BRPI0618577A2 - usos de rituximab - Google Patents

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BRPI0618577A2
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patients
antibodies
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BRPI0618577-0A
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Mark Totoritis
Timothy Mark Shaw
Sunil Agarwal
David Yocum
Ariella Kelman
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Biogen Idec Inc
Genentech Inc
Hoffmann La Roche
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Abstract

USOS DE RITUXIMAB. A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de lesão articular em um indivíduo elegível para tratamento, que envolvem a administração de um antagonista que se liga a um marcador de superfície das células B, tais como o anticorpo CD2O, ao indivíduo, em uma quantidade eficaz para tornar mais lenta a progressão da lesão articular, como medida por radiografia. São ainda fornecidos artigos manufaturados úteis para tais métodos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USOS DE RITUXIMAB".
Campo da invenção
A presente invenção refere-se aos métodos para o tratamento de lesão articular em indivíduos por ela acometidos. Antecedentes da Invenção Destruição e lesões articulares
A artrite inflamatória é uma manifestação clínica importante em vários distúrbios autoimunes, incluindo artrite reumatoide (RA), artrite psoriá- tica (PsA), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), síndrome de Sjõgren e polimi- osite. A maioria desses pacientes desenvolve deformidades articulares no exame físico, mas tipicamente apenas os pacientes com RA e PsA manifes- tam erosões ósseas nos exames de imagem.
A RA é uma doença inflamatória crônica que afeta aproximada- mente 0,5 a 1% da população adulta no norte da Europa e na América do Norte, e uma proporção ligeiramente menor nas outras partes do mundo. Alamonosa e Drosos, Autoimmun. Rev., 4: 130-136 (2005). Ela é uma doen- ça inflamatória sistêmica caracterizada por inflamação crônica na membrana sinovial das articulações afetadas que, ao final, leva à perda das funções cotidianas em conseqüência de dor e fadiga crônicas. A maioria dos pacien- tes também apresenta deterioração progressiva da cartilagem e óssea nas articulações afetadas, o que pode, eventualmente, levar a uma incapacidade permanente. O prognóstico de longo prazo da RA é ruim, com aproximada- mente 50% dos pacientes apresentando incapacidade funcional significativa em até 10 anos após o momento do diagnóstico. Keystone1 Rheumatology, 44 (Supl. 2): ii8-ii12 (2005). A expectativa de vida é reduzida em média 3-10 anos. Alamanos e Rosos, supra. Os pacientes com uma titulação mais ele- vada de fator reumatoide (RF) (aproximadamente 80% dos pacientes) pos- suem uma doença mais agressiva (Bukhari et ai, Arthritis Rheum. 46: 906- 912 (2002)), com um pior resultado final de longo prazo e uma mortalidade aumentada em relação aos que são RF-negativos (Heliovaara et al., Ann. Rheum. Dis. 54: 811-814 (1995)). A patogênese de doenças ósseas inflamatórias crônicas, como a RA, ainda não-está totalmente elucidada. Essas doenças são acompanhadas por perda óssea em torno das articulações afetadas em função do aumento da reabsorção osteoclástica. Esse processo é mediado, em grande parte, por aumento da produção local de citocinas pró-inflamatórias. Teitelbaum Science, 289:1.504-1.508 (2000); Goldring e Gravallese Arthritis Res. 2(1): 33-37 (2000). Essas citocinas podem atuar diretamente sobre as células na linhagem de os- teoclastos ou indiretamente ao afetar a produção do fator de diferenciação de osteoclastos essencial, ativador do receptor do Iigante NF<B (RANKL) I e/ou seu receptor de atração solúvel, osteoprotegerína (OPG), por células osteoblás- ticas/estromais. Hossbauer et ai J. Bone Miner. Res. 15(1): 2-12 (2000). O TNF-alfa (fator de necrose tumoral alfa) é um mediador importante da infla- mação, cuja importância na patogênese de várias formas de perda óssea é apoiada por várias linhas de evidências experimentais e clínicas (Feldmann et a/. Ceil 85(3): 307-310 (1996)). No entanto, TNF-alfa não é essencial para a osteoclastogênese (Douni et ai. J. Inflamm. 47: 27-38 (1996)), artrite erosiva (Campbell et ai. J. Clin. invest. 107(12): 1.519-1.527 (2001)), ou osteólise (Childs et ai J. Bon. Min. Res. 16: 338-347 (2001)), à medida que essas podem ocorre na ausência de TNF-alfa.
Especificamente na RA1 acredita-se que uma resposta imune seja iniciada/perpetuada por um ou vários antígenos presentes no comparti- mento sinovial, produzindo um influxo de células inflamatórias agudas e Iin- fócitos para a articulação. Ondas sucessivas de inflamação levam à forma- ção de um tecido invasivo e erosivo denominado pannus. Esse contém sino- viócitos em proliferação semelhantes a fibroblastos e macrófagos que pro- duzem citocinas pró-inflamatórias como, por exemplo, fator de necrose tu- moral-alfa (TNF-alfa) e interleucina-1 (IL-1). A liberação local de enzimas proteolíticas, vários mediadores inflamatórios e a ativação de osteoclastos contribuem com uma boa parte do dano tecidual. Há uma perda de cartila- gem articular e a formação de erosões ósseas. Os tendões circundantes e a bursa podem ser afetados pelo processo inflamatório. Ao final, a integridade da estrutura articular é comprometida, produzindo incapacidade. As contribuições precisas das células B para a imunopatogêne- se da RA não foram completamente caracterizadas. No entanto, há vários mecanismos possíveis através dos quais as células B podem participar no processo da doença (Silverman e Carson, Arthritis Res. Ther., 5 Supl. 4: S1- 6 (2003)).
Historicamente, acreditava-se que as células B contribuíssem para o processo de doença na RA predominantemente servindo como pre- cursores de células produtoras de auto-anticorpos. Foram identificadas vá- rias especificidades de auto-anticorpos, incluindo anticorpos para o Tipo co- lágeno II e proteoglicanos, além de fatores reumatoides. A geração de gran- des quantidades de anticorpos leva à formação de complexo imune e à ati- vação da cascata do complemento. Isso, por sua vez, amplifica a resposta imune e pode culminar na Iise local das células. A síntese de RF e o consu- mo de complemento foram correlacionados à atividade da doença. A pre- sença do próprio RF está associada a uma forma mais severa da RA e à presença de características extra-articulares.
Evidências recentes (Janeway e Katz, J. Immunol., 138: 1.051 (1998); Rivera et ai, Int. Immunol., 13: 1.583-1.593 (2001)) mostram que as células B são células de apresentação de antígeno (APC) altamente eficien- tes. As células B RF-positivas podem ser APCs particularmente potentes, uma vez que sua imunoglobulina de superfície permitiria facilmente a captu- ra de quaisquer complexos imunes, independentemente dos antígenos neles presentes. Muitos antígenos podem ser processados dessa forma para a- presentação às células T. Além disso, foi sugerido recentemente que isso também pode permitir que as células B RF-positivas se autoperpetuem (Ed- wards et ai, Immunology, 97: 188-196 (1999)).
Para a ativação de células T, precisam ser liberados dois sinais para as células: um por meio do receptor de célula T (TCR), que reconhece o peptídeo processado na presença do antígeno do complexo de histocom- patibilidade principal (MHC), e um segundo, através de moléculas coestimu- ladoras. Quando ativadas, as células B expressam moléculas coestimulado- ras em sua superfície e podem, dessa forma, fornecer o segundo sinal para ativação da célula Tea geração de células efetoras.
As células B podem promover sua própria função, além daquela de outras células, pela produção de citocinas (Harris et al., Nat. Immunol., 1: 475-482 (2000)). TNF-alfa e IL-1, linfotoxina-alfa, IL-6 e IL-10 fazem parte de algumas das citocinas que as células B podem produzir na sinóvia da RA.
Embora a ativação da célula T seja considerada um componen- te crucial na patogênese da RA1 um trabalho recente, usando explantes de sinóvia humana em camundongos com distúrbios severos de imunodeficiên- cia combinada (SCID), demonstrou que a ativação da célula Tea retenção dentro da articulação são criticamente dependentes da presença de células B (Takemura et al., J. Immunol., 167: 4.710-4.718 (2001)). O papel preciso das células B nesse fato ainda é incerto, à medida que outras APCs não pa- recem ter o mesmo efeito sobre as células T.
O dano estrutural às articulações é uma conseqüência impor- tante da inflamação sinovial crônica. Entre 60% e 95% dos pacientes com artrite reumatoide (RA) desenvolvem pelo menos uma erosão radiográfica em um intervalo de 3-8 anos do surgimento da doença (Paulus et al., J. Rheumatol., 23: 801-805 (1996); Hulsmans et al., Arthritis Rheum. 43: 1927- 1940 (2000)). Na RA inicial, a correlação entre classificações das lesões ra- diográfícas e capacidade funcional é fraca, mas, após 8 anos de doença, os coeficientes de correlação podem alcançar até 0,68 (Scott et al., Rheumato- logy, 39: 122-132 (2000)). Em 1.007 pacientes com menos de 60 anos de idade que possuíam RA por pelo menos quatro anos, Wolfe et al. (Arthritis Rheum, 43 Supl. 9: S403 (2000)) encontraram uma associação significativa entre a taxa de progressão da classificação das lesões radiográficas de Lar- sen (Larsen et al., Acta Radiol. Diagn. 18: 481-491 (1977)), aumentando o estado de incapacidade pelo seguro social, e diminuindo a renda familiar.
A prevenção ou o retardo das lesões radiográficas é um dos objetos do tratamento da RA (Edmonds et al., Arthritis Rheum. 36: 336-340 (1993)). Testes clínicos controlados de 6 ou 12 meses de duração documen- taram que a progressão das classificações das lesões radiográficas foi mais rápida no grupo de placebo do que nos grupos que receberam metotrexato (MTX) (Sharp et al., Arthritis Rheum. 43: 495-505 (2000)), Ieflunomida (Sharp et ai, supra), sulfasalazina (SSZ) (Sharp et ai, supra), prednisolona (Kirwan et al., N. Engl. J. Med., 333: 142-146 (1995); Wassenburg et ai, Art- hritis Rheum, 42: Supl. 9: S243 (1999)), antagonista do receptor de interleu- cina-1 (Bresnihan et ai, Arthritis Rheum, 41: 2.196-2.204 (1998)) ou uma combinação de infliximab/MTX (Lipsky et ai, N. Eng. J. Med., 343: 1.594- 1.604 (2000)), e que a progressão radiográfica após o tratamento com eta- nercept foi menos rápida do que após o tratamento com MTX (Bathon et ai, N. Engl. J. Med., 343: 1.586-1.593 (2000)). Outros estudos avaliaram a pro- gressão radiográfica em pacientes tratados com corticosteroides ("Joint Committee of the Medicai Research Council and Nuffield Foundation", Ann Rheum. Dis. 19: 331-337 (1960); Van Everdingen et al., Ann. Intem. Med., 136: 1-12 (2002)), ciclosporina A (Pasero et ai, J. Rheumatol., 24: 2.113- 2.118 (1997); Forre, Arthritis Rheum., 37: 1.506-1.512 (1994)), MTX versus azatioprina (Jeurissen et ai, Ann. Intem. Med., 114: 999-1.004 (1991)), MTX versus auranofin (Weinblatt et ai, Arthritis Rheum., 36: 613-619 (1993)), MTX (meta-análise) (Alarcon et ai, J. Rheumatoi, 19: 1.868-1.873 (1992)), hidroxicloroquina (HCQ) versus SSZ (Van der Heijde et ai, Lancet, 1: 1.036- 1.038), SSZ (Hannonen et al., Arthritis Rheum. 36: 1.501-1.509 (1993)), a combinação COBRA ("Combinatietherapei Bij Reumatoide Artritis") de pred- nisolona, MTX e SSZ (Boers et ai, Lancet, 350: 309-318 (1997); Landewe et ai, Arthritis Rheum., 46: 347-356 (2002)), combinações de MTX, SSZ e HCQ (0'Dell et ai, N. Engl. J. Med., 334: 1.287-1.291 (1996); Mottonen et ai, Lancet, 353: 1.568-1.573 (1999)), a combinação de ciclofosfamida, azatio- prina e HCQ (Csuka et al., JAMA, 255: 2.115-2.119 (1986)), e a combinação de adalimumab com MTX (Keystone et al., Arthritis Rheum., 46 Supl. 9:S205 (2002)).
O FDA aprovou recentemente comunicados de que certas me- dicações, por exemplo, leflunomida, etanercept e infliximab, tornam mais ienta a progressão da lesão articular radiográfica. Esses comunicados se baseiam nas diferenças estatisticamente significativas das taxas de progres- são observadas entre grupos de tratamento distribuídos aleatoriamente e grupos de controle. No entanto, as taxas de progressão em indivíduos dentro dos grupos de tratamento e de controle se sobrepõem consideravelmente; portanto, apesar das diferenças significativas entre grupos de tratamento, esses dados não podem ser usados para estimar a probabilidade de que um paciente que esteja começando um tratamento tenha um prognóstico favo- rável com relação à progressão da lesão radiográfica. Foram sugeridos vá- rios métodos para categorizar radiografias pareadas de pacientes individuais como não-progressivas, por exemplo, classificações de lesões de O em am- bos os períodos, sem aumento das classificações de lesões, nenhuma nova articulação com erosões, e uma mudança da classificação que não excede a menor diferença detectável (ou seja, 95% de intervalo de confiança para a diferença entre leituras repetidas da mesma radiografia) (Lassere et al., J. Rheumatol., 26: 731-739 (1999)).
Determinar se houve aumento do dano estrutural em um paci- ente individual durante o intervalo entre radiografias pareadas obtidas no início e no final de um teste clínico de 6 ou 12 meses tem sido difícil, por vá- rias razões. A taxa de lesão radiográfica não é uniforme dentro de uma po- pulação de pacientes com RA; poucos pacientes podem apresentar lesões rapidamente progressivas, mas muitos têm pouca ou nenhuma progressão, especialmente se o intervalo for relativamente curto. Os métodos para classi- ficação da lesão radiográfica, por exemplo, o método de Sharp (Sharp et al., Arthritis Rheum., 14: 706-720 (1971); Sharp et al., Arthritis Rheum., 28: 1.326-1.335 (1985)), de Larsen (Larsen et al., Acta Radiol. Diagn., 18: 481- 491 (1977)), e modificações desses métodos (Van der Heijde, J. Rheumatol., 27: 261-263 (2000)), dependem da avaliação e da interpretação do profis- sional para julgar se a aparente interrupção da placa cortical subcondral é real, ou se uma diminuição da distância entre os córtices em lados opostos de uma articulação é real ou é causada por uma ligeira mudança da posição da articulação em relação ao filme e ao feixe radiográfico, por uma alteração da exposição radiográfica, ou por algum outro fator técnico.
Portanto, a classificação registrada é uma aproximação da ver- dadeira lesão e, para muitos indivíduos, a menor diferença detectável entre classificações repetidas das mesmas radiografias é maior do que a real alte- ração ocorrida durante o intervalo entre as radiografias de base e final. Caso o profissional não saiba a seqüência temporal dos filmes, esses erros inevi- táveis de classificação podem ocorrer em qualquer direção, levando a uma aparente "cicatrização" quando a classificação diminui ou a uma aparente progressão rápida quando o erro de leitura aumenta a diferença entre os filmes. Quando o estudo envolve uma população suficientemente grande de pacientes que foram distribuídos aleatoriamente para receber um tratamento eficaz comparado com placebo, os erros de leitura positivos e negativos se destacam uns dos outros, e podem ser detectadas diferenças pequenas, mas reais, entre os grupos de tratamento.
A imprecisão das medidas clínicas que são usadas para quanti- ficar a atividade da doença da RA causou um problema similar; diferenças estatisticamente significativas entre certas medidas de prognóstico por tes- tes clínicos não foram úteis para estimar a probabilidade de melhora de um indivíduo em início de tratamento (Paulus et ai, Arthritis Rheum., 33: 477- 484 (1990)). A atribuição da melhora individual tornou-se prática com a cria- ção dos critérios compostos para melhora de 20% do "American College of Rheumatology" (ACR) (ACR20), que classifica um paciente como tendo a- presentado melhora caso haja uma melhora de 20% das contagens de sen- sibilidade e edema articular, e 20% de melhora em pelo menos 3 de 5 medi- das adicionais (dor, função física, avaliação da saúde geral pelo paciente, avaliação da saúde geral pelo médico e níveis reagentes da fase aguda) (Felson et al., Arthritis Rheum., 38: 727-735 (1995)). Todas essas medidas têm valores amplos para a menor diferença detectável, mas, ao exigirem uma melhora simultânea em 5 dos 7 aspectos do mesmo processo (ativida- de da doença), a aleatoriedade dos erros das 7 medidas é restringida, e é mais fácil atribuir a real melhora do indivíduo.
Na RA, a lesão articular é uma característica proeminente. Os parâmetros radiológicos de destruição articular são considerados uma medi- da prognostica fundamental nas descrições dos prognósticos da doença. Em um encontro de consenso recente da OMERACT ("Outcome Measures in Rheumatology Clinicai Trials"), a radiologia foi escolhida como parte do con- junto central de medidas prognósticas para estudos observacionais longitu- dinais (Wolfe et al., Arthritis Rheum., 41 Supl. 9: S204 (1998) - resumo). A radiologia também é parte do conjunto central necessário da WHO/ILAR ("World Health Organization/lnternational League of Associations for Rheu- matology") de medidas para testes clínicos de longo prazo (Tugwell e Boers1 J. Rheumatol., 20: 528-530 (1993)).
Os dados disponíveis sobre o prognóstico da lesão radiológica na RA foram obtidos tanto em estudos de curto prazo quanto em estudos de longo prazo. Em estudos de longo prazo de pacientes com RA com doença de início recente, radiografias obtidas a cada 6 meses mostraram que, após uma progressão rápida inicial, houve diminuição da taxa de progressão da lesão radiológica nas mãos e nos pés após 2-3 anos (Van der Heijde et ai, Arthritis Rheum., 35: 26-34 (1992); Fex et ai, Br. J. Rheumatoi, 35: 1.106- 1.055 (1996)). Em estudos de longo prazo com radiografias obtidas menos freqüentemente, constatou-se uma taxa de progressão constante, com dete- rioração contínua da lesão em até 25 anos de duração da doença (Wolfe e Sharp, Arthritis Rheum., 41: 1.571-1.582 (1998); Graudal et al., Arthritis Rheum., 41: 1.470-1.480 (1998); Plant et al., J. Rheumatol., 25: 417-426 (1998); Kaarela e Kautiainen, J. Rheumatoi, 24: 1.285-1.287 (1997)). Ainda não-está claro se essas diferenças no padrão de progressão radiográfica são causadas por diferenças nas técnicas de classificação.
Os sistemas de classificação usados diferem no número de ar- ticulações classificadas, na presença de classificações independentes para erosões (ERO) e estreitamento espaço articular (JSN), na classificação má- xima por articulação e no peso de uma anormalidade radiológica. Dessa forma, não há consenso sobre o método de classificação de preferência. Durante os primeiros 3 anos de acompanhamento em um estudo de coorte de pacientes com artrite inicial, verificou-se que JSN e ERO diferem na sua contribuição para a progressão medida da lesão radiológica das mãos e dos pés (Van der Heijde et ai, Arthritis Rheum., 35: 26-34 (1992)). Além disso, verificou-se que os métodos que classificam independentemente ERO e JSN1 por exemplo, as classificações de Sharp e Kellgren, são mais sensíveis às mudanças na RA inicial do que métodos com o uso de uma medida global como, por exemplo, a classificação de Larsen (Plant et ai, J. Rheumatol., 21: 1.808-1.813 (1994); Cuchacovich et al., Arthritis Rheum., 35: 736-739 (1992)). A classificação de Sharp é um método muito trabalhoso (Van der Heijde, Baillieres Clin. Rheumatol., 10: 435-533 (1996)). Na RA tardia ou destrutiva, constatou-se que os métodos de Sharp e de Larsen fornecem informações similares. No entanto, a sensibilidade às mudanças dos vários métodos de classificação no final da doença ainda não foi investigada, e po- de-se questionar se os métodos de classificação que medem independen- temente ERO e JSN fornecem informações úteis (Pincus et ai, J. Rheuma- tol., 24: 2.106-2.122 (1997)). Veja também Drossaers-Bakker et ai, Arthritis Rheum., 43: 1.465-1.472 (2000), que compararam os três sistemas de clas- sificação radiológica para a avaliação de longo prazo da RA.
Paulus et al., Arthritis Rheum., 50: 1.083-1.096 (2004) categori- zaram a lesão articular radiográfica como progressiva ou não-progressiva em indivíduos com RA participantes de testes clínicos, e concluíram que a lesão articular da RA em um coorte observacional pode ser classificada co- mo progressiva ou não-progressiva com o uso de uma definição composta que inclui diversas medidas imprecisas e relacionadas, mas distintas, de le- são articular estrutural. Parece que, na prática diária de um paciente com RA, uma mudança de intervalo entre um par de radiografias de pelo menos cinco unidades da classificação de Sharp das lesões radiográficas deve es- tar presente, antes de se considerar uma alteração estrutural como real e usá-la como base para uma decisão de tratamento.
Ao longo dos últimos 10 anos, houve avanços significativos no tratamento da RA. O uso combinado de fármacos antirreumáticos modifica- dores da doença (DMARDs) existentes, juntamente com novos agentes bio- lógicos, gerou níveis maiores de eficácia em uma proporção maior de paci- entes, enquanto o diagnóstico e o tratamento precoces da doença também melhoraram o prognóstico.
Etanercept é uma proteína de fusão totalmente humana que inibe o fator de necrose tumoral (TNF) e a subsequente cascata inflamatória de citocina. Etanercept demonstrou ser seguro e eficaz na redução rápida da atividade da doença em adultos com RA e na sustentação dessa melhora (Bathon et ai, N. Eng. J. Med., 343: 1.586-1.593 (2000); Moreland et ai, N.
Engl. J. Med., 337: 141-147 (1997); Moreland et ai, Ann. Intern. Med., 130: 478-486 (1999); Weinblatt et al., N. Engl. J. Med., 340: 253-259 (1999); Mo- reland et ai, J. Rheumatol., 28: 1.238-1.244 (2001)). Ele é igualmente eficaz em crianças com RA juvenil poliarticular (Lovell et ai, N. Engl. J. Med., 342: 763-769 (2000)). Etanercept é aprovado para uso como monoterapia, bem como em terapia combinada com MTX1 para o tratamento de RA.
A perda de função e a alteração radiográfica ocorrem precoce- mente na evolução da doença. Essas alterações podem ser retardadas ou evitadas com o uso de certos DMARDs. Embora vários DMARDs sejam inici- almente clinicamente eficazes e bem tolerados, muitos desses fármacos se tornam menos eficazes ou exibem toxicidade aumentada ao longo do tempo. Com base em sua eficácia e tolerabilidade, o MTX se tornou a terapia-padrão pela qual outros tratamentos são medidos (Bathon et ai, N. Eng. J. Med., 343: 1.586-1.593 (2000); Albert et ai, J. Rheumatoi, 27: 644-652 (2000)).
Estudos recentes examinaram a progressão radiográfica em pacientes com RA em estágio final que receberam leflunomida, MTX ou pla- cebo (Strand et ai, Arch. Intern. Med., 159: 2.542-2.550 (1999)) além de pa- cientes que receberam infliximab mais MTX ou placebo mais MTX após uma resposta parcial ao MTX (Lipsky et ai, N. Engl. J. Med., 343: 1.594-1.602 (2000); Maini et ai, Lancet, 354: 1.932-1.939 (1999)). No primeiro ano do teste Enbrel ERA (RA inicial), etanercept mostrou ser significativamente mais eficaz do que MTX na melhora dos sinais e sintomas da doença e na inibi- ção da progressão radiográfica (Bathon et ai, N. Eng. J. Med., 343: 1.586- 1.593 (2000)). Genovese et al., Arthritis Rheum. 46: 1.443-1.450 (2002) rela- tam resultados do segundo ano do estudo, concluindo que etanercept como monoterapia foi seguro e superior ao MTX na redução da atividade da doen- ça, interrompendo o dano estrutural e diminuindo a incapacidade ao longo de 2 anos em pacientes com RA inicial, agressiva. Além disso, foi observada uma redução da progressão radiográ- fica nas mãos e nos pés em pacientes com artrite reumatoide inicial após receberem infliximab em combinação com metotrexato (Van der Heijde et ai, Annals Rheumatic Diseases 64: 418-419 (2005)). Pacientes com artrite reu- matoide inicial obtiveram uma melhora clinicamente significativa e sustenta- da da função física após tratamento com infliximab (Smolen et ai, Annals Rheumatic Diseases 64: 418 (2005)). O efeito de infliximab e metotrexato sobre a progressão radiográfica em pacientes com artrite reumatoide inicial é relatado em Van der Heijde et ai, Annals Rheumatic Diseases 64: 417 (2005). O tratamento com infliximab de pacientes com espondilite anquilo- sante leva a alterações dos marcadores de inflamação e remodelação óssea associados à eficácia clínica (Visvanathan et ai, Annals Rheumatic Diseases 64: 319 (2005)).
O efeito da terapia com infliximab sobre a densidade mineral óssea em pacientes com espondilite anquilosante (AS) resultante de um tes- te randomizado, controlado com placebo, denominado ASSERT1 é relatado por Van der Heijde et al., Annals Rheumatie Diseases 64: 319 (2005). Verifi- cou-se que infliximab melhora a fadiga e a dor em pacientes com AS, em resultados de ASSERT (Van der Heijde et al., Annals Rheumatie Diseases 64: 318-319 (2005)). Além disso, a eficácia e a segurança de infliximab em pacientes com AS avaliada por ASSERT são descritas por van der Heijde et al., Arthritis Rheum. 5: 582-591 (2005). Os autores concluem que infliximab foi bem tolerado e eficaz em um grande coorte de pacientes com AS durante um período de estudo de 24 semanas. Além disso, o efeito da terapia com infliximab sobre a inflamação medular foi avaliado por exames de ressonân- cia magnética em um teste randomizado, controlado por placebo, de 279 pacientes com AS (Van der Heijde et ai, Annals Rheumatie Diseases 64: 317 (2005)). A forma pela qual o efeito do tratamento sobre a progressão radiográfica medular em pacientes com AS deve ser medido é abordada por van der Heijde et al., Arthritis Rheum. 52: 1.979-1.985 (2005).
Os resultados de análises radiográficas do teste controlado de artrite psoriática infliximab multinacional (IMPACT) após um ano são relata- dos por Antoni et al., Annals Rheumatic Diseases 64: 107 (2005). Evidências de benefício radiográfico do tratamento com infliximab mais MTX em pacien- tes com artrite reumatoide que não tiveram melhora clínica, com uma suba- nálise detalhada de dados do teste de antifator de necrose tumoral na artrite reumatoide com estudo de terapia concomitante, são relatadas por Smolen et al., Arthritis Rheum. 52: 1.020-1.030 (2005). A progressão radiográfica, medida pela mudança média na classificação de Sharp/van der Heijde modi- ficada, foi bem maior em pacientes que recebem MTX mais placebo do que em pacientes que recebem infliximab mais MTX. Os autores concluem que, mesmo em pacientes sem melhora clínica, o tratamento com infliximab mais MTX forneceu benefícios significativos com relação ao processo destrutivo, sugerindo que nesses pacientes, essas duas medidas da doença estão dis- sociadas. A associação entre a lesão radiográfica de base e a melhora da função física após o tratamento de pacientes que possuem artrite reumatoi- de com infliximab é descrita por Breedveld et al., Annals Rheumatic Disea- ses 64: 52-55 (2005). O dano estrutural foi avaliado com o uso da modifica- ção de van der Heijde da classificação de Sharp. Os autores concluem que uma lesão articular maior no nível de base estava associada a uma função física pior no nível de base e menos melhora da função física após o trata- mento, ressaltando a importância da intervenção precoce para tomar mais lenta a progressão da destruição articular. Anticorpos CD20 e terapia com os mesmos
Os linfócitos são um dos muitos tipos de células sangüíneas brancas produzidas na medula óssea durante o processo de hematopoiese. Há duas populações principais de linfócitos: linfócitos B (células B) e linfócitos T (células T). Os linfócitos de interesse particular neste pedido são células B.
As células B amadurecem dentro da medula óssea e deixam a medula expressando um anticorpo de ligação de antígeno na sua superfície celular. Quando uma célula B naive encontra pela primeira vez o antígeno para o qual seu anticorpo ligado à membrana é específico, a célula começa a se dividir rapidamente, e sua prole se diferencia em células B de memória e células efetoras, denominadas "células plasmáticas". As células B de me- mória têm uma expectativa de vida mais longa, e continuam a expressar o anticorpo ligado à membrana com a mesma especificidade que a célula pa- rente original. As células plasmáticas não-produzem anticorpo ligado à membrana, mas, em vez disso, produzem o anticorpo em uma forma que pode ser secretada. Os anticorpos secretados são as principais moléculas efetoras da imunidade humoral.
O antígeno CD20 (também denominado antígeno de diferencia- ção humano restrito ao linfócito B, Bp35 ou B1) é uma proteína integral da membrana glicosilada de quatro segmentos, com um peso molecular de a- proximadamente 35 kD, localizada em linfócitos pré-B e linfócitos B maduros (Valentine et ai, J. Biol. Chem. 264(19): 11.282-11.287 (1989) e Einfeld et ai, EMBO J. 7(3): 711-717 (1988)). O antígeno também é expresso em mais de 90% dos Iinfomas não-Hodgkin (NHL) de células B (Anderson etal. Blood 63(6): 1.424-1.433 (1984)), mas não é encontrado em células-tronco hema- topoiéticas, células pró-B, células plasmáticas normais ou em outros tecidos normais (Tedder et al. J. Immunol. 135(2): 973-979 (1985)). CD20 regula uma etapa inicial no processo de ativação para a iniciação e diferenciação do ciclo celular (Tedder et al., supra), e possivelmente funciona como um canal do íon de cálcio (Tedder et al., J. CeIi Biochem. 14D: 195 (1990)). CD20 é submetida à fosforilação em células B ativadas (Riley e Sliwkowski Semin. Oncoi, 27(12), 17-24 (2000)). CD20 aparece na superfície de linfóci- tos B no estágio de célula pré-B, e é encontrado em células B maduras e de memória, mas não em células plasmáticas (Stashenko et al. J. Immunol. 1980; 125: 1.678-1.685 (1980); Clark e LedbetteryAdv/. CancerRes. 52, 81- 149 (1989)). CD20 possui atividade de canal de cálcio, e pode ter uma parti- cipação no desenvolvimento de células Β. O relacionamento entre a Iise de células B CD20+ periféricas in vitro e a atividade de rituximab in vivo é incerto. Rituximab apresenta uma citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) in vitro (Reff et ai Blood 83: 435-445 (1994)). Também foi observada uma potente atividade citotóxica dependente de complemento (CDC) para rituximab em células e linhagens celulares de Iinfoma (Reff et al., supra, 1994) e em alguns modelos de xenoenxerto em camundongo (Di Gaetano et ai J, lmmunol, 171: 1.581-1.587 (2003)). Foi demonstrado que vários anticor- pos anti-CD20, incluindo rituximab, induzem apoptose in vitro quando reticu- Iados por um anticorpo secundário ou por outros meios (Ghetie et ai Proc. Natl. Acad. Sei. 94, 7.509-7.514 (1997)).
Considerando a expressão de CD20 em Iinfomas de células B1 esse antígeno pode servir como candidato para o "direcionamento" desses linfomas. Essencialmente, esse direcionamento pode ser generalizado da seguinte forma: anticorpos específicos para o antígeno de superfície CD20 de células B são administrados a um paciente. Esses anticorpos anti-CD20 se ligam especificamente ao antígeno CD20 de (ostensivamente) células B tanto normais quanto malignas; o anticorpo ligado ao antígeno de superfície CD20 pode levar à destruição e eliminação de células B neoplásicas. Adicio- nalmente, agentes químicos ou marcadores radioativos que possuam o po- tencial para destruir o tumor podem ser conjugados ao anticorpo anti-CD20, de tal forma que o agente é especificamente "liberado" às células B neoplá- sicas. Independentemente da abordagem, um objeto primário é a destruição do tumor; a abordagem específica pode ser determinada pelo anticorpo anti- CD20 utilizado especificamente e, dessa forma, as abordagens disponíveis para o direcionamento ao antígeno CD20 podem variar consideravelmente.
O anticorpo rituximab (RITUXAN®) é um anticorpo monoclonal projetado geneticamente quimérico murídeo/humano dirigido contra o antí- geno CD20. Rituximab é o anticorpo denominado "C2B8" na Patente U.S. N0 5.736.137 emitida em 7 de abril de 1998 (Anderson et ai). Rituximab é indi- cado para o tratamento de pacientes com Iinfoma não-Hodgkin de células B recidivado ou refratário, de baixo grau ou folicular, CD20-positivo. Estudos in vitro do mecanismo de ação demonstraram que rituximab se liga ao com- plemento humano e lisa linhagens Iinfoides de células B através de CDC (Reff et ai, Blood 83(2): 435-445 (1994)). Adicionalmente, ele possui ativida- de significativa em ensaios para ADCC. Mais recentemente, rituximab de- monstrou ter efeitos antiproliferativos em ensaio de incorporação de timidina tritiada e induz apoptose diretamente, enquanto outros anticorpos anti-CD19 e anti-CD20 não o fazem (Maloney et ai Blood 88 (10): 637a (1996)). A si- nergia entre rituximab e quimioterapias e toxinas também foi observada ex- perimentalmente. Em particular, rituximab sensibiliza linhagens celulares de células B de Iinfoma humano com resistência farmacológica aos efeitos cito- tóxicos de doxorrubicina, CDDP, VP-16, toxina diftérica e ricina (Demidem et al., Câncer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3): 177-186 (1997)). Estudos pré-clínicos in vivo demonstraram que rituximab elimina as células B do sangue periférico, Iinfonodos e medula óssea de macacos cinomolgos, presumivelmente através de processos mediados por complemento e por células (Reff etal., Blood 83: 435-445 (1994)).
