trifluoracético, TLC é cromatografia de camada fina UV é ultravioleta e vai é valina. Um "aminoácido de cisteína livre" refere-se a um resíduo de 5 aminoácidos de cisteína que foi engenheirado em um anticorpo parental, tem um grupo funcional tiol (-SH) e não é emparelhado como uma fonte dissulfeto intramolecular ou intermolecular. O termo "valor de reatividade tiol" é uma caracterização quantitativa da reatividade de aminoácidos de cisteína livres. O valor de 10 reatividade tiol é a porcentagem de um aminoácido de cisteína livre em um anticorpo engenheirado com cisteína que reage com um reagente tiol-reativo, e convertido em um valor máximo de 1. Por exemplo, um aminoácido de cisteína livre em um anticorpo engenheirado com cisteína que reage em 100% de rendimento com um reagente tio-reativo, tal como um reagente biotina- 15 maleimida, para formar um anticorpo marcado com biotina tem um valor de reatividade tiol de 1,0. Outro aminoácido de cisteína engenheirado no mesmo anticorpo parental ou um diferente que reage em 80% de rendimento com um reagente tiol-reativo tem um valor de reatividade tiol de 0,8. Outro aminoácido de cisteína engenheirado no mesmo anticorpo parental ou um diferente que 20 falha totalmente em reagir com um reagente tiol-reativo tem um valor de reatividade tiol de 0. Determinação do valor de reatividade tiol de uma cisteína particular pode ser conduzida através do ensaio ELISA, espectroscopia de massa, cromatografia líquida, autorradiografia ou outros testes analíticos quantitativos. 25 Um "anticorpo de origem" é um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácido da qual um ou mais resíduos de aminoácido são substituídos por um ou mais resíduos Cisteína. O anticorpo parental pode compreender uma sequência nativa ou do tipo selvagem. O anticorpo parental pode ter modificações de sequência de aminoácido preexistentes (tais como adições, deleções e/ou substituições) com relação a outras formas nativas, do tipo selvagem ou modificadas de um anticorpo. Um anticorpo parental pode ser direcionado contra um antígeno-alvo de interesse, por exemplo, um polipeptídeo biologicamente importante. Anticorpos direcionados contra antígenos de não-polipeptídeo (tais como antígenos de glicolipídeo associados a tumor; vide US 5091178) são também compreendidos
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III. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DA INVENÇÃO
A invenção provê anticorpos anti-CD79b ou fragmentos funcionais dos mesmos e seu método de uso no tratamento de tumores hematopoiéticos.
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo que se liga, preferivelmente especificamente, a qualquer um dos polipeptídeos descritos acima ou abaixo. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, incluindo fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, anticorpo de domínio simples, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epitopo antigênico. Os anticorpos da presente invenção podem ser opcionalmente conjugados a um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina, um maitansinoide, um derivado de dolostatina ou uma calicheamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similar. Os anticorpos da presente invenção podem ser 5 opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e preferivelmente induzem morte de uma célula à qual eles se ligam. Para propósitos de detecção, os anticorpos da presente invenção podem ser detectavelmente marcados, ligados a um apoio sólido ou similar.
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b 10 humanizado onde a afinidade monovalente do anticorpo para CD79B (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para CD79b) é substancialmente a mesma que a afinidade monovalente de um anticorpo de murino (por exemplo, afinidade do anticorpo de murino como um fragmento Fab para CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do 15 anticorpo quimérico como um fragmento Fab para CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em, uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada conforme mostrado nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b 20 humanizado onde a afinidade monovalente do anticorpo para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para CD79b) é menor, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 vezes menor, do que a afinidade monovalente de um anticorpo de murino (por exemplo, afinidade do 25 anticorpo de murino como um fragmento Fab para CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab para CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada conforme mostrado nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade monovalente do anticorpo para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para CD79b) é maior, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior, do que a afinidade monovalente de um anticorpo de murino (por exemplo, afinidade do anticorpo de murino como um fragmento Fab para CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab para CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada conforme mostrado nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é substancialmente a mesma que a afinidade de um anticorpo de murino (Por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab para CD79b) em sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada conforme mostrado nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é menor, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 vezes menor, do que a afinidade de um anticorpo de murino (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento de IgG para CD79b) em sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência 5 de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada conforme mostrado nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo mo uma IgG para CD97b) é maior, por 10 exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior, do que a afinidade de um anticorpo de murino (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento de IgG para CD79b) em sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma 15 sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada conforme mostrado nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,4 nM. Em 20 um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo humanizado anti-CD79b onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,4 nM +/- 0,04.
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b 25 (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,3 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,32 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,36 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b 5 humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,4 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,44 nM ou 10 melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,48 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para OD79b 15 (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,5 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,3 e 0,5 nM. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b 20 humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,32 e 0,48 nM. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 25 0,36 e 0,44 nM.
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,2 nM. Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,2 nM +/- 0,02.
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,1 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,12 nM ou melhor, Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,14 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,16 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,18 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,2 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,22 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,24 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,26 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,28 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,30 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,1 nM e 0,3 nM. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,12 nM e 0,28 nM. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti- CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,14 nM e 0,26 nM. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,16 nM e 0,24 nM. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,18 nM e 0,22 nM.
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,5 nM. Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,5 nM +/- 0,1.
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,4 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,5 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,6 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) é 0,7 nM ou melhor. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,3 nM e 0,7 nM. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,4 nM e 0,6 nM. Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD79b humanizado onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para CD79b) está entre 0,5 nM e 0,55 nM.
Em um aspecto, a afinidade monovalente do anticorpo de murino para CD79b é substancialmente a mesma que a afinidade de um fragmento Fab compreendendo sequências de domínio variável de SEQ ID NO: 10 (figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (figuras 8A-B). Em outro aspecto, a afinidade monovalente do anticorpo de murino para CD79b é substancialmente igual à afinidade de ligação de um fragmento Fab compreendendo sequências de domínio variável de um anticorpo gerado a partir do hibridoma depositado com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993 ou anticorpo quimérico compreendendo domínios variáveis de anticorpo gerado a partir dos hibridomas depositados com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993.
Como é bem estabelecido na técnica, afinidade de ligação de um ligante com seu receptor pode ser determinada usando qualquer um de uma variedade de ensaios, e expressa em termos de uma variedade de valores quantitativos. Desta maneira, em uma modalidade, a afinidade de ligação é expressa como valores Kd e reflete afinidade de ligação intrínseca (por exemplo, com efeitos de avidez minimizados). Em geral e preferivelmente, afinidade de ligação é medida in vitro, seja em um ambiente livre de célula ou associado à célula. Conforme descrito em mais detalhes aqui, diferença de vezes em afinidade de ligação pode ser quantificada em termos da razão do valor de afinidade de ligação monovalente de um anticorpo humanizado (por exemplo, em forma Fab) e o valor de afinidade de ligação monovalente de um anticorpo de referência/comparador (por exemplo, em forma Fab) (por exemplo, um anticorpo de murino tendo sequências de região hipervariável doadoras), onde aos valores de afinidade de ligação são determinados sob condições de ensaio similares. Então, em uma modalidade, a diferença em vezes em afinidade de ligação é determinada como a razão dos valores Kd do anticorpo humanizado e dito anticorpo Fab de referência/comparador. Por exemplo, em uma modalidade, se um anticorpo da invenção (A) tiver uma afinidade que é "3 vezes menor" do que a afinidade de um anticorpo de referência (M), então se o valor Kd para A for 3x, o valor Kd de M seria 1x, e a razão de Kd de A para Kd de M seria 3:1. Por outro lado, em uma modalidade, se um anticorpo da invenção (C) tiver uma afinidade que é "3 vezes maior" do que a afinidade de um anticorpo de referência (R), então se o valor Kd para C for 1x, o valor Kd de R seria 3x, e a razão de Kd de C para Kd de R seria 1:3. Qualquer um de vários ensaios conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos aqui, pode ser usado para obter medições de afinidade de ligação, 5 incluindo, por exemplo, Biacore, radioimunoensaio (RIA) e ELISA.
Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é provido, onde o anticorpo compreende: pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas do grupo consistido em: 10 HVR-L1 compreende a sequência A1-A15, onde A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) HVR-L2 compreende a sequência B1-B7, onde B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO; 132) HVR-L3 compreende a sequência C1-C9, onde C1-C9 é 15 QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) HVR-H1 compreende a sequência D1-D10, onde D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) HVR-H2 compreende a sequência E1-E18, onde E1-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e 20 HVR-H3 compreende a sequência F1-F10, onde F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO; 136).
Em uma modalidade, HVR-L1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, HVR-L2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 132.
Em uma modalidade, HVR-L3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 133. Em uma modalidade, HVR-H1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 134. Em uma modalidade, HVR-H2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 135. Em uma modalidade, HVR-H3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 136. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreendendo as sequências (em combinação conforme aqui descrito) é humanizado ou humano.
Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é provido, onde o anticorpo compreende: pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas do grupo consistindo em: HVR-L1 compreendendo a sequência A1-A15, onde A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) HVR-L2 compreendendo a sequência B1-B7, onde B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) HVR-L3 compreendendo a sequência C1-C9, onde C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) HVR-H1 compreendendo a sequência D1-D10, onde D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) HVR-H2 compreendendo a sequência E-E18, onde E1-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e HVR-h3 compreendendo a sequência F1-F10, onde F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136); e pelo menos uma HVR variante onde a sequência de HVR variante compreende modificação de pelo menos um resíduo da sequência mostrada na SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 ou 136. Em uma modalidade, HVR-L1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, HVR-L2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 132. Em uma modalidade, HVR-L3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 133. Em uma modalidade, HVR-H1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 134. Em uma modalidade, HVR-H2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 135. Em uma modalidade, HVR-H3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 136. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreendendo essas sequências (em combinação conforme aqui descrito) é humanizado ou humano.
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs, onde cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 131, 132, 133, 134, 135 e 136, e onde a SEQ ID NO: 131 corresponde a uma HVR-L1, SEQ ID NO: 132 corresponde a uma HVR-L2, SEQ ID NO: 133 corresponde a uma HVR-L3, SEQ ID NO: 134 corresponde a uma HVR-H1, SEQ ID NO: 135 corresponde a uma HVR-H2 e SEQ ID NO: 136 corresponde a uma HVR-H3. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, onde cada uma, em ordem, compreende SEQ ID NOs: 131, 132, 133, 134, 135 e 136. HVRs variantes em um anticorpo da invenção podem ter modificações de um ou mais resíduos dentro da HVR. Em uma modalidade, uma variante de HVR-L1 compreende uma substituição nas posições que seguem: A4 (K), A9 (E ou S) e A10 (A ou S). Em uma modalidade, uma variante de HVR-L2 compreende 1-5 (1, 2, 3, 4 ou 5) substituições em qualquer uma ou combinação das posições que seguem: B2 (S ou G), B3 (R ou G), B4 (K, R, Y, I, H ou Q), B5 (R), B6 (G, K, A, R, S ou L) e B7 (R, N, T ou G). Em uma modalidade, uma variante de HVR-L3 compreende 1-4 (1, 2, 3 ou 4 substituições) em qualquer uma ou combinação das posições que seguem: C1 (N ou D), C2 (N ou P), C3 (D ou R), C5 (S, K, A, Q, D, L ou G), C6 (A, E ou N), C7 (A), C8 (R) e C9 (N). Em uma modalidade, uma variante de HVR-H1 compreende 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) substituições em qualquer uma ou combinação das posições que seguem: D1 (P), D2 (F), D3 (P, S, Y, G ou N), D4 (L ou V), D5 (T, R, N, K, C, G ou P), D6 (R, T, K ou G), D8 (F), D9 (V ou L) e D10 (S, Q, N ou D). Em uma modalidade, uma variante de HVR-H3 compreende 1-3 (1,2 ou 3) substituições em qualquer uma ou combinação das posições que seguem: F4 (R ou I), F6 (I ou F), F7 (K, C, R, V ou F), F8 (L) e F9 (S). Letra(s) em parênteses seguindo cada posição indica um aminoácido de substituição ilustrativo; como seria evidente a um versado na técnica, adequabilidade de outros aminoácidos como aminoácidos de substituição no contexto descrito aqui pode ser rotineiramente avaliada usando técnicas conhecidas no campo e/ou descritas aqui. Em uma modalidade, A9 em uma HVR-L1 variante é E. Em uma modalidade, F6 em uma HVR-H3 variante é I. Em uma modalidade, F7 em uma HVR-H3 variante é R. Em uma modalidade, F8 em uma HVR-H3 variante é L. Em uma modalidade um anticorpo da invenção compreende uma HVR-H3 variante onde F6 é I, F7 é R e F8 é L. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L1 variante onde A9 é E e uma HVR-H3 variante onde F6 é I, F7 é R e F8 é l_. Em uma modalidade, A9 em uma HVR-L1 variante é S. Em uma modalidade um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L1 variante onde A9 é S e uma HVR-H3 variante onde F6 é I, F7 é R e F8 é L.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L1 variante onde A4 é K. Em algumas modalidades, a dita HVR-L1 variante compreende HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 onde cada uma compreende, em ordem, a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 132, 133, 134, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR- L1 variante compreende ainda uma variante de HVR-1 onde A9 é E ou S e/ou A10 é A ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-L1 variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 onde C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso de estrutura principal de cadeia pesada do subgrupo 111 humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas 5 modalidades desses anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade desses anticorpos, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso de estrutura principal de cadeia leve KI humana. Em alguma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana da estrutura principal compreende 10 substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana compreende a substituição nas posições 48, 67, 69, 15 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo II humana) 48 é 1,67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e 80 é M. Em algumas modalidades desses anticorpos, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso, da estrutura principal da 20 cadeia leve KI humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana) 4 é L e/ou 47 é F. 25 Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L2 variante, onde B3 é R, B4 é K, B6 é G e B7 é R. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L2 variante, onde B3 é R, B4 é Y, B6 é K e B7 é R. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L2 variante onde B3 é R, B4 é K e B6 é G. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-L2 variante compreende ainda HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 onde cada um compreende, em ordem, a sequência mostrada nas SEQ ID NOs.: 131, 133, 134, 135 e 136. Em 5 algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-L2 variante compreende uma variante de HVR-L1 onde A9 é E ou S e/ou A10 é A ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-L2 variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 onde C6 é E ou N e/ou 07 é A. Em algumas modalidades, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso de 10 estrutura principal de cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal compreende substituição nas posições 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade desses anticorpos, esses anticorpos compreendem ainda uma 15 sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana. Em alguma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana da esturtura principal compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da 20 cadeia leve KI humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71,73, 75,78 e/ou 80. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III 25 humano) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e 80 é M. Em algumas modalidades desses anticorpos, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L3 variante onde C5 é K. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L3 onde C5 é S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-L3 variante compreende ainda HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 onde cada um compreende, em ordem, a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 131, 132, 134, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-L3 variante compreende ainda uma variante de HVR-L1 onde A9 é E ou S e/ou A10 é A ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-L3 variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 onde C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso da estrutura principal compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em algumas modalidades desses anticorpos, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana da estrutura principal compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana) 4 é H e/ou 47 é F. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição nas posições 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e/ou 80 é M. Em algumas modalidades desses anticorpos, esses anticorpos compreendem 5 ainda uma sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana da estrutura principal compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da 10 cadeia leve KI humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-H1 variante onde D3 é P, D5 é T, D6 é R e D10 é N. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-H1 variante onde D3 é P, D5 é N, D6 é R e D10 é N. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-H1 15 variante compreende ainda HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, onde cada uma compreende, em ordem, a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 131, 132, 133, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-H1 variante compreende ainda uma variante de HVR-L1 onde A9 é E ou S e/ou A10 é A ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-H1 20 variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 onde C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso de estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso da estrutura principal compreende substituição nas posições 71, 73 e/ou 78. Em 25 algumas modalidades desses anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A.
Em uma modalidade desses anticorpos, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana da estrutura principal compreende substituição nas posições 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição nas posições 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e/ou 80 é M. Em algumas modalidades desses anticorpos, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana da estrutura principal compreende substituição nas posições 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-H3 variante onde F6 é I e F8 é L. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-H3 variante onde F6 é I, F7 é R e F8 é L. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-H3 variante compreende ainda HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR4H1 e HVR-H2 onde cada uma compreende, em ordem, a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 131, 132, 133, 134 e 135. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVF-H3 variante compreende ainda uma variante de HVR-L1 onde A9 é E ou S e/ou A10 é A ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo de HVR-H3 variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 onde C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso da estrutura principal de cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição nas posições 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana) 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição nas posições 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso de estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade desses anticorpos, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana da estrutura principal compreende substituição nas posições 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, posição (da sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição nas posições 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades desses anticorpos, posição (sequência de consenso da estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e 80 é M. Em algumas modalidades desses anticorpos, esses anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana. Em uma modalidade desses anticorpos, a sequência de consenso de estrutura principal da cadeia leve KI humana da estrutura principal compreende substituição nas posições 4 e/ou 47. Em algumas modalidades desses anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura principal da cadeia leve KI humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as sequências de HVR mostradas na figura 9 (SEQ ID NOs: 17-21) e/ou figura 10 (SEQ ID NOs: 22-106).
Um agente terapêutico para uso em um indivíduo hospedeiro elicita principalmente pouca ou nenhuma resposta imunogênica contra o agente no dito indivíduo. Em uma modalidade, a invenção provê tal agente. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo humanizado que elicita e/ou é esperado elicitar uma resposta de anticorpo anticamundongo humana (HAMA) em um nível substancialmente reduzido comparado a um anticorpo compreendendo a sequência das SEQ ID NOs: 10 e 14 em um indivíduo hospedeiro. Em outro exemplo, a invenção provê um anticorpo humanizado que elicita e/ou é esperado elicitar resposta mínima ou nenhuma de anticorpo anticamundongo humano (HAMA). Em um exemplo, um anticorpo da invenção elicita resposta de anticorpo anticamundongo que está no ou menos do que um nível clinicamente aceitável.
Um anticorpo humanizado da invenção pode compreender uma ou mais sequências (por exemplo, de estrutura principal) de região não- hipervariável de consenso humanas e/ou humanas em seu domínio variável de cadeia pesada e/ou leve. Em algumas modalidades, uma ou mais modificações adicionais estão presentes dentro das sequências de região não-hipervariável de consenso humanas e/ou humanas. Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo da invenção compreende uma sequência de estrutura principal de consenso humana, que em uma modalidade é a sequência de estrutura principal de consenso do subgrupo III. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma sequência de estrutura principal de consenso do subgrupo 111 variante modificada pelo menos em uma posição de aminoácido. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de estrutura principal de consenso do subgrupo III variante pode compreender uma substituição em uma ou mais posições 71, 73 e/ou 78. Em uma modalidade, a dita substituição é R71A, N73T e/ou L78A, em qualquer combinação das mesmas. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de consenso de estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III variante compreende substituição nas posições 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78. Em uma modalidade, a dita substituição é V48I, F67A, I69F, R71A, N73T e/ou L78A. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de consenso de estrutura principal da cadeia pesada do subgrupo III variante compreende substituição nas posições 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em uma modalidade, a dita substituição é V48I, F67A, I69F, R71A, N73T, K75S L78A e/ou L80M. Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo da invenção compreende uma sequência de estrutura principal de consenso humana, que em uma modalidade é a sequência de estrutura principal de consenso KI. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma sequência de estrutura principal de consenso KI variante modificada em pelo menos uma posição de aminoácido. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de estrutura principal de consenso KI variante pode compreender uma substituição na posição 4. Em uma modalidade, a dita substituição é M4L. Por exemplo, em uma modalidade, a sequência de estrutura principal de consenso KI variante pode compreender uma substituição nas posições 4 e/ou 47. Em uma modalidade, a dita substituição é M4L e/ou L47F. Como é conhecido na técnica, e conforme descrito em mais detalhes abaixo, a delineação da posição e/ou limite do aminoácido de uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na técnica (conforme descrito abaixo). Algumas posições dentro de um domínio variável podem ser vistas como posições hipervariáveis híbridas pelo fato que essas posições podem ser consideradas estar dentro de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios enquanto sendo consideradas estar fora de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios diferente. Uma ou mais dessas posições podem ser também encontradas em regiões hipervariáveis estendidas (como definido mais abaixo). A invenção provê anticorpos compreendendo modificações nessas posições hipervariáveis híbridas. Em uma modalidade, essas posições hipervariáveis incluem uma ou mais posições 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 e 101-102 em um domínio variável de cadeia pesada. Em uma modalidade, essas posições hipervariáveis híbridas incluem uma ou mais de posições 2429, 35-36, 46-49, 56 e 97 em um domínio variável de cadeia leve. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma sequência de estrutura principal de consenso de subgrupo humana variante humana modificada em uma ou mais posições hipervariáveis híbridas.
Em um aspecto, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de estrutura principal de consenso do subgrupo III humana variante modificada em uma ou mais posições 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 e 101. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição G26P. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição F27Y. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição T28P, S, Y, G ou N. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição F29L ou F29V. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S30T, R, N, K, C, G ou P. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição A33W ou A33F. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição M34I, V ou L. Em uma modalidade S35E, Q, N ou D. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição V48I. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S49G. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição Y58N. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição A60N. Em uma modalidade, 0 anticorpo compreende uma substituição D61E. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S62I, Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição V63F. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição A93T. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição D101S.
Em um aspecto, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de estrutura principal de consenso do subgrupo I capa humana variante modificada em uma ou mais posições 24, 27-29, 56 e 97. Em uma modalidade, o anticorpo compreende a substituição Q27K. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S28D ou E. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição I29G, A ou S. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S56R, N, T ou G. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição T97N.
Em um aspecto, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de estrutura principal de consenso do subgrupo III humana variante modificada nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou todas das posições 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 e 101. Em uma modalidade, modificação é selecionada do grupo consistindo em G26P, F27Y, T28P (S, Y, G ou N), F29L (V), S30T (R, N, K, C, G ou P), A33W (F), M34I (V ou L), S35E (Q, N ou D), V48I, S49G, Y58N, A60N, D61E, S62I, V63F, A93T e D101S. Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo da invenção compreende uma sequência de estrutura principal de consenso do subgrupo III variante modificada nas posições 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em uma modalidade, a dita substituição é V48I, F67A, I69F, R71A, N73T, K75S, L78A e/ou L80M.
Em um aspecto, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia compreendendo uma sequência de estrutura principal de consenso do subgrupo I capa humana variante modificada em 1,2, 3, 4, 5 ou todas das posições 24, 27-29, 56 e 97. Em uma modalidade, 5 modificação é selecionada do grupo consistindo em R24K, Q72K, S28D (E), I29G (A ou S), S56R (N, T ou G) e T97N. Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo da invenção compreende uma estrutura principal de consenso KI variante modificada nas posições 4 e/ou 47. Em uma modalidade, a dita substituição é M4L e/ou L47F.
Um anticorpo da invenção pode compreender quaisquer sequências de estrutura principal de cadeia leve de consenso humana ou humana, contanto que o anticorpo exiba as características biológicas desejadas (por exemplo, uma afinidade de ligação desejada). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma porção 15 (ou toda) da sequência de estrutura principal de cadeia leve K humana. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma porção da (ou toda) sequência de consenso de estrutura principal do subgrupo I K humana.
Em um aspecto, um anticorpo da invenção compreende um 20 domínio variável de cadeia pesada e/ou leve compreendendo sequência de estrutura principal mostrada na SEQ ID NO: 9 (figuras 7A-B) e/ou 13 (figuras 8A-B).
Em um aspecto, um anticorpo da invenção é um anticorpo anti- CD79b humanizado conjugado a um agente citotóxico. Em um aspecto, o 25 anticorpo anti-CD79b humanizado conjugado a um agente citotóxico inibe progressão de tumor em xenoenxertos.
Em um aspecto, ambos o anticorpo humanizado e o anticorpo quimérico são monovalentes. Em uma modalidade, ambos o anticorpo humanizado e o anticorpo quimérico compreendem uma região Fab única ligada a uma região Fc. Em uma modalidade, o anticorpo quimérico de referência compreende sequências de domínio variável mostradas nas figuras 7A-B (SEQ !D NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14) ligadas a uma região Fc 5 humana. Em uma modalidade, a região Fc humana é uma IgG (por exemplo, IgG 1,2, 3 ou 4).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as sequências HVR1- HC, HVR2-HO e/ou HVR3-HC mostradas na figura 15 (SEQ ID NOs: 164-166). 10 Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequências FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC mostradas na figura 15 (SEQ ID NOs: 160163). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência de CHI e/ou Fc mostrada na figura 15 (SEQ ID NO: 167 e/ou 168). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada 15 compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 15, SEQ ID NOs: 164-166) e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (figura 15, SEQ ID NOs: 160-163). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 20 15, SEQ ID NOs: 164-166) e a sequência de CH' e/ou Fc mostrada na figura 15 (SEQ ID NO: 167 e/ou 168). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 15, SEQ ID NOs; 164-166) e a sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (figura 15, 25 SEQ ID NOs: 160-163) e da CH1 e/ou Fc (figura 15, SEQ ID NO: 167 e/ou 168).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC mostrada na figura 15 (SEQ ID NOs: 156-158). Em uma modalidade, o domínio variável compreende a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC mostrada na figura 15 (SEQ ID NOs: 152-155). Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência CL1 mostrada na figura 15 (SEQ ID NO: 159). Em uma modalidade, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158) e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NOs: 152-155) mostrada na figura 15. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 156-158) e a sequência de CL1 (SEQ ID NO: 159) mostradas na figura 15. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 156-158) e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NOs: 152-155) mostradas na figura 15 e a sequência de CL1 mostrada na figura 15 (SEQ ID NO: 159).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1- HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC mostrada na figura 16 (SEQ ID NOs: 183-185). Em uma modalidade, o domínio variável compreende a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC mostrada na figura 16 (SEQ ID NOs: 179-182). Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência de CH1 e/ou Fc mostrada na figura 16 (SEQ ID NO: 186 e/ou 187). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 16, SEQ ID NOs: 183-185) e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (figura 16, SEQ ID NOs: 179-182). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 16, SEQ ID NOs: 183-185) e a sequência de CH1 e/ou Fc mostrada na figura 16 (SEQ ID NOs: 186 e/ou 187). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 16, SEQ ID NOs; 183-185) e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (figura 16, SEQ ID NOs: 179-182) e a de CH1 e/ou Fc (figura 16, SEQ ID NOs: 186 e/ou 187).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo o domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC mostrada na figura 16 (SEQ ID NOs: 175-177). Em uma modalidade, o domínio variável compreende a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC mostrada na figura 16 (SEQ ID NOs: 171-174). Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência de CL1 mostrada na figura 16 (SEQ ID NO: 178). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 175-177) e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NOs: 171-174) mostrada na figura 16. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 175-177) e a sequência de CL1 (SEQ ID NO: 178) mostradas na figura 16. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 175-177) e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NOs: 171-174) mostradas na figura 16 e a sequência de CL1 mostrada na figura 16 (SEQ ID NO: 178).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1- HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC mostrada na figura 17 (SEQ ID NOs: 100-204). Em uma modalidade, o domínio variável compreende a sequência de FR1-HC, 5 FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC mostrada na figura 17 (SEQ ID NOs: 198-201).
Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência de CH1 e/ou Fc mostrada na figura 17 (SEQ ID NOs: 205 e/ou 206). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 10 17, SEQ ID NOs: 202-204) e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (figura 17, SEQ ID NOs: 198-201). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 17, SEQ ID NOs: 202-204) e a sequência de CH1 e/ou Fc mostrada na figura 15 17 (SEQ ID NOs: 205 e/ou 206). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 17, SEQ ID NOs: 202-204) e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (figura 17, SEQ ID NOs: 198-201) e a de CH1 e/ou Fc (figura 17, SEQ ID NOs: 205 e/ou 20 206).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo o domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC mostrada na figura 17 (SEQ ID NOs: 194-196). Em uma modalidade, o domínio variável compreende a sequência de FR1-LC, 25 FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC mostrada na figura 17 (SEQ ID NOs: 190-193).
Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência de CL1 mostrada na figura 17 (SEQ ID NO: 197). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 194-196) e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NOs: 190-193) mostradas na figura 17. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, 5 HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 194-196) e a sequência de CL1 (SEQ ID NO: 197) mostradas na figura 17. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 194-196) e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NOs: 190-193) 10 mostradas na figura 17 e a sequência de CL1 mostrada na figura 17 (SEQ ID NO: 197).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1- HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC mostrada na figura 18 (SEQ ID NOs: 221-223).
Em uma modalidade, o domínio variável compreende a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC mostrada na figura 18 (SEQ ID NOs: 217-220).
Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência de CH1 e/ou Fc mostrada na figura 18 (SEQ ID NOs: 224 e/ou 225). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada 20 compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 18, SEQ ID NOs: 221-223) e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (figura 18, SEQ ID NOs: 217-220). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 25 18, SEQ ID NOs: 221-223) e a sequência de CH1 e/ou Fc mostradas na figura 18 (SEQ ID NOs: 224 e/ou 225). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (figura 18, SEQ ID NOs: 221-223) e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (figura 18, SEQ ID NOs: 217-220) e a de CH1 e/ou Fc (figura 18, SEQ ID NOs: 224 e/ou 225).
Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo o domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC mostrada na figura 18 (SEQ ID NOs: 213-215). Em uma modalidade, o domínio variável compreende a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC mostrada na figura 18 (SEQ ID NOs: 209-212). Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência de CL1 mostrada na figura 18 (SEQ ID NO: 216). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 213-215) e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NOs: 209-212) mostradas na figura 18. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 213-215) e a sequência de CL1 (SEQ ID NO: 216) mostradas na figura 18. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NOs: 213-215) e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NOs: 209-212) mostradas na figura 18 e a sequência de CL1 mostrada na figura 18 (SEQ ID NO: 216).
Em um aspecto, os anticorpos da invenção incluem anticorpos engenheirados com cisteína onde um ou mais aminoácidos de um anticorpo parental são substituídos com aminoácido de cisteína livre conforme descrito no W02006/034488; US 2007/0092940 (aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). Qualquer forma de anticorpo anti-CD79b pode então ser engenheirada, isto é, mutada. Por exemplo, um fragmento de anticorpo Fab parental pode ser engenheirado para formar um Fab engenheirado com cisteína, referido aqui como "TioFab". Similarmente, um anticorpo monoclonal parental pode ser engenheirado para formar um "TioMab". Deve ser notado que uma mutação de sítio única dá um resíduo de cisteína engenheirado único 5 em um TioFab, enquanto uma mutação de sítio única dá dois resíduos Cisteína engenheirados em um TioMab, devido à natureza dimérica do anticorpo de IgG. Os anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína da invenção incluem anticorpos monoclonais, anticorpos monoclonais humanizados ou quiméricos e os fragmentos de anticorpos de ligação a antígeno, polípeptídeos 10 de fusão e análogos que preferivelmente se ligam a polípeptídeos de CD79b associados à célula. Um anticorpo engenheirado com cisteína pode compreender alternativamente um anticorpo compreendendo uma cisteína em uma posição revelada aqui no anticorpo ou Fab, resultante do projeto da sequência e/ou seleção do anticorpo, sem necessariamente alterar um 15 anticorpo parental, tal como através de projeto e seleção de anticorpo de exibição de fago ou através de projeto de novo de sequências de estrutura principal de cadeias pesada e/ou leve e regiões constantes. Um anticorpo engenheirado com cisteína compreende um ou mais aminoácidos de cisteína livres tendo um valor de reatividade tiol nas faixas de 0,6 a 1,0; 0,7 a 1,0 ou 0,8 20 a 1,0. Um aminoácido de cisteína livre é um resíduo de cisteína que foi engenheirado no anticorpo parental e não é parte de uma ponte dissulfeto. Anticorpos engenheirados com cisteína são úteis para ligação de compostos citotóxicos e/ou de imagem no sítio da cisteína engenheirada através de, por exemplo, uma maleimida ou haloacetila. A reatividade nucleofílica da 25 funcionalidade tiol de um resíduo Cys para um grupo maleimida é cerca de 100 vezes maior comparado com qualquer outra funcionalidade de aminoácido em uma proteína, tal como grupo amino de resíduos lisina ou o grupo amino N- terminal. Funcionalidade específica tiol em reagentes iodoacetila e maleimida pode reagir com grupos amina, mas pH maior (>9,0) e tempos de reação mais longos são necessários (Garman, 1997, Non-Radioactive Labbeling: A Practical Approach, Academic Press, Londres).
Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína da invenção compreende uma cisteína engenheirada em qualquer uma das posições que seguem, onde a posição é numerada de acordo com Kabat e outros na cadeia leve (vide Kabat e outros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e de acordo com a numeração EU na cadeia pesada (incluindo a região Fc) (vide Kabat e outros (1991) supra), onde a região constante de cadeia leve mostrada pelo sublinhado nas figuras 24A, 25A, 26A, 27A, 28, 48A e 49A começa na posição 109 (numeração Kabat) e a região constante de cadeia pesada mostrada pelo sublinhado nas figuras 24B, 25B, 26B, 27B, 28B, 48B e 49B começa na posição 118 (numeração EU). A posição pode ser também referida pela sua posição em numeração sequencial dos aminoácidos da cadeia leve ou cadeia pesada de comprimento integral mostrados nas figuras 24-28, 48 e 49. De acordo com uma modalidade da invenção, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteína engenheirada em LC-V205C (número Kabat Vai 205; número sequencial 209 nas figuras 27A e 49a para ser Cys nesta posição). A cisteína engenheirada na cadeia leve é mostrada em texto sublinhado em negrito, sublinhado duplo nas figuras 27A e 49A. De acordo com uma modalidade, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteína engenheirada em HC-A118C (número EU: ala 118; número Kabat 114; número sequencial 118 na figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B engenheirada para ser Cys nesta posição). A cisteína engenheirada na cadeia pesada é mostrada em texto em negrito, de sublinhado duplo, na figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B. De acordo com uma modalidade, um anticorpo anti- CD79b compreende uma cisteína engenheirada em Fc-S400C (número EU: Ser 400; número Kabat 396; número sequencial 400 na figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B engenheirada para ser Cys nesta posição). Em outras modalidades, a cisteína engenheirada da cadeia pesada (incluindo a região Fc) está em qualquer uma das posições que seguem (de acordo com a numeração 5 Kabat com número EU em parênteses); 5, 23, 84, 112, 114 (numeração EU 118), 116 (numeração EU 120), 278 (numeração EU 278), 371 (numeração EU 375) ou 396 (numeração EU 400). Desta maneira, mudanças no aminoácido nessas posições para um anticorpo anti-CD76b humanizado parental da invenção são: V5C, A23C, A84C, S112C, A114C (numeração EU A118C), 10 T116C (numeração EU T120C), V278C (numeração EU V282C), S371 (numeração EU S375C) ou S396C (numeração EU S400C), Desta maneira, mudanças no aminoácido nessas posições para um anticorpo anti-CD79b quimérico parental da invenção são: Q5C, K23C, S84C, S112C, A114C (numeração EU A118C), T116C (numeração EU T120C), V278C (numeração 15 EU V282C), S371C (numeração EU S375C) ou S396C (numeração EU S400C). Desta maneira, mudanças no aminoácido nessas posições para um anticorpo anti-CD79b parental da invenção são: Q5C, T23C, S84C, S112C, A114C (numeração EU A118C), T116C (numeração EU T120C), V278C (numeração EU V282C), S371C (numeração EU S375C) ou S396C 20 (numeração EU S400C). Em outras modalidades, a cisteína engenheirada da cadeia leve está em qualquer uma das posições que seguem (de acordo com a numeração Kabat): 15, 110, 114, 121, 127, 168, 205. Desta maneira, mudanças no aminoácido nessas posições para um anticorpo anti-CD79b humanizado parental da invenção são: V15C, V110C, S114C, S121C, S168C 25 ou V205C. Desta maneira, mudanças no aminoácido nessas posições para um anticorpo anti-CD79b quimérico parental da invenção são: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C ou V205C. Então, mudanças no aminoácido nessas posições para um anticorpo anti-cino-CD79b parental da invenção são: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C ou V205C.
Em um aspecto, a invenção inclui um anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína compreendendo um ou mais aminoácidos de cisteína livres onde o anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína se liga a um polipeptídeo de CD79b e é preparado através de um processo compreendendo substituição de um ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo anti-CD79b parental por cisteína onde o anticorpo parental compreende pelo menos uma sequência de HVR selecionada de: HVR-L1 compreendendo a sequência: A1-A15, onde A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) ou KASQSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 137) HVR-L2 compreendendo a sequência B1-B7, onde B-1B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) HVL-L3 compreende a sequência C1-C9, onde C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) HVR-H1 compreendendo a sequência D1-D10, onde D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E8, onde E1-E8 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e HVR-H3 compreendendo a sequência F1-F10, onde F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136) ou TRRVPIRLDY (SEQ ID NO: 138).
Em um certo aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo anti- CD79b engenheirado com cisteína compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácido, para um anticorpo engenheirado com cisteína tendo uma sequência de aminoácido de comprimento integral conforme aqui descrito ou uma sequência de aminoácido de anticorpo engenheirado com cisteína sem o peptídeo de sinal conforme aqui descrito.
Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo 5 anti-CD79b engenheirado com cisteína isolado compreendendo uma sequência de aminoácido que é codificada por uma sequência de nucleotídeo que hibridiza para o complemento de uma molécula de DNA codificando (a) um anticorpo engenheirado com cisteína tendo uma sequência de aminoácido de comprimento integral conforme aqui descrito, (b) uma sequência de aminoácido 10 de anticorpo engenheirado com cisteína sem o peptídeo de sinal conforme aqui descrito, (c) um domínio extracelular de uma proteína de anticorpo engenheirado com cisteína de transmembrana, com ou sem o peptídeo de sinal, conforme aqui descrito, (d) uma sequência de aminoácido codificada por qualquer uma das sequências de ácido nucleico reveladas aqui ou (c) qualquer 15 outro fragmento especificamente definido de uma sequência de aminoácido de anticorpo engenheirado com cisteína de comprimento integral conforme aqui descrito.
Em um aspecto específico, a invenção provê um anticorpo anti- CD79b engenheirado com cisteína isolado sem a sequência de sinal N-terminal 20 e/ou sem a metionina de iniciação e é codificado por uma sequência de nucleotídeo que codifica tal sequência de aminoácido conforme aqui descrito. Processo para produção do mesmo são também descritos aqui, onde o processo compreende cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico de codificação apropriada 25 sob condições adequadas para expressão do anticorpo engenheirado com cisteína e recuperação do anticorpo engenheirado com cisteína a partir da cultura de célula.
Outro aspecto da invenção provê um anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína isolado que é ou deletado do domínio de transmembrana ou inativado no domínio de transmembrana. Processos para produção do mesmo são também aqui descritos, onde esses processos compreendem cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico de codificação apropriada sob condições adequadas para expressão do anticorpo engenheirado com cisteína e recuperação do anticorpo engenheirado com cisteína a partir da cultura de célula.
Em outros aspectos, a invenção provê anticorpos engenheirados com cisteína quiméricos anti-CD79b isolados compreendendo qualquer anticorpo engenheirado com cisteína descrito aqui fundido a um polipeptídeo heterólogo (não-CD79b). Exemplos de tais moléculas quiméricas compreendem qualquer um dos anticorpos engenheirados com cisteína descritos aqui fundidos a um polipeptídeo heterólogo tal como, por exemplo, uma sequência tag de epitopo ou uma região Fc de uma imunoglobulina.
O anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epitopo antigênico. Os anticorpos da presente invenção podem ser opcionalmente conjugados a um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina, um maítansinoide, um derivado de dolostatina ou um calicheamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similar. Os anticorpos da presente invenção podem ser opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e preferivelmente inibem o crescimento ou proliferação de ou induzem a morte de uma célula à qual eles se ligam. Para propósitos de diagramanóstico, os anticorpos da presente invenção podem ser detectavelmente marcados, ligados a um apoio sólido ou similar.
Em outros aspectos da presente invenção, a invenção provê vetores compreendendo DNA codificando qualquer um dos anticorpos anti- CD79b aqui descritos e anticorpos engenheirados com cisteína anti-CD79b.
Células hospedeira compreendendo qualquer tal vetor são também providas. A título de exemplo, as células hospedeira podem ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura. Um processo para produção de qualquer um dos polípeptídeos descritos aqui é provido ainda e compreende cultura das célula hospedeira sob condições adequadas para expressão do polipeptídeo 10 desejado e recuperação do polipeptídeo desejado a partir da cultura de célula.
Anticorpos engenheirados com cisteína podem ser úteis no tratamento de câncer e incluem anticorpos específicos para superfície celular e receptores de transmembrana e antígenos associados a tumor (TAA) (Tumor- Associated Antigens). Tais anticorpos podem ser usados como anticorpos nus 15 (não-conjugados a uma porção de fármaco ou marcador) ou como conjugados de anticorpo-fármaco (ADC). Os anticorpos engenheirados com cisteína da invenção podem ser acoplados especificamente e eficientemente a sítio com um reagente tiol-reativo. O reagente tiol-reativo pode ser um reagente ligante multifuncional, um reagente marcador de captura, um reagente de fluoróforo ou 20 um intermediário tipo fármaco. O anticorpo engenheirado com cisteína pode ser marcado com um marcador detectável, imobilizado em um suporte de fase sólida e/ou conjugado com uma porção de fármaco. Reatividade tiol pode ser generalizada para qualquer anticorpo onde substituição de aminoácidos com aminoácidos de cisteína reativos pode ser feita dentro das faixas na cadeia 25 leve selecionadas das faixas de aminoácido: L10-L20, L105-L115, L109-L119, L116-L126, L122-L132, L163-L173, L200-L120; e dentro das faixas na cadeia pesada selecionadas das faixas de aminoácido: H1-H10, H18-H28, H79-H89, H107-H117, H109-H119, H11-H121 e na região Fc dentro das faixas selecionadas de H270-H280, H366-H376, H391-401, onde a numeração de posições de aminoácido começa na posição 1 do sistema de numeração Kabat (Kabat e outros (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e continua sequencíalmente em seguida conforme descrito no W02006/034488; US 2007/0092940. Reatividade tiol pode ser também generalizada para certos domínios de um anticorpo, tais como o domínio constante de cadeia leve (CL) e os domínios constantes de cadeia pesada CH1, CH2 e CH3. Substituições de cisteína resultando em valores de reatividade tiol de 0,6 e maiores podem ser feitas nos domínios constantes de cadeia pesada α, δ, ε, y e μ de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo as subclasses de IgG: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Tais anticorpos e seus usos são descritos no W02006/034488; US 2007/0092940.
Os anticorpos engenheirados com cisteína da invenção preferivelmente retêm a capacidade de ligação de antígeno de seus pares de anticorpo parentais, do tipo selvagem. Então, anticorpos engenheirados com cisteína são capazes de ligação, preferivelmente especificamente, a antígenos. Tais antígenos incluem, por exemplo, antígenos associados a tumor (TAA), proteínas receptoras da superfície e outras moléculas de superfície celular, proteínas de transmembrana, proteínas de sinalização, fatores de regulagem de sobrevivência celular, fatores de regulagem de proliferação celular, moléculas associadas a (por exemplo, conhecidas ou suspeitas de contribuir funcionalmente para) desenvolvimento ou diferenciação de tecido, linfocinas, citocinas, moléculas envolvidas em regulagem do ciclo celular, moléculas envolvidas em vasculogênese e moléculas associadas à (por exemplo, conhecidas ou suspeitas de contribuir funcionalmente para) angiogênese. O antígeno associado a tumor pode ser um fator de diferenciação de agrupamento (isto é, uma proteína CD, incluindo, mas não limitado a, CD79b).
Anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína da invenção retêm a habilidade de ligação a antígeno de seus pares de anticorpo anti-CD79b parentais. Desta maneira, anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína da invenção são capazes de ligação, preferivelmente especificamente, a antígenos de CD79b incluindo isoformas anti-CD79b beta e/ou alfa, incluindo quando tais antígenos são expressos sobre a superfície de células, incluindo, sem limitação, células B.
Em um aspecto, os anticorpos da invenção podem ser conjugados com qualquer porção marcadora que possa ser covalentemente ligada ao anticorpo através de uma porção reativa, uma porção ativada ou um grupo cisteína tiol reativo (Singh e outros (2002) Anal. Biochem., 304:147-15; Harlow, E. e Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad, R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2a Ed., CRC Press, Boca Raton, FL). O marcador ligado pode funcionar para: (i) prover um sinal detectável; (ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detectável provido pelo primeiro ou segundo marcador, por exemplo, para dar FRET (transferência de energia de ressonância por fluorescência) {Fluorescence Resonance Energy Transfer) ; (iii) estabilizar interações ou aumentar a afinidade de ligação com um antígeno ou ligante; (iv) afetar mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética ou permeabilidade celular, através da carga, hidrofobicidade, formato ou outros parâmetros físicos; ou (v) prover uma porção de captura, para modular afinidade do ligante, ligação de anticorpo/antígeno ou complexação iônica.
Anticorpos engenheirados com cisteína marcados podem ser úteis em ensaios de diagramanóstico, por exemplo, para detecção da expressão de um antígeno de interesse em células, tecidos ou soro específicos. Para aplicações de diagramanóstico, o anticorpo será tipicamente marcado com uma porção detectável. Vários marcadores estão disponíveis, os quais podem ser geralmente agrupados nas categorias que seguem:
Radioisótopos (radionuclídeos), tal como 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, "TC, 111ln, 123l, 124l, 125l, 131l, 133Xe, 177l_u, 211At ou 213Bi.
Anticorpos marcados com radioisótopo são úteis em experimentos de imagem direcionados a receptor. O anticorpo pode ser marcado com reagentes ligantes que se ligam, quelatam ou de outra maneira complexam um metal de radioisótopo onde o reagente é ativo com a cisteína tiol engenheirada do anticorpo, usando a técnica descrita em Current Protocols in Immunology, 10 Volumes 1 e 2, Coligen e outros, Ed. Wiley-lnterscience, Nova York, NY, Pubs. (1991). Ligantes de quelação que podem complexar um ion de metal incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA e TETA (Macrocyclics, Dallas, TX). Radionuclídeos podem ser direcionados através de complexação com os conjugados anticorpo-fármaco da invenção (Wu e outros (2005) Nature 15 Biotechnology 23(9): 1137-1146). Reagentes ligantes tal como DOTA-maleimida (4- maleimidobutiramidobenzil-DOTA) podem ser preparados através da reação de aminobenzil-DOTA com ácido 4-maleimidobutírico (Fluka) ativado com isopropilcloroformato (Aldrich), seguindo o procedimento de Axworthy e outros 20 (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97(4):1802-1807). Reagentes DOTA- maleimida reagem com os aminoácidos de cisteína livres dos anticorpos engenheirados com cisteína e proveem um ligante de complexação com metal no anticorpo (Lewis e outros (1998) Bioconj. Chem., 9:72-86). Reagentes de marcação de ligante de quelação tal como DOTA-NHS (mono (n- 25 hidroxissucinimido éster) do ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10- tetraacético) estão comercialmente disponíveis (Macrocyclics, Dallas, TX). Imagem direcionada de receptor com anticorpos marcados com radionuclídeo pode prover um marcador de ativação de curso através da detecção e quantificação de acúmulo progressivo de anticorpos em tecido de tumor (Albert e outros (1998), Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:1207-1210). Os radio-metais conjugados podem permanecer intracelulares seguindo degradação lisossomal.
Complexos de metal-quelato adequados como marcadores de 5 anticorpo para experimentos de imagem são descritos: US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich e outros, (1983) J. Immunol. Methods, 65:147-157; Meares e outros, (1984) Anal. Biochem., 142:68-78; Mirzadeh e outros, (1990) Bioconjugate Chem., 1:59-65; Meares e 10 outros, (1990) J. Cancer, 1990, Supl. 10:21-26; Izard e outros, (1992) Bioconjugate Chem., 3:346-350; Nikula e outros, (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera e outros, (1993) Nucl. Med. Biol., 20:955-62; Kukis e outros, (1998) J. Nucl. Med., 39:2105-2110; Verei e outros, (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera e outros, (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg e 15 outros, (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verei e outros, (2003) J. Nucl. Med., 44:1663-1670; Lee e outros, (2001) Cancer Res., 61:4474-4482; Mitchell e outros, (2003) J. Nucl. Med., 44:1105-1112; Kobayashi e outros, (1999) Bioconjugate Chem., 10:103-111; Miederer e outros, (2004) J. Nucl. Med., 45:129-137; DeNardo e outros, (1998) Clinical Cancer Research, 4:2483-90; 20 Blend e outros, (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 18:355363; Nikula e outros, (1999) J. Nucl. Med., 40:166-76; Kobayashi e outros, (1998) J. Nucl. Med., 39:829-36; Mardirossian e outros, (1993) Nucl. Med. Biol., 20:65-74; Roselli e outros, (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20. 25 Marcadores fluorescentes tais como quelatos de terrosos raros (quelatos de európio), tipos de fluoresceína incluindo FITC, 5- carboxifluoresceína, 6-carboxi fluoresceína; tipos rhodamina incluindo TAMRA; dansil; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; Texas Red; e seus análogos. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados a anticorpos usando a técnica revelada em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. Corantes fluorescentes e reagentes marcadores fluorescentes incluem aqueles que estão comercialmente disponíveis da Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OU) e Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).
Vários marcadores de enzima-substrato estão disponíveis ou são descritos (US 4275149). A enzima geralmente catalisa uma alteração química de um substrato cromogênico que pode ser medida usando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato, que pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas para quantificação de uma mudança em fluorescência são descritas acima. O substrato quimioluminescente se torna eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (usando um quimioluminômetro, por exemplo) ou doar energia para um aceitador fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferase (por exemplo, luciferase do vaga-lume e luciferase bacteriana; US 4737456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, malato desidrogenase, uréase, peroxidase tal como peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina (AP), β-galactosidase, glicoamilase, lisozina, sacarídeo oxidase (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similar. Técnicas para conjugação de enzimas a anticorpos são descritas em O' Sullivan e outros (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", em Methods in Enzym. (Ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nova York, 73:147-166.
Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo: peroxidase de rábano silvestre (HRP) com peroxidase de hidrogênio como um substrato, onde a peroxidase de hidrogênio oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) e cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)); fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenila como substrato cromogênico; e β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidase) ou substrato fluorogênico 4- metilumbeliferil-β-D-galactosidase.
Várias outras combinações de enzima-substrato estão disponíveis para aqueles versados na técnica. Para uma revisão geral, vide US 4275149 e US 4318980.
Um marcador pode ser indiretamente conjugado com uma cadeia lateral de aminoácido, uma cadeia lateral de aminoácido ativada, um anticorpo engenheirado com cisteína e similar. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das três categorias amplas de marcadores mencionadas acima pode ser conjugada com avidina ou estreptavidina ou vice versa. A biotina se liga seletivamente à estreptavidina e, então, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo desta maneira indireta. Alternativamente, para obter conjugação indireta do marcador com a variante de polipeptídeo, a variante de polipeptídeo é conjugada com um hapteno pequeno (por exemplo, digoxina) e um dos tipos diferentes de marcadores mencionados acima é conjugado com uma variante de polipeptídeo anti- hapteno (por exemplo, anticorpo antidigoxina). Desta maneira, conjugação indireta do marcador com a variante de polipeptídeo pode ser conseguida (Hermanson, G. (1996) em Bioconjugate Techniques Academic Press, São Diego).
O anticorpo da presente invenção pode ser empregado em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ELISA, ensaios de ligação competitivos, ensaios sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação (Zola (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of 5 Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.).
Um marcador de detecção pode ser útil para localização, visualização e quantificação de um evento de ligação ou reconhecimento. Os anticorpos marcados da invenção podem detectar receptores de superfície celular. Outro uso para anticorpos detectavelmente marcados é um método de 10 imunocaptura baseado em conta compreendendo conjugação de uma conta com um anticorpo marcado fluorescente e detecção de um sinal de fluorescência quando da ligação de um ligante. Metodologias de detecção de ligação similares utilizam o efeito de ressonância de plasmon de superfície (SPR) (Surface Plasmon Resonance) para medir e detectar interações 15 anticorpo-antígeno.
Marcadores de detecção tais como corantes fluorescentes e corantes quimioluminescentes (Briggs e outros (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids". J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058) proveem um sinal detectável 20 e são geralmente aplicáveis para marcação de anticorpos, preferivelmente com as propriedades que seguem: (i) o anticorpo marcado deve produzir um sinal muito alto com background baixo de maneira que quantidades pequenas de anticorpos podem ser sensivelmente detectadas em ambos os ensaios livre de célula e baseado em célula; e (ii) o anticorpo marcado deve ser fotoestável de 25 maneira que o sinal de fluorescência possa ser observado, monitorado e registrado sem fotoalvejamento significante. Para aplicações envolvendo ligação de superfície celular de anticorpo marcado a membranas ou superfícies celulares, especialmente células vivas, os marcadores preferivelmente (iii) têm boa solubilidade em água para atingir concentrações de conjugado e sensibilidade de detecção eficazes e (iv) são não tóxicos para células vivas de maneira a não romper os processos metabólicos normais das células ou causar morte prematura das células.
Quantificação direta de intensidade de fluorescência celular e enumeração de eventos fluorescentemente marcados, por exemplo, ligação à superfície celular de conjugados peptídeo-ligante, podem ser conduzidas em um sistema (FMAT® 8100 HST System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.) que automatiza ensaios mistura-e-leitura, não-radioativos, com células vivas e 10 contas (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening, 4:193-204). Usos de anticorpos marcados também incluem ensaios de ligação de receptor de superfície celular, ensaios de imunocaptura, ensaios imunoabsorventes ligados à fluorescência (FLISA), 15 clivagem de caspase (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:618-23; US 6372907), apoptose (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. 20 Immunol. Methods 184:39-51) e ensaios citotóxicos. Tecnologia de ensaio de microvolume fluormétrico pode ser usada para identificar a supra ou sub- regulagem por uma molécula que é direcionada à superfície celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high- throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) 25 Anal. Biochem., 271:143-51).