Rituximab foi aprovado nos Estados Unidos em novembro de 1997 para o tratamento de pacientes com NHL de células B CD20+ recidiva- do ou refratário, de baixo grau ou folicular, em uma dose de 375 mg/m2 se- manalmente por quatro doses. Em abril de 2001, o FDA aprovou reivindica- ções adicionais para o tratamento de NHL de grau baixo: retratamento (se- manalmente por quatro doses) e um regime de dosagem adicional (sema- nalmente por oito doses). Já houve mais de 300.000 exposições de paciente ao rituximab, seja como monoterapia ou em combinação com fármacos imu- nossupressores ou quimioterápicos. Também foram tratados pacientes com rituximab como terapia da manutenção por até 2 anos (Hainsworth et ai, J. Clin. Oncol. 21: 1.746-1.751 (2003); Hainsworth etal., J. Clin. Oncol. 20: 4.261-4.267 (2002)). Além disso, rituximab foi usado no tratamento de dis- túrbios malignos e não-malignos de células plasmáticas (Treon e Anderson, Semin. Oncol. 27: 79-85 (2000)).
Rituximab também foi estudado em diversos distúrbios autoi- munes não-malignos, nos quais células B e auto-anticorpos parecem partici- par da fisiopatologia da doença (Edwards et al., Biochem Soe. Trans. 30: 824-828 (2002)). Há relatos de que rituximab potencialmente alivia os sinais e sintomas, por exemplo, de artrite reumatoide (RA) (Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61: 883-888 (2002); Edwards etal., Arthritis Rheum., 46 (Supl. 9): S46 (2002); Stahl et ai, Ann. Rheum. Dis., 62 (Supl. 1): OP004 (2003); Emery et al., Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)), lúpus (Eisenberg, Arthri- tis. Res. Ther. 5: 157-159 (2003); Leandro etal. Arthritis Rheum. 46: 2.673- 2.677 (2002); Gorman et ai, Lupus, 13: 312-316 (2004)), púrpura tromboci- topênica imune (D'Arena et ai, Leuk. Lymphoma 44: 561-562 (2003); Stasi et ai, Blood, 98: 952-957 (2001); Saleh et ai, Semin. Oncol., 27 (Supl. 12): 99-103 (2000); Zaia et ai, Haematolgica, 87: 189-195 (2002); Ratanathara- thom et ai, Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000)), aplasia pura de células vermelhas (Auner et al., Br. J. Haematol., 116: 725-728 (2002)); anemia au- toimune (Zaja et ai, Haematologica 87: 189-195 (2002) (errata aparece em Haematologica 87: 336 (2002)), doença da aglutinina fria (Layios et al., Leu- kemia, 15: 187-8 (2001); Berentsen et ai, Blood, 103: 2.925-2.928 (2004); Berentsen et ai, Br. J. Haematoi, 115: 79-83 (2001); Bauduer, Br. J. Hae- matol., 112: 1.083-1.090 (2001); Damiani et ai, Br. J. Haematoi, 114: 229- 234 (2001)), síndrome do tipo B de resistência grave à insulina (Coll et ai, N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004), crioglobulinemia mista (DeVita et ai, Arthritis Rheum. 46 Supl. 9: S206/S469 (2002)), miastenia gravis (Zaja et ai, Neurology, 55: 1.062-63 (2000); Wylam et ai, J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)), granulomatose de Wegener (Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44: 2.836-2.840 (2001)), pênfigo vulgar refratário (Dupuy et al., Arch Derma- toi, 140: 91-96 (2004)), dermatomiosite (Levine, Arthritis Rheum., 46 (Supl. 9): S1299 (2002)), síndrome de Sjõgren (Somer et al., Arthritis & Rheuma- tism, 49: 394-398 (2003)), crioglobulinemia mista ativa do tipo Il (Zaja et ai, Blood, 101: 3.827-3.834 (2003)), pênfigo vulgar (Dupay et ai, Arch. Derma- tol., 140: 91-95 (2004)), neuropatia autoimune (Pestronk et ai, J. Neuroi Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003)), síndrome paraneoplásica opso- clono-mioclono (Pranzatelli et ai Neurology 60 (Supl. 1) P05.128: A395 (2003)) e esclerose múltipla com recidivas/remissões (RRMS) (Cross et ai (resumo) "Preliminary Results from a Phase Il Trial of Rituximab in MS", "Ei- ghth Annual Meeting of the Américas Committees for Research and Treat- ment in Multiple Sclerosis", 20-21 (2003).
Foi realizado um estudo de Fase Il (WA16291) em pacientes com artrite reumatoide (RA)1 que forneceu dados de um período de acompa- nhamento de 48 semanas sobre a segurança e eficácia de Rituximab (Emery et al. Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003); Szczepanski et ai Arthritis Rheum. 48(9): S121 (2003)). Um total de 161 pacientes foi randomizado igualmente em quatro ramificações de tratamento: metotrexato, somente ritu- ximab, rituximab mais metotrexato, e rituximab mais ciclofosfamida (CTX). O regime de tratamento de rituximab foi de um grama administrado por via intravenosa no 1o e 15° dias. As infusões de rituximab na maioria dos pacien- tes com RA foram bem toleradas por quase todos os pacientes, com 36% dos pacientes apresentando pelo menos um evento adverso durante a primeira infusão (comparados com 30% dos pacientes que recebem placebo). No geral, a maioria dos eventos adversos foi considerada de leve a moderada em termos de gravidade, e era bem distribuída por todos os grupos de tratamen- to. Houve um total de 19 eventos adversos sérios por todas as quatra ramifi- cações ao longo das 48 semanas, que eram ligeiramente mais freqüentes no grupo de rituximab/CTX. A incidência de infecções foi bem distribuída por todos os grupos. A taxa média de infecção séria nessa população de pacien- tes com RA foi de 4,66 por 100 pacientes/ano, que é mais baixa do que a taxa de infecções que necessitam de internação hospitalar em pacientes com RA (9,57 por 100 pacientes/ano) relatada em um estudo epidemiológico com base comunitária (Doran et al., Arthritis Rheum. 46: 2.287-2.293 (2002)).
O perfil de segurança relatado de rituximab em um pequeno número de pacientes com distúrbios neurológicos, incluindo neuropatia auto- imune (Pestronk et ai, supra), síndrome opsoclonus-myoclonus (Pranzatelli et ai, supra) e RRMS (Cross et al., supra), foi similar àquele relatado em oncologia ou RA. Em um estudo em andamento patrocinado pelo investiga- dor (IST) de rituximab em combinação com interferon-beta (IFN-β) ou aceta- to de glatirâmero em pacientes com RRMS (Cross et al., supra), 1 de cada 10 pacientes tratados foi internado no hospital para observação de um dia para o outro após apresentar febre moderada e rigores após a primeira infu- são de rituximab, enquanto os outros 9 pacientes completaram o regime de quatro infusões sem nenhum evento adverso registrado.
Patentes e publicações de patente relacionadas aos anticorpos CD20 e moléculas de ligação de CD20 incluem as Patentes U.S. Nos 5.776.456, 5.736.137, 5.843.439, 6.399.061 e 6.682.734, além de U.S. 2002/0197255, U.S. 2003/0021781, U.S. 2003/0082172, U.S. 2003/0095963, U.S. 2003/0147885 (Anderson et ai.)] Patente U.S. N0 6,455,043 e WO 2000/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 2000/27428 (Grillo-Lopez e White); WO 2000/27433 (Grillo-Lopez e Leonard); WO 2000/44788 (Braslawsky et al.);
WO 2001/10462 (Rastetter, W.); WO 2001/10461 (Rastetter e White); WO 2001/10460 (White e Grillo-Lopez); U.S. 2001/0018041, U.S. 2003/0180292, WO 2001/34194 (Hanna e Hariharan); U.S. 2002/0006404 e WO 2002/04021 (Hanna e Hariharan); U.S. 2002/0012665, WO 2001/74388 e 6.896.885 B5 (Hanna, N.); U.S. 2002/0058029 (Hanna, N.); U.S. 2003/0103971 (Hariharan e Hanna); U.S. 2005/0123540 (Hanna et al.); U.S. 2002/0009444 e WO 2001/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 2001/97858; U.S. 2005/0112060 e Paten- te U.S. N0 6.846.476 (White, C.); U.S. 2002/0128488 e WO 2002/34790 (Reff, M.); WO 2002/060955 (Braslawsky et a/.);WO 2002/096948 (Bras- lawsky et al.),\NO 2002/079255 (Reff e Davies); Patente U.S. N0 6.171.586 e WO 1998/56418 (Lam et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); WO 1999/22764 (Raju, S.); WO 1999/51642, Patente U.S. N0 6.194.551, Patente U.S. N0 6.242.195, Patente U.S. N0 6.528.624 e Patente U.S. N0 6.538.124 (Idusogie et ai)·, WO 2000/42072 (Presta, L.); WO 2000/67796 (Curd et a/.); WO 2001/03734 (Grillo-Lopez et a/.); U.S. 2002/0004587 e WO 2001/77342 (Mil- ler e Presta); U.S. 2002/0197256 (Grewal, I.); U.S. 2003/0157108 (Presta, L.); Patentes U.S. Nos 6.565.827, 6.090.365, 6.287.537, 6.015.542, 5.843.398 e 5.595.721, (Kaminski et a/.); Patentes U.S. Nos 5.500.362, 5.677.180, 5.721.108, 6.120.767, 6.652.852, 6.893.625 (Robinson et al.); Patente U.S. N0 6.410.391 (Raubitschek et al.); Patente U.S. N0 6.224.866 e WO00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO 2000/67795 (Goldenberg); U.S. 2003/0133930; WO 2000/74718 e U.S. 2005/0191300A1 (Goldenberg e Hansen); U.S. 2003/0219433 e WO 2003/68821 (Hansen et al.); WO 2004/058298 (Goldenberg e Hansen); WO 2000/76542 (Golay ef a/.); WO 2001/72333 (Wolin e Rosenblatt); Patente U.S. N0 6.368.596 (Ghetie et al.); Patente U.S. N0 6.306.393 e U.S. 2002/0041847 (Goldenberg, D.); U.S. 2003/0026801 (Weiner e Hartmann); WO 2002/102312 (Engleman, E.); U.S. 2003/0068664 (Albitar et al.); WO 2003/002607 (Leung, S.); WO 2003/049694, U.S. 2002/0009427, e U.S. 2003/0185796 (Wolin ef a/.); WO 2003/061694 (Sing e Siegall); U.S. 2003/0219818 (Bohen ef a/.); U.S. 2003/0219433 e WO 2003/068821 (Han- sen ef a/.); U.S. 2003/0219818 (Bohen ef a/.); U.S. 2002/0136719 (Shenoy ef a/.); WO 2004/032828 e U.S. 2005/0180972 (Wahl ef a/.); e WO 2002/56910 (Hayden-Ledbetter). Veja também a Patente U.S. N0 5.849.898 e E.P. 330.191 (Seed ef a/.); E.P. 332.865 A2 (Meyer e Weiss); Patente U.S. N0 4.861.579 (Meyer ef ai.)] U.S. 2001/0056066 (Bugelski ef a/.); WO 1995/03770 (Bhat ef a/.); U.S. 2003/0219433 A1 (Hansen ef a/.J; WO 2004/035607 (Teeling et al.)·, WO 2005/103081 (Teeling ef a/.); WO 2004/056312 (Lowman ef a/.); U.S. 2004/0093621 (Shitara ef a/.); WO 2004/103404 (Watkins ef a/.); WO 2005/000901 (Tedder ef a/.); U.S. 2005/0025764 (Watkins ef a/.); WO 2005/016969 (Carr ef a/.); U.S. 2005/0069545 (Carr ef a/.); WO 2005/014618 (Chang ef a/.); U.S. 2005/0079174 (Barbera-Guillem e Nelson); U.S. 2005/0106108 (Leung e Hansen); WO 2005/044859 e U.S. 2005/0123546 (Umana ef a/.); WO 2005/070963 (Allan ef a/.); U.S. 2005/0186216 (Ledbetter e Hayden- Ledbetter); U.S. 2005/0202534 (Hayden-Ledbetter e Ledbetter); U.S. 2005/0202028 (Hayden-Ledbetter e Ledbetter); U.S. 2005/0202023 (Hayden- Ledbetter e Ledbetter); Patente U.S. N0 6.183.744 (GoIdenberg) e Patente U.S. N0 6.897.044 (Braslawski ef a/.).
Publicações relacionadas ao tratamento com rituximab incluem: Perotta e Abuel, "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab" Resumo N0 3.360 Blood 10(1) (parte 1-2): ρ. 88B (1998); Perotta et al., "Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic pur- pura (ITP)", Blood, 94: 49 (resumo) (1999); Matthews1 R., "Medicai Heretics" New Scientist (7 de abril de 2001); Leandro ef al., "Clinicai outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B Iymphocyte depletion" Ann. Rheum. 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Além disso, veja Looney, "B cells as a therapeutic target in auto- immune diseases other than rheumatoid arthritis" Rheumatology, 44 Supl. 2: ii13-ii17 (2005); Chambers and Isenberg, "Anti-B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases" Lupus 14(3): 210-214 (2005); Looney et ai, "B-cell depletion as a novel treatment for systemic Iupus erythemato- sus: a phase l/ll dose-escalating trial of rituximab" Arthritis Rheum. 50: 2.580- 2.589 (2004); Looney, "Treating human autoimmune disease by depleting B cells" Ann. Rheum. Dis. 61: 863-866 (2002); Edelbauer et ai, "Rituximab in childhood systemic Iupus erythematosus refractory to conventional immuno- suppression Case report" Pediatr. Nephrol. 20(6): 811-813 (2005); D1Cruz e Hughes, "The treatment of Iupus nephritis" BMJ 330(7488): 377-378 (2005); Looney, "B cell-targeted therapy in diseases other than rheumatoid arthritis" J. Rheumatoi Suppi 73: 25-28; discussão 29-30 (2005); Sfikakis et al., "Re- mission of proliferative Iupus nephritis following B cell depletion therapy is preceded by down-regulation of the T cell costimulatory molecule CD40 Ii- gand: an em aberto trial" Arthritis Rheum. 52(2): 501-513 (2005); Rastetter et ai, "Rituximab: expanding role in therapy for Iymphomas and autoimmune diseases" Annu. Rev. Med. 55: 477-503 (2004); Silverman1 "Anti-CD20 the- rapy in systemic Iupus erythematosus: a step closer to the clinic" Arthritis Rheum. 52(2): 371-7 (2005), Errata em: Arthritis Rheum. 52(4): 1.342 (2005); Ahn et al, "Long-term remission from life-threatening hypercoagulable state associated with Iupus anticoagulant (LA) following rituximab therapy" Am. J. Hematoi 78(2): 127-129 (2005); Tahir et al, "Humanized anti-CD20 mono- clonal antibody in the treatment of severe resistant systemic lupus erythema- tosus in a patient with antibodies against rituximab" Rheumatology, 44(4): 561-562 (2005), Epub 11 de janeiro de 2005; Looney et al, "Treatment of SLE with anti-CD20 monoclonal antibody" Curr. Dir. Autoimmun. 8: 193-205 (2005); Cragg et al, "The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy" Curr. Dir. Autoimmun. 8: 140-174 (2005); Gottenberg et al, "Tolerance and short term efficacy of rituximab in 43 patients with systemic autoimmune diseases" Ann. Rheum. Dis. 64(6): 913-920 (2005) Epub 18 de novembro de 2004; Tokunaga et al, "Down-regulation of CD40 and CD80 on B cells in patients with life-threatening systemic Iupus erythematosus after successful treatment with rituximab" Rheumatology 44(2): 176-182 (2005), Epub 19 de outubro de 2004. Veja também, Leandro et al, "B cell repopula- tion occurs mainly from naíve B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic Iupus erythematosus" Arthritis Rheum., 48 (Supl. 9): S1160 (2003).
Specks et al. "Response of Wegener's granulomatosis to anti- CD20 chimeric monoclonal antibody therapy" Arthritis & Rheumatism 44(12): 2.836-2.840 (2001) revelam o uso bem-sucedido de quatro infusões de 375 mg/m2 de rituximab e glicocorticoides em altas doses para o tratamento de granulomatose de Wegener. A terapia foi repetida após 11 meses, quando o cANCA recidivou, mas a terapia foi feita sem glicocorticoides. Com 8 meses após o segundo curso de rituximab, a doença dos pacientes permaneceu em remissão completa. Além disso, em outro estudo, verificou-se que rituximab é um agente de indução eficaz na remissão, bem tolerado, para vasculite grave associada ao ANCA (anticorpos citoplasmáticos anti-neutrófilos), quando usado em uma dose de 375 mg/m2 χ 4, juntamente com 1 mg/kg/dia de prednisona oral, que foi reduzida semanalmente 4 a 40 mg/dia, e até a suspensão completa ao longo das 16 semanas seguintes. Quatro pacientes fora tratado novamentes somente com rituximab para titulações de ANCA recorrentes/crescentes. Além dos glicocorticoides, nenhum agente imunos- supressor adicional parece ser necessário para indução de remissão e ma- nutenção de remissão sustentada (6 meses ou mais). Veja a apresentação on-line do resumo de Keogh et al., "Rituximab for Remission Induction in Se- vere ANCA-Associated Vasculitis: Report of a Prospective Em aberto Pilot Trial in 10 Patients", "American College of Rheumatology", Número da Ses- são: 28-100, Título da Sessão: "Vasculitis", Tipo de Sessão: "ACR Concur- rent Session, Primary Category: 28 Vasculitis", Sessão 10/18/2004 (<www.abstractonline.com/viewer/SearchResults.asp>). Veja também Keogh et al., Kidney Blood Press. Res. 26: 293 (2003), em que é relatado que onze pacientes com vasculite refratária associada ao ANCA foram tratados com quatro doses semanais de 375 mg/m2 de rituximab e glicocorticoides em al- tas doses, resultando em remissão.
Pacientes com vasculite refratária associada ao ANCA recebe- ram a administração de rituximab juntamente com medicamentos imunossu- pressores como, por exemplo, ciclofosfamida intravenosa, micofenolato de mofetila, azatioprina ou leflunomida, com eficácia aparente. Eriksson1 "Short- term outcome and safety in 5 patients com ANCA-positive vasculitis treated with rituximab", Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003) (cinco pacientes com vasculite associada ao ANCA tratados com rituximab 375 mg/m2 uma vez por semana por 4 semanas responderam ao tratamento); Jayne et al., "B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis" Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294-295 (2003) (seis pacientes com vas- culite refratária receberam quatro infusões por semana de rituximab a 375 mg/m2 com ciclofosfamida, junto com imunossupressão de base e predniso- lona apresentaram quedas expressivas da atividade vasculítica). Um relato adicional do uso de rituximab juntamente com ciclofosfamida intravenosa a 375 mg/m2 por dose em 4 doses para administração aos pacientes com vas- culite sistêmica refratária é apresentado em Jayne, pôster 88 ("11a Internati- onal Vasculitis and ANCA workshop"), "2003 American Society of Nephro- logy". Veja também Stone e Specks, "Rituximab Therapy for the Induction of Remission and Tolerance in ANCA-associated Vasculitis", no "Clinicai Trial Research Summary of the 2002-2003 Immune Tolerance Network", http://www.immunetolerance.org/research/autoimmune/trials/stone.html, no qual é proposto um teste de rituximab em vasculite associada ao ANCA por uma duração total de 18 meses. Veja também Eriksson1 J. Internai Med., 257: 540-548 (2005), que relata nove pacientes com vasculite ANCA-positivo que foram tratados com sucesso com duas ou quatro doses semanais de 500 mg de rituximab, além de Keogh et al., Arthritis and Rheumatism, 52: 262-268 (2005), que relata que, em 11 pacientes com vasculite refratária associada ao ANCA, o tratamento ou retratamento com quatro doses sema- nais de 375 mg/m2 de rituximab induziriu a remissão por eliminação de linfó- citos Β, o estudo sendo realizado entre janeiro de 2000 e setembro de 2002.
Sobre a atividade de um anticorpo anti-CD20 humanizado, veja, por exemplo, Vugmeyster et ai, "Depletion of B cells by a humanized anti- body anti-CD20 PR070769 in Macaca fascicularis" J. Immunother. 28: 212- 219 (2005). Para uma discussão sobre um anticorpo monoclonal humano, veja Baker et ai, "Generation and characterization of LymphoStat-B, a hu- man monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B Iymphocyte stimulator" Arthritis Rheum. 48: 3.253-3.265 (2003).
Os achados do estudo WA17043, um estudo de intervalo de doses de fase llb, randomizado, duplo-cego, em pacientes com artrite reu- matoide que tiveram uma resposta inadequada aos DMARDs (incluindo agentes anti-TNF) (Emery et ai, European League aginst Rheumatism (EULAR) (junho de 2005) OPOOO8; Van Vollenhoven et ai, EULAR Gunho de 2005) SAT0072), indicam que a combinação de rituximab com MTX está associada a uma melhora clínica e estatisticamente significativa dos sinto- mas da doença. Esse estudo identificou doses de rituximab em combinação com MTX que necessitam de investigação e confirmação adicionais dentro do quadro de um estudo clínico de fase III. Veja também "World Pharmaceu- tical News", www.scrippharma.com, artigo datado de 13 de junho de 2005, intitulado "Rituximab a future challenge for anti-TNFs?", que descreve os es- tudos da EULAR e especula se os dados de raios X do estudo de Fase Ill REFLEX mostrariam se rituximab pode tornar mais lenta a lesão articular. Além disso, WO 2004/091657, publicado em 28 de outubro de 2004, descre- ve o tratamento de pacientes que possuem artrite reumatoide que exibem uma resposta inadequada às terapias com inibidor de TNFa com anticorpos CD20, em que os pacientes podem ter evidências radiográficas de pelo me- nos uma articulação com erosão definitiva atribuível à artrite reumatoide, como determinado pelo sítio de leitura central (qualquer articulação das mãos, punhos ou pés, com a exceção das articulações DIP [articulação inter- falangianas distais] das mãos). Uma meta secundária potencial inclui alteração da classificação radiográfica de Sharp modificada total, classifica- ção da erosão e classificação do estreitamento de espaço articular, que po- dem ser analisados com o uso de metodologia contínua ou categórica, como for adequado. Metas e análise exploratórias podem envolver análises radio- gráficas que incluem a proporção de pacientes sem progressão erosiva, o que pode ser avaliado na 24a semana ou mais. Veja também U.S. 2005/00001862 publicada em 25 de agosto de 2005, equivalente ao WO 2005/060999, publicada em 7 de julho de 2005, em relação ao tratamento de pacientes que possuem artrite reumatoide com rituximab, em que a meta secundária potencial e as metas e análises exploratórias incluem aquelas em WO 2004/091657, supra.
Apesar dos avanços no tratamento da doença articular, um nú- mero significativo de pacientes não se qualifica, é intolerante ou apresenta uma resposta insuficiente aos tratamentos atuais. Portanto, são necessárias novas opções de tratamento, particularmente aquelas que possam ter como alvo aspectos diferentes da patologia da doença e ofereçam níveis similares ou melhores de benefícios clínicos. Sumário da Invenção
A presente invenção envolve a administração de um antagonis- ta de CD20 que fornece um regime de tratamento seguro e ativo em indiví- duos com lesão articular, incluindo a seleção de um regime de dosagem efi- caz e retratamento programado ou não-programado. Esse antagonista é efi- caz tanto na terapia inicial quanto no tratamento de doença refratária.
Consequentemente, a invenção é como reivindicada. Em um primeiro aspecto, a presente invenção está relacionada a um método para o tratamento de lesão articular em um indivíduo que compreende a adminis- tração de um anticorpo CD20 ao indivíduo, e a realização no indivíduo, pelo menos cerca de um mês após a administração, de um exame radiográfico que mede uma redução na lesão articular, comparado com os níveis de base antes da administração, em que a quantidade de anticorpo CD20 adminis- trado é eficaz na obtenção de uma redução na lesão articular.
Em outro aspecto, a invenção está relacionada a um método de monitoramento do tratamento de lesão articular em um indivíduo, que com- preende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo CD20 ao indivíduo, e a determinação por radiografias, após pelo menos cerca de um mês após a administração, de se a lesão articular foi reduzida em rela- ção à lesão basal antes da administração, em que uma diminuição da lesão versus lesão basal no indivíduo após tratamento indica que o anticorpo CD20 está tendo um efeito sobre a lesão articular. Em uma modalidade pre- ferida, o grau de redução versus o nível de base é medido uma segunda vez após a administração do anticorpo CD20.
Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para determinar se deve prosseguir a administração de um anticorpo CD20 a um indivíduo com lesão articular, que compreende a medida por redução radio- gráfica da lesão articular no indivíduo após administração do anticorpo CD20 uma primeira vez, a medida por redução radiográfica da lesão articular no indivíduo após administração do anticorpo CD20 uma segunda vez, a com- paração das classificações radiográficas no indivíduo na primeira vez e na segunda vez e, caso a classificação seja menor na segunda vez do que na primeira vez, a continuação da administração do anticorpo CD20.
Ainda em outro aspecto, a invenção é dirigida a um artigo ma- nufaturado que compreende:
(a) um recipiente que compreende um anticorpo CD20; e
(b) uma bula com instruções para o tratamento de lesão articu- lar em um indivíduo, em que as instruções indicam que o indivíduo recebe a administração do anticorpo CD20 e depois é submetido, pelo menos cerca de um mês após a administração, a um exame radiográfico que mede uma redução na lesão articular, comparado com os níveis de base antes da administração, em que a quantidade de anticorpo CD20 administrada é efi- caz na obtenção de uma redução na lesão articular.
Em um aspecto preferido, o artigo ainda compreende um recipien- te que compreende um segundo medicamento, em que o anticorpo CD20 é um primeiro medicamento, compreendendo ainda instruções na bula para o trata- mento do indivíduo com uma quantidade eficaz do segundo medicamento.
Em outra modalidade da invenção, é fornecido um método para o tratamento de lesão articular em um indivíduo que compreende a adminis- tração de um anticorpo CD20 ao indivíduo, e a realização no indivíduo, pelo menos cerca de 52 semanas após a administração, de um exame radiográfi- co que mede uma redução na lesão articular, comparado com os níveis de base antes da administração, em que a quantidade de anticorpo CD20 ad- ministrada é eficaz na obtenção de uma redução na lesão articular.
Ainda em outra modalidade adicional, a invenção fornece um método de monitoramento do tratamento de lesão articular em um indivíduo que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo CD20 ao indivíduo e a determinação por radiografia, após pelo menos cerca de 52 semanas após a administração, de se a lesão articular foi reduzida em relação à lesão basal antes da administração, em que uma diminuição da lesão versus lesão basal no indivíduo após tratamento indica que o anticorpo CD20 está tendo um efeito sobre a lesão articular.
Além disso, a invenção fornece um artigo manufaturado que compreende:
(a) um recipiente que compreende um anticorpo CD20; e
(b) uma bula com instruções para o tratamento de lesão articu- lar em um indivíduo, em que as instruções indicam que o indivíduo recebe a administração do anticorpo CD20 e depois é submetido, pelo menos cerca de 52 semanas após a administração, a um exame radiográfico que mede uma redução na lesão articular, comparado com os níveis de base antes da administração, em que a quantidade de anticorpo CD20 administrada é efi- caz na obtenção de uma redução na lesão articular. Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para o tratamento de lesão articular em um indivíduo, em que: (a) o indivíduo a- presentou uma resposta inadequada a um ou mais inibidores antifator de necrose tumoral (TNF); (b) o indivíduo recebeu pelo menos um curso de tra- tamento anterior com um anticorpo CD20, e (c) o tratamento compreende a administração de pelo menos um curso de tratamento adicional com um an- ticorpo CD20.
Esses e outros aspectos adicionais ficarão evidentes a partir do restante da especificação, incluindo os exemplos e as reivindicações em anexo.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 mostra o projeto do estudo para o tratamento de pa- cientes com RA com controle (placebo mais MTX) ou rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX (Exemplo 1 desta especificação).
A Figura 2 mostra as respostas ACR em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 3 mostra as respostas ACR20 ao longo de seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 4 mostra as alterações em 328DS em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 5 mostra respostas EULAR em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 6 mostra remissão ou redução da doença EULAR em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 7 mostra a proteína C reativa (CRP) média ao longo de seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 8 mostra a proporção de pacientes com RA com me- lhora clinicamente relevante da função em seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX. Figura 9 mostra a alteração percentual na classificação da ACR em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 10 mostra a alteração em FACIT-F em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 11 mostra as alterações em categorias SF-36 (saúde física e mental) em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 12 mostra o fator reumatoide total em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 13 mostra a mudança média na classificação total de Sharp-Genant em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 14 mostra a mudança média na classificação da ero- são de Sharp-Genant em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 15 mostra a mudança média na classificação do estrei- tamento espaço articular (JSN) de Sharp-Genant em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 16 mostra a proporção de pacientes com RA sem alte- ração da classificação da erosão em seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 17 mostra a alteração dos resultados radiográficos fi- nais na 24a semana (resultado exploratório) para pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 18 mostra alteração percentual média dos parâmetros da classificação de ACR na 24a semana para pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 19 mostra o CD19 médio em seis meses de pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX. A Figura 20 mostra os eventos adversos mais comumente rela- tados no estudo de pacientes com RA ao longo de seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 21 mostra eventos adversos que levam à retirada do estudo de pacientes com RA ao longo de seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 22 mostra eventos que ocorrem durante/em até 24 ho- ras das infusões no estudo de pacientes com RA ao longo de seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 23 mostra reações agudas à infusão no estudo de pa- cientes com RA ao longo de seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 24 mostra eventos adversos sérios que ocorrem du- rante/em até 24 horas das infusões no estudo de pacientes com RA ao longo de seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com ritu- ximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 25 mostra infecções e infestações por classe de órgão sistêmico no estudo de pacientes com RA ao longo de seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 26 mostra infecções sérias no estudo de pacientes com RA ao longo de seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 27 mostra a taxa de infecção no estudo de pacientes com RA ao longo de seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 28 mostra HACA no estudo de pacientes com RA ao longo de seis meses, em que os pacientes são tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 29 mostra os níveis de IgG ao longo de seis meses em pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 30 mostra os níveis de IgA ao longo de seis meses em pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 31 mostra os níveis de IgM ao longo de seis meses em pacientes com RA tratados com controle ou com rituximab (1.000 mg χ 2) mais MTX.
A Figura 32A é um alinhamento de seqüências que compara as seqüências de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve (Vl) de cada uma das cadeias leves capa murinas 2H7 (SEQ. ID. N°: 1), humanizadas 2H7.v16 variantes (SEQ. ID. N°: 2) e a cadeia leve capa humana do subgru- po I (SEQ. ID. N°: 3). As CDRs (regiões determinantes de complementarida- de) da V"L de 2H7 e hu2H7.v16 são as seguintes: CDR1 (SEQ. ID. N°: 4), CDR2 (SEQ. ID. N°: 5) e CDR3 (SEQ. ID. N°: 6).
A Figura 32B é um alinhamento de seqüências que compara as seqüências de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada (V"h) de cada uma das seqüências de consenso murina 2H7 (SEQ. ID. N°: 7), huma- nizada 2H7.v16 variante (SEQ. ID. N°: 8) e a seqüência de consenso huma- na do subgrupo III da cadeia pesada (SEQ. ID. N°: 9). As CDRs de Vh de 2H7 e hu2H7.v16 são as seguintes: CDR1 (SEQ. ID. N°: 10), CDR2 (SEQ. ID. N°: 11) e CDR3 (SEQ. ID. N°: 12).
Na Figura 32A e Figura 32B, a CDR1, CDR2 e CDR3 em cada cadeia estão entre colchetes, flanqueadas pelas regiões estruturais, FR1- 25 FR4, como indicado. 2H7 refere-se ao anticorpo murídeo 2H7. Os asteriscos entre duas fileiras de seqüências indicam as posições que são diferentes entre as duas seqüências. A numeração de resíduos está de acordo com Kabat et ai Sequences of Immunological Interest, 5a Ed. "Public Health Ser- vice, National Institutes of Health", Bethesda, Md. (1991), com inserções mostradas como a, b, c, d e e.
A Figura 33 mostra a seqüência de aminoácidos da cadeia 2H7.v16 L madura (SEQ. ID. N°: 13). A Figura 34 mostra a seqüência de aminoácidos da cadeia 2H7.V16 H madura (SEQ. ID. N0: 14).
A Figura 35 mostra a seqüência de aminoácidos da cadeia 2H7.v31 H madura (SEQ. ID. N0: 15). A cadeia L de 2H7.v31 é a mesma que para 2H7.v16.
A Figura 36 é um alinhamento de seqüências que compara as seqüências de aminoácidos da cadeia leve da variante humanizada 2H7.v16 (SEQ. ID. N0: 2) e variante humanizada 2H7.v138 (SEQ. ID. N0: 28).
A Figura 37 é um alinhamento de seqüências que compara as seqüências de aminoácidos da cadeia pesada da variante humanizada 2H7.v16 (SEQ. ID. N0: 8) e variante humanizada 2H7.v138 (SEQ. ID. N0: 29).
A Figura 38 mostra um alinhamento das cadeias leves maduras de 2H7.v16 e 2H7.v511 (SEQ. ID. Nos: 13 e 30, respectivamente), com nu- meração de Kabat do resíduo do domínio variável e numeração Eu do resí- duo do domínio constante.
A Figura 39 mostra um alinhamento das cadeias pesadas ma- duras de 2H7.v16 e 2H7.v511 (SEQ. ID. Nos:14 e 31, respectivamente), com numeração de Kabat do resíduo do domínio variável e numeração Eu do resíduo do domínio constante.
A Figura 40A mostra a seqüência do domínio variável da cadeia leve de 2H7.v114 humanizado (SEQ. ID. N0: 32); a figura 40B mostra a se- qüência do domínio variável da cadeia pesada de 2H7.v114 humanizado (SEQ. ID. N0: 33); e a figura 40C mostra a seqüência da cadeia pesada de comprimento total de 2H7.v114 humanizado (SEQ. ID. N0: 34), com numera- ção de Kabat do resíduo do domínio variável e numeração Eu do resíduo do domínio constante.
A Figura 41 ilustra a disposição do paciente do teste clínico REFLEX em 56 semanas, incluindo tratamentos em andamento dos subgru- pos de pacientes selecionados das ramificações de tratamento e de placebo do teste clínico REFLEX de Fase III.
A Figura 42 mostra a alteração dos resultados radiográficos fi- nais na 56a semana. A Figura 43 mostra a alteração média na classificação de Sharp-Genant total ao longo do tempo.
A Figura 44 mostra a distribuição cumulativa de alterações na classificação de Sharp-Genant total.
A Figura 45 mostra as análises de sensibilidade: alteração na classificação de Sharp-Genant total.
A Figura 46 mostra pacientes sem alterações radiográficas na 56a semana.
Descrição detalhada das modalidades preferidas
I. Definições
Uma "célula B" é um linfócito que amadurece dentro da medula óssea, e inclui uma célula B naive, célula B de memória ou célula B efetora (células plasmáticas). A célula B neste pedido é uma célula B normal ou não-maligna.
Um "marcador de superfície das células B" ou "antígeno de su- perfície células B" neste pedido é um antígeno expresso na superfície de uma célula B que pode servir como alvo para um antagonista que se liga a ele. Marcadores de superfície das células B exemplares incluem os marca- dores de superfície de leucócitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (para descrições, veja "The Leukocyte Antigen Facts Book", 2a Edição. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., Nova York). Outros marcadores de superfície das células B incluem RP105, FcRH2, CR2, C- CR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHI, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA e 239287 de célu- la Β. O marcador de superfície das células B de interesse particular é ex- presso, de preferência, em células B, comparado com outros tecidos diferen- tes de células B de um mamífero, e pode ser expresso tanto em células B precursoras quanto em células B maduras. Os marcadores de superfície das células B aqui preferidos são CD20 e CD22.
O antígeno "CD20" ou "CD20" é uma fosfoproteína não- glicosílada de cerca de 35 kDa, encontrada na superfície de mais de 90% das células B do sangue periférico ou órgãos linfoides. CD20 está presente tanto em células B normais quanto em células B malignas, mas não é ex- presso em células-tronco. Outros nomes para CD20 na literatura incluem "antígeno restrito a linfócitos B" e "Bp35". O antígeno CD20 é descrito em Clark et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82:1.766 (1985), por exemplo.
O antígeno "CD22" ou "CD22", também conhecido como BL-CAM ou Lyb8, é uma glicoproteína integral da membrana do tipo 1 com peso molecular de cerca de 130 (reduzida) a 140 kD (não-reduzida). Ela é expressa tanto no citoplasma quanto na membrana celular de linfócitos B. O antígeno CD22 aparece precocemente na diferenciação de linfócito de célula B aproximadamente no mesmo estágio que o antígeno CD19. Diferen- temente de outros marcadores de células B, a expressão na membrana de CD22 é limitada aos estágios finais de diferenciação compreendidos entre células B maduras (CD22+) e células plasmáticas (CD22-). O antígeno CD22 é descrito, por exemplo, em Wilson et ai, J. Exp. Med. 173: 137 (1991) e Wilson et ai, J. Immunol. 150: 5.013 (1993).
Um "antagonista" é uma molécula que, mediante ligação em cé- lulas B, destrói ou elimina as células B em um mamífero e/ou interfere com uma ou mais funções das células B, por exemplo, reduzindo ou impedindo uma resposta humoral despertada pelas células B. De preferência, o anta- gonista é capaz de eliminar as células B (ou seja, reduzir os níveis circulan- tes de células B) em um mamífero com ele tratado. Essa eliminação pode ser obtida através de vários mecanismos, tais como ADCC e/ou CDC, inibi- ção da proliferação de células B e/ou indução da morte de células B (por exemplo, por meio de apoptose). Antagonistas incluídos dentro do escopo da presente invenção incluem anticorpos, peptídeos sintéticos ou com se- qüência nativa, imunoadesinas e antagonistas de pequena molécula que se ligam a CD20, opcionalmente conjugados ou fundidos a outra molécula. O antagonista preferido compreende um anticorpo.
Um "antagonista de anticorpo", neste pedido, é um anticorpo que, mediante ligação a um marcador de superfície das células B em células Β, destrói ou elimina as células B em um mamífero e/ou interfere com uma ou mais funções das células B, por exemplo, reduzindo ou impedindo uma resposta humoral despertada pelas células B. De preferência, o antagonista de anticorpo é capaz de eliminar as células B (ou seja, reduzir os níveis cir- culantes de células B) em um mamífero com ele tratado. Essa eliminação pode ser obtida através de vários mecanismos, tais como ADCC e/ou CDC1 inibição da proliferação de células B e/ou indução da morte de células B (por exemplo, por meio de apoptose).
O termo "anticorpo" é usado neste pedido em seu sentido mais amplo, e cobre especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlo- nais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados por pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticor- po, desde que exibam a atividade biológica desejada.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, que compreende, de preferência, a região de ligação de antígeno deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diabodies; anticorpos lineares; moléculas de anticor- po de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticorpo.
Para as finalidades deste pedido, um "anticorpo intacto" é aquele que compreende domínios variáveis pesados e leves, além de uma região Fc.
Um "anticorpo que se liga a um marcador de superfície das cé- lulas B" é uma molécula que, mediante ligação a um marcador de superfície das células B1 destrói ou elimina as células B em um mamífero e/ou interfere com uma ou mais funções das células B, por exemplo, reduzindo ou impe- dindo uma resposta humoral despertada pelas células Β. O anticorpo, de preferência, é capaz de eliminar as células B (ou seja, reduzir os níveis cir- culantes de células B) em um mamífero com ele tratado. Essa eliminação pode ser obtida através de vários mecanismos, tais como ADCC e/ou CDC, inibição da proliferação de células B e/ou indução da morte de células B (por exemplo, por meio de apoptose). Em uma modalidade preferida, o marcador de superfície das células B é CD20 ou CD22 e, portanto, o anticorpo que se liga a um marcador de superfície das células B é um anticorpo que se liga ao CD20 ou CD22, respectivamente, ou um "anticorpo CD20" ou "anticorpo CD22", respectivamente. Exemplos de anticorpos CD22 incluem aqueles descritos em E.P. 1.476.120 (Tedder e Tuscano), E.P. 1.485.130 (Tedder) e E.P. 1.504.035 (Popplewell et al.), bem como aqueles descritos em U.S. 2004/0258682 (Leung et al.). Em uma modalidade ainda mais preferida, o anticorpo é um anticorpo CD20. Uma modalidade particularmente preferida é um anticorpo CD20 ou CD22, de preferência, um anticorpo CD20.
Exemplos de anticorpos CD20 incluem: "C2B8", que é agora de- nominado "rituximab" ("RITUXAN®/MABTHERA®") (Patente U.S. N0 5.736.137); o anticorpo murídeo 2B8 marcado com ítrio-[90] designado Ύ2Β8" ou "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVAUN®), disponível comercialmente por Biogen Idec, Inc. (por exemplo, Patente U.S. N0 5.736.137; 2B8 depositado na ATCC sob o n° de acesso HB11388 em 22 de junho de 1993); lgG2a murina "B1", também denominada "Tositumomab", opcionalmente marcada com 131I para gerar o anticorpo "1311-B1" ou "iodo I131 tositumomab" (BEXXAR®), disponível comercialmente por Corixa (veja também, por exemplo, a Patente U.S. N0 5.595.721); anticorpo monoclonal murídeo "1F5" (por exemplo, Press et al. Blood 69(2): 584-591 (1987) e variantes deste, incluindo "com enxerto estrutu- ral" ou 1F5 humanizado (por exemplo, WO 2003/002607, Leung, S.; depósito na ATCC HB-96450); anticorpo 2H7 murídeo e 2H7 quimérico (por exemplo, Patente U.S. N0 5.677.180); um 2H7 humanizado (por exemplo, WO 2004/056312 (Lowman et al.) e como apresentado abaixo); HUMAX-CD20™ totalmente humano, anticorpo de alta afinidade dirigida à molécula de CD20 na membrana celular de células B (Genmab, Dinamarca; veja, por exemplo, Glennie e van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) e Cragg et al., Blood 101: 1.045-1.052 (2003)); os anticorpos monoclonais humanos a- presentados em WO 2004/035607 e WO 2005/103081 (Teeling et al., Gen- Mab/Medarex); os anticorpos que possuem complexo de cadeias de açúcar unidas por N-glicosida ligadas à região Fc, descritos em U.S. 2004/0093621 (Shitara et al.); anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação de antígeno que se ligam a CD20 (por exemplo, WO 2005/000901, Tedder et al.) como, por exemplo, HB20-3, HB20-4, HB20-25, e MB20-11; proteínas de cadeia úni- ca que se ligam a CD20 (por exemplo, U.S. 2005/0186216 (Ledbetter e Hay- den-Ledbetter); U.S. 2005/0202534 (Hayden-Ledbetter e Ledbetter); U.S. 2005/0202028 (Hayden-Ledbetter e Ledbetter); U.S. 2005/0202023 (Hayden- Ledbetter e Ledbetter) - Trubion Pharm Inc.); moléculas de ligação de CD20, como, por exemplo, a série AME de anticorpos, por exemplo, anticorpos AME- 33™' como apresentados, por exemplo, em WO 2004/103404 e U.S. 2005/0025764 (Watkins et al., Applied Molecular Evolution, Inc.), e os anticor- pos CD20 com mutações de Fc, como apresentados, por exemplo, em WO 2005/070963 (Allan et al., Applied Molecular Evolution, Inc.); moléculas de liga- ção de CD20 como, por exemplo, aquelas descritas em WO 2005/016969 e U.S. 2005/0069545 (Carr et al.): anticorpos biespecíficos apresentado, por e- xemplo, em WO 2005/014618 (Chang et al.); anticorpos monoclonais humani- zados LL2, como descritos, por exemplo, em U.S. 2005/0106108 (Leung e Hansen; Immunomedics); anticorpos quiméricos ou humanizados B-Lyl para CD20, como descritos, por exemplo, em WO 2005/044859 e U.S. 2005/0123546 (Umana et a/.; GIycArt Biotechnology AG); anticorpo A20 ou va- riantes deste, por exemplo, o anticorpo quimérico ou humanizado A20 (cA20, hA20, respectivamente) e IMMUN-106 (por exemplo, U.S. 2003/0219433, Im- munomedics); e anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 ou NU-B2 disponíveis pelo "International Leukocyte Typing Workshop" (por exemplo, Va- Ientine et al., Em: Leukocyte Typing Ill (McMichael, Ed., p. 440, Oxford Uni- versity Press (1987)). Os anticorpos CD20 preferidos neste pedido são anti- corpos CD20 quiméricos, humanizados ou humanos, mais preferivelmente rituximab, um anticorpo A20 humanizado 2H7, quimérico ou humanizado (Im- munomedics), anticorpo CD20 humano HUMAX-CD20® (Genmab) e imuno- globulinas/proteínas que se ligam a CD20 (Trubion Pharm Inc.).
Os termos "rituximab" ou "RITUXAN®" referem-se, neste pedido, ao anticorpo monoclonal quimérico murídeo/humano projetado geneticamen- te dirigido contra o antígeno CD20 e designado "C2B8" na Patente U.S. N0 5.736.137, incluindo fragmentos destes que retenham a capacidade de se ligar a CD20. Apenas para as finalidades deste pedido, e a menos que indi- cado de forma diferente, um "2H7 humanizado" refere-se a um anticorpo CD20 humanizado, ou um fragmento de ligação de antígeno deste, que compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das seguintes seqüências de CDR:
seqüência de CDR L1 RASSSVSYXH, em que X é M ou L (SEQ. ID. N°: 35), por exemplo, SEQ. ID. N°: 4 (Figura 32A),
seqüência CDR L2 do SEQ. ID. N°: 5 (Figura 32A), seqüência de CDR L3 QQWXFNPPT, em que X é S ou A (SEQ. ID. N°: 36), por exemplo, SEQ. ID. N°: 6 (Figura 32A),
seqüência de CDR H1 do SEQ. ID. N°:10 (Figura 32B), seqüência de CDR H2 de AIYPGNGXTSYNQKFKG, em que X é D ou A (SEQ. ID. N°: 37), por exemplo, SEQ. ID. N°: 11 (Figura 32B), e
seqüência de CDR H3 de WYYSXXYWYFDV, em que o X na posição 6 é Ν, A, Y, W1 ou D, e o X na posição 7 é S ou R (SEQ. ID. N°: 38), por exemplo, SEQ. ID. N°:12 (Figura 32B).
Os anticorpos 2H7 humanizados aqui citados incluem aqueles com seqüências de aminoácidos da cadeia pesada que contêm uma Iisina no terminal C e aquelas que não a contêm. As seqüências de CDR acima estão geralmente presentes dentro das seqüências estruturais variáveis leves e va- riáveis pesadas humanas, tais como substancialmente os resíduos RF de consenso humanos da cadeia leve capa humana do subgrupo I (VL6I), e subs- tancialmente os resíduos RF de consenso humanos da cadeia pesada huma- na do subgrupo III (VHIII). Veja também WO 2004/056312 (Lowman et ai).
A região variável pesada pode ser unida a uma região constan- te da cadeia de IgG humana, em que a região pode ser, por exemplo, IgGI ou IgG3, incluindo regiões constantes de seqüência nativa e de seqüência não-nativa.
Em uma modalidade preferida, esse anticorpo compreende a se- quência do domínio variável pesado do SEQ. ID. N0: 8 (v16, como mostrado na Figura 32B), compreendendo também opcionalmente a seqüência do do- mínio variável leve do SEQ. ID. N°: 2 (v16, como mostrado na Figura 32A), que opcionalmente compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 56, 100 e/ou 100a, por exemplo, D56A, N100A, ou N100Y e/ou S100aR no domínio variável pesado, e uma ou mais substituições de aminoá- cidos nas posições 32 e/ou 92, por exemplo, M32L e/ou S92A, no domínio variável leve. De preferência, o anticorpo é um anticorpo intacto que compre- ende a seqüência de aminoácidos da cadeia leve do SEQ. ID. N0: 13 ou 30, e a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada do SEQ. ID. N0: 14, 15, 29, 31, 34 ou 39, a seqüência do SEQ. ID. N0: 39 sendo apresentada abaixo.
Um anticorpo 2H7 humanizado preferido é ocrelizumab (Genen- tech, Inc.).
O anticorpo neste pedido pode ainda compreender pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que aumente a atividade de ADCC como, por exemplo, uma em que as substituições de aminoácidos estão nas posições 298, 333 e 334, de preferência, S298A, E333A, e K334A, com o uso da numeração Eu de resíduos da cadeia pesada. Veja também a Patente U.S. N0 6.737.056, L. Presta.
Qualquer um desses anticorpos pode compreender pelo menos uma substituição na região Fc que aumenta a ligação de FcRn ou a meia-vida sérica, por exemplo, uma substituição na posição 434 da cadeia pesada, por exemplo, N434W. Veja também a Patente U.S. N0 6.737.056, L. Presta.
Qualquer um desses anticorpos pode ainda compreender pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que aumente a ativida- de de CDC, por exemplo, compreendendo pelo menos uma substituição na posição 326, de preferência, K326A ou K326W. Veja também a Patente U.S. N0 6.528.624, Idusogie et ai
Algumas variantes preferidas de 2H7 humanizado são aquelas que compreendem o domínio variável leve do SEQ. ID. N0: 2 e o domínio variável pesado do SEQ. ID. N0: 8, incluindo aquelas com ou sem substitui- ções em uma região Fc (se presente), e aquelas que compreendem um do- mínio variável pesado com alteração na SEQ. ID. N0: 8 de N100A; ou D56A e N100A; ou D56A, N100Y, e S10OaR; e um domínio variável leve com alte- ração na SEQ. ID. N0: 2 de M32L; ou S92A; ou M32L e S92A. M34 no domínio variável pesado de 2H7.v16 foi identificado como uma fonte potencial de estabilidade do anticorpo, e é outro candidato em potencial para substituição.
Em um resumo de algumas das várias modalidades preferidas da invenção, a região variável de variantes baseadas em 2H7.v16 compre- ende as seqüências de aminoácidos de v16, exceto nas posições de substi- tuições de aminoácidos que estão indicadas na tabela abaixo. A menos que indicado de forma diferente, as variantes de 2H7 terão a mesma cadeia leve que v16.
Variantes do anticorpo 2H7 humanizado exemplar
<table>table see original document page 42</column></row><table>
Um 2H7 humanizado preferido compreende a seqüência do domínio variável leve de 2H7.v16:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGK APKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSF NPPTFGQGTKVEIKR (SEQ. ID. Nº: 2);
e a seqüência do domínio variável pesado de 2H7.v16: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ. ID. Nº: 8).
Quando o anticorpo 2H7.v16 humanizado é um anticorpo intac- to, ele pode compreender a seqüência de aminoácidos da cadeia leve:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGK APKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSF NPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ. ID. Nº: 13);
e a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada do SEQ. ID. Nº: 14 ou:
EVQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCAASG YTFTSYN M HWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ. ID. Nº: 15).
Outro anticorpo 2H7 humanizado preferido compreende a se- qüência do domínio variável leve de 2H7.v511:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKA PKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFN PPTFGQGTKVEIKR (SEQ. ID. Nº: 39)
e a seqüência do domínio variável pesado de 2H7.v511: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARWWSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ. ID. N0: 40).
Quando o anticorpo 2H7.v511 humanizado é um anticorpo in- tacto, ele pode compreender a seqüência de aminoácidos da cadeia leve: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKA PKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFN PPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ. ID. N0: 30) e a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada do SEQ. ID.
N°: 31 ou:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTK PREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPG (SEQ. ID. N°: 41).
Veja as Figuras 38 e 39, que alinham as cadeias leves e pesa- das maduras, respectivamente, de 2H7.v511 humanizado com 2H7.v16 humanizado usando a seqüência de Iisina no terminal C para a cadeia pesada.
Quando o anticorpo 2H7.v31 humanizado é um anticorpo intac- to, ele pode compreender a seqüência de aminoácidos da cadeia leve:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKA PKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFN PPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ. ID. N°: 13) e a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada do SEQ. ID.
N0: 15 ou:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYC ARVVYYSN SYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKG PSVF PLAPSS KSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ. ID. N0: 42) ou:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTA VATCARVVYYSYRYVVYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPG (SEQ. ID. N0: 43).
Uma modalidade preferida deste pedido é aquela em que o an- ticorpo é 2H7 humanizado que compreende as seqüências do domínio vari- ável nas SEQ. ID. Nos: 2 e 8 (versão 16). Outra modalidade preferida deste pedido é aquela em que o anticorpo é 2H7 humanizado que compreende as seqüências do domínio variável nas SEQ. ID. Nos: 39 e40 (versão 511). Ain- da mais preferida é aquela em que o anticorpo é 2H7 humanizado que com- preende as seqüências do domínio variável nas SEQ. ID. Nos: 32 e 33 (veja a Figura 40, versão 114), como, por exemplo, um que compreende o domí- nio variável da cadeia leve na SEQ. ID. N0: 32 e a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada do SEQ. ID. N0: 34. Ainda mais preferida é aquela em que o anticorpo é 2H7 humanizado que compreende um domínio variável da ca- deia pesada com alteração N100A, ou D56A e N10OA1 ou D56A, N100Y, e SIOOaR na SEQ. ID. N0: 8, e um domínio variável da cadeia leve com altera- ção M32L, ou S92A, ou M32L e S92A na SEQ. ID. N0: 2.
"Citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por células" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada por células na qual células cito- tóxicas inespecíficas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células natural killer (NK)1 neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado em uma célula-alvo e, subseqüentemente, causam a Iise da célula- alvo. As células primárias para a mediação da ADCC, as células NK, ex- pressam somente FcyRIII1 enquanto monócitos expressam FcyRI1 FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é resumida na Ta- bela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio de ADCC in vitro como, por exemplo, aquele descrito nas Patentes U.S. Nos 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares do sangue periféri- co (PBMC) e células natural killer (NK). Alternativa, ou adicionalmente, a ati- vidade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por e- xemplo, em um modelo animal como, por exemplo, aquele apresentado em Clynes et ai PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. De preferência, as células expres- sam pelo menos FcyRIII e efetuam a função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK)1 monócitos, células cito- tóxicas T e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas.
Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é uma seqüência nativa de FcR humano. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama), e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, e Fcy Rlll, incluindo variantes alélicas e, alternati- vãmente, formas unidas desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que possuem seqüências de aminoácidos similares que diferem basicamen- te nos domínios citoplasmáticos destas. O receptor de ativação FcyRIIA con- tém um motivo de ativação imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FeyRIIB contém um moti- vo de inibição imunorreceptor baseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático (veja Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-492 (1991); Capei et ai, Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et a/., J. Lab. CHn. Med. 126: 330-341 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a serem identifi- cados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" aqui utilizado. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferên- cia de IgGs maternas ao feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere- se à capacidade de uma molécula para Iisar um alvo na presença de com- plemento. A via de ativação de complemento é iniciada pela ligação do pri- meiro componente do sistema complemento (C1q) a uma molécula (por e- xemplo, um anticorpo) em complexo com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação de complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC1 por e- xemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Anticorpos "inibidores do crescimento" são aqueles que evitam ou reduzem a proliferação de uma célula que expressa um antígeno ao qual o anticorpo se liga. Por exemplo, o anticorpo pode evitar ou reduzir a prolife- ração de células B in vitro e/ou in vivo.
Anticorpos que "induzem a apoptose" são aqueles que induzem a morte celular programada, por exemplo, de uma célula B, como determi- nado por ensaios padronizados de apoptose como, por exemplo, a ligação de anexina V, fragmentação de DNA1 encolhimento celular, dilatação do retí- culo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas na membrana (denominadas corpos apoptóticos).
"Anticorpos nativos" são normalmente glicoproteínas heterote- traméricas de cerca de 150.000 dáltons, compostos de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto covalente, en- quanto o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótipos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve tam- bém possui pontes de dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada possui em uma extremidade um domínio variável (VH), segui- do por diversos domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em uma extremidade (Vl) e um domínio constante na outra extremi- dade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro do- mínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem uma interface entre os domínios variá- veis da cadeia leve e da cadeia pesada.
O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem intensamente em termos de seqüência entre an- ticorpos, e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo em par- ticular por seu antígeno em particular. No entanto, a variabilidade não é dis- tribuída igualmente por todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, nos domínios variáveis tanto da cadeia leve quanto da cadeia pesada. As por- ções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões variáveis (FRs). Cada um dos domínios variáveis de cadeias pesa- das e leves nativos compreende quatro FRs, adotando amplamente uma configuração de lâmina β, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam alças que conectam e, em alguns casos, formam parte da estrutura de lâmina β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas com grande proximidade pelos FRs e, com as regiões hipervariáveis da ou- tra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno de anticorpos (veja Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, 5a Ed. "Public Health Service, National Institutes of Health", Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não-estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras como, por exemplo, participação do anticorpo na ADCC.
A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de ligação de antígeno e ainda é capaz de reticulação do antígeno.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de reconhecimento de antígeno e de ligação de antígeno completos. Essa regi- ão consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve em íntima associação não-covalente. É nes- sa configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do díme- ro Vh-Vl. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especifici- dade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) possui a capacidade de reco- nhecer e se ligar ao antígeno, embora com uma afinidade menor do que o sítio de ligação inteiro.
O fragmento Fab também contém o domínio constante da ca- deia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmen- tos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 da cadeia pesada que inclui uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab-SH é a designação aqui utilizada para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constan- tes abriga pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab1 que possu- em cisteínas de dobradiça entre eles. Também são conhecidos outros aco- plamentos químicos de fragmentos de anticorpo. As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser divididas em um de dois tipos claramente distintos, denominados capa (κ) e Iambda (λ), com base nas seqüências de aminoácidos de seus domínios constantes.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio cons-
tante de suas cadeias pesadas, os anticorpos podem ser divididos em clas- ses diferentes. Há cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD1 IgE, IgG e IgMl e várias destas podem ainda ser divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas e as configurações tridimensionais da subunidade de diferentes classes de imunoglobulinas são bem-conhecidas.
"Fv de cadeia única" ou fragmentos de anticorpo "scFv" com- preendem os domínios de anticorpo Vh e Vl, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipeptídeo Fv ainda compreende um Iigante polipeptídico entre os domínios Vh e Vl que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação do antígeno. Para uma revisão sobre scFv, veja Pluckthun em The Pharmacology of Mo- noclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, No- va York, pp. 269-315(1994).
O termo "diabodies" refere-se a pequenos fragmentos de anti- corpo com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreen- dem um domínio variável da cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL), na mesma cadeia polipeptídica (Vh - VL). Com a utilização de um Iigante suficientemente curto para não permitir o pareamen- to entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a pa- rear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diabodies são descritos com mais detalhes, por exem- pio, em E.P. 404.097; WO 93/11161; e Hollinger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6.444-6.448 (1993).
O termo "anticorpo monoclonal", como aqui usado, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancial- mente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compõem a po- pulação são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epitopo, exceto possíveis variantes que possam surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, e essas variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Em contraste com preparações de anticorpos policlonais que tipicamente inclu- em diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epito- pos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vanta- josos pelo fato de não serem contaminados por outras imunoglobulinas. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, e não deve ser considerado como sendo necessária a produção do anticorpo pode qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a se- rem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo mé- todo de hibridoma, descrito inicialmente por Kohler et ai., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, a Patente U.S. N0 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" tam- bém podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago com o uso de técnicas descritas em Clackson et a!., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et ai, J. MoL Biol., 222: 581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais nesta especificação incluem especi- ficamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às seqüências corres- pondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular, ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às seqüências correspon- dentes em anticorpos derivados de outra espécie, ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, além de fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. N0 4.816.567; Morrison et ai, Proc. NatL Acad. Sei. USA, 81: 6.851-6.855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse aqui usados incluem anticorpos "primatizados" que compreendem seqüências de ligação de antigeno do domínio variável derivadas de um primata não-humano (por exemplo, maca- cos do hemisfério oriental como, por exemplo, babuínos, rhesus ou macaco cinomolgo) e seqüências da região constante humana (Patente U.S. N0.
5.693.780).
Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exem- plo, murídeos) são anticorpos quiméricos que contêm uma seqüência míni- ma derivada de uma imunoglobulina não-humana. Em sua maior parte, anti- corpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo do receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anti- corpo do doador) como, por exemplo, camundongo, rato, coelho ou primata não-humano, que possuem a especificidade, afinidade e capacidade deseja- das. Em alguns casos, resíduos da região estrutural (RF) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo do receptor ou no anticorpo do doador. Essas mo- dificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente tudo de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais todas, ou subs- tancialmente todas, as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana, e todos, ou substancialmente todos, os FRs são aqueles de uma seqüência de imunoglobulina humana, exceto a substi- tuição^) de RF observada acima. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, veja Jones et ai, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Bioi 2: 593-596 (1992).
O termo "região hipervariável", quando aqui usado, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação do antigeno. A região hipervariável compreende resíduos de amino- ácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve, e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, 5a Ed. "Public Health Service, National Institutes of Health", Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de uma "alça hipervariável" (por exemplo, resí- duos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve, e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesa- da; Chothia e Lesk J. Moi Biol. 196:901-917 (1987)). Resíduos "estruturais" ou "RF" são aqueles resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável aqui definidos.
Um "anticorpo naked" é um anticorpo (como aqui definido) que não-está conjugado a uma molécula heteróloga como, por exemplo, uma porção citotóxica, polímero ou marcador radioativo.
Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir en- zimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% por peso de anticorpo, como determinado pelo método de Lowry e, principal- mente, mais de 99% por peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos do terminal N ou seqüência de aminoácidos interna pelo uso de um sequenciador giratório, ou (3) até a homogeneidade por SDS- PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras com o uso de azul Coo- massie ou, de preferência, coloração com prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, à medida que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não-estará presente. Nor- malmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
O termo "lesão articular" é usado em seu sentido mais amplo e refere-se à lesão ou destruição parcial ou completa de qualquer parte de uma ou mais articulações, incluindo o tecido conjuntivo e cartilagem, em que a lesão inclui lesão estrutural e/ou funcional de qualquer causa, e pode ou não causar dor articular/artralgia. Ele inclui, sem limitação, lesão articular associada ou resultante de doença articular inflamatória, além de doença articular não-inflamatória. Essa lesão pode ser causada por qualquer condi- ção como, por exemplo, uma doença autoimune como lúpus (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico), artrite (por exemplo, artrite aguda e crônica, artrite reumatoide, incluindo artrite reumatoide de surgimento juvenil, artrite juvenil idiopática (JIA), ou RAjuveniI (JRA), e estágios como sinovite reuma- toide, gota ou artrite gotosa, artrite imunológica aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite induzida por colágeno do tipo II, artrite infecciosa, artrite séptica, artrite de Lyme1 artrite proliferativa, artrite psoriáti- ca, doença de Still1 artrite vertebral, osteoartrite, artrite crônica progressiva, artrite deformante, poliartrite crônica primária, artrite reativa, artrite da meno- pausa, artrite por depleção de estrogênio e espondilite anquilosan- te/espondilite reumatoide), doença reumática autoimune diferente de RA, envolvimento sistêmico significativo secundário a RA (incluindo, sem limita- ção, vasculite, fibrose pulmonar ou síndrome de Felty), síndrome de Sjõgren, especialmente secundária a esta síndrome, vasculite cutânea limitada se- cundária com RA, espondilo-artropatia soronegativa, doença de Lyme, do- ença inflamatória do intestino, esclerodermia, miopatia inflamatória, doença mista do tecido conjuntivo, qualquer síndrome sobreposta, bursite, tendinite, osteomielite, doenças infecciosas, incluindo influenza, rubéola, febre reumá- tica, síndrome do vírus de Epstein-Barr, hepatite, caxumba, rubéola alemã e varicela (catapora), condromalácea patelar, colite colagenosa, distúrbios au- toimunes associados a doenças do colágeno, inflamação articular, esforço incomum ou uso excessivo, por exemplo, torções ou tensões, lesões que incluem fraturas, gota, especialmente encontradas no dedão do pé, além das causadas por distúrbios neurológicos, distúrbios hemofílicos (por exemplo, artropatia hemofílica), distúrbios musculares, distúrbios progressivos, distúr- bios ósseos, distúrbios de cartilagens e distúrbios vasculares. Para as finali- dades desse pedido, articulações são pontos de contato entre elementos de um esqueleto (de um vertebrado, por exemplo, um animal) com as partes que os circundam e apoiam, e incluem, sem limitação, por exemplo, quadris, articulações entre as vértebras da coluna, articulações entre a coluna e a pelve (articulações sacroilíacas), articulações onde os tendões e os Iigamen- tos se fixam aos ossos, articulações entre as costelas e a coluna, ombros, joelhos, pés, cotovelos, mãos, dedos das mãos, tornozelos e dedos dos pés, mas especialmente articulações nas mãos e nos pés.
Neste pedido, um "indivíduo" é um indivíduo humano, incluindo um paciente, elegível para tratamento, que apresenta ou apresentou um ou mais sinais, sintomas ou outros indicadores de lesão articular, foi diagnosti- cado com lesão articular, seja ele, por exemplo, recentemente diagnosticado ou previamente diagnosticado, e que agora apresenta uma recorrência ou recidiva, ou esteja em risco para o desenvolvimento de lesão articular, qual- quer que seja a causa. O indivíduo pode ter sido tratado previamente com anticorpo CD20 ou não. Um indivíduo elegível para o tratamento de lesão articular pode opcionalmente ser identificado como aquele que foi rastreado, por exemplo, pelo sangue, quanto a níveis elevados de células CD20 infil- trantes, ou que foi rastreado com o uso de um ensaio para detectar auto- anticorpos, em que a produção de auto-anticorpos é avaliada qualitativamen- te e, de preferência, quantitativamente. O indivíduo pode ser naive para um segundo medicamento usado quando o tratamento é iniciado, ou seja, ele não havia sido tratado previamente com, por exemplo, um agente imunossu- pressor como metotrexato no "nível de base" (ou seja, no momento antes da administração de uma primeira dose de anticorpo CD20 no método de tra- tamento aqui apresentado como, por exemplo, o dia de rastreamento do in- divíduo antes do tratamento ser iniciado). Esses indivíduos são considerados geralmente como sendo candidatos para o tratamento com este segundo medicamento.
Neste pedido, o "tratamento" de um indivíduo refere-se ao tra- tamento tanto terapêutico quanto profilático ou a medidas preventivas. Aque- les que necessitam de tratamento incluem aqueles que já apresentam lesão articular, bem como aqueles nos quais a lesão articular ou o progresso de lesão articular deve ser evitado. Dessa forma, o indivíduo pode ter sido diag- nosticado como tendo a lesão articular ou pode estar predisposto ou susce- tível à lesão articular, ou pode ter lesão articular limitada, com probabilidade de progredir na ausência de tratamento. O tratamento é bem-sucedido caso a lesão articular seja aliviada ou cicatrizada, ou a progressão do dano articu- lar ou estrutural seja interrompida ou tornada mais lenta, comparada com antes da administração. O tratamento bem-sucedido ainda inclui a preven- ção completa ou parcial do desenvolvimento de lesão articular. Para as fina- lidades deste pedido, tornar mais lenta ou reduzir a lesão articular ou a pro- gressão da lesão articular é o mesmo que interromper, diminuir ou reverter a lesão articular.