Os anticorpos marcados da invenção são úteis como biomarcadores de imagem e sondas através dos vários métodos e técnicas de imagem biomédica e molecular tais como: (i) MRI (imagem por ressonância magnética); (ii) MicroCT (tomografia computadorizada); (iii) SPECT (tomografia computadorizada de emissão de fóton simples); (iv) PET (tomografia de emissão de positron) Chen e outros (2004) Bioconjugate Chemr, 15:41-49; (v) bioluminescência; (vi) fluorescência; e (vii) ultrassom. Imunocintigrafia é um procedimento de imagem onde anticorpos marcados com substâncias reativas são administrados a um paciente animal ou humano e é tirada uma foto de sítios no corpo onde o anticorpo se localiza (US 6528624). Biomarcadores de imagem podem ser objetivamente medidos e avaliados como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. Biomarcadores pode ser de vários tipos: o Tipo 0 são marcadores de história natural de uma doença e se relacionam longitudinalmente com índices clínicos conhecidos, por exemplo, avaliação MRI de inflamação sinovial em artrite reumatoide; os marcadores Tipo I capturam o efeito de uma intervenção de acordo com um mecanismo de ação, mesmo que o mecanismo possa não estar associado com resultado clínico; os marcadores Tipo II funcionam como pontos finais substitutos onde a mudança no, ou sinal do, biomarcador prevê um benefício clínico para "validar" a resposta direcionada, tal como erosão óssea medida em artrite reumatoide através de CT. Biomarcadores de imagem então podem prover informação terapêutica farmacodinâmica (PD) sobre: (i) expressão de uma proteína-alvo; (ii) ligação de um agente terapêutico à proteína-alvo, isto é, seletividade, e (iii) dados farmacocinéticos de eliminação e meia-vida. Vantagens dos biomarcadores de imagem in vivo com relação a biomarcadores baseados em lab incluem: tratamento não-invasivo, avaliação de sangue integral, quantificável, dosagem e avaliação repetitivas, isto é, pontos de tempo múltiplos, e efeitos potencialmente transferíveis de resultados pré-clínicos (animal pequeno) para clínicos (humanos). Para algumas aplicações, bioimagem suplanta ou minimiza o número de experimentos animais em estudos pré-clínicos.
Métodos de marcação de peptídeo são bem conhecidos. Vide Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem., 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem., V2\ Glazer e outros, (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., Nova York; Lundblad, R. L. e Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I e II, CRC Press, Nova York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin e Nova York; e Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rod rig uez e outros, (2004) Chem.Eur., J. 10:11491155; Lewis e outros (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li e outros, (2002) Bioconjugate Chem., 13:110-115; Mier e outros (2005) Bioconjugate Chem., 16:240-237.
Peptídeos e proteínas marcados com duas porções, um repórter fluorescente e extintor, em proximidade suficiente sofrem transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET). Grupos repórter são tipicamente corantes fluorescentes que são excitados por luz em um certo comprimento de onda e transferem energia para um grupo aceitador, ou extintor, com a mudança Stokes apropriada para emissão em brilho máximo. Corantes fluorescentes incluem moléculas com aromaticidade estendida, tais como fluoresceína e rhodamina, e seus derivados. O repórter fluorescente pode ser parcialmente ou significantemente extinto pela porção de extinção em um peptídeo intacto. Quando da clivagem do peptídeo por uma peptidase ou protease, um aumento detectável em fluorescência pode ser medido (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34).
Os anticorpos marcados da invenção podem ser também usados como um agente de purificação de afinidade. Neste processo, o anticorpo 5 marcado é imobilizado em uma fase sólida, tal como resina Sephadex ou papel filtro, usando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é contatado com uma amostra contendo o antígeno a ser purificado, e em seguida o suporte é lavado com um solvente adequado que vai remover substancialmente todo o material na amostra exceto o antígeno a ser 10 purificado, que é ligado à variante de polipeptídeo imobilizada. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que vai liberar o antígeno da variante de polipeptídeo.
Reagentes de marcação tipicamente carregam funcionalidade reativa que pode reagir (i) diretamente com uma cisteína tiol de um anticorpo 15 engenheirado com cisteína para formar o anticorpo marcado, (ii) com um reagente ligante para formar um intermediário ligante-marcador ou (ii) com um anticorpo ligante para formar o anticorpo marcado. Funcionalidade reativa de reagentes de marcação incluem: maleimida, haloacetila, iodoacetamida succinimidil éster (por exemplo, NHS, N-hidroxissuccinimida), isotiocianato, 20 cloreto de sulfonila, 2,6-diclorotriazinila, pentafluorfenil éster e fosforamidita, embora outros grupos funcionais possam ser também usados.
Um grupo funcional reativo exemplar é N-hidroxisuccinimidil éster (NHS) de um substituinte do grupo carboxila de um marcador detectável, por exemplo, biotina ou um corante fluorescente. O NHS éster do marcador pode 25 ser pré-formado, isolado, purificado e/ou caracterizado, ou ele pode ser formado in situ e reagido com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Tipicamente, a forma carboxila do marcador é ativada através de reação com alguma combinação de um reagente carbodiimida, por exemplo, diciclo- hexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida ou um reagente urônio, por exemplo, TSTU (tetrafluorborato de O-(N-Succinimidil)-N,N,N'-N'-tetrametilurônio), HBTU (hexafluorfosfato de O-benzotnazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio) ou HATU (hexafluorfosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio), um ativador, tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) e N-hidroxissuccinimida para dar o NHS éster do marcador. Em alguns casos, o marcador e o anticorpo podem ser acoplados através de ativação in situ do marcador e reação com o anticorpo para formar o conjugado marcador-anticorpo em uma etapa. Outros reagentes de ativação e acoplamento incluem TBTU (hexafluorfosfato de 2- (1H-benzotriazol-1-il)-1-1,3,3-tetrametilurônio), TFFH (N,N',N",N"- tetrametilurônio 2-flúor-hexafluorfosfato), PyBOP (hexafluorfosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfônio), EEDQ (2-etóxi-1-etoxicarbonil-1,2- di-hidro-quinolina), DCC (diciclo-hexilcarbodiimida); DIPCDI (diisopropilcarbodiimida), MSTN (1 -(mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1 H-1,2,4- triazol e haletos de aril sulfonila, por exemplo, cloreto de triisopropilbenzenossulfonila.
COMPOSTOS DE PEPTÍDEO DE LIGAÇÀO À ALBUMINA-FAB DA INVENÇÃO
Em um aspecto, o anticorpo da invenção é fundido a uma proteína de ligação à albumina. Ligação à proteína do plasma pode ser um meio eficaz de aperfeiçoamento das propriedades farmacocinéticas de moléculas de vida curta. A albumina é a proteína mais abundante no plasma. Peptídeos de ligação à albumina do soro (ABP) podem alterar a farmacodinâmica de proteínas de domínio ativo fundidas, incluindo alteração de absorção, penetração e difusão no tecido. Esses parâmetros farmacocinéticos podem ser modulados através de seleção específica da sequência de peptídeo de ligação à albumina no soro apropriada (US 20040001827). Uma série de peptídeos de ligação à albumina foi identificada através de avaliação de exibição de fago (Dennis e outros, (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J. Biol. Chem., 277:35035-35043; WO 01/45746). Os compostos da invenção incluem sequências ABP ensinadas por: (i) Dennis e outros, (2002) J. Biol. Chem., 277:35035-35043 nas Tabelas III e IV, página 35038; (ii) US 20040001827 em [0076] SEQ ID NOS: 9-22; e (iii) WO 5 01/45746 nas páginas 12-13, todos aqui incorporados a título de referência. Fabs de Ligação à Albumina (ABP) são engenheirados através de fusão de um peptídeo de ligação à albumina ao terminal C da cadeia pesada de Fab em razão estequiométrica 1:1 (1 ABP/1 Fab). Foi mostrado que associação desses ABP-Fab com albumina aumentou a meia-vida do anticorpo em mais de 25 10 vezes em coelhos e camundongos. Os resíduos Cys reativos descritos acima podem então ser introduzidos nesses ABP-Fabs e usados para conjugação específica a sítio com fármacos citotóxicos seguido por estudos em animais in vivo. Sequências de peptídeo de ligação à albumina exemplares 15 incluem, mas não estão limitados âs, sequências de aminoácido listadas nas SEQ ID NOs: 246-250; CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 246 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF QRLIEDICLPRWGCLWEDDF 20 RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 249 DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 250 CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO
Em outro aspecto, a invenção provê imunoconjugados, ou conjugados de anticorpo-fármaco (ADC), compreendendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, um fármaco, um agente inibidor de crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal ou seus fragmentos) ou isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).
Em outro aspecto, a invenção provê ainda métodos de uso dos imunoconjugados. Em um aspecto, um imunoconjugado compreende qualquer um dos anticorpos anti-CD79b acima ligado covalentemente a um agente citotóxico ou um agente detectável.
Em um aspecto, um anticorpo de CD79b da invenção se liga ao mesmo epitopo em CD79b ligado por outro anticorpo de CD79b. Em outra modalidade, um anticorpo de CD79b da invenção se liga ao mesmo epitopo em CD79b ligado pelo fragmento Fab de um anticorpo monoclonal gerado de hibridomas depositados com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993, um anticorpo monoclonal compreendendo os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (figuras 8A-B) ou um anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável ou do anticorpo gerado a partir de hibridomas HB11413 depositados com o ATCC em 20 de julho de 1993 e domínios constantes de lgG1 ou os domínios variáveis de anticorpo monoclonal compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 10 (figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (figuras 8A-B). Em outra modalidade, um anticorpo de CD79b da invenção se liga ao mesmo epitopo em CD79b ligado a outro anticorpo de CD79b (isto é, CB3.1 (NQ. de Catálogo BD Biosciences 555678; São Jose, CA), AT105-1 (N-. de Catálogo AbD Serotec MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (N°. de Catálogo AbD Serotec MCA2209), anticorpo de CD79b anti-humano ((N°. de Catálogo BD Biosciences 557592; São Jose, CA),
Em outro aspecto, um anticorpo de CD79b da invenção se liga a um epitopo em CD79b distinto de um epitopo ligado por outro anticorpo de CD79b. Em outra modalidade, um anticorpo de CD79b da invenção se liga a um epitopo em CD79b distinto de um epitopo ligado pelo fragmento Fab de, anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas HB11413 depositados com ATCC em 20 de julho de 1993, anticorpo monoclonal compreendendo os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (figuras 8A-B), ou anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável de qualquer anticorpo gerado a partir de hibridomas HB11413 depositados com ATCC em 20 de julho de 1993 e domínios constantes de lgG1 ou os domínios variáveis de anticorpo monoclonal compreendendo as sequências de SEQ ID NO: 10 (figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (figuras 8A-B). Em outra modalidade, um anticorpo de CD79b da invenção se liga a um epitopo em CD79b distinto de um epitopo em CD79b ligado por outro anticorpo de CD79b (isto é, CB3.1 (N2. de Catálogo BD Bioscence 555678; São José, CA), AT105-1 (Ne. de Catálogo Serotec AbD MCA2208); Raleigh, NC), AT107-2 (N2. de Catálogo Serotec AbD MCA2209); anticorpo de CD79b anti-humano (N2. de Catálogo BD Biosciences 557592; São José, CA)).
Em outro aspecto, um anticorpo de CD79b da invenção é distinto de (isto é, não é) um fragmento Fab do, anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas depositados com ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993, do anticorpo monoclonal compreendendo os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (figuras 8A-B), ou anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável de anticorpo gerado de hibridomas depositados com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993 e domínios constantes de lgG1, ou domínios variáveis de anticorpo monoclonal compreendendo as sequências de SEQ ID NO: 10 (figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (figuras 8A-B). Em outra modalidade, um anticorpo de CD79b da invenção é distinto de (isto é, não é) um fragmento Fab ou outro anticorpo de CD79b (isto é, CB3.1 (N2. de Catálogo BD Bioscence 555678; São José, CA), AT105-1 (N2. de Catálogo Serotec AbD MCA2208); Raleigh, NC), AT107-2 (N2. de Catálogo Serotec AbD MCA2209); anticorpo de CD79b anti-humano (N2. de Catálogo BD Biosciences 557592; São José, CA)).
Em um aspecto, um anticorpo da invenção se liga especificamente a CD79b de uma primeira espécie animal e não se liga especificamente a CD79b de uma segunda espécie animal. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é humana e/ou primata (por exemplo, macaco cinomólogo) e a segunda espécie animal é murino (por exemplo, camundongo) e/ou canina. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é humana. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é primata, por exemplo, macaco cinomólogo. Em uma modalidade, a segunda espécie animal é murino, por exemplo, camundongo. Em uma modalidade, a segunda espécie animal é canina.
Em um aspecto, a invenção provê composições compreendendo um ou mais anticorpos da invenção e um carreador. Em uma modalidade, o carreador é farmaceuticamente aceitável.
Em um aspecto, a invenção provê ácidos nucleicos codificando um anticorpo de CD79b da invenção. Em um aspecto, a invenção provê vetores compreendendo um ácido nucleico da invenção.
Em um aspecto, a invenção provê célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou um vetor da invenção, llm vetor pode ser de qualquer tipo, por exemplo, um vetor recombinante tal como um vetor de expressão. Qualquer uma de uma variedade de célula hospedeira pode ser usada. Em uma modalidade, uma célula hospedeira é uma célula procariótica, por exemplo, E. coli. Em uma modalidade, uma célula hospedeira é uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de mamífero tal como célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) {Chinese Hamster Ovary).
Em um aspecto, a invenção provê métodos para produção de um anticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção provê um método de produção de um anticorpo de CD79b (que, conforme aqui definido, inclui comprimento completo e fragmentos do mesmo), o dito método compreendendo expressão em uma célula hospedeira adequada de um vetor recombinante da invenção codificando o dito anticorpo (ou fragmento do mesmo) e recuperação do dito anticorpo.
Em um aspecto, a invenção provê um artigo de fabricação compreendendo um recipiente; e uma composição contida no recipiente, onde 5 a composição compreende um ou mais anticorpos de CD79b da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende um ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade, uma composição compreendendo um anticorpo compreende ainda um carreador, que em algumas modalidades é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, um artigo de fabricação da 10 invenção compreende ainda instruções para administração da composição (por exemplo, o anticorpo) a um indivíduo.
Em um aspecto, a invenção provê um estojo compreendendo um primeiro recipiente compreendendo uma composição compreendendo um ou mais anticorpos de GD79b da invenção; e um segundo recipiente 15 compreendendo um tampão. Em uma modalidade, o tampão é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, uma composição compreendendo um anticorpo antagonista compreende ainda um recipiente, que em algumas modalidades é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, um estojo compreende ainda instruções para administração da 20 composição (por exemplo, do anticorpo) a um indivíduo,
Em um aspecto, a invenção provê uso de um anticorpo de CD79b da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, câncer, tumor e /ou distúrbio 25 proliferativo celular é selecionado de linfoma, linfoma Não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto.
Em um aspecto, a invenção provê o uso de um ácido nucleico da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um 5 distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio proliferativo celular é selecionado de linfoma, linfoma Não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda 10 (ALL) e linfoma da célula do manto.
Em um aspecto, a invenção provê o uso de um vetor de expressão da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou 15 distúrbio proliferativo celular é selecionado de linfoma, linfoma Não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto. 20 Em um aspecto, a invenção provê o uso de uma célula hospedeira da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio proliferativo celular é selecionado de linfoma, linfoma Não-Hodgkin 25 (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto.
Em um aspecto, a invenção provê o uso de um artigo de fabricação da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio proliferativo celular é selecionado de linfoma, linfoma Não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto.
Em um aspecto, a invenção provê o uso de um estojo da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio proliferativo celular é selecionado de linfoma, linfoma Não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, luecemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
Em um aspecto, a invenção provê um método de inibição do crescimento de uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo contato da dita célula com um anticorpo da invenção desta maneira causando uma inibição de crescimento da dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a invenção provê um método de tratamento terapeuticamente um mamífero tendo um tumor canceroso compreendendo uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo administrar ao dito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, desta maneira tratando eficazmente o dito animal. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a invenção provê um método para tratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular associado com expressão aumentada de CD79b, o dito método compreendendo administrar ao dito indivíduo com necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desta maneira tratando ou prevenindo eficazmente o dito distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, o dito distúrbio proliferativo é câncer. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a invenção provê um método para inibição do crescimento de uma célula, onde o crescimento da dita célula é pelo menos em parte dependente do efeito de potencialização de crescimento do CD79b, o dito método compreendendo contato da dita célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desta maneira inibindo o crescimento da dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a invenção provê um método de tratamento terapeuticamente um tumor em um mamífero, onde o crescimento do dito tumor é pelo menos em parte dependente do efeito de potencialização de crescimento do CD79b, o dito método compreendendo contato da dita célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desta maneira tratando eficazmente o dito tumor. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente de inibição de crescimento.
Em um aspecto, a invenção provê um método de tratamento de câncer compreendendo administrar a um paciente a formulação farmacêutica compreendendo um imunoconjugado descrito aqui, diluente, carreador ou excipiente aceitável. Em uma modalidade, o câncer é selecionado de linfoma, linfoma Não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto. Em uma modalidade, o paciente é administrado com um agente citotóxico em combinação com o composto conjugado anticorpo-fármaco.
Em um aspecto, a invenção provê um método de inibição de proliferação de célula B compreendendo exposição de uma célula a um imunoconjugado compreendendo um anticorpo da invenção sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b. Em uma modalidade, a proliferação de célula B é selecionada de linfoma, linfoma Não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto. Em uma modalidade, a célula B é um xenoenxerto. Em uma modalidade, a exposição acontece in vitro. Em uma modalidade, a exposição acontece in vivo.
Em um aspecto, a invenção provê um método de determinação da presença de CD79b em uma amostra suspeita de conter CD79b, o dito método compreendendo exposição da dita amostra a um anticorpo da invenção, e determinação da ligação do dito anticorpo a CD79b na dita amostra onde ligação do dito anticorpo a CD79b na dita amostra é indicativo da presença da dita proteína na dita amostra. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra biológica. Em uma modalidade adicional, a amostra biológica compreende células B, Em uma modalidade, a amostra biológica é de um mamífero que sofre ou suspeito de sofrer um distúrbio de célula B e/ou distúrbio proliferativo de célula B incluindo, mas não limitado a, linfoma, linfoma Não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma 5 linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto.
Em um aspecto, um método de diagramanóstico de um distúrbio proliferativo celular associado com um aumento em células, tais como células B, expressando CD79b é provido, o método compreendendo contato de uma 10 célula de teste em uma amostra biológica com qualquer um dos anticorpos acima; determinação do nível de anticorpo ligado às células de teste na amostra através da detecção da ligação do anticorpo a CD79b; e comparação do nível de anticorpo ligado a células em uma amostra controle, onde o nível de anticorpo ligado é normalizado para o número de células expressando 15 CD79b nas amostras de teste e controle, e onde um nível mais alto de anticorpo ligado na amostra de teste comparado com a amostra controle indica a presença de um distúrbio proliferativo celular associado com células expressando CD79b.
Em um aspecto, um método de detecção de CD79b solúvel em 20 sangue ou soro, o método compreendendo contato da amostra de teste de sangue ou soro de um mamífero suspeito de sofrer um distúrbio proliferativo de célula B com um anticorpo anti-CD79b da invenção e detecção de um aumento em CD79b solúvel na amostra de teste com relação a uma amostra controle de sangue ou soro de um mamífero normal. Em uma modalidade, o método de 25 detecção é útil como um método de diagramanóstico de um distúrbio proliferativo de célula B associado com um aumento em CD79b solúvel em sangue ou soro de um mamífero.
Em um aspecto, o método de ligação de um anticorpo da 'I invenção a uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo contato da dita célula com um anticorpo da invenção. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Os métodos da invenção podem ser usados para afetar qualquer estado patológico, por exemplo, células e/ou tecidos associados com expressão de CD79b. Em uma modalidade, uma célula que é direcionada em um método da invenção é uma célula hematopoiética. Por exemplo, uma célula hematopoiética pode ser uma selecionada do grupo consistindo em um linfócito, leucócito, plaqueta, eritrócito e célula assassina natural. Em uma modalidade, uma célula que é direcionada em um método da invenção é uma célula B ou célula T. Em uma modalidade, uma célula que é direcionada em um método da invenção é uma célula de câncer. Por exemplo, uma célula de câncer pode ser uma selecionada do grupo consistindo em uma célula de linfoma, célula de leucemia ou célula mieloma.
Os métodos da invenção podem compreender ainda etapas de tratamento adicionais. Por exemplo, em uma modalidade, um método compreende ainda uma etapa onde uma célula e/ou tecido alvo (por exemplo, uma célula de câncer) é exposto a um tratamento por radiação ou um agente quimioterapêutico.
Conforme descrito aqui, CD79b é um componente de sinalização do receptor de célula B. Desta maneira, em uma modalidade de métodos da invenção, uma célula que é direcionada (por exemplo, uma célula de câncer) é uma onde CD79b é expresso comparado com uma célula que não expressa CD79b. Em uma modalidade adicional, a célula-alvo é uma célula de câncer onde expressão de CD79b é aumentada comparado com uma célula não câncer normal do mesmo tipo de tecido. Em uma modalidade, um método da invenção causa a morte de uma célula-alvo,
Em outros aspectos da presente invenção, a invenção provê vetores compreendendo DNA codificando qualquer um dos anticorpos descritos aqui. Célula hospedeira compreendendo qualquer vetor do tipo é também provida. A título de exemplo, as célula hospedeira podem ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura. Um processo para produção de qualquer um dos anticorpos descritos aqui é provido adicionalmente e compreende cultura das célula hospedeira sob condições adequadas para expressão do anticorpo desejado e recuperação do anticorpo desejado a partir da cultura de célula.
Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma composição de matéria compreendendo um anticorpo anti-CD79b conforme aqui descrito em combinação com um carreador. Opcionalmente, o carreador é um carreador farmaceuticamente aceitável.
Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b conforme aqui descrito para a preparação de um medicamento útil no tratamento de uma condição que é responsiva ao anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b.
Outro aspecto da invenção é uma composição compreendendo uma mistura de compostos anticorpo-fármaco de Fórmula I onde a carga de fármaco média por anticorpo é cerca de 2 a cerca de 5 ou cerca de 3 a cerca de 4.
Outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica incluindo composto ADC de Fórmula I, uma mistura de compostos ADC de Fórmula l, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um diluente, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Outro aspecto provê uma combinação farmacêutica compreendendo um composto ADC da Fórmula I e um segundo composto tendo propriedades anticâncer ou outros efeitos terapêuticos.
Outro aspecto é um método para morte ou inibição da proliferação de células de tumor ou células de câncer compreendendo tratamento das células com uma quantidade de um conjugado anticorpo-fármaco de Fórmula I, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, sendo eficaz 5 para matar ou inibir a proliferação das células de tumor ou células de câncer.
Outro aspecto é um método de tratamento de câncer compreendendo administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica incluindo um ADC da Fórmula I.
Outro aspecto inclui artigos de fabricação, isto é, estojos, compreendendo um conjugado anticorpo-fármaco, um recipiente e uma bula ou rótulo indicando um tratamento.
Um aspecto da invenção é um método para fabricação de um composto conjugado anticorpo-fármaco de Fórmula I compreendendo as 15 etapas de: (a) reação de um grupo cisteína engenheirado do anticorpo engenheirado com cisteína com um reagente ligante para formar intermediário ligante-anticorpo Ab-L; e (b) reação de Ab-L com uma porção D ativada por fármaco; com o que o conjugado anticorpo-fármaco é formado; ou compreendendo as etapas de: (c) reação de um grupo nucleofílico de uma 20 porção de fármaco com um reagente ligante para formar intermediário fármaco- ligante D-L; e (d) reação de D-L com um grupo cisteína engenheirado do anticorpo engenheirado com cisteína; com o que o conjugado anticorpo- fármaco é formado.
Um aspecto da invenção é um ensaio para detecção de células de 25 câncer compreendendo: (a) exposição das células a um conjugado anticorpo- fármaco anti-Cd79b engenheirado com cisteína; e (b) determinação da extensão de ligação do composto conjugado anticorpo-fármaco anti-CD79b engenheirado com cisteína a células.
A. ANTICORPOS ANTI-CD79B
Em uma modalidade, a presente invenção provê anticorpos anti- CD79b que podem encontrar uso aqui como agentes terapêuticos. Anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados.
1. ANTICORPOS POLICLONAIS
Anticorpos policlonais são preferivelmente criados em animais através de injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante (especialmente quando peptídeos sintéticos são usados) a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada. Por exemplo, o antígeno pode ser conjugado à hemocianlna de Megathura crenuiata (KLH) {Keyhole Limpet Hemocyanin), albumina do soro, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina da soja, usando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, maleimidobenzoil sulfossuccinimido éster (conjugação através de resíduos Cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes.
Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados através da combinação de, por exemplo, 100 μg ou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injeção da solução intradermalmente em sítios múltiplos. Um mês depois, os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund através de injeção subcutânea em sítios múltiplos. Sete a 14 dias depois, os animais sofrem sangria e o soro é ensaiado quanto a título de anticorpo. Os animais são reforçados até o platô de título. Os conjugados podem ser também feitos em cultura de célula recombinante como fusões de proteína. Também, agentes de agregação tal como alume são adequadamente usados para aumentar a resposta imune. 2. ANTICORPOS MONOCLONAIS I Anticorpos monoclonais são feitos usando o método de hibridoma primeiro descrito por Kohler e outros, Nature, 256:495 (1975) ou podem ser feitos através de métodos de DNA recombinante (Patente U.S. No. 4.816.567).
No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado conforme descrito acima para elicitar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após imunização, os linfócitos são isolados e então fundidos com linhagem de célula de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma então preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que contém preferivelmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais, não fundidas (também referidas como par de fusão). Por exemplo, se as células de mieloma parentais não tiverem a enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura seletivo para os hibridomas tipicamente vai incluir hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
As células de mieloma de par de fusão preferidas são aquelas que fundem eficientemente, suportam produção de anticorpo de alto nível estável pelas células de produto de anticorpo selecionadas e são sensíveis a um meio seletivo que seleciona contra as células parentais não fundidas.
Linhagens de célula de mieloma preferidas são linhagens de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis da Salk Institute Cell Distribution Center, São Diego, Califórnia, USA, e SP-2 e derivados, por exemplo, células X63-Ag8-653 disponíveis da American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Linhagens de célula de mieloma humano e de heteromieloma camundongo- humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur e outros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1987)).
Meio de cultura onde células de híbridoma estão crescendo é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de híbridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).
A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser, por exemplo, determinada através da análise Scatchard descrita em Munson e outros, Anal.. Biochem. 107:220 (1980).
Uma vez células de híbridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas sendo identificadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitantes e crescimento através de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI- 1640. Ainda, as células de híbridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores ascites em animais, por exemplo, através de injeção i.p. das células em camundongos.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro através de procedimentos de purificação de anticorpo convencionais tais como, por exemplo, cromatografia por afinidade (por exemplo, usando proteína A ou 5 proteína G-Sepharose) ou cromatografia de troca de íon, cromatografia de hidroxilapatita, eleteroforese em gel, diálise, etc. DNA codificando os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligação específica a 10 genes codificando as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser posto em vetores de expressão, que são então transfectados para célula hospedeira tais como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma 15 que não produzem de outra maneira proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas célula hospedeira recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de DNA codificando o anticorpo incluem Skerra e outros, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
Em uma modalidade adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo geradas usando as técnicas descritas em McCafferty e outros, Nature, 348:552-554 (1990). Clackson e outros, Nature, 352:628 (1991) e Marks e outros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de 25 anticorpos de murino e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fago.
Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) através de embaralhamento de cadeia (Marks e outros, Bio/Technology, 10:779-783 (1993)), bem como infecção combinatorial e recombinação in vivo como uma estratégia para construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse e outros, Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Então, essas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento de anticorpos 5 monoclonais. O DNA que codifica o anticorpo pode ser modificado para produzir polipeptídeos de anticorpo quimérico ou de fusão, por exemplo, substituindo sequências de domínio constante de cadeia pesada e cadeia leve humanas (CH e CL) por sequências de murino homólogas (Patente U.S. No. 4.816.567; e 10 Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)) ou através de fusão da sequência de codificação de imunoglobulina com toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo de não-imunoglobulína (polipeptídeo heterólogo). As sequências de polipeptídeo de não imunoglobulina podem substituir os domínios constantes de um anticorpo ou 15 eles são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de combinação de antígeno tendo especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno tendo especificidade para um antígeno diferente.
3. ANTICORPOS HUMANOS E HUMANIZADOS
Os anticorpos anti-CD79b da invenção podem compreender ainda anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são imunoglobulinas quiméricas,cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tal como 25 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras sequências de ligação de antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não- humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) onde resíduos de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, a afinidade e a capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de estrutura principal Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem nas sequências de CDR ou estrutura principal importadas. Em geral, o anticorpo humanizado vai compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, onde todas ou substancialmente todas das regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das regiões de Fr são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado vai também compreender otimamente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana [Jones e outros, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann e outros, Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Estrutura. Biol., 2:593-596 (1992)].
Métodos para imunização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos nele a partir de uma fonte que é não humana. Esses resíduos de aminoácido não-humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados", que são tipicamente obtidos de um domínio variável "importado". Humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones e outros, Nature, 321:522-525 (1986); Riechman e outros, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen e outros, Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo sequências correspondentes de um anticorpo humano por sequências de CDRs ou CDR de roedor. Desta maneira, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. No. 4.816.567), onde substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos onde alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.
A escolha de domínios variáveis humanos, ambos leve e pesado, a serem usados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade e resposta de HAMA (anticorpo anticamundongo humano) quando o anticorpo é pretendido para uso terapêutico. Redução ou eliminação de uma resposta de HAMA é um aspecto significante de desenvolvimento clínico de agentes terapêuticos adequados. Vide, por exemplo, Khaxzaeli e outros, J. Natl. Cancer Inst. (1988), Khaxzaeli e outros, J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers e outros., Transplantation (1986), 41:572; Shawlere outros, J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears e outros, J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller e outros, Blood (1983), 62:988; Hakimi e outros, J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann e outros, Nature (1988), 332:323; Junghans e outros, Cancer Res. (1990), 50:1495. Conforme aqui descrito, a invenção provê anticorpos que são humanizados de maneira que resposta HAMA é reduzida ou eliminada. Variantes desses anticorpos podem ser ainda obtidas usando métodos de rotina conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos adicionalmente abaixo. De acordo com o chamado método "best-fit", a sequência do domínio variável de um anticorpo roedor é avaliada contra a biblioteca inteira de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência de domínio V humana que é mais próxima daquela do roedor é identificada e a região de estrutura principal humana (FR) dentro dela aceita para o anticorpo humanizado (Sims e outros, J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia e outros, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método usa uma região de estrutura principal particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura principal pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta e outros, J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Por exemplo, uma sequência de aminoácido de um anticorpo conforme aqui descrito pode servir como uma sequência de partida (parental) para diversificação da(s) sequência(s) de estrutura principal e/o hipervariável(eis). Uma sequência de estrutura principal selecionada à qual uma sequência hipervariável de partida é ligada é referida aqui como uma estrutura principal humana aceitadora. Embora as estruturas principais humanas aceitadores possam ser de, ou derivadas de, uma imunoglobulina humana (as suas regiões VL e/ou VH), preferivelmente as estruturas principais humanas aceitadoras são de, ou derivadas de, uma sequência de estrutura principal de consenso humana uma vez que tais estruturas foram demonstradas ter imunogenicidade mínima, ou nenhuma, em pacientes humanos.
Onde o aceitador for derivado de uma imunoglobulina humana, uma pessoa pode opcionalmente selecionar uma sequência de estrutura principal humana que é selecionada com base em sua homologia com a sequência de estrutura principal doadora através de alinhamento da sequência de estrutura principal doadora com várias sequências de estrutura principal humanas em uma coleção de sequências de estrutura principal humana, e selecionar a sequência de estrutura principal mais homóloga como a aceitadora.
Em uma modalidade, estruturas principais de consenso humanas aqui são de, ou derivadas de, sequências de estrutura principal de consenso VH subgrupo 111 e/ou VL capa subgrupo I.
Desta maneira, a estrutura principal humana aceitadora de VH pode compreender uma, duas, três ou todas as sequências de estrutura principal que seguem: FR1 compreendendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143), FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144), FR3 compreendendo FR compreende RFTISX|DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 147), onde Xi é A ou R, X2 é T ou N e X3 is A ou L, FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146). Exemplos de estruturas principais de consenso de VH incluem: estrutura principal de consenso do subgrupo I de VH humana menos CDRs Kabat (SEQ ID NO:108); estrutura principal de consenso do subgrupo I de VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs:109-111); estrutura principal de consenso do subgrupo II de VH humana menos CDRs Kabat (SEQ ID NO: 112); estrutura principal de consenso do subgrupo II de VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 113-115); estrutura principal de consenso do subgrupo III de VH humana menos CDRs Kabat (SEQ ID NO: 116); estrutura principal de consenso do subgrupo III de VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 117-119); estrutura principal aceitadora VH humana menos CDRs Kabat (SEQ ID NO: 120); ’ estrutura principal aceitadora de VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 121-122); estrutura principal 2 aceitadora de VH humana menos CDRs Kabat (SEQ ID NO: 123); ou estrutura principal 2 aceitadora de VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 124-126).
Em uma modalidade, a estrutura principal humana aceitadora de 5 VH compreende uma, duas, três ou todas as sequências de estrutura principal que seguem: FR1 compreendendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143), FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144), 10 FR3 compreendendo RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 148), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 149), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO: 150), ou 15 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO: 151) FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
A estrutura principal humana aceitadora de VL pode compreender uma, duas, três ou todas as sequências de estrutura principal que seguem: FR1 compreendendo DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID 20 NO: 139), FR2 compreendendo WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 140), FR3 compreendendo GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 141), FR4 compreendendo FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 142). 25 Exemplos de estruturas principais de consenso de VL incluem: estrutura principal de consenso do subgrupo I capa de VL humana (SEQ ID NO: 127); (SEQ ID NO: 128); estrutura principal de consenso do subgrupo III capa VL humana (SEQ ID NO: 129); ou estrutura principal de consenso do subgrupo IV capa de VL humana (SEQ ID NO: 130).
Embora o aceitador possa ser idêntico em sequência à sequência de estrutura principal humana selecionada, seja de uma imunoglobulina humana ou uma estrutura principal de consenso humana, a presente invenção compreende que a sequência aceitadora pode compreender substituições de aminoácido preexistentes com relação à sequência de imunoglobulina humana ou sequência de estrutura principal de consenso humana. Essas substituições preexistentes são preferivelmente mínimas; geralmente quatro, três, duas ou uma diferença de aminoácido apenas com relação à sequência de imunoglobulina humana ou sequência de estrutura principal de consenso.
Resíduos de região hipervariável do anticorpo não humano são incorporados às estruturas principais humanas aceitadoras de VH e/ou VL. Por exemplo, uma pessoa pode incorporar resíduos correspondendo aos resíduos de CDR Kabat, os resíduos de alça hipervariável de Chothia, os resíduos Abm e/ou resíduos de contato. Opcionalmente, os resíduos de região hipervariável estendida como segue são incorporados: 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3), 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3).
Embora "incorporação" de resíduos de região hipervariável seja discutida aqui, será compreendido que isto pode ser conseguido de várias maneiras, por exemplo, ácido nucleico codificando a sequência de aminoácido desejada pode ser gerado através de mutação do ácido nucleico codificando a sequência de domínio variável de camundongo de maneira que seus resíduos de estrutura principal são mudados para resíduos de estrutura principal humana aceitadora, ou através de mutação do ácido nucleico codificando a sequência de domínio variável humana de maneira que os resíduos de domínio hipervariável sejam mudados para resíduos não-humanos, ou através de sintetização do ácido nucleico codificando a sequência desejada, etc.
Nos presentes exemplos, variantes enxertadas com região 5 hipervariável foram geradas através de mutagênese Kunkel de ácido nucleico codificando as sequências aceitadoras humanas, usando um oligonucleotídeo separado para cada região hipervariável. Kunkel e outros, Methods Enzymol., 154:367-382 (1987). Mudanças apropriadas podem ser introduzidas na estrutura principal e/ou região hipervariável, usando técnicas de rotina, para 10 corrigir e restabelecer interações de região hipervariável-antígeno apropriadas.
Exibição de fago/fagemídeo (também referida como exibição de fago em alguns contextos) pode ser usada como um método conveniente e rápido para geração e avaliação de muitos anticorpos potenciais diferentes em uma biblioteca gerada por aleatorização de sequência. No entanto, outros 15 métodos para fabricação e avaliação de anticorpos alterados estão disponíveis ao versado na técnica.
Tecnologia de exobição de fago/fagemídeo proveu uma ferramenta poderosa para geração e seleção de proteínas novas que se ligam a um ligante, tal como um antígeno. Uso das técnicas de exibição de 20 fago/fagemídeo permite a geração de bibliotecas grandes de variantes de proteína que podem ser rapidamente classificadas quanto àquelas sequências que se ligam a uma molécula-alvo com alta afinidade. Ácido nucleicos codificando polipeptídeos variantes são geralmente fundidos a uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína de revestimento virai, tal como a 25 proteína III do gene ou a proteína VIII do gene. Sistemas de exibição de fagemídeo monovalentes onde a sequência de ácido nucleico codificando a proteína ou polipeptídeo é fundida a uma sequência de ácido nucleico codificando uma porção da proteína III do gene foram desenvolvidos. (Bass, S.,
Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). Em um sistema de exibição de fagemideo monovalente, a fusão de gene é expressa em níveis baixos e proteínas III do gene do tipo selvagem são também expressas de maneira que a infectividade das partículas é retida. Métodos de geração de bibliotecas de peptídeo e avaliação dessas bibliotecas foram descritos em muitas patentes (por exemplo, Patente U.S. Ns. 5.723.286, Patente U.S. Na. 5.432.018, Patente U.S. N2. 5.580.717, Patente U.S. N2. 5.427.908 e Patente U.S. N2. 5.498.530).
Bibliotecas de anticorpos ou polipeptídeos de ligação de antígeno foram preparadas de várias maneiras incluindo alteração de um gene único através de inserção de sequências de DNA aleatórias ou através de clonagem de uma família de genes relacionados. Métodos para exibição de anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno usando exibição de fago/fagemídeo foram descritos nas Patentes U.S. N—. 5.750.373, 5.733.743, 5.837.242, 5.969.108, 6.172.197, 5.580.717 e 5.658.727. A biblioteca é então avaliada quanto à expressão de anticorpos ou proteínas de ligação a antígeno com as características desejadas.
Métodos de substituição de um aminoácido de escolha em um ácido nucleico molde são bem estabelecidos na técnica, alguns deles são descritos aqui. Por exemplo, resíduos de região hipervariável podem ser substituídos usando o método Kunkel. Vide, por exemplo, Kunkel e outros, Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).
A sequência de oligonucleotídeos inclui um ou mais dos conjuntos de códon projetados para os resíduos de região hipervariável a serem alterados. Um conjunto de códon é um conjunto de sequências tripleto de nucleotídeo diferentes usadas para codificar aminoácidos variantes desejados. Conjuntos de códons podem ser representados usando símbolos para designar nucleotídeos particulares ou misturas equimolares de nucleotídeos conforme mostrado abaixo de acordo com o código IUB. CÓDIGOS IUB G Guanina A Adenina T Timina C Citosina R (A ou G) Y (C ou T) M (A ou C) K (G ou T) S (C ou G) W (A ou T) H (A ou C ou T) B (C ou G ou T) V (A ou C ou G) D (A ou G ou T) H N (A ou C ou G ou T)
Por exemplo, no conjunto de códon DVK, D pode ser nucleotídeos A ou G ou T; V pode ser A ou G ou C; e K pode ser G ou T. Este conjunto de códon pode apresentar 18 códons diferentes e pode codificar aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly e Cys.
Conjuntos de oligonucleotídeo ou iniciador podem ser sintetizados usando métodos padrão. Um conjunto de oligonucleotídeos pode ser sintetizado, por exemplo, através de síntese de fase sólida, contendo sequências que representam todas as combinações possíveis de tripletos de nucleotídeo providas pelo conjunto de codon e que vão codificar o grupo de aminoácidos desejado. Síntese de oligonucleotídeos com "degeneração" de nucleotídeo selecionada em certas posições é bem conhecida na técnica. Tais conjuntos de nucleotídeos tendo certos conjuntos de códon podem ser sintetizados usando sintetizadores de ácido nucleico comerciais (disponíveis da, por exemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA) ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, da Life Technologyes, Rockville, MD). Desta 5 maneira, um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados tendo um conjunto de códon particular vai tipicamente incluir uma pluralidade de oligonucleotídeos com sequências diferentes, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códon dentro da sequência geral. Oligonucleotídeos, conforme usado de acordo com a invenção, têm sequências que permitem a hibridização para um molde de 10 ácido nucleico de domínio variável e também podem incluir sítios de enzima de restrição para propósitos de clonagem. Em um método, sequências de ácido nucleico codificando aminoácidos variantes podem ser criadas através de mutagênese mediada por oligonucleotídeo. Esta técnica é bem conhecida no campo conforme descrito 15 por Zoller e outros Nucleic Acids Res. 10:6487-6504(1987). Em suma, sequências de ácido nucleico codificando aminoácidos variantes são criadas através de hibridização de um conjunto de oligonucleotídeo codificando os conjuntos de códon desejados para um molde de DNA, onde o molde é a forma de filamento único do plasmídeo contendo uma sequência de molde de ácido II I 20 nucleico de região variável. Após hibridização, DNA polimerase é usada para sintetizar um segundo filamento complementar inteiro do molde que vai então incorporar o iniciador de oligonucleotídeo, e vai conter os conjuntos de códon conforme provido pelo conjunto de oligonucleotídeo.
Em geral, oligonucleotídeos de pelo menos 25 nucleotídeos de 25 comprimento são usados. Um oligonucleotídeo opcional terá 12 a 15 nucleotídeos que são completamente complementares ao molde em qualquer lado do(s) nucleotídeo(s) codificando a(s) mutação(ões). Isto assegura que o oligonucleotídeo vai hibridizar apropriadamente para a molécula modelo de DNA de filamento único. Os oligonucleotídeos são prontamente sintetizados usando técnicas conhecidas no campo tais como aquelas descritas por Grea e outros, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA, 75:5765 (1978).
O molde de DNA é gerado por aqueles vetores que ou são derivados de vetores de bacteriófago M13 (os vetores M13mp18 e M13mp19 comercialmente disponíveis são adequados) ou aqueles vetores que contêm uma origem de replicação de fago de filamento único conforme descrito por Viera e outros, Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Desta maneira, o DNA que deve ser mutado pode ser inserido em um desses vetores a fim de gerar molde de filamento único. Produção do molde de filamento único é descrita nas seções 4.21-4.41 de Sambrook e outros, acima.
Para alterar a sequência de DNA nativo, o oligonucleotídeo é hibridizado para o molde de filamento simples sob condições de hibridização adequadas. Uma enzima de polimerização de DNA, geralmente T7 DNA polimerase ou o fragmento Klenow de DNA polimerase, é então adicionada para sintetizar o filamento complementar do molde usando o oligonucleotídeo como um iniciador para síntese. Uma molécula heteroduplex é então formada, de maneira que um filamento de DNA codifica a forma mutada de gene 1, e o outro filamento (o molde original) codifica a sequência de gene 1 sem alteração. Esta molécula heteroduplex é então formada em uma célula hospedeira adequado, geralmente uma procariótica tal como JM101 de E. coli. Após crescimento das células, elas são postas plaqueadas em placas de agarose e avaliadas usando o iniciador de oligonucleotídeo radiomarcado com 32-Fosfato para identificar as colônias de bactérias que contêm o DNA mutado.
O método descrito imediatamente acima pode ser modificado de maneira que uma molécula de heterodúplex pode ser criada onde ambos os filamentos do plasmídeo contêm a(s) mutação(ões). As modificações são como segue: o oligonucleotídeo de filamento simples é anelado para molde de filamento duplo conforme acima descrito. Uma mistura de três desoxirribonucleotídeos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) e desoxirribotimidina (dTT), é combinada com uma tiodesoxirribocitosina modificada chamada dCTP-(aS) (que pode ser obtida da Amersham). Esta mistura é adicionada ao complexo molde-oligonucleotídeo. Quando da adição de polimerase de DNA a esta mistura, um filamento de DNA idêntico ao molde exceto pelas bases mutadas é gerado. Ainda, este novo filamento de DNA vai conter dCTP-(aS) ao invés de dCTP, que serve para protegê-lo de digestão de endonuclease de restrição. Após o filamento do 10 molde do heteroduplex de filamento duplo ser fendido (nicked) com uma enzima de restrição apropriada, o filamento molde pode ser digerido com Exolll nuclease ou outra nuclease apropriada depois da região que contém o(s) sítio(s) a ser(em) mutagenizado(s). A reação é então parada para deixar uma molécula que é apenas parcialmente de filamento simples. Um homoduplex de DNA de filamento duplo complexo é então formado usando polimerase de DNA na presença de todos os quatro desoxirribonucleotídeo trifosfatos, ATP e DNA ligase. Esta molécula de heteroduplex pode então ser transformada em uma célula hospedeira adequada.
Conforme anteriormente indicado a sequência do conjunto de oligonucleotídeo é de comprimento suficiente para hibridizar para o ácido nucleico molde e pode também, mas não necessariamente, conter sítios de restrição. O molde de DNA pode ser gerado por aqueles vetores que ou são derivados de vetores de bacteriófago M13 ou vetores que contêm uma origem de replicação de fago de filamento simples conforme descrito por Viera e 25 outros, Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Então, o DNA a ser mutado deve ser inserido em um desses vetores a fim de gerar molde de filamento simples. Produção do molde de filamento simples é descrita nas seções 4.21-4.41 de Sambrook e outros, supra.
De acordo com outro método, ligação de antígeno pode ser restaurada durante humanização de anticorpos através da seleção de regiões hipervariáveis reparadas (vide Pedido Na. 11/061.841 depositado em 18 de fevereiro de 2005). O método inclui incorporação de regiões hipervariáveis não 5 humanas a uma estrutura principal aceitadora e introdução ainda de uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais regiões hipervariáveis sem modificação da sequência de estrutura principal aceitadora. Alternativamente, a introdução de uma ou mais substituições de aminoácido pode ser acompanhada por modificações na sequência da estrutura principal aceitadora.
De acordo com outro método, uma biblioteca pode ser gerada através da provisão de conjuntos de oligonucleotídeo a montante e a jusante, cada conjunto tendo uma pluralidade de oligonucleotídeos com sequências diferentes, as sequências diferentes estabelecidas pelos conjuntos de códon providos dentro da sequência dos oligonucleotídeos. Os conjuntos de 15 oligonucleotídeos a montante e a jusante, junto com uma sequência de ácido nucleico de molde de domínio variável, podem ser usados em uma reação em cadeia da polimerase para gerar uma "biblioteca" de produtos de PCR. Os produtos de PCR podem ser referidos como "cassetes de ácido nucleico", uma vez que eles podem ser fundidos com outras sequências de ácido nucleico 20 relacionadas ou não-relacionadas, por exemplo, proteínas de revestimento virais e domínios de dimerização, usando técnicas de biologia molecular estabelecidas.
A sequência de iniciadors de PCR inclui um ou mais dos conjuntos de códon designados para posições acessíveis e altamente diversas 25 de solvente em uma região hipervariável. Conforme acima descrito, um conjunto de códon é um conjunto de sequências tripleto de nucleotídeo diferentes usado para codificar aminoácidos variantes desejados.
Selecionadores de anticorpo que satisfazem os critérios desejados, conforme selecionado através de etapas de avaliação/seleção apropriadas, podem ser isolados e clonados usando técnicas recombinantes padrão.
É ainda importante que anticorpos sejam humanizados com retenção de afinidade de ligação alta para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão geralmente disponíveis e são familiares àqueles versados na técnica. Programas de computador estão disponíveis, os quais ilustram e mostram estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. Inspeção dessas amostras permite análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata em ligar seu antígeno. Desta maneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir do recipiente e sequências importadas de maneira que a característica do anticorpo desejada, tal como uma afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo, seja obtida. Em geral, os resíduos de região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciamento de ligação de antígeno.
Várias formas de um anticorpo anti-CD79b humanizado são compreendidas. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agente(s) citotóxico(s) a fim de gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgG intacto.
Como uma alternativa para humanização, anticorpos humanos podem ser gerados. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, quando da imunização, de produção de um repertório inteiro de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene da região de união da cadeia pesada do anticorpo (JH) em camundongos quiméricos e mutantes de linha germinativa resulta em inibição completa de produção de anticorpo endógeno. Transferência da disposição de gene de imunoglobulina de linha germinativa humana em tais camundongos mutantes de linha germinativa vai resultar na produção de anticorpos humanos quando da provocação com antígeno. Vide, por exemplo, Jakobovits e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits e outros, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann e outros, Year in Immuno. 7:33 (1993); Patentes U.S. N—. 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas da GenPharm); 5.545.807; e WO 97/17852. Alternativamente, tecnologia de exibição de fago (McCafferty e outros, Nature 348:552-553 ([1990]) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de gene de domínio variável de imunoglobulina (V) a partir de doadores imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V de anticorpo são clonados em estrutura em urn gene de proteína de revestimento maior ou menor de urn bacteriófago filamentoso, tai como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos de anticorpo funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Devido ao fato da partícula filamentosa conter uma cópia de DNA de filamento simples do genoma de fago, seleção com base nas propriedades funcionais do anticorpo também resulta em seleção do gene codificando o anticorpo exibindo essas propriedades. Então, o fago imita algumas das propriedades da célula B. Exibição de fago pode ser realizada em uma variedade de formatos, revistos em, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmento de gene V podem ser usadas para exibição de fago. Clackson e outros, Nature, 352:624628 (1991) isolaram uma disposição diversa de anticorpos anti-oxazolona de 5 uma biblioteca combinatorial aleatória pequena de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não-imunizados pode ser construído e anticorpos para uma disposição diversa de antígenos (incluindo auto-antígeno) podem ser isolados essencialmente seguindo a técnica descrita por Marks e outros, J, Mol. Biol. 10 222:581-597 (1991) ou Griffith e outros, EMBO J. 12:725-734 (1993). Vide também Patentes U.S. N-. 5.565.332 e 5.573.905.
Conforme acima discutido, anticorpos humanos podem ser também gerados por células B ativadas in vitro (vide Patentes U.S. N—. 5.567.610 e 5.229-275).
4. FRAGMENTOS DE ANTICORPO
Em certas circunstâncias, há vantagens no uso de fragmentos de anticorpo, ao invés de anticorpos integrais. O tamanho menor dos fragmentos permite eliminação rápida, e pode levar a acesso aperfeiçoado a tumores sólidos.
Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto e outros, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107117 (1992); e Brennan e outros, Science, 229:81 (1985)). No entanto, esses 25 fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por célula hospedeira recombinantes. Fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem ser todos expressos em e secretaclos de E. coli, desta maneira permitindo a produção fácil de grandes quantidades desses fragmentos. Fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter e outros, Bio/TechnolOQy 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, 5 fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Fragmentos Fab e F(ab’)2 com meia-vida in vivo maior compreendendo resíduos de epitopo de ligação a receptor selvagem são descritos na Patente U.S. N2. 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão aparentes ao praticante versado. Em outras 10 modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Vide WO 93/16185; Patente U.S. N2. 5.571.894; e Patente U.S. N2. 5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são destituídas de regiões constantes; então, eles são adequados para ligação não-específica reduzida durante uso in vivo. Proteínas de fusão de sFc 15 podem ser construídas para produzir fusão de uma proteína efetora ou no terminal amino ou carbóxi de um sFv. Vide Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecíficos ou 20 biespecíficos.
5. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS
Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação para pelo menos dois epitopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar a dois epitopos diferentes de uma proteína CD79b 25 conforme descrito aqui. Outros tais anticorpos podem combinar um sítio de ligação de CD79b com um sítio de ligação com outra proteína. Alternativamente, um braço anti-CD79b pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula de disparo em um leucócito tal como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de maneira a focar e localizar mecanismos de defesa celular para a célula expressando CD79b. Anticorpos biespecíficos podem ser também usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam CD79b. Esses anticorpos possuem um braço de ligação de CD79b e um braço que liga o agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-a, vinca alcalóíe, cadeia da ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento integral ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos de F(ab')2).
O WO 96/16673 descreve um anticorpo anti-ErbB2/anti-FcyRIII biespecífico e a Patente U.S. N-. 5.837.234 revela um anticorpo anti- ErbB2/anti-FcyRI biespecífico. Um anticorpo anti-ErbB2/Fca biespecífico é mostrado no WO98/02463. A Patente U.S. N2. 5.821.337 ensina um anticorpo anti-ErbB2/anti-CD3 biespecífico.
Métodos para fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento integral é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve da imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein e outros., Nature, 305:537-539 (1983)). Devido ao sortimento aleatório de cadeias pesada e leve da imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. Purificação da molécula correta, que é geralmente feita através de etapas de cromatografia por afinidade, é ao contrário excessivamente trabalhosa, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos no WO 93/08829 e em Traunecker e outros, EMBO J„ 10:3655-3659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) são fundidos a sequências de domínio constante da imunoglobulina. Preferivelmente, a fusão é com um domínio constante da cadeia pesada, compreendendo pelo menos parte das regiões de impedimento, CH2 e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação à cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs codificando as fusões de cadeia pesada da imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são co-transfectados em uma célula hospedeira adequada. Isto provê maior flexibilidade em ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando razões diferentes das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção proveem o rendimento ótimo do anticorpo biespecífico desejado. É, no entanto, possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão único quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em razões iguais resulta em rendimentos altos ou quando as razões não têm nenhum efeito significante sobre o rendimento da combinação de cadeia desejada.
Em uma modalidade preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada da imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia pesada-cadeia leve da imunoglobulina híbrida (provendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Foi constatado que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve da imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica provê um modo fácil de separação. Esta abordagem é revelada no WO 94/04690. Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh e outros, Methods in Enzymology, 121:210(1986).