"Melhora clínica" refere-se à prevenção do progresso adicional da lesão articular ou qualquer melhora da lesão articular em conseqüência do tratamento, como determinado por um teste diferente de um exame ra- diográfico. Dessa forma, a melhora clínica pode ser determinada, por exem- plo, por avaliação do número de articulações sensíveis ou edemaciadas, pelo índice de Avaliação da Gravidade de Psoríase, uma avaliação clínica global do indivíduo, avaliação da velocidade de sedimentação de eritrócitos) ou avaliação da quantidade do nível de proteína C reativa.
Para as finalidades deste pedido, um indivíduo está em "remis- são" se ele/ela não apresenta sintomas de lesão articular ativa como, por exemplo, aquelas detectáveis pelos métodos aqui descritos, e não apresen- tou progressão da lesão articular avaliada no nível de base ou em certo mo- mento durante o tratamento. Aqueles que não-estão em remissão incluem, por exemplo, aqueles que apresentam uma piora ou progressão da lesão articular. Esses indivíduos que apresentam um retomo dos sintomas, inclu- indo lesão articular ativa, são aqueles que possuem uma "recidiva" ou que tiveram uma "recorrência".
Um "sintoma" de lesão articular é qualquer fenômeno mórbido ou afastamento do normal em termos de estrutura, função ou sensibilidade, a - presentado pelo indivíduo e indicativo de lesão articular como, por exemplo, aqueles observados acima, incluindo articulações sensíveis ou edemaciadas. A expressão "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade do anticorpo ou do antagonista que é eficaz para o tratamento de lesão articu- lar, incluindo uma quantidade que é eficaz na obtenção de uma redução da lesão articular, quando comparada ao nível de base antes da administração dessa quantidade, como determinado por exames radiográficos. Uma quan- tidade eficaz de outros medicamentos como, por exemplo, segundos medi- camentos, é uma quantidade desse medicamento eficaz para tratar lesão articular ou outros efeitos indesejáveis, incluindo efeitos colaterais ou sinto- mas ou outras condições que acompanham a lesão articular, incluindo uma doença ou distúrbio subjacente.
"Classificação de Sharp total modificada" significa uma classifi- cação obtida para avaliação de radiografias com a utilização do método de acordo com Sharp, modificado por Genant, Am. J. Med., 30: 35-47 (1983). A avaliação primária será a alteração da classificação de Sharp-Genant total do rastreamento. A classificação de Sharp-Genant combina uma classifica- ção da erosão e uma classificação do estreitamento de espaço articular de ambas as mãos e ambos os pés. A lesão articular é medida nesta classifica- ção de teste pela mudança média da perda em relação à classificação no nível de base (quando o paciente é rastreado ou testado, antes da primeira administração do antagonista de CD20 deste pedido).
Como aqui usado, o termo "artrite reumatoide" refere-se a um estado de doença reconhecido que pode ser diagnosticado de acordo com os critérios revisados em 2000 da "American Rheumatoid Association" para a classificação de artrite reumatoide, ou quaisquer critérios similares. Os in- dicadores fisiológicos da RA incluem edema articular simétrico que é carac- terístico, embora não seja invariável, na artrite reumatoide. O edema fusi- forme das articulações interfalangianas proximais (PIP) das mãos, bem co- mo as articulações metacarpofalangianas (MCP), punhos, cotovelos, joelhos, tornozelos e metatarsofalangianas (MTP) são comumente afetados, e o e- dema é facilmente detectado. A dor à movimentação passiva é o teste mais sensível para inflamação articular, e a inflamação e a deformidade estrutural freqüentemente limitam a amplitude de movimento da articulação afetada. As alterações visíveis típicas incluem desvio ulnar dos dedos nas articula- ções MCP, hiperextensão ou hiperflexão das articulações MCP e PIP1 con- traturas em flexão dos cotovelos e subluxação dos ossos do carpo e dos dedos dos pés. O indivíduo com artrite reumatoide pode ser resistente aos DMARDs1 à medida que os DMARDs não são eficazes ou totalmente efica- es no tratamento dos sintomas. Além disso, os candidatos à terapia de a- cordo com esta invenção incluem aqueles que apresentaram uma resposta inadequada ao tratamento prévio ou atual com inibidores do TNF como, por exemplo, etanercept, infliximab e/ou adalimumab, em conseqüência de toxi- cidade ou eficácia inadequada (por exemplo, etanercept por 3 meses a 25 mg duas vezes por semana ou pelo menos 4 infusões de infliximab a 3 mg/kg). Um paciente com "artrite reumatoide ativa" significa um paciente com sintomas ativos e não-latentes de artrite reumatoide. Indivíduos com "artrite reumatoide ativa inicial" são aqueles indivíduos com artrite reumatoi- de ativa diagnosticados há pelo menos 8 semanas, mas há não mais de quatro anos, de acordo com os critérios revisados em 1987 da ACR para a classificação de RA.
A artrite psoriática (PsA) é uma doença articular inflamatória ca- racterizada por reabsorção óssea intensa. Como também será aqui descrito, amostras de sangue de pacientes com PsA, particularmente aqueles com erosões ósseas nas radiografias simples, exibem um aumento acentuado dos precursores de osteoclastos (OCP), quando comparados com controles saudáveis.
O termo "exposição ao anticorpo" refere-se ao contato ou expo- sição ao anticorpo deste pedido, em uma ou mais doses administradas ao longo de um período de tempo de cerca de 1 dia a cerca de 5 semanas. As doses podem ser dadas de uma vez ou em intervalos de tempo fixos ou irre- gulares ao longo desse período de exposição como, por exemplo, uma dose por semana por quatro semanas, ou duas doses separadas por um intervalo de tempo de cerca de 13-17 dias. As exposições ao anticorpo iniciais e tar- dias são separadas no tempo uma da outra como aqui descrito em detalhe.
Uma exposição que não é administrada ou fornecida até certo tempo "a partir da exposição inicial" ou a partir de qualquer exposição prévia significa que o tempo até a segunda exposição ou última exposição é medi- do a partir do momento em que foi administrada qualquer uma das doses a partir da exposição prévia, caso mais de uma dose tenha sido administrada naquela exposição. Por exemplo, quando são administradas duas doses em uma exposição inicial, a segunda exposição não é dada até pelo menos cer- ca de 16-54 semanas, medido a partir do momento de a primeira ou segun- da dose ter sido administrada dentro daquela exposição prévia. Da mesma forma, quando são administradas três doses, a segunda exposição pode ser medida a partir do momento da primeira, segunda ou terceira dose dentro da exposição prévia. De preferência, "a partir da exposição inicial" ou a partir de qualquer descrição prévia é medida a partir do momento da primeira dose.
O termo "agente imunossupressor", como aqui usado para tera- pia acessória, refere-se às substâncias que atuam para suprimir ou masca- rar o sistema imunológico do mamífero aqui tratado. Isso incluiria substân- cias que suprimem a produção de citocina, infrarregulam ou suprimem a ex- pressão de autoantígenos, ou mascaram os antígenos de MHC. Exemplos desses agentes incluem pirimidinas 2-amino-6-aril-5-substituídas (veja a Pa- tente U.S. N0 4.665.077); fármacos anti-inflamatórios não-esteroides (NSAIDs); ganciclovir, tacrolimus, glicocorticoides como cortisol ou aldoste- rona, agentes anti-inflamatórios como, por exemplo, um inibidor da ciclo- oxigenase, um inibidor da 5-lipoxigenase ou um antagonista do receptor de leucotrieno; antagonistas de purina como, por exemplo, azatioprina ou mico- fenolato mofetil (MMF); agentes alquilantes como, por exemplo, ciclofosfa- mida; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldeído (que mascara os antí- genos de MHC, como descrito na Patente U.S. N0 4.120.649); anticorpos anti-idiotípicos para antígenos de MHC e fragmentos de MHC; ciclosporina A; esteroides, tais como corticosteroides ou glicocorticoides ou análogos de glicocorticoide, por exemplo, prednisona, metilprednisolona, incluindo succi- nato sódico de metilprednisolona SOLU-MEDROL®, e dexametasona; inibi- dores da di-hidrofolato redutase como, por exemplo, metotrexato (oral ou subcutâneo); agentes antimaláricos como, por exemplo, cloroquina e hidro- xicloroquina; sulfasalazina; leflunomida; antagonistas de citocina como, por exemplo, anticorpos contra citocina ou anticorpos contra o receptor de cito- cina, incluindo anticorpos anti-interferon-alfa, -beta, ou -gama, anticorpos antifator de necrose tumoral (TNF)-alfa (infliximab (REMICADE®) ou adali- mumab), imunoadesina anti-TNF-alfa (etanercept), anticorpos anti-TNF-beta, anticorpos anti-interleucina-2 (IL-2) e anticorpos anti-IL-2 receptor e anticor- pos e antagonistas do receptor de anti-interleucina-6 (IL-6); anticorpos anti- LFA-1, incluindo anticorpos anti-CD11a e anti-CD18; anticorpos anti-L3T4; globulina heteróloga anti-linfócito; anticorpos pan-T, de preferência, pan-T anti-CD3 ou anti-CD4/CD4a; peptídeo solúvel contendo um domínio de liga- ção de LFA-3 (WO 90/08187 publicada em 7/26/90); estreptoquinase; fator de transformação de crescimento-beta (TGF-beta); estreptodornase; RNA ou DNA do hospedeiro; FK506; RS-61443;, clorambucil; desoxiespergualina; rapamicina; receptor de célula T (Cohen et al., Patente U.S. N° 5.114.721); fragmentos de receptor de célula T (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; laneway, Nature, 341: 482 (1989); e WO 91/01133); antagonistas de BAFF como, por exemplo, anticorpos contra BAFF e anti- corpos contra BR3 e antagonistas de zTNF4 (para uma revisão, veja Mackay e Mackay, Trends Immunol., 23: 113-5 (2002)); agentes biológicos que inter- ferem com os sinais de células T auxiliares, por exemplo, receptor anti-CD40 ou ligante anti-CD40 (CD154), incluindo anticorpos de bloqueio para o ligan- te CD40-CD40 (por exemplo, Durie et al., Science, 261: 1.328-30 (1993); Mohan et al, J. Immunol., 154: 1.470-80 (1995)) e CTLA4-lg (Finck et al., Science, 265: 1.225-7 (1994)); e anticorpos contra o receptor de célula T (EP 340,109) como, por exemplo, T10B9. Alguns agentes imunossupressores aqui apresentados também são DMARDs, por exemplo, metotrexato. Exem- plos de agentes imunossupressores preferidos neste pedido incluem ciclo- fosfamida, clorambucil, azatioprina, leflunomida, MMF ou metotrexato.
O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células que atuam em outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de citocinas são linfocinas, monocinas; interleuci- nas (ILs) como, por exemplo, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, incluindo PROLEUKIN® rlL-2; um fator de necrose tumoral como, por exemplo, TNF-α ou TNF-β; e outros fatores polipeptídicos, incluindo LIF e Iigante de kit (KL). Como aqui usado, o termo "citocina" inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equi- valentes biologicamente ativas das citocinas de seqüência nativa, incluindo entidades de pequena molécula produzidas sinteticamente e derivados e sais farmaceuticamente aceitáveis destas. Uma "antagonista de citocina" é uma molécula que inibe ou antagoniza essas citocinas por qualquer meca- nismo, incluindo, por exemplo, anticorpos para a citocina, anticorpos para o receptor de citocina e imunoadesinas.
O termo "hormônio" refere-se aos hormônios polipeptídicos, que são geralmente secretados por órgãos glandulares com duetos. Estão incluí- dos entre os hormônios, por exemplo, hormônios do crescimento como, por exemplo, o hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionila e hormônio do crescimento bovino; hormônio da parati- reoide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; estradiol; terapia de reposição hormonal; androgênios, tais como calusterona, propionato de dromostanolo- na, epitiostanol, mepitiostano ou testolactona; pró-relaxina; hormônios de glicoproteínas, tais como hormônio estimulante de folículos (FSH), hormônio estimulante da tireoide (TSH) e hormônio Iuteinizante (LH); prolactina, Iacto- gênio placentário, peptídeo associado à gonadotropina de camundongo, hormônio de liberação de gonadotropina; inibina; activina; substância inibido- ra de muller; e trombopoietina. Como aqui usado, o termo hormônio inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equi- valentes biologicamente ativos do hormônio de seqüência nativa, incluindo entidades de pequena molécula produzidas sinteticamente e derivados e sais farmaceuticamente aceitáveis destas.
O termo "fator de crescimento" refere-se às proteínas que pro- movem o crescimento, e incluem, por exemplo, fator de crescimento hepáti- co; fator de crescimento de fibroblastos; fator de crescimento vascular endo- telial; fatores de crescimento de nervos, tais como NGF-β; fator de cresci- mento derivado de plaquetas; fatores de transformação de crescimento (TGFs) como, por exemplo, TGF-α e TGF-β; fator de crescimento I e II tipo insulina; eritropoietina (EPO); fatores de indução óssea; interferons como, por exemplo, interferon-α, -β e -γ; e fatores de estimulação de colônias (CSFs), tais como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulócitos- macrófagos (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF). Como aqui usado, o termo "fator de crescimento" inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos do fator de crescimento de seqüência nativa, incluindo entidades de pequena molécula produzidas sinteticamente e derivados e sais farmaceuticamente aceitáveis destas.
O termo "integrina" refere-se a uma proteína receptora que permite que as células se liguem e respondam à matriz extracelular, e está envolvido em diversas funções celulares, tais como cicatrização de feridas, diferenciação celular, orientação de células tumorais e apoptose. Eles são parte de uma grande família de receptores da adesão celular que está en- volvida nas interações célula-matriz extracelular e célula-célula. Integrinas funcionais consistem em duas subunidades de glicoproteína transmembra- na, denominadas alfa e beta, que são ligadas de forma não-covalente. To- das as subunidades alfa compartilham alguma homologia entre si, assim como o fazem as subunidades beta. Os receptores sempre contêm uma ca- deia alfa e uma cadeia beta. Exemplos incluem Alfa6beta1, Alfa3beta1, Al- fa7beta1, LFA-1 etc. Como aqui usado, o termo "integrina" inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos da integrina de seqüência nativa, incluindo entidades de pequena molécula produzidas sinteticamente e derivados e sais farma- ceuticamente aceitáveis destes.
Para as finalidades deste pedido, "fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa)" refere-se a uma molécula de TNF-alfa humano que compreende a seqüência de aminoácidos descrita em Pennica et ai, Nature, 312: 721 (1984) ou Aggarwal et ai, JBC, 260: 2.345 (1985). Um "inibidor de TNF-alfa" é um agente que inibe, em alguma extensão, uma função biológica de TNF- alfa, geralmente através da ligação a TNF-alfa e neutralização de sua ativi- dade. Exemplos de inibidores do TNF especificamente contemplados pela invenção são etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®) e adalimu- mab (HUMIRA®).
Exemplos de "fármacos antirreumáticos modificadores da doen- ça" ou "DMARDs" incluem hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, Ie- flunomida, etanercept, infliximab (mais metotrexato oral e subcutâneo), aza- tioprina, D-penicilamina, sais de ouro (oral), sais de ouro (intramuscular), minociclina, ciclosporinas, incluindo ciclosporinas A e ciclosporinas tópicas, proteína estafilocócica A (Goodyear e Silverman, J. Exp. Med., 197, (9), p. 1.125-39 (2003)), incluindo sais e derivados destes etc. Um DMARD preferi- do nesta invenção é metotrexato.
Exemplos de "fármacos anti-inflamatórios não-esteroides" ou "NSAIDs" incluem aspirina, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, flurbiprofeno, naproxeno, indometacina, sulindac, tolmetin, fenilbutazona, diclofenaco, ce- toprofeno, benorilato, ácido mefenâmico, metotrexato, fenbufeno, azapropa- zona; inibidores da COX-2 como, por exemplo, celecoxib (CELEBREX®; 4- (5-(4-metilfenil)-3-(trifluormetil)-1H-pirazol-1-il)benzenossulfonamida, valde- coxib (BEXTRA®), meloxicam (MOBIC®), GR 253035 (Glaxo Wellcome); e MK966 (Merck Sharp & Dohme), incluindo sais e derivados destes etc. De preferência, eles são aspirina, naproxeno, ibuprofeno, indometacina ou tol- metina.
Exemplos de "antagonistas ou anticorpos de integrina" nesta in- venção incluem um anticorpo de LFA-1, por exemplo, efalizumab (RAPTI- VA®), disponível comercialmente por Genentech, ou um anticorpo contra integrina alfa 4 como, por exemplo, natalizumab (ANTEGREN®), disponível por Biogen, ou derivados da fenilalanina diazacíclica (WO 2003/89410), deri- vados de fenilalanina (WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 e WO 2003/53926), derivados do ácido fenilpropiônico (WO 2003/10135), deri- vados de enamina (WO 2001/79173), derivados do ácido propanoico (WO 2000/37444), derivados do ácido alcanoico (WO 2000/32575), derivados de fenila substituída (Patentes U.S. Nos 6.677.339 e 6.348.463), derivados de amina aromática (Patente U.S. N0 6.369.229), polipeptídeos do domínio de desintegrina ADAM (US2002/0042368), anticorpos para integrina alfa-beta3 (EP 633945), derivados do aminoácido bicíclico com ponte aza (WO 2002/02556) etc.
"Corticosteroide" refere-se a qualquer uma das várias substân- cias sintéticas ou de ocorrência natural com a estrutura química geral de es- teroides que mimetizam ou aumentam os efeitos dos corticosteroides de o- corrência natural. Exemplos de corticosteroides sintéticos incluem predniso- na, prednisolona (incluindo metilprednisolona como, por exemplo, succinato sódico de metilprednisolona SOLUMEDROL®), dexametasona ou dexameta- sona triancinolona, hidrocortisona e betametasona. Os corticosteroides pre- feridos nesta invenção são prednisona, metilprednisolona, hidrocortisona ou dexametasona.
Os termos "BAFF", "polipeptídeo BAFF", "TALL-1" ou "TALL-1 polipeptídeo" e "BLyS", quando usados nesta invenção, englobam "polipeptí- deos BAFF de seqüência nativa" e "variantes de BAFF". "BAFF" é uma de- signação dada àqueles polipeptídeos que possuem qualquer uma das se- qüências de aminoácidos mostradas abaixo: Seqüência de BAFF humano (SEQ. ID. N°: 16):
1 MDDSTEREQSRLTSCLKKREEMKLKECVSILPRKESPSVRSSKDGKLLAATLLLALLSCC 61 LTWSFYQVAALQGDLASLRAELQGHHAEKLPAGAGAPKAGLEEAPAVTAGLKIFEPPAP 121 GEGNSSQNSRNKRAVQGPEETVTQDCLQLIADSETPTIQKGSYTFVPWLLSFKRGSALEE 181 KENKILVKETGYFFIYGQVLYTDKTYAMGHLIQRKKVHVFGDELSLVTLFRCIQNMPETL 241 PNNSCYSAGIAKLEEGDELQLAIPRENAQISLDGDVTFFGALKLL Seqüência de BAFF de camundongo (SEQ. ID. N0:17): 1 MDESAKTLPPPCLCFCSEKGEDMKVGYDPITPQKEEGAWFGICRDGRLLAATLLLALLSS 61 SFTAMSLYQLAALQADLMNLRMELQSYRGSATPAAAGAPELTAGVKLLTPAAPRPHNSSR 121 GHRNRRAFQGPEETEQDVDLSAPPAPCLPGCRHSQHDDNGMNLRNIIQDCLQLIADSDTP 181 TIRKGTYTFVPWLLSFKRGNALEEKENKIWRQTGYFFIYSQVLYTDPIFAMGHVIQRKK 241 VHVFGDELSLVTLFRCIQNMPKTLPNNSCYSAGIARLEEGDEIQLAIPRENAQISRNGDD 301 TFFGALKLL
e homólogos e fragmentos e variantes destes que possuam a atividade biológica do BAFF nativo. Uma atividade biológica de BAFF pode ser selecionada do grupo que consiste em: promoção da sobrevida de célu- las B1 promoção da maturação de células B e ligação a BR3. As variantes de BAFF terão, de preferência, pelo menos 80% ou qualquer número inteiro sucessivo até 100%, incluindo, mais preferivelmente, pelo menos 90%, e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95% de identidade de seqüências de aminoácidos com uma seqüência nativa de um polipeptídeo BAFF.
Um polipeptídeo BAFF "de seqüência nativa" compreende um polipeptídeo que possui a mesma seqüência de aminoácidos que o polipep- tídeo BAFF correspondente derivado da natureza. Por exemplo, BAFF existe em uma forma solúvel após clivagem pela superfície celular por proteases do tipo furina. Esses polipeptídeos BAFF de seqüência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes e/ou sintéticos.
O termo "polipeptídeo BAFF de seqüência nativa" ou "BAFF na- tivo" engloba especificamente formas de ocorrência natural truncadas ou secretadas (por exemplo, uma seqüência do domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas unidas alternativamen- te), e variantes alélicas de ocorrência natural do polipeptídeo. O termo "BAFF" inclui aqueles polipeptídeos descritos em Shu et a/., J. Leukocyte Biol., 65: 680 (1999); N0 de Acesso no GenBank AF136293; WO 1998/18921, publicada em 7 de maio de 1998; E.P. 869,180, publicada em 7 de outubro de 1998; WO 1998/27114, publicada em 25 de junho de 1998; WO 1999/12964, publicada em 18 de março de 1999; WO 1999/33980, pu- blicada em 8 de julho de 1999; Moore et ai, Science, 285: 260-263 (1999); Schneider et ai., J. Exp. Med., 189: 1.747-1.756 (1999) e Mukhopadhyay et ai, J. Bioi Chem., 274: 15.978-15.981 (1999).
O termo "antagonista de BAFF", como utilizado nesta invenção, é usado no sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que: (1) se ligue a um polipeptídeo BAFF de seqüência nativa ou se ligue a uma seqüência na- tiva de BR3 para bloquear parcial ou totalmente a interação de BR3 com o polipeptídeo BAFF1 e (2) bloqueie, iniba ou neutralize parcial ou totalmente a atividade de BAFF de seqüência nativa. Em uma modalidade preferida, o receptor de BAFF a ser bloqueado é o receptor BR3. A atividade de BAFF nativo promove, dentre outras coisas, a sobrevida de células B e/ou a matu- ração de células B. Em uma modalidade, a inibição, o bloqueio ou a neutrali- zação da atividade de BAFF resulta em uma redução no número de células B. Um antagonista de BAFF de acordo com esta invenção bloqueará, inibirá ou neutralizará, parcial ou totalmente, uma ou mais atividades biológicas de um polipeptídeo BAFF, in vitro e/ou in vivo. Em uma modalidade, um BAFF biologicamente ativo potencializa qualquer um ou uma combinação dos se- guintes eventos in vitro e/ou in vivo: um aumento da sobrevida de células B, 10 um aumento do nível de IgG e/ou IgM, um aumento dos números de células plasmáticas e processamento de NF-Kb2/100 em p52 NF-Kb em células B esplênicas (por exemplo, Batten et ai, J. Exp. Med. 192: 1.453-1.465 (2000); Moore et ai, Science 285: 260-263 (1999); Kayagaki et ai Immunity 17: 515- 524 (2002)).
Como mencionado anteriormente, um antagonista de BAFF po- de funcionar de forma direta ou indireta para bloquear, inibir ou neutralizar, parcial ou totalmente, a sinalização de BAFF, in vitro ou in vivo. Por exem- plo, o antagonista de BAFF pode se ligar diretamente ao BAFF. Por exem- plo, anticorpos para BAFF que se ligam dentro de uma região de BAFF hu- mano que compreende os resíduos 162-275 e/ou um resíduo vizinho ao re- síduo selecionado do grupo que consiste em 162, 163, 206, 211, 231, 233, 264 e 265 de BAFF humano de tal forma que o anticorpo impede esterica- mente a ligação de BAFF a BR3 são contemplados, em que esses números de resíduo referem-se ao SEQ. ID. N0: 16. Em outro exemplo, um Iigante direto é um polipeptídeo que compreende qualquer porção de um receptor de BAFF que se liga a BAFF como, por exemplo, um domínio extracelular de um receptor de BAFF, ou fragmentos e variantes deste que se ligam ao BAFF nativo. Em outro exemplo, antagonistas de BAFF incluem os polipep- tídeos que possuem uma seqüência de um polipeptídeo que compreende a seqüência de Fórmula I:
X1-C-X3-D-X5-L-X7-X8-X9-Xio-Xii-X^-C-X14-X15-X16-X17 (Fórmula I) (SEQ. ID. N°: 18) em que Χι, X3, Xs> X7. Χβ. X9. X10. X11. X12. X14, X15 e X17 são qualquer aminoácido, exceto cisteína; e
em que X16 é um aminoácido selecionado do grupo que consis- te em L1 F11 e V; e
em que o polipeptídeo não compreende uma cisteína dentro do terminal N de sete resíduos de aminoácidos até o C da cisteína mais ao ter- minal N e terminal C até o C da cisteína mais ao terminal C de Fórmula I.
Em uma modalidade, um polipeptídeo que compreende a se- qüência de Fórmula I tem os dois Cs unidos por pontes de dissulfeto; X5LX7X8 formando a conformação de uma estrutura de giro beta do tipo I, com o centro do giro entre L e X7; e tem um ângulo positivo para o ângulo diédrico phi de Xe. Em uma modalidade, X10 é selecionado do grupo que con- siste em W, F, V, L, I, Υ, M e um aminoácido apoiar. Em outra modalidade, X10 é W. Em outra modalidade, X3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Μ, V, L, I, Y, F1 W e um aminoácido apoiar. Em outra modalidade, X5 é selecionado do grupo que consiste em V, L1 P, S, I, A e R. Em outra mo- dalidade, X7 é selecionado do grupo que consiste em V, Τ, I e L. Em outra modalidade, Xe é selecionado do grupo que consiste em R, K1 G, Ν, H e um D-aminoácido. Em outra modalidade, Xg é selecionado do grupo que consiste em Η, K, A, R e Q. Em outra modalidade, Xn é I ou V. Em outra modalidade, X12 é selecionado do grupo que consiste em P, A, D, E e S. Em outra modali- dade, X16 é L. Em uma modalidade específica, a seqüência de Fórmula I é uma seqüência selecionada do grupo que consiste em ECFDLLVRAWVPCS- VLK (SEQ. ID. N°: 19), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ. ID. N0: 20), ECFDL- 25 LVRRWVPCEMLG (SEQ. ID. N0: 21), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ. ID. N0: 22), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ. ID. N0: 23), e QCFDRLNAWVPCS- VLK (SEQ. ID. N0: 24). Em uma modalidade preferida, o antagonista de BAFF compreende qualquer uma das seqüências de aminoácidos selecio- nadas do grupo que consiste na SEQ. ID. N0: 19, 20, 21, 22 e 23.
Ainda em outro exemplo, os antagonistas de BAFF incluem os polipeptídeos que possuem uma seqüência de um polipeptídeo que compre- ende a seqüência de Fórmula II: X1-C-X3-D-X5-L-V-X8-X9-W-V-P-C-Xi4-Xi5-L-Xi7 (Fórmula II) (SEQ. ID. N0: 25)
em que X1, X3, X5, X8, X9, X14, X15 e X17 são qualquer aminoáci- do, exceto cisteína; e
em que o polipeptídeo não compreende uma cisteína dentro do terminal N de sete resíduos de aminoácidos até o C da cisteína mais ao ter- minal N e terminal C até o C da cisteína mais ao terminal C de Fórmula II.
Em uma modalidade, um polipeptídeo que compreende a se- qüência de Fórmula II tem uma ligação de dissulfeto entre os dois Cs e tem a conformação de X5LX7X8 formando uma estrutura de giro beta do tipo I com o centro do giro entre L e X7; e tem um ângulo positivo para o ângulo diédrico phi de X8. Em outra modalidade de Fórmula II, X3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Μ, A, V, L, I, Y, F, W e um aminoáci- do apoiar. Em outra modalidade de Fórmula II, X5 é selecionado do grupo que consiste em V, L, P, S, I, A e R. Em outra modalidade de Fórmula II, X8 é selecionado do grupo que consiste em R1 K, G, Ν, H e D-aminoácido. Em outra modalidade de Fórmula II, X9 é selecionado do grupo que consiste em H, K, A, R e Q.
Em uma modalidade adicional, o receptor de BAFF do qual o domínio extracelular ou fragmento de ligação de BAFF ou variante de liga- ção de BAFF deste é derivado é TACI, BR3 ou BCMA. Alternativamente, o antagonista de BAFF pode se ligar a um domínio extracelular de uma BR3 de seqüência nativa em sua região de ligação de BAFF para bloquear, inibir ou neutralizar, parcial ou totalmente, BAFF ligação a BR3 in vitro, in situ, ou in vivo. Por exemplo, esse antagonista indireto é um anticorpo anti-BR3 que se liga a uma região de BR3 que compreende os resíduos 23-38 de BR3 humano, como definido abaixo (SEQ. ID. N0: 26) ou uma região vizinha da- queles resíduos, de tal forma que a ligação de BR3 humano ao BAFF é este- ricamente impedida.
Em algumas modalidades, um antagonista de BAFF de acordo com esta invenção inclui anticorpos para BAFF e imunoadesinas que com- preendem um domínio extracelular de um receptor de BAFF, ou fragmentos e variantes deste que se ligam ao BAFF nativo. Em uma modalidade adicio- nal, o receptor de BAFF do qual o domínio extracelular ou fragmento de liga- ção de BAFF ou variante de ligação de BAFF deste é derivado é TACI, BR3 ou BCMA. Ainda em outra modalidade, a imunoadesina compreende uma seqüência de aminoácidos daquelas de Fórmula I ou Fórmula II, como apre- sentado acima, incluindo uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma do grupo que consiste nas SEQ. ID. Nos: 19, 20, 21, 22, 23 e 24.
De acordo com uma modalidade, o antagonista de BAFF se liga a um polipeptídeo BAFF ou a um polipeptídeo BR3 com uma afinidade de ligação de 100 nM ou menos. De acordo com outra modalidade, o antagonis- ta de BAFF se liga a um polipeptídeo BAFF ou a um polipeptídeo BR3 com uma afinidade de ligação de 10 nM ou menos. De acordo ainda com outra modalidade, o antagonista de BAFF se liga a um polipeptídeo BAFF ou a um polipeptídeo BR3 com uma afinidade de ligação de 1 nM ou menos.
Os termos "BR3", "polipeptídeo BR3" ou "receptor BR3", quando usados nesta invenção, englobam "polipeptídeos BR3 de seqüência nativa" e "variantes de BR3" (que serão aqui definidos posteriormente). "BR3" é uma designação dada àqueles polipeptídeos que compreendem a seguinte se- quência de aminoácidos e homólogos desta, e variantes ou fragmentos des- ta que se ligam ao BAFF nativo: Seqüência de BR3 humano (SEQ. ID. N0: 26):
1 MRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQ 61 ESVGAGAGEAALPLPGLLFGAPALLGLALVLALVLVGLVSWRRRQRRLRGASSAEAPDGD 121 KDAPEPLDKVIILSPGISDATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATELGSTELVTTKTAG 181 PEQQ.
Os polipeptídeos BR3 da invenção podem ser isolados de vá- rias fontes, por exemplo, de vários tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos. O termo "BR3" inclui o polipeptídeos BR3 descrito em WO 2002/24909 e WO 2003/14294.
Um polipeptídeo BR3 "de seqüência nativa" ou "BR3 nativo" compreende um polipeptídeo que possui a mesma seqüência de aminoáci- dos que o polipeptídeo BR3 correspondente derivado da natureza. Esses polipeptídeos BR3 de seqüência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes e/ou sintéticos. O termo "polipeptídeo BR3 de seqüência nativa" engloba especificamente formas de ocorrência natural truncadas, solúveis ou secretadas (por exemplo, uma se- qüência do domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas unidas alternativamente) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipeptídeo. Os polipeptídeos BR3 da invenção incluem o poli- peptídeo BR3 que compreende ou consiste na seqüência de resíduos de aminoácidos contíguos 1 a 184 de um BR3 humano (SEQ. ID. N0: 26).
Um "domínio extracelular" de BR3 ou "ECD" refere-se a uma forma do polipeptídeo BR3 que é essencialmente livre dos domínios trans- membrana e citoplasmáticos. As formas de ECD de BR3 incluem um poli- peptídeo que compreende qualquer uma das seqüências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste nos aminoácidos 1-77, 2-62, 2-71, 1-61, 7-71, 23-38 e 2-63 de BR3 humano. A invenção contempla antagonistas de BAFF que são polipeptídeos que compreendem qualquer uma das formas de ECD de BR3 humano e variantes e fragmentos destes citados acima que se ligam a um BAFF nativo.
Mini-BR3 é uma região central de 26 resíduos do domínio de li- gação de BAFF de BR3, ou seja, a seqüência de aminoácidos: TPCVPA- ECFDLLVRHCVACGLLRTPR (SEQ. ID. N0: 27).