De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. N-. 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser engenheirada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados de cultura de célula recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácido pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensadoras de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) laterais grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo através da substituição das cadeias laterais de aminoácido grandes com umas menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto provê um mecanismo para aumento do rendimento do heterodímero sobre produtos finais indesejados tais como homodímeros.
Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina, o outro à biotina. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direcionar a células dos sistema imune quanto a células indesejadas (Patente U.S. N2 4.676.980) e para tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e são descritos na Patente U.S. N2. 4.676.980 junto com várias técnicas de reticulação.
Técnicas para geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo foram também descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan e outros, Science, 229:81 (1985) descrevem um procedimento onde anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2, Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação ditiol, arsenita de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e prevenir formação dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab’ gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então convertido no Fab'-tiol através de redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab’-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
Progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby e outros, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) descrevem a produção de molécula de F(ab')2 de anticorpo biespecífico integralmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado de E. coli e submetido a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico então formado era capaz de se ligar a células superexpressando o receptor ErbB2 e células T humanas normais, bem como disparar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humanos.
Várias técnicas para fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpo biespecíficos diretamente a partir de cultura de célula recombinante foram também descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zípers de leucina. Kostelny e outros, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão de gene. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de impedimento para formar monômeros e então reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método pode ser também utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia "diacorpo" descrita por Hollinger e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) proveu um mecanismo alternativo para produção de fragmentos de anticorpo biespecíficos. Os fragmentos compreendem um VH conectado a um VL por um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Desta maneira, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VH e VL complementares de outro fragmento, desta maneira formando dois sítios de ligação de antígeno. Outra estratégia para produção de fragmentos de anticorpo específicos através do uso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia simples foi também relatada. Vide Gruber e outros, J. Immunol., 152:5368 (1994).
Anticorpos com mais de duas valências são compreendidos. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt e outros, J. Immunol., 147:60(1991).
6. ANTICORPOS HETEROCONJUGADOS
Anticorpos heteroconjugados estão também dentro do escopo da presente invenção. Anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos covalentemente ligados. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos direcionar células do sistema imune a célula indesejadas [Patente U.S. N° 4.676.980] e para tratamento de infecção por HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. É compreendido que os anticorpos podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos em química de proteína sintética, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca dissulfeto ou através de formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4- mercaptobutirimidato e aqueles descritos, por exemplo, na Patente U.S. N2. 4.676.980.
7. ANTICORPOS MULTIVALENTES
Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolisado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula expressando um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que são outros que não da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser prontamente produzidos através de expressão recombinante de ácido nucleico codificando as cadeias de polipeptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação de antígeno. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) uma região Fc de uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo vai compreender uma região Fc e três ou mais sítios de ligação de antígeno amino-terminais para a região Fc. O presente anticorpo multivalente preferido compreende (ou consiste em) três a cerca de oito, mais preferivelmente quatro, sítios de ligação de antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia de polipeptídeo (e preferivelmente duas cadeias de polipeptídeo), onde a(s) cadeia(s) de polipeptídeo compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeo pode(m) compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, onde VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia de polipeptídeo de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo e n é 0 ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeo pode(m) compreender: VH-CH1-ligante flexível-VH-CH1-cadeia da região Fc; ou VH-CH1-VH-CH1- cadeia da região Fc. O presente anticorpo multivalente preferivelmente compreende ainda pelo menos dois (e 251 JI preferivelmente quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O presente anticorpo multivalente pode, por exemplo, compreender de a partir de cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve.
Os polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve contemplados aqui compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreende ainda um domínio CL.
8. ENGENHARIA DE FUNÇÃO EFETORA
Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com relação à função efetora, por exemplo, de maneira a aumentar a citotoxidez mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxidez dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser conseguido introduzindo uma ou mais substituições de aminoácido em uma região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, desta maneira permitindo formação de ligação dissulfeto intercadeia nesta região. O anticorpo heterodimérico então gerado pode ter capacidade de internalização aperfeiçoada e/ou morte celular mediada por complemento e citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentada. Vide Caron e outros, J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumor aumentada podem ser também preparados usando reticulantes heterobifuncionais conforme descrito em Wolff e outros, Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo pode ser engenheirado, o qual tem regiões Fc duplas e pode então ter capacidades de lise de complemento e ADCC aumentadas. Vide Stevenson e outros., AntiCancer Drug Design, 3:219-230 (1989). Para aumentar a meia-vida no soro do anticorpo, uma pessoa pode incorporar um epitopo de ligação de receptor selvagem ao anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) conforme descrito na Patente U.S. 5.739.277, por exemplo. Conforme aqui usado, o termo "epitopo de ligação de receptor selvagem" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4) que é responsável pelo aumento da meia-vida no soro in vivo da molécula de IgG.
9. IMUNOCONJUGADOS
A invenção refere-se também a imunoconjugados (intercomutavelmente referidos como "conjugados de anticorpo-fármaco" ou "ADCs") compreendendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, um agente inibidor de crescimento, uma 10 toxina (por exemplo, toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal ou seus fragmentos) ou um isótopo radioativo (isto é, radioconjugado).
Em certas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo e um agente quimioterapêutico ou outra toxina. Agentes 15 quimioterapêuticos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser usados incluem cadeia A da difteria, fragmentos ativos de não ligação de toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de 20 Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 1311, 131 In, 90Y 25 e 186Re. Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento à proteína bifuncionais tais como N- succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCL de dimetil adipimidato), ésteres ativos (tal como dissuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-di-isocianato) e compostos flúor bis- 5 ativos (tal como 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta e outros, Science, 238:1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3- metildietileno triaminopentaacético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente de quelação exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao 10 anticorpo. Vide WO 94/11026.
Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tal como uma calicheamicina, peptídeos de auristatina, tal como monometilauristatina (MMAE) (análogo sintético de dolastatina), maitansinoides, tal como DM1, um tricoteno e CC1065 e os derivados dessas 15 toxinas que têm atividade de toxina, são também compreendidos aqui. IMUNOCONJUGADOS EXEMPLARES - CONJUGADOS ANTICORPO-FÁRMACO Um imunoconjugado (ou "conjugado anticorpo-fármaco" ("ADC")) da invenção pode ser de Fórmula I, abaixo, onde um anticorpo é conjugado (isto é, covalentemente ligado) a uma ou mais porções de fármaco (D) através 20 de um ligante opcional (L). ADCs podem incluir conjugados de tioMAb-fármaco ("TDC"). Ab-(L-D)p I
Desta maneira, o anticorpo pode ser conjugado ao fármaco ou diretamente ou através de um ligante. Na Fórmula I, p é o número médio de porções de fármaco por anticorpo, que pode variar, por exemplo, de a partir de 25 cerca de 1 a cerca de 20 porções de fármaco por anticorpo, e em certas modalidades de a partir de cerca de 1 a cerca de 8 porções de fármaco por anticorpo. A invenção inclui uma composição compreendendo uma mistura de anticorpo-compostos de fármaco de Fórmula I onde o carregamento de fármaco médio por anticorpo é cerca de 2 a cerca de 5 ou cerca de 3 a cerca de 4.
A. LIGANTES EXEMPLARES
Um ligante pode compreender um ou mais componentes ligantes. Componentes ligantes exemplares incluem 6-maleimidocaproíla ("MC"), maleimidopropanoíla ("MP"), valina-citrulina ("val-cit" ou "vc"), alanina- fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonila (uma "PAB") e aqueles resultantes da conjugação com reagentes ligantes: N-succinimidil 4-(2-piridiltio) 10 pentanoato ("SPP"), N-succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-1 carboxilato ("SMCC", também referido aqui como "MCC") e N-Succinimidil (4- iodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Vários componentes ligantes são conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos abaixo. Um ligante pode ser um "ligante clivável", facilitando a liberação 15 de um fármaco na célula. Por exemplo, um ligante ácido-lábil (por exemplo, hidrozona), ligante sensível à protease (por exemplo, sensível à peptidase), ligante fotolábil, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari e outros, Cancer Research 52:127-131 (1992); Patente U.S. Ns. 5,208,020) pode ser usado. 20 Em certas modalidades, um ligante é conforme mostrado na Fórmula II que segue:
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onde A é uma unidade de alongamento, e a é um inteiro de a partir de 0 a 1; W é uma unidade de aminoácido e w é um inteiro de a partir de 0 a 12; Y é uma unidade espaçadora e y é 0, 1 ou 2; e Ab, D e p são conforme 25 acima definido para a Fórmula I. Modalidades exemplares de tais ligantes são descritas na US 2005-0238649 A1, que é expressamente aqui incorporada a título de referência.
Em algumas modalidades, um componente ligante pode compreender uma "unidade de alongamento" que liga um anticorpo a outro componente ligante ou a uma porção de fármaco. Unidades de alongamento 5 exemplares são mostradas abaixo (onde a linha ondulada indica sítios de
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Em algumas modalidades, um componente ligante pode compreender uma unidade de aminoácido. Em modalidade deste tipo, a unidade de aminoácido permite clivagem do ligante por uma protease, desta 10 maneira facilitando liberação do fármaco a partir do imunoconjugado quando da exposição a proteases intracelulares, tais como enzimas lisossomais. Vide, por exemplo, Doronina e outros (2003) Nat. Biotechnol., 21:778-784. Unidades de aminoácido exemplares incluem, mas não estão limitadas a, um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo e um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplares 15 incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe); fenilalanina-lisina (fk ou phe-lys); ou N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Tripeptídeos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina- glicina-glicina (gly-gly-gly). Uma unidade de aminoácido pode compreender resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente, bem como aminoácidos em quantidades menores e análogos de aminoácido de ocorrência não natural, tal como citrulina. Unidades de aminoácido podem ser projetadas e otimizadas em sua seletividade para divagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsinas B, C e D ou uma protease de plasmina.
Em algumas modalidades, um componente ligante pode compreender uma unidade "espaçadora" que liga o anticorpo a uma porção de fármaco, ou diretamente ou por meio de uma unidade de alongamento e/ou uma unidade de aminoácido. Uma unidade espaçadora pode ser "auto-imolativo" ou uma "não-auto-imolativo". Uma unidade espaçadora "não-auto-imolativa" é uma onde parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada à porção de fármaco quando da divagem enzimática (por exemplo, proteolítica) do ADC. Exemplos de unidades espaçadoras não autoimolativas incluem, mas não estão limitados a, uma unidade espaçadora glicina e uma unidade espaçadora glicina-glicina. Outras combinações de espaçadores de peptídeo suscetíveis à divagem enzimática específica de sequência são também compreendidas. Por exemplo, divagem enzimática de um ADC contendo uma unidade espaçadora glicina-glicina por uma protease associada à célula de tumor resultaria em liberação de glicina-glicina-porção de fármaco do restante do ADC. Em tal modalidade, a glicina-glicina-porção de fármaco é então submetida a uma etapa de hidrólise separada na célula de tumor, então clivando a unidade espaçadora glicina-glicina da porção de fármaco,
Uma unidade espaçadora "autoimolativa" permite liberação da porção de fármaco sem uma etapa de hidrólise separada. Em certas modalidades, uma unidade espaçadora de um ligante compreende uma unidade p-aminobenzila. Em tal modalidade, um álcool p-aminobenzila é ligado a uma unidade de aminoácido através de uma ligação amida, e um 5 carbamato, metilcarbamato, ou carbonato é feito entre o benzil álcool e um agente citotóxico. Vide, por exemplo, Hamann e outros (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005), 15:1087-1103. Em uma modalidade, a unidade espaçadora é p-aminobenziloxicarbonila (PAB). Em certas modalidades, a porção fenileno de uma unidade p-aminobenzila é substituída com Qm, 10 onde Q é -Ci-C8 alquila, -O-(C-i-C8 alquila), -halogênio, -nitro ou -ciano; e m é um inteiro variando de 0-4. Exemplos de unidades espaçadoras auto- imolativas incluem ainda, mas não estão limitados a, compostos aromáticos que são eletronicamente similares a p-amibenzil álcool (vide, por exemplo, US 2005/0256030 A1), tal como derivados de 215 aminoimidazol-5-metanol (Hay e outros, (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett., 9:2237) e orto- ou para-aminobenzilacetais, Espaçadores podem ser usados, os quais sofrem ciclização quando da hidrólise de ligação amida, tais como amidas do ácido 4-aminobutírico substituídas e não-substituídas (Rodrigues e outros, Chemistry Biology, 1995, 2, 223); sistemas de anel 20 biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] apropriadamente substituídos (Storm e outros, J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815); e amidas do ácido 2- aminofenilpropiônico (Amsberry e outros, J. Org. Chem., 1990, 55, 5867). Eliminação de fármacos contendo amina que são substituídos na posição ct da glicina (Kingsbury e outros, J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) são também 25 exemplos de espaçadores auto-imolativos úteis em ADCs.
Em uma modalidade, uma unidade espaçadora é uma unidade de bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificado conforme mostrado abaixo, que pode ser usada para incorporar e liberar múltiplos fármacos.
Figure img0036
onde Q é C-|-C8 alquila, -O-(Ci-C8 alquila), -halogênio, -nitro, ou - ciano; m é um inteiro variando de 0-4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a cerca de 20.
Em outra modalidade, o ligante L pode ser um ligante tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma porção de fármaco através 5 de uma porção ligante multifuncional, de ramificação, a um anticorpo (Sun e outros (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 12:2213-2215; Sun e outros (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry, 11:1761-1768). Ligantes dendríticos podem aumentar a razão molar de fármaco para anticorpo, isto é, carga, que está relacionada com a potência do ADC. Desta maneira, onde um 10 anticorpo engenheirado com cisteína carregar apenas um grupo cisteína tiol reativo, uma variedade de porções de fármaco pode ser ligada através de um ligante dendrítico.
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Componentes ligantes exemplares e suas combinações são mostrados abaixo no contexto de ADCs de Fórmula II:
Componentes ligantes, incluindo unidades extensoras, espaçadoras e de aminoácido, podem ser sintetizados através de métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos na US 2005-0238649 A1. B. PORÇÕES DE FÁRMACO EXEMPLARES 5 (1) MAITANSINA E MAITANSINOIDES
Em algumas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de maitansinoide. Maitansinoides são inibidores mitóticos que agem através da inibição de polimerização da tubulina. A maitansina foi primeiro isolada do arbusto africano 10 oriental Maytenus serrata (Patente U.S. N2. 3896111). Subsequentemente, foi constatado que certos micróbios também produzem maitansinoides, tais como maitansinol e C-3 maitansinol ésteres (Patente U.S. N2. 4.151.042). Maitansinol sintético e derivados e análogos do mesmo são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 15 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533.
Porções de fármaco maitansinoide são porções de fármaco atraentes em conjugados de anticorpo-fármaco porque elas são: (1) relativamente acessíveis para preparo através de fermentação ou modificação química ou derivatização de produtos de fermentação, (ii) condescendentes à derivatização com grupos funcionais adequados para conjugação através de ligantes dissulfeto e não-dissulfeto a anticorpos, (iii) estáveis em plasma e (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens de célula de tumor.
Compostos maitansina adequados para uso como porções de fármaco maintansinoide são bem conhecidos na técnica e podem ser isolados de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos ou produzidos usando técnicas de engenharia genética e de fermentação (US 6790952; US 2005/0170475; Yu e outros (2002) PNAS 99:7968-7973). Maitansinol e análogos de maitansinol podem ser também preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos.
Porções de fármaco maitansinoide exemplares incluem aquelas tendo um anel aromático modificado, tais como: C-19-descloro (Patente U.S. Ns. 4256746) (preparado através de redução de hidreto de alumínio lítio de ansamitocina P2); C-20 hidróxi (ou C20-desmetila) +/-C-19-descloro (Patentes U.S. Nos. 4361650 e 4307016) (preparado através de desmetilação usando Streptomyces ou Actinomyces ou descloração usando LAH); e C-20-desmetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/-descloro (Patente U.S. No. 4.294.757) (preparado através de acilação usando cloretos de acila) e aqueles tendo modificações em outras posições.
Porções de fármaco maitansinoide exemplares também incluem aquelas tendo modificações tais como: C-9-SH (Patente U.S. No. 4424219) (preparada através da reação de maitansinol com H2S ou P2S5); C-14- alcoximetil(desmetóxi/CH2 OU)(US 4331598); C-14-hidroximetila ou aciloximetila (CH2OH ou CH2OAc) (Patente U.S. Ns. 4450254) (preparada a partir de Nocardia)-, C-15-hidróxi/acilóxi (US 4364866) (preparado através da conversão de maitansinol por Streptomyces)-, C-15-metóxi (Patentes U.S. N—. 4313946 e 4315929) (isolado de Trewía nudlflora)-, C-18-N-desmetila (Patentes U.S. N—. 4362663 e 4322348) (preparada através da desmetilação de 5 maitansinol por Streptomyces)-, e 4,5-desóxi (US 4371533) (preparada através da redução por tricloreto de titânio/LAH de maitansinol).
Muitas posições em compostos maintansina são conhecidas ser úteis como a posição de ligação, dependendo do tipo de ligante. Por exemplo, para formação de uma ligação éster, a posição C-3 tendo um grupo hidroxila, a 10 posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e a posição C-20 tendo um grupo hidroxila são todas adequadas (US 5208020; US RE39151; US 6913748; US 7368565; US 2006/0167245; US 2007/0037972). Porções de fármaco maitansinoide incluem aquelas tendo a estrutura:
Figure img0039
onde a linha pontilhada indica a ligação covalente do átomo de enxofre da porção de fármaco maitansinoide a um ligante de um ADC. R pode ser independentemente H ou uma Ci-C6 alquila. A cadeia alquileno ligando o grupo amida ao átomo de enxofre pode ser metanila, etanila ou propila, isto é, m é 1, 2 ou 3 (US 633410 ; US 5208020; US 7276497; Chari e outros (1992), Cancer Res. 52:127-131; Liu e outros (1996), Proc. Natl. Acad. Sei USA, 93:8618-8623).
Todos os estereoisômeros da porção de fármaco maitansinoide 5 são compreendidos para os compostos da invenção, isto é, qualquer combinação de configurações R e S nos carbonos quirais de D. Em uma modalidade, a porção de fármaco maitansinoide terá a estereoquímica que segue:
Figure img0040
Modalidades exemplares de porções de fármaco de maitansinoide 10 incluem: DM1; DM3; e DM4, tendo as estruturas:
Figure img0041
Figure img0042
em que a linha pontilhada indica a ligação covalente do átomo de enxofre do fármaco a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco (WO 2005/037992; US 2005/0276812 A1).
Outros conjugados de anticorpo-fármaco de maitansinoide 5 exemplares têm as estruturas e abreviações que seguem (em que Ab é anticorpo e p é 1 a cerca de 8):
Figure img0043
Conjugados anticorpo-fármaco exemplares em que DM1 é ligado através de um ligante BMPEO a um grupo tiol do anticorpo têm a estrutura e abreviação:
Figure img0044
em que Ab é anticorpo; n é 0, 1 ou 2; e p é 1, 2, 3 ou 4.
Imunoconjugados contendo maitansinoides, métodos para sua fabricação e seu uso terapêutico são descritos, por exemplo, em Erickson e outros (2006) Cancer Res., 66(8):4426-4433; Patentes U.S. Nos. 5.208.020, 5.416.064, US 2005/0276812 A1 e Patente Europeia EP 0 425 235 B1, cujos relatórios são aqui expressamente incorporados a título de referência.
Conjugados de anticorpo-maitansinoide são preparados ligando quimicamente um anticorpo a uma molécula de maitansinoide sem diminuir significantemente a atividade biológica nem do anticorpo nem da molécula de maitansinoide. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.208.020 (cujo relatório é aqui expressamente incorporado a título de referência). Maitansinoides podem ser sintetizados através de técnicas conhecidas ou isoladas de fontes naturais. Maitansinoides adequados são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.208.020 e em outras publicações de patente e não-patente referidas acima, tais como maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tais como vários ésteres de maitansinol. Há muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para fabricação de conjugados de anticorpo-maitansinoide, incluindo, por exemplo, aqueles descritos na Patente U.S. No. 5208020 e na Patente EP 0 425 235 B1;
Chari e outros, Cancer Research 52:127-131 (1992); e US 2005/016993 A1, cujos relatórios são aqui expressamente incorporados a título de referência. Conjugados de anticorpo-maitansinoide compreendendo o componente ligante SMCC podem ser preparados conforme descrito na US 2005/0276812 A1, "Antibody-drug conjugates and Methods". Os ligantes compreendem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos lábeis ácidos, grupos fotoláveis, grupos lábeis de peptidase ou grupos lábeis de esterase, conforme descrito nas patentes identificadas acima. Ligantes adicionais são descritos e exemplificados aqui.
Conjugados do anticorpo e maitansinoide podem ser usados usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imídoésteres (tal como HCI de dimetil adipimidato), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis(p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tal como tolueno 2,6-di- isocianato) e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-diflúor2,4- dinitrobenzeno). Em certas modalidades, o agente de acoplamento é N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (Carlsson e outros, Biochem. J., 173:723-737 (1978)) ou N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para prover uma ligação dissulfeto.
O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinoide em várias posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada através de reação com um grupo hidroxila usando técnicas de acoplamento convencionais. A reação pode acontecer na posição C-3 tendo um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C- 15 modificada com um grupo hidroxila e a posição C-20 tendo um grupo hidroxila. Em uma modalidade, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo de maitansinol. (2) AuRISTATINAS E POLAST ATINAS
Em algumas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado à dolastatina ou um análogo ou derivado peptídico de dolastatina, por exemplo, uma auristatina (Patentes U.S. Nos. 5635483; 5780588). Dolastatinas e auristatinas foram mostradas interferir com dinâmica de microtúbulo, hidrólise de GTP e divisões nuclear e celular (Woyke e outros, Antimicrob. Agents and Chemother, 45(12):3580-3584) e têm atividades anticâncer (Patente U.S. No. 5663149) e antifúngica (Pettit e outros (1998) Antimicrob. Agents Chemother., 42:2961-2965). A porção de fármaco de dolastatina ou auristatina pode ser ligada ao anticorpo através do N-terminal (amino) ou do C-terminal (carboxila) da porção de fármaco peptídica (WO 02/088172).
Modalidades de auristatina exemplares incluem as porções de fármaco monometilauristatina ligadas ao N-terminal DE e DF (US 2005/0238649, descrito em Senter e outros, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, apresentado em 28 de março de 2004, cujo relatório é aqui expressamente incorporado a título de referência em sua totalidade.
Uma porção de fármaco peptídica pode ser selecionada de Fórmulas DE e DF abaixo:
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em que a linha pontilhada de DE e DF indica o sítio de ligação covalente a um anticorpo ou componente ligante de anticorpo, e independentemente em cada local: R2 é selecionado de H e CrCs alquila; R3 é selecionado de H, Ci-C8 alquila, C3-C8 carbociclo, arila, Ci- C8 alquil-arila, CrC8 alquil-(C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo e Ci-C8 alquil- (C3-C8 heterociclo); R4 é selecionado de H, CrC8 alquila, C3-C8 carbociclo, arila, CrC8 alquil-arila, CrC8 alquil-(C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo e Ci-C8 alquil-(C3- C8 heterociclo); R5 é selecionado de H e metila; ou R4 e R5 juntos formam um anel carbocíclico e têm a fórmula - (CRaRb)n- em que Ra e Rb são independentemente selecionados de H, C-|-C8 alquila e C3-C6 carbociclo e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6; R6é selecionado de H e CrC8 alquila; R7 é selecionado de H, Ci-C8 alquila, C3-C8 carbociclo, arila, CrC8 alquil-arila, Ci-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo e CrC8 alquil-(C3- C8 heterociclo); cada R8 é independentemente selecionado de H, OH, C-|-C8 alquila, C3-C8 carbociclo e O-( Ci-C8 alquila); R9 é selecionado de H e Ci-C8 alquila; R10 é selecionado de arila ou C3-C8 heterociclo; Z é O, S, NH ou NR12, em que R12 é Ci-C8 alquila; R11 é selecionado de H, C-i-20 alquila, arila, C3-C8 heterociclo, - (R13O)m-R14 ou -(R13O)m-CH(R15)2; m é um inteiro variado de 1-1000; R13é C2-C8 alquila; R14é H ou Ci-C8 alquila; cada ocorrência de R15 é independentemente H, COOH, -(θH2)n- N(R16)2, -(CH2)n-SO3H ou -(CH2)n-SO3-Ci-C8 alquila; cada ocorrência de R16 é independentemente H, CrC8 alquila ou -(CH2)n-COOH; CrC8 alquila ou - (CH2)n-COOH; R18é selecionado de -C(R8)2-C(R8)2-arila, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 heterociclo) e-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 carbociclo); e n é um inteiro variando de 0 a 6.
Em uma modalidade, R3, R4 e R7 são independentemente isopropila ou sec-butila e R5 é -H ou metila. Em uma modalidade exemplar, R3 e R4são cada um isopropila, R5 é -H e R7 é sec-butila.
Em ainda outra modalidade, R2 e R6 são cada um metila e R9 é - H.
Em ainda outra modalidade, cada ocorrência de R8 é -OCH3.
Em uma modalidade exemplar, R3 e R4 são cada um isopropila, R2 e R6 são cada um metila, R° é -H, R7é sec-butila, cada ocorrência de R8 é - OCH3 e R9 é -H.
Em uma modalidade, Z é -O- ou -NH-.
Em uma modalidade, R10 é arila.
Em uma modalidade exemplar, R10 é fenila.
Em uma modalidade exemplar, quando Z é -O-, R11 é -H, metila ou t-butila.
Em uma modalidade, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é-(CH2)n-N(R16)2 e R16 é-CrC8 alquila ou -(CH2)n-COOH.
Em outra modalidade, quando Z é Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é -(CH2)n-SO3H.
Uma modalidade de auristatina exemplar de fórmula DE é MMAE, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco:
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Uma modalidade de auristatina exemplar de Fórmula DF é MMAF, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco (vide US 2005/0238649 e Doronina e outros
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Outras modalidades exemplares incluem compostos monometilvalina tendo modificações carbóxi fenilalanina no C-terminal da porção de fármaco pentapeptídeo auristatina (WO 2007/008848) e compostos monometilvalina tendo modificações da cadeia lateral fenilalanina no C-terminal da porção de fármaco pentapeptídeo auristatina (WO 2007/008603). 10 Outras porções de fármaco incluem os derivados de MMAF que seguem, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de
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Em um aspecto, grupos hidrofílicos incluindo, mas não limitado a, trietileno glicol ésteres (TEG), conforme mostrado acima, podem ser ligados à porção de fármaco em R11. Sem ser limitado por nenhuma teoria particular, os grupos hidrofílicos auxiliam na internalização e não-aglomeração da porção de fármaco.
Modalidades exemplares de ADCs de Fórmula I compreendendo uma auristatina/dolastatina ou seu derivado são descritas na US 2005-0238649 e Doronina e outros (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124, aqui expressamente incorporados a título de referência. Modalidades exemplares de ADCs de Fórmula I compreendendo MMAE ou MMAF e vários componentes ligantes têm as estruturas e abreviações que seguem (em que "Ab" é um anticorpo; p é 1 a cerca de 8, "Val-Cit" ou "vc" é um dipeptídeo valina-citrulina: e "S" é um átomo de enxofre. Será notado que em certas descrições estruturais de ACD ligado a enxofre aqui o anticorpo é representado como "Ab-S" apenas para indicar a característica de ligação de enxofre e não indicar que um átomo de enxofre particular carrega porções de ligante-fármaco múltiplas. O parênteses à esquerda das estruturas que seguem pode ser também posto à esquerda do átomo de enxofre, entre Ab e S, que seria uma descrição equivalente do ADC da invenção descrito ao longo do presente.
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Modalidades exemplares de ADCs de Fórmula I compreendendo MMAF e vários componentes ligantes incluem ainda Ab-MC-PAB-MMAF e Ab- PAB-MMAF. Interessantemente, imunoconjugados compreendendo MMAF ligado a um anticorpo por urn ligante que não é proteoliticamente clivável foram mostrados possuir atividade comparável a imunoconjugados compreendendo MMAF ligado a um anticorpo através de um ligante proteoliticamente clivável. Vide Doronina e outros (2006) Bioconjugate Chem., 17:114-124. Em tais casos, liberação de fármaco é acreditada ser realizada através de degradação de anticorpo na célula. Id. Tipicamente, porções de fármaco à base de peptídeo podem ser preparadas através de formação de uma ligação peptídeo entre dois ou mais fragmentos de aminoácidos e/ou peptídeo. Tais ligações de peptídeo podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (vide E. Schroder e K. Lübke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo de química de peptídeo. Porções de fármaco auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: US 2005-0238649 A1; Patente U.S. No.5635483; Patente U.S. No.5780588; Pettit e outros (1989), J. Am. Chem. Soc., 111:5463- 5465; Pettit e outros (1998), Anti-Cancer Drug Design, 13:243-277; Pettit, G.R. e outros, Synthesis, 1996, 719-725; Pettit e outros (1996), J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1 5:859-863; e Doronina (2003) Nat. Biotechnol., 21(7):778-784.
Em particular, porções de fármaco auristatina/dolastatina de Fórmula DF, tal como MMAF e seus derivados, podem ser preparadas usando métodos descritos na US 2005-0238649 A1 e Doronina e outros (2006)
Bioconjugate Chem. 17:114-124. Porções de fármaco auristatina/dolastatina de Fórmula DF, tai como MMAE e seus derivados, podem ser preparadas usando métodos descritos em Doronina e outros (2003), Nat. Biotech., 21:778-784. Porções de ligação de fármaco MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF e MC-vc-PAB-MMAE podem ser convenientemente sintetizadas através de métodos de rotina, por exemplo, conforme descrito em Doronina e outros (2003), Nat. Biotech., 21:778-784 e Publicação de Pedido de Patente No. US 2005/0238649 A1, e então conjugadas a um anticorpo de interesse.
(3) CALICHEAMICINA
Em outras modalidades, o imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de calicheamicina. Δ família calicheamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de filamento duplo em concentrações subpicomolares. Para a preparação de conjugados da família calicheamicina, vide Patentes U.S. Nos. Nos. 5.712.374. 5.714.586. 5.739.116. 5.767.285. 5.770.701. 5.770.710. 5.773.001. 5.877.296 (todas da American Cyanamid Company). Análogos estruturais de calicheamicina que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a YÓ O21, O31, N-acetil-Y?, PSAG e θ1! (Hinman e outros, Cancer Research, 53:33363342 (1993), Lode e outros, Cancer Research, 58:2925-2928 (1998) e as Patentes U.S. acima mencionadas para a American Cyanamid). Outro fármaco antitumor ao qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifolato. Ambos a calicheamicina e o QFA têm sítios intracelulares de ação e não cruzam prontamente a membrana palsmática. Desta maneira, absorção celular desses agentes através de internalização mediada por anticorpo aumenta muito seus efeitos citotóxicos.
C. OUTROS AGENTES CITOTÓXICOS
Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados a um anticorpo incluem BCNU, estreptozocina, vincristina e 5-fluoruracila, a família de agentes conhecida coletivamente como complexo LL-E33288, descrita nas Patentes U.S. Nos. 5.053.394, 5.770.710, bem como esperamicinas (Patente U.S. No. 5.877.296).
Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem 5 ser usados incluem cadeia A da difteria, fragmentos ativos de não-ligação da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas Aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de 10 sapaonaría officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina e tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21231 publicado em 28 de outubro de 1993.
A presente invenção refere-se ainda a um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por 15 exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease tal como uma desoxirribonuclease; DNase).
Em certas modalidades, um imunoconjugado pode compreender um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 20 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o imunoconjugado é usado para detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou um marcador giratório para imagem de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagem de ressonância magnética, 25 mri), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio- 15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
Os marcadores rádio ou outros podem ser incorporados ao imunoconjugado de maneiras conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado através de síntese de aminoácido química usando precursores de aminoácido adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores tais como tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser ligados através de um resíduo Cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo lisina. O método IODOGEN (Fraker e outros (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun., 80: 4957) pode ser usado para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.
Em certas modalidades, um imunoconjugado pode compreender um anticorpo conjugado a uma enzima de ativação de pró-fármaco que converte um pró-fármaco (por exemplo, um agente quimioterapêutico peptidila, vide WO 81/01145) em um fármaco ativo, tal como um fármaco anticâncer. Tais imunoconjugados são úteis em terapia de pró-fármaco mediada por enzima dependente de anticorpo ("ADEPT"). Enzimas que podem ser conjugadas a um anticorpo incluem, mas não estão limitadas a, fosfatases alcalinas, que são úteis para conversão de pró-fármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatases, que são úteis para conversão de pró-fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina desaminase, que é útil para conversão de 5-fluorcitosina não-tóxica no fármaco anticâncer, 5-fluoruracila; proteases, tal como protease serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para conversão de pró-fármacos contendo peptídeo em fármacos livres; D- alanilcarboxipeptidases, que são úteis para conversão de pró-fármacos que contêm substituintes D-aminoácido; enzimas de divagem de carboidrato tal como β-galactosidase e neuraminidase, que são úteis para conversão de pró- fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase, que é útil para conversão de fármacos derivatizados com β-lactamas em fármacos livres; e penicilinas amidases, tal como penicilina V amidase e penicilina G amidase, que são úteis para conversão de fármacos derivatizados em suas nitrogênio aminas com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacos livres. Enzimas podem ser covalentemente ligadas a anticorpos através de 5 técnicas de DNA recombinante bem conhecidas no campo. Vide, por exemplo, Neuberger e outros, Nature, 312:604-608 (1984).
D. CARGA DE FÁRMACO
A carga do fármaco é representada por p, o número médio de porções de fármaco por anticorpo em uma molécula de Fórmula I. A carga do 10 fármaco pode variar de a partir de 1 a 20 porções de fármaco (D) por anticorpo. ADCs de Fórmula I incluem coleções de anticorpos conjugados com uma faixa de porções de fármaco, de a partir de 1 a 20. O número médio de porções de fármaco por anticorpo em preparações de ADC de reações de conjugado pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espectroscopia de massa, 15 ensaio ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode ser também determinada. Em alguns casos, separação, purificação e caracterização de ADC homogêneo em que p é um certo valor de ADC com outras cargas de fármaco podem ser obtidas por meios tal como HPLC de fase reversa ou eletroforese. Formulações farmacêuticas de conjugados de 20 anticorpo-fármaco de fórmula I podem então ser uma mistura heterogênea de tais conjugados com anticorpos ligados a 1, 2, 3, 4 ou mais porções de fármaco.
Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Por exemplo, em que a ligação é 25 uma cisteína tiol, como nas modalidades exemplares acima, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos cisteína tiol ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um ligante pode ser ligado. Em certas modalidades, carga de fármaco maior, por exemplo, p>5, pode causar agregação, insolubilidade, toxidez ou perda de permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo-fármaco. Em certas modalidades, a carga de fármaco para um ADC da invenção varia de a partir de 1 a cerca de 8; de a partir de cerca de 2 a cerca de 6; ou de a partir de cerca de 3 a cerca de 5 5. Na verdade, foi mostrado que para certos ADCs, a razão ótima de porções de fármaco por anticorpo pode ser menos do que 8 e pode ser cerca de 2 a cerca de 5. Vide US 2005-0238649 A1.
Em certas modalidades, menos do que o máximo teórico de porções de fármaco é conjugado a um anticorpo durante uma reação de 10 conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos lisina que não reagem com o intermediário fármaco-ligante ou reagente ligante, conforme discutido abaixo. Em geral, anticorpos não contêm muitos grupos cisteína tiol livres e reativos que podem ser ligados a uma porção de fármaco; na verdade a maioria dos resíduos Cisteína tiol em anticorpos existe como pontes dissulfeto.
Em certas modalidades, um anticorpo pode ser reduzido com um agente de redução tal como ditiotreitol ou tricarboniletilfosfina (TCEP), sob condições de redução parcial ou total, para gerar grupos cisteína tiol reativos. Em certas modalidades, um anticorpo é submetido a condições de desnaturação para revelar grupos nucleofílicos reativos tal como lisina ou cisteína.
A carga (razão de fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de maneiras diferentes, por exemplo, através de: (i) limitação do excesso molar de intermediário fármaco-ligante ou reagente ligante com relação a anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura de reação de conjugado e (iii) condições de redução parciais ou limitantes para modificação 25 de cisteína tiol.
Deve ser compreendido que em que mais de um grupo nucleofílico reagir com um intermediário fármaco-ligante ou reagente ligante seguido por reagente de porção de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos de ADC com uma distribuição de uma ou mais porções de fármaco ligadas a um anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura através de um ensaio de anticorpo ELISA duplo, que é específico para anticorpo e específico para o fármaco.
Moléculas de ADC individuais podem ser identificadas na mistura através de espectroscopia de massa e separadas através de HPLC, por exemplo, através de cromatografia de interação hidrofóbica (vide, por exemplo, McDonagh e outros (2006), Prot. Engr. Design & Selection, 19(7):299-307; Hamblett e outros (2004), Clin. Cancer Res., 10:7063-7070; Hamblett, K.J., e outros, "Effect of 10 drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti- CD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de março, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004; Allei, S.C. e outros, "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Abstract No. 627, 15 American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de março, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004). Em certas modalidades, um ADC homogêneo com urn valor de carga único pode ser isolado da mistura de conjugação através de eletroforese ou cromatografia.
E. CERTOS MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE IMUNOCONJUGADOS
Um ADC de Fórmula I pode ser preparado através de várias vias empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos daqueles versados na técnica, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente ligante bivalente para formar Ab-L através de uma ligação covalente, seguido por reação com uma porção de fármaco D; e 25 (2) reação de um grupo nucleofílico de uma porção de fármaco com um reagente ligante bivalente, para formar D-L, através de uma ligação covalente, seguido por reação com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos exemplares para preparação de um ADC de Fórmula I através da última via são descritos na US 2005-0238649 A1, que é expressamente aqui incorporada a título de referência.
Grupos nucleofílicos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral, 5 por exemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, por exemplo, cisteína e (iv) grupos hidroxila ou amino de açúcar em que o anticorpo é glicosilado. Grupos amina, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções de ligante e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como NHS ésteres, HOBt ésteres, 10 haloformiatos e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida. Certos anticorpos têm dissulfetos intercadeia, isto é, pontes de cisteína. Anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes através de tratamento com um agente de redução tal como DTT (ditiotreitol) ou 15 tricarboniletilfosfina (TCEP), de maneira que o anticorpo seja integralmente ou parcialmente reduzido. Cada ponte de cisteína vai então formar, teoricamente, dois nucleófilos tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos através de modificação de resíduos lisina, por exemplo, através da reação de resíduos lisina com 2-iminotiolano (reagente de 20 Traus), resultando em conversão de uma amina em um tiol. Grupos tiol reativos podem ser introduzidos em um anticorpo através de introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos Cisteína (por exemplo, através da preparação de anticorpos variantes compreendendo um ou mais resíduos amino cisteína não- nativos).
Os conjugados anticorpo-fármaco da invenção podem ser também produzidos através da reação entre um grupo eletrofílico e um anticorpo, tal como um grupo aldeído ou carbonil cetona, com um grupo nucleofílico em um reagente ligante ou fármaco. Grupos nucleofílicos úteis em um reagente ligante incluem, mas não estão limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato e aril hidrazida. Em uma modalidade, um anticorpo é modificado para introduzir porções eletrofílicas que são capazes de reação com substituintes nucleofílicos no 5 reagente ligante ou fármaco. Em outra modalidade, os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes de oxidação de periodato, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amina de reagentes ligantes ou porções de fármaco. Os grupos de base Schiff imida resultantes podem formar uma ligação estável ou podem ser reduzidos, 10 por exemplo, através de reagentes de boroidreto para formar ligações amina estáveis. Em uma modalidade, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado ou com galactose oxidase ou meta-periodato de sódio pode dar grupos carbonila (aldeído e cetona) no anticorpo que podem reagir com grupos apropriados no fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra 15 modalidade, os anticorpos contendo resíduos serina ou treonina N-terminais podem reagir com meta-periodato de sódio, resultando em produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan e Stroh, (1992) Bioconjugate Chem., 3:138-146; US 5362852). Tal aldeído pode ser reagido com uma porção de fármaco ou nucleófilo ligante.
Grupos nucleofílicos em uma porção de fármaco incluem, mas não estão limitados a: amina, tiol, hidroxila, hidrazina, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato e grupos aril hidrazida capazes de reação para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos ou porções de ligante e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como NHS ésteres, 25 HOBt ésteres, haloformiatos e haletos ácidos; (ii) haietos de alquila e benzila tais como haloacetamidas; (iii) grupos aldeídos, cetonas, carboxila e maleimida.
Os compostos da invenção compreendem expressamente, mas não estão limitados a, ADC preparado com os reagentes de reticulação que seguem: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo- MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da 5 Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A.; vide páginas 467-498, 2003- 2004, Applications Handbook and Catalog.
Imunoconjugados compreendendo um anticorpo e um agente citotóxico podem ser também feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2- 10 piridiltio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (SMCC), iminotiolato (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCI de dimetil adipimidato), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como gluraldeído), compostos bis-azido (tal como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como 15 bis-(p-diazonilbenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tal com o tolueno 2,6-di- isocianato) e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-diflúor2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta e outros, Science, 238:1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado com carbono 20 14 (MX-DTPA) é um agente de quelação exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026.
Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo e um agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, através de técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo. Uma molécula de DNA 25 recombinante pode compreender regiões codificando o anticorpo e porções citotóxicas do conjugado ou adjacentes umas às outras ou separadas por uma região codificando um peptídeo de ligante que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.
Em ainda outra modalidade, um anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento a tumor em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido por remoção de conjugado não-ligado da circulação usando um agente de eliminação e então administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).
IMUNOCONJUGADOS EXEMPLARES - CONJUGADOS DE ANTICORPO TlO-FÁRMACO A. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B ENGENHEIRADOS COM CISTEÍNA
DNA codificando uma variante de sequência de aminoácido dos anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína e anticorpos anti-CD79b parentais da invenção é preparado através de uma variedade de métodos que incluem, mas não estão limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácido de ocorrência natural), preparação através de mutagênese direcionada a sítio (ou mediada por oligonucleotídeo) (Carter (1985) e outros, Nucleic Acids Res., 13:4431-4443; Ho e outros, (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; Kunkel e outros, (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:488; Liu e outros, (1998) J. Biol. Chem., 273:20252-20260), PCR mutagenesis (Higuchi, (1990) em PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito e outros, (1991) Gene 102:67-70; Bernhard e outros, (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; e Vallette e outros, (1989) Nuc. Acids Res., 17:723-733) mutagênese de cassete (Wells e outros, (1985) Gene, 34:315-323) de um DNA preparado anteriormente codificando o polipeptídeo. Protocolos de mutagênese, estojos e reagentes estão comercialmente disponíveis, por exemplo, QuikChange® Multi Site-Direct Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Mutações simples são também geradas através de mutagênese direcionada a oligonucleotídeo usando DNA de plasmídeo de filamento duplo como mutagênese baseada em PCR molde (Sambrook e Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição; Zoller e outros, (1983) Methods Enzimol. 100:468-500; Zoller, M.J. e Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500). Variantes de anticorpos recombinantes podem ser construídas também através de manipulação de fragmento de restrição ou através de PCR de extensão de sobreposição com oligonucleotídeos sintéticos.
Iniciadores mutagênicos codificam a(s) substituição(ões) de códon de cisteína.Técnicas de mutagênese padrão podem ser empregadas para gerar DNA codificando tais anticorpos engenheirados com cisteína mutantes (Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., 1989; e Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley- Interscience, Nova York, N.Y., 1993).
Tecnologia de exibição de fago (McCafferty e outros, (1990), Nature, 348:552-553) pode ser usada para produzir anticorpos humanos anti- CD79b e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de gene de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não-imunizados. De acordo com esta técnica, genes de domínio V de anticorpo são clonados em estrutura em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibido como fragmentos de anticorpo funcional sobre a superfície da partícula de fago. Devido ao fato da 20 partícula filamentosa conter uma cópia de DNA de filamento simples do genoma de fago, seleções com base nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam em seleção do gene codificando o anticorpo exibindo essas propriedades. Desta maneira, o fago imita algumas das propriedades da célula B (Johnson e outros, (1993), Current Opinion in Structural Biology 3:564-571; Clackson e outros, (1991), Nature, 352:624-628; Marks e outros, (1991), J. Mol. Biol., 222:581-597; Griffith e outros, (1993), EMBO J., 12:725-734; US - 5565332; US 5573905; US 5567610; US 5229275).
Anticorpos anti-CD79b podem ser quimicamente sintetizados usando metodologia de síntese de oligopeptídeo conhecida ou podem ser preparados e purificados usando tecnologia recombinante. A sequência de aminoácido apropriada ou porções da mesma podem ser produzidas através de síntese de peptídeo direta usando técnicas de fase sólida (Stewart e outros, Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969), W.H. Freeman Co., São Francisco, CA; Merrifield, (1963), J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154). Síntese de proteína in vitro pode ser realizada usando técnicas manuais ou através de automação. Síntese de fase sólida automática pode ser realizada, por exemplo, empregando aminoácidos protegidos com t-BOC ou Fmoc e usando um Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) usando as instruções do fabricante. Várias porções do anticorpo anti-CD79b ou polipeptídeo de CD79b podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas usando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o anticorpo anti-CD79b ou polipeptídeo de CD79b.
Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (Morimoto e outros, (1992), Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; e Brennan e outros, (1985), Science, 229:81) ou produzidos diretamente através de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo anti-CD79b Fab, Fv e ScFv podem ser todos expressos em e secretados de E, coli, desta maneira permitindo a produção fácil de quantidades grandes desses fragmentos. Fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas aqui. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter e outros, (1992), Bio/Technology 10:163-167) ou isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. O anticorpo anti-CD79b pode ser um fragmento Fc de cadeia simples (scFv) (WO 93/16185; US 5571894; US. 5587458). O fragmento de anticorpo anti-CD79b pode ser também um "anticorpo linear" (US 5641870). Tais fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
A descrição abaixo refere-se principalmente à produção de anticorpos anti-CD79b através de cultura das células transformadas ou transfectadas com um vetor contendo um ácido nucleico codificando anticorpo antí-CD79b. DNA codificando anticorpos anti-CD79b podem ser obtidos de uma biblioteca de cDNA preparada de tecido acreditado possuir o mRNA de anticorpo anti-CD79b e expressá-lo em um nível detectável. Desta maneira, DNA de anticorpo anti-CD79b humano ou polipeptídeo de CD79b pode ser convenientemente obtido de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido humano. O gene codificando o anticorpo anti-CD79b pode ser também obtido de uma biblioteca genômica ou através de procedimentos sintéticos conhecidos (por exemplo, síntese de ácido nucleico automática).
Os métodos de projeto, seleção e preparação da invenção permitem anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína que são reativos com funcionalidade eletrofílica. Esses métodos permitem ainda compostos conjugados de anticorpo tais como compostos conjugados de anticorpo- fármaco (ADC) com moléculas de fármaco em sítios designados, projetados, seletivos. Resíduos Cisteína reativos em uma superfície de anticorpo permitem conjugação específica de uma porção de fármaco através de um grupo reativo tiol tal como maleimida ou haloacetíla. A reatividade nucleofílica da funcionalidade tiol de um resíduo Cisteína para um grupo maleimida é cerca de 1000 vezes maior comparado com qualquer outra funcionalidade de aminoácido em uma proteína, tal como grupo amino de resíduos lisina ou o grupo amino N-terminal. Funcionalidade específica tiol em reagentes iodoacetila e maleimida pode reagir com grupos amina, mas pH maior (>9,0) e tempos de reação maiores são requeridos (Garman, 1997, Non-Radioactive .í Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres). A quantidade de tiol livre em uma proteína pode ser estimada através do ensaio de Ellman padrão. Imunoglobulina M é um exemplo de um pentâmero ligado a dissulfeto, enquanto a imunoglobulina G é um exemplo de uma proteína com pontes 5 dissulfeto internas ligando as subunidades. Em proteínas tal como esta, redução das ligações dissulfeto com um reagente tal como ditiotreitol (DTT) ou selenol (Singh e outros, (2002), Anal. Biochem. 304:147-156) é requerida para gerar o tiol livre reativo. Esta abordagem pode resultar em perda de estrutura terciária de anticorpo e especificidade de ligação de antígeno.
O ensaio PHESELECTOR (Phage ELISA for Selection of Reactive Tiols) permite a detecção de grupos cisteína reativos em anticorpos em um formato de fago de ELISA desta maneira auxiliando no projeto de anticorpos engenheirados com cisteína (Junutula, J.R. e outros, (2008), J. Immunol. Methods., 332:41-52; WO 2006/034488; US 2007/0092940). O anticorpo 15 engenheirado com cisteína é revestido sobre superfícies de cavidade, seguido por incubação com partículas de fago, adição de anticorpo secundário marcado com HRP e detecção de absorbância. Proteínas mutantes exibidas no fago podem ser avaliadas de uma maneira rápida, robusta e de alto rendimento. Bibliotecas de anticorpos engenheirados com cisteína podem ser produzidas e 20 submetidas à seleção de ligação usando a mesma abordagem para identificar sítios apropriadamente reativos de incorporação de Cys livre a partir de bibliotecas de proteina-fago aleatórias de anticorpos ou outras proteínas. Esta técnica inclui reação de proteínas mutantes de cisteína exibidas em fago com um reagente de afinidade ou grupo repórter que é também tiol-reativo.
O ensaio PHESELECTOR permite avaliação de -grupos tiol reativos em anticorpos. Identificação da variante A121Catravés deste método é exemplar. A molécula de Fab inteira pode ser eficazmente pesquisada para identificar mais variantes TioFab com grupos tiol reativos. Um parâmetro, acessibilidade da superfície fracionai, foi empregado para identificar e quantificar a acessibilidade de solvente para os resíduos de aminoácido em um polipeptídeo. A acessibilidade de superfície pode ser expressa como a área de superfície (Â2) que pode ser contatada por uma molécula de solvente, por 5 exemplo, água. O espaço ocupado de água é aproximado como uma esfera de raio 1,4 Â. Software está disponível grátis ou licenciável (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, Reino Unido, Fax: (+44) 1925 603825 ou pela internet: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) como o CCP4 Suite of crystallography programs que empregam algoritmos para calcular a 10 acessibilidade de superfície de cada aminoácido de uma proteína com coordenadas derivadas de cristalografia de raio X conhecidas ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Cristallography" (1994) Acta. Crist. D50:760-763). Dois módulos de software exemplares que realizam cálculos de acessibilidade de superfície são "AREAIMOL" e "SURFACE", com base nos algoritmos de 15 B.Lee e F.M.Richards (1971) J.Mol.Biol., 55:379-400. O AREAIMOL define a superfície de acessibilidade do solvente de uma proteína como o local do centro de uma esfera de sonda (representando uma molécula de solvente) conforme ela rola sobre a superfície Van der Waals da proteína. AREAIMOL calcula a área de superfície acessível de solvente através da geração de 20 pontos de superfície em uma esfera estendida sobre cada átomo (em uma distância do centro do átomo igual à soma do raio do átomo e da sonda) e eliminação daqueles que se encontram dentro de esferas equivalentes associadas com átomos vizinhos. AREAIMOL encontra a área acessível de solvente de átomos em um arquivo coordenado PDB, e sumariza a área 25 acessível por resíduo, por cadeia e para uma molécula inteira. Áreas acessíveis (ou diferenças de área) para átomos individuais podem ser escritas para um arquivo de saída pseudo-PDB. AREAIMOL supõe um raio único para cada elemento, e apenas reconhece um número limitado de elementos diferentes. AREAIMOL e SURFACE relatam acessibilidades absolutas, isto é, o número de Angstroms quadrados (A). Acessibilidade de superfície fracionai é calculada com referência a um estado padrão relevante para um aminoácido 5 dentro de um polipeptídeo. O estado de referência é tripeptídeo Gly-X-Gly, em que X é o aminoácido de interesse, e o estado de referência deve ser uma conformação 'estendida', isto é, tais como aquelas em filamentos beta. A conformação estendida maximiza a acessibilidade de X. A área acessível calculada é dividida pela área acessível em um estado de referência de 10 tripeptídeo Gly-X-Gly e relata o cociente, que é a acessibilidade fracionai.
Acessibilidade percentual é acessibilidade fracionai multiplicada por 100. Outro algoritmo exemplar para cálculo da acessibilidade de superfície é baseado no módulo SOLV do programa xsae (Broger, C., F. Hoffman-LaRoche, Basel) que calcula acessibilidade fracionai de um resíduo de aminoácido para uma esfera 15 de água com base nas coordenadas de raio X do polipeptídeo. A acessibilidade da superfície fracionai para cada aminoácido em um anticorpo pode ser calculada usando informação de estrutura de cristal disponível (Eigenbrot e outros (1993), J. Mol. Biol., 229:969-995). DNA codificando os anticorpos engenheirados com cisteína é 20 prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino). As células de hibridoma servem como uma fonte de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser posto em vetores de expressão, que são então 25 transfectados em células hospedeirass tais como células de E. coli, células COS simianas, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou outras células hospedeiras de mamífero, tais como células de mieloma (US 5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310) que não produzem de outra maneira a proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.
Após projeto e seleção, anticorpos engenheirados com cisteína, por exemplo, TioFabs, com os resíduos Cys não-emparelhados altamente reativos, engenheirados, "aminoácidos de cisteína livres", podem ser produzidos através de: (i) expressão em um sistema bacteriano, por exemplo, de E. coli (Skerra e outros (1993), Curr. Opinion in Immunol,, 5:256-262; Plückthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188) ou um sistema de cultura de célula de mamífero (WO 01/00245), por exemplo, Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO); e (ii) purificação usando técnicas de purificação de proteína comuns (Lowman e outros (1991), J. Biol. Chem., 266(17):10982- 10988).
Os grupos tióis Cys engenheirados reagem com reagentes ligantes eletrofílicos e intermediários tipo fármaco para formar conjugados de anticorpo engenheirado com cisteína-fármaco e outros anticorpos engenheirados com cisteína marcados. Resíduos Cys de anticorpos engenheirados com cisteína, e presentes nos anticorpos parentais, que são emparelhados e formam ligações dissulfeto intercadeia e intracadeia não têm quaisquer grupos tióis reativos (a menos que tratados com um agente de redução) e não reagem com reagentes ligantes eletrofílicos ou intermediários fármaco-ligante. O resíduo Cys recém-engenheirado pode permanecer não- emparelhado e capaz de reagir com, isto é, conjugado a, um reagente ligante eletrofílico ou intermediário fármaco-ligante. Intermediários fármaco-ligante exemplares incluem: MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE e MC-vc- PAB-MMAF. As posições de estrutura dos resíduos Cys engenheirados das cadeias pesadas e leves são numeradas de acordo com o sistema de numeração sequencial. Este sistema de numeração sequencial está relacionado com o sistema de numeração Kabat (Kabat e outros (1991), t ’
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) começando no N-terminal, difere do esquema de numeração Kabat (fileira inferior) pelas inserções anotadas por a, b, c. Usando o sistema de numeração Kabat, a sequência de aminoácido 5 linear real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondendo a um encurtamento de, ou inserção em, uma FR ou CDR do domínio variável. Os sítios variantes de cadeia pesada engenheirados com cisteína são identificados - pelos esquemas de numeração sequencial e numeração Kabat.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD79b engenheirado com 10 cisteína é preparado através de um processo compreendendo; substituição de um ou mais resíduos de aminoácido de um i anticorpo anti-CD79 parental por cisteína; e determinação da reatividade tiol do anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína através de reação do anticorpo engenheirado com 15 cisteína com um reagente tiol-reativo.
O anticorpo engenheirado com cisteína pode ser mais reativo do que o anticorpo parental com o reagente tiol-reativo.
Os resíduos de aminoácido de cisteína livre podem estar localizados nas cadeias pesadas ou leves ou nos domínios constantes ou 20 variáveis. Fragmentos de anticorpo, por exemplo, Fab, podem ser também engenheirados com um ou mais aminoácidos de cisteína substituindo aminoácidos do fragmento de anticorpo, para formar fragmentos de anticorpo engenheirados com cisteína.
Outra modalidade da invenção provê um método de preparação 25 (fabricação) de um anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína compreendendo: introdução de um ou mais aminoácidos de cisteína em um anticorpo anti-CD79b parental a fim de gerar o anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína; e determinação da reatividade tiol do anticorpo engenheirado com cisteína com um reagente tiol-reativo; em que o anticorpo engenheirado com cisteína é mais reativo do que o anticorpo parental com o reagente tiol-reativo. 5 A etapa (a) do método de preparação de um anticorpo engenheirado com cisteína pode compreender: mutagênese de uma sequência de ácido nucleico codificando o anticorpo engenheirado com cisteína; expressão do anticorpo engenheirado com cisteína; e 10 isolamento e purificação do anticorpo engenheirado com cisteína.
A etapa (b) do método de preparação de um anticorpo engenheirado com cisteína pode compreender expressão do anticorpo engenheirado com cisteína em uma partícula virai selecionada de uma partícula de fago ou fagemídeo.
A etapa (b) do método de preparação de um anticorpo engenheirado com cisteína pode também compreender: reação do anticorpo engenheirado com cisteína com um reagente de afinidade tiol-reativo para gerar um anticorpo engenheirado com cisteína, marcado por afinidade; e 20 medição da ligação do anticorpo engenheirado com cisteína marcado por afinidade a um meio de captura.
Outra modalidade da invenção é um método de avaliação de anticorpos engenheirados com cisteína com aminoácidos de cisteína não- emparelhados, altamente reativos, quanto à reatividade tiol compreendendo: 25 introdução de um ou mais aminoácidos de cisteína em um anticorpo parental a fim de gerar um anticorpo engenheirado com cisteína; reação do anticorpo engenheirado com cisteína com um reagente de afinidade tiol-reativo para gerar um anticorpo engenheirado com cisteína, marcado por afinidade; e medição da ligação do anticorpo engenheirado com cisteína marcado por afinidade a um meio de captura; e determinação da reatividade tiol do anticorpo engenheirado com 5 cisteína com o reagente tiol-reativo.
A etapa (a) do método de avaliação de anticorpos engenheirados com cisteína pode compreender: mutagênese de uma sequência de ácido nucleico codificando o anticorpo engenheirado com cisteína; 10 expressão do anticorpo engenheirado com cisteína; e isolamento e purificação do anticorpo engenheirado com cisteína. A etapa (b) do método de avaliação de anticorpos engenheirados com cisteína pode compreender expressão do anticorpo engenheirado com cisteína em uma partícula virai selecionada de uma partícula de fago ou 15 fagemídeo.
A etapa (b) do método de avaliação de anticorpos engenheirados com cisteína pode também compreender: reação do anticorpo engenheirado com cisteína com um reagente de afinidade tiol-reativo para gerar um anticorpo engenheirado com cisteína, 20 marcado por afinidade; e medição da ligação do anticorpo engenheirado com cisteína marcado por afinidade a um meio de captura.
B. ENGENHARIA COM CISTEÍNA DE VARIANTES DE IGG ANTI-CD79B
Cisteína foi introduzida no sítio 118 da cadeia pesada (numeração 25 EU) (equivalente à posição 118 da cadeia pesada, numeração sequencial) nos anticorpos monoclonais anti-CD79b parentais quiméricos, de comprimento integral, ou no sítio 205 da cadeia leve (numeração Kabat) (equivalente à posição 209 na cadeia leve, numeração sequencial) nos anticorpos monoclonais anti-CD79 monoclonais parentais quiméricos, de comprimento integral, através dos métodos de engenharia com cisteína descritos aqui.
Os anticorpos engenheirados com cisteína em 118 da cadeia pesada (numeração EU) gerados foram: (a) tio-MA79b.v17-HC(A118C) com sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 228) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 229), Figura 14; (b) tio-MA79b.v18-HC(A118C) com sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 230) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 231), Figura 25; (c) tio-MA79b.v28-HC(A118), com sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 232) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 233), Figura 26; (d) tio-MA79b-HC(A118C) com sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 236) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 237), Figura 28; e (e) tio- anti-cinoCD79b-HC(A118C) com sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 244) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 245), Figura 48.
Anticorpos engenheirados com cisteína na cadeia leve 205 (numeração Kabat) gerados foram: (a) tio-MA79b-LC(V205C) com sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 234) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 235), Figura 27 e (b) tio-anti-cinoCD79b(ch10D10)-LC(V205C) com sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 299) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 300), Figura 49.
Esses anticorpos monoclonais engenheirados com cisteína foram expressos em células CHO (Ovário de Hamster Chinês) através de fermentação transiente em meios contendo cisteína 1 mM.
De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína MA79b humanizados compreendem uma ou mais das sequências de cadeia pesada que seguem com um aminoácido de cisteína livre (SEQ ID NOs: 251-259, Tabela 2). TABELA 2: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÕES SEQUENCIAL, KABAT E EU DE CADEIA PESADA PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B ENGENHEIRADO COM CISTEÍNA MA79B HUMANIZADO
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De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína MA79b quiméricos compreendem uma ou mais das sequências de cadeia pesada que seguem com um aminoácido de cisteína 5 livre (SEQ ID NOs: 260-268, Tabela 3). TABELA 3: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÕES SEQUENCIAL, KABAT E EU DE CADEIA PESADA PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B ENGENHEIRADO' COM CISTEÍNA CHMA79B
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De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína anti-cinoCD79b(ch10D10) compreendem uma ou mais das sequências de cadeia pesada que seguem com um aminoácido de cisteína livre (SEQ ID NOs: 269-277, Tabela 4). 5 TABELA 4: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÕES SEQUENCIAL, KABAT E EU DE CADEIA PESADA PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B ENGENHEIRADO COM
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De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína MA79b humanizados compreendem uma ou mais das sequências de cadeia leve que seguem com um aminoácido de cisteína livre (SEQ ID NOs: 278-284, Tabela 5). TABELA 5: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÕES SEQUENCIAL E KABAT DE CADEIA LEVE PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B ENGENHEIRADO COM CISTEÍNA
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De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína MA79b quiméricos compreendem uma ou mais das sequências de cadeia leve que seguem com um aminoácidos de cisteína livre (SEQ ID NOs: 285-291, Tabela 6). 10 TABELA 6: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÕES SEQUENCIAL E KABAT DE CADEIA LEVE PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTHCD79B ENGENHEIRADO COM CISTEÍNA MA79B QUIMÉRICO
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De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína anti-cinoCD79b(ch10D10) compreendem uma ou mais das sequências de cadeia leve que seguem com um aminoácido de cisteína livre (SEQ ID NOs: 292-298, Tabela 7). 5 TABELA 7: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÕES SEQUENCIAL E KABAT DE CADEIA LEVE PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B ENGENHEIRADO COM CISTEÍNA ANTI- CINOCD79B(CH10D10)
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C. ANTICORPOS ANTI-CD79B ENGENHEIRADOS COM CISTEÍNA MARCADOS
Anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína podem ser 10 acoplados especificamente em sítio e eficientemente com um reagente tiol- reativo. O reagente tiol-reativo pode ser um reagente ligante multifuncional, um reagente marcador de captura, isto é, afinidade (por exemplo, um reagente biotina-ligante), um marcador de detecção (por exemplo, um reagente fluoróforo), um reagente de imobilização de fase sólida (por exemplo, SEPHAROSE®, poliestireno ou vidro) ou um intermediário fármaco-ligante. Um exemplo de um reagente tiol-reativo é N-etil maleimida (NEM). Em uma modalidade exemplar, uma reação de um TioFab com um reagente biotina- ligante provê um TioFab biotinilado através do qual a presença e a reatividade do resíduo Cisteína engenheirado podem ser detectadas e medidas. Reação de um TioFab com um reagente ligante multifuncional provê um TioFab com um ligante funcionalizado que pode ser reagido mais com um reagente de porção de fármaco ou outro marcador. Reação de um TioFab com um intermediário fármaco-ligante provê um conjugado TioFab-fármaco.
Os métodos exemplares descritos aqui podem ser aplicados geralmente à identificação e à produção de anticorpos e, mais geralmente, a outras proteínas através da aplicação das etapas de projeto e avaliação descritas aqui. Tal abordagem pode ser aplicada à conjugação de outros reagentes tiol-reativos em que o grupo reativo é, por exemplo, uma maleimida, uma iodoacetamida, um dissulfeto de piridina ou outro par de conjugação tiol- reativo (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem., 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. , 1:2; Hermanson, G. em Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, São Diego, pp. 40-55, 643-671). O reagente tiol-reativo pode ser uma porção de fármaco, um fluoróforo tal como um corante fluorescente tal como fluoresceína ou rodamina, um agente de quelação para um metal de imagem ou radioterapêutico, um marcador de peptidila ou não-peptidila ou tag de detecção ou um agente de modificação de eliminação tais como vários isômeros de polietileno glicóis, um peptídeo que se liga a um terceiro componente ou outro carboidrato ou agente lipofílico.
D. Usos DE ANTICORPOS ANTI-CD79B ENGENHEIRADOS COM CISTEÍNA
Anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína e seus conjugados podem encontrar uso como agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico. A presente invenção provê ainda métodos de prevenção, tratamento ou melhora de um ou mais sintomas associados a um distúrbio relacionado com célula B. Em particular, a presente invenção provê métodos 10 de prevenção, tratamento ou melhora de um ou mais sintomas associados a um distúrbio proliferativo celular, tal como câncer, por exemplo, linfoma, Linfoma Não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de 15 célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto. A presente invenção provê ainda métodos para diagnóstico de um distúrbio relacionado com CD79b ou predisposição ao desenvolvimento de tal distúrbio, bem como métodos para identificação de anticorpos, e fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos, que preferivelmente se ligam a polipeptídeos 20 de CD79b associados à célula B. Outra modalidade da presente invenção refere-se ao uso de um anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína para a preparação de um medicamento útil no tratamento de uma condição que é responsiva a um distúrbio relacionado com célula B.
E. CONJUGADOS DE ANTICORPO ENGENHEIRADO COM CISTEÍNA-FÁRMACO (CONJUGADOS DE ANTICORPO TIO-FÁRMACO) (TDCS))
Outro aspecto da invenção é um composto conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo anti-OD79b engenheirado com cisteína (Ab) e uma porção de fármaco auristatina (D) em que o anticorpo engenheirado com cisteína é ligado através de um ou mais aminoácidos de cisteína livre por uma porção ligante (L) a D; o compostos tendo a Fórmula I: Ab-(L-D)-P I em que p é 1,2, 3 ou 4; e em que o anticorpo engenheirado com cisteína é preparado através de um processo compreendendo substituição de um ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo anti-CD79b parental por um ou mais aminoácidos de cisteína livre.
Outro aspecto da invenção é uma composição compreendendo uma mistura de compostos anticorpo-fármaco de Fórmula I em que a carga de fármaco média por anticorpo é cerca de 2 a cerca de 5 ou cerca de 3 a cerca de 4.
As Figuras 24-28 e 48-49 mostram modalidades de conjugados anticorpo anti-CD79b engenheirados com cisteína-fármaco (ADC) em que uma porção de fármaco auristatina é ligada a um grupo cisteína engenheirado na: cadeia leve (LC-ADC) ou cadeia pesada (HC-ADC).
Vantagens potenciais de conjugados de anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína -fármaco incluem segurança aperfeiçoada (índice terapêutico maior), parâmetros de PK aperfeiçoados, as ligações dissulfeto intercadeia do anticorpo são retidas, as quais podem estabilizar o conjugado e reter sua conformação de ligação ativa, os sítios de conjugação de fármaco são definidos e a preparação de conjugados de anticorpo engenheirado com cisteína-fármaco a partir da conjugação de anticorpos engenheirados com cisteína com reagentes ligantes de fármaco resulta em um produto mais homogêneo. LIGANTES "Ligante", "Unidade Ligante" ou "ligação" significa uma porção química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que liga covalentemente um anticorpo a uma porção de fármaco. Em várias modalidades, um ligante é especificado como L. Um "Ligante" (L) é uma porção bifuncional ou multifuncional que pode ser usada para ligar uma ou mais porções de Fármaco (D) e uma unidade de anticorpo (Ab) para formar conjugados anticorpo-fármaco (ADC) de Fórmula I. Conjugados de anticorpo- 5 fármaco (ADC) podem ser convenientemente preparados usando um ligante tendo funcionalidade reativa para ligação ao fármaco e ao Anticorpo. Uma cisteína tiol de um anticorpo engenheirado com cisteína (Ab) pode formar uma ligação com um grupo funcional eletrofílico de um reagente ligante, uma porção de fármaco ou intermediário fármaco-ligante.
Em um aspecto, um ligante tem um sítio reativo que tem um grupo eletrofílico que é reativo para uma cisteína eletrofílica presente em um anticorpo. A cisteína tiol do anticorpo é reativa com um grupo eletrofílico em um ligante e forma uma ligação covalente com um ligante. Grupos eletrofílicos úteis incluem, mas não estão limitados a, grupos maleimida e haloacetamida. 15 Ligantes incluem um radical divalente tal como uma alquildiila, um arileno, um heteroarileno, porções tais como: -(CR2)nO(CR2)n-> unidades de repetição de alquilóxi (por exemplo, polietilenoóxi, PEG, polimetilenoóxi) e alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine®); e éster diácido e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida. 20 Anticorpos engenheirados com cisteína reagem com reagentes ligantes ou intermediários tipo ligante, com grupos funcionais eletrofílicos tal como maleimida ou a-halo carbonila, de acordo com o método de conjugação na página 766 de Klussman e outros (2004), Bioconjugate Chemistry, 15(4):765-773 e de acordo com o protocolo do Exemplo 6. 25 O ligante pode ser composto de um ou mais componentes ligantes. Componentes ligantes exemplares incluem 6-maleimidocaproíla ("MC"), maleimidopropanoíla ("MP"), valina-citrulina ("Val-cit" uu "vc"), alanina- fenilalanina ("ala-phe" ou "af"), p-aminobenziloxicarbonila ("PAB"), N- succinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoato ("SPP"), N-succinimidil 4-(N- maleimidometil) ciclo-hexano-1 carboxilato ("SMCC"), N-succinimidil (4-iodo- acetil) aminobenzoato ("SIAB"), etilenoóxi -CH2CH2O- como uma ou mais unidades de repetição ("EO" ou "PEO"), Componentes ligantes adicionais são 5 conhecidos na técnica e alguns são descritos aqui.
Em uma modalidade, ligante L de um ADC tem a fórmula: Aa Ww Yy— em que: -A- é uma unidade Extensora covalentemente ligada a uma cisteína tiol do anticorpo (Ab); 10 a é 0 ou 1; cada -W- é independentemente uma unidade de Aminoácido; w é independentemente um inteiro variando de 0 a 12; -I- é uma unidade Espaçadora covalentemente ligada à porção de fármaco; e 15 y é 0, 1 ou 2.
UNIDADE DE EXTENSORA
A unidade extensora (-A-), quando presente, é capaz de ligar uma unidade de anticorpo a uma unidade de aminoácido (-W-). Com relação a isso, um anticorpo (Ab) tem um grupo funcional que pode formar uma ligação com 20 um grupo funcional de um Extensor. Grupos funcionais úteis que podem estar presentes em um anticorpo, ou naturalmente ou através de manipulação química, incluem, mas não estão limitados a, sulfidrila (-SH), amino, hidroxila, carbóxi, ou grupo hidroxila anomérico de um carboidrato e carboxila. Em um aspecto, os grupos funcionais de anticorpo são sulfidrila ou amino. Grupos 25 sulfidrila podem ser gerados através da redução de uma ligação dissulfeto intramolecular de um anticorpo. Alternativamente, grupos sulfidrila podem ser gerados através de reação de um grupo amino de uma porção lisina de um anticorpo usando 2-íminotiolano (reagente de Traut) ou outro reagente de geração de sulfidrila. Em uma modalidade, um anticorpo (Ab) tem um grupo cisteína tiol livre que pode formar uma ligação com um grupo funcional eletrofílico de uma unidade de Extensão. Unidades de extensão exemplares em conjugados de Fórmula I são mostradas pelas Fórmulas II e III, em que Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme acima definido, e R17 é um radical divalente selecionado de Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme acima definido e R17 é um radical divalente selecionado de (CH2)r, C3-C8 carbociclila, O-(CH2)r, arileno, (CH2)r-arileno, -arileno-(CH2)r-, (CH2)r-(C8-C8 carbociclila), (C8-Cg carbociclila)-(CH2)r, Cg-C8 heterociclila, (CH2)r-(Cg-C8 heterociclila), -(C8-C8 heterociclila)-(CH2)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-, -(CH2CH2O)r- -(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2 , -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2- e -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r- ; em que Rb é H, CrC6 alquila, fenila ou benzila; e ré independentemente um inteiro variando de 1-10.
Arileno inclui radicais hidrocarbono aromáticos divalentes de 6-20 átomos de carbono derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do sistema de anel aromático. Grupos arileno típicos incluem, mas não estão limitados a, radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenila e similar.
Grupos heterociclila incluem um sistema de anel em que um ou mais átomos do anel são um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, oxigênio e enxofre. O radical heterociclo compreende 1 a 20 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S. Um heterociclo pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S) ou um biciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S), por exemplo, um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. Heterociclos são descritos em Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nova York, 1968), particularmente Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series 5 of Monographs" (John Wiley & Sons, Nova York, 1950 até o presente), em particular Volumes 13, 14, 16,19 e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960), 82:5566.
Exemplos de heterociclos incluem a título de exemplo e não limitação piridila, di-hidroipiridila, tetra-hidropiridil (piperidila), tiazolila, tetra- hidrotiofenila, tetra-hidrotiofenila oxidada por enxofre, pirimidinila, furaníla, 10 tienila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tetrazolila, benzofuranila, tianaftalenila, indolila, indolenila, quinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, piperidinila, 4- piperidonila, pirrolidinila, 2-pirrolidonila, pirrolinila, tetra-hidrofuranila, bis-tetra- hidrofuranila, tetra-hidropiranila, bis-tetra-hidropiranila, tetra-hidroquinolinila, tetra-hidroisoquinolinila, decaidroquinolinila, octaidroisoquinolinila, azocinila, 15 triazinila, 6H-1,2,5-tiadiazinila, 2H,6H-1,5,2-ditiazinila, tienila, tiantrenila, piranila, isobenzofuranila, cromenila, xantenila, fenoxatinila, 2H-pirrolila, isotiazolila, isoxazolila, pirazinila, piridazinila, indolizinila, isoindolila, 3H-indolila, 1H-indazolila, purinila, 4H-quinolizinila, fthalazinila, naftiridinila, quinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, pteridinila, 4Ah-carbazolila, carbazolila, β-carbolinila, 20 fenantridinila, acridinila, pirimidinila, fenantrolinila, fenazinila, fenotiazinila, furazanila, fenoxazinila, isocromanila, cromanila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pirazolinila, piperazinila, indolinila, isoindolinila, quinuclidinila, morfolinila, oxazolidinila, benzotriazolila, benzisoxazolila, oxindolila, benzoxazolinila e isatinoila.
Grupos carbocíclicos incluem um anel saturado ou insaturado tendo 3 a 7 átomos de carbono como um monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono como urn biciclo. Carbociclos monocíclicos têm 3 a 6 átomos no anel, mais tipicamente ainda 5 ou 6 átomos no anel. Carbociclos bicíclicos têm 7 a 12 átomos no anel, por exemplo, dispostos como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6] ou 9 ou 10 átomos no anel dispostos como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6]. Exemplos de carbociclos monocíclicos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, 1-ciclopent-1-enila, 1-ciclopent-2-enila, 1-ciclopent-3- 5 enila, ciclo-hexila, 1-ciclo-hex-1-enila, 1-ciclo-hex-2-enila, 1-ciclo-hex-3-enila, cicloeptila e ciclooctila.
Deve ser compreendido de todas as modalidades exemplares de ADC de Fórmula I tais como ll-VI que mesmo, em que não expressamente indicado, de 1 a 4 porções de fármaco são ligadas a um anticorpo (p = 1-4), 10 dependendo do número de resíduos Cisteína engenheirados.
Figure img0062
Uma unidade extensora de Fórmula II ilustrativa é derivada de
Figure img0063
Uma unidade extensora ilustrativa de Fórmula I é derivada de maleimido-propanoíla (MP) em que R17 é -(CH2)2-:
Figure img0064
Outra unidade extensora ilustrativa de Fórmula II em que R17 é - (CH2CH2O)r-CH2- e r é 2:
Figure img0065
Outra unidade extensora ilustrativa de Fórmula Il em que R17 é -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O),-CH2-, em que R' é H e cada ré 2:
Figure img0066
MPEG
Uma unidade extensora ilustrativa de Fórmula III em que R17 é -
Figure img0067
Em outra modalidade, a unidade extensora é ligada ao anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína através de uma ligação dissulfeto entre o átomo de enxofre engenheirado com cisteína do anticorpo e um átomo de enxofre da unidade extensora. Uma unidade extensora representativa da presente modalidade é mostrada pela Fórmula IV, em que R17, Ab-, -W-, -Y-, - D, w e y são conforme acima definido.
Figure img0068
Em ainda outra modalidade, o grupo reativo do extensor contém um grupo funcional tiol-reativo que pode formar uma ligação com uma tiol cisteína livre de um anticorpo. Exemplos de grupos funcionais de reação tiol incluem, mas não estão limitados a, maleimida, ct-haloacetila, ésteres ativos tais como succinimidil ésteres, 4-nitrofenil ésteres, pentafluorfenil ésteres, tetrafluorfenil ésteres, anidridos, cloretos ácidos, cloretos de sulfonila, isocianatos e isotiocianatos. Unidades de Extensão representativas da presente modalidade são mostradas pelas Fórmulas Va e Vb, em que -R17-, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme acima definido;
Figure img0069
Em outra modalidade, o ligante pode ser um ligante do tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma porção de fármaco através de uma porção de ligante multifuncional, de ramificação, a um anticorpo (Sun e outros (2002), Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun e outros (2003), Bioorganic & Medicinal Chemistry, 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters, 43:1987-1990). Ligantes dendríticos podem aumentar a razão molar de fármaco para anticorpo, isto é, carga, que está relacionada com a potência do ADC. Desta maneira, em que um anticorpo engenheirado com cisteína carregar apenas um grupo cisteína tiol reativo, uma pluralidade de porções de fármaco pode ser ligada através de um ligante dendrítico.
UNIDADE DE AMINOÁCIDO
O ligante pode compreender resíduos de aminoácido. A unidade de aminoácido (-Ww-), quando presente, liga o anticorpo (Ab) à porção de fármaco (D) do conjugado anticorpo engenheirado com cisteína-fármaco (ADC) da invenção. -Ww- é uma unidade dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo, undecapeptídeo ou dodecapeptídeo. Resíduos de aminoácido que compreendem a unidade de Aminoácido incluem aqueles de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácido de ocorrência não-natural, tal como citrulina. Cada unidade -W- tem independentemente a fórmula mostrada abaixo nos colchetes e w é um inteiro 5 variando de 0 a 12;
Figure img0070
em que R19 é hidrogênio, metila, isopropila, isobutila, sec-butlia, benzila, p-hidroxibenzila, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, - CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, - (CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, - 10 (CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, - (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetila-, 3-piridilmetila-, 4- piridilmetila-, fenila, ciclo-hexila,
Figure img0071
Quando R19 é outro que não hidrogênio, o átomo de carbono ao qual R19 está ligado é quiral. Cada átomo de carbono ao qual R19 está ligado 15 está independentemente na configuração (S) ou (R) ou uma mistura racêmica.
Unidades de aminoácidos podem então ser enantiomericamente puras, racêmicas ou diastereoméricas.
Unidades de Aminoácido -Ww- exemplares incluem um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplares incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Tripeptídeos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácido que compreendem um componente ligante de aminoácido incluem aqueles de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácido de ocorrência não- natural, tal como citrulina.
A unidade de Aminoácido pode ser enzimaticamente clivada por uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a tumor, para liberar a porção de Fármaco (-D), que em uma modalidade é protonada in vivo quando da liberação para prover um Fármaco (D). Componentes ligantes de aminoácido podem ser projetados e otimizados em sua seletividade para clivagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsinas B, C e D ou uma plasmino protease.
UNIDADE ESPAÇADORA
A unidade espaçadora (-Yy-), quando presente (y = 1 ou 2), liga uma unidade de Aminoácido (-Ww-) à porção de fármaco (D) quando uma unidade de Aminoácido está presente (w = 1-12). Alternativamente, a unidade espaçadora liga a unidade extensora à porção de fármaco quando a unidade de aminoácido está ausente. A unidade espaçadora também liga a porção de fármaco à unidade de anticorpo quando ambas a unidade de aminoácido e a unidade de extensão estão ausentes (w, y = 0). Unidades espaçadoras são de dois tipos gerais: Auto-imolativas e não-auto-imolativas. Uma unidade espaçadora não-auto-imolativa é uma em que parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada à porção de fármaco após clivagem, particularmente enzimática, de uma unidade de aminoácido do conjugado anticorpo-fármaco ou da porção de fármaco-ligante. Quando um ADC contendo uma unidade espaçadora glicina-glicina ou uma unidade espaçadora glicina sofre clivagem enzimática através de uma protease associada á célula de 5 tumor, uma protease associada à célula de câncer ou uma protease associada a linfócito, uma glicina-glicina-porção de fármaco ou uma glicina-porção de fármaco é clivada de Ab-Aa-Ww-. Em uma modalidade, uma reação de hidrólise independente acontece dentro da célula-alvo, clivando a ligação glicina-porção de fármaco e liberando o fármaco.
Em outra modalidade, -Yy- é uma unidade p- aminobenzilcarbamoíla (PAB) cuja porção fenileno é substituída com Qm em que Q é Ci-C8 alquila, -O-(Ci-C9 alquila), -halogênio, -nitro ou -ciano; e m é um inteiro variando de 0-4.
Modalidades exemplares de uma unidade Espaçadora auto- 15 imolativa (-Y-) são: -Gly-Gly-; -Gly-; -Ala-Phe; -Val-Cit-,
Em uma modalidade, uma porção de Fármaco-ligante ou um ADC é provido em que a unidade Espaçadora está ausente (y=o) ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo. Alternativamente, um ADC contendo uma unidade espaçadora 20 auto-imolativa pode liberar-D. Em uma modalidade, -Y- é um grupo PAB que é ligado a -Ww- através do átomo de nitrogênio amino do grupo PAB e conectado diretamente a -D através de um grupo carbonato, carbamato ou éter, em que o ADC tem a estrutura exemplar:
Figure img0072
em que Q é -Ci-C8 alquila, -O-(Ci-C8 alquila), -halogênio, -nitro 25 ou -ciano; m é um inteiro variando de 0-4; e p varia de 1 a 4.
Outros exemplos de espaçadores auto-imolativos incluem, mas não estão limitados a, compostos aromáticos que são eletronicamente similares ao grupo PAB tais como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay e outros (1999), Bioorg. Med. Chem. Lett., 9:2237), análogos de PAB 5 heterocíclicos (US 2005/0256030), beta-glucuronida (WO 2007/011968) e orto ou para-aminobenzilacetais. Espaçadores podem ser usados, os quais sofrem ciclização quando da hidrólise da ligação amida, tais como amidas do ácido 4- aminobutírico substituídas e não-substituídas (Rodrigues e outros (1995), Chemistry Biology, 2:223), sistemas de anel biciclo[2.2.1 ] e biciclo[2.2.2] 10 apropriadamente substituídos (Storm e outros (1972), J. Amer. Chem. Soc., 94:5815) e amidas do ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry e outros (1990), J. Org. Chem., 55:5867). Eliminação de fármacos contendo amina que são substituídos em glicina (Kingsbury e outros (1984), J. Med. Chem., 27:1447) são também exemplos de espaçador auto-imolativo útil em ADCs.
Unidades espaçadoras exemplares (-Yy-) são representadas pelas Fórmulas X-XII:
Figure img0073
LIGANTE DENDRÍTICOS
Em outra modalidade, o ligante L pode ser um ligante do tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma porção de fármaco através 20 de uma porção ligante multifuncional, de ramificação, a um anticorpo (Sun e outros (2002), Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 12:2213-2215; Sun e outros (2003), Bioorganic & Medicinal Chemistry, 11:1761-1768). Ligantes dendríticos podem aumentar a razão molar do fármaco para anticorpo, isto é, carga, que está relacionada com a potência do ADC. Desta maneira, em que um anticorpo engenheirado com cisteína carregar apenas um grupo cisteína tiol reativo, uma pluralidade de porções de fármaco pode ser ligada através de um 5 ligante dendrítico. Modalidades exemplares de ligantes dendríticos, ramificados, incluem 2,6-bis(hidroximetil)-p-cresol e unidades de dendrímero de (2,4,6-tris(hidroximetil)-fenol (WO 2004/01993; Szalai e outros (2003), J. Amer. Chem. Soc., 125:15688-15689; Shamis e outros (2004), J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amire outros (2003), Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499).
Em uma modalidade, a unidade espaçadora é bis(hidroximetil)estireno ramificado (BHMS), que pode ser usado para incorporar e liberar fármacos múltiplos, tendo a estrutura:
Figure img0074
compreendendo uma unidade de dendrímero 2-(4- aminbenzilideno)propano-1,3-diol (W02004/043493; de Groot e outros (2003) 15 Angew. Chem. Int. Ed,, 42:4490-4494), em que Q é -Ci-C8 alquila, -O-(Ci-C8 alquila), -halogênio, -nitro ou -ciano; m é um inteiro variando de 0-4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a 4.
Modalidades exemplares dos compostos de conjugado anticorpo- fármaco de Fórmula I incluem Xllla (MC), Xlllb (val-cit), Xlllc (MC-val-cit) e Xllld 20 (MC-val-cit-PAB):
Figure img0075
Figure img0076
Outras modalidades exemplares dos compostos de conjugado anticorpo-fármaco da Fórmula la incluem XIVa-e:
Figure img0077
Figure img0078
e R é independentemente H ou CvCβ alquila; e n é 1 a 12.
Em outra modalidade, urn ligante tem um grupo funcional reativo que tem um grupo nucleofílico que é reativo a um grupo eletrofílico presente 5 em um anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis em um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, grupos carbonila aldeído e cetona. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de um ligante pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente com uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis em um ligante incluem, mas não estão limitados a, 10 hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e arilidrazida. O grupo eletrofílico em um anticorpo provê um sítio conveniente para ligação a um ligante.
Tipicamente, ligantes tipo peptídeo podem ser preparados formando uma ligação de peptídeo entre dois ou mais fragmentos de 15 aminoácidos e/ou peptídeo. Tais ligações de peptídeo podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (E. Schrõder e K. Lübke (1965) "The Peptides”, volume 1, pp 76-136, Academic Press) que é bem conhecido no campo de química de peptídeo. Intermediários ligantes podem ser montados com qualquer combinação ou sequência de reações incluindo unidades espaçadores, de extensão e de aminoácido. As unidades espaçadora, de extensão e de aminoácido empregam grupos funcionais reativos que são de natureza eletrofílica, nucleofílica ou de radical livre. Grupos funcionais reativos incluem, mas não estão limitados a, grupos carboxilas, hidroxilas, paranitrofenilcarbonato, isotiocianato e de saída, tal como O-mesila, O-tosila, -Cl, -Br, -I; ou maleimida.
Por exemplo, um substituinte carregado tal como sulfonato (-SO3') ou amónio pode aumentar a solubilidade em água do reagente e facilitar a reação de acoplamento do reagente ligante com o anticorpo ou a porção de fármaco ou facilitar a reação de acoplamento de Ab-L (intermediário anticorpo- ligante) com D ou D-L (intermediário fármaco-ligante) com Ab, dependendo da via sintética empregada para preparar ADC.
REAGENTES LIGANTES
Conjugados do anticorpo e auristatina podem ser feitos usando uma variedade de reagentes ligantes bifuncionais tais como N-succinimidil-3- (2-piridiltio)propionato (SPDP), ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N- maleimidometila) (SMCC), iminotiolato (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCI de dimetil adipimato), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutareldeído), compostos bis- azido (tal como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tal como tolueno-2,6-di-isocianato) e compostos flúor bis-ativos (tal como 1,5-diflúor2,4- dinitrobenzeno).
Os conjugados de anticorpo-fármaco podem ser também preparados com reagentes ligantes: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo- GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfono)benzoato) e incluindo reagentes de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-bis-maleimidodietilenoglicol (BM(PEO)2) e 1,11-bis-maleimidotrietilenoglicol (BM(PEO)3), que estão comercialmente disponíveis da Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, e outros fornecedores de reagente. Reagentes bis-maleimida permitem a ligação do grupo tiol de um anticorpo engenheirado com cisteína a uma porção de fármaco contendo tiol, marcador ou intermediário ligante, de uma maneira sequencial ou concomitante. Outros grupos funcionais além da maleimida, que são reativos com um grupo tiol de um anticorpo engenheirado com cisteína, porção de fármaco, marcador ou intermediário ligante incluem iodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridína, dissulfeto, dissulfeto de piridila, isocianato e isotiocianato.
Figure img0079
Reagentes ligantes úteis podem ser também obtidos através de outras fontes comerciais, tal como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), ou sintetizados de acordo com procedimentos descritos em Toki e outros (2002), J. Org. Chem., 67:1866-1872; Walker, MA (1995) J. Org. Chem., 60:53525355; Frisch e outros (1996), Bioconjugate Chem., 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; and WO 04/032828.
Extensores de fórmula (llla) podem ser introduzidos em um ligante através de reação dos reagentes ligantes que seguem com o N-terminal de uma unidade de Aminoácido:
Figure img0080
em que n é um inteiro variando de 1-10 e T é-H ou -SO3Na;
Figure img0081
em que n é um inteiro variando de 0-3;
Figure img0082
Unidades de extensão podem ser introduzidas em um ligante através da reação dos reagentes bifuncionais que seguem com o N-terminal de uma unidade de Aminoácido:
Figure img0083
Unidades extensoras de fórmula podem ser também introduzidas em um ligante através de reação dos reagentes bifuncionais que seguem com o N-terminal de uma unidade de Aminoácido:
Figure img0084
Um reagente ligante de dipeptideo valina-citrulina (Val-cit ou vc) exemplar tendo uma Extensão maleimida e um espaçador para- aminobenzilcarbamoila (PAB) auto-imolativo tem a estrutura:
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Um reagente ligante de dipeptideo phe-lys(Mtr, mono-45 metoxitritila) exemplar tendo uma unidade de extensão maleimida e uma unidade espaçadora auto-imolativa PAB pode ser preparado de acordo com Dubowchik e outros (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60, e tem a estrutura:
Figure img0086
PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO ANTI-CD79B ENGENHEIRADO COM CISTEÍNA-FÁRMACO
O ADC de Fórmula I pode ser preparado através de várias vias, empregando reações, condições e reagentes de química orgânica conhecidos daqueles versados na técnica incluindo: (1) reação de um grupo cisteína de um anticorpo engenheirado com cisteína com um reagente ligante, para formar intermediário anticorpo-ligante Ab-L, através de uma ligação covalente, seguido por reação com uma porção de fármaco ativada D; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma porção de fármaco com um reagente ligante para formar intermediário fármaco-ligante D-L, através de ligação covalente, seguido por reação com um grupo cisteína de um anticorpo engenheirado com cisteína. Os métodos de conjugação (1) e (2) podem ser empregados com uma variedade de anticorpos engenheirados com cisteína, porções de fármaco e ligantes para preparar os conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula I.
Grupos cisteína tiol de anticorpo são nucleofílicos e capazes de reação para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em reagentes ligantes e intermediários fármaco-ligante incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos e haletos ácidos; (ii) haletos e alquila e benzila, tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida; e (iv) dissulfetos, incluindo dissulfetos de piridila, através de troca de sulfeto. Grupos nucleofílicos em uma porção de fármaco incluem, mas não estão limitados a: grupos amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e arilidrazina capazes de reação para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções ligantes e reagentes ligantes.
Anticorpos engenheirados com cisteína podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes através de tratamento com um agente de redução tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou TCEP cloridrato de (tris(2-carboxietil)fosfina; Getz e outros (1999) Anal. Biochem., Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA), seguido por reoxidação para formar ligações dissulfeto intercadeia e intracadeia (Exemplo 5). Por exemplo, anticorpos monoclonais engenheirados com cisteína, de comprimento integral (TioMabs) expressos em células CHO, são reduzidos com um excesso molar de cerca de 50 vezes de TCEP por 3 horas a 37° C para reduzir ligações dissulfeto em adutos de cisteína que podem se formar entre os resíduos de cisteína recém-introduzidos e a cisteína presente nos meios de cultura. O TioMab reduzido é diluído e carregado em coluna HiTrap S em acetato de sódio 10 mM, pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio 0,3M. Ligações dissulfeto foram restabelecidas entre resíduos Cisteína presentes no Mab parental com sulfato de cobre aquoso diluído (200 nM) (CuSO4) em temperatura ambiente, da noite para o dia. Alternativamente, ácido desidroascórbico (DHAA) é um oxidante eficaz para restabelecer os grupos dissulfeto intercadeia do anticorpo engenheirado com cisteína após clivagem redutiva dos adutos de cisteína. Outros oxidantes, isto é, agentes oxidantes, e condições de oxidação, que são conhecidos na técnica podem ser usados. Oxidação pelo ar ambiente também é eficaz. Esta etapa de reoxidação parcial, suave, forma dissulfetos intracadeia eficientemente com alta fidelidade e preserva os grupos tióis dos resíduos Cisteína recém-introduzidos. Um excesso aproximado de 10 vezes de intermediário fármaco-ligante, MC-vc-PAB-MMAE, foi adicionado, misturado e deixado descansar por cerca de uma hora em temperatura ambiente para realizar conjugação e formar o conjugado anticorpo anti-CD79b-fármaco. A mistura de conjugação foi filtrada em gel e carregada e eluída através de uma coluna HiTrap S para remover intermediário fármaco- ligante em excesso e outras impurezas.
A figura 23 mostra o processo geral para preparar um anticorpo engenheirado com cisteína expresso de cultura celular para conjugação. Quando o meio de cultura celular contém cisteína, adutos de dissulfeto podem se formar entre o aminoácido de cisteína recém-introduzido e cisteína do meio. Os adutos de cisteína, mostrados como um círculo no TioMab exemplar (esquerda) na Figura 23, devem ser reduzidos para gerar anticorpos engenheirados com cisteína reativos para conjugação. Adutos de cisteína, presumivelmente junto com várias ligações dissulfeto intercadeia, são redutivamente clivados para dar uma forma reduzida do anticorpo com agentes de redução como TCEP. As ligações dissulfeto intercadeia entre resíduos Cisteína emparelhados são reformadas sob condições de oxidação parciais com sulfato de cobre, DHAA ou exposição a oxigênio ambiente. Os resíduos Cisteína não-emparelhados, engenheirados, recém-introduzidos, permanecem disponíveis para reação com reagentes ligantes ou intermediários fármaco- ligante para formar os conjugados de anticorpo da invenção. O TioMabs expresso em linhagens de célula de mamífero resulta em aduto de Cys externamente conjugado a um Cys engenheirado através de formação de ligação -S-S-. Desta maneira, TioMabs purificados são tratados com os procedimentos de redução e reoxidação conforme descrito no Exemplo 5 para produzir TioMabs reativo. Esses TioMabs são usados para conjugar com fármacos citotóxicos contendo maleimida, fluoróforos e outros marcadores.
10. IMUNOLIPOSSOMAS
Os anticorpos anti-CD79b descritos aqui podem ser também formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo que são úteis para aplicação de um fármaco em um mamífero. Os componentes do lipossoma são geralmente dispostos em uma formação de bicamada, similar à disposição de lipídeo de membranas biológicas. Lípossomas contendo o anticorpo são preparados através de métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); Patentes U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e WO97/38731 publicado em 23 de outubro de 1997. Lípossomas com tempo de circulação aumentado são descritos na Patente U.S. No. 5.013.556.
Lípossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Lipossomas são extrudados através dos filtros para definir tamanho do poro para dar lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomas conforme descrito em Martin e outros, J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) através de uma reação de intertroca de dissulfeto. Um agente quimioterapêutico está opcionalmente contido no lipossoma, Vide Gabizon e outros, J. National Cancer Inst.. 81 (19): 1484 (1989).
B. CERTOS MÉTODOS DE FABRICAÇÃO DE ANTICORPOS 1. AVALIAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B COM AS PROPRIEDADES DESEJADAS
Técnicas para geração de anticorpos que se ligam a polipeptídeos de CD79b foram descritas acima. Uma pessoa posse selecionar anticorpos com certas características biológicas, conforme necessário.
Os efeitos inibidores de crescimento de um anticorpo anti-CD79b da invenção podem ser avaliados através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando células que expressam um polipeptídeo de CD79b ou endogenamente ou seguindo transfecção com o gene de CD79b. Por exemplo, linhagens de célula de tumor apropriadas e células transfectadas com CD79b podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal anti-CD79b da invenção em várias concentrações por alguns dias (por exemplo, 2-7 dias) e tingidas com violeta cristal ou MTT ou analisadas através de algum outro ensaio colorimétrico. Outro método de medição de proliferação seria através da comparação da absorção de 3H-timidina pela célula tratada na presença ou ausência de um anticorpo anti-CD79b da invenção. Após tratamento, as células são coletadas e a quantidade de radioatividade incorporada ao DNA quantificada em um contador de cintilação. Controles positivos adequados incluem tratamento de uma linhagem de célula selecionada com um anticorpo inibidor de crescimento conhecido inibir o crescimento desta linhagem de célula. Inibição de crescimento de células de tumor in vivo pode ser determinada de várias maneiras conhecidas na técnica. A célula de tumor pode ser uma que expressa em excesso um polipeptídeo de CD79b. O anticorpo anti-CD79b vai inibir proliferação celular de uma célula de tumor expressando 5 CD79b in vitro ou in vivo em cerca de 25-100% comparado com a célula de tumor não-tratada, mais preferivelmente em cerca de 30-100% e mais preferivelmente ainda em cerca de 50-100% ou 70-100%, em uma modalidade, em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 pg/ml. Inibição de crescimento pode ser medida em uma concentração de anticorpo de cerca de 10 0,5 a 30 pg/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, em que a inibição de crescimento é determinada 1-10 dias após exposição das células de tumor ao anticorpo. O anticorpo é inibidor de crescimento in vivo se administração de um anticorpo anti-CD79b em cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 μg/kg de peso do corpo resultar em redução em tamanho do tumor ou redução 15 de proliferação de célula de tumor dentro de cerca de 5 dias a 3 meses da primeira administração do anticorpo, preferivelmente dentro de cerca de 5 a 30 dias.
Para selecionar um anticorpo anti-CD79b que induz morte celular, perda de integridade da membrana conforme indicado através de, por exemplo, 20 absorção de iodeto de propídio (PI), azul tripano ou 7AAD, por ser avaliada com relação a controle. Um ensaio de absorção de PI pode ser realizado na ausência de complemento e células imunoefetoras. Células expressando polipeptídeo de CD79b são incubadas com meio sozinho ou meio contendo o anticorpo anti-CD79b apropriado (por exemplo, em cerca de 10 μg/ml). As 25 células são incubadas por um período de 3 dias. Seguindo cada tratamento, as células são lavadas e separadas em alíquotas em tubos de 12 x75 tampados com coador de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para remoção de grumos de célula. Os tubos então recebem PI (10 μg/ml). As amostras podem ser analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN® e software FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson). Aqueles anticorpos anti-CD79b que induzem níveis estatisticamente significantes de morte celular conforme determinado através de absorção de PI podem ser selecionados como anticorpos anti-CD79b de indução de morte celular.
Para avaliar anticorpos que se ligam a um epitopo em um polipeptídeo de CD79b ligado por um anticorpo de interesse, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tais como aqueles descritos em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizado. Este ensaio pode ser usado para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo sítio ou epitopo que um anticorpo anti- CD79b conhecido. Alternativamente, ou adicionalmente, mapeamento de epitopo pode ser realizado através de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a sequência de anticorpo pode sofrer mutagênese tal como através de varredura com alanina, para identificar resíduos de contato. O anticorpo mutante é inicialmente testado quanto à ligação com anticorpo policlonal para assegurar dobra apropriada. Em um método diferente, peptídeos correspondendo a regiões diferentes de um polipeptídeo de CD79b podem ser usados em ensaios de competição com os anticorpos de teste ou com um anticorpo de teste e um anticorpo com um epitopo caracterizado ou conhecido.
2. CERTOS MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE BIBLIOTECA
Os anticorpos anti-CD79b da invenção podem ser feitos usando bibliotecas combinatoriais para avaliar anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para geração de bibliotecas de exibição de fago e avaliação de tais bibliotecas quanto a anticorpos que possuem as características de ligação desejadas. Tais métodos são descritos em geral em Hoogenboom e outros (2001) em Methods in Molecular Biology, 178:1-37 (O'Brien e outros, ed., Human Press, Totowa, NJ), e em certas modalidades, em Lee e outros (2004), J. Mol. Biol., 340:10731093.
A princípio, clones de anticorpo sintético são selecionados através de avaliação de bibliotecas de fago contendo fago que exibe vários fragmentos 5 de região variável de anticorpo (Fv) fundidos à proteína de revestimento de fago. Tais bibliotecas de fago são fotografadas através de cromatografia por afinidade contra o antígeno desejado. Clones expressando fragmentos Fv capazes de ligação ao antígeno desejado são adsorvidos para o antígeno e então separados dos clones de não-ligação na biblioteca. Os clones de ligação 10 são então eluídos do antígeno e podem ser enriquecidos mais através de ciclos adicionais de adsorção/eluição de antígeno. Qualquer um dos anticorpos anti- CD79b da invenção pode ser obtido através do planejamento de um procedimento de avaliação de antígeno adequado para selecionar o clone de fago de interesse seguido por construção de um clone de anticorpo anti-CD79b 15 de comprimento integral usando a sequências de Fv de um clone de fago de interesse e sequências (Fc) de região constante adequadas descritas em Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
Em certas modalidades, o domínio de ligação de antígeno de um 20 anticorpo é formado de duas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, de cada uma das cadeias leve (VL) e pesada (VH), que apresentam ambas três alças hipervariáveis (HVRs) ou regiões de determinação de complementaridade (CDRs). Domínios variáveis podem ser exibidos funcionalmente em fago, ou como fragmentos Fv de cadeia simples 25 (scFv), em que VH e VL são covalentemente ligados através de um peptídeo flexível, curto, ou como fragmentos Fab, em que eles são, cada um, fundidos a um domínio constante e interagem não-covalentemente, conforme descrito em Winter e outros, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Conforme aqui usado, clones de fago codificando scFv e clones de fago codificando Fab são coletivamente referidos como "clones de fago Fv" ou "clones de Fv".
Repertórios de genes de VH e VL podem ser separadamente clonados através de reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem então ser pesquisadas quanto a clones de ligação de antígeno conforme descrito em Winter e outros, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Bibliotecas de fontes imunizadas proveem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório puro pode ser clonado para prover uma fonte única de anticorpos humanos para uma faixa ampla de antígenos não-próprios e também próprios sem qualquer imunização conforme descrito por Griffiths e outros, EMBO J., 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas puras podem ser também feitas sinteticamente através de clonagem dos segmentos de gene V não-redispostos das células-tronco, e usando iniciadores de PCR contendo sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e realizar redisposição in vitro conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Em certas modalidades, fago filamentoso é usado para exibir fragmentos de anticorpo através de fusão à proteína de revestimento em quantidade menor plll. Os fragmentos de anticorpo podem ser mostrados como fragmentos Fv de cadeia simples, em que domínios VH e VL são conectados na mesma cadeia de polipeptídeo por um espaçador de polipeptídeo flexível, por exemplo, conforme descrito por Marks e outros, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou como fragmentos Fab, em que uma cadeia é fundida a plll e a outra é secretada no periplasma da célula hospedeira bacteriana de uma estrutura de proteína revestida com Fab que fica exibida na superfície do fago através de deslocamento de algumas das proteínas de revestimento do tipo selvagem, por exemplo, conforme descrito em Hoogenboom e outros, Nucleic Acids. Res., 19.4133-4137 (1991).
Em geral, ácidos nucleicos codificando fragmentos de gene de anticorpo são obtidos de células imunes colhidas de seres humanos ou animais. Se uma biblioteca propensa a clones anti-CD79b for desejada, o 5 indivíduo é imunizado com CD79b para gerar uma resposta de anticorpo, e células do baço e/ou células B em circulação outros que não linfócito sanguíneo periférico (PBLs) são recuperadas para construção de biblioteca. Em uma modalidade preferida, uma biblioteca de fragmento de gene de anticorpo humano propensa a clones anti-CD79b é obtida através da geração 10 de uma resposta de anticorpo anti-CD79b em camundongos transgênicos carregando uma disposição de gene de imunoglobulina humana (e sem um sistema de produção de anticorpo endógeno funcional) de maneira que a imunização de CD79b dá origem a células B produzindo anticorpos humanos contra CD79b. A geração de camundongos transgênicos de produção de 15 anticorpo humano é descrita abaixo.
Enriquecimento adicional para populações de célula reativas anti- CD79b pode ser obtido usando um procedimento de avaliação adequado para isolar células B expressando anticorpo ligado á membrana específico de CD79b, por exemplo, através de separação de célula usando cromatografia de 20 afinidade de CD79b ou adsorção de células para CD79b marcado com fluorcromo seguido por classificação celular ativada por fluxo (FACS).
Alternativamente, o uso de células do baço e/ou células B ou outras PBLs de um doador não-imunizado provê uma melhor representação do repertório de anticorpo possível, e também permite a construção de uma 25 biblioteca de anticorpo usando qualquer espécie animal (humano ou não- humano) em que CD79b não seja antigênico. Para bibliotecas incorporando construção de gene de anticorpo in vitro, células-tronco são colhidas do indivíduo para prover ácidos nucleicos codificando segmentos de gene de anticorpo não-redispostos. As células imunes de interesse podem ser obtidas de uma variedade de espécies animais, tais como espécies humana, camundongo, rato, lagomorfa, luprina, canina, felina, porcina, bovina, equina e ave, etc.
Ácido nucleicos codificando segmentos de gene variáveis de anticorpo (incluindo segmentos VH e VL) são recuperados das células de interesse e amplificados. No caso de bibliotecas de gene de VH e VL redisposto, o DNA desejado pode ser obtido através de isolamento de DNA ou mRNA genômico de linfócitos seguido por reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores que se encontram com as extremidades 5' e 3’ de genes de VH e VL redispostos conforme descrito em Orlandi e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 3833-3837 (1989), desta maneira fazendo repertórios de gene V diversos para expressão. Os genes V podem ser amplificados de cDNA e DNA genômico, com iniciadores reversos na extremidade 5' do exon codificando o domínio V maduro e iniciadores avançados baseados dentro do segmento J conforme descrito em Orlandi e outros (1989) e em Ward e outros, Nature, 341: 544-546 (1989). No entanto, para amplificação a partir de cDNA, iniciadores reversos podem ser também baseados no exon líder conforme descrito em Jones e outros, Biotechnol., 9: 88-89 (1991), e iniciadores avançados dentro da região constante conforme descrito em Sastry e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar complementaridade, degeneração pode ser incorporada nos iniciadores conforme descrito em Orlandi e outros (1989) ou Sastry e outros (1989). Em certas modalidades, a diversidade da biblioteca é maximizada usando iniciadores de PCR direcionados a cada família de gene V a fim de amplificar todas as disposições de VH e VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucleico de célula imune, por exemplo, conforme descrito no método de Marks e outros, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) ou conforme descrito no método de
Orum e outros., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para clonagem do DNA amplificado em vetores de expressão, sítios de restrição raros podem ser introduzidos no iniciador de PCR como um tag em uma extremidade conforme descrito em Orlandi e outros (1989) ou através de amplificação por PCR adicional com um iniciador tagged conforme descrito em Clackson e outros, Nature, 352: 624-628 (1991).