O termo "variante de BR3" significa um polipeptídeo BR3 que possui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüências de aminoáci- dos com a seqüência de aminoácidos de um BR3 de seqüência nativa, de comprimento total, ou ECD de BR3, e se liga a um polipeptídeo BAFF de seqüência nativa. Opcionalmente, a variante de BR3 inclui um domínio único rico em cisteína. Tais polipeptídeos de variante de BR3 incluem, por exem- pio, polipeptídeos BR3 em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou eliminados, no término N e/ou C, bem como dentro de um ou mais domínios internos, da seqüência de aminoácidos de comprimento total. Fragmentos do ECD de BR3 que se ligam a um polipeptídeo BAFF de seqüência nativa também são contemplados. De acordo com uma modalida- de, um polipeptídeo de variante de BR3 terá pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 81% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 82% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 83% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 84% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 85% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 86% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 87% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 88% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 89% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 90% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 91% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 92% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 93% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 94% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 95% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 96% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 97% de dentidade de seqüências de aminoácidos, pelo menos cerca de 98% de dentidade de seqüências de aminoácidos ou pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüências de aminoácidos com um polipeptídeo BR3 huma- no ou um fragmento especificado deste (por exemplo, ECD). Os polipeptí- deos de variante de BR3 não englobam a seqüência nativa do polipeptídeo BR3. De acordo com outra modalidade, os polipeptídeos de variante de BR3 possuem comprimento de pelo menos cerca de 10 aminoácidos, comprimen- to de pelo menos cerca de 20 aminoácidos, comprimento de pelo menos cerca de 30 aminoácidos, comprimento de pelo menos cerca de 40 aminoá- cidos, comprimento de pelo menos cerca de 50 aminoácidos, comprimento de pelo menos cerca de 60 aminoácidos ou comprimento de pelo menos cerca de 70 aminoácidos. Em uma modalidade preferida, os antagonistas de BAFF aqui apresentados são imunoadesinas que compreendem uma porção de BR3, TACI ou BCMA que se liga a BAFF1 ou variantes destes que se ligam a BAFF. Em outras modalidades, o antagonista de BAFF é um anticorpo para BAFF. Um "anticorpo para BAFF" é um anticorpo que se liga a BAFF e, de preferência, se liga a BAFF dentro de uma região do BAFF humano que compreende os resíduos 162-275 da seqüência de BAFF humano aqui des- crita sob a definição de "BAFF" (SEQ. ID. N0: 16). Em outra modalidade, o antagonista de BAFF é um anticorpo para BR3. Um "anticorpo para BR3" é um anticorpo que se liga a BR3, e é, de preferência, um que se liga a BR3 dentro de uma região de BR3 humano que compreende os 23-38 da se- qüência de BR3 humano aqui descrita sob a definição de "BR3" (SEQ. ID. N0: 26). Em geral, as posições de aminoácidos de BAFF humano e de BR3 humano aqui citadas estão de acordo com a numeração de seqüências sob BAFF humano e BR3 humano, SEQ. ID. Nos: 16 e 26, respectivamente, aqui descritas sob as definições de "BAFF" e de "BR3".
Outros exemplos de polipeptídeos de ligação de BAFF ou anti- corpos para BAFF podem ser encontrados, por exemplo, em WO 2002/092620, WO 2003/014294, Gordon et a/., Biochemistry 42(20): 5.977- 5.983 (2003), Kelley et ai, J. Bioi Chem. 279 (16): 16.727-16.735 (2004), WO 1998/18921, WO 2001/12812, WO 2000/68378 e WO 2000/40716.
Uma "bula" é usada para se referir às instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, con- traindicações, outros produtos terapêuticos a serem combinados com o pro- duto embalado e/ou avisos em relação ao uso desses produtos terapêuticos etc.
Um "medicamento" é um fármaco ativo para tratar a lesão arti- cular ou seus sintomas ou efeitos colaterais. II. Terapia
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de lesão articular em um indivíduo, por exemplo, um paciente, que compreende a administração de um antagonista, de preferência, um anticorpo, que se liga a um marcador de superfície das células B (mais pre- ferivelmente um anticorpo CD20) ao indivíduo, e a avaliação por exame ra- diográfico (raios X) de se o indivíduo apresentou uma redução da lesão arti- cular com o tratamento.
Dessa forma, a invenção contempla um método para o trata- mento de lesão articular em um indivíduo que compreende a administração de um antagonista que se liga a um marcador de superfície das células B ao indivíduo, e aplicar no indivíduo, pelo menos cerca de um mês após a admi- nistração, de um exame radiográfico que mede uma redução na lesão articu- lar, comparado com os níveis de base antes da administração, em que a quantidade de antagonista administrada é eficaz na obtenção de uma redu- ção na lesão articular, indicando que o indivíduo foi tratado com sucesso da lesão articular.
A invenção também contempla um método para o tratamento de lesão articular em um indivíduo que compreende a administração de um anticorpo que se liga a um marcador de superfície das células B ao indiví- duo, e aplicar no indivíduo, pelo menos cerca de um mês após a administra- ção, de um exame radiográfico que mede uma redução na lesão articular, comparado com os níveis de base antes da administração, em que a quanti- dade de anticorpo administrada é eficaz na obtenção de uma redução na lesão articular, indicando que o indivíduo foi tratado com sucesso da lesão articular.
A invenção ainda contempla um método para o tratamento de lesão articular em um indivíduo que compreende a administração de um an- ticorpo CD20 ao indivíduo, e aplicar no indivíduo, pelo menos cerca de um mês após a administração, de um exame radiográfico que mede uma redu- ção na lesão articular, comparado com os níveis de base antes da adminis- tração, em que a quantidade de anticorpo CD20 administrada é eficaz na obtenção de uma redução na lesão articular, indicando que o indivíduo foi tratado com sucesso da lesão articular.
Em uma modalidade preferida, o exame radiográfico após a administração do antagonista ou do anticorpo como, por exemplo, anticorpo CD20, ocorre pelo menos cerca de dois meses, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 semanas, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de três meses, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de quatro me- ses, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de cinco meses, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 24 semanas ou, pelo menos, cer- ca de seis meses e, principalmente, pelo menos cerca de 52 semanas, após a administração do antagonista ou do anticorpo. Em outra modalidade prefe- rida, o exame mede uma classificação de Sharp modificada total.
Em outra modalidade preferida, o indivíduo é tratado novamen- te e, portanto, o método ainda compreende a administração ao indivíduo de um antagonista ou anticorpo como, por exemplo, anticorpo CD20, em uma quantidade eficaz para obter uma redução contínua ou mantida da lesão ar- ticular, comparado com o efeito de uma administração prévia do antagonista ou anticorpo como, por exemplo, o anticorpo CD20. Dessa forma, o indivíduo pode receber a administração de uma segunda dosagem do antagonista ou anticorpo e é avaliado por exame radiográfico pelo menos cerca de um mês (e, de preferência, mais do que cerca de dois meses, mais preferivelmente cerca de 24 semanas ou cerca de 6 meses) após essa segunda dosagem para determinar se a segunda dosagem é eficaz (ou seja, uma quantidade eficaz do antagonista ou anticorpo é administrada) para manter os efeitos da primeira dosagem ou aumentar a redução da lesão articular, comparado com o efeito da primeira dosagem. Esse regime de retratamento pode ser repeti- do da forma desejada ou necessária para se obter ou manter a redução da lesão articular, o que indica o tratamento bem-sucedido da lesão articular.
Em outra modalidade, o antagonista ou anticorpo como, por e- xemplo, anticorpo CD20, é adicionalmente (continua a ser) administrado ao indivíduo, mesmo se não há uma melhora clínica no indivíduo no momento do exame radiográfico, após uma administração anterior, por exemplo, a primeira administração do antagonista ou do anticorpo. Nessa última modali- dade, de preferência, a melhora clínica é determinada por avaliação do nú- mero de articulações sensíveis ou edemaciadas, do índice de Avaliação da Gravidade de Psoríase, uma avaliação clínica global do indivíduo, avaliação da velocidade de sedimentação de eritrócitos ou avaliação da quantidade do nível de proteína C reativa.
Para as finalidades desta invenção, a segunda exposição ao antagonista ou ao anticorpo para retratamento ocorre logo após o indivíduo ter sido tratado com o antagonista ou, por exemplo, anticorpo CD20, após a exposição inicial ao anticorpo, não havendo antagonista interferente ou, por exemplo, tratamento ou exposição ao anticorpo CD20 entre a exposição ini- cial e a segunda exposição. Esse retratamento pode ser programado ou não-programado, mas é preferivelmente uma redosagem programada, parti- cularmente proteger os órgãos, por exemplo, os rins, contra lesões. Caso um anticorpo, especialmente um anticorpo CD20, seja empregado, de preferên- cia, a segunda exposição ao anticorpo é de cerca de 0,5 a 4 gramas, mais preferivelmente cerca de 1,5 a 3,5 gramas, ainda mais preferivelmente cerca de 1,5 a 2,5 gramas, a segunda exposição não sendo efetuada até cerca de 20 a 35 semanas (de preferência, cerca de 23 a 30, mais preferivelmente cerca de 23 a 28 semanas) a partir da exposição inicial.
O método contempla a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do antagonista ou, por exemplo, anticorpo CD20, para for- necer uma terceira exposição ao antagonista ou ao anticorpo (se anticorpo, mais preferivelmente anticorpo CD20), de preferência, de cerca de 0,5 a 4 gramas, mais preferivelmente cerca de 1,5 a 3,5 gramas, ainda mais preferi- velmente cerca de 1,5 a 2,5 gramas), a terceira exposição não sendo efetu- ada até cerca de 46 a 60 semanas (de preferência, cerca de 46 a 55, mais preferivelmente, cerca de 46 a 52 semanas) a partir da exposição inicial. De preferência, nenhuma exposição adicional ao antagonista ou ao anticorpo é efetuada até pelo menos cerca de 70-75 semanas a partir da exposição ini- cial e, ainda mais preferivelmente, nenhuma exposição adicional ao antago- nista ou ao anticorpo é efetuada até cerca de 74 a 80 semanas a partir da exposição inicial.
Quando for empregado um anticorpo, qualquer uma ou mais das exposições ao anticorpo podem ser efetuadas ao indivíduo como uma dose única de anticorpo, ou como doses separadas, por exemplo, cerca de 1-4 doses separadas do anticorpo (por exemplo, constituindo uma primeira e uma segunda doses, ou uma primeira, segunda e terceira doses, ou uma primeira, segunda, terceira e quarta doses etc.). O número específico de do- ses (seja uma, duas ou três ou mais) empregado para cada exposição ao anticorpo depende, por exemplo, do tipo de lesão articular tratada, do tipo de anticorpo empregado, de se há o emprego de um segundo medicamento e, caso haja, do seu tipo e de quantos e qual a quantidade usada, como obser- vado abaixo, e do método e da freqüência de administração. Quando são administradas doses separadas, a última dose (por exemplo, a segunda ou a terceira dose) é administrada, de preferência, após cerca de 1 a 20 dias, mais preferivelmente após cerca de 6 a 16 dias e, principalmente, após cer- ca de 14 a 16 dias do momento em que a dose prévia foi administrada. As doses separadas são administradas, de preferência, em um período total entre cerca de 1 dia e 4 semanas, mais preferivelmente entre cerca de 1 e 20 dias (por exemplo, em um período de 6-18 dias). Nesse aspecto, as do- ses separadas são administradas semanalmente, com a segunda dose sen- do administrada aproximadamente uma semana após a primeira dose, e uma terceira dose ou doses subsequentes sendo administradas cerca de uma semana após a segunda dose. Cada dose separada do anticorpo é, de preferência, de cerca de 0,5 a 1,5 grama, mais preferivelmente, de cerca de 0,75 a 1,3 grama.
Na modalidade mais preferida, é fornecido um método de tra- tamento de lesão articular em um indivíduo que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga a um marcador de superfície das células B (por exemplo, um anticorpo CD20) ao indivíduo para fornecer uma exposição inicial ao anticorpo, seguida por uma segunda ex- posição ao anticorpo, em que a segunda exposição não é fornecida até que se passem de 16 a 54 semanas a partir da exposição inicial, e cada uma das exposições ao anticorpo é fornecida ao indivíduo como uma dose única ou como duas ou três doses separadas de anticorpo. De preferência, nesse método, as exposições ao anticorpo são de cerca de 0,5 a 4 gramas cada e, principalmente, as quantidades apresentadas acima.
Em uma modalidade, o indivíduo recebe pelo menos cerca de três exposições do anticorpo, por exemplo, de cerca de 3 a 60 exposições e, mais particularmente, cerca de 3 a 40 exposições, mais particularmente, cerca de 3 a 20 exposições. De preferência, essas exposições são adminis- tradas em intervalos a cada 24 semanas. Em uma modalidade, cada exposi- ção ao anticorpo é feita como uma dose única do anticorpo. Em uma moda- lidade alternativa, cada exposição ao anticorpo é feita como doses separa- das do anticorpo. No entanto, nem toda exposição ao anticorpo precisa ser feita como uma dose única ou como doses separadas.
Em uma modalidade preferida, cerca de 2-3 gramas do anticor- po CD20 são administrados como a exposição inicial. Caso cerca de 3 gra- mas sejam administrados, então cerca de 1 grama do anticorpo CD20 é ad- ministrado semanalmente por cerca de três semanas como a exposição ini- ciai. Caso cerca de 2 gramas do anticorpo CD20 sejam administrados como a exposição inicial, então cerca de 1 grama do anticorpo CD20 é administra- do, seguida em cerca de duas semanas por mais cerca de 1 grama do anti- corpo como a exposição inicial. Em um aspecto preferido, a segunda exposi- ção ocorre cerca de 24 semanas ou seis meses a partir da exposição inicial, e é administrada em uma quantidade de cerca de 2 gramas. Em um aspecto alternativo preferido, a segunda exposição ocorre cerca de 24 semanas ou seis meses a partir da exposição inicial, e é administrada como cerca de 1 grama do anticorpo, seguida por cerca de duas semanas por mais cerca de 1 grama do anticorpo.
Em uma modalidade preferida do método de multiexposições aqui apresentado, o indivíduo está em remissão após a exposição inicial ou quaisquer exposições posteriores do antagonista ou ao anticorpo. Mais pre- ferivelmente, o método de multiexposições aqui apresentado envolve uma redosagem ou retratamento programado, de tal forma que o indivíduo esteja em remissão quando fornecida a segunda e, de preferência, todas as expo- sições ao antagonista ou anticorpo. Essa redosagem é programada para evitar qualquer recidiva, recorrência ou lesão orgânica, e não para tratá-lo terapeuticamente. Mais preferivelmente, o indivíduo está em remissão por pelo menos cerca de 24 semanas ou seis meses e, ainda mais preferivel- mente, pelo menos cerca de nove meses e, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 52 semanas ou um ano desde a última exposição ao anta- gonista ou ao anticorpo usado no método de retratamento.
Ainda em outra modalidade, o indivíduo é tratado com o mesmo antagonista ou anticorpo, por exemplo, anticorpo CD20, por pelo menos du- as exposições ao antagonista ou anticorpo e, de preferência, para cada ex- posição ao antagonista ou ao anticorpo. Dessa forma, a exposição inicial e a segunda exposição ao antagonista ou anticorpo são, de preferência, com o mesmo antagonista ou anticorpo e, mais preferivelmente, todas as exposi- ções ao antagonista ou anticorpo são com o mesmo antagonista ou anticor- po, ou seja, o tratamento para as primeiras duas exposições e, de preferên- cia, todas as exposições, é feito com um tipo de antagonista ou anticorpo que se liga a um marcador de superfície das células B, por exemplo, o anti- corpo CD20, por exemplo, todas com rituximab ou todas com o mesmo 2H7 humanizado.
Em todos os métodos da invenção aqui apresentados, o anta- gonista (por exemplo, o anticorpo CD20 ou marcador de superfície das célu- las B) pode ser não-conjugado como, por exemplo, um anticorpo "naked", ou pode ser conjugado a outra molécula para aumento da eficácia, como, por exemplo, para aumentar a meia-vida. O anticorpo CD20 aqui preferido é um anticorpo CD20 quimérico, humanizado ou humano, mais preferivelmente rituximab, um 2H7 humanizado (por exemplo, que compreende as sequên- cias do domínio variável nas SEQ. ID. Nos: 2 e 8, ou é 2H7 humanizado que compreende as seqüências do domínio variável nas SEQ. ID. Nos: 39 e 40, ou que compreende as seqüências do domínio variável nas SEQ. ID. Nos: 32 e 33, ou que compreende um domínio variável da cadeia pesada com altera- ção N100A, ou D56A e N100A, ou D56A, N100Y, e SIOOaR na SEQ. ID. N0: 8 e um domínio variável da cadeia leve com alteração M32L, ou S92A, ou M32L e S92A na SEQ. ID. N0: 2), anticorpo A20 quimérico ou humanizado (Immunomedics)1 anticorpo CD20 humano HUMAX-CD20® (Genmab) ou proteínas de cadeia única que se ligam a CD20 (Trubion Pharm Inc.). Prefe- re-se ainda mais rituximab ou um 2H7 humanizado.
Em uma modalidade adicional de todos os métodos aqui apre- sentados, o indivíduo nunca foi tratado previamente com um ou mais fárma- cos, por exemplo, com um inibidor anti-TNF-alfa, por exemplo, um anticorpo para o receptor anti-TNF-alfa ou anti-TNF-alfa, para tratar, por exemplo, artri- te, ou com agentes imunossupressores para tratar a lesão articular ou uma causa subjacente como, por exemplo, um distúrbio autoimune, e/ou nunca foi tratado previamente com um antagonista (por exemplo, anticorpo) para um marcador de superfície das células B (por exemplo, nunca foi tratado previamente com um anticorpo CD20). Em uma dessas modalidades, o indi- víduo nunca foi tratado previamente com um anticorpo de integrina anti-alfa 4 ou um modulador da coestimulação, um agente biológico, um DMARD di- ferente de MTX, exceto azatioprina e/ou leflunomida, uma terapia de elimi- nação de células, incluindo agentes em investigação (por exemplo, CAMPA- TH, anti-CD4, anti-CD5, anti-CD3, anti-CD19, anti-CD11a, anti-CD22, ou BLys/BAFF), uma vacina de vírus vivo/atenuado em até 28 dias antes do nível de base, ou gIicocorticoides intra-articulares ou parenterais em até 4 semanas antes do nível de base.
Ainda em um aspecto adicional, o indivíduo pode ter apresenta- do recidiva da lesão articular ou ter sofrido lesão orgânica como, por exem- plo, lesão renal, antes de ser tratado por qualquer um dos métodos acima, incluindo após a exposição inicial ou uma exposição posterior ao antagonista ou ao anticorpo. No entanto, de preferência, o indivíduo apresentou recidiva da lesão articular e, mais preferivelmente, não teve essa recidiva antes, pelo menos, do tratamento inicial.
Em outra modalidade, o antagonista (por exemplo, anticorpo CD20) é o único medicamento administrado ao indivíduo para tratar a lesão articular. Em outra modalidade, o antagonista (por exemplo, anticorpo CD20) é um dos medicamentos usados para tratar a lesão articular. Em uma moda- lidade adicional, o indivíduo não possui uma doença maligna, incluindo tu- mores sólidos, doenças hematológicas malignas ou carcinoma in situ (exceto carcinoma de célula basal e de células escamosas da pele que foi removido e curado). Ainda em outra modalidade adicional, o indivíduo não possui artri- te reumatoide (RA). Em outro aspecto, o indivíduo não possui outra doença reumática autoimune além de RA, ou o envolvimento sistêmico significativo secundário a RA (incluindo, sem limitação, vasculite, fibrose pulmonar ou síndrome de Felty). Em outra modalidade, o indivíduo possui síndrome de Sjõgren secundária ou vasculite cutânea limitada secundária. Em outra mo- dalidade, o indivíduo não possui AR funcional da classe IV, como definida pela Classificação do Nível Funcional na RA do ACR. Em uma modalidade adicional, o indivíduo não possui outra doença articular inflamatória além da RA (incluindo, sem limitação, gota, artrite reativa, artrite psoriática, espondi- lo-artropatia soronegativa, doença de Lyme), ou outro distúrbio autoimune sistêmico (incluindo, sem limitação, lúpus eritematoso sistêmico, doença in- flamatória do intestino, esclerodermia, miopatia inflamatória, doença mista do tecido conjuntivo, ou qualquer síndrome sobreposta). Em outra modalida- de, o indivíduo não possui artrite juvenil idiopática (JIA) ou RA juvenil (JRA) e/ou RA antes dos 16 anos de idade. Em outra modalidade, o indivíduo não possui doença cardíaca ou pulmonar significativa e/ou não-controlada (inclu- indo doença pulmonar obstrutiva), ou doença concomitante significativa, in- cluindo, se limitação, distúrbios do sistema nervoso, renais, hepáticos, endó- crinos ou gastrointestinais, imunodeficiência primária ou secundária (história de, ou ativa atualmente), incluindo história conhecida de infecção pelo HIV. Em outro aspecto, o indivíduo não possui nenhum distúrbio neurológico (congênito ou adquirido), vascular ou sistêmico, que poderia afetar qualquer uma das avaliações da eficácia, em particular, dor e edema articulares (por exemplo, doença de Parkinson, paralisia cerebral, neuropatia diabética). A- inda em outra modalidade adicional, o indivíduo não possui esclerose múlti- pla. Ainda em outra modalidade adicional, o indivíduo não possui lúpus ou síndrome de Sjõgren. Em ainda outra modalidade, o indivíduo não possui uma doença autoimune. Ainda em outro aspecto da invenção, a lesão articu- lar não-está associada a uma doença autoimune ou a uma doença autoimu- ne além de artrite, ou com um risco de desenvolvimento de uma doença au- toimune ou uma doença autoimune além de artrite. Em relação a essas últi- mas afirmativas, uma "doença autoimune" nessa especificação é uma doen- ça ou um distúrbio que surge e é dirigido contra os próprios tecidos ou ór- gãos de um indivíduo ou uma conseqüência ou manifestação desta ou resul- tante dessa condição. Sem se prender a uma teoria, as células B demons- tram um efeito patogênico em doenças autoimunes humanas através de vá- rios mecanismos, incluindo a produção de auto-anticorpos, formação de complexos imunes, ativação de células dendríticas e de células T, síntese de citocinas, liberação direta de quimiocina e fornecimento de um nicho para neo-linfogênese ectópica. Cada uma dessas vias participa em graus diferen- tes da patologia das doenças autoimunes.
Em uma modalidade preferida, a lesão articular é causada por artrite, deslocamento articular asséptico de implantes ortopédicos, não- consolidação de uma fratura, espondiloartropatias, psoríase ou doença de Crohn. Mais preferivelmente, a lesão articular é causada por artrite, que é, de preferência, artrite reumatoide, osteoartrite, espondilite anquilosante ou artrite psoriática.
Ainda em modalidades adicionais, caso o antagonista seja um anticorpo, o anticorpo será administrado por via intravenosa ou subcutânea.
Ainda em aspectos preferidos, caso o antagonista seja um anti- corpo, o anticorpo será administrado em uma dose de cerca de 0,4 a 4 gra- mas, mais preferivelmente cerca de 1,5 a 3,5 gramas, ainda mais preferivel- mente cerca de 1,5 a 2,5 gramas. Em outro aspecto, o anticorpo é adminis- trado, de preferência, em uma dose de cerca de 0,4 a 1,3 grama, em uma freqüência de uma a quatro doses em um período de cerca de um mês, mais preferivelmente cerca de 500 mg a 1,2 grama, ainda mais preferivelmente cerca de 500 mg ou cerca de 750 mg a cerca de 1,1 grama e, mais preferi- velmente, o anticorpo é administrado em duas a três doses. Ainda mais pre- ferivelmente, o anticorpo é administrado em um período de cerca de 2 a 3 semanas.
Em outro aspecto preferido, o indivíduo é fator reumatoide- negativo. Em outro aspecto, o indivíduo é fator reumatoide-positivo. Em outro aspecto preferido do método descrito acima, o indiví- duo recebeu a administração de metotrexato antes do nível de base ou do início do tratamento. Mais preferivelmente, o metotrexato foi administrado em uma dose de cerca de 10-25 mg/semana. Além disso, de preferência, o metotrexato foi administrado por pelo menos cerca de 12 semanas antes do nível de base e, ainda mais preferivelmente, o metotrexato foi administrado em uma dose estável nas últimas quatro semanas antes do nível de base. Em outras modalidades, o metotrexato foi administrado por via oral ou pa- renteral.
Em modalidades particularmente preferidas do método identifi- cado acima, a lesão articular é causada por artrite reumatoide e o indivíduo apresentou uma resposta inadequada a um ou mais inibidores antifator de necrose tumoral (TNF), e/ou metotrexato é administrado ao indivíduo em conjunto com o antagonista, por exemplo, anticorpo CD20, e/ou o antagonis- ta é um anticorpo CD20 que é administrado em uma dose de cerca de 1.000 mg χ 2 no 1o e 15° dias por via intravenosa no início do tratamento.
Ainda em modalidades adicionais, a invenção fornece um mé- todo de monitoramento do tratamento de lesão articular em um indivíduo que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de um marcador de superfície das células B (por exemplo, um anticorpo con- tra ele, incluindo um anticorpo CD20) ao indivíduo, e a determinação por ra- diografias, após pelo menos cerca de um mês após a administração, se a lesão articular foi reduzida em relação à lesão basal antes da administração, em que uma diminuição da lesão versus lesão basal no indivíduo após tra- tamento indica que o antagonista ou anticorpo como, por exemplo, anticorpo CD20, possui um efeito sobre a lesão articular. De preferência, o grau de redução versus o nível de base é medido uma segunda vez após a adminis- tração do antagonista ou do anticorpo como, por exemplo, o anticorpo CD20. Além disso, de preferência, a medida é feita após pelo menos cerca de 24 semanas após a administração.
Também é incluído nesta invenção um método de monitora- mento do tratamento de lesão articular em um indivíduo que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de um marcador de superfície das células B (por exemplo, um anticorpo contra ele, incluindo um anticorpo CD20) ao indivíduo, e a determinação por radiografia, após pelo menos cerca de 52 semanas após a administração, de se a lesão arti- cular foi reduzida em relação à lesão basal antes da administração, em que uma diminuição da lesão versus lesão basal no indivíduo após tratamento indica que o antagonista ou anticorpo como, por exemplo, anticorpo CD20, possui um efeito sobre a lesão articular. De preferência, o grau de redução versus o nível de base é medido uma segunda vez após a administração do antagonista ou do anticorpo como, por exemplo, o anticorpo CD20.
Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método para determinar se a administração de um antagonista de um marcador de super- fície das células B deve prosseguir (por exemplo, um anticorpo contra ele, incluindo um anticorpo CD20) em um indivíduo com lesão articular, que compreende a medida por redução radiográfica da lesão articular no indiví- duo após administração do antagonista como, por exemplo, o anticorpo CD20, uma primeira vez, a medição da redução radiográfica da lesão articu- lar no indivíduo após administração do antagonista como, por exemplo, o anticorpo CD20, uma segunda vez, a comparação das classificações radio- gráficas no indivíduo na primeira vez e na segunda vez e, caso uma classifi- cação seja menor na segunda vez do que na primeira vez, a continuação da administração do antagonista ou do anticorpo como, por exemplo, o anticor- po CD20.
Ainda em outra modalidade adicional, é incluída uma etapa no método de tratamento para testar a resposta do indivíduo ao tratamento a- pós a etapa de administração para determinar se o nível de resposta é eficaz para tratar a lesão articular. Por exemplo, é incluída uma etapa para testar a classificação radiográfica após a administração, e compará-la com uma classificação radiográfica de base obtida antes da administração, para de- terminar se o tratamento é eficaz medindo-se se houve alteração e, caso tenha havido, quantificá-la. Esse teste pode ser repetido em vários intervalos de tempo programados ou não-programados após a administração para de- terminar a manutenção de qualquer remissão parcial ou completa. Alternati- vamente, os métodos aqui apresentados compreendem uma etapa de teste do indivíduo, antes da administração, para ver se um ou mais biomarcadores ou sintomas de lesão articular estão presentes, como apresentados acima.
Em outro método, pode ser incluída uma etapa para verificar a história clíni- ca do indivíduo, como detalhado acima, por exemplo, para excluir infecções ou doenças malignas como causas, por exemplo, causas primárias, da con- dição do indivíduo, antes da administração do anticorpo ou do antagonista ao indivíduo. De preferência, a lesão articular é primária (ou seja, a doença principal), e não secundária, por exemplo, secundária a uma infecção ou a uma doença maligna, sejam tumores sólidos ou líquidos.
Em uma modalidade de todos os métodos aqui apresentados, nenhum outro medicamento além do antagonista, por exemplo, o anticorpo CD20, é administrado ao indivíduo para tratar a lesão articular.
Em qualquer um dos métodos aqui apresentados, de preferên- cia, pode-se administrar ao indivíduo, juntamente com o antagonista ou o anticorpo que se liga a um marcador de superfície das células B, uma quan- tidade eficaz de um segundo medicamento (em que o antagonista ou o anti- corpo que se liga a um marcador de superfície das células B (por exemplo, o anticorpo CD20) é um primeiro medicamento). O segundo medicamento po- de ser um ou mais medicamentos, e incluem, por exemplo, um agente imu- nossupressor, um antagonista de citocina como, por exemplo, um anticorpo contra citocina, um fator de crescimento, um hormônio, uma integrina, um antagonista ou anticorpo contra integrina, ou qualquer combinação destes. O tipo desse segundo medicamento depende de vários fatores, incluindo o tipo de lesão articular, a gravidade da lesão articular, a condição e a idade do indivíduo, o tipo e a dose do primeiro medicamento empregado etc.
Exemplos desses medicamentos adicionais incluem um fárma- co da classe dos interferons como, por exemplo, interferon-alfa (por exem- pio, de Amarillo Biosciences, Inc.), IFN-beta-1a (REBIF® e AVONEX®) ou IFN-beta-1b (BETASERON®), um oligopeptídeo como, por exemplo, acetato de glatirâmero (COPAXONE®), um Iigante de agente de bloqueio de CD40- CD40, um agente imunossupressor (por exemplo, mitoxantrona (NOVAN- TRONE®), metotrexato, ciclofosfamida, clorambucila, Ieflunomida e azatio- prina), imunoglobulina intravenosa (gamaglobulina), terapia de eliminação de linfócitos (por exemplo, mitoxantrona, ciclofosfamida, CAMPATH® anticorpos anti-CD4, cladribina, uma construção polipeptídica com pelo menos dois domínios que compreendem um antígeno desimunizado, autorreativo ou seu fragmento que é reconhecido especificamente pelos receptores de Ig de cé- lulas B autorreativas (WO 2003/68822), irradiação corporal total, transplante de medula óssea), antagonista ou anticorpo contra integrina (por exemplo, um anticorpo contra LFA-1 como, por exemplo, efalizumab/RAPTIVA® dis- ponível comercialmente por Genentech, ou um anticorpo contra integrina alfa 4 como, por exemplo, natalizumab/ANTEGREN® disponível por Biogen, ou outros, como observado acima), fármacos que tratam os sintomas secundá- rios ou relacionados à lesão articular como, por exemplo, aqueles aqui cita- dos, esteroides como, por exemplo, corticosteroide (por exemplo, predniso- lona, metilprednisolona, por exemplo, succinato sódico de metilprednisolona SOLU-MEDROL® para injeção, prednisona, por exemplo, prednisona da bai- xa dose, dexametasona, ou glicocorticoide, por exemplo, por meio de injeção intra-articular, incluindo terapia com corticosteroide sistêmico), terapia imu- nossupressora sem eliminação de linfócitos (por exemplo, MMF ou ciclospo- rinas), fármacos de redução do colesterol da classe das "estatinas" (que in- clui cerivastatina (BAYCOL®), fluvastatina (LESCOL®), atorvastatina (LIPI- TOR®), Iovastatina (MEVACOR®), pravastatina (PRAVACHOL®) e simvasta- tina (ZOCOR®)), estradiol, testosterona (opcionalmente em dosagens eleva- das; Stuve et ai Neurology 8: 290-301 (2002)), androgênio, terapia de repo- sição hormonal, um inibidor do TNF como, por exemplo, um anticorpo para TNF-alfa, DMARD, NSAID, plasmaferese ou troca de plasma, trimetoprim- sulfametoxazol (BACTRIM®, SEPTRA®), micofenolato de mofetila, bloquea- dores H2 ou inibidores da bomba de prótons (durante o uso de terapia imu- nossupressora potencialmente ulcerogênica), levotiroxina, ciclosporina A (por exemplo, SANDIMMUNE®), análogo de somatastatina, um DMARD ou NSAID, um antagonista de citocina como, por exemplo, anticorpo, antimeta- bólito, agente imunossupressor, cirurgia de reabilitação, iodo radioativo, tire- oidectomia, antagonista de BAFF como, por exemplo, anticorpos ou imunoa- desinas contra BAFF ou BR3, receptor anti-CD40 ou Iigante anti-CD40 (CD154), antagonista/anticorpo do receptor anti-IL-6, outro antagonista ou anticorpo da superfície de células B como, por exemplo, um 2H7 humanizado ou outro anticorpo CD20 humanizado ou humano com rituximab; bloqueado- res de IL-1, por exemplo, rHUIL-1Ra (Amgen-Synergen) e inibidor do ácido tiaprofênico 1-1B (Hoechst); e modificadores coestimuladores como, por e- xemplo, ORENCIA® (abatacept) (Bristol-Myers Squibb); enlimomab (anticorpo monoclonal anti-ICAM-1); CDO-855 (anticorpo humanizado, que se liga espe- cificamente a uma região do complexo MHC da Classe II, Celltech); CH-3298 (Chiroscience); acemetacina (Merck); GW353430 (anticorpo monoclonal anti- CD23, Glaxo Wellcome); GR 252025 (inibidor da COXQ2, Glaxo Wellcome); 4162W94 (anticorpo humanizado anti-CD4; Glaxo Wellcome); azatioprina (DMARD, Glaxo Welcome); penicilamina e fenoprofeno (Eli Lilly) etc.