Repertórios de genes V sinteticamente dispostos podem ser derivados in vitro de segmentos de gene V. A maioria dos segmentos de gene de VH humanos foi clonada e sequenciada (descrito em Tomlinson e outro, J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)) e mapeada (descrito em Matsuda e outros, Nature Genet., 3: 88-94 (1993); esses segmentos clonados (incluindo todas as conformações principais da alça H1 e H2) podem ser usados para gerar repertórios de gene de VH diversos com iniciadores de PCR codificando alças H3 de sequência e comprimento diversos conforme descrito em Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Repertórios de VH podem ser também feitos com toda a diversidade de sequência focada em uma alça H3 longa de um comprimento único conforme descrito em Barbas e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4457-4461 (1992). Segmentos de VK e VA humanos foram clonados e sequenciados (descrito em Williams e Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) e podem ser usados para fazer repertórios de cadeia leve sintéticos. Os repertórios de gene V sintéticos, com base em uma faixa de dobras de VH e VL, e comprimentos L3 e H3, vai codificar anticorpos de diversidade estrutural considerável. Seguindo amplificação de DNAs codificando gene V, segmentos de gene V de linha germinativa podem ser dispostos in vitro de acordo com os métodos de Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992).
Repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídos combinando repertórios de gene de VH e VL juntos de várias maneiras. Cada repertório pode ser criado em vetores diferentes, e os vetores recombinados in vitro, por exemplo, conforme descrito em Hogrefe e outros, Gene, 128: 119-126 (1993) ou in vivo através de infecção combinatorial, por exemplo, o sistema loxP descrito em Waterhouse e outros, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). A abordagem de recombinação in vivo explora a natureza de duas cadeias de fragmentos Fab para superar o limite em tamanho de biblioteca imposto por eficiência de transformação de E. coli. Repertórios de VH e VL puros são clonados separadamente, um em um fagemídeo e o outro em um vetor de fago. As duas bibliotecas são então combinadas através de infecção de fago ou bactérias contendo fagemídeo de maneira que cada célula contém uma combinação diferente e o tamanho da biblioteca é limitado apenas pelo número de células presentes (cerca de 1012 clones). Ambos os vetores contêm sinais de recombinação in vivo de maneira que os genes de VH e VL são recombinados em um replicon único e são co-empacotados em virions de fago. Essas bibliotecas grandes proveem números grandes de anticorpos diferentes de boa afinidade (Kd'1 de cerca de 10“8 M).
Alternativamente, os repertórios podem ser clonados sequencialmente no mesmo vetor, por exemplo, conforme descrito em Barbas e outros, Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 88: 7978-7982 (1991) ou montados juntos através de PCR e então clonados, por exemplo, conforme descrito em Clackson e outros, Nature, 352: 624-628 (1991). Montagem através de PCR pode ser também usada para unir DNAs de VH e VL com DNA codificando urn espaçador de peptídeo flexível para formar repertórios de cadeia Fv simples (scFv). Em ainda outra técnica, "montagem de PCR em célula" é usada para combinar genes de VH e VL dentro de linfócitos através de PCR e então clonar repertórios de genes ligados conforme descrito em Embleton e outros, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).
Os anticorpos produzidos por bibliotecas puras (ou naturais ou sintéticas) podem ser de afinidade moderada (Kd‘1 de cerca de 106 a 10' M'1), mas maturação por afinidade pode ser também imitada in vitro através da construção e nova seleção de bibliotecas secundárias conforme descrito em Winter e outros (1994), supra. Por exemplo, mutação pode ser introduzida aleatoriamente in vitro usando polimerase propensa a erro (relatado em Leung e outros, Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkins e outros, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram e outros, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 89: 3576-3580 (1992). Ainda, maturação por afinidade pode ser realizada através de mutação aleatória de uma ou mais CDRs, por exemplo, usando PCR com iniciadores carregando sequências aleatórias abrangendo a CDR de interesse, em clones de Fv individuais selecionados e avaliação quanto a clones de afinidade maior. O WO 9607754 (publicado em 14 de março de 1006) descreveu um método para indução de mutagênese em uma região de determinação de complementaridade de uma cadeia leve da imunoglobulina para criar uma biblioteca de genes de cadeia leve. Outra abordagem eficaz é recombinar os domínios de VH e VL selecionados através de exibição de fago com repertórios de variantes de domínio V de ocorrência natural obtidos de doadores imunizados e avaliar quando à afinidade maior em várias rodadas de novo embaralhamento de cadeia conforme descrito em Marks e outros, Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpo com afinidades de cerca de 10'9 M ou menos.
Avaliação das bibliotecas pode ser realizada através de várias técnicas conhecidas no campo. Por exemplo, CD79b pode ser usado para revestir as cavidades de placas de adsorção, expresso em células hospedeiras afixadas a placas de adsorção ou usado em classificação de célula, ou conjugado à biotina para captura com contas revestidas com estreptavidina, ou usado em qualquer outro método para fotografia panorâmica de bibliotecas de exibição de fago.
As amostras de biblioteca de fago são contatadas com CD79b imobilizado sob condições adequadas para ligação de pelo menos uma porção das partículas de fago com o adsorvente. Normalmente, as condições, incluindo pH, resistência iônica, temperatura e similar, são selecionadas para imitar condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e então eluídos por ácido, por exemplo, conforme descrito em Barbas e outros, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 88: 7978-7982 (1991) ou por álcali, por exemplo, conforme descrito em Marks e outros, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou por competição de antígeno de CD79b, por exemplo, em um procedimento similar ao método de competição de antígeno de Clackson e outros, Nature, 352: 624628 (1991). Os fagos podem ser enriquecidos 20-1.000 vezes em uma rodada de seleção única. Além disso, os fagos enriquecidos podem ser cultivados em cultura bacteriana e submetidos a rodadas de seleção adicionais.
A eficiência de seleção depende de muitos fatores, incluindo a cinética de dissociação durante lavagem, e se fragmentos de anticorpo múltiplos em um fago único podem engajar simultaneamente com antígeno. Anticorpos com cinética de dissociação rápida (e afinidades de ligação fracas) podem ser retidos pelo uso de lavagens curtas, exibição de fago multivalente e densidade de revestimento alta de antígeno em fase sólida. A densidade alta não apenas estabiliza o fago através de interações multivalentes, mas favorece nova ligação de fago que dissociou. A seleção de anticorpos com cinética de dissociação lenta (e boas afinidades de ligação) pode ser promovida através do uso de lavagens longas e exibição de fago monovalente conforme descrito em Bass e outros, Proteins, 8: 309-314 (1990) e no WO 92/09690, e uma densidade de revestimento baixa de antígeno conforme descrito em Marks e outros, Biotechnol., 10: 779-783 (1992).
É possível selecionar entre anticorpos de fago de afinidades diferentes, mesmo com afinidades que diferem ligeiramente, para CD79b. No entanto, mutação aleatória de um anticorpo selecionado (por exemplo, conforme realizado em algumas técnicas de maturação por afinidade) é provável dar origem a muitos mutantes, a maioria se ligando a antígeno, e alguns com afinidade maior. Com CD79b limitante, fago de afinidade alta raro poderia ser suplantado. Para reter todos os mutantes de afinidade maior, os fagos podem ser incubados com CD79b biotinilado em excesso, mas com o CD79b biotinilado em uma concentração de molaridade menor do que a constante de afinidade molar-alvo para CD79b. Os fagos de ligação de afinidade alta podem então ser capturados através de contas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. Tal "captura de equilíbrio" permite que os anticorpos sejam selecionados de acordo com suas afinidades de ligação, com sensibilidade que permite isolamento de clones mutantes com afinidade no mínimo duas vezes maior de um excesso grande de fagos com afinidade menor. Condições usadas em lavagem de fagos ligados a uma fase sólida podem ser também manipuladas para discriminar com base em cinética de dissociação. Clones de anti-CD79b podem ser selecionados com base em atividade. Em certas modalidades, a invenção provê anticorpos anti-CD79b que se ligam a células vivas que expressam naturalmente CD79b. Em uma modalidade, a invenção provê anticorpos anti-CD79b que bloqueiam a ligação entre um ligante de CD79b e CD79b, mas não bloqueiam a ligação entre um ligante de CD79b e uma segunda proteína. Clones de Fv correspondendo a tais anticorpos anti-CD79b podem ser selecionados através de (1) isolamento de clones anti-CD79b de uma biblioteca de fago conforme descrito acima e opcionalmente amplificação da população isolada de clones de fago através de cultivo da população em um hospedeiro bacteriano adequado; (2) seleção de CD79b e uma segunda proteína contra os quais atividades de bloqueio e não- bloqueio, respectivamente, são desejadas; (3) adsorção dos clones de fago anti-CD79b para CD79b imobilizado; (4) uso de um excesso da segunda proteína para eluir quaisquer clones indesejados que reconhecem determinantes de ligação a CD79b que se sobrepõem ou são compartilhados 5 com as determinantes de ligação da segunda proteína; e (5) eluição dos clones que permanecem adsorvidos seguindo a etapa (4). Opcionalmente, clones com as propriedades de bloqueio-não-bloqueio desejadas podem ser enriquecidos mais através da repetição dos procedimentos de seleção descrito aqui uma ou mais vezes. 10 DNA codificando anticorpos monoclonais derivados de híbridoma ou clones de Fv de exibição de fago da invenção é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando iniciadores de oligonucleotídeo projetados para amplificar especificamente as regiões de codificação de cadeias pesada e leve de interesse de híbridoma ou 15 molde de DNA de fago). Uma vez isolado, o DNA pode ser posto em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS simianas, células de ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outra maneira proteína da imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais desejados 20 nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de DNA de codificação de anticorpo incluem Skerra e outros, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992). DNA codificando os clones de Fv da invenção pode ser 25 combinado com sequências de DNA conhecidas codificando regiões constantes de cadeia pesada e/ou cadeia leve (por exemplo, as sequências de DNA apropriadas podem ser obtidas de Kabat e outros, supra) para formar clones codificando cadeias pesadas e/ou leves de comprimento integral ou parcial. Será compreendido que regiões constantes de qualquer isotipo podem ser usadas para este propósito, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgG e IgE, e que tais regiões constantes podem ser obtidas de qualquer espécie humana ou animal. Um clone de Fv derivado do DNA de domínio variável de uma espécie animal (tal como humano) e então fundido a DNA de região constante de outra espécie animal para formar sequência(s) de codificação para cadeia pesada e/ou cadeia leve de comprimento integral, híbridas, é incluído na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido" conforme aqui usado. Em certas modalidades, um clone de Fv derivado de DNA variável humano é fundido a DNA de região constante humana para formar sequência(s) de codificação para cadeias pesadas e/ou leves humanas de comprimento integral ou parcial. DNA codificando anticorpo anti-CD79b derivado de um hibridoma pode ser também modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para domínios constantes de cadeias pesada e leve humanas no lugar de sequências de murino homólogas derivadas do clone de hibridoma (por exemplo, no método de Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). DNA codificando um anticorpo ou fragmento derivado de hibridoma ou clone de Fv pode ser modificado mais através de união covalente à sequência de codificação de imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo não-imunoglobulina. Desta maneira, anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" são preparados, os quais têm a especificidade de ligação dos anticorpos derivados do clone de Fv ou do clone de hibridoma da invenção. C TERAPIA COM PRÓ-FÁRMACO MEDIADA POR ENZIMA DEPENDENTE DE ANTICORPO (ADEPT)
Os anticorpos da presente invenção podem ser também usados em ADEPT através de conjugação do anticorpo com uma enzima de ativação de pró-fármaco que converte um pró-fármaco (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidila, vide WO81/01145) em um fármaco anticâncer ativado. Vide, por exemplo, o WO 88/07378 e a Patente U.S. No. 4.975.278.
O componente enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui 5 uma enzima capaz de ação sobre um pró-fármaco de tal maneira que ela o converte em sua forma citotóxica, mais ativa.
Enzimas que são úteis no método da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, fosfatase alcalina útil para conversão de pró- fármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útil para conversão 10 de pró-fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina desaminase útil para conversão de 5-fluorcitosina não-tóxica no fármaco anticâncer, 5- fluoruracila; proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilísina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para conversão de pró-fármacos contendo peptídeo em fármacos livres; D 15 alanilcarboxipeptidases úteis para conversão de pró-fármacos que contêm substituintes D-aminoácidoss; enzimas de divagem de carboidrato tais como β- galactosidase e neuraminidase úteis para conversão de pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase útil para conversão de fármacos derivatizados com β-lactamas em fármacos livres; e penicilinas amidases, tal 20 como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para conversão de fármacos derivatizados em suas nitrogênio aminas com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como "abzymas", podem ser usados para converter os pró-fármacos da invenção em fármacos 25 ativos livres (vide, por exemplo, Massey, Nature, 328:457-458 (1987)). Conjugados de anticorpo-abzyme podem ser preparados conforme descrito aqui para aplicação da abzyme a uma população de célula de tumor.
As enzimas da presente invenção podem ser covalentemente II' l vl ligadas aos anticorpos anti-CD79b através de técnicas bem conhecidas no campo tal como o uso dos reagentes de reticulação heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção ligada a 5 pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima da invenção podem ser construídas usando técnicas de DNA recombinante bem conhecidas no campo (vide, por exemplo, Neuberger e outros, Nature, 312:604-608 (1984).
D. ANTICORPO ANTI-CD79B
Em adição aos anticorpos anti-CD79b descritos aqui, é 10 compreendido que variantes de anticorpo anti-CD79b podem ser preparadas.
Variantes de anticorpo anti-CD79b podem ser preparadas introduzindo mudanças de nucleotídeo apropriadas no DNA de codificação e/ou através de síntese do anticorpo ou polipeptídeo desejado. Aqueles versados na técnica vão compreender que mudanças de aminoácido podem alterar processos pós- 15 traducionais do anticorpo anti-CD79b, tal como mudança do número ou posição de sítios de glicosilação ou alteração das características de ancoragem de membrana.
Variações nos anticorpos anti-CD79b descritas aqui podem ser feitas, por exemplo, usando qualquer uma das técnicas e orientações para 20 mutações conservatives e não-conservativas mostradas, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.364.934. Variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais códons codificando o anticorpo ou polipeptídeo que resulta em uma mudança na sequência de aminoácido comparado com o anticorpo ou polipeptídeo da sequência nativa. Opcionalmente a variação é 25 através de substituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou mais dos domínios do anticorpo anti-CD79b. Orientação na determinação de qual resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar de modo adverso a atividade desejada pode ser encontrada comparando a sequência do anticorpo anti-CD79b com aquela de moléculas de proteína conhecidas homólogas e minimização do número de mudanças de sequência de aminoácido feitas em regiões de alta homologia. Substituições de aminoácido podem ser o resultado de substituição de um aminoácido com outro aminoácido tendo propriedades estruturais e/ou químicas similares, tal como a substituição de uma leucina com uma serina, isto é, substituições de aminoácido conservatives. Inserções ou deleções podem estar opcionalmente na faixa de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada através realização sistemática de inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e teste das variantes resultantes quanto à atividade exibida pela sequência nativa de comprimento integral ou madura.
Fragmentos de anticorpo anti-CD79b são providos aqui. Tais fragmentos podem ser truncados no N-terminal ou C-terminal ou podem não ter resíduos internos, por exemplo, quando comparado com um anticorpo ou proteína nativa de comprimento integral. Certos fragmentos não têm resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma atividade biológica desejada do anticorpo anti-CD79b.
Fragmentos de anticorpo anti-CD79b podem ser preparados através de qualquer uma de várias técnicas convencionais. Fragmentos de peptídeo desejados podem ser quimicamente sintetizados. Uma abordagem alternativa envolve geração de fragmentos de anticorpo ou polipeptídeo através de digestão enzimática, por exemplo, através de tratamento da proteína com uma enzima conhecida clivar proteínas em sítios definidos por resíduos de aminoácido particulares, ou através de digestão do DNA com enzimas de restrição adequadas e isolamento do fragmento desejado. Ainda outra técnica adequada envolve isolamento e amplificação de um fragmento de DNA codificando um fragmento de anticorpo ou polipeptídeo desejado, através de reação em cadeia da polimerase (PCR). Oligonucleotídeos que definem os terminais desejados do fragmento de DNA são empregados nos iniciadores 5' e 3' na PCR. Preferivelmente, fragmentos de anticorpo anti-CD79b compartilham pelo menos uma atividade biológica e/ou imunológica com o anticorpo anti- 5 CD79b nativo descrito aqui.
Em modalidades particulares, substituições conservatives de interesse são mostradas na Tabela 8 sob o cabeçalho de substituições preferidas. Se tais substituições resultarem em uma mudança em atividade biológica, então mudanças mais substanciais, denominadas substituições 10 exemplares na Tabela 8, ou conforme descrito mais abaixo em referência a classes de aminoácido, são introduzidas nos produtos avaliados.
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Modificações substanciais em função ou identidade imunológica do anticorpo anti-CD79b são realizadas através da seleção de substituições que diferem significantemente em seu efeito sobre manutenção (a) da estrutura da estrutura principal de polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformação folha ou helical, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio-alvo ou (c) do volume da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base em propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr; (3) ácida: asp, glu; (4) básica: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; and (6) aromática: trp, tyr, phe.
Substituições não-conservativas vão compreender troca de um membro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos podem ser também introduzidos nos sítios de substituição conservative ou, mais preferivelmente, nos sítios restantes (não-conservados).
As variações podem ser feitas usando métodos conhecidos na técnica tais como mutagênese mediada por oligonucleotídeo (direcionada a sítio), varredura de alanina e mutagênese de PCR. Mutagênese direcionada a sítio [Carter e outros, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller e outros, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagênese de cassete [Wells e outros, Gene, 5 34:315 (1985)], mutagênese de seleção de restrição [Wells e outros, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir o DNA variante de anticorpo anti-CD79b.
Análise de aminoácido de varredura pode ser também empregada 10 para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. Dentre os aminoácidos de varredura preferidos estão aminoácidos neutros, relativamente pequenos. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina e cisteína. Alanina é tipicamente um aminoácido de varredura preferido dentre este grupo porque ela elimina a cadeia lateral além do beta-carbono e é menos 15 provável de alterar a conformação de cadeia principal da variante [Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. A alanina é também tipicamente preferida porque ela é o aminoácidos mais comum. Ainda, ela é frequentemente encontrada em ambas as posições enterrada e exposta [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 20 150:1 (1976)]. Se substituições alanina não renderem quantidades adequadas de variante, um aminoácido isotérico pode ser usado.
Qualquer resíduo Cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo anti-CD79b pode ser também substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e 25 prevenir reticulação aberrante. Por outro lado, ligação(ões) cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo anti-CD79b para melhorar sua estabilidade (particularmente em que o anticorpo for um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).
Um tipo particularmente preferido de variante substitucional envolve substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Em geral, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento 5 adicional terão propriedades biológicas aperfeiçoadas com relação ao anticorpo parental do qual elas são geradas. Um modo conveniente de geração de tais variantes substitucionais envolve maturação por afinidade usando exibição de fago. Em suma, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições possíveis em cada sítio. As 10 variantes de anticorpo então geradas são exibidas de uma maneira monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões com o produto de gene III de M13 empacotado dentro de cada partícula. As variantes exibidas do fago são então avaliadas quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) conforme aqui descrito. A fim de identificar sítios 15 de região hipervariável candidatos para modificação, mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de região hipervariável contribuindo significantemente para ligação de antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o 20 anticorpo e polipeptídeo de CD79b. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez tais variantes sendo gerados, o painel de variantes é submetido à avaliação conforme descrito aqui e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para 25 desenvolvimento adicional.
Moléculas de ácido nucleico codificando variantes de sequência de aminoácido do anticorpo anti-CD79b são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação através de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada a sítio), mutagênese por PCR e mutagênese de cassete de uma versão variante ou não-variante preparada anteriormente do anticorpo anti-CD79b.
E. MODIFICAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B
Modificações covalentes de anticorpos anti-CD79b são incluídas no escopo da presente invenção. Um tipo de modificação covalente inclui reação de resíduos de aminoácido-alvo de um anticorpo anti-CD79b com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas dos resíduos N ou C terminais do anticorpo anti-CD79b. Derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticulação do anticorpo anti-CD79b para uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para uso no método para purificação de anticorpos anti-CD79b e vice- versa. Agentes de reticulação geralmente usados incluem, por exemplo, 1,1- bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidila tal como 3,3'- ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais tal como bis- maleimido-1,8-octano e agentes tal como metil-3-[(p- azidofenil)ditio]propioimidato.
Outras modificações incluem desaminação de resíduos glutaminila e asparaginila para os resíduos glutamila e aspartila correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos serila ou treonila, metilação dos grupos ct- amino de cadeias laterais lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., São Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxila N-terminal.
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-CD79b incluída no escopo da presente invenção compreende alteração do padrão de glicosilação nativo do anticorpo ou polipeptídeo. "Alteração do padrão de 5 glicosilação nativo" pretende para os presentes propósitos significar deleção de uma ou mais porções de carboidrato encontradas em anticorpo anti-CD79b de sequência nativa (ou através de remoção do sítio de glicosilação de base ou através da deleção da glicosilação através de meios químicos e/ou enzimáticos) e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão 10 presentes no anticorpo anti-CD79b de sequência nativa. Ainda, a expressão inclui mudanças qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, envolvendo uma mudança na natureza e na proporção de várias porções carboidrato presentes.
Glicosilação de anticorpos e outros polipeptídeos é tipicamente ou 15 N-ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à ligação da porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção carboidrato com a cadeia lateral da asparagina. Desta maneira, a 20 presença de qualquer uma dessas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiâmico, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possa ser também usada.
Adição de sítios de glicosilação ao anticorpo anti-CD79b é convenientemente realizada através da alteração da sequência de aminoácido de maneira que ela contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeo descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode ser também feita através da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos serina ou treonina à sequência do anticorpo anti-CD79b original (para sítios de glicosilação O-ligados). A sequência de aminoácido do anticorpo anti-CD79b pode ser opcionalmente alterada através de mudanças no nível de DNA, 5 particularmente através de mutação do DNA codificando o anticorpo anti- CD79b em bases pré-selecionadas de maneira que códons são gerados que vão traduzir nos aminoácidos desejados.
Outro meio de aumento do número de porções carboidrato no anticorpo anti-CD79b é através de acoplamento químico ou enzimático de 10 glicosídeos ao polipeptídeo. Tais métodos são descritos na técnica, por exemplo, no WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
Remoção de porções carboidrato presentes no anticorpo anti- CD79b pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente ou através de 15 substituição mutacional de códons codificando resíduos de aminoácido que servem como alvos para glicosilação. Técnicas de desglicosilação química são conhecidas no campo e descritas, por exemplo, por Hakimuddin e outros, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge e outros, Anal. Biochem., 118:131 (1981). Clivagem enzimática de porções carboidrato em polípeptídeos 20 pode ser conseguida através do uso de uma variedade de endo- e exo- glicosidases conforme descrito por Thotakura e outros, Meth. Enzymol., 138:350(1987).
Outro tipo de modificação covalente de anticorpo anti-CD79b compreende ligação do anticorpo a um de uma variedade de polímeros não- 25 proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da maneira mostrada na Patente U.S. No. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337. O anticorpo pode ser também aprisionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial (por exemplo), microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de aplicação de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, 5 microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed., (1980).
O anticorpo anti-CD79b da presente invenção pode ser também modificado de maneira formar moléculas quiméricas compreendendo um 10 anticorpo anti-CD79b fundido a outra sequência de polipeptídeo ou aminoácido heteróloga.
Em uma modalidade, tal molécula quimérica compreende uma fusão do anticorpo anti-CD79b com um polipeptídeo de marcaçãoque provê um epitopo ao qual um anticorpo anti-marcação pode se ligar seletivamente. O 15 epitopo tag é geralmente posto no terminal amino ou carboxila do anticorpo anti-CD79b. A presença de tais formas marcadas de epitopo do anticorpo anti- CD79b pode ser detectada usando um anticorpo contra o polipeptídeo de marcação. Também, provisão de epitopo tag permite que o anticorpo anti- CD79b seja prontamente purificado através de purificação por afinidade usando 20 um anticorpo anti-fag ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao epitopo tag. Vários polipeptídeos tag e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na técnica. Exemplos incluem de poli-histidina (poly-his) ou poli- histidina-glicina (poly-his-gly) tags; o polipeptídeo de marcação HA da gripe e seu anticorpo 12CA5 [Field e outros, Mol. Cell. Biol,, 8:2159-2165 (1988)]; o c- 25 myc tag e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 para ele [Evan e outros, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; e o (gD) tag da glicoproteína D do vírus Herpes Simplex e seu anticorpo [Paborsky e outros, Protein Engineering, 3(6);547-553 (1990)]. Outros polipeptídeo de marcaçãos incluem o peptídeo de Flag [Hopp e outros, BioTechnoloqy, 6:1204-1210 (1988)]; o peptídeo do epitopo de KT3 [Martin e outros, Science, 255:192-194 (1992)]; um peptídeo do epitopo de a-tubulina [Skinner e outros, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o peptídeo de marcação da proteína do gene 10 5 de T7 [Lutz-Freyermuth e outros, Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397 (1990)].
Em uma modalidade alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do anticorpo anti-CD79b com uma imunoglobulina ou região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da 10 molécula quimérica (também referida como uma "imunoadesina"), tal fusão poderia ser com a região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de IgG incluem preferivelmente a substituição de uma forma solúvel (domínio de transmembrana deletado ou inativado) de um anticorpo anti-CD79b no lugar de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula de lg. Em uma 15 modalidade particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões de dobradiça, CH2 e CH3, ou a dobradiça, CH1, CH2 e CH3 de uma molécula de lgG1. Para a produção de fusões de imunoglobulina vide também Patente U.S. No. 5.428.130 expedida em 27 de junho de 1995. F. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B
A descrição abaixo refere-se principalmente à produção de anticorpos anti-CD79b através de cultura de células transformadas ou transfectadas com um vetor contendo ácido nucleico codificando anticorpo anti- CD79b. É, com certeza, compreendido que métodos alternativos que são bem conhecidos na técnica podem ser empregados para preparar anticorpos anti- 25 CD79b. Por exemplo, a sequência de aminoácido apropriada, ou suas porções, pode ser produzida através de síntese de peptídeo direta usando técnicas de fase sólida [vide, por exemplo, Stewart e outros, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., São Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85.2149-2154 (1963)]. Síntese de proteína in vivo pode ser realizada usando técnicas manuais ou através de automação. Síntese automática pode ser realizada, por exemplo, usando o Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) usando as instruções do fabricante. Várias porções do anticorpo anti-CD79b podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas usando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o anticorpo anti-CD79b desejado.
1. ISOLAMENTO DE DNA CODIFICANDO ANTICORPO ANTI-CD79B
DNA codificando anticorpo anti-CD79b pode ser obtido de uma biblioteca de CDNA preparada de tecido acreditada possuir o mRNA de anticorpo anti-CD79b e expressá-lo em um nível detectável. Desta maneira, DNA de anticorpo anti-CD79b humano pode ser convenientemente obtido de uma biblioteca de cDNA preparada de tecido humano. O gene codificando o anticorpo anti-CD79b pode ser também obtido de uma biblioteca genômica ou através de procedimentos sintéticos conhecidos (por exemplo, síntese de ácido nucleico automatizada).
As bibliotecas podem ser avaliadas com sondas (tais como oligonucleotídeos de pelo menos cerca de 20-80 bases) projetadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por ele. Avaliação da biblioteca de cDNA ou genômica com a sonda selecionada pode ser conduzida usando procedimentos padrão, tal como descrito em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene codificando anticorpo anti-CD79b é usar metodologia de PCR [Sambrook e outros, supra; Dieffenbach e outros, PCR Iniciador: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Técnicas para avaliação de uma biblioteca de cDNA são bem conhecidas no campo. As sequências de oligonucleotídeo selecionadas como sondas devem ser de comprimento suficiente e suficientemente sem ambiguidade de modo que falsos positivos sejam minimizados. O oligonucleotídeo é preferivelmente marcado de maneira que ele possa ser detectado quando da hibridização para DNA na biblioteca sendo avaliada.
Métodos de marcação são bem conhecidos na técnica e incluem o uso de radiomarcadores tal como ATP marcado com 32P, biotinilação ou marcação de enzima. Condições de hibridização, incluindo adstringência moderada e adstringência alta, são providas em Sambrook e outros, supra. Sequências identificadas em tais métodos de avaliação de 10 biblioteca podem ser comparadas e alinhadas com outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bancos de dados públicos tal como GenBank ou outros bancos de dados de sequência privados. Identidade de sequência (no nível de aminoácido ou nucleotídeo) dentro de regiões definidas da molécula ou através da sequência de comprimento integral pode ser 15 determinada usando métodos conhecidos na técnica e conforme aqui descrito. Ácido nucleico tendo sequência de codificação de proteína pode ser obtido através da avaliação de cDNA selecionado ou bibliotecas genômicas usando a sequência de aminoácido deduzida descrita aqui pela primeira vez e, se necessário, usando de procedimentos de extensão de iniciador 20 convencionais conforme descrito em Sambrook e outros, supra, para detectar precursores e intermediários de processamento de mRNA que podem não ter sofrido transcrição reversa para cDNA.
2. SELEÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS
Células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com 25 vetores de expressão ou clonagem descritos aqui para produção de anticorpo anti-CD79b e culturadas em meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas. As condições de cultura, tais como meio, temperatura, pH e similar, podem ser selecionadas pelo versado na técnica sem experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos e técnicas práticas para maximização da produtividade de culturas de célula podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a 5 Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook e outros, supra.
Métodos de transfecção de célula eucariótica e transformação de célula procariótica, que significam introdução de DNA no hospedeiro de maneira que o DNA seja replicável, ou como um integrante extracromossomal 10 ou por integrante cromossomal, são conhecidos do versado comum na técnica, por exemplo, CaCh CaPO4, mediados por lipossoma, polietilenoglicol/DMSO e eletroporação. Dependendo da célula hospedeira usada, transformação é realizada usando técnicas padrão apropriadas para tais células. Tratamento de cálcio empregando cloreto de cálcio, conforme descrito em Sambrook e outros, 15 supra, ou eletroporação, é geralmente usado para procariontes. Infecção com Agrobacterium tumefaciens é usada para transformação de certas células de planta, conforme descrito por Shaw e outros, Gene, 23:315 (1983) e WO 89/05859 publicado em 29 de junho de 1989. Para células de mamífero sem ■ tais paredes celulares, o método de precipitação com fosfato de cálcio de 20 Graham e van der Eb., Virology, 52: 456-457 (1978) pode ser empregado.
Aspectos gerais de transfecções de sistema hospedeiro de célula de mamífero foram descritos na Patente U.S. No. 4.399.216. Transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen e outros, J. Bact, 130:946 (1977) e Hsiao e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76:3829 25 (1979). No entanto, outros métodos para introdução de DNA em células, tal como através de microinjeção nuclear, eletropração, fusão de protoplasto bacteriano com células intactas ou policátions, por exemplo, polibreno, poliornitina, podem ser usados. Para várias técnicas para transformação de células de mamífero, vide Keown e outros., Methods in Enzymology, 185:527537 (1990) e Mansour e outros, Nature, 336:348-352 (1988).
Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos presentes vetores incluem células procariotas, levedura ou eucariotas 5 superiores.
A. CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIÓTICAS
Procariontes adequados incluem, mas não estão limitados a, arquebactérias e eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram- positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli. Várias linhagens 10 de E. coli estão publicamente disponíveis, tal como a linhagem K12 MM294 de E. coli (ATCC 31,446); X1776 de E. coli (ATCC 31,537); linhagem W3110 de E. coli (ATCC 27,325) eK5 772 (ATCC 53,635). Outras células hospedeiras adequadas incluem Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo,
Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli tai como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P descrito na DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus e Streptomyces. Esses exemplos são ilustrativos ao invés de limitantes. A 20 linhagem W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro parental particularmente preferido porque ela é uma linhagem hospedeiro comum para fermentações de produto de DNA recombinante. Preferivelmente, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a linhagem W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.:
American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; Depósito na ATCC No. 27.325) pode ser modificada para realizar uma mutação genética nos genes codificando proteínas endógenas para o hospedeiro, com exemplos de tais hospedeiros incluindo a linhagem W3110 1A2 de E. coli, que tem o genótipo completo tonA; linhagem W3110 9E4 de E. coli, que tem o genótipo completo tonA ptr3; linhagem W3110 27C7 de E. coli (ATCC 55,244), que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr; linhagem W3110 37D6 de E. coli, que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA 5 E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; linhagem W3110 40B4 de E. coli, que é a linhagem 37D6 com uma mutação de deleção de degP resistente à canamicina; linhagem W3110 33D3 de E. coli tendo o genótipo W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac lq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (Pat. U.S. No. 5.639.635) e uma linhagem de E. coli tendo uma protease periplásmica 10 mutante descrita na Patente U.S. No. 4.946.783 depositada em 7 de agosto de 1990. Outras linhagens e seus derivados, tal como 294 de E. coli 294 (ATCC 31,446), B de E. coli, 1776 de E. coliK (ATCC 31.537) e RV308 de E. coli (ATCC 31.608) são também adequadas. Esses exemplos são ilustrativos ao invés de limitantes. Métodos para construção de derivados de qualquer uma 15 das bactérias acima mencionadas tendo genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Bass e outros, Proteins, 8:309-314 (1990). É geralmente necessário selecionar as bactérias apropriadas levando em consideração a capacidade de replicação do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, espécie E. coli. Serratia ou Salmonella pode ser 20 adequadamente usada como o hospedeiro quando plasmídeos bem conhecidos tal como pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410 é usado para fornecer o replicon. Tipicamente, a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e inibidores de protease individuais podem ser desejavelmente incorporados na cultura de célula.
Alternativamente, métodos in vitro de clonagem, por exemplo, PCR ou outras reações da polimerase do ácido nucleico, são adequados.
Anticorpo de comprimento integral, fragmentos de anticorpo e proteínas de fusão de anticorpo podem ser produzidos em bactérias, em particular quando glicosilação e função efetora de Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) e o imunoconjugado por si só mostra eficácia em destruição de célula de tumor. Anticorpos de comprimento integral têm meia- 5 vida em circulação maior. Produção em E. coli é mais rápida e de custo mais eficiente. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias vide, por exemplo, US 5.648.237 (Carter e outros), U.S. 5.789.199 (Joly e outros) e U.S. 5.840.523 (Simmons e outros) que descrevem região de iniciação de tradução (TIR) e sequências de sinal para otimização da 10 expressão e secreção, essas patentes são aqui incorporadas a título de referência. Após expressão, o anticorpo é isolado de pasta de célula de E. coli em uma fração solúvel e pode ser purificado através de, por exemplo, uma coluna de proteína A ou G dependendo do isotipo. Purificação final pode ser realizada similar ao processo para purificação de anticorpo expresso em, por 15 exemplo, células CHO.
B. CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIÓTICAS
Em adição aos procariontes, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentos ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores de codificação de anticorpo anti-CD79b.
Saccharomyces cerevisiae é um micro-organismo hospedeiro eucariótico inferior comumente usado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada em 2 de maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente U.S. No. 4.943.529; Fleer e outros, Bio/Technoloqy, 9:968-975 (1991)) tais como, por exemplo, K. lactis 25 (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt e outros, J. BacterioL, 154(2):737- 742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg outros, Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna e outros, J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case e outros, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tai como 5 Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicada em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro de 1991) e hospedeiros Aspergillus tal como A. nidulans (Ballance e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn e outros, Gene, 26:20510 221 [1983]; Yelton e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J,, 4:475-479 [1985]). Leveduras metilotrópicas são adequadas aqui e incluem, mas não estão limitadas a, levedura capaz de se desenvolver em metanol selecionado dos gêneros consistindo em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, 15 Torulopsis e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exemplares desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo anti-CD79b glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos 20 de células de invertebrado incluem células de inseto tal como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células de planta, tais como culturas de algodão, milho, batata, soja, amendoim, petúnia, tomate e tabaco. Várias linhagens baculovirais e variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), 25 Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de linhagens virais para transfecção está publicamente disponível, por exemplo, a variante L-1 de NPV de Autographa californica e a linhagem Bm-5 de NPV de Bombyx mori, e tais vírus podem ser usados como o presente vírus de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
No entanto, interesse tem sido maior em células de vertebrado, e 5 propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecido) se tornou um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamífero úteis são linhagem CV1 de rim transformada SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônica humana (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham e outros, J. 10 Gen Virol., 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol, Reprod., 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC 15 CRL-1587); celulas de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL i _ 75); células de fígado humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather e outros, I ■ l 20 Annals N.Y, Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma II linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos acima para produção de anticorpo anti- CD79b e culturadas em meio nutriente convencional modificado conforme 25 apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas.
3. Seleção e Uso de um Vetor Replicável
Para produção recombinante de um anticorpo da invenção, o ácido nucleico (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) codificando-o é isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA codificando o anticorpo é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando 5 sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha de vetor depende em parte da célula hospedeira a ser usada. Em geral, células hospedeiras preferidas são de origem ou procariótica ou eucariótica (geralmente mamífero). 10 O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula virai ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor através de uma variedade de procedimentos. Em geral, DNA é inserido em um sítio(s) de endonuclease de restrição apropriado(s) usando técnicas conhecidas no campo. Componentes de vetor 15 geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento aumentador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. Construção de vetores adequados contendo um ou mais desses componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas do 20 versado no campo.
O CD79b pode ser produzido recombinantemente não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo tendo um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína ou polipeptídeo 25 maduro. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor ou ela pode ser uma parte do DNA codificando anticorpo anti-CD79b que está inserido no vetor. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina estável ao calor II líderes. Para secreção de levedura a sequência de sinal pode ser, por exemplo, a invertase da levedura líder, fator alfa líder (incluindo fator-a líderes Saccharomyces e Khluyveromyces, a última sendo descrita na Patente U.S. No. 5.010.182), ou 5 líder de fosfatase ácida, a glicoamilase de C. albicans líder (EP 362.179 publicada em 4 de abril de 1990) ou o sinal descrito no WO 90/13646 publicado em 15 de novembro de 1990. Em expressão de célula de mamífero, sequências de sinal de mamífero podem ser usadas para direcionar a secreção da proteína, tais como sequências de sinal de polípeptídeos secretados da 10 mesma espécie ou espécie relacionada, bem como líderes secretores virais.
A. CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIÓTICAS
Sequências de polinucleotídeo codificando componentes de polipeptídeo do anticorpo da invenção podem ser obtidas usando técnicas recombinantes padrão. Sequências de polinucleotídeo desejadas podem ser 15 isoladas e seqüenciadas de células de produção de anticorpo tais como células de hibridoma. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizados usando sintetizador de nucleotídeo ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as sequências codificando os polípeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicação e expressando polinucleotídeos heterólogos 20 em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estão disponíveis e conhecidos na técnica podem ser usados para o propósito da presente invenção. Seleção de um vetor apropriado vai depender principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém 25 vários componentes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo ou ambas) e sua compatibilidade com a célula hospedeira particular em que ele reside.
Em geral, muitos vetores de plasmídeo contendo sequências de replicon e controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em conexão com esses hospedeiros. Ambos os vetores de expressão e clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras 5 selecionadas, bem como células de marcação que são capazes de provisão de seleção fenotípica em células transformadas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, levedura e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322, que contém genes codificando resistência à ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e então provê meios fáceis para 10 identificação de células transformadas, é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo 2 μ é adequada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovirus, VSV ou BPV) são úteis para clonagem de vetores em células de mamífero. pBR322, seus derivados, ou outros plasmídeos bacterianos ou bacteriófagos podem também 15 conter, ou ser modificados para conter, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 usados para expressão de anticorpos particulares são descritos em detalhes em Carter e outros, Patente U.S. No. 5.648.237.
Ainda, vetores de fago contendo replicon e sequências controle 20 que são compatíveis com o micro-organismo hospedeiro podem ser usados como vetores de transformação em conexão com esses hospedeiros. Por exemplo, bacteriófago tal como ÀGEM.TM.-11 pode ser utilizado na fabricação de um vetor recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis tal como LE392 de E. coli.
O vetor de expressão da invenção pode compreender dois ou mais pares de promotor-cistron codificando cada um dos componentes do polipeptídeo. Um promotor é uma sequência reguladora não-traduzida localizada a montante (5') para um cistron que modula sua expressão.
Promotores procarióticos tipicamente se encaixam em duas classes, induzíveis e constitutivos. Promotor induzível é um promotor que inicia níveis aumentados de transcrição do cistron sob seu controle em resposta a mudanças na condição de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança em temperatura.
Um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais é bem conhecido. O promotor selecionado pode ser operavelmente ligado a DNA de cistron codificando uma cadeia leve ou pesada através da remoção do promotor do DNA fonte através de digestão de enzima de restrição e inserção da sequência de promotor isolada no vetor da invenção. Ambos a sequência promotora nativa e muitos promotores heterólogos podem ser usados para direcionar amplificação e/ou expressão dos genes-alvo. Em algumas modalidades, promotores heterólogos são utilizados, uma vez que eles geralmente permitem transcrição maior e rendimentos mais altos de gene-alvo expresso comparado com o promotor de polipeptídeo-alvo nativo.
Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Promotores adequados para uso com hospedeiro procarióticos incluem o promotor PhoA, sistemas de promotor de β-lactamase e lactose [Chang e outros, Nature, 275:615 (1978); Goeddel e outros, Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776] e promotores híbridos tal como o tac [deBoer e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:21-25 (1983)] ou o promotor trc. Promotores para uso em sistemas bacterianos também vão conter uma sequência Shine-Dalgarno (S.D.) operavelmente ligada ao DNA codificando anticorpo anti-CD79b. No entanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores bacterianos ou de fago conhecidos) são adequados também. Suas sequências de nucleotídeo foram publicadas, desta maneira permitindo que um versado na técnica os liguem a cistrons codificando as cadeias leves e pesadas-alvo (Siebenlist e outros, (1980) Cell, 20: 269) usando ligantes ou adaptadores para fornecer quaisquer sítios de restrição requeridos.
Em um aspecto da invenção, cada cistron dentro do vetor recombinante compreende um componente de sequência de sinal de secreção que direciona a translocação dos polípeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor ou ela pode ser parte do DNA de polipeptídeo-alvo que é inserido no vetor. A sequência de sinal selecionada para o propósito da presente invenção deve ser uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam as sequências de sinal nativas para os polipeptídeo heterólogos, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, do grupo consistindo na fosfatase alcalina, pecinilinase, Ipp, ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor (STII)f LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Em uma modalidade da invenção, as sequências de sinal usadas em ambos os cistrons do sistema de expressão são sequências de sinal STH ou suas variantes.
Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a invenção pode acontecer no citoplasma da célula hospedeira e então não requer a presença de sequências de sinal de secreção dentro de cada cistron. Com relação a isso, cadeias leves e pesadas da imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Certas linhagens de hospedeiro (por exemplo, as linhagens trxB' de E. coli) proveem condições de citoplasma que são favoráveis para formação de ligação dissulfeto, desta maneira permitindo dobra e montagem adequadas de subunidades de proteína expressas. Proba e Pluckthun, Gene, 159:203 (1995).
A presente invenção provê um sistema de expressão em que a razão quantitativa de componentes de polipeptídeo expressos pode ser modulada a fim de maximizar o rendimento de anticorpos secretados e apropriadamente montados da invenção. Tal modulação é realizada pelo menos em parte modulando simultaneamente resistências traducionais para os componentes de polipeptídeo.
Uma técnica para modulação de resistência traducional é descrita em Simmons e outros, Patente U.S. No. 5.840.523. Ela utiliza variantes da região de iniciação de tradução (TIR) dentro de um cistron. Para uma dada TIR, uma série de variantes de sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico pode ser criada com uma faixa de resistência traducionais, desta maneira provendo um meio conveniente através do qual ajustar este fator para o nível de expressão desejado da cadeia específica. Variantes de TIR podem ser geradas através de técnicas de mutagênese convencionais que resultam em mudanças de códon que podem alterar a sequência de aminoácido, embora mudanças silenciosas na sequência de nucleotídeo sejam preferidas. Alterações na TIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento de sequências Shine-Dalgarno, junto com alterações na sequência de sinal. Um método para geração de sequências de sinal mutantes é a geração de um "banco de códon" no início de uma sequência de codificação que não muda a sequência de aminoácido da sequência de sinal (isto é, as mudanças são silenciosas). Isto pode ser realizado mudando a posição do terceiro nucleotídeo de cada códon; ainda, alguns aminoácidos, tais como leucina, serina e arginina, têm primeira e segunda posições múltiplas que podem agregar complexidade na fabricação do banco. Este método de mutagênese é descrito em detalhes em Yansura e outros (1992) METHODS: A Companion to Methods in EnzymoL 4:151-158.
Preferivelmente, um conjunto de vetores é gerado com uma faixa de resistências de TIR para cada cistron nele. Este conjunto limitado provê uma comparação de níveis de expressão de cada cadeia bem como o rendimento dos produtos de anticorpo desejados sob várias combinações de resistência de TIR. As resistências de TIR podem ser determinadas através da quantificação do nível de expressão de um gene repórter conforme descrito em detalhes em Simmons e outros, Patente U.S. No. 5.840,523. Com base na comparação de resistência traducional, as TIRs individuais desejadas são selecionadas para serem combinadas no construto do vetor de expressão da invenção.
B. CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIÓTICAS
Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais do que segue: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento aumentador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. (1) COMPONENTE DA SEQUÊNCIA DE SINAL
Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucariótica pode também conter uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo tendo um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A sequência de sinal heteróloga selecionada é preferivelmente uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Em uma expressão de célula de mamífero, sequências de sinal de mamífero bem como líderes secretoras virais, por exemplo, o sinal gD do herpes simplex, estão disponíveis.
O DNA para tal região precursora é ligado em estrutura de leitura com o DNA codificando o anticorpo.
(2) ORIGEM DE REPLICAÇÃO
Em geral, um componente da origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero. Por exemplo, a origem de
SV40 pode tipicamente ser usada apenas porque ela contém o promotor precoce.
(3) COMPONENTE DE GENE SELEÇÃO
Vetores de expressão e clonagem vão conter tipicamente um gene de seleção, também chamado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não-disponíveis de meios complexos, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase para Bacilli.
Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a fármaco e então sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante são fármacos neomicina, ácido micofenólico e hidromicina.
Um exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes em absorver o ácido nucleico codificando o anticorpo antí-CD79b, tal como DHFR ou timidina cinase, metalotioneínas I e II, preferivelmente genes da metalotioneína de primata, adenosina desaminase, ornitinina descarboxilase, etc. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR do tipo selvagem é usado é a linhagem de célula CHO deficiente em atividade de DHFR (por exemplo, CRL-9096 ATTC), preparada e propagada conforme descrito por Urlaub e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980). Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção de DHFR são primeiro identificadas através de cultura de todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR.
Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiros do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de DNA codificando um anticorpo, proteína de DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3'- fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas através de crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Vide Patente U.S. No. 4.965.199.
Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 [Stinchcomb e outros, Nature, 282:39 (1979); Kingsman e outros, Gene, 7:141 (1979); Tschemper e outros, Gene, 10:157 (1980)]. O gene trp! provê um marcador de seleção para uma linhagem mutante de levedura sem a habilidade em se desenvolver em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. (4) COMPONENTE DO PROMOTOR
Vetores de expressão e clonagem geralmente contêm um promotor operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico codificando anticorpo anti-CD79b para síntese de mRNA direta. Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos.
Genes virtualmente aleucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio em que transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início de transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição do filamento poli A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas essas sequências são adequadamente inseridas em vetores de expressão eucarióticos.
Exemplos de sequências de promoção adequadas para uso com hospedeiros levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato cinase [Hitzeman e outros, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess e outros, J. Adv. Enzyme Req., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofutocinase, glucose- 6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicocinase.
Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis tendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocroma C, fosfatase ácida, enzimas degradantes associadas com metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso em expressão de levedura são descritos mais na EP 73.657.
Transcrição de anticorpo anti-CD79b a partir de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus tais como polioma vírus, vírus fowlpox (RU 2.211.504 publicada em 5 de julho de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2), papiloma vírus bovino, vírus sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovirus, vírus da hepatite B e Vírus Simiano 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor da imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, contanto que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de célula hospedeira.
Os promotores precoce e tardios do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem de replicação viral de SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição E Hindlll. Um sistema para expressão de DNA em hospedeiros mamíferos usando o vírus papiloma bovino como um vetor é 5 descrito na Patente U.S. No. 4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente U.S. No. 4.601.978. Vide também Reyes e outros, Nature, 297:598-601 (1982) sobre a expressão de cDNA de β-interferon humano em células de camundongo sob o controle de um promotor da timidina cinase do vírus herpes simplex. Alternativamente, a repetição do terminal longo do Vírus 10 do Sarcoma Rous pode ser usada como o promotor.
(5) COMPONENTE DE ELEMENTO AUMENTADOR
Transcrição de um DNA codificando o anticorpo anti-CD79b por eucariontes superiores pode ser aumentada através da inserção de uma sequência aumentadora no vetor. Aumentadores são elementos de ação cis de 15 DNA, geralmente de a partir de 10 a 300 pb, que agem em um promotor para aumentar sua transcrição. Muitas sequências aumentadoras são agora conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, o-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, uma pessoa vai usar um aumentador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o aumentador de SV40 no 20 lado tardio da origem de replicação (PB 100-270), o aumentador do promotor precoce de citomegalovírus, o aumentador de polioma no lado tardio da origem de replicação e aumentadores de adenovirus. Vide também Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre elementos de aumento para ativação de promotores eucarióticos. O aumentador pode ser unido ao vetor em uma posição 5' ou 3' 25 para a sequência de codificação de anticorpo anti-CD79b, mas está preferivelmente localizado no sítio 5' a partir do promotor.
(6) COMPONENTE DA TERMINAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO
Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungos, inseto, planta, animal, humano ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) vão também conter sequências necessárias para o término de transcrição e para estabilização do mRNA. Tais sequências estão geralmente disponíveis das regiões não-traduzidas 5‘ e, ocasionalmente, 3', de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não-traduzida do mRNA codificando anticorpo anti-CD79b. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. Vide WO 94/11026 e o vetor de expressão descrito nele.
Ainda outros métodos, vetores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese de anticorpo anti-CD79b em cultura de célula de vertebrado recombinante são descritos em Gething e outros, Nature, 293:620625 (1981); Mantei e outros, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; eEP 117,058.
4. CULTURA DAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS
As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo anti- CD79b da presente invenção podem ser culturadas em uma variedade de meios.
A. CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIÓTICAS
Células procarióticas usadas para produzir os polipeptídeos da invenção são cultivadas em meio conhecido na técnica e adequado para cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meio adequado incluem caldo Luria (LB) mais suplementos nutrientes necessários. Em algumas modalidades, o meio também contém um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletivamente crescimento de células procarióticas contendo o vetor de expressão. Por exemplo, ampicilina é adicionada ao meio para crescimento de células expressando gene resistente à ampicilina.
Quaisquer suplementos necessários além das fontes de carbono, nitrogênio e fosfato inorgânico podem ser também incluídos em concentrações apropriadas introduzidos sozinhos ou como uma mistura com outro suplemento ou meio tal como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente o meio de cultura pode conter um ou mais agentes de redução selecionados do grupo consistindo em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.
As células hospedeiras procarióticas são culturadas em temperaturas adequadas. Para crescimento de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia de a partir de cerca de 20° C a cerca de 39° C, mais preferivelmente de a partir de cerca de 25° C a cerca de 37° C, mais preferivelmente ainda em cerca de 30° C. O pH do meio pode ser qualquer pH variando de a partir de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é preferivelmente de a partir de cerca de 6,8 a cerca de 7,4 e mais preferivelmente cerca de 7,0.
Se um promotor induzível for usado no vetor de expressão da invenção, expressão de proteína é induzida sob condições adequadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da invenção, promotores PhoA são usados para controle da transcrição dos polipeptídeos. Desta maneira, as células hospedeiras transformadas são culturadas em um meio limitante de fosfato para indução. Preferivelmente, o meio limitante de fosfato é o meio C.R.A.P. (vide, por exemplo, Simmons e outros, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser usada, de acordo com o construto de vetor empregado, como é conhecido na técnica.
Em uma modalidade, os polipeptídeos expressos da presente invenção são secretados em e recuperados do periplasma das células hospedeiras. Recuperação de proteína tipicamente envolve rompimento do micro-organismo, geralmente através de meios tal como choque osmótico, sonificação ou lise. Uma vez rompidas as células, os restos de célula ou células inteiras podem ser removidos através de centrifugação ou filtragem. As proteínas podem ser purificadas mais, por exemplo, através de cromatografia de resina por afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para os meios de cultura e isoladas neles. As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante da cultura sendo filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polípeptídeos expressos podem ser isolados mais e identificados usando métodos geralmente conhecidos tais como eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaio Western blot.
Em um aspecto da invenção, produção de anticorpo é conduzida em grande quantidade por um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação em fed-batch de grande escala estão disponíveis para produção de proteínas recombinantes. Fermentações em grande escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade, preferivelmente cerca de 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Esses fermentadores usam propulsores de agitador para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose (a fonte de carbono/energia preferida). Fermentação em pequena escala refere-se em geral à fermentação em um fermentador que não é mais do que aproximadamente 100 litros de capacidade volumétrica, e pode variar de a partir de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.
Em um processo de fermentação, indução de expressão de proteína é tipicamente iniciada após as células terem sido cultivadas sob condições adequadas para uma densidade desejada, por exemplo, OD550 de cerca de 180-220, estágio em que as células estão na fase estacionária precoce. Uma variedade de indutores pode ser usada, de acordo com o construto de vetor empregado, como é conhecido na técnica e descrito acima.
As células podem ser cultivadas por períodos de tempo mais curtos antes da indução. As células são geralmente induzidas por cerca de 12-50 horas, embora tempo de indução mais longo ou mais curto possa ser usado.
Para melhorar o rendimento da produção e a qualidade dos polipeptídeos da invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para melhorar a montagem e a dobra apropriadas dos polipeptídeos de anticorpo secretados, vetores adicionais superexpressando proteínas chaperona, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil cis.trans-isomerase com atividade chaperona) podem ser usados para co-transformar as células hospedeiras procarióticas. As proteínas chaperona foram demonstradas facilitar a dobra e a solubilidade apropriadas de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen e outros (1999), J. Bio. Chem,, 274:19601-19605; Georgiou e outros, Patente U.S. No. 6.083.715; Georgiou e outros, Patente U.S. No. 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem., 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem., 275:17106-17113; Arie e outros (2001), Mol. Microbiol. 39:199-210.
Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente aquelas que são proteoliticamente sensíveis), certas linhagens hospedeiro deficientes quanto a enzimas proteolíticas podem ser usadas para a presente invenção. Por exemplo, linhagens de célula hospedeira podem ser modificadas para realizar mutação(ões) genética(s) nos genes codificando proteases bacterianas conhecidas tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e suas combinações. Algumas linhagens deficientes em protease de E. coli estão disponíveis e descritas em, por exemplo, Joly e outros (1998), supra; Georgiou e outros, Patente U.S. No. 5.264.365; Georgiou e outros, Patente U.S. No. 5,508,192; Hara e outros, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
Em uma modalidade, linhagens de E. coli deficientes quanto a enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos superexpressando uma ou mais proteínas chaperona são usadas como células hospedeiras no sistema de expressão da invenção.
B. CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIÓTICAS
Meios comercialmente disponíveis tais como Ham's 10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio da Eagle Modificado com da Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Ainda, qualquer um dos meios descritos em Ham e otros, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes e outros, Anal Biochem., 102:255 (1980), Patente U.S. No. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. 30.985 pode ser usado como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidermal), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tal como adenosina e timidina), antibióticos (tal como o fármaco GENTAMYCIN®), elementos traços (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem ser também incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas daqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similar, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão aparentes ao versado comum.
5. DETECÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO/EXPRESSÃO DE GENE
Amplificação e/ou expressão de gene pode ser medida em uma amostra diretamente, por exemplo, através de Southern blotting Northern blotting convencionais, para quantificar a transcrição de mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de DNA) ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas sequências providas aqui. Alternativamente, anticorpos podem ser empregados, os quais podem reconhecer dúplices específicos, incluindo dúplices de DNA, dúplices de RNA e dúplices de híbrido de DNA-RNA ou dúplices de DNA-proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser marcados e o ensaio pode ser realizado em que o dúplex é ligado a uma superfície, de maneira que quando da formação de dúplex sobre a superfície, a presença de anticorpo ligado ao dúplex pode ser detectada.
Expressão de gene, alternativamente, pode ser medida através de métodos imunológicos, tal como tingimento imunoistoquímico de células ou seções de tecido e ensaio de cultura de célula ou fluidos do corpo, para quantificar diretamente a expressão de produto de gene. Anticorpos úteis para tingimento imunoistoquímico e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser ou monoclonais ou policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipeptídeo de CD79b de sequência nativa ou contra um peptídeo sintético com base nas sequências de DNA providas aqui ou contra sequência exógena fundida a DNA de CD79b e codificando um epitopo de anticorpo específico.
6. PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD79B
Formas de anticorpo anti-CD79b podem ser recuperadas de meio de cultura ou de lisatos de célula hospedeira. Se ligado à membrana, ele pode ser solto da membrana usando uma solução detergente adequada (por exemplo, Triton-X 100) ou através de clivagem enzimática. Células empregadas em expressão de anticorpo anti-CD79b podem ser rompidas através de vários meios físicos ou químicos, tal como ciclo de congelamento- descongelamento, sonificação, rompimento mecânico ou agentes de lise celular.
Pode ser desejado purificar anticorpo anti-CD79b de proteínas ou polipeptídeos de célula recombinante. Os procedimentos que seguem são exemplares de procedimentos de purificação adequados: através de fracionamento em uma coluna de troca de íon; precipitação de etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca de cátion tal como DEAE; cromatofoco; SDS-PAGE; precipitação de sulfato de amónio; filtragem em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tal como IgG; e colunas de quelação de metal para ligar formas epitopo-marcado do anticorpo anti-CD79b. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nova York (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s) vai/vão depender, por exemplo, da natureza do processo de produção usado e do anticorpo anti-CD79b particular produzido.
Quando usando técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os restos de partícula, ou células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltragem. Carter e outros, Bio/Technoloqy, 10:163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolamento de anticorpos que são secretados para o espaço periplásmico de E. coli. Em suma, pasta de célula é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) durante cerca de 30 minutos. Restos de célula podem ser removidos através de centrifugação. Em que o anticorpo for secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de filtragem Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas acima para inibir proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de 5 contaminantes futuros.
A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da 10 proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas y1, y2 ou y4 humanas (Lindmark e outros, J. Immunol, Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de 15 camundongo e para y3 humana (Guss e outros, EMBO J., 5:15671575 (1986)). i '
A matriz à qual o ligante por afinidade é ligado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tal como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que pode ser 20 conseguido com agarose. Em que o anticorpo compreender um domínio CH3, a resina ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína tais como fracionamento em uma coluna de troca de íon, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE® cromatografia em uma 25 resina de troca de ânion ou cátion (tal como coluna de ácido poliaspártico), cromatofoco, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amónio estão também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.
Seguindo qualquer etapa(s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida à cromatografia de interação hidrofóbica de pH baixo usando um tampão de eluição em um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferivelmente realizada em concentrações de sal baixas (por exemplo, de a partir de cerca de 0-0,25 M de sal).
G. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da invenção podem ser administrados através de qualquer via apropriada para a condição a ser tratada. O ADC será tipicamente administrado parenteralmente, isto é, infusão, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradermal, intratecal e epidural.
Para tratamento desses cânceres, em uma modalidade, o conjugando anticorpo-fármaco é administrado através de infusão intravenosa. A dosagem administrada através de infusão está na faixa de cerca de 1 μg/m2 a cerca de 10.000 μg/m2 por dose, geralmente uma dose por semana para um total de uma, duas, três ou quatro doses. Alternativamente, a faixa de dosagem é de cerca de 1 μg/m2 a cerca de 1000 μg/m2, cerca de 1 μg/m2 a cerca de 800 μg/m2, cerca de 1 μg/m2 a cerca de 600 μg/m2, cerca de 1 μg/m2 a cerca de 400 μg/m2, cerca de 10 μg/m2 a cerca de 500 μg/m2, cerca de 10 μg/m2 a cerca de 300 μg/m2, cerca de 10 μg/m2 a cerca de 200 μg/m2 e cerca de 1 μg/m2 a cerca de 200 μg/m2. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez por semana, múltiplas vezes por semana, mas menos do que uma vez por dia, múltiplas vezes por mês, mas menos do que uma vez por dia, múltiplas vezes por mês, mas menos do que uma vez por semana, uma vez por mês ou intermitentemente para parar ou aliviar sintomas da doença. A administração pode continuar em qualquer um dos intervalos descritos até remissão do tumor ou sintomas do linfoma, leucemia, sendo tratados, A administração pode continuar após remissão ou alívio dos sintomas serem obtidos, em que tal remissão ou alívio é prolongado portal administração continuada.
A invenção também provê um método de alívio de uma doença autoimune compreendendo administrar a um paciente sofrendo da doença autoimune uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado anticorpo MA79b humanizado-fármaco de qualquer uma das modalidades anteriores. Em 5 modalidades preferidas, o anticorpo é administrado intravenosamente ou subcutaneamente. O conjugado anticorpo-fármaco é administrado intravenosamente em uma dosagem na faixa de cerca de 1 μg/m2 a cerca de 100 mg/m2 por dose e em uma modalidade específica, a dosagem é 1 μg/m2 a cerca de 500 μg/m2. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez 10 por semana, múltiplas vezes por semana, mas menos do que uma vez por dia, múltiplas vezes por mês, mas menos do que uma vez por dia, múltiplas vezes por mês, mas menos do que uma vez por semana, uma vez por mês ou intermitentemente para parar ou aliviar os sintomas da doença. Administração pode continuar em qualquer um dos intervalos descritos até o parada ou alívio 15 de sintomas da doença autoimune sendo tratada. A administração pode continuar após parada ou alívio dos sintomas ser obtido em que tal parada ou alívio é prolongado portal administração continuada.
A invenção também provê um método de tratamento de distúrbio de célula B compreendendo administrar a um paciente sofrendo de um 20 distúrbio de célula B, tal como um distúrbios proliferativo de célula B (incluindo sem limitação linfoma e leucemia) ou uma doença autoimune, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo MA79b humanizado de qualquer uma das modalidades anteriores, anticorpo que não é conjugado a uma molécula citotóxica ou uma molécula detectável. O anticorpo será tipicamente 25 administrado em uma faixa de dosagem de cerca de 1 μg/m2 a cerca de 1000 mg/m2.
Em um aspecto, a invenção provê ainda formulações farmacêuticas compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b da invenção e/ou pelo menos um imunoconjugado do mesmo e/ou pelo menos um conjugado de anticorpo anti-CD79b-fármaco da invenção. Em algumas modalidades, uma formulação farmacêutica compreende (1) um anticorpo da invenção e/ou um imunoconjugado do mesmo e (2) um carreador 5 farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma formulação farmacêutica compreende (1) um anticorpo da invenção e/ou um imunoconjugado do mesmo, e, opcionalmente, (2) pelo menos um agente terapêutico adicional. Agentes terapêuticos adicionais incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos abaixo. O ADC será tipicamente administrado 10 parenteralmente, isto é, infusão, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradermal, intratecal e epidural.
Formulações terapêuticas compreendendo um anticorpo anti- CD79b ou imunoconjugado de CD79b usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento através de mistura do anticorpo 15 ou imunoconjugado, tendo o grau de pureza desejado, com carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes ou estabilizadores adequados são não-tóxicos para o recipiente nas dosagens e 20 concentrações empregadas e incluem tampões tais como acetato, Tris, fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservativos (tais como cloreto de octadecildimetibenzil amónio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou benzil álcool; alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno; 25 catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarideos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação tal como EDTA; tonificantes tais como trealose e cloreto de sódio; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; tensoativo tal como polysorbato; contraíons de formação de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos tal como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Formulações farmacêuticas a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. Isto é prontamente conseguido através de filtragem por membranas de filtragem estéreis.
As presentes formulações podem também conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetam de modo adverso um ao outro. Por exemplo, em adição a um anticorpo anti- CD79b, pode ser desejável incluir na formulação um anticorpo adicional, por exemplo, um segundo anticorpo anti-CD79b que se liga a um epitopo diferente no polipeptídeo de CD79b, ou um anticorpo para algum outro alvo tal como fator de crescimento que afeta o crescimento do câncer particular. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição compreende ainda um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citocina, agente de inibição de crescimento, agente anti-hormonal e/ou cardioprotetores. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
Os ingredientes ativos podem ser também aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de aplicação de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas.
Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(vinilálcool), polilactídeos (Patente U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e y etil-L-glutamato, copolímeros de etielno-acetato de vinila não-degradáveis, ácido láctico-ácido glícólico degradável tal como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico- ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Embora polímeros tais como de etileno-acetato de vinila e ácido láctico-ácido glicólico permitam liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando imunoglobulinas encapsuladas permanecem no corpo por um longo tempo, elas podem desnaturar ou agregar como um resultado de exposição à umidade 20 a 37° C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças em imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser previstas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação for constatado ser formação de ligação S-S intermolecular através de intertroca tio-dissulfeto, estabilização pode ser 25 conseguida através da modificação de resíduo sulfidrila, liofilização a partir de soluções ácidas, controle do teor de umidade, uso de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz de polímero específicas.
Um anticorpo pode ser formulado em qualquer forma adequada para aplicar a uma célula/tecido-alvo. Por exemplo, anticorpos podem ser formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo que é útil para aplicação de um fármaco a um mamífero. Os componentes do lipossoma são geralmente dispostos em uma formação de bicamada, similar à disposição de lipídeo de membranas biológicas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados através de métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); Patentes U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e WO97/38731 publicado em 23 de outubro de 1997. Lipossomas com tempo de circulação aumentado são descritos na Patente U.S. No. 5.013.556.
Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo compreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para dar lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomas conforme descrito em Martin e outros, J. Biol, Chem., 257:286-288 (1982) através de uma reação intercadeia dissulfeto. Um agente quimioterapêutico está opcionalmente contido no lipossoma. Vide Gabizon e outros, J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).
As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado através de filtragem por membranas de filtragem estéreis.
H. TRATAMENTO COM ANTICORPOS ANTI-CD79B
Para determinar a expressão de CD79b no câncer, vários ensaios de detecção estão disponíveis. Em uma modalidade, superexpressão do polipeptídeo de CD79b pode ser analisada através de imunoistoquímica (IHC). Seções de tecido embebidas em parafina de uma biópsia de tumor podem ser submetidas ao ensaio de IHC e se conformar a critérios de intensidade de tingimento de proteína de CD79b como segue: Score 0 - nenhum tingimento é observado ou tingimento de membrana é observado em menos do que 10% de células de tumor. Score 1+ - um tingimento de membrana fraco/dificilmente perceptível é detectado em mais do que 10% das células de tumor. As células são apenas tingidas em parte de sua membrana. Score 2+ - um tingimento de membrana completo fraco a moderado é observado em mais de 10% das células de tumor. Score 3+ - um tingimento de membrana moderado a forte é observado em mais de 10% das células de tumor.
Aqueles tumores com scores 0 ou 1+ para expressão de polipeptídeo de CD79b podem ser caracterizados como não superexpressando CD79b, enquanto aqueles tumores com scores 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como superexpressando CD79b.
Alternativamente, ou adicionalmente, ensaios FISH tal como INFORM® (vendido pela Ventana, Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois) podem ser realizados em tecido de tumor embebido em parafina, fixado com formalina, para determinar a extensão (se alguma) da superexpressão de CD79b no tumor.
A superexpressão ou amplificação de CD79b pode ser avaliada usando um ensaio de detecção in vivo, por exemplo, através da administração de uma molécula (tal como um anticorpo) que se liga à molécula a ser detectada e é marcada com um marcador detectável (por exemplo, um isótopo radioativo ou um marcador fluorescente) e externamente realizando uma varredura no paciente para localização do marcador.
Conforme acima descrito, os anticorpos anti-CD79b da invenção têm várias aplicações terapêuticas. Os anticorpos anti-CD79b da presente invenção podem ser úteis para verificação do estágio de cânceres de expressão de polipeptídeo de CD79b (isto é, radioimagem). Os anticorpos são 5 também úteis para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de CD79b a partir de células, para detecção e quantificação de polipeptídeo de D79b in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot, para matar ou eliminar células expressando CD79b de uma população de células mistas como uma etapa na purificação de outras células.
Atualmente, dependendo do estágio do câncer, tratamento de câncer envolve uma ou uma combinação das terapias que seguem: cirurgia para remover o tecido canceroso, terapia com radiação e quimioterapia. Terapia de anticorpo anti-CD79b pode ser especialmente desejável em pacientes idosos que não toleram a toxidez e efeitos colaterais de 15 quimioterapia bem e em doença metastática em que terapia com radiação tem utilidade limitada. Os anticorpos anti-CD79b de direcionamento a tumor da invenção são úteis para aliviar cânceres expressando CD79b quando do diagnóstico inicial da doença ou durante relapso. Para aplicações terapêuticas, o anticorpo anti-CD79b pode ser usado sozinho ou em terapia de combinação 20 com, por exemplo, hormônios, antiangiogênicos ou compostos radiomarcados ou com cirurgia, crioterapia e/ou radioterapia. Tratamento com anticorpo anti- CD79b pode ser administrado em conjunto com outras formas de terapia convencional ou consecutivamente com pré- ou pós-terapia convencional. Fármacos quimioterapêuticos tais como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® 25 (paclitaxel), estramustina e mitoxantrona são usados no tratamento de câncer, em particular em pacientes com muito risco. No presente método da invenção para tratamento ou alívio de câncer, o paciente com câncer pode ser administrado com anticorpo anti-CD79b em conjunto com tratamento com um ou mais dos agentes quimioterapêuticos acima. Em particular, terapia de combinação com paclitaxel e derivados modificados (vide, por exemplo, EP0600517) é compreendida. O anticorpo anti-CD79b será administrado com uma dose terapeuticamente eficaz do agente quimioterapêutico. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD79b é administrado em conjunto com quimioterapia para aumentar a atividade e a eficácia do agente quimioterapêutico, por exemplo, paclitaxel. O Physicians' Desk Reference (PDR) revela dosagens desses agentes que têm sido usadas no tratamento de vários cânceres. O regime de dosagem e as dosagens desses fármacos quimioterapêuticos mencionados acima que são terapeuticamente eficazes vão depender do câncer particular sendo tratado, da extensão da doença e outros fatores familiares ao médico de habilidade na técnica e podem ser determinados pelo médico.
Em uma modalidade particular, um conjugado compreendendo um anticorpo anti-CD79b conjugado com um agente citotóxico é administrado ao paciente. Preferivelmente, o imunoconjugado ligado à proteína CD79b é internalizado pela célula, resultando em eficácia terapêutica aumentada do imunoconjugado em matar a célula de câncer à qual ele se liga. Em uma modalidade preferida, o agente citotóxico se direciona ao ou interfere com o ácido nucleico na célula de câncer. Exemplos de tais agentes citotóxicos são descritos acima e incluem maitansinoides, calícheamicinas, ribonucleases e endonucleases de DNA.
Os anticorpos anti-CD79b ou conjugados de toxina dos mesmos são administrados a um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa, por exemplo, como um bolo ou através de infusão contínua durante um período de tempo, através de via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica ou inalação. Administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo é preferida.
Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração do anticorpo anti-CD79b. A administração combinada inclui co- administração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e administração consecutiva em qualquer ordem, em que preferivelmente há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas. Preferivelmente tal terapia combinada resulta em um efeito terapêutico sinergístico.
Pode ser também desejável combinar administração do anticorpo ou anticorpos anti-CD79b com administração de um anticorpo direcionado contra outro antígeno de tumor associado com o câncer particular.
Em outra modalidade, os métodos de tratamento terapêutico da presente invenção envolvem a administração combinada de um anticorpo anti- CD79b (ou anticorpos) e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores de crescimento, incluindo co-administração de coquetéis de agentes quimioterapêuticos diferentes ou outro(s) agente(s) citotóxico(s) ou outro(s) agente(s) terapêutico(s) que também inibem crescimento de tumor. Agentes quimioterapêuticos incluem fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina, 5-fluoruracila, melfalano, ciclofosfamida, hidroxiureia e hídroxiureataxanos (tais como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos antraciclina. Programas de preparação e dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou conforme determinado empiricamente pelo praticante versado. Programas de preparação e dosagem para tal quimioterapia são também descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). O anticorpo pode ser combinado com um composto anti-hormonal; por exemplo, um composto antiestrogênio tal como tamoxifeno; uma antiprogesterona tal como onapristona (vide EP 616 812); ou um antiandrogênio tai como flutamida, em dosagens conhecidas para tais moléculas. Em que o câncer a ser tratado é câncer independente de androgênio, o paciente pode previamente ter sido submetido à terapia antiandrogênio e, após o câncer se tornar independente de androgênio, o anticorpo anti-CD79b (e opcionalmente outros agentes conforme aqui descrito) podem ser administrados ao paciente.
Algumas vezes, pode ser benéfico também co-administrar um cardioprotetor (para prevenir ou reduzir a disfunção miocardial associada com a terapia) ou uma ou mais citocinas ao paciente. Em adição aos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células de câncer e/ou terapia com radiação (por exemplo, irradiação de feixe externo ou terapia com um agente marcado radioativo, tal como um anticorpo), antes, simultaneamente com ou pós-terapia com anticorpo. Dosagens adequadas para qualquer um dos agentes co-administrados acima são aquelas aqui usadas e podem ser diminuídas devido â ação combinada (sinergia) do agente e anticorpo anti-CD79b.
A composição de anticorpo da invenção será formulada, dosada e administrada de uma maneira consistente com boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de aplicação do agente, o método de administração, o programa de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes de medicina. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente, formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpos da invenção presentes na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e outros fatores discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração usadas aqui antes ou de a partir de cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até o presente.
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem e o modo de administração serão escolhidos pelo médico de acordo com critérios conhecidos. A dosagem do anticorpo apropriada vai depender do tipo de doença a ser tratada, conforme acima definido, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, a história clínica do paciente e resposta ao anticorpo e a opinião do médico acompanhante. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos. Preferivelmente, o anticorpo é administrado através de infusão intravenosa ou através de injeções subcutâneas. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a cerca de 50 mg/kg de peso do corpo (por exemplo, dose de cerca de 0,1-15 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas ou através de infusão contínua. Um regime de dosagem pode compreender administração em uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo anti-CD79b. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Uma dosagem diária típica pode variar de a partir de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante vários dias ou rnais, dependendo da condição, o tratamento é prolongado até que uma supressão desejada dos sintomas da doença aconteça. O progresso desta terapia pode ser prontamente monitorado através de métodos e ensaios convencionais e baseados em critérios conhecidos do médico ou outras pessoas na técnica.
Além da administração da proteína de anticorpo ao paciente, a presente aplicação compreende administração do anticorpo através de terapia de gene. Tal administração de ácido nucleico codificando o anticorpo é compreendida pela expressão "administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo". Vide, por exemplo, WO96/07321 publicado em 14 de março de 1996 com relação ao uso de terapia de gene para gerar anticorpos intracelulares. Há duas abordagens principais para inserir o ácido nucleico (opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente; in vivo e ex vivo. Para aplicação in vivo, o ácido nucleico é injetado diretamente no paciente, geralmente no sítio em que o anticorpo é requerido. Para tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paciente ou diretamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que são implantadas no paciente (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.892.538 e 5.283.187). Há uma variedade de técnicas disponíveis para introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido para células de cultura in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem o uso de lípossomas, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, o método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. Um vetor geralmente usado para aplicação ex vivo do gene é um vetor retroviral.
As técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo atualmente preferidas incluem transfecção com vetores virais (tal como adenovirus, vírus Herpes Simplex I ou vírus adenoassociado) e sistemas à base de lipídeo (lipídeos úteis para transferência mediada por lipídeo do gene são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo). Para revisão dos protocolos de marcação de gene e terapia de gene atualmente conhecidos vide Anderson e outros, Science, 256:808-813 (1992). Vide também o WO 93/25673 e as referências citadas nele.
Os anticorpos anti-CD79b da invenção podem estar nas diferentes formas compreendidas pela definição de "anticorpo" aqui. Desta maneira, os anticorpos incluem anticorpo de comprimento integral ou intacto, fragmentos de anticorpo, anticorpo de sequência nativa ou variantes de 5 aminoácido, anticorpos humanizados, quiméricos ou de fusão, imunoconjugados e fragmentos funcionais dos mesmos. Em anticorpos de fusão, uma sequência de anticorpo é fundida a uma sequência de polipeptídeo heteróloga. Os anticorpos podem ser modificados na região Fc para prover funções efetoras desejadas. Conforme discutido em mais detalhes nas 10 presentess seções, com as regiões Fc apropriadas, o anticorpo nu ligado na superfície celular pode induzir citotoxidez, por exemplo, através de cicototoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) ou através de recrutamento de complemento em citotoxidez dependente de complemento ou algum outro mecanismo. Alternativamente, em que for desejável eliminar ou 15 reduzir funções efetoras, de maneira a minimizar os efeitos colaterais ou complicações terapêuticas, certas outras regiões Fc podem ser usadas.
Em uma modalidade, o anticorpo compete para ligação ou se liga substancialmente ao mesmo epitopo que os anticorpos da invenção. Anticorpos tendo as características biológicas dos presentes anticorpos anti-CD79b da 20 invenção são também compreendidos, especificamente incluindo o direcionamento a tumor in vivo e quaisquer características de inibição de proliferação de célula ou citotóxicas.
Métodos de produção dos anticorpos acima são descritos em detalhes aqui.
Os presentes anticorpos anti-CD79b são úteis para tratamento de um câncer expressando CD79b ou alívio de um ou mais sintomas do câncer em um mamífero. Tais cânceres incluem, mas não estão limitados a, cânceres hematopoiéticos ou cânceres relacionados a sangue, tais como linfoma leucemia, mieloma ou males linfoides, mas também cânceres do baço e cânceres dos nós linfáticos. Exemplos mais particulares de tais cânceres associados à célula B incluindo, por exemplo, linfomas de graus algo, intermediário e baixo (incluindo linfomas de célula B tal como, por exemplo, linfoma de célula B de tecido linfoide associado à mucosa e Linfoma Não- Hodgkin, linfoma da célula do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula grande difusa, linfoma folicular e linfoma de Hodgkin e linfomas de célula T) e leucemias (incluindo leucemia secundária, leucemia linfocítica crônica, tal como leucemia de célula B (CD5 + linfócitos B), leucemia mieloide, tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide, tal como leucemia linfoblástica aguda e mielodisplasia), e outros cânceres hematológicos e/ou associados à célula B ou célula T. Os cânceres compreendem cânceres metastáticos de qualquer um dos acima. O anticorpo é capaz de se ligar a pelo menos uma porção das células de câncer que expressam polipeptídeo de CD79b no mamífero. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é eficaz para destruir ou matar células de tumor expressando CD79b ou inibir o crescimento de tais células de tumor, in vitro ou in vivo, quando da ligação ao polipeptídeo de CD79b na célula. Tal anticorpo inclui um anticorpo anti-CD79b nu (não conjugado a nenhum agente). Anticorpos nus que têm propriedades citotóxicas ou de inibição de crescimento celular podem ser controlados com um agente citotóxico para torná-los ainda mais potentes em destruição de célula de tumor. Propriedades citotóxicas podem ser conferidas a um anticorpo anti-CD79b através de, por exemplo, conjugação do anticorpo com um agente citotóxico, para formar um imunoconjugado conforme aqui descrito. O agente citotóxico ou um agente inibidor de crescimento é preferivelmente uma molécula pequena. Toxinas tal como calicheamicina ou um maitansinoide ou seus análogos ou derivados são preferíveis.
A invenção provê uma composição compreendendo um anticorpo anti-CD79b da invenção e um carreador. Para os propósitos de tratamento de câncer, as composições podem ser administradas ao paciente com necessidade de tal tratamento, em que a composição pode compreender um ou mais anticorpos anti-CD79b presentes como um imunoconjugado ou como o anticorpo nu. Em uma modalidade adicional, as composições podem compreender esses anticorpos em combinação com outros agentes terapêuticos tais como agentes citotóxicos ou de inibição de crescimento, incluindo agentes quimioterapêuticos. A invenção também provê formulações compreendendo um anticorpo anti-CD79b da invenção e um carreador. Em uma modalidade, a formulação é uma formulação terapêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável.
Outro aspecto da invenção são ácidos nucleicos isolados codificando os anticorpos anti-CD79b. Ácidos nucleicos codificando ambas as cadeias H e L e especialmente os resíduos da região hipervariável, cadeias que codificam o anticorpo de sequência nativa bem como variantes, modificações e versões humanizadas do anticorpo são compreendidos.
A invenção também provê métodos úteis para tratamento de um câncer expressando polipeptídeo de CD79b ou alívio de um ou mais sintomas do câncer em um mamífero compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD79b ao mamífero. As composições terapêuticas de anticorpo podem ser administradas a curto prazo (aguda) ou crônicas ou intermitente conforme orientado pelo médico. São também providos métodos de inibição do crescimento de e morte de uma célula expressando polipeptídeo de CD79b.
A invenção também provê estojos e artigos de fabricação compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b. Estojos contendo anticorpos anti-CD79b encontram uso, por exemplo, para ensaios de morte de célula CD79b, para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de CD79b de células. Por exemplo, para isolamento e purificação de CD79b, o estojo pode conter um anticorpo anti-CD79b acoplado a contas (por exemplo, contas de sepharose). Os estojos podem ser providos, os quais contêm os anticorpos para detecção e quantificacao de CD79b in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot. Tal anticorpo útil para detecção pode ser provido com um marcador tal como um fluorescente ou radiomarcador.
I. TRATAMENTOS COM CONJUGADO ANTICORPO-FÁRMACO
É compreendido que os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da presente invenção podem ser usados para tratar várias doenças ou distúrbios, por exemplo, caracterizados pela superexpressão de um antígeno de tumor. Condições ou distúrbios hiperproliferativos exemplares incluem tumores benignos ou malignos; leucemia e males linfoides. Outros incluem distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos, glandulares, macrofageais, epiteliais, estromais, blastocoélicos, inflamatórios, angiogênicos e imunológicos, incluindo distúrbios autoimunes.
Os compostos de ADC que são identificados nos modelos animais e ensaios baseados em célula podem ser testados mais em primatas superiores carregando tumor e testes clínicos humanos. Testes clínicos humanos podem ser planejados para testar a eficácia do anticorpo monoclonal anti-CD79b ou imunoconjugado da invenção em pacientes sofrendo de um distúrbio proliferativo de célula B incluindo, sem limitação, linfoma, Linfoma Não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL refratário indolente, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto. O teste clínico pode ser planejado para avaliar a eficácia de um ADC em combinações com regimes terapêuticos conhecidos, tal como radiação e/ou terapia envolvendo agentes quimioterapêuticos e/ou citotóxicos conhecidos.
Em geral, a doença ou distúrbio a ser tratado é uma doença hiperproliferativa tal como um distúrbio proliferativo de célula B e/ou um câncer de célula B. Exemplos de câncer a ser tratado aqui incluem, mas não estão limitados a, distúrbio proliferativo de célula B selecionado de linfoma, Linfoma Não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto,
O câncer pode compreender células expressando CD79b, de maneira que os ADCs da presente invenção são capazes de ligar a células de câncer. Para determinar a expressão de CD79b no câncer, vários ensaios de diagnóstico/prognóstico estão disponíveis. Em uma modalidade, superexpressão de CD79b pode ser analisada através de IHC. Seções de tecido embebidas em parafina de uma biópsia de tumor podem ser submetidas ao ensaio de HC e acordadas com critérios de intensidade de tingimento de proteína de CD79b com relação ao grau de tingimento e em qual proporção de células de tumor examinada.
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um ADC vai depender do tipo de doença a ser tratada, conforme acima definido, da gravidade e do curso da doença, seja a molécula administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, a história clínica do paciente e resposta ao anticorpo, e a opinião do médico acompanhante. A molécula é adequadamente administrada ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de molécula é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas, ou através de infusão contínua. Uma dosagem diária típica variaria de a partir de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dosagem exemplar de ADC a ser administrada a um paciente está na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso do paciente.
Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é prolongado até que uma supressão desejada de sintomas da doença aconteça. Um regime de dosagem exemplar compreende administração em uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg de um anticorpo anti-Erb2. Outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado através de técnicas e ensaios convencionais.
J. TERAPIA DE COMBINAÇÃO
Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção pode ser combinado em uma formulação de combinação farmacêutica, ou regime de dosagem como terapia de combinação, com um segundo composto tendo propriedades anticâncer. O segundo composto da formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem tem preferivelmente atividades complementares ao ADC da combinação de maneira que eles não afetam de maneira adversa um ao outro.
O segundo composto pode ser um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citocina, agente inibidor de crescimento, agente anti- hormonal e/ou cardioprotetor. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. Uma composição farmacêutica contendo um ADC da invenção pode também ter uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterapêutico tal como um inibidor de formação de tubulina, um inibidor de topoisomerase ou um aglutinante de DNA.
Em um aspecto, o primeiro composto é um ADC anti-CD79b da invenção e o segundo composto é um anticorpo anti-CD20 (ou um anticorpo nu ou um ADC). Em uma modalidade, o segundo composto é um anticorpo anti- CD20 rituximabe (Rituxan®) ou 2H7 (Genentech, Inc., São Francisco do Sul, 5 CA). Outros anticorpos úteis para imunoterapia combinada com ADCs anti- CD79b da invenção incluem sem limitação anti-VEGF (por exemplo, Avastin®).
Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração de agente anticâncer identificado de acordo com a presente invenção, incluindo, sem limitação, terapia com radiação e/ou transplantes de 10 medula óssea e sangue periférico e/ou um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico ou um agente inibidor de crescimento. Em uma de tais modalidades, um agente quimioterapêutico é um agente ou uma combinação de agentes tal como, por exemplo, ciclofosfamida, hdiroxidaunorrubicina, doxorrubicina, vincristina (Oncovin®), prednisolona, CHOP, CVP ou COP, ou 15 imunoterapêuticos tal como anti-CD20 (por exemplo, Rituxan®) ou anti-VEGF (por exemplo, Avastin®).
A terapia de combinação pode ser administrada como um regime simultâneo ou sequencial. Quando administrada sequencialmente, a combinação pode ser administrada em duas ou mais administrações. A 20 administração combinada inclui co-administração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e administração consecutiva em qualquer ordem, em que preferivelmente há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.
Em uma modalidade, tratamento com um ADC envolve a administração combinada de um agente anticâncer identificado aqui e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes de inibição de crescimento, incluindo co-administração de coquetéis de agentes quimioterapêuticos diferentes. Agentes quimioterapêuticos incluem taxanos (tal como paclitaxel ou docetaxel) e/ou antibióticos antraciclina. Programas de preparação e dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou conforme determinado empiricamente pelo 5 praticante na técnica. Programas de preparação e dosagem para tal quimioterapia são também descritos em "Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
Dosagens adequadas para qualquer um dos agentes co- administrados acima são aquelas aqui usadas e podem ser diminuídas devido 10 à ação combinada (sinergia) do agente recém-identificado e outros agentes ou tratamentos quimioterapêuticos.
A terapia combinada pode prover "sinergia" e provar "ser sinérgica", isto é, o efeito obtido quando os ingredientes ativos usados juntos é maior do que a soma dos efeitos que resulta do uso dos compostos 15 separadamente. Um efeito sinérgico pode ser obtido quando os ingredientes ativos são: (1) co-formulados e administrados ou aplicados simultaneamente em uma formulação de dosagem unitária, combinada; (2) aplicação através da alternação ou em paralelo como formulações separadas; ou (3) através de algum outro regime. Quando aplicado em terapia alternativa, um efeito 20 sinérgico pode ser obtido quando os compostos são administrados ou aplicados sequencialmente, por exemplo, através de injeções diferentes em seringas separadas. Em geral, durante a terapia de alternação, uma dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, isto é, serialmente, enquanto em terapia de combinação, dosagens eficazes de dois 25 ou mais ingredientes ativos são administradas juntas.
K. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO E ESTOJOS
Outra modalidade da invenção é um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de câncer expressando CD79b. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou associado com o recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tal como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição de câncer e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha que pode ser furada por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo anti- CD79b da invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para tratamento de câncer. O rótulo ou bula vai compreender ainda instruções para administração da composição de anticorpo ao paciente com câncer. Ainda, o artigo de fabricação vai compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI) (Bacteriostatic Water for Injection'), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
São também providos estojos que são úteis para vários propósitos, por exemplo, para ensaios de morte de célula expressando CD70b, para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de CD79b a partir de células. Para isolamento e purificação de polipeptídeo de CD79b, o estojo pode conter um anticorpo anti-CD79b acoplado a contas (por exemplo, contas de sepharose). Podem ser providos estojos, os quais podem conter os anticorpos para detecção e quantificação de polipeptídeo de CD79b in vitro, por exemplo, em um ELISA ou Western blot. Como com o artigo de fabricação, o estojo compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou em associação com o recipiente. O recipiente contém uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b da invenção. Recipientes adicionais podem ser incluídos, os quais contêm, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos de controle. O rótulo ou bula pode prover uma descrição da composição bem como instruções para o uso in vitro ou de detecção pretendido.
L. Usos PARA POLIPEPTÍDEOS DE CD79B
A presente invenção compreende métodos de avaliação de compostos para identificar aqueles que imitam o polipeptídeo de CD79b (agonistas) ou previnem o efeito do polipeptídeo de CD79b (antagonistas). Ensaios de avaliação para candidatos a fármaco antagonistas são planejados 10 para identificar compostos que se ligam ou formam complexo com os polipeptídeos de CD79b codificados pelos genes identificados aqui ou de outra maneira interferem com a interação dos polipeptídeos codificados com outras proteínas celulares, incluindo, por exemplo, inibição da expressão de polipeptídeos de CD789b a partir das células. Tais ensaios de avaliação vão 15 incluir ensaios condescendentes à avaliação de alto rendimento de bibliotecas químicas, tornando-os particularmente adequados para identificação de candidatos a fármaco de molécula pequena.
Os ensaios podem ser realizados em uma variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de avaliação 20 bioquímicos, imunoensaios e ensaios baseados em célula, que são bem caracterizados na técnica.
Todos os ensaios para antagonistas são comuns pelo fato de que eles necessitam contato do candidato a fármaco com um polipeptídeo de CD79b codificado por um ácido nucleico identificado aqui sob condições e por 25 tempo suficientes para permitir que esses componentes interajam.
Em ensaios de ligação, a interação é ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura de reação. Em uma modalidade particular, o polipeptídeo de CD79b codificado pelo gene identificado aqui ou o candidato a fármaco é imobilizado em uma fase sólida, por exemplo, em uma placa de microtitulação, através de ligações covalentes ou não-covalentes. Ligação não-covalente é geralmente realizada através do revestimento da superfície sólida com uma solução do polipeptídeo de CD79b 5 e secagem. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, por exemplo, um anticorpo monoclonal, específico para o polipeptídeo de CD79b a ser imobilizado, pode ser usado para ancorá-lo a uma superfície sólida. O ensaio é realizado através de adição do componente não-imobilizado, que pode ser marcado por um marcador detectável, ao componente imobilizado, por 10 exemplo, a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reação está completa, os componentes não reativos são removidos, por exemplo, através de lavagem, e complexos ancorados na superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não-imobilizado carrega um marcador detectável, a detecção de marcador imobilizado na superfície indica 15 que complexação aconteceu. Em que o componente originalmente não- imobilizado não carrega um marcador, complexação pode ser detectada, por exemplo, usando anticorpo marcado especificamente se ligando ao complexo imobilizado.
Se o composto candidato interagir, mas não se ligar a um polipeptídeo de CD79b particular codificado por um gene identificado aqui, sua interação com este polipeptídeo pode ser ensaiada através de métodos bem conhecidos para detecção de interações proteína-proteína. Tais ensaios incluem abordagens tradicionais, tais como, por exemplo, reticulação, co- imunoprecipitação e co-purificação através de colunas de gradientes ou 25 cromatográficas. Ainda, interações proteína-proteína podem ser monitoradas usando um sistema genético baseado em levedura descrito por Fields e outros (Fields e Song, Nature (Londres), 340:245-246 (1989); Chien e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:9578-9582 (1991)) conforme descrito por Chevray e
Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muitos ativadores de transcrição, tai como GAL4 de levedura, consistem em dois domínios modulares fisicamente separados, um agindo como o domínio de ligação de DNA e o outro funcionando como o domínio de ativação de transcrição. O sistema de expressão de levedura descrito nas publicações acima (geralmente referido como o "sistema de dois híbridos") obtém vantagem desta propriedade, e emprega duas proteínas híbridas, uma em que a proteína-alvo é fundida ao domínio de ligação de DNA de GAL4 e outra em que proteínas de ativação de candidato são fundidas ao domínio de ativação. A expressão de um gene repórter GAL1 -lacZ sob controle de um promotor ativado por GAL4 depende da reconstituição da atividade de GAL4 através de interação proteína-proteína. Colônias contendo polípeptídeos de interação são detectadas com um substrato cromogênico para β-galactosidase. Um estojo completo (MATCHMAKER®) para identificação de interações proteína-proteína entre duas proteínas específicas usando a técnica de dois-híbridos está comercialmente disponível da Clontech. Este sistema pode ser também estendido para mapear domínios de proteína envolvidos em interações de proteína específicas bem como resíduos de aminoácido específicos que são cruciais para essas interações.
Os compostos que interferem com a interação de um gene codificando um polipeptídeo de CD79b identificado aqui e outros componentes intra- ou extracelulares podem ser testados como segue: geralmente uma mistura de reação é preparada contendo o produto do gene e o componente intra- ou extracelular sob condições e por um tempo que permitem a interação e ligação dos dois produtos. Para testar a habilidade de um composto candidato em inibir ligação, a reação é realizada na ausência e na presença do composto de teste. Ainda, um placebo pode ser adicionado a uma terceira mistura de reação, para servir como um controle positivo. A ligação (formação de complexo) entre o composto de teste e o componente intra- ou extracelular presente na mistura é monitorada conforme descrito acima. A formação de um complexo na(s) reação(ões) controle mas não na mistura de reação contendo o composto de teste indica que o composto de teste interfere com a interação do composto de teste e seu par de reação.
Para ensaiar antagonistas, o polipeptídeo de CD79b pode ser adicionado a uma célula junto com o composto a ser avaliado quanto a uma atividade particular, e a habilidade do composto em inibir a atividade de interesse na presença do polipeptídeo de CD79b indica que o composto é um antagonista para o polipeptídeo de CD79b. Alternativamente, antagonistas podem ser detectados através da combinação do polipeptídeo de CD79b e um antagonista potencial com receptores de polipeptídeo de CD79b ligados à membrana ou receptores recombinantes sob condições apropriadas para um ensaio de inibição competitivo. O polipeptídeo de CD79b pode ser marcado, tal como através de radioatividade, de maneira que o número de moléculas de polipeptídeo de CD79b ligadas ao receptor pode ser usado para determinar a eficácia do antagonista potencial. O gene codificando o receptor pode ser identificado através de vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, fotografia panorâmica de ligante e classificação FACS. Coligan e outros, Current Protocols in Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferivelmente, clonagem de expressão é empregada, em que RNA poliadenilado é preparado a partir de uma célula responsiva ao polipeptídeo de CD79b e uma biblioteca de cDNA criada a partir deste RNA é dividida em grupos e usada para transfectar células COS ou outras células que não são responsivas ao polipeptídeo de CD79b. Células transfectadas que são cultivadas em lâminas de vidro são expostas a polipeptídeo de CD79b marcado. O polipeptídeo de CD79b pode ser marcado através de uma variedade de meios incluindo iodínação ou inclusão de um sítio de reconhecimento para uma proteína cinase específica de sítio. Seguindo fixação e incubação, as lâminas são submetidas à análise autorradiográfica. Grupos positivos são identificados e subgrupos são preparados e retransfectados usando um processo de subagrupamento e de reavaliação interativo, eventualmente dando um clone único que codifica o receptor putativo.
Como uma abordagem alternativa para identificação de receptor, polipeptídeo de CD79b marcado pode ser ligado por fotoafinidade com membrana celular ou preparações de extrato que expressam a molécula de receptor. Material reticulado é separado através de PAGE e exposto à película de raio X. O complexo marcado contendo o receptor pode ser excisado, separado em fragmentos de peptídeo e submetido a microssequenciamento de proteína. A sequência de aminoácido obtida a partir de microssequenciamento seria usada para projetar um conjunto de sondas de oligonucleotídeo degeneradas para avaliar uma biblioteca de cDNA para identificar o gene codificando o receptor putativo.
Em outro ensaio para antagonistas, células de mamífero ou uma preparação de membrana expressando o receptor seriam incubadas com polipeptídeo de CD79b marcado na presença do composto candidato. A habilidade do composto em aumentar ou bloquear esta interação é então medida.
Exemplos mais específicos de antagonistas potenciais incluem um oligonucleotídeo que se liga às fusões de imunoglobulina com polipeptídeo de CD79b e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anticorpos poli- e monoclonais e fragmentos de anticorpo, anticorpos de cadeia simples, anticorpos antiidiotípicos e versões quiméricas ou humanizadas de tais anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo. Alternativamente, um antagonista potencial pode ser uma proteína intimamente relacionada, por exemplo, uma forma mutada do polipeptídeo de CD79b que reconhece o receptor mas não oferece nenhum efeito, desta maneira inibindo competitivamente a ação do polipeptídeo de CD79b.
Anticorpos se ligando especificamente a um polipeptídeo de CD79b identificado aqui, bem como outras moléculas identificadas pelos 5 ensaios de avaliação descritos aqui anteriormente, podem ser administrados para o tratamento de vários distúrbios, incluindo câncer, na forma de composições farmacêuticas.
Se o polipeptídeo de CD79b for intracelular e anticorpos integrais forem usados como inibidores, anticorpos de internalização são preferidos. No 10 entanto, lipofecções ou lípossomas podem ser também usados para aplicar o anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, a células. Em que fragmentos de anticorpo forem usados, o fragmento inibidor menor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína-alvo é preferido. Por exemplo, com base nas sequências de região variável de um anticorpo, 15 moléculas de peptídeo podem ser projetadas, as quais retêm a habilidade em se ligar à sequência de proteína-alvo. Tais peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos através de tecnologia de DNA recombinante. Vide, por exemplo, Marasco e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 7889-7893(1993).
A presente formulação pode também conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetam de modo adverso um ao outro. Altemativamente, ou em adição, a composição pode compreender um agente que aumenta sua função tal 25 como, por exemplo, um agente citotóxico, citocina, agente quimioterapêutico ou agente de inibição de crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
M. DERIVADOS DE ANTICORPO
Os anticorpos da presente invenção podem ser modificados mais para conter porções não-proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. Preferivelmente, as porções adequadas 5 para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não-limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool de polivinila, polivinil pirrolidona, poli-1,3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, 10 poliaminoácidos (ou homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co-polímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool de polivinila e suas misturas. Polietileno glicol propionaldeído pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em 15 água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não-ramíficado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero estiver ligado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações incluindo, 20 mas não limitado a, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a serem aperfeiçoadas, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.
N. MÉTODO DE AVALIAÇÃO
Ainda outra modalidade da presente invenção refere-se a um 25 método de determinação da presença de um polipeptídeo de CD79b em uma amostra suspeita de conter o polipeptídeo de CD79b, em que o método compreende exposição da amostra a um conjugado de anticorpo-fármaco do mesmo, que se liga ao polipeptídeo de CD79b e determinação da ligação do conjugado anticorpo-fármaco do mesmo ao polipeptídeo na amostra, em que a presença de tal ligação é indicativa da presença do polipeptídeo de CD79b na amostra. Opcionalmente, a amostra pode conter células (que podem ser células cancerosas) suspeitas de expressão do polipeptídeo de CD79b. O conjugado anticorpo-fármaco do mesmo, empregado no método, pode ser opcionalmente marcado detectavelmente, ligado a um suporte sólido ou similar.
Outra modalidade da presente invenção refere-se a um método de diagnóstico da presença de um tumor em um mamífero, em que o método compreende (a) contato de uma amostra de teste compreendendo células de tecido obtidas do mamífero com um conjugado anticorpo-fármaco do mesmo, que se liga a um polipeptídeo de CD79b e (b) detecção da formação de um complexo entre o conjugado anticorpo-fármaco do mesmo e o polipeptídeo de CD79b na amostra de teste, em que a formação de um complexo é indicativa da presença de um tumor no mamífero. Opcionalmente, o conjugado anticorpo- fármaco do mesmo é detectavelmente marcado, ligado a um suporte sólido, ou similar, e/ou a amostra de teste de células de tecido é obtida de um indivíduo suspeito de ter um tumor canceroso.
IV. MÉTODOS ADICIONAIS DE USO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B E IMUNOCONJUGADOS A. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E MÉTODOS DE DETECÇÃO
Em um aspecto, anticorpos anti-CD79b e imunoconjugados da invenção são úteis para detecção da presença de CD79b em uma amostra biológica. O termo "detecção" conforme aqui usado compreende detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido. Em certas modalidades, tais tecidos incluem tecidos normais ou cancerosos que expressam CD79b em níveis maiores com relação a outros tecidos, por exemplo, células B e/ou tecidos associados á célula B.
Em um aspecto, a invenção provê um método de detecção da presença de CD79 em uma amostra biológica. Em certas modalidades, o método compreende contato da amostra biológica com um anticorpo anti- CD79b sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-CD79b a 5 CD79b, e detecção de se um complexo é formado entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b.
Em um aspecto, a invenção provê um método de diagnóstico de um distúrbio associado à expressão aumentada de CD79b. Em certas modalidades, o método compreende contato de uma célula de teste com um 10 anticorpo anti-CD79b; determinação do nível de expressão (ou quantitativamente ou qualitativamente) de CD79b pela célula de teste através da detecção da ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b; e comparação do nível de expressão de CD79b pela célula de teste com o nível de expressão de CD79b por uma célula controle (por exemplo, uma célula normal da mesma 15 origem de tecido que a célula de teste ou uma célula que expressa CD79b em níveis comparáveis com tal célula normal), em que um nível maior de expressão de CD79b pela célula comparado com a célula controle indica a presença de um distúrbio associado à expressão aumentada de CD79b. Em certas modalidades, a célula de teste é obtida de um indivíduo suspeito de ter 20 um distúrbio associado à expressão aumentada de CD79b. Em certas modalidades, o distúrbio é um distúrbio proliferativo celular, tal como um câncer ou um tumor.
Distúrbios proliferativos celulares exemplares que podem ser diagnosticados usando um anticorpo da invenção incluem um distúrbio de 25 célula B e/ou um distúrbio proliferativo de célula B incluindo, mas não limitado a, linfoma, linfoma não-Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
Em certas modalidades, um método de diagnóstico ou detecção, tais como aqueles descritos acima, compreende detecção da ligação de um 5 anticorpo anti-CD79b a CD79b expresso em uma superfície de uma célula ou em uma preparação de membrana obtida de uma célula expressando CD79b sobre sua superfície. Em certas modalidades, o método compreende contato de uma célula com um anticorpo anti-CD79b sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b, e detecção de se um complexo é 10 formado entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b na superfície celular. Um ensaio exemplar para detecção da ligação de um anticorpo anti-CD79b a CD79b expresso na superfície de uma célula é um ensaio "FACS".
Certos outros métodos pode ser usados para detectar ligação de anticorpos anti-CD79b a CD79b. Tais métodos incluem, mas não estão 15 limitados a, ensaios de ligação a antígeno que são bem conhecidos na técnica, tais como Western blots, radioimunoensaio, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima), imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A e imunoistoquímica (IHC).
Em certas modalidades, anticorpos anti-CD79b são marcados.
Marcadores incluem, mas não estão limitados a, marcadores ou porções que são detectados diretamente (tais como marcadores fluorescentes, cromofóricos, elétron-densos, quimioluminescentes e radioativos), bem como porções, tais como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, por 25 exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular.
Marcadores exemplares incluem, mas não estão limitados a, os radioisótopos 32P, 14C, 125l, 3H e 1311, fluoróforos tais como quelatos terrosos-raros ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, [ umbeliferona, luciferases, por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (Patente U.S. No. 4.737,456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoaminase, lisozima, sacarideo oxidases, por exemplo, glicose oxidase, 5 galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterociclicas tais como uricase e xantina oxidase, acoplados com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante tal como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores bacteriófagos, radicais livres estáveis e similar.
Em certas modalidades, anticorpos anti-CD79b são imobilizados sobre uma matriz insolúvel. Imobilização compreende separação do anticorpo anti-CD79b de qualquer CD79b que permaneça livre em solução. Isto é convencionalmente realizado através de ou insolubilização do anticorpo anti- CD79b antes do procedimento de ensaio, como através de adsorção em uma 15 matriz ou superfície insolúvel em água (Bennich e outros, U.S. 3.720.760) ou através de acoplamento covalente (por exemplo, usando reticulação de glutaraldeído) ou através de insolubilização do anticorpo anti-CD79b após formação de um complexo entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b, por exemplo, imunoprecipitação.
Qualquer uma das modalidades de diagnóstico ou detecção acima pode ser realizada usando um imunoconjugado da invenção no lugar de ou em adição a um anticorpo anti-CD79b.
B. MÉTODOS TERAPÊUTICOS
Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser usado 25 em, por exemplo, métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo. Em urn aspecto, a invenção provê métodos para inibição de crescimento ou proliferação celular, ou in vivo ou in vitro, o método compreendendo exposição de uma célula a um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b. "Inibição de crescimento ou proliferação celular" significa diminuição do crescimento ou proliferação de uma célula em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100%, e inclui indução de morte celular. Em certas modalidades, a célula é uma célula de tumor. Em certas modalidades, a célula é uma célula B. Em certas modalidades, a célula é um xenoenxerto, por exemplo, conforme aqui exemplificado.
Em um aspecto, um anticorpo ou imunoconjugado da invenção é usado para tratar ou prevenir um distúrbio proliferativo de célula B. Em certas modalidades, o distúrbio proliferativo celular está associado à expressão e/ou atividade aumentada de CD79b. Por exemplo, em certas modalidades, o distúrbio proliferativo de célula B está associado à expressão aumentada de CD79b sobre a superfície de uma célula B. Em certas modalidades, o distúrbio proliferativo de célula B é um tumor ou um câncer. Exemplos de distúrbios proliferatívos de célula B a serem tratados pelos anticorpos ou imunoconjugados da invenção incluem, mas não estão limitados a, linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto.
Em um aspecto, a invenção provê métodos para tratamento de um distúrbio proliferativo de célula B compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo. Em certas modalidades, um método para tratamento de um distúrbio proliferativo de célula B compreende administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado anti-CD79b e, opcionalmente, pelo menos um agente terapêutico adicional, tais como aqueles providos abaixo. Em certas modalidades, um método para tratamento de um distúrbio proliferativo celular compreende administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo 1) um 5 imunconjugado compreendendo um anticorpo anti-CD79b e um agente citotóxico; e opcionalmente 2) pelo menos um agente terapêutico adicional, tais como aqueles providos abaixo.
Em um aspecto, pelo menos alguns dos anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem se ligar a CD79b de espécies outras que 10 não humano. Desta maneira, anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser usados para ligar CD79b, por exemplo, em uma cultura celular contendo CD79b, em humanos, ou em outros mamíferos tendo um CD79b com o qual um anticorpo ou imunoconjugado da invenção reage cruzado (por exemplo, chimpanzé, babuíno, mico, macacos cinomólogo e rhesus, porcos ou 15 camundongo). Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser usado para direcionamento a CD79b em células B através de contato do anticorpo ou imunoconjugado com CD79b para formar um complexo anticorpo ou imunoconjugado-antígeno de maneira que uma citotoxina conjugada do imunoconjugado acesse o interior da célula. Em uma 20 modalidade, o CD79b é CD79b humano.
Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser usado em um método para ligação de CD79b em um indivíduo sofrendo de um distúrbio associado à expressão e/ou atividade de CD79b aumentada, o método compreendendo administração ao indivíduo do 25 anticorpo ou imunoconjugado de maneira que CD79b no indivíduo seja ligado. Em uma modalidade, o anticorpo ou imunoconjugado ligado é internalizado na célula B expressando CD79b. Em uma modalidade, o CD79b é CD79b humano, e o indivíduo é um indivíduo humano. Alternativamente, o indivíduo pode ser um mamífero expressando CD79b ao qual um anticorpo anti-CD79b se liga. Ainda o indivíduo pode ser um mamífero ao qual CD79b foi introduzido (por exemplo, através da administração de CD79b ou através da expressão de um transgene codificando CD79b).
Um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser administrado a um ser humano para propósitos terapêuticos. Além disso, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser administrado a um mamífero não-humano expressando CD79b com o qual o anticorpo reage cruzado (por exemplo, um primata, porco, rato ou camundongo) para propósitos veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Com relação ao último, tais modelos animais podem ser úteis para avaliação da eficácia terapêutica de anticorpos ou imunoconjugados da invenção (por exemplo, teste de dosagens e cursos de tempo de administração).
Os anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser usados ou sozinhos ou em combinação com outras composições em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser co-administrado com pelo menos um agente terapêutico e/ou adjuvante adicional. Em certas modalidades, um agente terapêutico adicional é um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico ou um agente inibidor de crescimento. Em uma de tais modalidades, um agente quimioterapêutico é um agente ou uma combinação de agentes tal como, por exemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, adriamicina, doxorrubicina, vincristina (Oncovin®), prednisolona, CHOP, CVP, ou OOP, ou imunoterapêuticos tal como anti-CD20 (por exemplo, Rituxan®) ou anti-VEGF (por exemplo, Avastin®), em que a terapia de combinação é útil no tratamento de cânceres e/ou distúrbios de célula B tais como distúrbios proliferativos de célula B incluindo linfoma, Linfoma Não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo relapsado, NHL indolente relapsado, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma da célula do manto.
Tais terapias de combinação mencionadas acima compreendem 5 administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos nas mesmas formulações ou formulações separadas) e administração separada, caso em que administração do anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode acontecer antes da, simultaneamente a e/ou seguindo a, administração do agente terapêutico e/ou adjuvante adicional. Anticorpos ou 10 imunoconjugados da invenção podem ser também usados em combinação com terapia de radiação.
Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção (e qualquer agente terapêutico ou adjuvante adicional) pode ser administrado através de qualquer meio adequado, incluindo parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, 15 intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea. Ainda, o anticorpo ou imunoconjugado é adequadamente administrado através de infusão por pulso, particularmente com doses em declínio do anticorpo ou imunoconjugado. A 20 dosagem pode ser através de qualquer via adequada, por exemplo, através de injeção, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica.
Anticorpos ou imunoconjugados da invenção seriam formulados, dosados e administrados de uma maneira consistente com boa prática médica. 25 Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de aplicação do agente, o método de administração, o programa de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes de medicina. O anticorpo ou imunoconjugado não precisa ser, mas é opcionalmente, formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo ou imunoconjugado presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e outros fatores discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme aqui descrito, ou de a partir de 1 a 99% das dosagens descritas aqui ou em qualquer dosagem e através de qualquer via que seja empiricamente/clinicamente determinada ser apropriada.
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada do anticorpo ou imunoconjugado da invenção (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais, tais como agentes quimioterapêuticos) vai depender do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo ou imunoconjugado, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo ou imunoconjugado é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, a história clínica do paciente e resposta ao anticorpo ou imunoconjugado e da opinião do médico acompanhante. O anticorpo ou imunoconjugado é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg-20 mg/kg) de anticorpo ou imunoconjugado pode ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas ou através de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderia variar de a partir de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente prolongado até que uma supressão desejada de sintomas aconteça. Uma dosagem exemplar do anticorpo ou imunoconjugado estaria na faixa de a partir de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta maneira, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinações das mesmas) de anticorpo ou imunoconjugado podem ser administradas ao paciente. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, toda semana ou a cada três semanas (por exemplo, de maneira que o paciente recebe de a partir de cerca de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo ou imunoconjugado). Uma dose de carga maior inicial, seguido por uma ou mais doses menores, pode ser administrada. Um regime de dosagem exemplar compreende administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado através de técnicas e ensaios convencionais.
C. ENSAIOS DE ATIVIDADE
Anticorpos anti-CD79b e imunoconjugados da invenção podem ser caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas através de vários ensaios conhecidos na técnica.
1. ENSAIOS DE ATIVIDADE
Em um aspecto, são providos ensaios para identificação de anticorpos anti-CD79b ou imunoconjugados dos mesmos tendo atividade biológica. Atividade biológica pode incluir, por exemplo, a habilidade em inibir crescimento ou proliferação celular (por exemplo, atividade de "morte celular") ou a habilidade em induzir morte celular, incluindo morte celular programada (apoptose). Anticorpos ou imunoconjugados tendo tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro são também providos.
Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo é testado quanto à sua habilidade em inibir crescimento ou proliferação celular in vitro. Ensaios para inibição de crescimento ou proliferação celular são bem conhecidos na técnica. Certos ensaios para proliferação celular, exemplificados por ensaios de "morte celular" descritos aqui, medem viabilidade celular. Tal tipo de ensaio é o CelITiter-Glo® 5 Luminescent Cell Viability Assay, que está comercialmente disponível da
Promega (Madison, Wl). O ensaio determina o número de células viáveis em cultura com base em quantificação de ATP presente, que é uma indicação de células metabolicamente ativas. Vide Crouch e outros (1993), J. Immunol. Meth., 160:81-88, Patente U.S. No. 6602677. O ensaio pode ser conduzido em 10 um formato de 96 ou 384 cavidades, tornando-o condescendente à avaliação de alto rendimento automática (HTS) (High-Throughput Screening). Vide Cree e outros (1995) AntiCancer Drugs, 6:398-404. O procedimento de ensaio envolve adição de um reagente único (CelITiter-Glo® Reagent) diretamente às células culturadas. Isto resulta em lise celular e geração de um sinal 15 luminescente produzido por uma reação de luciferase. O sinal luminescente é proporcional à quantidade de ATP presente, que é diretamente proporcional ao número de células viáveis presentes em cultura. Os dados podem ser registrados através de luminômetro ou dispositivo de imagem de câmera CCD. O resultado luminescente é expresso como unidades de luz relativas (RLU) (Relative Light Units).
Outro ensaio para proliferação celular é o ensaio "MTT", um ensaio colorimétrico que mede a oxidação de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazólio para formazan através de redutase mitocondrial. Tal como o ensaio CelITiter-Glo®, este ensaio indica o número de células 25 metabolicamente ativas presentes em uma cultura celular. Vide, por exemplo,
Mosmann (1983) J. Immunol. Meth., 65:55-63 e Zhang e outros (2005) Cancer Res., 65:3877-3882.
Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b é testado quanto à sua habilidade em induzir morte celular in vitro. Ensaios para indução de morte celular são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, tais ensaios medem, por exemplo, perda de integridade de membrana conforme indicado pela absorção de iodeto de propídio (PI), azul tripano (vide Moore e outros, 5 (1995) Cytotechnology, 17:1-11) ou 7AAD. Em um ensaio de absorção de PI exemplar, as células são culturadas em Meio da Eagle Modificado com da Dulbecco (D-MEM):Ham's F-12 (50:50) suplementado com FBS inativado por calor 10% (Hyclone) e L-glutamina 2 mM. Desta maneira, o ensaio é realizado na ausência de células complemento e imunoefetoras. As células são 10 semeadas em uma densidade de 3 x 106 por placa em placas de 100 x 20 mm e deixar ligar de um dia para o outro. O meio é removido e posto com meio fresco sozinho ou meio contendo várias concentrações do anticorpo ou imunoconjugado. As células são incubadas por um período de tempo de 3 dias. Seguindo o tratamento, monocamadas são lavadas com PBS e separadas 15 através de tripnização. As células são então centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a 4°C, o pélete ressuspenso em 3 ml de tampão de ligação de Ca2+ frio (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCI 140 mM, CaCI2 2,5 mM) e separado em alíquotas em tubos de 12 x 75 mm tampados com coador de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para remoção de grumos de célula. Os tubos 20 então recebem PI (10 μg/ml). As amostras são analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN® e software FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson). Anticorpos ou imunoconjugados que induzem níveis estatisticamente significantes de morde celular conforme determinado através de absorção de PI são então identificados.
Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado é testado quanto à sua habilidade em induzir apoptose (morte celular programada) in vitro. Um ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induz apoptose é um ensaio de ligação de anexina. Em um ensaio de ligação de anexina exemplar, as células são culturadas e semeadas em placas conforme discutido no parágrafo anterior. O meio é removido e substituído com meio fresco sozinho ou meio contendo 0,001 a 10 μg/ml do anticorpo ou imunoconjugado. Seguindo um período de incubação de três dias, as 5 monocamadas são lavadas com PBS e detectadas através de tripnização. As células são então centrifugadas, ressuspensas em tampão de ligação de Ca2+ e separadas em alíquotas em tubos conforme descrito no parágrafo anterior. Os tubos então recebem anexina marcada (por exemplo, anexina V-FITC) (1 μg/ml). As amostras são analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN® 10 e software FACSCONVERT® CelIQuest (BD Biosciences). Os anticorpos ou imunoconjugados que induzem níveis estatisticamente significantes de ligação de anexina com relação a controle são então identificados. Outro ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induzem apoptose é um ensaio colorimétrico ELISA DNA para detecção de degradação 15 internucleossomal de DNA genômico. Tal ensaio pode ser realizado usando, por exempolo, o Cell Death Detection ELISA kit (Roche, Palo Alto, CA). Células para uso em qualquer um dos ensaios in vitro acima incluem células ou linhagens de célula que expressam naturalmente CD79b ou que foram engenheiradas para expressar CD79b. Tais células incluem células 20 de tumor que superexpressam CD79b com relação a células normais da mesma origem de tecido. Tais células também incluem linhagens de célula (incluindo linhagens de célula de tumor) que expressam CD79b e linhagens de célula que não expressam normalmente CD79b mas foram transfectadas com ácido nucleico codificando CD79b.
Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo é testado quanto à habilidade em inibir crescimento ou proliferação celular in vivo. Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo é testado quanto à sua habilidade em inibir crescimento de tumor in vivo. Sistemas de modelo in vivo, tais como modelos de xenoenxerto, podem ser usados para tai teste. Em um sistema de xenoenxerto exemplar, células de tumor humanas são introduzidas em um animal não-humano adequadamente imunocomprometido, por exemplo, um camundongo SCID. Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção é administrado ao animal. A habilidade do anticorpo ou imunoconjugado em inibir ou diminuir crescimento de tumor é medida. Em certas modalidades do sistema de xenoenxerto acima, as células de tumor humanas são células de tumor de um paciente humano. Tais células úteis para preparação de modelos de xenoenxerto incluem linhagens de célula de leucemia e linfoma humana, que incluem, sem limitação, as células BJAB-luc (uma linhagem de célula de linfoma de Burkitt EBV-negativa transfectada com o gene repórter da luciferase). Células Ramos (ATCC, Manassas, VA, CRL-1923), células SuDHL- 4 (DSMZ, Braunschweig, Alemanha, AAC 495), células DoHH2 (vide Kluin- Neilemans, H.C. e outros, Leukemia, 5:221-224 (1991) e Kluin-Neilemans, H.C. e outros, Leukemia, 8:1385-1391 (1994)), células Granta-519 (vide Jadayel, D.M. e outros, Leukemia, 11(1):64-72 (1997)). Em certas modalidades, as células de tumor humanas são introduzidas em um animal adequadamente imunocomprometido não-humano através de injeção subcutânea ou através de transplante em um sítio adequado, tal como uma parte mole mamária.
2. ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS
Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b é testado quanto à sua atividade de ligação a antígeno. Por exemplo, em certas modalidades, um anticorpo anti-CD79b é testado quanto à sua habilidade em se ligar a CD79b superexpresso sobre a superfície de uma célula. Um ensaio FACS pode ser usado para tal teste.
Em um aspecto, ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo monoclonal que compete com anticorpo anti-CD79b de murino, anticorpo MA79b.v17 humanizado e/ou MA79b.v18 humanizado e/ou MA79b/v28 humanizado e/ou MA79b.32 humanizado para ligação a CD79b. Em certas modalidades, tal anticorpo de competição se liga ao mesmo epitopo (por exemplo, um epitopo linear ou um conformacional) que é ligado por 5 anticorpo MA79b de murino, anticorpo MA79bv.17 humanizado e/ou anticorpo MA79b.v18 humanizado e/ou MA79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado. Ensaios de competição exemplares incluem, mas não estão limitados a, ensaios de rotina tais como aqueles providos em Harlow e Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, cap. 14 (Cold Spring Harbor 10 Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Métodos exemplares detalhados para mapeamento de um epitopo ao qual um anticorpo se liga são providos em Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Dois anticorpos são ditos se ligar ao mesmo epitopo se cada um bloquear a ligação do outro em 50% ou mais.
Em um ensaio de competição exemplar, CD79b imobilizado é incubado em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga a CD79b (por exemplo, anticorpo MA79b de murino, anticorpo MA79b.v17 humanizado e/ou anticorpo MA79b.v18 humanizado e/ou MA79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado) e um segundo anticorpo 20 não-marcado que está sendo testado quando à sua habilidade em competir com o primeiro anticorpo para ligação a CD79b. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de híbridoma. Como controle, CD79b imobilizado é incubado em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado mas não o segundo anticorpo não-marcado. Após incubação sob 25 condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo a CD79b, anticorpo não-ligado em excesso é removido, e a quantidade de marcador associado com CD79b imobilizado é medida. Se a quantidade de marcador associado com CD79b imobilizado for substancialmente reduzida na amostra de teste com relação à amostra controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação com CD79b. Em certas modalidades, CD79b imobilizado está presente na superfície de uma célula ou em uma preparação de membrana obtida a partir de uma célula expressando 5 CD79b em sua superfície.
Em um aspecto, anticorpos anti-CD79b purificados podem ser caracterizados mais por uma série de ensaios incluindo, mas não limitado a, sequenciamento N-terminal, análise de aminoácido, cromatografia líquida de alta pressão de exclusão de tamanho de não-desnaturação (HPLC), 10 espectrometria de massa, cromatografia de troca de íon e digestão com papaína.
Em uma modalidade, a invenção compreende um anticorpo alterado que possui algumas, mas não todas, funções efetoras que o tornam um candidato desejável para muitas aplicações em que a meia-vida do 15 anticorpo in vivo é importante ainda que certas funções efetoras (tal como complemento e ADCC) sejam desnecessárias ou prejudiciais. Em certas modalidades, as atividades de Fc do anticorpo são medidas para assegurar que apenas as propriedades desejadas sejam mantidas. Ensaios de citotoxidez in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção 20 de atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação de receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo não tenha ligação a FcyR (então provavelmente sem atividade de ADCC), mas retenha habilidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam FcyRIII apenas, enquanto monócitos expressam FcyRI, 25 FcyRII e FCYRIII- Expressão de FcR em células hematopoiéticas é sumarizada na Tabela 3 na página 464 de Ravetech e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:45792 (1991). Um exemplo de um ensaio in vitro para avaliar atividade de ADCC de uma molécula de interesse é descrito na Patente U.S. No. 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células Assassinas Naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito em Clynes e outros, PNAS (USA), 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação de C1q podem ser também realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar C1q e então não tem atividade de CDC. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro e outros, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizado. Determinações de Ligação a FcRn e eliminação/meia-vida podem ser também realizadas usando métodos conhecidos na técnica. Os exemplos que seguem são oferecidos para propósitos ilustrativos apenas e não pretendem limitar o escopo da presente invenção de modo algum. Todas as referências de patente e literatura mencionadas no presente pedido são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.
EXEMPLOS
Reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplos foram usados de acordo com as instruções do fabricante a menos que de outra maneira indicado. Anticorpos usados nos exemplos incluem anticorpos comercialmente disponíveis e incluem, mas não estão limitados a, anti-CD79b (anticorpo comprado da Biomeda (Foster City, CA) ou Bdbioscience (São Diego, CA) ou Ancell (Bayport, MN)), anti-CD79b (gerado a partir de hibridoma depositado com a ATCC HB11413 em 20 de julho de 1993) e anticorpos anti- CD79b quiméricos (compreendendo domínios variáveis de anticorpos gerados de hibridomas depositados com o ATCC HB11413 em 20 de julho de 1993). A fonte dessas células identificada nos exemplos que seguem, e durante o relatório, pelos números de acesso ATCC, é a American Type Culture Collection, Manassas, VA.
EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD79B HUMANIZADO
Os números de resíduo estão de acordo com Kabat (Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological interest, 5a Ed., Public Health 5 Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Abreviações de aminoácido de uma letra são usadas. Degenerações de DNA são representadas usando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = N&G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
A. ENXERTO DE ANTICORPO ANTI-CD79B HUMANIZADO
Vários anticorpos anti-CD79b humanizados foram gerados. Os domínios VH e VI de anticorpo para MA79b de murino (MA79b) (Roswell Park Cancer Institute; Okazaki e outros, Blood, 81:84-94 (1993)) foram alinhados com os domínios kappa I de VL de consenso humano (huKI) e VH de consenso de subgrupo III humano (hulll). Para fazer o enxerto de HVR, a estrutura 15 principal de HV aceitadora, que difere do domínio VH de consenso do subgrupo III humano em 3 posições: R71A, N73T e L78A (Carter e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)) foi usada. Regiões hipervariáveis de MA79b de murino (MA79b) foram engenheiradas na estrutura principal de consenso humana aceitadora para gerar um enxerto de HVR de MA79b (aqui referido 20 como "enxerto de MA79b" ou "anticorpo 'humanizado' enxertado com MA79b" ou "enxerto de huMA79b"). No domínio VL, as regiões que seguem foram enxertadas para o aceitador de consenso humano: posições 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) (Figuras 7A-B). No domínio VH, as posições 26-35 (H1), 4965 (H2) e 93-102 (H3) foram enxertadas (Figuras 8A-B). MacCalIum 25 (MacCalIum e outros, J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996)) analisaram estruturas de cristal de complexo anticorpo-antígeno e constataram que as posições 49, 93 e 94 da cadeia pesada são parte da região de contato e são então incluídas na definição de HVR-H2 e HVR-H3 quando humanizando anticorpos.
A variante de enxerto direto (enxerto de huMA79b) foi gerada através de mutagênese Kunkel, como ambos o Fab exibido em fago e como uma IgG, usando um oligonucleotídeo separado para cada região hipervariável. Clones corretos foram avaliados através de sequenciamento de DNA.
B. VARIANTES DE ENXERTO DE ANTICORPO ANTI-CD79B HUMANIZADO
Variantes de enxerto de anticorpo anti-CD79b que incluíam diversidade mutacional nas regiões hipervariáveis do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b foram geradas usando bibliotecas de fago. As variantes de enxerto de anticorpo anti-CD79b incluíam ou uma variação de posição única nas HVRs (Figura 9) ou variações de posição múltiplas nas HVRs (Figura 10).
C. SELEÇÃO DE FAGO
Para seleção de fago, o domínio extracelular de CD79b (huCD79beCd) (2 μg/ml) foi imobilizado em PB em placas de microtitulação MaxiSorp (Nunc) da noite para o dia a 4o C. As placas foram bloqueadas por pelo menos 1 hora usando Casein Blocker (Pierce). Fagos foram coletados do sobrenadante de cultura e suspensos em PBS contendo BSA 0,5% e Tween 20 0,05% (PBSBT). Seguindo adição da biblioteca de fago e seleção de fago por 2 horas, cavidades de microticulação foram lavadas extensivamente com PBS contendo Tween 20 0,05% (PBST) para remover fagos não-ligados e fagos ligados foram eluídos através de incubação das cavidades com HCI 10 mM por 30 minutos. Adstringência da seleção pode ser aumentada durante rodadas sucessivas de seleção através do aumento do número de lavagens com PBST ou através da incubação com huCD79becd para aumento de períodos de tempo antes da eluição.
Fago eluído foi neutralizado com Tris 1 M, pH 8 e amplificado usando células XL1-Blue e fago auxiliar M13/KO7 e cultivado de um dia para o outro a 37° C em 2YT, 50 μg/ml de carbenacilina. Os títulos de fago eluídos de uma cavidade contendo alvo foram comparados com títulos de fago recuperado de uma cavidade contendo não-alvo para avaliar enriquecimento.
D. PRODUÇÃO DE FAB E PRODUÇÃO DE IGG
Para expressar proteína de Fab para medições de afinidade, um códon de parada foi introduzido entre a cadeia pesada e g3 no vetor de exibição de fago. Os clones foram transformados em células 34B8 de E. coli e cultivados em meio Complete C.R.A.P. a 30° C (Presta e outros, Cancer Res., 57:4593-4599 (1997)). As células foram coletadsas através de centrifugação, suspensas em PBS, PMSF 100 μM, benzamidina 100 μM, EDTA 2,4 mM e quebradas usando um microfluidizador. Fab foi purificado com cromatografia de afinidade de Proteína G.
Para propósitos de avaliação, variantes de IgG foram inicialmente produzidas em células 293. Vetores codificando VL e VH (25 pg) foram transfectados em células 293 usando o sistema FuGene. 500 pl de FuGene foram misturados com 4,5 ml de meio DMEM não contendo nenhum FBS e incubados em temperatura ambiente por 5 minutos. Cada cadeia (25 pg) foi adicionada a esta mistura e incubada em temperatura ambiente por 20 minutos e então transferida para um frasco para transfecção de um dia para o outro a 37° C em CO2 5%. No dia seguinte, os meios contendo a mistura de transfecção foram removidos e substituídos com 23 ml de meio PS04 com 0,1 ml/L de elementos em quantidade traço (A0934) e 10 mg/L de insulina (A0940). As células foram incubadas por mais 5 dias após o que o meio foi coletado a 1000 rpm por 5 minutos e filtrado estéril usando um filtro de ligação de proteína inferior de 0,22 pm. As amostras puderam ser armazenadas a 4o C após adição de 2,5 ml de PMSF 0,1% por cada 125 mi de meio.
E. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE BIACORE)
Para determinação de afinidade de variantes de anticorpo "humanizado" enxertadas com MA79b, o domínio extracelular de CD79b humano (huCD79becd) foi expresso em células CHO sozinho ou como uma fusão de Fc (huCD79eCd-Fc) e purificado através de meios convencionais. Ainda, um peptídeo de 16 aminoácidos (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ ID NO: 16) contendo o epitopo para MA79b foi sintetizado através de meios convencionais.
Caracterização de epitopo para anticorpo MA79b (marcado como "peptídeo de teste" na Figura 19) foi previamente descrita no Pedido U.S. No. 11/462.336 depositado em 3 de agosto de 2006. O epitopo para MA79b estava localizado na região de peptídeo extracelular distai para o domínio de transmembrana e estava presente nas formas de comprimento integral e truncada de CD79b humano (Cragg, Blood, 100(9): 3068-76 (2002)), que foi descrito em células B normais e malignas (Hashimoto, S. e outros, Mol. Immunol., 32(9): 651-9 (1995); Alfarano e outros, Blood, 93(7):2327-35 (1999)). A forma truncada de CD79b não tem o domínio tipo IgG extracelular inteiro (o domínio tipo lg extracelular que não está presente na forma truncada unida de D79b está em caixa na Figura 19).
Ligação de variantes de Fab e IgG de MA79b, o anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b ou variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b para huCD79beCd imobilizado ou huCD79b-Fc ou o peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epitopo para MA79b foi medida através de ressonância de plasma de superfície. Determinações de afinidade foram realizadas através de ressonância de plasmon de superfície usando um BIAcore®-2000. O antígeno, huCD79becd ou huCD79b-Fc foi imobilizado (aproximadamente 50-200 RU) em acetato de sódio 10 mM pH 4,8 em um sensor chip CM5. Devido a um efeito de avidez grande, medições de afinidade foram sensíveis à quantidade de huCD79becd imobilizado. Por esta razão, afinidades, determinadas para amostras ativadas em dias diferentes, foram normalizadas para MA79b que foi ativado ao lado como um padrão. Em experimentos que mediam a ligação do peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epitopo para MA79b (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ ID NO: 16), o peptídeo biotinilado foi capturado (aproximadamente 20 RU) em um sensor chip revestido com estreptavidina. Variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (como Fab ou IgG) (uma diluição serial de 2 vezes de 0,5 a 1000 nM em PBST) foi injetada em uma taxa de fluxo de 30 pL/min. Cada amostra foi analisada com associação de 4 minutos e dissociação de 10 minutos. Após cada injeção, o ch/pfoi regenerado usando Glicina 10 mM pH 1,7.
Resposta de ligação foi corrigida subtraindo uma célula de fluxo controle de células de fluxo variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (como Fab ou IgG). Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de Kon e KOff foi usado para análise cinética.
F. ANÁLISE DE LIGAÇÃO (ANÁLISE FACS)
Para determinar mais a ligação das variantes de Fab de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b ou variantes de anticorpo, ligação de variantes de Fab e/ou IgG a células DoHH-2 foi analisada usando análise FACS. Ainda, ligação de variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b a células BJAB-luciferase foi analisada usando análise FACS.
Para análise FACS de variantes de Fab de variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com mA79b (anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (versão IgG usada como um controle)), células DOHH-2 (1 x 106 em volume de 100 μ) foram primeiro incubadas com ou sem 1 μg de anticorpo monoclonal anti-CD79b de camundongo original (MA79b) por 30 minutos, antes da adição de 1 μg de variante de Fab (ou anticorpo controle). Ig anti-humano de camundongo conjugado a PE, cadeia leve kappa (clone G20-193, BD Biosciences, São Diego, CA), foi usado como o anticorpo de detecção secundário, uma vez que todas as variantes de Fab carregam cadeia leve kappa e células DoHH-2 não expressam cadeia leve kappa na superfície celular.
Para análise FACS adicional de variantes de IgG de variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (versão IgG de chMA79b usada como controle), 1,0 μg, 0,1 μg ou 0,01 μg de anticorpo foi titulado por milhões de células de células BJAB-luciferase. Ig anti-humana de camundongo conjugada a PE foi usada como o anticorpo de detecção secundário.
G. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE SCATCHARD)
Para determinar mais a ligação das variantes de IgG tendo mudanças em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3), ligação de variantes de IgG iodadas a células BJAB expressando CD79b humano e CD79b de cinomólogo foi analisada e análise Scatchard foi realizada.
Para análise Scatchard, MA79b ou huMA79b L2/H3 marcado com I125 0,5 nM foi competido contra MA79b ou huMA79b L2/H3 não-marcado, respectivamente, variando de 50 a 0,02 nM (diluição serial 1:2 em 12 etapas) na presença de uma linhagem BJAB transfectada expressando estavelmente CD79b de cinomólogo e CD79b humana endógena. Após uma incubação de quatro horas a 4o C, as células foram lavadas e contagens de pélete de célula foram lidas por um contador gamma (1470 WIZARD Automatic Gamma Counter, Perkin Elmer, Waithem, MA). Todos os pontos foram feitos em triplicata e contados por 10 minutos. A CPM média foi usada para cálculo de Kd usando o programa New Ligand (Genentech, São Francisco do Sul, CA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO A. RESULTADOS DE GERAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD79B HUMANIZADO
A estrutura principal aceitadora humana usada para a geração de anticorpo antí-CD79b humanizado compreende o domínio VL de kappa I humano de consenso e uma variante do domínio VH de consenso de subgrupo III humano. O domínio VH variante tem 3 mudanças do consenso humano: R71A, N73T e L78A. Os domínios VL e VH de MA79b foram alinhados com os domínios do de kappa I e subgrupo III humanos; cada HVR foi identificado e então enxertado na estrutura principal aceitadora humana para gerar um enxerto de HVR que poderia ser deslocado como um Fab em fago (Figuras 7 e 8).
Fago exibindo o enxerto de MA79b como um Fab se ligou a huCD79beCd imobilizado (dados não mostrados). No entanto, quando a sequência de enxerto de huMA79b foi expressa como uma IgG, análise FACS de sua afinidade para huCD79eCd indicou que afinidade de ligação tinha sido reduzida em mais de 100 vezes (dados não mostrados) e análise Biacore indicou uma perda de mais de 50 vezes (Figura 11).
1. REPARO DE CDR
Variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b que eram capazes de se ligar a huCH79becd imobilizado com as mudanças de sequência que seguem foram identificadas.
Apenas mudanças de sequência se direcionando a HVRs em VL 15 foram observadas nas bibliotecas contendo mudanças de posição únicas e são mostradas na Figura 9 (para mutações de L1: Q27K (SEQ ID NO: 17; mutação de SPL-2), (para mutações de L2: L54R (SEQ ID NO: 18), E55K (SEQ ID NO: 19)) e (para mutações de L3: E93S (SEQ ID NO: 20; mutação de SPL-5), E93K (SEQ ID NO: 21)).
Apenas mudanças de sequência se direcionando a HVRs em L2, L3, H1 e H3 foram observadas nas bibliotecas contendo mudanças de posição múltiplas e são mostradas na Figura 10 (para mutações de L2: S52R, N53K, E55G e S56R (SEQ ID NO: 22; mutação de L2-2); N53R (SEQ ID NO: 23); S52R, N53K, E55G e S56N (SEQ ID NO: 24); S52R, N53K, E55K e S56R 25 (SEQ ID NO: 25); S52R, N53Y, E55K e S56R (SEQ ID NO: 26; mutação de L2- 29); S52R, N53K e E55K (SEQ ID NO: 27); S52R, N53K e E55A (SEQ ID NO: 28); S52G, N53I, E55A e S56R (SEQ ID NO: 29); S52R, N53K, E55R (SEQ ID NO: 30); S52R, N53K e E55G (SEQ ID NO: 31; mutação de L2-38); S52R, N53H, E55K e S56R (SEQ ID NO: 32); A51S, S52R, N53Y, E55S e S56R (SEQ ID NO: 33); A51G, N53K, E55L e S56R (SEQ ID NO: 34); L54R e E55K (SEQ ID NO: 35); N53K e E55G (SEQ ID NO: 36); S52R, N53Y, E55R e S56R (SEQ ID NO: 37); S52R, N53R, E55R e S56T (SEQ ID NO: 38); S52R, N53R, E55G e 5 S56R (SEQ ID NO: 39); S52R, N53Q, L54R, E55K e S56R (SEQ ID NO: 40); S52R, N53K, E55L e S56R (SEQ ID NO: 41); S52R, N53K, E55K e S56N (SEQ ID NO: 42); S52R, N53K, E55G e S56T (SEQ ID NO: 43); S52R, N53K, E55G e S56G (SEQ ID NO: 44); e S52R, N53K, E55A e S56R (SEQ ID NO: 45)), (para mutações de L3: E93A (SEQ ID NO: 46); E93Q (SEQ ID NO: 47); sem mutação 10 (SEQ ID NO: 48); E93D (SEQ ID NO: 49); E93L (SEQ ID NO: 50); Q89N, Q90N, E93G e T97N (SEQ ID NO: 51); Q90P, S91D, D94A e L96R (SEQ ID NO: 52); Q89D, S91R e E93A (SEQ ID NO: 53)), (para mutações de H1: T28P, S30T, S31R e E35S (SEQ ID NO: 54); T28P, S30R e E35Q (SEQ ID NO: 55); T28P, S30T e E35N (SEQ ID NO: 56); T28P, S30T, S31R e E36N (SEQ ID NO: 15 57; mutação de H1-6)); S30N, S31R e E35N (SEQ ID NO: 58); T28S e S30K (SEQ ID NO: 59); G26P, T28S, F29L, S30C, S31T, W33F e E35D (SEQ ID NO: 60); T28Y e S30T (SEQ ID NO: 61); T28P, S30G, S31R, I34V e E35N (SEQ ID NO: 62); S30K e S31K (SEQ ID NO: 63); T28P, S30T e E35Q (SEQ ID NO: 64); T28P, S30R e S31R (SEQ ID NO: 65); T28P, F29V, S30G, S31R e E35S 20 (SEQ ID NO: 66); T28P, S30N, S31R e E35N (SEQ ID NO: 67; mutação de H1- 1); T28G, S30T e E35S (SEQ ID NO: 68); S30T, I34L e E35S (SEQ ID NO: 69); S30T (SEQ ID NO: 70); S31G e E35N (SEQ ID NO: 71); S30R, S31R e E35N (SEQ ID NO: 72); T28S, S30R e E35N (SEQ ID NO: 73); T28S, S30R, S31R e E35N (SEQ ID NO: 74); T28S, S30R e S31R (SEQ ID NO: 75); T28S, S30P, 25 I34L e E35Q (SEQ ID NO: 76); T28P, S30T e S31R (SEQ ID NO: 77); T28P e S31G (SEQ ID NO: 78); T28P, S30R e E35S (SEQ ID NO: 79); T28P, S30R e E35N (SEQ ID NO: 80); T28P, S30R e S31G (SEQ ID NO: 81); T28P, S30N e S31R (SEQ ID NO: 82); T28P, S30N, S31G e E35N (SEQ ID NO: 83); T28N, F29V, I34L e E35S (SEQ ID NO: 84); Y27F, T28P, S30T e E35S (SEQ ID NO: 85); e Y27F, T28P, S30N, S31R e E35N (SEQ ID NO: 86)) e (para mutações de H3: V98I e F100L (SEQ ID NO: 87; mutação de H3-12); sem mutação (SEQ ID NO: 88); Y99K e F100L (SEQ ID NO: 89); F100L (SEQ ID NO: 90); V98I 5 (SEQ ID NO: 91); V98F, Y99C e F100L (SEQ ID NO: 92); F100L (SEQ ID NO: 93); V98I, Y99R e F100L (SEQ ID NO: 94; mutação de H3-10); V98I, Y99K e F100L (SEQ ID NO: 95); V98I e Y99R (SEQ ID NO: 96); V98I (SEQ ID NO: 97); D101S (SEQ ID NO: 98); Y99V e F100L (SEQ ID NO: 99); Y99R e F100L (SEQ ID NO: 100); Y99R (SEQ ID NO: 101); Y99F e F100L (SEQ ID NO: 102); V98I e 10 F100L (SEQ ID NO: 103); V98I (SEQ ID NO: 104); V96R, Y99C e F100L (SEQ ID NO: 105); e V96I (SEQ ID NO: 106)). Os clones selecionados foram refeitos como Fab para análise através de FACS e como IgG para análise adicional através de Biacore e Scatchard. 15 A. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE BIACORE) Conforme mostrado na Figura 11, mostrando análise Biacore, esta abordagem de reparo de CDR identificou muitas mudanças de sequência individuais que melhoram a afinidade do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b. Os ensaios de ressonância de plasmon de superfície mostraram 20 que embora nenhuma das variantes testadas com mudanças de HVR únicas tivesse uma atividade similar a MA79b, a combinação de mudanças identificada em HVR-L2 e HVR-H3 (variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b L2/H3; também referida aqui como huMA79b L2/H3) levou a uma variante com afinidade similar (Figura 11) a MA79b quando se 25 ligando a huCD79becCj imobilizado ou huCD79beCd-Fc ou ao peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epitopo para MA79b conforme determinado através de análise Biacore. Análise de ligação monomérica (Fab) versus ligação dimérica (IgG) de MA79b a antígeno (huCD79eCd-Fc) (Figura 11, fileira 1, comparar colunas Fab com IgG) sugeriu que um componente de avidez de 100 vezes presente em MA79b pode estar faltando nas variantes aperfeiçoadas na afinidade. Especificamente, na variante de anticorpo L2-2 humanizado enxertado com MA79b (também referido aqui como huMA79b L2-2) que demonstra um aperfeiçoamento de 5 vezes em ligação monomérica comparado com mA79b (Figura 11, fileiras 1 e 3, comparar colunas de Fab), nenhuma afinidade aparente é ganha quando da reforma de huMA79b L2-2 como uma IgG) (Figura 11, fileira 4, comparar colunas Fab com IgG). Ainda, o anticorpo "humanizado" enxertado com HVR MA79b inicial (enxertado com huMA79b) demonstra a perda deste componente de avidez em ligação (Figura 11, fileira 2, comparar colunas Fab com IgG). A habilidade em aumentar a ligação através de avidez pode ser desejável em ligação de antígenos de superfície celular.
B. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE SCATCHARD)
Conforme avaliado através de análise Scatchard, esta abordagem de reparo de CDR identificou muitas mudanças de sequência individuais que aperfeiçoaram a afinidade do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b. Especificamente, os ensaios de ligação celular mostraram que a afinidade de MA79b e variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b L2/H3 (huMA79b L2/H3) (refeita como IgG) para ligação de células BJAB estavelmente expressando CD79b de cinomólogo e CD79b humana endógena estava com valores Kd de 0,63 nM (MA79b; Kd = 0,63 ±0,14 nM) e 0,52 nM (huMA79b L2/H3; Kd = 0,52 ± 0,1 nM), respectivamente (dados não mostrados), conforme determinado através de análise Scatchard.
C. DETERMINAÇÃO DE LIGAÇÃO (ANÁLISE FACS)
Conforme determinado através de análise FACS, esta abordagem de reparo de CDR identificou muitas mudanças de sequência individuais que aperfeiçoaram a ligação do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (enxerto de huMA79b) a células DoHH-2 (dados não mostrados). Especificamente, análise FACS de variantes de Fab (mutações L2-2, H3-10 e H1-1) identificadas das bibliotecas SP e 6 SR para células DoHH-2 mostrou 5 ligação das variantes de Fab e enxerto de huMA79b (feitas como uma IgG) a células DoHH (dados não mostrados). Ainda, análise FACS das variantes de Fab mostrou que ligação das variantes de Fab a células DoHH-2 foi bloqueada através de pré-incubação com anticorpo monoclonal anti-CD79b de murino (MA79b) (dados não mostrados).
2. REPARO DE ESTRUTURA PRINCIPAL
Mudanças de sequência de HVR introduzidas em HVR-L2 da variante de huMA79b L2/H3 eram radicalmente diferentes daquelas observadas em qualquer linhagem germinativa humana. A variante de huMA79b L2/H3, quando conjugada a DM1, foi observada ser eficaz em 15 inibição de crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto de camundongo in vivo (Tabela 9). Uma vez que análise de ligação monomérica (Fab) versus ligação dimérica (IgG) de variante de huMA79b L2/H3 a antígeno mostrou uma perda de avidez (Figura 11), reparo da estrutura principal foi realizado conforme descrito abaixo.
Para explorar o papel de posições da estrutura principal em ligação de antígeno dimérico, uma variante de posições da "estrutura inteira" foi construída em que posições da estrutura principal de murino potencialmente importantes foram incorporadas ao anticorpo "humanizado" enxertado com HVR de MA79b (enxerto de huMA79b). Esta variante (referida na Figura 12 25 como de "estrutura inteira") sem quaisquer mudanças de HVR possuíam afinidade de ligação dimérica similar a anticorpo MA79b quimérico (chMA79b) (Figura 12) conforme avaliado através de Análise Biacore e análise Scatchard.
Variantes de IgG, incluindo resíduos de estrutura principal de murino nas posições 4 e/ou 47 (VL) e/ou posições 47, 48, 67, 69, 71, 73, 74, 78 e/ou 80 (VH) foram geradas para determinar o conjunto mínimo de posições da estrutura principal necessário para manter ligação dimérica, de alta afinidade (Figura 12). Resíduos de estrutura principal de murino são mostrados nas 5 Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14). As posições na estrutura principal 47 em VL e 75 e 80 em VH foram constatadas dispensáveis conforme evidenciado através da variante 17 de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.v17) (Figura 12, fileira marcada como 17).
Variante 18 de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (MA79b.v18; Figura 12, fileira marcada como 18), que inclui resíduos de estrutura principal de murino nas posições 4 em VL e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH e inclui ainda mudanças em HVR-H3 (referidas na Figura 12 como "H3- 10" e descritas acima como mutação H3-10), incluindo V98I, Y99R e F100L, 15 mostrou um aperfeiçoamento adicional de 2 vezes (Figura 12, fileira marcada como 28) em ligação quimérica quando comparado com a variante 17 (Figura 12, fileira marcada 17). Para evitar questões de fabricação potenciais, um sítio de formação de ácido iso-aspártico potencial (Asp-Gly) em HVR-L1 das variantes 20 de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b foi eliminado através de conversão de D28 em Glu (ácido glutâmico) (D28E; vide variante 28; também referida aqui como "huMA79b.v28"; Figura 12, fileira marcada como 28). Outras substituições para estabilidade em VL das variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b foram também toleradas incluindo D28 em Ser (serina) 25 (D28E; vide variante 32; também referida aqui como "huMA79b.v32"; Figura 12, fileira marcada como 32). Variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b 28 (huMA79b.v28; Figura 12, fileira marcada como 28) que inclui: (1) resíduos de estrutura principal de murino nas posições 4 em VL e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, (2) inclui ainda mudanças em HVR-H3 (referidas na Figura 12 como "H3-10" e descritas acima como mutação H3-10), incluindo V98I, Y99R e F1OOL, e (3). inclui ainda mudanças em HVR-L1 (D28E, descrita acima) foi 5 caracterizada através de análise Biacore. Variante de anticorpo "humanizado" enxertado com mA79b 32 (MA79b.v32; Figura 12, fileira marcada como 32) que inclui: (1) resíduos de estrutura principal de murino nas posições 4 em VL e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, (2) inclui ainda mudanças em HVR-H3 (referidas na Figura 12 como 10 "H3-10" e descritas acima como mutação H3-10), incluindo V98I, Y99R e F100L, e (3) inclui ainda mudanças em HVR-L1 (D28D, descrita acima) foi caracterizada através de análise Biacore.
A. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE BIACORE)
Conforme mostrado na Figura 12, mostrando análise Biacore, 15 esta abordagem de reparo de estrutura principal identificou muitas mudanças de sequência individuais que aperfeiçoaram a afinidade do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b para huCH79becC|. Os ensaios de ressonância de plasmon de superfície mostraram que uma variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b 28 (huMA79b.v28; com 20 posições na estrutura principal de murino 4 em VL, 48, 67, 71, 73 e 78 em VH, bem como a mutação H3-10 em HVR-H3 (V98I, U99R e F100L (também descrita acima) e uma mutação D28E em HVR-L1 (quanto à estabilidade, vide descrição acima); A figura 12, fileira marcada como 28) e uma variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.v32; com posições 25 na estrutura principal de murino 4 em VL, 47, 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, bem como a mutação H3-10 em HVR-H3 (V98I, Y99R e F100L (também descrita acima) e uma mutação D28S em HVR-L1 (quanto à estabilidade, vide descrição abaixo); Figura 12, fileira marcada como 32) tinham afinidade equivalente a anticorpo MA79b quimérico (chMA79b) quando se ligando a huCD79becd imobilizado conforme determinado através de análise Biacore.
B. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE SCATCHARD)
Conforme avaliado através de análise Scatchard, similar à análise Biacore, esta abordagem de reparo de estrutura principal identificou muitas mudanças de sequência individuais que aperfeiçoaram a afinidade do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (enxerto de huMA79b). Os ensaios de ligação celular mostraram que a afinidade de MA79b, variante 28 de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.v28; vide Figura 12, fileira marcada como 28) (refeita como IgG) e variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b 32 (huMA79b.v32; vide Figura 12, fileira marcada como 32) para ligação da células BJAB expressando estavelmente CD79b cinomólogo e CD79b humano endógeno estava com valores Kd de 0,63 nM (MA79b; Kd = 0,63 ± 0,14 nM), 0,44 nM (huMA79b.v28; Kd = 0,44 ± 0,04 nM) e 0,24 nM (huMA79b.v32; Kd = 0,24 ± 0,02 nM), respectivamente (dados não mostrados), conforme determinado através de análise Scatchard.
C. DETERMINAÇÃO DE LIGAÇÃO (ANÁLISE FACS)
Conforme avaliado através de análise FACS, esta abordagem de reparo de estrutura principal identificou muitas mudanças de sequência individuais que aperfeiçoaram a ligação do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (enxerto de huMA79b) a células BJAB-luciferase (dados não mostrados). Especificamente, análise FACS de variantes de IgG de variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (variantes huMA79b.v28 e huMA79b.v32) para células BJAB-luciferase mostrou ligação a células BJAB- luciferase (dados não mostrados).
B. DISCUSSÃO DE GERAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B HUMANIZADOS
Partindo de um enxerto das 6 HVRs de MA79b de murino (definidas nas posições 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 26-35 (H1), 49-65 (H2) e 93-102 (H3)) na VL Kappa I e na VH subgrupo III de consenso humanas (contendo A71, T73 e A78), reparo de CDR foi usado para identificar mudanças em HVRs 1-6 que aperfeiçoam a afinidade de ligação. Mudanças nas sequências de HVR identificadas nas Figuras 10 e 11 ou combinações dessas mudanças levaram a variantes humanizadas de MA79b com afinidades similares a MA79b. Alternativamente, reparo da estrutura principal foi usado para recapturar avidez de ligação dimérica através da adição de posições 4 da estrutura principal em VL e 48, 67 e 69 em VH para o enxerto huMA79b (que inclui resíduos de estrutura principal de murino em 71, 73 e 78 de VH) (Figura 12; variante de anticorpo "humanizado" enxertado com mA79b 17 (huMA79b.v17)). A afinidade dessas variantes de mutação de estrutura principal para antígeno de huCD79eCd foi aumentada mais através da adição de 3 mudanças em HVR-H3: V98I, Y99R e F100L (Figura 12; variante de anticorpo "humanizado" enxertada com MA79b 18 (huMA79b.v18)). Um ácido isoaspártico potencial formando sítio em HVR-L1 foi eliminado com uma mutação D28E (Figura 12; variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b 28 (huMA79b.v28)).
EXEMPLO 2: GERAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO ANTI-CD79B -FÁRMACO (ADCs)
Para testar a eficácia de variantes de IgG de variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b, as variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b foram conjugadas a fármacos, tal como DM1. As variantes conjugadas a DM1 incluíam as variantes tendo mudanças em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b, L2/H3), huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA79b.v28 e huMA79b.v32.
Os fármacos usados para geração de conjugados de anticorpo- fármaco (ADCs) para anticorpos anti-CD79b incluíam derivados de maitansinoide DM1 e dolastatinalO monometilauristatina E (MMAE) e monometillauristatína F (MMAF). (US 2005/0276812; US 2005/0238649; Doronina e outros, Bioconjug. Chem., 17:114-123 (2006); Doronina e outros, Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003); Erickson e outros, Cancer Res., 66: 44264433 (2006), todos aqui incorporados a título de referência em sua totalidade). Ligantes úteis para geração dos ADCs são BMPEO, SPP ou SMCC (também referido aqui como "MCC") para DM1 e MC ou MC-vc-PAB para MMAE e MMAF. Para DM1, os anticorpos foram ligados ao grupo tiol de DM1 e através do grupo ε-amino de lisina usando o reagente ligante SMCC. Alternativamente, para DM1, os anticorpos foram ligados a DM1 através do grupo ε-amino de lisina usando o ligante SPP. SPP (N-succinimidil 4-(2'-piridiltio)pentanoato) reage com o grupo épsilon amino de lisina para deixar um ligante dissulfeto 2- piridila na proteína. Com ligantes SPP, quando da reação com um sulfidral livre (por exemplo, DM1), o grupo piridila é deslocado, deixando o DM1 ligado através de uma ligação dissulfeto reduzível. DM1 ligado através de um ligante SPP é liberado sob condições de redução (isto é, por exemplo, dentro de células) enquanto DM1 ligado através do ligante de SMCC é resistente à clivagem em condições de redução. Ainda, ACDs de SMCC-DM1 induzem toxidez celular se o ADC for internalizado e direcionado ao lisossoma causando a liberação de lisina-Nε-DM1, que é um agente antimitótico eficaz dentro da célula, e quando liberada da célula, lisina-Nε-DM1 é não-tóxica (Erickson e outros, Cancer Res., 66: 4426-4433 (2006)) . Para MMAE e MMAF, os anticorpos foram ligados a MMAE ou MMAF através da cisteína por maleimidocaproil-valina-citrulina (vc)-p-aminobenziloxicarbonila (MC-vc-PAB). Para MMAE, os anticorpos foram alternativamente ligados a MMAF através da cisteína por ligante maleimidocaproíla (MC). O ligante MC-vc-PAB é clivável através de proteases intercelulares tal como catepsina B e quando clivado, libera fármaco livre (Doronina e outros, Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003)) enquanto o ligante MC é resistente à clivagem por proteases intracelulares.
Conjugados anticorpo-ármaco (ADCs) para anti-CD79b, usando SMCC e DM1, foram gerados similar ao procedimento descrito na US 2005/0276812. Anticorpos purificados anti-CD79b tiveram tampão trocado em uma solução contendo fosfato de potássio 50 mM e EDTA 2 mM, pH 7,0. SMCC (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) foi dissolvido em dimetilacetamida (DMA) e adicionado à solução de anticorpo para fazer uma razão molar de SMCC/Ab de 10:1. A reação foi deixada prosseguir por três horas em temperatura ambiente com mistura. O anticorpo modificado com SMCC foi subsequentemente purificado em uma coluna de dessalinização GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada em citrato de sódio 35 mM com NaCI 150 mM e EDTA 2 mM, pH 6,0, DM1, dissolvido em DMA, foi adicionado à preparação de anticorpo SMCC para dar uma razão molar de DM1 para anticorpo de 10:1. A reação foi deixada prosseguir por 4-20 horas em temperatura ambiente enquanto misturando. A solução de anticorpo modificada com DM1 foi diafiltrada com 20 volumes de PBS para remover DM1 não-reagido, filtrada estéril e armazenada a 4 graus C. Tipicamente, um rendimento de 40-60% de anticorpo foi atingido através deste processo. A preparação era geralmente >95% monomérica conforme avaliado através de filtragem em gel e difração de luz laser. Uma vez que DM1 tem um máximo de absorção em 252 nm, a quantidade de um fármaco ligado ao anticorpo poderia ser determinada através de medições de absorção diferencial a 252 e 280 nm. Tipicamente, a razão de fármaco para anticorpo era 3 a 4.
Conjugados anticorpo fármaco (ADCs) para anticorpos anti- CD79b descritos aqui usando ligantes de SPP-DM1 podem ser gerados de maneira similar ao procedimento descrito na US 2005/0276812. Anticorpos purificados anti-CD79b têm tampão trocado em uma solução contendo fosfato de potássio 50 mM e EDTA 2 mM, pH 7,0. SPP (Immunogen) foi dissolvido em DMA e adicionado à solução de anticorpo para fazer uma razão molar de SPP/Ab final de aproximadamente 10:1, a razão exata dependendo da carga de fármaco desejada do anticorpo. Uma razão 10:1 vai geralmente resultar em uma razão de fármaco para anticorpo de aproximadamente 3-4. O SPP é deixado reagir por 3-4 horas em temperatura ambiente com mistura. O anticorpo modificado com SPP é subsequentemente purificado em uma coluna de dessalinização GE Healthcare HITrap (G-25) equilibrada em citrato de sódio 35 mM com NaCI 150 mM e EDTA 2 mM, pH 6,0 ou solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4, DM1 é dissolvido em DMA e adicionado à preparação de anticorpo SPP para dar uma razão molar de DM1 para anticorpo de 10:1, que resulta em um excesso molar de 3-4 vezes sobre os ligantes de SPP disponíveis no anticorpo. A reação com DM1 é deixada prosseguir por 4-20 horas em temperatura ambiente com mistura. A solução de anticorpo modificada com DM1 é diafiltrada com 20 volumes de PBS para remover DM1 não-reagido, filtrada estéril e armazenada a 4 graus C. Tipicamente, rendimentos de anticorpo de 40-60% ou mais são obtidos com este processo. O conjugado anticorpo-fármaco é geralmente >95% monomérico conforme avaliado através de filtragem em gel e difração de luz laser. A quantidade de fármaco ligado é determinada através de medições de absorção diferencial a 252 e 280 nm conforme descrito para a preparação de conjugados SMCC-DM1 (descrita acima).
Conjugados anticorpo-fármaco (ADC) para anticorpos anti-CD79b descritos aqui usando ligantes de fármaco MC-MMAF, MC-MMAE, MC-val-cit (vc)-PAB-MMAE ou MC-val-cit (vc)-PAB-MMAF podem ser também similares ao procedimento descrito na US 2005/0238649. Anticorpo anti-CD79b purificado é dissolvido em borato de sódio 500 mM e cloreto de sódio 500 mM em pH 8,0 e tratado mais com um excesso de ditiotreitol 100 mM (DTT). Após incubação a 37° C por cerca de 30 minutos, o tampão é trocado através de eluição em resina Sephadex G25 e eluído com PBS com DTPA 1 mM. O valor de tiol/Ab é checado através da determinação da concentração de anticorpo reduzido a partir da absorbância a 280 nm da solução e da concentração de tiol através de reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) e determinação da 5 absorbância a 412 nm. O anticorpo reduzido é dissolvido em PBS esfriado em gelo. O ligante de fármaco, por exemplo, MC-val-cit (vc)-PAB-MMAE, em DMSO, é dissolvido em acetonitrila e água, e adicionado ao anticorpo reduzido esfriado em PBS. Após uma hora de incubação, um excesso de maleimida é adicionado para extinguir a reação e capear quaisquer grupos tiol de anticorpo 10 não-reagidos. A mistura de reação é concentrada através de ultrafiltragem centrífuga e o conjugado anticorpo-fármaco é purificado e dessalinizado através de eluição por uma resina G25 em PBS, filtrada em filtros de 0,2 pm sob condições estéreis e congelada para armazenamento.
Conjugados de anticorpo-fármaco (usando anticorpos anti-CD79b 15 descritos aqui) foram diluídos a 2 x 10 μg/ml em meio de ensaio. Os conjugados foram ligados com reticuladores SMCC (ligante dissulfeto alternativo pode ser usado para SPP para toxina de maitansinoide DM1) (vide US 2005/0276812 e US 2005/0238649). Ainda, conjugados podem ser ligados com MC-valina-citrulina (vc)-PAB ou MC a derivados de dolastatinalO, toxina 20 de monometilauristatina E (MMAE) ou toxina de monometilauristatina F (MMAF) (vide Pedido de Patente U.S. No. 11/141.344 depositado em 31 de maio de 2005 e Pedido U.S. No. 10/983.340 depositado em 5 de novembro de 2004). Controles negativos incluíam conjugados baseados em HERCEPTIN® (trastuzumab) (anti-HER2) (SMCC-DM1 ou SPP-DM1 ou MC-vc-MMAE ou MC25 vc-MMAF). Controles positivos podem incluir L-DM1 equivalente á dose de carga do conjugado. As amostras foram vortexadas para assegurar mistura homogênea antes da diluição.