Medicamentos preferidos desses tipos são um antibiótico, anti- integrina, gamaglobulina, um agente para controle da dor, um antagonista da integrina, anti-CD4, cladribina, trimetoprim-sulfametoxazol, um bloqueador H2, um inibidor da bomba de prótons, ciclosporinas, fármacos de redução do colesterol da classe das estatinas, estradiol, testosterona, androgênio, fár- maco de reposição hormonal, um inibidor do TNF como, por exemplo, um inibidor de TNF-alfa, DMARD, NSAID (para tratar, por exemplo, sintomas músculo-esqueléticos), levotiroxina, ciclosporina A, análogo da somatastati- na, antagonista de citocina (incluindo antagonista do receptor de citocina), antimetabólito, antagonista de BAFF como, por exemplo, anticorpo contra BAFF ou anticorpo contra BR3, especialmente um anticorpo para BAFF, um agente imunossupressor como, por exemplo, metotrexato ou um corticoste- roide, um bisfosfonato, um hormônio, e outro anticorpo de marcador de su- perfície das células B como, por exemplo, uma combinação de rituximab e um 2H7 humanizado ou outro anticorpo CD20 humanizado.
Os mais preferidos desses medicamentos são um antibiótico, um agente imunossupressor como, por exemplo, metotrexato, ou um corti- costeroide, um DMARD, um agente para controle da dor, um antagonista da integrina, um NSAID, um antagonista de citocina, um bisfosfonato ou um hormônio, ou uma combinação destes.
Em uma modalidade particularmente preferida, o segundo me- dicamento é um DMARD, que é selecionado, de preferência, do grupo que consiste em auranofin, cloroquina, D-penicilamina, ouro injetável, ouro oral, hidroxicloroquina, sulfasalazina, miocrisina e metotrexato.
Em outra modalidade como essa, o segundo medicamento é um NSAID, que é selecionado, de preferência, do grupo que consiste em: pentasa, mesalazina, asacol, fosfato de codeína, benorilato, fenbufeno, na- prosina, diclofenaco, etodolac e indometacina, aspirina e ibuprofeno.
Em outra modalidade como essa, o segundo medicamento é um agente para controle da dor, que é selecionado, de preferência, do grupo que consiste em: paracetamol e dextropropoxifeno.
Em uma modalidade como essa, o segundo medicamento é um agente imunossupressor, que é selecionado, de preferência, do grupo que consiste em etanercept, infliximab, adalimumab, leflunomida, anaquinra, aza- tioprina, metotrexato e ciclofosfamida.
Em outras modalidades preferidas, o segundo medicamento é selecionado do grupo que consiste em OPG, etanercept, infliximab, etaner- cept, adalimumab, quinaret, raptiva, osteoprotegerina (OPG), RANKFc, anti- RANKL, pamidronato, alendronato, actonel, zolendronato, clodronato, meto- trexato, azulfidina, hidroxicloroquina, doxiciclina, leflunomida, sulfasalazina (SSZ), prednisolona, antagonista do receptor de interleucina-1, prednisona e metilprednisolona.
Ainda em outras modalidades preferidas, o segundo medica- mento é selecionado do grupo que consiste em infliximab, uma combinação de infliximab/metotrexato (MTX), etanercept, um corticosteroide, ciclosporina A, azatioprina, auranofina, hidroxicloroquina (HCQ), combinação de predni- solona, MTX e SSZ, combinações de MTX, SSZ e HCQ, a combinação de ciclofosfamida, azatioprina e HCQ, e a combinação de adalimumab com MTX. Caso o segundo medicamento seja um corticosteroide, de preferência, ele será prednisona, prednisolona, metilprednisolona, hidrocortisona ou de- xametasona. Além disso, de preferência, o corticosteroide é administrado em quantidades menores do que as que são usadas se o anticorpo CD20 não for administrado a um indivíduo tratado com um corticosteroide. Mais preferi- velmente, o segundo medicamento é metotrexato.
Todos esses segundos medicamentos podem ser usados em combinação com cada um de outros ou por eles próprios com o primeiro medicamento, de forma que a expressão "segundo medicamento", como aqui usada, não significa que ele é o único medicamento além do primeiro medicamento, respectivamente. Dessa forma, o segundo medicamento não precisa ser um medicamento, mas pode constituir ou compreender mais de um desses fármacos.
Esses segundos medicamentos, como aqui apresentados, são usados geralmente nas mesmas dosagens, e com as mesmas vias de admi- nistração aqui usadas anteriormente, ou cerca de 1 a 99% das dosagens aqui empregadas anteriormente. Caso os segundos medicamentos sejam realmente usados, de preferência, eles serão usados em quantidades meno- res do que se o primeiro medicamento não-estivesse presente, especialmen- te em dosagens subsequentes além da dosagem inicial com o primeiro me- dicamento, de forma a eliminar ou reduzir os efeitos colaterais pode eles causados.
Para os métodos de retratamento aqui descritos, quando um segundo medicamento for administrado em uma quantidade eficaz com uma exposição ao antagonista ou ao anticorpo, ele poderá ser administrado com qualquer exposição, por exemplo, apenas com uma exposição, ou com mais de uma exposição. Em uma modalidade, o segundo medicamento é adminis- trado com a exposição inicial. Em outra modalidade, o segundo medicamen- to é administrado com a exposição inicial e com a segunda exposição. Ainda em outra modalidade adicional, o segundo medicamento é administrado com todas as exposições. Prefere-se que após a exposição inicial como, por e- xemplo, de esteroide, a quantidade desse segundo medicamento seja redu- zida ou eliminada de forma a reduzir a exposição do indivíduo a um agente com efeitos colaterais como, por exemplo, prednisona, prednisolona, metil- prednisolona e ciclofosfamida.
A administração combinada de um segundo medicamento inclui a coadministração (administração concomitante), o uso de formulações se- paradas ou uma única formulação farmacêutica e a administração consecu- tiva em qualquer ordem, em que, de preferência, há um período de tempo em que ambos (ou todos) os agentes ativos (medicamentos) exercem simul- taneamente suas atividades biológicas.
O anticorpo ou antagonista aqui apresentado é administrado por qualquer meio adequado, incluindo a administração parenteral, tópica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal e/ou intralesional. Infu- sões parenterais incluem a administração intramuscular, intravenosa (i.v.), intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A administração intratecal tam- bém é contemplada (veja, por exemplo, U.S. 2002/0009444, Grillo-Lopez, "A concerning intrathecal delivery of a CD20 antibody"). Além disso, o anticorpo ou antagonista pode ser administrado adequadamente por pulsoterapia, por exemplo, com doses declinantes do anticorpo ou do antagonista. De prefe- rência, a dosagem é administrada por via intravenosa ou subcutânea e, mais preferivelmente, por infusão intravenosa.
Caso sejam administradas exposições múltiplas do anticorpo, cada exposição poderá ser fornecida com o uso no mesmo modo de admi- nistração ou com um modo de administração diferente. Em uma modalidade, cada exposição é feita por administração intravenosa. Em outra modalidade, cada exposição é dada por administração subcutânea. Ainda em outra mo- dalidade, as exposições são feitas por administração tanto intravenosa quan- to subcutânea.
Em uma modalidade, o anticorpo CD20 é administrado como uma infusão intravenosa lenta, em vez de uma infusão intravenosa em pulso ou em bolo. Por exemplo, um esteroide como, por exemplo, prednisolona ou metilprednisolona (por exemplo, cerca de 80-120 mg i.v., mais especifica- mente, cerca de 100 mg i.v.) é administrado cerca de 30 minutos antes de qualquer infusão do anticorpo CD20. O anticorpo CD20 é infundido, por e- xemplo, através de uma punção venosa exclusiva.
Para a dose inicial de uma exposição multidoses ao anticorpo CD20, ou para uma dose única, caso a exposição envolva apenas uma do- se, essa infusão começa, de preferência, em uma taxa de cerca de 50 mg/hora. Essa taxa pode ser aumentada gradualmente, por exemplo, em uma taxa de cerca de incrementos de 50 mg/hora aproximadamente a cada 30 minutos, até um máximo de cerca de 400 mg/hora. No entanto, caso o indivíduo apresente uma reação relacionada à infusão, a taxa de infusão é preferivelmente reduzida, por exemplo, à metade da taxa atual, por exemplo, de 100 mg/hora para 50 mg/hora. De preferência, a infusão dessa dose de anticorpo CD20 (por exemplo, uma dose total de cerca de 1.000 mg) termina em cerca de 255 minutos (4 horas e 15 minutos). Opcionalmente, os indiví- duos recebem um tratamento profilático de acetaminofeno/paracetamol (por exemplo, cerca de 1 g) e HCI de difenidramina (por exemplo, cerca de 50 mg ou dose equivalente de agente similar) por via oral, cerca de 30 a 60 minutos antes do início de uma infusão.
Caso seja dada mais de uma infusão (dose) de anticorpo CD20 para se obter a exposição total, a segunda infusão ou a infusão subsequente de anticorpo CD20 nessa modalidade de infusão começará, de preferência, em uma taxa mais elevada do que a infusão inicial, por exemplo, em cerca de 100 mg/hora. Essa taxa pode ser aumentada gradualmente, por exemplo, em uma taxa de incrementos de cerca de 100 mg/hora aproximadamente a cada 30 minutos, até um máximo de cerca de 400 mg/hora. Os indivíduos que a- presentam uma reação relacionada à infusão, de preferência têm a taxa de infusão reduzida à metade daquela taxa, por exemplo, de 100 mg/hora para 50 mg/hora. De preferência, a infusão dessa segunda dose ou da dose sub- sequente de anticorpo CD20 (por exemplo, uma dose total de cerca de 1.000 mg) termina em cerca de 195 minutos (3 horas e 15 minutos).
Em outra modalidade, é fornecido um método para o tratamento de lesão articular em um indivíduo que compreende a administração de um antagonista de um marcador de superfície das células B, por exemplo, um anticorpo contra ele, por exemplo, anticorpo CD20, ao indivíduo, e a realiza- ção no indivíduo, pelo menos cerca de 52 semanas após a administração, de um exame radiográfico que mede uma redução na lesão articular, compa- rado com os níveis de base antes da administração, em que a quantidade de antagonista ou anticorpo como, por exemplo, anticorpo CD20, administrada é eficaz na obtenção de uma redução na lesão articular, indicando que o indivíduo foi tratado com sucesso.
Nesse método, de preferência, o exame mede uma classifica- ção de Sharp modificada total. Em outra modalidade preferida, o antagonista é um anticorpo CD20. Mais preferivelmente, o anticorpo CD20 é rituximab ou é 2H7 humanizado que compreende as seqüências do domínio variável nas SEQ. ID. Nos: 2 e 8, ou é 2H7 humanizado que compreende as seqüências do domínio variável nas SEQ. ID. Nos: 39 e 40, ou é 2H7 humanizado que compreende as seqüências do domínio variável nas SEQ. ID. Nos: 32 e 33, ou é 2H7 humanizado que compreende um domínio variável da cadeia pe- sada com alteração N100A, ou D56A e N100A, ou D56A, N100Y, e SIOOaR na SEQ. ID. N0: 8 e um domínio variável da cadeia leve com alteração M32L, ou S92A, ou M32L e S92A na SEQ. ID. N0: 2.
Em outra modalidade preferida, a lesão articular é causada por artrite, de preferência, RA e, mais preferivelmente, RA inicial ativa. Em outra modalidade preferida, o indivíduo não foi tratado previamente com um agente imunossupressor antes da administração de uma primeira dose de antagonis- ta ou anticorpo como, por exemplo, anticorpo CD20, no método de tratamen- to. Em uma modalidade preferida, o antagonista ou anticorpo é administrado em uma dose de cerca de 0,4 a 4 gramas e, mais preferivelmente, o antago- nista ou anticorpo é administrado em uma dose de cerca de 0,4 a 1,3 grama, em uma freqüência de uma a quatro doses em um período de cerca de um mês. Ainda mais preferivelmente, a dose é de cerca de 500 mg a 1,2 grama e, em outras modalidades, é de cerca de 750 mg a 1,1 grama. Nesses aspectos, o antagonista ou anticorpo é administrado, de preferência, em duas a três do- ses e/ou é administrado em um período de cerca de 2 a 3 semanas.
Em outro aspecto, tal método ainda compreende o retratamento do indivíduo por fornecimento de uma administração adicional ao indivíduo do antagonista como, por exemplo, um anticorpo CD20, em uma quantidade eficaz para obter uma redução contínua ou mantida da lesão articular, com- parado com o efeito de uma administração prévia do antagonista ou anticor- po como, por exemplo, o anticorpo CD20. Em um aspecto dessa modalida- de, o antagonista ou anticorpo como, por exemplo, anticorpo CD20, é adi- cionalmente administrado ao indivíduo, mesmo que não haja melhora clínica no indivíduo no momento do exame radiográfico após uma administração anterior. O retratamento pode ser iniciado pelo menos cerca de 24 semanas após a primeira administração do antagonista como, por exemplo, o anticor- po CD20, e um ou mais retratamentos adicionais são opcionalmente inicia- dos. Em outra modalidade, o retratamento adicional é iniciado pelo menos cerca de 24 semanas após a segunda administração do antagonista como, por exemplo, o anticorpo CD20. Em um aspecto preferido adicional, a lesão articular foi reduzida após o retratamento, como comparada com a extensão da lesão articular após a primeira avaliação radiográfica.
De preferência, nesse método, em relação à avaliação de apro- ximadamente 52 semanas, um segundo medicamento é administrado em uma quantidade eficaz, em que o antagonista ou anticorpo como, por exem- plo, anticorpo CD20, é um primeiro medicamento. Em um aspecto, o segun- do medicamento é mais de um medicamento. Em outro aspecto, o segundo medicamento é um antibiótico, um agente imunossupressor, um fármaco antirreumático de modificação da doença (DMARD), um agente para contro- le da dor, um antagonista da integrina, um fármaco anti-inflamatório não- esteroide (NSAID), um antagonista de citocina, um bisfosfonato, ou um hor- mônio, ou uma combinação destes, principalmente metotrexato. O indivíduo pode ser fator reumatoide-negativo ou positivo. Além disso, de preferência, o antagonista como, por exemplo, o anticorpo CD20 é administrado por via intravenosa ou subcutânea, principalmente por via intravenosa.
Será apresentada a seguir, uma discussão dos métodos de pro- dução, de modificação e de formulação destes anticorpos. III. Produção de Anticorpos
Os métodos e artigos manufaturados da presente invenção u- sam, ou incorporam, um anticorpo que se liga a um marcador de superfície das células B1 especialmente um que se liga ao CD20. Consequentemente, serão aqui descritos métodos para a geração destes anticorpos.
O antígeno CD20 a ser usado para a produção, ou rastreamen- to, de anticorpo(s) pode ser, por exemplo, uma forma solúvel de CD20 ou uma porção deste, contendo o epitopo desejado. Alternativa ou adicional- mente, células que expressam CD20 em sua superfície celular podem ser usadas para gerar, ou rastrear, anticorpo(s). Outras formas de CD20 úteis para a geração de anticorpos ficarão evidentes para aqueles versados na técnica.
A descrição a seguir ilustra técnicas exemplares para a produ- ção dos anticorpos usados de acordo com a presente invenção. (i) Anticorpos policlonais
Anticorpos policlonais são desenvolvidos, de preferência, em animais por múltiplas injeções subcutâneas (s.c.) ou intraperitoneais (i.p.) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno rele- vante a uma proteína que seja imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina do "keyhole limpet" (KLH), albumina sérica, tireoglo- bulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja, com o uso de um agente bifun- cional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfos- succinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissucci- nimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidreto succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, em que R e R1 são grupos alquila diferentes.
Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imu- nogênicos, ou derivados por combinação, por exemplo, 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e por injeção da solução por via intradérmica em vários locais. Após um mês, os animais recebem um reforço com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em vários locais. Sete a 14 dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é testado quanto à titulação de anticorpos. Os animais recebem um reforço até o platô da titula- ção. De preferência, o animal recebe reforço com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado como uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser feitos em cultura de células recombinantes como fusões de proteínas. Além disso, agentes de agregação como, por exemplo, são adequadamente usados para aumentar a resposta imune.
(ii) Anticorpos monoclonais
Anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos indivi- duais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epitopo, exceto quanto às possíveis variantes que surgem durante a produ- ção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Dessa forma, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos ou policlonais.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos com a utilização do método de hibridoma descrito inicialmente por Kohler et ai, Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser feito por métodos de DNA recombi- nante (Patente U.S. N0 4.816.567).
No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hos- pedeiro apropriado como, por exemplo, um hamster, é imunizado como aqui descrito anteriormente para gerar linfócitos que produzem ou que são capa- zes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos a células de mieloma com o uso de um agente de fusão adequado como, por exemplo, polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e de- senvolvidas em um meio de cultura adequado que contém, de preferência, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevida das célu- las de mieloma originais, não-fundidas. Por exemplo, caso as células de mie- loma originais sejam desprovidas da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipi- camente incluirão hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.
As células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção estável de alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas, e são sensíveis a um meio como, por exemplo, o meio HAT. Dentre essas, linhagens de células de mie- loma preferidas são linhagens de mieloma murinas, como aquelas derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11, disponíveis pelo "Salk Institute Cell Distribution Center", San Diego, Califórnia EUA, e as células SP-2 ou X63-Ag8-653, disponíveis pelo "American Type Culture Collection", Rockville, Mariland EUA. Linhagens de células de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3.001 (1984); Brodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)).
O meio de cultura no qual as células de hibridoma se desenvol- vem é testado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. De preferência, a especificidade de ligação de anticorpos mono- clonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipi- tação ou por um ensaio de ligação in vitro como, por exemplo, o radioimuno- ensaio (RIA) ou o ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).
A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser de- terminada, por exemplo, pela análise Scatchard de Munson et ai, Anal. Bio- chem., 107: 220 (1980).
Após serem identificadas as células de hibridoma que produ- zem os anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de limitação da dilui- ção e desenvolvidos por métodos padronizados (Goding, Monoclonal Anti- bodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para essa finalidade incluem, por exemplo, o meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem crescer in vivo como tumores ascíticos em um animal.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são a- dequadamente separados do meio de cultura, fluido ascítico ou soro por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas como, por exemplo, proteína A-SEPHAROSE®, cromatografia com hidroxilapatita, ele- troforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.
O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente iso- lado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exem- pio, com a utilização de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos murídeos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em veto- res de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras co- mo, por exemplo, células de E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO)1 ou células de mieloma que de outra forma não- produzem a proteína da imunoglobulina, para se obter a síntese de anticor- pos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA que codifica o anti- corpo incluem Skerra et ai, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
Em uma modalidade adicional, anticorpos ou fragmentos de an- ticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpos geradas com o uso das técnicas descritas em McCafferty et ai, Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et ai, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. MoL Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murídeos e humanos, respectivamente, com o uso de bibliotecas de fago. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afini- dade (na faixa de nM) por embaralhamento de cadeias (Marks et al., Bi- o/Technology, 10: 779-783 (1992)), além de infecção combinatória e recom- binação in vivo como estratégia para a construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et ai, Nuc. Acids. Res., 21: 2.265-2.266 (1993)). Dessa forma, essas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para o isolamento de anticorpos mo- noclonais.
O DNA também pode ser modificado, por exemplo, por substitu- ição da seqüência de codificação para os domínios constantes da cadeia pesada e leve humanas no lugar das seqüências murinas homólogas (Pa- tente U.S. N0 4.816.567; Morrison, et ai, Proc. Natl Acad. Sei. USA1 81: 6.851 (1984)), ou por ligação covalente à seqüência de codificação de imu- noglobulina de toda ou parte da seqüência de codificação para um polipeptí- deo que não é de imunoglobulina.
Tipicamente, esses polipeptídeos que não são de imunoglobuli- na servem de substitutos para os domínios constantes de um anticorpo, ou servem de substitutos para os domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo, para criar um anticorpo quimérico bivalente que compreende um sítio de combinação de antígeno que possui especifici- dade para um antígeno, e outro sítio de combinação de antígeno que possui especificidade para um antígeno diferente.
Além disso, anticorpos que compreendem uma região Fc varian- te com alta afinidade por FcyR são úteis para o tratamento de doenças em que se deseja o aumento da eficácia da função de célula efetora como, por exemplo, doenças autoimunes, como mostrado, por exemplo, em U.S. 2005/0037000 e WO 2004/63351 (Macrogenics, Inc. STAVENHAGEN et al). (iii) Anticorpos humanizados
Métodos para a humanização de anticorpos não-humanos fo- ram descritos na técnica. De preferência, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que é não-humana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são freqüen- temente denominados resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser realizada ba- sicamente de acordo com o método de Winter e colaboradores (Jones et ai, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1.534-1.536 (1988)), com o uso de sequên- cias da região hipervariável como substituintes para as seqüências corres- pondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N0 4.816.567) nos quais substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana.
Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos RF são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados na produção dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método "mais adequado", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roe- dor é rastreada contra toda a biblioteca de seqüências conhecidas do domí- nio variável humano. A seqüência humana mais próxima daquela do roedor é então aceita como a região estrutural (RF) humana para o anticorpo hu- manizado (Sims et ai, J. Immunol., 151: 2.296 (1993); Chothia et ai, J. Moi Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utiliza uma região estrutural específica derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis da cadeia leve ou pesada. A mes- ma estrutura central pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89: 4.285 (1992); Presta et al, J. Immunol., 151: 2.623 (1993)).
É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção da alta afinidade pelo antígeno e de outras propriedades biológicas favoráveis. Para se atingir esse objetivo, de acordo com um método preferi- do, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências originais e de vários produtos humanizados conceituais com o uso de modelos tridimensionais das seqüências originais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina são comumente disponíveis, e são familiares para aqueles versados na técnica. Existem programas de computador que ilustram e exibem as estruturas conformacionais tridimensi- onais de seqüências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspe- ção dessas ilustrações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar a seu antígeno. Dessa forma, resíduos RF podem ser selecionados e combinados pelas seqüências do receptor e importadas, de forma que as características desejadas do anticorpo como, por exemplo, afinidade aumen- tada pelo antígeno(s)-alvo, sejam obtidas. Em geral, os resíduos da região hipervariável estão direta e mais substancialmente envolvidos na influência sobre a ligação de antígeno.
(iv) Anticorpos humanos
Como alternativa à humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Por exemplo, agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção en- dógena de imunoglobulina. Por exemplo, foi descrito que a eliminação homo- zigota do gene da região de junção (Jh) da cadeia pesada de anticorpo em camundongos quiméricos e de linhagem germinativa mutante resulta na inibi- ção completa da produção endógena de anticorpo. A transferência do arranjo gênico de imunoglobulina da linhagem germinativa humana nesses camun- dongos de linhagem germinativa mutante resultará na produção de anticorpos humanos mediante ataque de antígeno. Veja, por exemplo, Jakobovits et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2.551 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Yearin Immuno., 7: 33 (1993); e Paten- tes U.S. Nos: 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807.
Alternativamente, a tecnologia de exibição de fago (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) pode ser usada para a produção de anti- corpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios do gene do domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não- imunizados. De acordo com essa técnica, os genes do domínio V de anticor- po são clonados "in-frame" em um gene da proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, por exemplo, M13 ou fd, e exibi- dos como fragmentos funcionais de anticorpo na superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia do DNA de filamento simples do genoma do fago, seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelas propriedades. Dessa forma, o fago mimetiza algumas das propriedades das células Β. A exibição de fago pode ser realizada em diver- sos formatos; para uma revisão sobre o assunto, veja, por exemplo, Johnson et ai, Current Opinion in Structurai Bioiogy 3: 564-571 (1993). Várias fontes de segmentos do gene V podem ser usadas para exibição de fago. Clackson et ai, Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um arranjo diverso de anticorpos anti-oxazolona de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não-imunizados pode ser construído, e anticorpos para um conjunto diversificado de antígenos (incluindo autoantígenos) po- dem ser isolados seguindo essencialmente as técnicas descritas por Marks et ai., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) ou Griffith et ai, EMBO J. 12: 725- 734 (1993). Veja também as Patentes U.S. Nos: 5.565.332 e 5.573.905.
Anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas in vitro (veja as Patentes U.S. Nos: 5.567.610 e 5.229.275).
(v) Fragmentos de anticorpos
Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de frag- mentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos eram derivados por meio da digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja, por exemplo, Mori- moto et al., Joumal of Biochemical e Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) e Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985)). No entanto, esses fragmentos ago- ra podem ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab1-SH po- dem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente, para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et ai, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados dire- tamente de uma cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para aqueles ver- sados na técnica. Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um frag- mento Fv de cadeia única (scFv). Veja WO 93/16185, Patente U.S. N° 5.571.894 e Patente U.S. N° 5.587.458. O fragmento de anticorpo também po- de ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito na Patente U.S. N° 5.641.870, por exemplo. Esses fragmentos de anticorpo linear podem ser mo- noespecíficos ou biespecíficos.
(vi) Anticorpos biespecíficos
Anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especifi- cidades de ligação por pelo menos dois epitopos diferentes. Anticorpos bies- pecíficos exemplares podem se ligar a dois epitopos diferentes do antígeno CD20. Outros anticorpos desse tipo podem se ligar a CD20 e ainda a um se- gundo marcador de superfície das células B. Alternativamente, uma ramifica- ção de ligação anti-CD20 pode ser combinada com uma ramificação que se liga a uma molécula de desencadeamento em um leucócito, tal como, uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR), tais como, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma a se concentrar nos mecanismos de defesa celulares para células B. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar certos a - gentes para células B. Esses anticorpos possuem uma ramificação de liga- ção a CD20 e uma ramificação que se liga ao agente (por exemplo, metotre- xato). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos F(ab')2 biespecíficos).
Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são co- nhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total se baseia na coexpressão de dois pares de cadeia pesa- da-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especi- ficidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Por causa da distribuição aleatória das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 molé- culas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespe- cífica correta. A purificação da molécula correta, que normalmente é feita por etapas de cromatografia por afinidade, é bem trabalhosa, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829 e em Traunecker et ai, EMBO J., 10: 3.655-3.659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combi- nação de anticorpo-antígeno) são fundidos às seqüências do domínio cons- tante de imunoglobulina. A fusão é, de preferência, com um domínio cons- tante da cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos par- te das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante da cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para a liga- ção da cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que co- dificam as fusões da cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, da cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão sepa- rados, e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso permite uma grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em modalidades nas quais proporções desiguais das três cadeias polipeptídicas usadas na construção geram os melhores rendimentos. É possível, no entanto, inserir as seqüências de codificação para duas ou para todas as três cadeias polipeptídicas em um vetor de ex- pressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em proporções iguais resulta em altos rendimentos ou quando as proporções não são significativamente importantes.
Em uma modalidade preferida dessa abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina hí- brida, com uma primeira especificidade de ligação em uma ramificação, e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrido (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) na outra ramificação. Verificou-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado das combinações indesejadas de cadeias de imunoglobulina, à medida que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina apenas na metade da molécula biespecífica fornece um modo fácil de separação. Essa abordagem é descrita em WO 94/04690. Para mais detalhes sobre a gera- ção de anticorpos biespecíficos veja, por exemplo, Suresh et a/., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. N0 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser pro- jetada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recupera- dos da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um domínio constante do anticor- po. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). São criadas "cavida- des" compensatórias de tamanhos idênticos ou similares às cadeias laterais grandes na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição de cadeias laterais grandes de aminoácidos pelas pequenas (por exemplo, ala- nina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumento do rendimento do heterodímero em relação aos outros produtos finais indesejáveis como, por exemplo, homodímeros.
Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "hete- roconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina, o outro à biotina. Foi proposto que tais anticorpos, por e- xemplo, direcionem células do sistema imune às células indesejadas (Patente U.S. N0: 4.676.980), e para o tratamento de infecção pelo HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e E.P. 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos com o uso de métodos convenientes de reticulação. Agentes de reticulação adequados são bem-conhecidos na técnica, e são descritos na Patente U.S. N0: 4.676.980, juntamente com diversas técnicas de reticulação.
Técnicas para a geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados com o uso de ligação quími- ca. Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento no qual anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para a geração de fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de formação de complexos ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vi- zinhos e evitar a formação intermolecular de dissulfeto. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab1-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina, e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab1-TNB1 para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos bi- especificos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
Também foram descritas várias técnicas para a produção e iso- lamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente da cultura de células recombinantes. Por exemplo, foram produzidos anticorpos biespecí- ficos com o uso de zíperes de Ieucina (Kostelny et ai, J. Immunol., 148(5): 1.547-1.553 (1992)). Os peptídeos do zíper de Ieucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão gênica. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de dobra- diça para formarem monômeros, e depois reoxidados para formar os hetero- dímeros de anticorpo. Esse método também pode ser utilizado para a produ- ção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diabodf descrita por Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90: 6.444-6.448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para a produção de fragmentos e anticorpos bi- específicos. Os fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável da cadeia leve (Vl) por um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmen- to são forçados a parear com os domínios Vl e Vh complementares de outro fragmento formando, dessa forma, dois sítios de ligação de antígeno. Tam- bém foi relatada outra estratégia para a produção de fragmentos de anticor- po biespecífico pelo uso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia única. Veja Gru- ber et ai, J. Immunol., 152: 5.368 (1994).
Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos (Tutt et ai, J. Im- munol. 147: 60 (1991)). IV. Conjugados e outras modificações do anticorpo
Modificações do anticorpo são aqui contempladas. Dessa for- ma, em uma modalidade, o anticorpo pode ser conjugado a outra molécula, por exemplo, para aumentar a meia-vida ou a estabilidade ou de algum outro modo melhorar a farmacocinética do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a um dentre diversos polímeros proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. Fragmentos de anticorpos, por e- xemplo, Fab', ligados a uma ou mais moléculas de PEG1 formam uma moda- lidade especialmente preferida da invenção.
Os anticorpos aqui descritos também podem ser formulados como lipossomos. Lipossomos contendo o anticorpo são preparados por mé- todos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em Epstein et ai, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 82: 3.688 (1985); Hwang et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USAt 77: 4.030 (1980); Patentes U.S. Nos: 4.485.045 e 4.544.545; e WO 97/38731, publicada em 23 de outubro de 1997. Lipossomos com tempo de circulação aumentado são descritos na Patente U.S. N0: 5.013.556.
Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo mé- todo de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica que com- preende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Lipossomos são extruídos através de filtros com tamanho de poros definidos para a geração de lipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab' de um anticorpo da presente invenção podem ser con- jugados aos lipossomos, como descrito em Martin et al. J. Bioi Chem. 257: 286-288 (1982) por meio de uma reação de troca de dissulfeto.
As modificações de seqüências de aminoácidos de anticorpos de proteína ou peptídeo aqui descritos são contempladas. Por exemplo, po- de ser desejável aumentar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes da seqüência de aminoácidos do anticor- po são preparadas por introdução de mudanças de nucleotídeos apropriadas no ácido nucleico do anticorpo, ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, eliminações e/ou inserções e/ou substituições de re- síduos dentro das seqüências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer com- binação de eliminação, inserção e substituição é feita para se chegar à cons- trução final, desde que a construção final possua as características deseja- das. As mudanças de aminoácido também podem alterar os processos pós- tradução do anticorpo, por exemplo, a mudança do número ou da posição de sítios de glicosilação.
Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regi- ões do anticorpo que são localizações preferidas para mutagênese é deno- minado "mutagênese por varredura de alanina", como descrito por Cunnin- gham e Wells, Science, 244: 1.081-1.085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos-alvo é identificado (por exemplo, resíduos com carga, como arg, asp, his, Iys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou com carga ne- gativa (principalmente, alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígenos. Aquelas localizações de aminoácido que de- monstram sensibilidade funcional às substituições são a seguir refinadas por introdução de variantes adicionais ou outras variantes no, ou para, os sítios de substituição. Dessa forma, embora o sítio para a introdução de uma vari- ação da seqüência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mu- tação por si não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em certo sítio, a mutagênese por varredura de ala ou aleatória é realizada no códon ou região-alvo, e as variantes do anticorpo expressas são rastreadas quanto à atividade desejada.
Inserções da seqüência de aminoácidos incluem fusões do ter- minal amino e/ou carboxila que variam, em termos de comprimento, de um resíduo a polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, além de inserções intrassequência de um único ou de múltiplos resíduos de ami- noácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila no terminal N ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo ou polímero. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao término N ou C do anticorpo de uma enzima, ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.
Outro tipo de variante é uma variante por substituição de ami- noácido. Essas variantes possuem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para a mutagênese de anticorpos por substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações RF também são contempladas.
Substituições conservadoras são mostradas na tabela abaixo sob o título de "substituições preferidas". Caso essas substituições resultem em uma alte- ração da atividade biológica, alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na tabela abaixo, ou como descritas com mais detalhe abaixo em referência às classes de aminoácidos, podem ser introdu- zidas, e os produtos rastreados.
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Modificações substanciais das propriedades biológicas do anti- corpo são obtidas por seleção de substituições que diferem significativamen- te em seu efeito sobre a manutenção: (a) da estrutura da cadeia principal na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em lâmina ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio-alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acor- do com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger1 em Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, No- va York (1975)):
(1) não-polares: Ala (A), Val (V), Leu (L)1 Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp(W)1Met(M)
(2) polares sem carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T)1 Cys (C)1 Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) ácidos: Asp (D), Glu (E)
(4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H)
Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu1 lie;
(2) hidrofílicos neutros: Cys1 Ser1 Thr1 Asn1 Gln;
(3) ácidos: Asp1 Glu;
(4) básicos: His, Lys1 Arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp1 Tyr1 Phe.
Substituições não-conservadoras conferirão a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
Qualquer resíduo de cisteína que não-esteja envolvido na ma- nutenção da conformação adequada do anticorpo também pode ser substitu- ído, geralmente com serina, para aumentar a estabilidade oxidativa da molé- cula e evitar reticulação aberrante. Inversamente, ligações de cisteína po- dem ser adicionadas ao anticorpo para aumentar sua estabilidade (particu-
larmente quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo como, por e- xemplo, um fragmento Fv).