Anticorpos anti-CD79b para conjugação de fármaco incluíam anticorpos MA79b quiméricos (chMA79b) e variante de anticorpo huMA79b L2/H3 e huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA79b.v28 e huMA79b.v32 descritos aqui (vide Exemplo 1). Anticorpos adicionais para conjugação podem incluir quaisquer anticorpos descritos aqui (vide Exemplo 1).
EXEMPLO 3: ENSAIO DE MORTE CELULAR DE TUMOR IN VIVO A. XENOENXERTOS
Para testar a eficácia de variantes de IgG de variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b tendo mudanças em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3), a variante huMA79b L2/H3 foi conjugada a DM1 e o efeito da variante conjugada sobre tumores em camundongos foi analisado.
Especificamente, a habilidade dos anticorpos em regredir tumores em modelos de xenoenxerto múltiplos, incluindo células RAMOS, células BJAB (linhagem de célula de linfoma de Burkitt que contém a translocação t(2;8)(p112;q24) (IGK-MYC), um gene p53 mutado e é negativa para o vírus Epstein-Barr (EBV)) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)), células Granta 519 (linhagem de célula do linfoma da célula do manto que contém a translocação t(11 ;14)(q13;q32) (BCL1-IGH) que resulta na superexpressão de ciclina D1 (BCL1), contém deleções de P16INK4B e P16INK4A e é positiva para EBV) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, São Diego: Academic Press, 2001)), células U698M (linhagem de célula B de linfossarcoma linfoblástico); (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, São Diego: Academic Press, 2001) e células DoHH2 (linhagem de célula de linfoma folicular que contém a característica de translocação de linfoma folicular t(14;18)(q32;q21) que resulta na superexpressão de Bcl-2 dirigida pela cadeia pesada de lg, contém deleção de P16INK4A, contém a translocação de t(8; 14)(q24;q32) (IGH-MYC) e é negativa para EBV) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, São Diego: Academic Press, 2001)), pode ser examinada.
Para análise de eficácia de variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b, camundongos SCID ICR CB17 fêmeas (6-8 semanas de vida do Charles River Laboratoryes; Hollister, CA) foram inoculados 5 subcutaneamente com 2 x 107 células BJAB-luciferase ou células Granta-519 através de injeção nos flancos de camundongos CB17 ICR SCID e os tumores de xenoenxerto foram deixados crescer para uma média de 200 mm2. O Dia 0 refere-se ao dia que os tumores tinham uma média de 200 mm2 e quando a primeira/ou dose unida de tratamento foi administrada, a menos que de outra 10 maneira especificamente indicado abaixo. O volume do tumor foi calculado com base em duas dimensões, medidas usando compassos de calibre, e foi expresso em mm3 de acordo com a fórmula: V = 0,5a X b2, em que a e b são os diâmetros de longo e curto do tumor, respectivamente. Dados coletados de cada grupo experimental foram expressos como média ± SE. Grupos de 10 15 camundongos foram tratados com uma dose intravenosa (i.v.) única entre 50 μg e 210 μg de fármaco ligado a anticorpo /m2 de camundongo (correspondendo a —1,4 mg/kg de camundongo) com variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b ou conjugados anticorpo-fármaco controle. Os tumores foram medidos ou uma vez ou duas por semana durante 20 o experimento. Pesos do corpo de camundongos foram medidos ou uma vez ou duas por semana durante o experimento. Os camundongos foram eutanizados antes dos volumes do tumor atingirem 3000 mm3 ou quando os tumores mostraram sinais de ulceração inibida. Todos os protocolos animais foram aprovados por um Institutional Animal Care and Use Committee 25 (IACUC). Ligantes entre o anticorpo e a toxina que foram usados foram reticulante de tioéter SMCC para DM1. Ligantes adicionais podem incluir ligante dissulfeto SPP ou reticulante tioéter SMCC para DM1 ou MC ou MC- i valina-cítrulina(vc)-PAB ou (um reagente ligante de dipeptídeo valina-citrulina (vc)) tendo um componente maleimida e um component auto-imolativo para- aminobenzilcarbamoíla (PAB) para monometilauristatina E (MMAE) ou monometilauristatina F (MMAF). As toxinas usadas foram DM1. Toxinas adicionais podem incluir MMAE ou MMAF.
Anticorpos de CD79b para este experimento incluíam anticorpos de MA79b quiméricos (chMA79b) conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 11/462.336 depositado em 3 de agosto de 2006 bem como variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b descritas aqui (vide Exemplo 1A). Anticorpos adicionais podem incluir anticorpos comercialmente disponíveis, incluindo anticorpo anti-CD79b, e anticorpos monoclonais MA79b gerados de hibridomas depositados com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993.
Controles negativos incluíam conjugados baseados em anti-HER2 (HERCEPTIN® (trastuzumab)) (SMCC-DM1).
B. RESULTADOS XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE
Em um curso de tempo de 35 dias com conjugados de fármaco e doses conforme mostrado na Tabela 9, variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b L2/H3 (variante huMA79b L2/H3) (refeita como IgG) e anticorpo anti-CD79b quimérico (chMA79b) conjugados a DM1 (huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 e chMA79b-SMCC-DM1, respectivamente), mostrou inibição de crescimento de tumor em camundongos SCID com tumores de BJAB-luciferase comparado com controle negativo, HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC-DMI (anti-HER2-SMCC-DM1). ADCs foram administrados em uma dose única (conforme indicado na Tabela 9) no dia 0 para todos os ADCs e controles. Especificamente, os anticorpos huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 (refeitos com IgG) e chMA79b-SMCC-DM1 inibiram significantemente crescimento de tumor (Figura 20). Ainda, na Tabela 9, o número de camundongos do número total de camundongos testados mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume do tumor em qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor 5 medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado.
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2. XENOENXERTOS DE GRANTA-519
Em um curso de 14 dias com conjugados de fármaco e doses conforme mostrado na Tabela 10, variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b 17, variante 18, variante 28 e variante 32 (huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA79b.v28 e huMA79b.v32, respectivamente) (refeita como IgG) e anticorpo anti-CD79b quimérico (chMA79b) conjugado a DM1 (huMA79b.v17-SMCC-DM1, huMA79b.v18- 15 SMCC-DM1, huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32-SMCC-DM1 echMA79b-SMCC-DM1, respectivamente) mostraram inibição de crescimento de tumor em camundongos SCID com tumores de Granta-519 comparado com controle negativo, HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC-DMI (anti-HER2- SMCC-DM1). ADCs foram administrados em uma dose única (conforme indicado na Tabela 10) no dia 0 para todos os ADCs e controles.
Especificamente, os anticorpos huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32- SMCC-DM1, huMA79b.v17-SMCC-DM1 e huMA79b.v18-SMCC-DM1 (refeitos como IgG) e chMA79b-SMCC-DM1 inibiram significantemente o crescimento de tumor (Figura 21 A).
Ainda, tratamento com huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32- 10 SMCC-DM1, huMA79b.v17-SMCC-DM1, huMA79b.v18-SMCC-DM1 e chMA79b-SMCC-DM1 e HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC-DMI (anti-HER2- SMCC-DM1) controle não resultou em uma diminuição na porcentagem de peso do corpo dos camundongos (Figura 21B). Ainda, na Tabela 10, o número de camundongos do número total de dez camundongos testados mostrando 15 PR = Regressão Parcial (em que o volume do tumor em qualquer momento após a administração caiu para menos de 50% do volume de tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado.
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À luz da habilidade de ADCs de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b em inibir significantemente progressão de tumor em xenoenxertos, moléculas de CD79b podem ser excelentes alvos para terapia de tumores em mamíferos, incluindo cânceres associados à célula B, tais como 5 linfomas (isto é, Linfoma Não-Hodgkin), leucemias (isto é, leucemia linfocítica crônica) e outros cânceres de células hematopoiéticas. Ainda, ADCs "humanizados" enxertados com MA79b são úteis para redução de crescimento de tumor in vivo de tumores, incluindo cânceres associados à célula B, tais como linfomas (isto é, Linfoma Não-Hodgkin), leucemias (isto é, leucemia 10 linfocítica crônica) e outros cânceres de células hematopoiéticas.
EXEMPLO 4: CO-LOCALIZAÇÂO DE ANTICORPO DE CD79B
Para determinar em que anticorpos "humanizados" enxertados com MA79b e variantes de anticorpo são aplicados quando internalizados em uma célula, estudos de co-localização dos anticorpos anti-CD79b 15 internalizados em linhagens de célula B podem ser avaliados em linhagens de célula Ramos. LAMP-1 é um marcador para endossomas e lisossomas tardios (Kleijmeer e outros, Journal of Cell Biology, 139(3): 639-649 (1997); Hunziker e outros, Bioessays, 18:379-389 (1996); Mellman e outros, Annu. Rev. Dev. Biology, 12:575-625 (1996)), incluindo compartimentos de classe II do MHC (MIICs), que é o compartimento tipo endossoma/lissoma tardio. HLA-DM é um marcador para MIICs. Células Ramos são incubadas por 3 horas a 37° C com 1 μg/ml de anticorpos "humanizados" enxertados com MA79b e variantes de anticorpo, bloco FcR (Miltenyi) e 25 μg/ml de Alexa647-Transferrina (Molecular Probes) em meio livre de carbonato completo (Gibco) com a presença de 10 μg/ml de leupeptina (Roche) e 5 μM de pepstatina (Roche) para inibir degradação lisossomal. As células são então lavadas duas vezes, fixadas com paraformaldeído 3% (Electron Microscopy Science) por 20 minutos em temperatura ambiente, extintas com NH4CI 50 mM (Sigma), permeabilizadas com Saponina 0,4%/FBS 2%/BSA 1% por 20 minutos e então incubadas com 1 μg/ml de anticamundongo Cy3 (Jackson Immunoresearch) por 20 minutos. A reação é então bloqueada por 20 minutos com IgG de camundongo (Moelcular Probes), seguido por uma incubação de 30 minutos com Image-iT FX Signal Enhancer (Molecular Probes). As células são finalmente incubadas com anti- LAMP1 de camundongo marcado com Zenon Alexa488 (BD Pharmingen), um marcador para ambos os lisossomas e MIIC (um compartimento tipo lisossoma que é parte do curso classe II do MHC), por 20 minutos, e pós-fixadas com PFA 3%. As células são ressuspensas em 20 μl de tampão de saponina e deixadas aderir a lâminas revestidas com poli-lisina (Sigma) antes da montagem de uma tampa com VectaShield contendo DAPI (Vector Laboratoryes). Para imunofluorescência do MIIC ou lisossomas, as células são fixadas, permeabilizadas e aumentadas como acima, então co-tingidas com Alexa555-HLA-DM marcado com Zenon (BD Pharmingen) e Alexa488-Lamp1 na presença de IgG de camundongo em excesso conforme as instruções do fabricante (Moelcular Probes). Desta maneira, co-localização de anticorpos "humanizados" enxertados com MA79b ou variantes de anticorpo com MIIC ou lisossomas de linhagens de célula B conforme avaliado através de imunofluorescência pode indicar as moléculas como excelentes agentes para terapia de tumores em mamíferos, incluindo cânceres associados com célula B, tais como linfomas (isto é, Linfoma Não-Hodgkin), leucemia (isto é, leucemia linfocítica crônica) e outros cânceres de células hematopoiéticas.
EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B ENGENHEIRADOS COM CISTEÍNA
A preparação de anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína foi realizada conforme aqui descrito. DNA codificando o anticorpo de MA79b (cadeia leve, SEQ ID NO: 4, Figura 4; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 5, Figura 5) sofreu mutagênese através dos métodos descritos aqui para modificar a cadeia leve e a cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo de MA79b (cadeia pesada, SEQ ID NO: 5; Figura 5) pode sofrer mutagênese também através de métodos descritos aqui para modificar a região Fc da cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v17 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 304, Figura 15) sofreu mutagênese através de métodos descritos aqui para modificar a cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v17 (cadeia leve, SEQ ID NO: 303; Figura 15; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 304, Figura 15) pode também sofrer mutagênese através de métodos descritos aqui para modificar a cadeia leve ou a região Fc da cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v18 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 306, Figura 16) sofreu mutagênese através de métodos descritos aqui para modificar a cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v18 (cadeia leve, SEQ ID NO: 305; Figura 16; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 306; Figura 16) pode também sofrer mutagênese através de métodos descritos aqui para modificar a cadeia leve ou a região Fc da cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v28 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 308, Figura 17) sofreu mutagênese através de métodos descritos aqui 5 para modificar a cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v28 (cadeia leve, SEQ ID NO: 307, Figura 17; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 308, Figura 17) pode também sofrer mutagênese através de métodos descritos aqui para modificar a cadeia leve ou a região Fc da cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v32 (cadeia leve, SEQ ID 10 NO: 310, Figura 18; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 309, Figura 18) pode sofrer mutagênese através de métodos descritos aqui para modificar a cadeia leve e a cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo de CD79b anti-cino (cadeia leve, SEQ ID NO: 241; Figura 45 e cadeia pesada, SEQ ID NO: 243, Figura 47) 15 sofreu mutagênese através de métodos descritos aqui para modificar a cadeia pesada e a cadeia leve. DNA codificando o anticorpo de CD79b anti-cino (cadeia pesada, SEQ ID NO: 243, Figura 47) pode também sofrer mutagênese através de métodos descritos aqui para modificar a região Fc da cadeia pesada. 20 Na preparação dos anticorpos anti-CD79b engenheirados com cisteína, DNA codificando a cadeia leve sofreu mutagênese para substituir valina por cisteína na posição Kabat 205 na cadeia leve (posição sequencial 209) conforme mostrado na Figura 27 (cadeia leve SEQ ID NO: 235 ou MA79b tioMAb) e Figura 49 (cadeia leve SEQ ID NO: 300 ou tioMAb anti-cino CD79b 25 (ch10D10). DNA codificando a cadeia pesada sofreu mutagênese para substituir alanina por cisteína na posição EU 118 na cadeia pesada (posição sequencial 118; número Kabat 114) conforme mostrado na Figura 48 (SEQ ID NO: 244 da cadeia pesada de anticorpo de CD79b anti-cino tioMab (ch10D10), Figura 28 (SEQ ID NO: 236 da cadeia pesada de tioMAb de MA79), Figura 24 (SEQ ID NO: 228 da cadeia pesada de huMA79b.v17 de tioMAb), Figura 25 (SEQ ID NO: 230 de huMA79b.v18 de tioMAb) e Figura 26 (SEQ ID NO: 232 da cadeia pesada de huMA79v.v28 de tioMAb). A região Fc de anticorpos anti- 5 CD79b pode sofrer mutagênese para substituir serina por cisteína na posição EU 400 na região Fc de cadeia pesada (posição sequencial 400; número Kavat 396) conforme mostrado nas Tabelas 2-4.
A. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B ENGENHEIRADOS COM CISTEÍNA PARA CONJUGAÇÃO ATRAVÉS DE REDUÇÃO E REOXIDAÇÃO
Anticorpos monoclonais anti-CD79b engenheirados com cisteína, de comprimento integral, (TioMAbs) expressos em células CHO e purificados em uma cromatografia de afinidade de proteína A seguido por uma cromatografia de exclusão de tamanho. Os anticorpos purificados são reconstituídos em borato de sódio 500 mM e cloreto de sódio 500 mM em 15 pH de cerca de 8,0 e reduzidos com excesso molar de cerca de 50-100 vezes de TCEP 1 mM (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina; Getz e outros (1999), Anal. Biochem., Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) por cerca de 1-2 horas a 37° C. O tioMab reduzido é diluído e carregado em uma coluna HiTrap S em acetato de sódio 10 mM, pH 5 e eluído com PBS 20 contendo cloreto de sódio 0,3M. O TioMab reduzido eluído é tratado com ácido desidroascórbico 2 mM (dhAA) em pH 7 por 3 horas ou sulfato de cobre aquoso 2 mM (CuSO4) em temperatura ambiente da noite para o dia. Oxidação ao ar ambiente pode ser também eficaz. O tampão é trocado através de eluição em resina Sephadex G25 e eluido com PBS com DTPA 25 1 mM. O valor tiol/Ab é estimado através da determinação da concentração de anticorpos reduzida da absorbância a 280 nm da solução e a concentração de tiol através da reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) e determinação da absorbância a 412 nm.
EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE ANTICORPO ANTI-CD79B ENGENHEIRADO COM CISTEÍNA-FÁRMACO ATRAVÉS DE CONJUGAÇÃO DOS ANTICORPOS ANTI-CD79B ENGENHEIRADOS COM CISTEÍNA E INTERMEDIÁRIOS FÁRMACO-LIGANTE
Após os procedimentos de redução e reoxidação do Exemplo 5, o anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína é reconstituído em tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) e esfriado em gelo. Cerca de 1,5 equivalente molar com relação a cisteínas engenheiradas por anticorpo de um intermediário fármaco ligante auristatina, tal como MC-MMAE (maleimidocapropil-monometil auristatina E), MC-MMAF, MC-val-cit-PAB- MMAE ou MC-val-cit-PAB-MMAF, com um grupo funcional tiol reativo tal como maleimido, é dissolvido em DIVISO, diluído em acetonitrila e água, e adicionado ao anticorpo reoxidado, reduzido frio, em PBS. Após cerca de uma hora, um excesso de maleimido é adicionado para extinguir a reação e capear quaisquer grupos tióis de anticorpo não-reagidos. A mistura de reação é concentrada através de ultrafiltragem centrífuga e o conjugado anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína -fármaco é purificado e dessalinizado através de eluição através de resina G25 em PBS, filtrado em filtros de 0,2 pm sob condições estéreis e congelado para armazenamento. Preparação de huMA79b.v18-HC(A118C) tioMAb-BMPEO-DM1 foi realizada como segue. A cisteína livre em tioMAb huMA79b.v18-HC (A118C) foi modificada pelo reagente bis-maleimido BM(PEO)3 (Píerce Chemical), deixando um grupo maleimido não-reagido na superfície do anticorpo. Isto foi realizado através de dissolução de BM(PEO)3 em uma mistura de etanol/água 50% para uma concentração de 10 mM e adição de um excesso molar de 10 vezes de BM(PEO)3 a uma solução contendo tioMAb huMA79b.v18-HC(A118C) em solução salina tamponada com fosfato em uma concentração de aproximadamente 1,6 mg/ml (10 micromolares) e permitindo que ele reagisse por 1 hora. BM(PEO)a em excesso foi removido através de filtragem em gel (coluna HiTrap, Pharmacia) em citrato 30 mM, pH 6 com tampão de NaCI 150 mM. Um excesso molar de aproximadamente 10 vezes de DM1 dissolvido em dimetil acetamida (DMA) foi adicionado ao 5 intermediário tioMAb huMA79b,v18-HC(A118C) -BMPEO. Dimetilformamida (DMF) pode ser também empregada para dissolver o reagente da porção de fármaco. A mistura de reação foi deixada reagir de um dia para o outro antes de filtragem em gel ou diálise em PBS para remover fármaco não- reagido. Filtragem em gel em coluna S200 em PBS foi usada para remover 10 agregados de peso molecular alto e fornecer tioMAb huMA79b.v18- HC(A118C) -BMPEO-DM1.
Através dos mesmos protocolos, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)- BMPEO-DM1 controle, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF controle, tio I hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE controle e tio anti-CD22 15 HC(A118C)-MC-MMAF controle foram gerados.
Através dos procedimentos acima, os conjugados de anticorpo- fármaco anti-CD79b engenheirados com cisteína que seguem (TDCs) foram preparados e testados: 1. tio huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF através da 20 conjugação de A118C tio huMA79b.v18-HC(A118C) e MC-MMAF; 2. tio huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1 através da conjugação de A118C tio huMA79b.v18-HC(A118C) e BMPEO-DM1 ; 3. tio huMA79b.v18-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE através da conjugação de A118C tio huMA79b.v18-HC(A118C) e MC-val-cit-PAB-MMAE; 25 4. tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF através da conjugação de A118C tio huMA79b.v28-HC(A118C) e MC-MMAF; 5. tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 através da conjugação de tio huMA79b.v28-HC(A118C) e BMPEO-DM1; 6. tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-val-cit-PAB-MMAE através da conjugação de tio huMA79b.v28-HC(A118C) e MC-val-cit-PAB- MMAE; 7. tio anti-cinoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF através 5 da conjugação de A118C tio anti-cinoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) e MC- MMAF; 8. tio anti-cinoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)-BMPE0-DM1 através da conjugação de A118C tio anti-cinoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) eBMPE0-DM1; 10 9. tio anti-cinoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE através da conjugação de A118C tio anti-cinoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) e MC-val-cit-PAB-MMAE; 10. tio MA79b-HC(A118C)-MC-MMAF através da conjugação de tio MA79b-HC(A118C) e MC-MMAF; e 15 11. tio MA79b-LC(V205C)-MC-MMAF através da conjugação de tio MA79b-LC(V205C) e MC-MMAF.
EXEMPLO 7: CARACTERIZAÇÃO DE AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE CONJUGADOS DE TIOMAB ENGENHEIRADO COM CISTEÍNA -FÁRMACO A ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE CELULAR
A afinidade de ligação de tio huMA79b.v18, conjugados de tio huMA79b.v28-fármaco e conjugados de tio MA79b-fármaco a CD79b expresso em células BJAB-luciferase foi determinada através de análise FACS. Ainda, a afinidade de ligação de conjugados de anti-cinoCD79b(ch10D10)-fármaco a CD79b expresso em células BJAB expressando cinoCD79b foi determinada 25 através de análise FACS.
Em suma, aproximadamente 1x106 células em 100 μl foram contatadas com quantidades variáveis (1,0 μg, 0,1 μg ou 0,01 μg de Ab por milhões de célula de células BJAB-luciferase ou células BJAB expressando cinoCD79b (para tioMAbs anti-cinoCD79b)) de um dos conjugados de anti- CD79b tioMAb-fármaco que seguem ou nus (Ab não-conjugado como um controle): (1) tio MA79b-LC(V205C)-MC-MMAF ou (2) tio MA79b- HC(A118C)-MC-MMAF (Figuras 29A-B, respectivamente); (3) tio 5 huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF, (4) tio huMA79b.v18-HC(A118C)- MC-vcPAB-MMAE ou (5) tio huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1 (Figures 30B-D, respectivamente); (6) tio huMA79b.v28-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE, (7) tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 ou (8) tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF (vide Figuras 31B-31D, 10 respectivamente); ou (9) tio anti-cinoCDb79(ch10D10)-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE, (10) tio anti-cinoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO- DM1 ou (11) tio anti-cinoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF (vide Figuras 32B-32D, respectivamente). Ig anti-humana de camundongo conjugada a PE foi usada como o anticorpo de detecção secundário (No. 15 Cat. BD 555787).
Anticorpo anti-CD79b ligado à superfície celular foi detectado usando Ig anti-humana de camundongo conjugada a PE. Os gráficos das Figuras 29-32 indicam que ligação de antígeno era aproximadamente a mesma para todos os conjugados de tioMAb-fármaco testados.
EXEMPLO 8: ENSAIO QUANTO À REDUÇÃO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO PELOS CONJUGADOS TIOMAB ANTI-CD79B-FÁRMACO
A potência in vitro de conjugados TioMAb anti-CD79b-fármaco (incluindo tio huMA79b.v18-HC(A118C)-MCMMAF, tio huMA79b.v28- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e tio huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO- 25 DM1) foi medida através de um ensaio de proliferação celular (Figura 41 A, BJAB-luciferase; Figura 41B, Granta-519; Figura 41C, WSU-DLCL2). O CelITiter-GIo® Luminescent Cell Viability Assay é um método de ensaio homogêneo comercialmente disponível (Promega Corp., Madison, Wl) baseado na expressão recombinante de Coleoptera luciferase (US 5583024; US 5674713; US 5700670). O ensaio de proliferação celular determina o número de células viáveis em cultura com base na quantificação da ATP presente, um indicador de células metabolicamente 5 ativas Crouch e outros, J. Immunol. Metho., 160: 81-88 (1993); US 6602677). O CelITiter-Glo® Assay foi conduzido em formato de 96 cavidades, tornando-o condescendente à avaliação de alto rendimento automática (HTS) (Cree e outros, AntiCancer Drugs, 6:398-404 (1995)). O procedimento de ensaio homogêneo envolve adição de um reagente único 10 (O CelITiter-Glo® Reagent) diretamente a células culturadas em meio suplementado com soro.
O formato "adicionar-misturar-medir" homogêneo resulta em lise celular e geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. O substrato, Luciferina de Besouro, é oxidativamente 15 descarboxilado através de luciferase de vaga-lume recombinante com conversão concomitante de ATP em AMP e geração de fótons. Células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativa (RLU). Os dados podem ser registrados por um luminômetro ou dispositivo de imagem de câmera CCD. O resultado luminescente é apresentado como 20 RLU, medido com o tempo. %RLU é porcentagem RLU normalizada comparado com um controle "não conjugado a fármaco". Alternativamente, fótons de luminescência podem ser contados em um contador de cintilação na presença de um cintilante. As unidades de luz podem ser representadas então como CPS (contagens por segundo).
A eficácia de conjugados tioMAb-fármaco foi medida através de um ensaio de proliferação celular empregando o protocolo que segue, adaptado do CellTiter Gio Luminescent Cell Viability Assay, Promega Corp. Technical bulletin TB288; Mendoza e outros, Cancer Res., 62: 5485-5488 r (2002)):
Uma alíquota de 40 μl de cultura cellular contendo cerca de 3000 células BJAB, Granta-519 ou WSU-DLCL2 em meio foi depositada em cada cavidade de uma placa de parede opaca, de 384 cavidades. 5 TDC (Conjugado de TioMab-Fármaco) (TioMab Drug Conjugate) (10 μm) foi adicionado a cavidades experimentais em quadruplicata para a concentração final de 10000, 3333, 1111, 370, 123, 41, 13,7, 4,6 ou 1,5 ng/mL, com cavidades controle de "conjugado não-fármaco" recebendo meio sozinho, e incubado por 3 dias. 10 As placas foram equilibradas em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. CelITiter-Glo Reagent (50 μl) foi adicionado.
Os teores foram misturados por 2 minutos em um agitador orbital para induzir lise celular.
A placa foi incubada em temperatura ambiente por 10 minutos para estabilizar o sinal luminescente. Luminescência foi registrada e relatada em gráficos como %RLU (unidades de luminescência relativa). Dados de células incubadas com meio livre de conjugado de 20 fármaco foram postos em gráfico a 0,51 ng/ml. Meio: células BJAB, Granta-519 e WSU-DLCL2 crescem em RPMI1640/FBS10%/glutamina 2 mM.
EXEMPLO 9: ENSAIO QUANTO À INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO DE TUMOR IN VIVO POR CONJUGADOS DE TIOMAB ANTI-CD79B -FÁRMACO A. GRANTA-519 (LINFOMA DE CÉLULA DO MANTO HUMANA)
Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto que o descrito no Exemplo 3 (vide acima), variação dos conjugados de fármaco e doses administradas, a eficácia de conjugados de tioMab-fármaco em xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Célula do Manto Humana) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de fármaco e doses (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na Tabela 11, abaixo.
O Ab controle era hu-anti-HER2-MC-MMAF or MA79b-MC- MMAF. O tioMAb HC(A118C) controle era tioMAb hu-anti-HER2- HC(A118C)-MMAF. Os resultados são mostrados na Tabela 11 e na Figura 33.
A figura 33A é um gráfico ilustrando as mudanças em volume de tumor médio com o tempo no xenoenxerto de Granta-519 em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs anti-CD79b A118C de cadeia pesada ou V205C de cadeia leve, nas doses mostradas na Tabela 11. Especificamente, administração de tio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF e tio chMA79b- LC(V205C)-MC-MMAF mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado com controles negativos (anti-hu-HER2-MC-MMAF e tio-hu-anti- HER2-HC(A118C)-MC-MMAF.
Ainda, no mesmo estudo, a mudança de peso corporal percentual nos primeiros 14 dias foi determinada em cada grupo de dose. Os resultados (Figura 33B) indicaram que administração desses conjugados tioMAb-fármaco não resultou em uma diminuição significante em porcentagem de peso do corpo ou perda de peso durante este tempo.
Ainda, na Tabela 11, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume de tumor em qualquer momento após administração caiu para menos de 50% do volume de tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado e NA = não-aplicável. (DAR = Razão de Fármaco para Anticorpo) (Drug to Antibody Ratio).
ABELA 11: REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO TIO CHMA79B-HC(A1 18C) ou TIO CHMA79B - LC(V205C) MMAF EM XENOENXERTOS DE GRANTA-519 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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B. XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE (LINFOMA DE BURKITT)
Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto que o descrito no Exemplo 3 (acima), variando os conjugados de fármaco e doses administrados, a eficácia de conjugados de fármaco adicionais foi testada em xenoenxertos de BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) em camundongos SCID CB17. Os conjugados e doses de fármaco (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na Tabela 12, abaixo.
O anticorpo controle era huMA79b.v28 (conjugado a SMCC-DM1).
O tioMAb HC (A118C) controle era tioMAb anticorpo tio hu-anti-HER2- HC(A118C) (conjugado a MBPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE), tioMAb tio huMA79b.v28-HC(A118C) ou tioMAb hu-anti-CD22(10F4v3)- HC(A118C) (conjugado a MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 10 12 e Figura 34, abaixo.
A figura 34A é um gráfico ilustrando mudanças em volume de tumor médio com o tempo nos xenoenxertos de BJAB-luciferase em camundongos SCID CB17 tratados com conjugados de huMA79b.v28- HC(A118C)tioMAb conforme mostrado na Tabela 12. Especificamente, 15 administração dos conjugados de fármaco tioMAb tio huMA79b.v28- HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF e tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE mostrou uma inibição em crescimento de tumor quando comparado com os conjugados anticorpo- fármaco controle negativo (tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio- 20 hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e tio-hu-antí-HER2-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE). Outros controles eram tio-huMA79b.v28-HC(A118C), huMA79b.v28-SMCC-DM1 e tio-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC- MMAF.
Ainda, no mesmo estudo, a mudança de peso do corpo percentual 25 nos primeiros 7 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (Figura 34B) indicaram que administração desses conjugados de tioMAb-fármaco não causaram uma diminuição significante em peso do corpo percentual ou perda de peso durante este tempo.
Ainda, na Tabela 12, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para menos de 50% do volume do tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume 5 do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado e NA = não-aplicável. (DAR = Razão de Fármaco para Anticorpo). TABELA 12: REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO ADMINISTRAÇÃO DE CONJUGADO TIO HUMA79B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAF E DM1 EM XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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C. XENOENXERTOS DE WSU-DCLC2 (LINFOMA DE CÉLULA GRANDE DIFUSO)
Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto descrito no Exemplo 3 (vide acima), variando os conjugados de fármaco e doses administrados, a eficácia de conjugados de tioMAb-fármaco 5 em xenoenxertos de linfoma folicular WSU-DLCL2 (Linfoma de Célula Grande Difuso) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de fármaco e doses são mostrados na Tabela 13, abaixo.
O anticorpo controle era huMA79b.v28 (conjugado a SMCC-DM1). o tioMAb HC(A118C) controle era anticorpo tioMAb tio hu-anti-HER2- 10 HC(A118C) (conjugado a BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE), tioMAb tio huMA79b.v28-HC(A118C) ou tioMAb tio anti-CD22 10F4v3- HC(A118C) (conjugado a MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 13, abaixo. A figura 35A é um gráfico ilustrando mudanças em volume de tumor médio com o tempo no xenoenxerto de WSU-DLCL2 (Linfoma de Célula 5 grande Difuso) em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs anti-CD79b A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na Tabela 13. Especificamente, administração de huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio huMA79b.v28- HC(A118C)-MC-MMAF e tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 10 mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado com os controles negativos (tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-hu-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF, tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, tio- huMA79b.v28-HC(A118C)). Outros controles incluíam tio-huMA79b.v28- HC(A118C), huMA79b.v28-SMCC-DM1 e tio hu-anti-CD22(10F4v3)- 15 HC(A118C)-MC-MMAF. O TDC de tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAEparecia ser o mais eficaz dos agentes testados neste estudo. Ainda, no mesmo estudo, a mudança de peso do corpo percentual nos primeiros 7 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os 20 resultados (Figura 35B) indicaram que administração desses conjugados de tioMAb-fármaco não causou uma diminuição significante em peso do corpo percentual ou perda de peso durante este tempo. Ainda, na Tabela 13, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume do tumor em 25 qualquer momento após administração caiu para menos de 50% do volume de tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado e NA = não-aplicável. (DAR = Razão de Fármaco para Anticorpo). TABELA 13: REDUÇÃO DE VOLUME DE TUMOR IN VIVO ADMINISTRAÇÃO DE CONJUGADO TIO HUMA79B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAF E DM1 EM XENOENXERTOS DE WSU-DLCL2 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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D. XENOENXERTOS DE DOHH2 (LINFOMA FOLICULAR)
Em um estudo similar, usando os mesmos protocolos de estudo de xenoenxerto que descrito no Exemplo 3 (vide acima), variando os conjugados de fármaco e doses administrados, a habilidade dos conjugados de tioMAb-fármaco em reduzir volume de tumor de célula B em modelos de xenoenxerto de DOHH2 em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de fármaco e doses (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na Tabela 14, abaixo.
O Ab controle era huMA79b.v28 (conjugado a SMCC-DM1). O tioMAb HC(A118C) controle era tioMAb tio hu-anti-HER2-HC(A118C) (conjugado a BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE), tioMab tio huMA79b.v28-HC(A118C) e tio hu-anti-CD22-HC(A118C) (conjugado a MC- MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 14 e na Figura 36.
A figura 36A é um gráfico ilustrando mudanças em volume de tumor médio com o tempo no xenoenxerto de célula de DOHH2 em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs A118C de cadeia pesada, nas doses conforme mostrado na Tabela 14. Especificamente, administração dos conjugados tioMAb-fármaco tio huMA79b.v28-HC-(A118C)-BMPEO-DM1, tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF e tio huMA79b.v28-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE nas doses mostradas na Tabela 14 mostrou uma inibição em crescimento de tumor quando comparado com os conjugados de fármaco- controle negativos (Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1 controle, Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF controle, Tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-IVII\/IAE controle. Outros controles incluíam Tio 5 huMA79b.v28-HC(A118C) controle, Tio anti-CD22-HC(A118C)-MC-MMAF controle e Tio huMA79b.v28-HC(A118C) controle e huMA79b.v28-SMCC- DM1 controle. Ainda, na Tabela 14, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume do tumor em 10 qualquer momento após administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado e NA = não-aplicável. (DAR = Razão de Fármaco para Anticorpo). TABELA 14: REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO 15 ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO TIO HUMA79B.V28-HC(A118C) DM1, MMAF E MMAE EM XENOENXERTOS DE DOHH2 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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E. XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE (LINFOMA DE BURKITT)
Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto que o descrito no Exemplo 3, variação dos conjugados anticorpo- fármaco e doses de administrados, a eficácia de conjugados de fármaco em 5 xenoenxertos de BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados e doses de fármaco (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na Tabela 15, abaixo.
O anticorpo controle era veículo (tampão (para ADC) sozinho). O tioMAb HC (A118C) controle era anticorpo tioMAb tio hu-anti-HER2-HC(A118C) 10 (conjugado a BMPEO-DM1, MCvcPAB-MMAE ou MC-MMAF), tioMAb tio huMA79b.v28-HC(A118C) ou tioMAb tio anti-CD22 10F4v3-HC(A118C) (conjugado a MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 15, abaixo.
A figura 37A é um gráfico ilustrando mudanças em volume de 5 tumor médio com o tempo no xenoenxerto de BJAB-luciferase em camundongos SCID CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b A118C de cadeia pesada, em doses conforme mostrado na Tabela 15. Especificamente, administração de huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO- DM1, tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e tio huMA79b.v28- 10 HC(A118C)-MC-MMAF mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado com os controles negativos (tío-anti-HER2-HC(A118C)- BMPEO-DM1, tio-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, tio-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF). Outros controles incluíam tio huMA79b.v28- HC(A118C) e tio-10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF. 15 Ainda, na Tabela 15, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu abaixo de 50% do volume de tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) é indicado e NA = 20 não-aplicável. (DAR = Razão de Fármaco para Anticorpo). TABELA 15: REDUÇÃO DE VOLUME DE TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DE CONJUGADO TIO HUMA79B.V28-HC(A1 18C) MMAE, MMAF E DM1 EM XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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F. XENOENXERTOS DE GRANTA-519 (LINFOMA DE CÉLULA DO MANTO HUMANA)
Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto que o descrito no Exemplo 3 (vide acima), variação dos conjugados de fármaco e doses administrados, a eficácia de conjugados de 5 tioMAb-fármaco em xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Célula do Manto Humana) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados e doses de fármaco (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na Tabela 16, abaixo.
O tioMAb HC(A118C) controle era tioMAb hu-anti-HER2- 10 HC(A118C) (conjugado a BMPEO-DM1 ou MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 16 e na Figura 38.
A figura 38A é um gráfico ilustrando mudanças em volume de tumor médio com o tempo no xenoenxerto de Granta-519 em camundongos SCID CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b A118C, nas doses conforme 15 mostrado na Tabela 16. Especificamente, a administração dos conjugados de tio huMA79b.v28-HC-(A118C)-BMPEO-DM1 e tio huMA79b.v28-HC(A118C)- MC-MMAF tioMAb nas doses mostradas na Tabela 6 mostrou uma inibição em crescimento de tumor quando comparado com os conjugados de fármaco controle. 20 Ainda, no mesmo estudo, a mudança de peso corporal percentual nos primeiros 14 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (Figura 38B) indicaram que a administração desses conjugados de tioMAb fármaco não resultou em uma diminuição no peso corporal percentual ou causou perda de peso durante este tempo.
Na Tabela 16, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume de tumor em qualquer momento após administração caiu abaixo de 50% do volume de tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado. TABELA 16: REDUÇÃO DO VOLUME DE TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DE CONJUGADO TIO HUMA79B.V28-HC(A1 18C) DM1 E MMAF EM XENOENXERTOS DE GRANTA-519 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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G. XENOENXERTOS DE WSU-DLCL2 (LINFOMA DE CÉLULA GRANDE DIFUSO)
Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto que o descrito no Exemplo 3 (vide acima), variando os conjugados de fármaco e doses administrados, a eficácia de conjugados de tioMAb- 5 fármaco em xenoenxertos de WSU-DLCL2 (Linfoma de Célula Grande Difuso) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de fármaco e doses (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controle) são mostrados na Tabela 17, abaixo.
O anticorpo controle era veículo (tampão (para ADC) sozinho). Os 10 tio MAbs controle eram tioMAbs de anticorpo tio hu-anti-HER2-HC(A118C) (conjugados a BMPEO-DM1, MCvcPAB-MMAE or MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 17 e na Figura 39.
A figura 39 é um gráfico ilustrando mudanças em volume de tumor médio com o tempo no xenoenxerto de WSU-DLCL2 em camundongos SCID 15 CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na Tabela 17. Especificamente, administração de huMA79b.v28- HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF e tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE (em dose de Ab de 0,5, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg e 4,0 mg/kg) mostrou inibição do crescimento do tumor 20 quando comparado com os controles negativos (tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)- BMPEO-DM1, tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, tio-hu-anti- HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e veículo A). Ainda, na Tabela 17, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume de tumor em qualquer momento após administração caiu abaixo de 50% do volume de tumor 5 medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado e NA = não-aplicável. (DAR = Razão de Fármaco para Anticorpo). TABELA 17: REDUÇÁO DE VOLUME DE TUMOR//VV/VO, 10 ADMINISTRAÇÃO DE CONJUGADO TIO HUMA79B.V28-HC(A1 18C) MMAE, MMAF E DM1 EM XENOENXERTOS DE WSU-DLCL2 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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H. XENOENXERTOS DE GRANTA-519 (LINFOMA DE CÉLULA DO MANTO HUMANA)
Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme descrito no Exemplo 3 (vide acima), variando os conjugados de fármaco e doses administrados, a eficácia de conjugados de 5 tioMAb-fármaco em xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Célula do Manto Humana) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados e doses de fármaco administrados (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na Tabela 18, abaixo.
Os tio MAbs controle eram tio hu-anti-HER2-HC(A118C) 10 (conjugado a BMPEO-DM1) e tioMAbs de anticorpo tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE. Os resultados são mostrados na Tabela 18, abaixo. A figura 40a é um gráfico ilustrando mudanças em volume de tumor médio com o tempo no xenoenxerto de Granta-519 em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs anti-CD79b A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na Tabela 18. Especificamente, administração de tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 e tio huMA79b.v28-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE (em Ab na dose de 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg e 4,0 mg/kg) mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado com os controles negativos (tio-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1 e tio-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE. Ainda, na Tabela 18, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume de tumor em qualquer momento após administração caiu abaixo de 50% do volume de tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado e NA = não-aplicável. (DAR = Razão de Fármaco para Anticorpo). TABELA 18: REDUÇÃO DE VOLUME DE TUMOR IN VIVO ADMINISTRAÇÃO DE CONJUGADO TIO HUMA79B.V28-HC(A1 18C) DM1 EMMAE EM XENOENXERTOS DE GRANTA-519 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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I. XENOENXERTOS DE BJAB-CINOCD79B
Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto que o descrito no Exemplo 3 (vide acima), variando os conjugados de fármaco e doses administrados, a eficácia de conjugados tioMAb-fármaco em células BJAB (Linfoma de Burkitti) expressando xenoenxertos de cinoCD79b (BJAB-cinoCD79b) em SCID CB17 foi estudada. Os conjugados e doses de fármaco (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na Tabela 18, abaixo.
O Ab controle era veículo (tampão sozinho). Os tio MAbs controle eram tioMAbs de anticorpo tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-hu- anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE. Os resultados são mostrados na Tabela 19 e na Figura 50.
A figura 50 é um gráfico ilustrando a inibição de crescimento de tumor com o tempo no xenoenxerto de BJAB-cinoCD79b em camundongos SCID CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na Tabela 19. Especificamente, administração de tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e tio huMA79b.v28- HC(A118C)-MC-MMAF bem como tio-anti-cinoCD79b(ch10D10)- HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-anti-cinoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE e tio-anti-cinoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF mostraram inibição de crescimento de tumor quando comparado com controles negativos (tio-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-anti- HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e tio-anti-HER2-HC(A118C)-MC- MMAF e veículo A).
Ainda, na Tabela 19, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume de tumor em qualquer momento após administração caiu abaixo de 50% do volume de tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após administração caiu para 0 mm3) é indicado e NA = não-aplicável. (DAR = Razão de Fármaco para Anticorpo). TABELA 19: REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO TIO ANTI-CINO CD79B(CH10D10)-HC(A118C) DM1, MMAF ou MMAE ou Tio HUMA79B.V28 DM1, MMAF ou MMAE EM XENOENXERTOS DE BJAB-CYNOCD79B EM CAMUNDONGOS SCUD CB17
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J. XENOENXERTOS DE BJAB-CYNOCD79B
Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme descrito no Exemplo 3 (vide acima), variando os conjugados e dose de fármaco administrados, a eficácia de conjugados 5 tioMAb-fármaco em BJAB (Linfoma de Burkitti) expressando xenoenxerto de cinoCD79 (BJAB cinoCD79b) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados e as doses de fármaco (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na Tabela 19, abaixo.
O tio MAbs controle era tioMAbs de anticorpo tio-hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-huMA79b.v28-HC(A118C) e tio-anti- cinoCD79b(ch10D10)-HC(A118C). Os resultados são mostrados na Tabela 20 e na Figura 51.
A figura 51 é um gráfico ilustrando inibição de crescimento de tumor com o tempo no xenoenxerto de BJAB-cynoCD79b em camundongos 15 CB17 SCID tratados com os TDCs anti-CD79b A118C de cadeia pesada nas doses mostradas na Tabela 20. Especificamente, administração de tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 bem como tio-anti- cinoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado com os controles negativos (tio-anti- HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1. Outros controles incluíam tio-hu-MA79b.v28- HC(A118C)e tio-anti-cinoCD79b(ch10D10)-HC(A118C).
Os resultados são mostrados na Tabela 20 abaixo. Na Tabela 20, o número de camundongos do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (em que o volume de tumor em qualquer momento após administração caiu abaixo de 50% do volume de tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (em que o volume do tumor em qualquer momento após 10 administração caiu para 0 mm3) é indicado e NA = não-aplicável. (DAR = Razão de Fármaco para Anticorpo). TABELA 20: REDUÇÃO DE VOLUME DE TUMOR IN VIVO ADMINISTRAÇÃO DE CONJUGADO TIO ANTI-CINO CD79B(CH10D10)-HC(A118C) DM1 ou Tio HUMA79B.V28-HC(A118C) DM1 EM XENOENXERTOS DE BJAB- CYNOCD79B EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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Figure img0110
O relatório escrito acima é considerado ser suficiente para permitir que um versado na técnica pratique a invenção. A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelo construto depositado, uma vez que a modalidade depositada é pretendida apenas como uma ilustração simples de certos 5 aspectos da invenção e quaisquer construtos que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção. O depósito do presente material não constitui uma admissão que o relatório aqui contido seja inadequado para permitir a prática de qualquer aspecto da invenção, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser considerado como limitante do escopo das reivindicações às ilustrações específicas que ele representa. Na verdade, várias modificações da invenção em adição àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes àqueles versados na técnica do relatório acima e vão se encaixar no escopo das reivindicações apensas.

Claims (31)

1. ANTICORPO ANTI-CD79b QUIMÉRICO engenheirado com cisteína, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais aminoácidos de cisteína livre e uma sequência selecionada entre:
Figure img0111
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos de cisteína livre estão localizados na cadeia pesada.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma ou mais 10 sequências selecionadas entre:
Figure img0112
4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos de cisteína livre estão localizados na cadeia leve.
5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma ou mais sequências selecionadas entre:
Figure img0113
6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, 5 caracterizado pelo fato de que o anticorpo é preparado pelo processo que compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo anti-CD79b parental por cisteína e em que o anticorpo parental compreende uma sequência de cadeia pesada selecionada entre: SEQ ID NOS: 308, 304, 306 e 310 e/ou uma sequência de cadeia leve selecionada 10 entre: SEQ ID NOS: 307, 303, 305 e 309.
7. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é covalentemente ligado a porção de fármaco auristatina, em que o conjugado anticorpo-fármaco é formado.
8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína (Ab), e uma porção de fármaco de auristatina (D), em que o anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína é ligado através de um ou mais aminoácidos de cisteína livre por uma porção ligante (L) a D; o composto tendo a fórmula I: Ab-(L-D)p I em que p é 1, 3, 4, ou preferencialmente 2.
9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que L tem a fórmula: -Aa—Ww—Yy— onde: A é uma unidade de estiramento covalentemente ligada a uma cisteína tiol do anticorpo engenheirado com cisteína (Ab); a é 0 ou 1; cada W é independentemente uma unidade de aminoácido; w é um número inteiro que varia de 0 a 12; Y é uma unidade de Espaçador covalentemente ligada à porção de fármaco; e y é 0, 1 ou 2.
10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o conjugado anticorpo-fármaco tem a fórmula:
Figure img0114
onde PAB é para-aminobenzilcarbamoíla, e R17 é um radical divalente selecionado de (CH2)r, C3-C8 carbociclila, O-(CH2)r, arileno, (CH2)r- arileno, -arileno-(CH2)r-, (CH2)r-(C3-C8 carbociclila), (C3-C8 carbociclil)-(CH2)r, C3-C8 heterociclila, (CH2)r-(C3-C8 heterociclila), -(C3-C8 heterociclil)-(CH2)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-, -(CH2CH2O)T-, -(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, e - (CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-; onde Rb é H, Ci-C6 alquila, fenila, ou benzila; e r é independentemente um número inteiro que varia de 1 a 10.
11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de Wwé valina-citrulina.
12. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que tem a fórmula:
Figure img0115
13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que R17 é (CH2)5 ou (CH2)2.
14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que tem a fórmula:
Figure img0116
15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que L é SMCC, SPP, SPDB ou BMPEO.
16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que D é tanto MMAE, preferencialmente tendo a estrutura:
Figure img0117
em que a linha ondulada indica o sítio de ligação ao ligante L, ou
Figure img0118
em que a linha ondulada indica o sítio de ligação ao ligante L.
17. COMPOSTO CONJUGADO de anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que é selecionado das estruturas: Ab-MC-vc-PAB-MMAF
Figure img0119
em que Vai é valína; Cit é citrulina; p é 1, 2, 3 ou 4; Ab-MC-vc-PAB-MMAE
Figure img0120
em que Vai é valina; Cit é citrulina; p é 1, 2, 3 ou 4; Ab-MC-MMAE
Figure img0121
em que Vai é valina; Cit é citrulina; p é 1, 2, 3 ou 4; ou Ab-MC-MMAF
Figure img0122
em que Vai é valína; Cit é citrulina; p é 1, 2, 3 ou 4.
18. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6 ou composto conjugado de acordo com uma das reivindicações 7 a 17, caracterizado pelo fato de que anticorpo anti-CD79b parental é selecionado a partir de um anticorpo monoclonal, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado e um fragmento de anticorpo, preferencialmente um fragmento Fab.
19. COMPOSTO CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é preparado pelo processo que compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo anti-CD79b parental por cisteína, em que o anticorpo parental compreende: 10 i) SEQ ID NO:307 e/ou SEQ ID NQ:308; ii) SEQ ID NO:303 e/ou SEQ ID NO:304; iii) SEQ ID NQ:305 e/ou SEQ ID NQ:306; ou iv) SEQ ID NQ:309 e/ou SEQ ID NO:310.
20. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína quimérica conforme descrito na reivindicação 1 ou o composto conjugado de anticorpo-fármaco conforme descrito na reivindicação 7 e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis, e opcionalmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterapêutico.
21. MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE PROTEÍNA CD79b em uma amostra suspeita de conter a dita proteína, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende expor a dita amostra a um anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína conforme descrito na reivindicação 1 e determinar a ligação do dito anticorpo à dita proteína CD79b 25 na dita amostra, em que a ligação do anticorpo à dita proteína é indicativa da presença da dita proteína na dita amostra.
22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é covalentemente ligado a uma marcação selecionada de uma tintura fluorescente, um radioisótopo, biotina ou um ligante de complexação de metal; ou em que a dita amostra compreende célula suspeita de expressar a dita proteína CD79b, ou em que a dita célula é uma célula de câncer hematopoiético.
23. ENSAIO PARA DETECTAR CÉLULAS DE CÂNCER, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) expor as células a um composto de conjugado de anticorpo- fármaco conforme descrito na reivindicação 7; e (b) determinar a extensão da ligação do composto de conjugado de anticorpo-fármaco às células; em que preferencialmente as células são células de tumor hematopoiético.
24. MÉTODO PARA INIBIR PROLIFERAÇÃO CELULAR, caracterizado pelo fato de que compreende tratar células de tumor mamíferas em um meio de cultura de célula com um composto de conjugado de anticorpo- fármaco conforme descrito na reivindicação 7, em que a proliferação das células de tumor é inibida, em que as células de tumor mamíferas são preferencialmente células de tumor hematopoiético.
25. USO DE UM ANTICORPO, conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar câncer, em que preferencialmente o câncer é selecionado do grupo que consiste em linfoma, mieloma e leucemia.
26. USO DE UM COMPOSTO CONJUGADO, conforme descrito em uma das reivindicações de 7 a 19, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar câncer, em que preferencialmente o câncer é selecionado do grupo que consiste em linfoma, mieloma e leucemia.
27. USO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o medicamento ainda compreende um agente quimioterapêutico.
28. USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA conforme descrita na reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar câncer, em que preferencialmente o câncer é selecionado do grupo que consiste em linfoma, mieloma e leucemia.
29. MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UM COMPOSTO CONJUGADO anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CD79b engenheirado com cisteína (Ab) conforme descrito na reivindicaçãol, e uma porção de fármaco de auristatina (D), em que o anticorpo engenheirado com cisteína é ligado através de um ou mais aminoácidos de cisteína livre por uma porção de ligante (L) a D; o composto tendo a fórmula I: Ab-(L-D)p I em que p é 1,2, 3, ou 4; o método compreendendo as etapas de: (a) reagir um grupo cisteína engenheirado do anticorpo engenheirado com cisteína com um reagente ligante para formar o intermediário de anticorpo-ligante Ab-L; e (b) reagir Ab-L com uma porção de fármaco ativada D; por meio do qual o conjugado de anticorpo-fármaco é formado; ou compreendendo as etapas de: (c) reagir um grupo nucleofílico de uma porção de fármaco com um reagente ligante para formar o intermediário de fármaco-ligante D-L; e (d) reagir D-L com um grupo cisteína engenheirado do anticorpo engenheirado com cisteína; por meio do qual o conjugado de anticorpo- fármaco é formado; em que o método opcionalmente compreende a etapa de expressar o anticorpo engenheirado com cisteína em células de ovário de hamster chinês (CHO).
30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de tratar o anticorpo engenheirado com cisteína expresso com um agente redutor, em que o agente redutor é preferencialmente selecionado entre TCEP e DTT.
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado 5 pelo fato de que ainda compreende a etapa de tratar o anticorpo engenheirado com cisteína expresso com um agente oxidante, após tratar com o agente redutor, em que o agente oxidante é preferencialmente selecionado de sulfato de cobre, ácido deidroascórbico e ar.
BRPI0906435A 2008-01-31 2009-01-14 Anticorpo anti-cd79b quimérico, composto conjugado, formulação farmacêutica, método para determinar a presença da proteína cd79b, ensaio para detectar células de câncer, método para inibir proliferação celular, usos de um anticorpo, de um composto conjugado e de uma formulação farmacêutica, e método para a fabricação de um composto conjugado BRPI0906435B8 (pt)

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