Um tipo particularmente preferido de variante por substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parente. Geralmente, as variantes resultantes selecionadas para desenvolvimento posterior terão propriedades biológicas aumentadas em relação ao anticorpo parente do qual são geradas. Uma forma conveniente para gerar essas variantes por substituição é a maturação por afinidade com o uso de exibição de fago. Resumidamente, vários sítios da região hipervari- ável (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são exibidas de forma monovalente por partículas de fago filamentoso como fu- sões ao produto gênico Ill de M13 compactado dentro de cada partícula. As variantes exibidas por fago são então rastreadas quanto à sua atividade bio- lógica (por exemplo, afinidade de ligação), como aqui descrito. A fim de iden- tificar sítios da região hipervariável candidatos à modificação, pode ser reali- zada mutagênese por varredura de alanina para identificar os resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação do an- tígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristal do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Após a geração dessas variantes, o painel de variantes é sub- metido a uma varredura, como aqui descrito, e os anticorpos com proprieda- des superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento posterior.
Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o pa- drão de glicosilação original do anticorpo. Essa alteração inclui a eliminação de uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo e/ou a adição de um ou mais sítios de glicosilação que não-estão presentes no an- ticorpo.
A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente ligada ao N ou Ii- gada ao O. Ligada ao N refere-se à adesão da porção de carboidrato à ca- deia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências tripeptídicas aspa- ragina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para a adesão enzi- mática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Dessa for- ma, a presença de uma dessas seqüências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação ligada ao O refere- se à adesão de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidróxi-aminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas.
A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é obtida conve- nientemente por alteração da seqüência de aminoácidos de forma que ela contenha uma ou mais das seqüências tripeptídicas acima descritas (para sítios de glicosilação ligado ao Ν). A alteração também pode ser feita pela adição, ou substituição, de um ou mais resíduos de serina ou treonina à se- qüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação ligados ao O).
Quando o anticorpo compreender uma região Fc, o carboidrato a ele anexado poderá ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estru- tura de carboidrato madura desprovida de fucose anexada a uma região Fc do anticorpo são descritos no Pedido de Patente U.S. N0: U.S. 2003/0157108 (Presta, L.). Veja também U.S. 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Anticorpos com uma N-acetilglicosamina (GIcNAc) dividida no carboidrato anexado a uma região Fc do anticorpo são citados em WO 2003/011878, Jean-Mairet et ai e na Patente U.S. N0 6.602.684, Umana et ai Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo anexado a uma região Fc do anticorpo são relatados em WO 1997/30087, Patel et ai Veja, também, WO 1998/58964 (Raju, S.) e WO 1999/22764 (Ra- ju, S.) em relação aos anticorpos com carboidrato alterado anexado à região Fc destes. Veja também U.S. 2005/0123546 (Umana et al.) sobre moléculas de ligação de antígeno com glicosilação modificada.
A variante de glicosilação aqui preferida compreende uma regi- ão Fe, em que uma estrutura de carboidrato enxada à região Fc é desprovi- da de fucose. Tais variantes possuem função de ADCC aprimorada. Opcio- nalmente, a região Fc ainda compreende uma ou mais substituições de ami- noácidos nela presentes que aumentam ainda mais a ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração Eu de resíduos). Exemplos de publicações relacionadas aos anticorpos "desfu- cosilados" ou "deficientes em fucose" incluem: U.S. 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; U.S. 2003/0115614; U.S. 2002/0164328; U.S.
2004/0093621; U.S. 2004/0132140; U.S. 2004/0110704; U.S. 2004/0110282; U.S. 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; Okazaki ét al. J. Mol. Biol. 336: 1.239- 1.249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exem- plos de linhagens celulares que produzem anticorpos desfucosilados incluem células CHO Lecl 3 deficientes na fucosilação da proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Pedido de Patente U.S. N0: U.S. 2003/0157108 A1, Presta, L; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especi- almente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout como, por exemplo, o gene de alfa-1,6-fucosiltransferase, células CHO knockout para FUT8 (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).
Moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes da se- qüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por vários métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, sem limitação, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de seqüência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleo- tídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR, e mutagênese por cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anti- corpo.
Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com rela- ção à função efetora, por exemplo, de forma a aumentar a ADCC e/ou CDC do anticorpo. Isso pode ser obtido por introdução de uma ou mais substitui- ções de aminoácidos em uma região Fc de um anticorpo. Alternativa ou adi- cionalmente, resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc per- mitindo, dessa forma, a formação de ligação de dissulfeto intercadeias nessa região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de in- ternalização aumentada e/ou morte celular mediada por complemento e ADCC aumentadas. Veja Caron et al., J. Exp Med. 176: 1.191-1.195 (1992) e Shopes1 J. Immunol. 148: 2.918-2.922 (1992). Anticorpos homodiméricos também podem ser preparados com o uso de Iigantes cruzados heterobifun- cionais, como descrito em Wolff et al. Câncer Research 53: 2.560-2.565 (1993). Alternativamente, pode ser projetado um anticorpo que tenha regiões Fc duplas e que possa, assim, ter capacidades aumentadas de Iise de com- plemento e de ADCC. Veja Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219- 230 (1989).
WO 00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos com função de ADCC aumentada na presença de células efetoras humanas, em que os an- ticorpos compreendem substituições de aminoácidos na região Fc destes. De preferência, o anticorpo com ADCC aumentada compreende substitui- ções nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fe. De preferência, a região Fc alterada é uma região Fc de IgGI humana que compreende ou que con- siste em substituições em uma, duas ou três dessas posições.
Anticorpos com ligação de C1q e/ou CDC alteradas são descri- tos em WO 99/51642, na Patente U.S. N° 6.194.551 B1, na Patente U.S. N° 6.242.195 B1, na Patente U.S. N° 6.528.624 B1 e na Patente U.S. N° 6.538.124 (Idusogie et al.). Os anticorpos compreendem uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 e/ou 334 da região Fc destes.
Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, pode-se incor- porar um epitopo de ligação de receptor de salvamento no anticorpo (espe- cialmente um fragmento de anticorpo), como descrito em na Patente U.S. N0: 5.739.277, por exemplo. Como aqui usado, o termo "epitopo de ligação de receptor de salvamento" refere-se a um epitopo da região Fc de uma mo- lécula de IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia-vida sérica in vivo da molécula de IgG. Anticorpos com substituições em uma região Fc destes e com meias-vidas séricas aumenta- das também são descritos em WO 00/42072 (Presta, L.).
Anticorpos projetados com três ou mais (de preferência, quatro) sítios de ligação de antígeno funcionais também são contemplados (Pedido U.S. N°: U.S. 2002/0004587 A1, Miller etal.). V. Formulações farmacêuticas
Formulações terapêuticas dos anticorpos usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para estocagem por mistura de um anticorpo que possui o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington1S Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol1 A. Ed. (1980)), na forma de for- mulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabili- zantes aceitáveis são atóxicos para os receptores nas dosagens e concen- trações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato e outros áci- dos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conser- vantes (por exemplo, cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos como, por exemplo, metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipep- tídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofíli- cos como, por exemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos, por exemplo, glici- na, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, por exemplo, EDTA; acúcares, por exemplo, sacarose, manitol, tealose ou sorbitol; contraíons formadores de sais, por exemplo, sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína) e/ou tensoativos não iônicos, por exemplo, TWEEN®, PLURONIC® ou polietileno glicol (PEG).
Formulações de anticorpo anti-CD20 exemplares são descritas em WO 98/56418. Essa publicação descreve uma formulação multidoses líquida que compreende 40 mg/ml de rituximab, acetato a 25 mM, tealose a 150 mM, álcool benzílico a 0,9%, polissorbato 20 a 0,02% em pH 5,0, que possui uma validade mínima de dois anos em estocagem a 2-8°C. Outra formulação de anti-CD20 de interesse compreende 10 mg/ml de rituximab em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/ml de di-hidrato de citrato de só- dio, 0,7 mg/ml de polissorbato 80, e Água Estéril para Injeção, pH 6,5. Formulações liofilizadas adaptadas para administração subcu- tânea são descritas na Patente U.S. N0: 6.267.958 (Andya et ai). Essas for- mulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado até uma concentração de proteína elevada, e a formulação reconstituída po- de ser administrada por via subcutânea ao mamífero a ser tratado.
Formas cristalizadas do anticorpo também são contempladas. Veja, por exemplo, U.S. 2002/0136719 A1 (Shenoy et al.).
A formulação aqui apresentada também pode conter mais de um composto ativo (um segundo medicamento, como observado acima), como for necessário, de preferência, aqueles com atividades complementa- res que não afetem de forma adversa uns aos outros. O tipo e as quantida- des eficazes desses medicamentos dependem, por exemplo, da quantidade de anticorpo presente na formulação, e de parâmetros clínicos dos indiví- duos. Os medicamentos preferidos foram citados acima.
Os ingredientes ativos também podem ser englobados em mi- crocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de aglomeração ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas coloidais de liberação de fármacos (por exemplo, lipossomos, mi- croesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são descritas em Remington's Pharma- ceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
Podem ser feitas preparações de liberação sustentada. Exem- plos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou po- li(álcool vinílico)), polilactidas (Patente U.S. N0 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não degradá- vel, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico, por exemplo, LUPRON DEPO® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de áci- do lático- ácido glicólico e acetato de leuprolídeo) e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico.
As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por filtração através de membra- nas de filtração estéreis.
VI. Artigos manufaturados
Em outra modalidade da invenção, são fornecidos artigos ma- nufaturados contendo materiais úteis para o tratamento de lesões articulares descritas acima. A invenção, em particular, fornece um artigo manufaturado que compreende: (a) um recipiente que compreende um antagonista, por exemplo, um anticorpo que se liga a um marcador de superfície das células B (por exemplo, um anticorpo CD20) (de preferência, o recipiente compre- endendo o anticorpo e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável dentro do recipiente); e (b) uma bula com instruções para o tratamento de lesão articular em um indivíduo, em que as instruções indicam que o indiví- duo recebe a administração do antagonista ou do anticorpo (por exemplo, anticorpo CD20) e é então submetido, pelo menos cerca de um mês após a administração, a um exame radiográfico que mede uma redução na lesão articular, comparado aos níveis de base antes da administração, em que a quantidade de antagonista ou anticorpo como, por exemplo, anticorpo CD20, administrada é eficaz na obtenção de uma redução na lesão articular, indi- cando que o indivíduo foi tratado com sucesso.
Em uma modalidade preferida desse aspecto da invenção, o ar- tigo manufaturado aqui apresentado ainda compreende um recipiente que consiste em um segundo medicamento, em que o antagonista ou anticorpo é um primeiro medicamento, e cujo artigo ainda compreende instruções na bula para o tratamento do indivíduo com o segundo medicamento, em uma quantidade eficaz. O segundo medicamento pode ser qualquer um daqueles apresentados acima, com um segundo medicamento exemplar sendo um daqueles apresentados acima, incluindo um antibiótico, um agente imunos- supressor, um fármaco anti-reumático de modificação da doença (DMARD), um agente para controle da dor, um antagonista da integrina, um fármaco anti-inflamatório não-esteroide (NSAID), um antagonista de citocina, bisfos- fonato, ou um hormônio, ou uma combinação destes, mais preferivelmente um DMARD, NSAID, agente para controle da dor ou, agente imunossupres- sor. Mais preferivelmente, o segundo medicamento é metotrexato.
Nesse aspecto, a bula faz parte ou está associada ao recipiente.
Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas etc.
Os recipientes podem ser formados por vários materiais como, por exemplo, vidro ou plástico. O recipiente abriga ou contém uma composição que é eficaz para o tratamento da lesão articular, e pode ter uma via de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa ou um frasco de solução intraveno- sa que possui uma tampa que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o antagonista ou anticorpo. O rótulo ou a bula indica que a composição deve ser para o trata- mento de lesão articular em um indivíduo elegível ao tratamento, com diretri- zes específicas em relação às quantidades e aos intervalos de dosagem de antagonista ou anticorpo e qualquer outro medicamento fornecido. O artigo manufaturado pode ainda compreender um recipiente adicional que compre- ende um tampão diluente farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água bacteriostática para injeção (BWFI), soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de Ringer e/ou solução de dextrose. O artigo manufaturado pode ain- da incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Em modalidades mais específicas, um artigo manufaturado com- preende: (a) um recipiente que compreende um antagonista como, por exem- plo, um anticorpo que se liga a um marcador de superfície das células B (por exemplo, um anticorpo CD20) (de preferência, o recipiente compreende o an- ticorpo e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável dentro do recipi- ente); e (b) uma bula com instruções para o tratamento de lesão articular em um indivíduo, em que as instruções indicam que o indivíduo recebe a adminis- tração do antagonista ou do anticorpo (por exemplo, anticorpo CD20) e é en- tão submetido, pelo menos cerca de 52 semanas após a administração, a um exame radiográfico que mede uma redução na lesão articular, comparado com os níveis de base antes da administração, em que a quantidade de anti- corpo CD20 administrada é eficaz na obtenção de uma redução na lesão arti- cular, indicando que o indivíduo foi tratado com sucesso. Em uma modalidade preferida, o artigo compreende um recipiente que compreende um segundo medicamento, em que o antagonista ou anticorpo (por exemplo, anticorpo CD20) é um primeiro medicamento, compreendendo ainda instruções na bula para o tratamento do indivíduo com o segundo medicamento em uma quanti- dade eficaz. De preferência, esse segundo medicamento é metotrexato.
Maiores detalhes da invenção serão ilustrados pelos Exemplos não Iimitantes que serão apresentados a seguir. As descrições de todas as citações no relatório descritivo são expressamente aqui incorporadas por referência. Exemplo 1
Eficácia e segurança de rituximab em pacientes com uma res- posta inadequada ou ausência de tolerância à terapia anti-TNF prévia
Esse é um teste clínico multicêntrico de grupos em paralelo de Fase III, randomizado, duplo-cego, denominado: "Randomised Evaluation oF Long-term Efficacy_of Rituximab in RA" (REFLEX). O projeto do estudo é mostrado na Figura 1.
Os objetivos desse estudo foram os seguintes: - Determinar a eficácia e a segurança de rituximab, quando u- sado em combinação com metotrexato (MTX), em 517 pacientes com artrite reumatoide ativa que possuem uma resposta inadequada a uma ou mais terapias anti-TNF.
- Explorar a farmacocinética e a farmacodinâmica de rituximab nessa população de pacientes (por exemplo, extensão da duração da elimi- nação de células B e os efeitos sobre imunoglobulinas e fator reumatoide).
Os resultados finais desse estudo foram os seguintes:
- Resultado final primário:
-A proporção de pacientes com uma resposta do ACR20 na 24a Semana.
- Resultados finais secundários: - Proporção de pacientes com respostas ACR50 e ACR70 na
24a Semana.
- Alteração de DAS28 do nível de base até a 24a Semana.
- Resposta EULAR na 24a Semana.
- Alterações em relação ao nível de base na classificação de ACR.
- Alterações em relação ao nível de base em SF-36.
- Alteração da classificação radiográfica de Sharp modificada por Genant total na 56a semana.
- Alteração da classificação radiográfica de Sharp modificada por Genant na 24a semana (exploratória);
- Alteração da classificação da erosão e da classificação do es- treitamento do espaço articular.
Os critérios fundamentais de inclusão desse estudo foram os seguintes:
- Apresentação de uma resposta inadequada ao tratamento prévio ou atual com etanercept, infliximab ou adalimumab por causa de toxi- cidade ou eficácia inadequada.
- Etanercept por > 3 meses a 25 mg duas vezes por semana. - Infliximab pelo menos 4 infusões a ( 3 mg/kg.
- Adalimumab por ( 3 meses a 40 mg em semanas alternadas.
- Deve ter recebido MTX em uma dose de 10-25 mg/semana (por via oral (v.o.) ou parenteral) por pelo menos 12 semanas, com as últi- mas 4 semanas antes da seleção em uma dose estável.
- Retirada de todos os DMARDs/modificadores da resposta bio- lógica pelo menos 4 semanas antes da randomização (8 semanas for inflixi- mab, Ieflunomida e adalimumab).
- Prednisona equivalente a (10 mg/dia.
- Contagem do edema articular (SJC) ( 8 (contagem de 66 arti- culações), e contagem da sensibilidade articular (TJC) ( 8 (contagem de 68 articulações).
- CRP ( 1,5 mg/dl (15 mg/l) ou ESR ( 28 mm/h. - Evidência radiográfica de pelo menos uma articulação com uma erosão definitiva atribuível à artrite reumatoide.
O tratamento de estudo do estudo foi o seguinte:
- Grupo A:
- Rituximab duas infusões i.v. de 1.000 mg no 1o e 15° dias
- Grupo B:
- Infusões i.v. de placebo no 1o e 15° dias.
- Ambos os grupos:
- 100 mg de metilprednisolona i.v. antes de cada infusão de ri- tuximab/ placebo.
- 60 mg/d de prednisona nos I0-I0 dias e 30 mg/d nos 8°-14° di- as.
<table>table see original document page 119</column></row><table>
- ITT:
- Randomizados
- Receberam parte da infusão - Analisados como randomizados
- Por protocolo:
- Como acima, mas aderiram ao protocolo
- Segurança:
- Randomizados
- Receberam parte de infusão
- Analisados como tendo recebido
Dados demográficos dos pacientes:
<table>table see original document page 120</column></row><table>
Características da doença de base dos pacientes:
<table>table see original document page 120</column></row><table> Disposição dos pacientes:
Placebo Rituximab
2 χ 1.000 mg
Randomizados 209 308
Retirados 97(46%) 54(18%)
Eventosadversos 1 (<1%) 8(3%)
Morte
Resposta insuficiente 83 (40%) 36 (12%)
Tratamento recusado 5 (2%) 5 (2%)
Outros 8(4%) 5(2%)
Completaram 24 semanas 112 (54%) 254 (82%)
Os resultados finais do estudo sobre a eficácia são mostrados nas Figuras 1-12.
Os resultados finais radiográficos do estudo são mostrados nas Figuras 13-17.
A mudança média nos parâmetros da classificação de ACR é mostrada na Figura 18.
A análise de segurança do estudo é mostrada nas Figuras 19-31.
As conclusões do estudo REFLEX foram as seguintes:
- Rituximab estava associado a um aumento significativo da ta- xa de resposta do ACR20 em relação ao placebo (resultado primário final).
- Todos os resultados finais secundários e exploratórios (DAS, EULAR, classificação ACR) apoiaram a análise primária.
- Os resultados radiográficos finais indicam que a ramificação de tratamento mostrou uma classificação total de Sharp-Genant menor ao longo de 24 semanas versus a ramificação de placebo (Figura 13), uma classificação da erosão de Sharp-Genant menor ao longo das 24 semanas versus a ramificação de placebo (Figura 14), uma classificação de Sharp- Genant de JSN menor ao longo das 24 semanas versus a ramificação de placebo (Figura 15), uma proporção bem maior de pacientes sem alteração da classificação da erosão em 24 semanas do tratamento versus a ramifica- ção de placebo (Figura 16), com um resumo dos resultados radiográficos finais na 24a semana para as ramificações de placebo e de tratamento apre- sentadas na Figura 17.
- Rituximab foi geralmente bem tolerado.
- Eventos relacionados à infusão
- Taxa de todas as infecções comparáveis ao placebo
- Ligeiro aumento da taxa /incidência de infecções sérias
- Nenhum impacto significativo sobre as imunoglobulinas
- HACA baixa Resultados com 56 semanas:
N0 de pacientes (%)* Placebo Rituximab
(n=186) (n=277)
Completaram 56 semanas 141 (76) 202 (73)
Retirados 46(25) 75(27)
Retirados e receberam tratamento com
inibidor do TNF 12(6,5) 29(10,5)
* Pacientes com dados radiográficos disponíveis em 56 semanas.
A Figura 41 ainda ilustra a disposição do paciente do teste clíni- co REFLEX em 56 semanas, incluindo tratamentos em andamento de sub- grupos de pacientes selecionados das ramificações de tratamento e de pla- cebo do teste clínico REFLEX de Fase III.
Como mostrado na Figura 42, na 56a semana, todas as mudan- ças médias na classificação de Sharp modificada por Genant total (Genant, Am. J. Med., 30: 35-47 (1983)), no estreitamento do espaço articular (JSN) e na classificação da erosão mostraram uma melhora estatisticamente signifi- cativa em relação ao placebo.
A eficácia do tratamento com rituximab é ainda ilustrada pela mu- dança média na classificação de Sharp-Genant total ao longo do tempo. Como mostrado na Figura 43, a melhora continuou da 24a semana até a 56a semana.
A Figura 44 mostra a distribuição cumulativa da mudança na classificação de Sharp-Genant total. A Figura 45 mostra os resultados de análises de sensibilidade, expressados pela mudança na classificação de Sharp-Genant total. A ramifi- cação de tratamento de rituximab + MTX foi consistentemente superior em relação à ramificação de tratamento de placebo + MTX.
A Figura 46 mostra a percentagem de pacientes que não apre- sentaram alterações radiográficas no ponto de observação na 56a semana em sua condição articular, como medida pela classificação da erosão e pela classificação de Sharp modificada por Genant, respectivamente.
Em conclusão, os resultados desse teste clínico mostram que rituximab inibe significativamente a progressão radiográfica em pacientes com artrite reumatoide (RA), com uma resposta inadequada ou intolerância a um ou mais inibidores do TNF. Além disso, esse estudo fornece a primeira indicação de que uma terapia dirigida às células B pode inibir a progressão radiográfica.
Exemplo 2
Rituximab na RA: programa da Fase III
Um resultado final importante para avaliar a RA inclui a inibição da progressão da lesão articular estrutural e a melhora da função física. Esse resultado final é particularmente importante para pacientes que foram diagnosticados recentemente com RA, uma vez que o impacto inicial nesses pacientes traz um beneficio de longo prazo potencialmente maior (Genovese et al., Arthritis Rheum. 46: 1.443-1.450 (2002)). Uma população de pacientes com RA inicial seria, portanto, uma população apropriada para estudo des- ses importantes resultados finais.
Com relação a um tratamento de controle adequado para esses pacientes, a terapia-padrão atual da RA inicial é MTX. Consequentemente, a seleção de uma população de pacientes virgens para o MTX e a compara- ção de rituximab mais MTX com MTX isoladamente fornece uma compara- ção dessa nova abordagem de tratamento contra o tratamento-padrão para esses pacientes.
Esse estudo é um estudo multicêntrico de grupos paralelos ran- domizado de Fase III controlado, duplo-cego, para avaliar a segurança e a eficácia de rituximab em combinação com MTX1 comparado com MTX isola- damente, em pacientes virgens para o MTX com RA ativa. Objetivos primários:
1. Determinar a eficácia de rituximab na prevenção da progres- são da lesão articular estrutural e para avaliar a segurança de rituximab em pacientes com RA ativa que iniciam tratamento com MTX.
2. Avaliar a eficácia de rituximab na melhora da função física do paciente e sinais e nos sintomas de RA.
3. Investigar por uma abordagem de análise da população a farmacocinética (PK) de rituximab na população-alvo de pacientes com RA e a influência de covariáveis sobre os parâmetros PK.
4. Explorar a eficácia e segurança a longo prazo de cursos adi- cionais de rituximab.
Desenho do estudo do primeiro curso:
Grupo A: rituximab 500 mg i.v. x2 mais MTX (7,5 mg aumenta- dos gradualmente até 20 mg v.o.)
Grupo B: rituximab 1.000 mg i.v. χ 2 mais MTX (7,5 mg aumen- tados gradualmente até 20 mg v.o.)
Grupo C: Placebo rituximab i.v. χ 2 mais MTX (7,5 mg aumen- tados gradualmente até 20 mg v.o.)
Para os pacientes do Grupo C, a partir da 104a semana, o retra- tamento com cursos de rituximab 500 mg i.v. χ 2 mais MTX será disponível para pacientes elegíveis.
As seguintes regras para o retratamento, de acordo com os re- gimes acima, se aplicam:
Segundo curso:
Um segundo curso de rituximab mais MTX ou placebo mais MTX será administrado logo que possível, quando for obtido o seguinte:
1. Um período mínimo de 24 semanas tenha se passado desde a primeira infusão do último curso da medicação de estudo.
2. DAS28-ESR > 2,6
3. Os critérios de elegibilidade para contagem absoluta de neutrófilos (não abaixo de 1,5 x 103 μl), IgG (não abaixo 5,0 mg/ml) e IgM (não abaixo 0,40 mg/ml) foram alcançados na última análise de amostra de sangue.
Além disso, o paciente deve preencher os critérios de exclusão de elegibilidade 8, 10 e 11 descritos abaixo:
1. Doença cardíaca ou pulmonar significativa (incluindo doença pulmonar obstrutiva).
2. Imunodeficiência primária ou secundária (história de, ou ativa atualmente), incluindo história conhecida de infecção pelo HIV.
3. Infecção ativa conhecida de qualquer tipo (excluindo infec- ções fúngicas dos leitos ungueais), ou qualquer episódio importante de in- fecção que necessite de hospitalização ou tratamento com anti-infeciosos i.v. em até 4 semanas de infusão ou término de anti-infeciosos orais em até 2 semanas antes da infusão.
Os pacientes que não preenchem os critérios para um segundo curso de rituximab/placebo na 24a semana serão acompanhados a cada 4 a 8 semanas, e receberão subseqüentemente o segundo curso no momento em que se tornarem elegíveis com base nos critérios acima. Cursos adicionais:
A partir da 48a semana, os pacientes podem se tornar elegíveis para receber um terceiro curso de rituximab/placebo. O terceiro curso e os seguintes só podem ser administrados aos pacientes que preencheram os critérios acima para o segundo curso, e nos quais o pesquisador considera que tenha ocorrido uma resposta clínica relevante após o primeiro ou o se- gundo curso de rituximab. Os pacientes que nunca tenham tido uma respos- ta clínica devem ser retirados no acompanhamento de segurança (SFU).
Os pacientes que supostamente tiveram uma resposta clínica, mas que no momento não preencham os critérios para os cursos adicionais de rituximab, serão acompanhados a cada 4 semanas a partir da 48a sema- na até 56a semana, e depois a cada 8 semanas, e receberão subseqüente- mente cursos adicionais no momento em que se tornarem elegíveis com ba- se nos critérios acima. Todos os pacientes receberão pré-medicação com 100 mg de metilprednisolona i.v. antes de cada infusão. Todos os pacientes também receberão uma dose estável de folato (pelo menos 5 mg/semana), dada co- mo uma dose única ou como uma dose semanal dividida.
Todos os pacientes devem continuar a receber qualquer corti- costeroide de base (pelo menos 10 mg/dia prednisona ou equivalente) ou fármacos anti-inflamatórios não-esteroides orais (NSAIDs) em uma dose es- tável. A randomização será estratificada por região (US - Estados Unidos - ou ROW - Rest of Woríd - outros países que não os EUA) e fator reumatoi- de (positivo ou negativo) para assegurar uma alocação equilibrada de paci- entes pelos estados de região e RF entre as ramificações de tratamento.
Os pacientes comparecerão à clínica uma vez a cada 4 sema- nas pelas primeiras 24 semanas, e a cada 8 semanas posteriormente (exce- to para as 48a-56a semanas, quando as consultas serão a cada 4 semanas) para avaliações de eficácia, segurança, imunologia e qualidade de vida. As avaliações radiográficas serão realizadas na seleção, na 24a semana e na 52a semana. Avaliações radiográficas também serão realizadas com 2 e 3 anos após a primeira dose de medicação de estudo.
A avaliação do resultado primário final (mudança na classifica- ção de Sharp modificada total) ocorrerá em 52 semanas. Os resultados fi- nais secundários e exploratórios incluirão resultados radiográficos finais adi- cionais e sinais e sintomas, função física e resultados finais de remissão.
A qualquer momento após a avaliação radiográfica na 52a se- mana, os pacientes que não tenham uma melhora de 20% nas contagens tanto do edema quanto da sensibilidade articular podem receber terapia de resgate com uma dose aumentada de MTX ou um DMARD não biológico.
Todos os pacientes que foram retirados do estudo em qualquer ponto, ou que completaram o período total de tratamento, devem retornar para avaliações de SFU na 4a, 12a, 24a, 36a e 48a semanas após a retirada ou o término do tratamento. Isso acompanha de forma eficaz o paciente por um ano após o paciente ser retirado ou ter completado o estudo. Caso a contagem de células B periféricas (CD19) de um paciente não tenha retor- nado ao seu nível de base ou à faixa da normalidade, o que for mais baixo, após um ano, as consultas de acompanhamento de segurança devem conti- nuar a ser realizadas em intervalos de 12 semanas até que ocorra a recom- posição das células B.
Para todos os eventos adversos infecciosos sérios relatados, devem ser determinadas contagens de CBC, diferenciais, plaquetas, Ig quantitativa e CD19 em até uma semana após o evento adverso infeccioso ter se tornado sério.
Os pacientes removidos do estudo em SFU devem ser fortemente encorajados a retornar para todas as avaliações radiográficas programadas (na 24a, 52a, 104a e 152a semanas), independentemente do seu ponto de retirada do estudo. As radiografias desses pacientes devem ser de acordo com o curso original de avaliações, em relação ao dia original de randomização.
Aproximadamente 852 pacientes serão recrutados para esse estudo, e serão randomizados igualmente em três grupos de tratamento. Os pacientes serão estratificados por região (US ou Resto do mundo ROW) e estado do RF (RF-positivos, pelo menos 20 Ul/ml, ou RF-negativos, menos de 20 Ul/ml). A proporção global de pacientes RF-negativos será limitada a 20% do tamanho total da amostra. O recrutamento será competitivo, com no máximo 70% e no mínimo 30% sendo arrolados em uma das regiões. Não haverá substituição de pacientes, caso o tratamento de um paciente seja suspenso por qualquer motivo.
População-alvo:
A população-alvo para esse estudo é formada por pacientes com RA inicial ativa, que sejam virgens ao MTX.
Critérios de inclusão:
Os pacientes devem preencher os seguintes critérios para se- rem elegíveis ao estudo:
1. Devem ser capazes e dispostos a fornecerem consentimento informado por escrito e se submeter às exigências do protocolo do estudo.
2. Pacientes com RA diagnosticada por pelo menos 8 semanas, mas no máximo 4 anos, de acordo com os critérios revisados em 1987 da ACR para a classificação de RA.
3. Pacientes virgens e considerados como candidatos para o tratamento com MTX.
4. Contagem do edema articular (SJC) de pelo menos 8 (conta- 5 gem de 66 articulações), e contagem da sensibilidade articular (TJC) de pelo
menos 8 (contagem de 68 articulações) na seleção e no nível de base.
5. CRP na seleção de pelo menos 1,2 mg/dl (12 mg/l).
6. 18-80 anos de idade.
7. São permitidos glicocorticoides pelo menos 10 mg/dia de prednisolona ou equivalente, se estável por pelo menos quatro semanas an- tes do nível de base.
8. O uso de NSAIDs é permitido, se estável por pelo menos du- as semanas antes do nível de base.
9. Para pacientes com potencial reprodutivo (homens e mulhe- res), o uso de um meio contraceptivo confiável (por exemplo, contraceptivo
hormonal, emplastro, dispositivo intrauterino, barreira física) por toda a parti- cipação no estudo.
10. Devem querer receber folato oral.
11. Somente para pacientes RF-negativos, evidências radiográ- ficas de pelo menos uma articulação com erosão definitiva atribuível a RA.
12. Pacientes que estejam a ponto de receber, ou que atual- mente recebem, tratamento ambulatorial.
Critérios de exclusão:
Exclusões relacionadas a RA
1. Outra doença reumática autoimune que não RA, ou envolvi- mento sistêmico significativo secundário a RA (incluindo, sem limitação, vas- culite, fibrose pulmonar ou síndrome de Felty). Síndrome de Sjõgren secun- dária ou vasculite cutânea limitada secundária a RA é permitida.
2. Classe funcional IV, definida pela Classificação do Nível Fun- cional na RA da ACR.
3. Presença atual ou história de outra doença articular inflama- tória que não RA (incluindo, sem limitação, gota, artrite reativa, artrite psoriá- tica, espondilo-artropatia soronegativa, doença de Lyme), ou outro distúrbio autoimune sistêmico (incluindo, sem limitação, lúpus eritematoso sistêmico, doença inflamatória do intestino, esclerodermia, miopatia inflamatória, doen- ça mista do tecido conjuntivo, ou qualquer síndrome sobreposta).
4. Diagnóstico de artrite juvenil idiopática (JIA) ou RA juvenil (JRA) e/ou RA antes dos 16 anos de idade. Exclusões relacionadas à saúde geral:
5. Quaisquer procedimentos cirúrgicos, incluindo cirurgi- a/sinovectomia óssea/articular (incluindo fusão ou substituição articular) em até 12 semanas antes do nível de base ou planejada durante o estudo.
6. Ausência de acesso venoso periférico.
7. Gravidez ou amamentação.
8. Doença cardíaca ou pulmonar importante e/ou não- controlada (incluindo doença pulmonar obstrutiva).
9. Evidências de doença concomitante significativa, incluindo, sem limitação, distúrbios do sistema nervoso, renais, hepáticos, endócrinos ou gastrointestinais os quais, na opinião do pesquisador, excluiriam a parti- cipação do paciente.
10. Imunodeficiência primária ou secundária (história de, ou ati- va atualmente), incluindo história conhecida de infecção pelo HIV.
11. Infecção ativa conhecida de qualquer tipo (excluindo infec- ções fúngicas dos leitos ungueais), ou qualquer episódio importante de in- fecção que necessite de hospitalização ou tratamento com anti-infeciosos i.v. em até 4 semanas do nível de base ou término de anti-infeciosos orais em até 2 semanas antes do nível de base.
12. História de infecção de espaço/tecido profundo (por exem- plo, fascite, abscesso, osteomielite) em até 52 semanas antes do nível de base.
13. História de infecção séria recorrente ou crônica (para pes- quisa de uma infecção pulmonar, será realizada uma radiografia do tórax na seleção, caso não tenha sido realizada em até 12 semanas antes da sele- ção). 14. História de câncer, incluindo tumores sólidos, doenças he- matológicas malignas e carcinoma in situ (exceto carcinoma de célula basal e de células escamosas da pele que foi removido e curado).
15. Qualquer distúrbio neurológico (congênito ou adquirido), vascular ou sistêmico que possa afetar qualquer uma das avaliações da efi- cácia, em particular, dor e edema articulares (por exemplo, doença de Par- kinson, paralisia cerebral, neuropatia diabética).
16. Uso abusivo de álcool ou fármaco ativo atual ou história de uso abusivo de álcool ou fármacos em até 24 semanas antes do nível de base.
Exclusões relacionadas às medicações:
17. História de reação alérgica ou anafilática grave a um agente biológico ou hipersensibilidade conhecida a qualquer componente de rituxi- mab ou a proteínas murinas.
18. Tratamento prévio com qualquer agente biológico aprovado ou em investigação para RA.
19. Tratamento prévio com um anticorpo de integrina anti-alfa 4 ou modulador da coestimulação.
20. Tratamento concomitante com qualquer agente biológico ou DMARD diferente de MTX. O tratamento deve ser suspenso 14 dias antes do nível de base, exceto pelos seguintes: azatioprina por pelo menos 28 di- as; Ieflunomida por pelo menos 8 semanas (ou pelo menos 14 dias após 11 dias de eliminação-padrão de colestiramina ou de carvão ativado).
21. Tratamento prévio com quaisquer terapias de eliminação de células, incluindo agentes em investigação (por exemplo, CAMPATH, anti- CD4, anti-CD5, anti-CD3, anti-CD19, anti-CD11a, anti-CD22, BLys/BAFF, e anti-CD20).
22. Tratamento com qualquer agente em investigação em até 28 dias do nível de base ou cinco meias-vidas do fármaco em investigação (o que for mais longo).
23. Ter recebido uma vacina de vírus vivo/atenuado em até 28 dias antes do nível de base (recomenda-se que o cartão de vacinação do paciente e a necessidade de imunização antes de receber rituximab/placebo sejam investigados cuidadosamente).
24. Glicocorticoides intra-articulares ou parenterais em até 4 semanas antes do nível de base.
25. Intolerância ou contraindicações aos glicocorticoides i.v.
Exclusões relacionadas aos achados laboratoriais:
26. Gonadotropina coriônica humana sérica (hCG) positiva me- dida antes da primeira infusão de rituximab.
27. Testes positivos para antígeno de superfície da hepatite B
(HBsAg)1 anticorpo central da hepatite B (HBsAb) ou sorologia para hepatite C.
28. Hemoglobina abaixo de 8,0 g/dl.
29. Concentrações de IgG e/ou IgM séricas abaixo de 5,0 e 0,40 mg/ml, respectivamente.
30. Contagem absoluta de neutrófilos (ANC) abaixo de 1,5 χ
103/μl.
31. AST ou ALT acima de 2,5 vezes o limite superior do normal.
O final do tratamento é definido como o resultado final após o período de 3 anos, após o qual haverá um período adicional de pelo menos um ano de SFU.
Rituximab (500 mg ou 1.000 mg) mais MTX ou placebo mais
MTX serão administrados por infusão IV no 1º e 15° dias. Os pacientes po- dem ser elegíveis para retratamento (duas doses com intervalo de 14 dias) com uma freqüência máxima de um retratamento a cada 24 semanas. Os pacientes originalmente randomizados para receber rituximab mais MTX re- ceberão retratamento na mesma dose por todo o estudo. A partir da 104a semana, os pacientes originalmente randomizados para placebo mais MTX podem ser elegíveis para receber rituximab (500 mg) mais MTX. A pré- medicação com 100 mg de metilprednisolona i.v. deve ser administrada an- tes de cada infusão.
Comprimidos de metotrexato (7,5 mg/semana aumentados gra- dualmente até 20 mg/semana) serão administrados por via oral a todos os grupos. Recomenda-se que todos pacientes sejam pré-medicados com paracetamol/acetaminofeno (1 gm v.o.) e HCI de difenidramina (100 mg i.v. ou anti-histamínico oral equivalente), 30 a 60 minutos antes do início de uma infusão para reduzir o potencial de reações à infusão.
Os pacientes receberão folato ou equivalente (pelo menos 5 mg/semana), dado como uma dose única ou como uma dose semanal divi- dida.
Os pacientes podem continuar a receber qualquer glicocorticoi- de de base (pelo menos 10 mg/dia de prednisona ou equivalente). Podem ser usados analgésicos, se necessário.
O endpoint é a mudança desde a seleção na classificação de Sharp modificada total na 52a semana com o uso da população da invenção de tratamento (intent-to-treat) (ITT) modificada.
Os endpoints secundários radiográficos são os seguintes:
1. uma mudança da classificação de Sharp modificada total nas 24a e 104a Semanas.
2. uma mudança na classificação de Sharp modificada da ero- são na 52a Semana.
3. uma mudança na classificação modificada do estreitamento do espaço articular na 52a Semana.
4. A proporção de pacientes sem progressão radiográfica na 52a Semana (definida como mudança na classificação de Sharp modificada total menor ou igual a 0). Além disso, a proporção de pacientes sem pro- gressão radiográfica nas 24a e 104a Semanas será analisada.
Os resultados radiográficos finais exploratórios são os seguin- tes:
1. uma mudança nas classificações de Sharp modificadas serão apresentadas ao longo do tempo.
2. Proporção de pacientes sem progressão radiográfica nas 24a, 52a, e 104a Semanas será ainda apresentada nas seguintes subcategorias:
a) Proporção de pacientes sem mudanças na classificação de Sharp modificada da erosão a partir da seleção. b) Proporção de pacientes sem mudanças na classificação mo- dificada do estreitamento do espaço articular a partir da seleção.
c) Proporção de pacientes sem articulações recém-erodidas.
As avaliações radiográficas serão feitas da seguinte forma: ra- diografias separadas de cada mão póstero-anterior (PA), e de cada pé ânte- ro-posterior (AP), serão feitas de acordo com o curso de avaliações. Na con- sulta de seleção, a legibilidade e a qualidade das radiografias (como pode ser encontrado em um manual de procedimentos para exames radiográficos das mãos, punhos e pés) devem ser confirmadas, antes de o paciente deixar o local de exame. As radiografias para pacientes RF-negativos na consulta de seleção serão pesquisadas em busca de evidências radiográficas de pelo menos uma articulação com uma erosão definitiva atribuível a RA pelo local de leitura central. Todas as radiografias serão avaliadas com o uso do méto- do de acordo com Sharp, modificado por Genant, Am. J. Med., 30: 35-47 (19δ3). A avaliação primária será a alteração a partir da seleção na classifi- cação de Sharp modificada total na 52a semana. A classificação de Sharp modificada total combina uma classificação da erosão e uma classificação do estreitamento do espaço articular de ambas as mãos e ambos os pés. A classificação máxima total da erosão nas mãos é de 100, e nos pés, de 42, as classificações máximas para o estreitamento do espaço articular nas mãos é de 100, e nos pés, de 48. A classificação de Sharp modificada total máxima que pode ser obtida é de 290. A mudança na classificação na 52a semana deve ser calculada como:
Mudança = classificação da 52a semana menos classificação na seleção.
Serão feitas radiografias das mãos e dos pés para computar uma classificação de Sharp modificada total. Antes do inicio do teste, todos os departamentos de radiologia participarão de sessões de treinamento para padronizar as radiografias. Essas incluirão padronização para procedimentos de validação quanto aos equipamentos, filmes, cassetes, colocação das mãos/pés e procedimentos para a obtenção de radiografias consistentes.
Espera-se que a mudança na classificação de Sharp modificada total seja aleatória e, portanto, não se distribua normalmente. Portanto, a mu- dança na classificação de Sharp modificada total na 52a semana será testada entre grupos de tratamento com o uso de uma estratificação estatística do teste não paramétrico para região e estado do RF. No entanto, caso os dados se mostrem aproximadamente distribuídos normalmente, os dados serão analisa- dos com o uso de uma análise de modelo de variância (ANOVA) com região, estado do RF e grupos de tratamento como termos exploratórios no modelo.
O princípio do fechamento será utilizado para ajustar compara- ções múltiplas no resultado primário final. A primeira comparação será entre cada uma das três ramificações de tratamento com o uso da estatística de um teste de Kruskal-Wallis.
As três ramificações de tratamento serão consideradas diferen- tes caso haja evidências estatísticas suficientes para rejeitar a seguinte hipó- tese nula:
Ho:- μ1 = u2 = u3OU seja, sem evidências de que haja qualquer di- ferença na mudança na classificação de Sharp modificada total em qualquer uma das ramificações de tratamento e aceita-se a hipótese alternativa:
Ho:u1 não é igual a μ2, ou μι não é igual a p3, ou μ2 não é igual a P3 ou seja, há uma diferença na mudança na classificação de Sharp modifi- cada total em pelo menos uma das comparações pareadas de tratamentos.
Caso o resultado do teste seja estatisticamente significativo no nível V = 0,05, conclui-se que há uma diferença na mudança a partir do nível de base na classificação de Sharp modificada total na 52a semana, entre as ramificações de tratamento.
Subseqüentemente, cada um dos grupos de rituximab é compa- rado com o grupo de placebo, no nível V = 0,05, como descrito abaixo. As comparações primárias serão consideradas como sendo o grupo individual de dose de rituximab vs. o grupo de placebo, com o uso da estatística do teste de Van Elteren.
Cada uma das ramificações tratadas com rituximab será consi- derada superior ao placebo caso haja evidências estatísticas suficientes pa- ra rejeitar a seguinte hipótese nula: H0: μ1 = M2 ou seja, sem evidências de que a mudança na clas- sificação de Sharp modificada total na ramificação de rituximab seja superior à ramificação de placebo e aceita-se a hipótese alternativa:
H1: μ1 não é igual a u2 ou seja, a mudança na classificação de Sharp modificada total na ramificação de rituximab é superior à ramificação de placebo.
Caso o resultado do teste seja estatisticamente significativo no nível V = 0,05, será concluído que a ramificação de rituximab demonstrou uma mudança superior a partir do nível de base na classificação de Sharp modificada total na 52a semana, quando comparada com a ramificação de placebo.
Serão feitos esforços para assegurar, sempre que possível, que os pacientes retornem para suas consultas radiográficas, mesmo se forem retirados do fármaco de estudo. Os dados perdidos da 52a semana serão readquiridos com o uso dos seguintes métodos:
Caso estejam faltando os dados radiográficos da 52a semana, serão usados os dados radiográficos da 24a semana para extrapolar linear- mente o resultado da 52a semana do paciente. Aqueles pacientes retirados prematuramente do estudo antes da 52a semana serão incluídos como parte da análise de dados radiográficos da 52a semana. Todos os pacientes que não possuam dados radiográficos pós-seleção serão excluídos da população ITT modificada e, portanto, da análise do resultado primário final.
A influência de desequilíbrios potenciais nas alocações de tra- tamento dentro de locais particulares será investigada. Serão realizadas análises de sensibilidade para avaliar o impacto de locais grosseiramente desequilibrados sobre a análise primária.
Quanto aos resultados radiográficos finais secundários, a mu- dança na classificação de Sharp modificada total nas 24a e 104a semanas será analisada da mesma forma que a especificada para o resultado primá- rio final. A mudança na classificação de Sharp modificada da erosão na 52a semana será analisada da mesma forma que a especificada para o resultado primário final. Além disso, a mudança na classificação de Sharp modificada da erosão nas 24a e 104a semanas será analisada. A mudança na classificação modificada do estreitamento do espaço articular na 52a semana será analisada da mesma forma que a especificada para o resultado primá- rio final. Além disso, a mudança na classificação modificada do estreitamen- to do espaço articular nas 24a e 104a semanas será analisada. A proporção de pacientes sem progressão radiográfica na 52a semana (definida como uma mudança na classificação de Sharp modificada total menor ou igual a 0) será analisada da seguinte forma: a diferença nas proporções será testada com o uso de uma estratificação estatística do teste de Cochran-Mantel Haenszela (CMH) para região e estado do RF. Além disso, a proporção de pacientes sem progressão radiográfica nas 24a e 104a semanas será anali- sada.
Quanto aos resultados radiográficos finais exploratórios, a mu- dança nas classificações de Sharp modificadas serão apresentadas ao longo do tempo. A proporção de pacientes sem progressão radiográfica nas 24a, 52a e 104a semanas será ainda apresentada nas seguintes subcategorias:
- Proporção de pacientes sem mudanças na classificação de Sharp modificada da erosão a partir da seleção.
- Proporção de pacientes sem mudanças na classificação modi- ficada do estreitamento do espaço articular a partir da seleção.
- Proporção de pacientes sem articulações recém-erodidas.
Os detalhes das articulações para a avaliação radiográfica e escalas de graduação (Genant, Am. J. Med., 30: 35-47 (1983)) são os se- guintes:
Escalas de graduação:
1. Estreitamento do espaço articular (JSN)
Grau 0-Normal.
Grau 0,5-JSN sutil ou achados duvidosos.
Grau 1,0-JSN leve (focai ou discreto).
Grau 1,5-JSN leve a moderado.
Grau 2,0-JSN moderado.
Grau 2,5-JSN moderado a grave. Grau 3,0-JSN grave.
Grau 3,5-JSN grave, próximo à anquilose.
Grau 4,0-Anquilose distinta.
2. Erosões (interrupção distinta da superfície cortical)
Grau 0-Normal.
Grau 0,5-Perda sutil da continuidade cortical ou achados duvi- dosos de erosão óssea.
Grau 1,0-Leve. Erosões nítidas, mas pequenas, de um ou am- bos os ossos articulares, normalmente nas áreas descobertas que envolvem menos de 25% das superfícies articulares.
Grau 1,5-Leve a moderada. Erosões pequenas a médias que envolvem menos de 25% da superfície articular de um ou ambos os ossos articulares.
Grau 2,0-Moderado. Erosões médias a grandes que envolvem 26-50% da superfície articular de ambos os ossos articulares.
Grau 2,5-Moderado a grave. Erosões de 51-75% das superfí- cies articulares.
Grau 3,0-Grave. Erosões de 76-90% das superfícies articula- res.
Grau 3,5-Muito grave. Erosões de 100% das superfícies articu- lares (destruição total das superfícies articulares).
Avaliação da articulação: 1. Estreitamento do espaço articular na mão (13 articulações por mão):
a) Todas as articulações interfalangianas proximais (PIP) nos dedos Il-V.
b) A articulação interfalangiana no dedo I.
c) Todas as articulações metacarpofalangianas (MCP).
d) As articulações carpometacárpicas (CMC) dos dedos Ill-V como uma unidade única.
e) O espaço pericapitato (escafoide-capitato e lunato-capitato combinados).
f) A articulação radiocárpica 2. Classificações das erosões na mão (14 articulações por mão):
a) Todas as articulações interfalangianas proximais (PIP) nos dedos ll-V.
b) A articulação interfalangiana no dedo I.
c) Todas as articulações metacarpofalangianas (MCP).
d) As articulações carpometacárpicas (CMC) do dedo I.
e) O osso escafoide.
f) O rádio distai.
g) A ulna distai.
As classificações serão somadas separadamente (14 χ 3,5 má- ximo por articulação χ 2 = 98 para erosões e 13 χ 4 máximo por articulação χ 2 para JSN). Cada soma será normalizada para uma escala de 0 - 100. Am- bas as classificações serão adicionadas para obter uma classificação total (escala de 0 - 200).
3. Estreitamento do espaço articular e erosões (6 articulações por pé):
a) Todas as articulações metatarsofalangianas (MTP).
b) Todas as articulações interfalangianas no dedo I.
As classificações serão somadas separadamente (6 χ 3,5 má- ximo por articulação χ 2 = 42 para erosões e 6 χ 4 máximo por articulação χ 2 = 48 para JSN. Ambas as classificações serão adicionadas para obter uma classificação total com uma escala de 0 - 90).
As radiografias originais serão enviadas para o local de leitura central, onde terão a qualidade controlada. Caso a radiografia inicial seja de qualidade inaceitável, o centro será avisado de que são necessárias corre- ções e instruído para obter uma segunda radiografia.
Todos os pacientes randomizados no estudo que receberam pelo menos parte de uma dose de rituximab (incluindo aqueles que foram retirados no acompanhamento de segurança) terão radiografias das mãos/punhos e pés tiradas nas 24a, 52a, 104a e 152a semanas. Os pacientes devem ser fortemente encorajados a retornar parta todas as avaliações ra- diográficas, independentemente de seu ponto de retirada do estudo. As ra- diografias desses pacientes devem ser feitas de acordo com o curso original de avaliações, em relação ao dia original de randomização.
Resultados finais secundários e exploratórios adicionais serão sinais e sintomas, função física, remissão e resultados finais relatados pelo paciente.
A mudança na classificação de Sharp modificada total na 52a semana será testada entre grupos de tratamento com o uso de uma estratifi- cação estatística de um teste não paramétrico para região e estado do RF. No entanto, caso fique demonstrado que os dados se distribuem quase nor- malmente, os dados serão analisados com um modelo de análise de variân- cia (ANOVA)1 com região, estado do RF e grupos de tratamento como ter- mos exploratórios no modelo.
É claramente desejável manter os pacientes em um estado de baixa atividade da doença limitando-se as crises da doença e potencialmente limitando-se a progressão do dano estrutural. No estudo DANCER citado acima (Emery et al., EULAR, supra, e Van Vollenhoven et ai, EULAR, supra), na 24a semana, aproximadamente 90% dos pacientes tratados com rituximab não ob- tiveram remissão EULAR (DAS28). No estudo que é objeto desse Exemplo, estes pacientes seriam elegíveis para receber seu primeiro retratamento de rituximab na 24a semana. O retratamento mandatório com base em DAS28- ESR fornece informações objetivas em relação a um paradigma de retratamen- to baseado na atividade da doença. O período mínimo de 24 semanas entre os cursos é recomendado com base na farmacocinética e farmacodinâmica de rituximab. Sem se prender a uma teoria, a farmacocinética e farmacodinâmica de rituximab parecem demonstrar que, nesse momento (24a semana), os níveis de fármaco estão abaixo do nível de detecção, e há evidências de retorno das células CD19+ periféricas. Isso ocorre em paralelo a um aumento aparente da atividade da doença após esse momento e, portanto, representa um ponto ra- zoável a partir do qual podem ser dados cursos adicionais.
Espera-se que rituximab (ou um anticorpo 2H7 humanizado que substitua rituximab) em combinação com MTX seja eficaz para atingir o re- sultado primário final na prevenção de progressão na lesão articular estrutu- ral, como apresentado neste Exemplo. Espera-se também que o regime des- te estudo alcance um ou mais dos resultados radiográficos secundários fi- nais. Dessa forma, espera-se que a administração de uma primeira dose de rituximab ou 2H7 humanizado (a 500 mg χ 2 ou 100 mg χ 2) com metotrexa- to) reduza a lesão articular em relação ao nível de base (antes da primeira administração de anticorpo CD20), como medido pela classificação de Sharp modificada total, pelo menos cerca de um mês após o nível de base ou início do tratamento, de preferência, pelo menos cerca de 24 semanas após o ní- vel de base, mais preferivelmente pelo menos cerca de 52 semanas após o nível de base, e em momentos adicionais até 104 semanas após o nível de base. Espera-se também que os pacientes possam ser tratados eficazmente com 24 semanas ou 52 semanas após o nível de base para manter essa prevenção da progressão da lesão articular.
Espera-se e prevê-se que a administração de rituximab ou um 2H7 humanizado ao indivíduo no protocolo de redosagem programada apre- sentado acima seja eficaz na prevenção da progressão de lesão articular estrutural na 52a semana ou posteriormente. Espera-se que esses resulta- dos sejam significativamente melhores do que os do controle.
Espera-se também que em torno da 48a-54a semana, outra do- se de 1 g ou 2 g do anticorpo CD20 (por exemplo, rituximab ou um 2H7 hu- manizado), dada de uma só vez ou espalhada ao longo de 14-16 dias em quantidades de 0,5 ou 1 grama, seria eficaz para tratar lesão articular por todo o segundo ano, com ou sem um ou mais segundos medicamentos co- mo, por exemplo, agentes imunossupressores. Dessa forma, o anticorpo CD20 seria administrado inicialmente dentro de um período de tempo de aproximadamente 2 semanas, seguido por outro tratamento em cerca de 4-8 meses, seguido por outro tratamento em cerca de um ano a partir do trata- mento inicial (medido a partir do momento em que qualquer uma das doses foi dada), seguido por tratamento em cerca de dois anos a partir do trata- mento inicial, com o sucesso esperado, em uma dosagem de cerca de meio grama ou um grama χ 2-4 para cada tratamento, administradas em conjunto, aproximadamente uma vez por semana ou aproximadamente em semanas alternadas, ao longo de aproximadamente duas a quatro semanas. Supos- tamente, os resultados desse tratamento seriam bem melhores do que os do controle com placebo. Espera-se que esse protocolo de retratamento seja usado com sucesso por vários anos, com poucos ou sem efeitos adversos.
Contempla-se também que rituximab, ou outro anticorpo CD20, atingirá o resultado primário final como monoterapia, com o uso do mesmo regime na mesma dose, ou com uma dose maior, sem um segundo medi- camento como, por exemplo, MTX, e que o retratamento com o uso do mesmo regime na mesma dose, ou com uma dose maior, seria bem- sucedido como monoterapia. Exemplo 3
Estudo da eficácia do retratamento com rituximab em pacientes com artrite reumatoide
Esse exemplo descreve um estudo multicêntrico de Fase III, controlado por placebo, randomizado, duplo-cego, do retratamento com ritu- ximab em indivíduos com RA que recebem metotrexato associado.
O objetivo primário desse estudo é avaliar a eficácia do retra- tamento com rituximab em indivíduos com RA ativa que estão recebendo MTX e que tiveram uma resposta inadequada aos inibidores do TNF.
Os objetivos secundários desse estudo são os seguintes:
- avaliar a segurança do retratamento com rituximab em indiví- duos com RA ativa que estão recebendo MTX e que tiveram uma resposta inadequada aos inibidores do TNF.
- avaliar a segurança de rituximab em indivíduos com RA ativa que estão recebendo MTX e que tiveram uma resposta inadequada aos ini- bidores do TNF.
Esse é um estudo multicêntrico de Fase III, controlado por pla- cebo, randomizado, duplo-cego, que avalia a eficácia do retratamento com rituximab em indivíduos com RA ativa que recebem MTX. O estudo consiste em quatro partes: seleção, período de tratamento (em aberto para o rituximab para o primeiro curso e, para indivíduos elegiveis, retratamento randomizado, duplo-cego), acompanhamento de segurança (SFU) e acompanhamento de células B. Os indivíduos devem ter tido resposta inadequada ao tratamento com um ou mais inibidores do TNF por causa de toxicidade ou eficácia inade- quada. Aproximadamente 555 indivíduos serão incluídos no período de trata- mento em aproximadamente 150 locais de investigação nos Estados Unidos. Serão arrolados indivíduos RF-positivos e RF-negativos, e eles serão aloca- dos igualmente entre as ramificações de tratamento, com a proporção global de indivíduos RF-negativos limitada a 20% do tamanho total da amostra.
Antes do 1° Dia, serão suspensos os DMARDs de todos os in- divíduos, exceto MTX (para leflunomida1 adalimumab e infliximab por ≥ 8 semanas e etanercept por ≥ 4 semanas). Todos os indivíduos continuarão a receber MTX 10-25 mg/semana, em uma dose estável pela duração do es- tudo. A consulta de seleção pode ocorrer em até 56 dias antes do recebi- mento da primeira dose de tratamento de estudo, dependendo das necessi- dades de eliminação de outros medicamentos.
Todos os indivíduos que preenchem os critérios de elegibilidade e que são incluídos no experimento receberão rituximab pelo primeiro curso de tratamento. Um curso de rituximab é definido como duas doses intrave- nosas (IV) de 1.000 mg, dadas com intervalo de 14 dias, com pré-medicação com metilprednisolona 100 mg IV antes de cada dose de rituximab. Todos os indivíduos também receberão uma dose estável de folato (≥ 5 mg/semana). Todos os indivíduos devem continuar a receber quaisquer corticosteroides de base (≤10 mg/dia prednisona ou equivalente), ou fármacos anti- inflamatórios não-esteroides orais (NSAIDs) em uma dose estável.
A primeira dose de rituximab deve ser dada em até 24 horas após as avaliações do nível de base. No entanto, se necessário, serão per- mitidas até 72 horas entre as avaliações do nível de base e a primeira dose do fármaco do estudo.
Durante as 24a-40a Semanas, indivíduos que possuem doença ativa com base na classificação de atividade da doença em 28 articulações (DAS 28 - velocidade de sedimentação de eritrócitos [ESR]) ≥ 2,6 serão con- siderados elegíveis para retratamento, e serão randomizados em uma pro- porção de 2:1 para receberem retratamento com um curso adicional de ritu- ximab (Grupo A) ou placebo (Grupo B). Os indivíduos que não preenchem os critérios para um segundo curso de rituximab durante as 24a-40a Sema- nas continuarão a ser acompanhados quanto à segurança e eficácia. Os in- divíduos que preenchem os critérios para retratamento durante as 24a-40a Semanas e recusam o retratamento, por qualquer motivo, serão retirados do período de tratamento e entrarão no período de SFU.
Serão realizadas avaliações padronizadas de artrite e seguran- ça. As medidas farmacodinâmicas incluirão células B CD19+, imunoglobuli- nas e autoanticorpos. As classificações DAS 28-ESR serão calculadas pelo investigador em consultas programadas regularmente (Prevoo et al. Arthritis Rheum 38: 44-48 (1995); "DAS-score.nl 2005 DAS-score.nl 2005: home of the DAS". "Department of Rheumatology University Medicai Center Nijme- gan—the Netherlands". [citado em 1° de setembro de 2005]. Disponível em: http://www.das-score.nl/www.das-score.nl/index.html).
O período de tratamento tem duração de 72 semanas (1° Dia a 72a Semana). Todos os indivíduos que foram retirados do período de trata- mento em qualquer momento, ou que recebem retratamento com rituxi- mab/placebo entre as 24a-40a Semanas e completam o período de trata- mento, devem retornar para avaliações de SFU nas 4a, 12a, 24a, 36a e 48a Semanas de SFU após a retirada ou a conclusão do estudo. Todos os indi- víduos serão acompanhados por pelo menos 48 semanas após sua última dose de rituximab. Todos os indivíduos que recebem apenas um curso de tratamento com rituximab (ou seja, aqueles que não se qualificam para o retratamento durante o estudo) e completam o período de tratamento não retornarão para SFU.
Os indivíduos cujas contagens de células B periféricas não se recuperaram ao final do período de tratamento ou do período de SFU conti- nuarão a ser acompanhados para avaliações laboratoriais e quanto à ocor- rência de eventos adversos sérios a cada 12 semanas, até a recuperação das células Β. A recuperação das células B é definida como contagens peri- féricas de CD19+ que retornaram aos valores de base ou ao limite inferior dos valores normais (LLN), o que for menor.
Com 16 semanas ou mais após o retratamento, os indivíduos que não obtiveram uma melhora de 20% tanto nas contagens da sensibilida- de articular (TJCs) quanto nas contagens do edema articular (SJCs), compa- radas com o nível de base, podem iniciar o tratamento de resgate com um DMARD não biológico, cuja escolha fica a critério do médico assistente.
Em um estudo de retratamento com rituximab na RA1 os indiví- duos obtiveram respostas sustentadas do "American College of Rheumato- logy" (ACR) de 20, 50 e 70 (Pavelka et ai "Efficay and safety following repe- ated courses of rituximab in patients with active rheumatoid arthritis". Resu- mo apresentado em EULAR 2005). No entanto, pelo fato desse estudo ser um estudo em aberto, não há dados controlados que avaliem a eficácia e segurança do retratamento com rituximab na RA. O presente estudo é proje- tado para avaliar a eficácia do retratamento em um teste controlado por pla- cebo com um único curso adicional de rituximab em indivíduos com RA ati- va. Os indivíduos com doença ativa, caracterizada por DAS 28-ESR > 2,6, serão tratados com um segundo curso do fármaco do estudo (rituximab ou placebo) durante as 24a-40a Semanas.
As finalidades do retratamento com rituximab é evitar as crises, promover o controle sustentado da doença, e potencialmente evitar a pro- gressão da doença. O critério de DAS 28-ESR > 2,6 para retratamento irá assegurar que os indivíduos com atividade clinicamente significativa da do- ença sejam tratado novamentes. O DAS 28-ESR será calculado com o uso do número de articulações edemaciadas e sensíveis, o ESR1 e a Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (em uma escala visual análoga de 100 mm [VAS]).
O resultado primário final desse estudo é a proporção de indiví- duos tratado novamentes com uma ACR20 na 48a Semana em relação ao nível de base (1o Dia), e não em relação ao momento do retratamento. Foi escolhido o nível de base (1o Dia), e não o momento do retratamento, a fim de avaliar o benefício global do retratamento com rituximab em indivíduos com RA de moderada a severa. Sem se prender a uma teoria, há a hipótese de que o retratamento com RTX resulte na manutenção do efeito até uma ligeira melhora na 48a Semana em relação a 24a Semana, em comparação com a deterioração nos indivíduos tratados com placebo. Embora possa ha- ver um nítido benefício do tratamento em indivíduos tratado novamentes, as respostas ACR20 na 48a Semana em relação a um nível de base da 24a Semana para ambos os grupos podem ser insignificantes. Dessa forma, es- se estudo não é projetado para avaliar a melhora a partir do momento do retratamento.
Com base nos dados da 24a Semana no estudo de Fase Ill (REFLEX, WA17042/U2646s/IDEC102-20), aproximadamente 91% dos indi- víduos tratados com rituximab teriam preenchido o critério do retratamento (DAS 28-ESR > 2,6) na 24a Semana desse protocolo. O retratamento man- datório com base em DAS 28-ESR fornecerá informações objetivas da eficá- cia com o uso de um paradigma de retratamento baseado na atividade da doença. O período mínimo de 24 semanas se baseia na farmacocinética e na farmacodinâmica de rituximab. Isso ocorre em paralelo a um aumento aparente da atividade da doença após esse momento e, portanto, representa um momento razoável para o retratamento.
A medida do resultado final primário é a proporção de indiví- duos tratado novamentes com uma resposta do ACR20 na 48a Semana em relação ao nível de base (1o Dia).
As medidas do resultado final secundário são as seguintes:
- Proporção de indivíduos tratado novamentes com uma respos- ta do ACR50 e ACR70 na 48a Semana em relação ao nível de base (1o Dia).
- Mudança em DAS 28-ESR na 48a Semana comparado com o nível de base (1o Dia) para indivíduos tratado novamentes.
- Proporção de indivíduos tratado novamentes que obtêm a resposta da "European League Against Rheumatism" (EULAR) (boa ou mo- derada) na 48a Semana em relação ao nível de base (1o Dia).
- Alteração da classificação de ACR na 48a Semana comparada com o nível de base (1o Dia) para indivíduos tratado novamentes (SJC, TJC, "Health Assessment Questionnaire" [HAQ], avaliações globais do paciente e do médico, avaliação da dor pelo paciente, proteína C reativa [CRP] e ESR).
- ACR-N na 48a Semana em indivíduos tratado novamentes. - Mudança na subescala SF-36 e classificações resumidas a partir do nível de base (1o Dia) até a 48a Semana em indivíduos tratado no- vamentes.
- Mudança em avaliação da "Functional Assessment of Chronic Illness Therapy-Fatigue" (FACIT-F) a partir do nível de base (1o Dia) até a 48a Semana em indivíduos tratado novamentes.
- Proporção das respostas ACR20, ACR50, e ACR70 na 48a Semana em todos os indivíduos.
As medidas do resultado exploratório final são as seguintes:
- Proporção de todos os indivíduos que obtêm uma resposta do ACR20, ACR50 e ACR70 na 72a Semana, comparado com o nível de base.
- Proporção de indivíduos com remissão de DAS 28-ESR (DAS 28-ESR < 2,6) na 48a Semana.
- Proporção de indivíduos com redução da doença DAS 28-ESR (DAS 28-ESR < 3,2) na 48a Semana.
- Proporção de indivíduos com remissão de DAS 28-ESR (DAS 28-ESR < 2,6) na 72a Semana.
- Proporção de indivíduos com redução da doença DAS 28-ESR (DAS 28-ESR < 3,2) na 72a Semana.
Os indivíduos elegíveis que possuem RA ativa RF-positiva (> 20 Ul/ml) ou RF-negativa, estão recebendo MTX e tiveram uma resposta inade- quada prévia ou atual a um ou mais inibidores do TNF serão avaliados quan- to à participação no estudo. Indivíduos RF-negativos serão limitados a 20% da população arrolada total.
Os indivíduos devem preencher os seguintes critérios para se- rem elegíveis à inclusão no estudo:
- Termo de Consentimento informado.
- Capacidade e disposição para se submeter às exigências do protocolo do estudo.
- 18-80 de idade.
- Diagnóstico de RA por pelo menos 6 meses, de acordo com os critérios revisados em 1987 da ACR para a classificação da RA (Hoch- berg et al. Arthritis Rheum 35: 498-502 (1992)): Classe l
Capacidade funcionai completa com capacidade de realizar to- das as tarefas habituais, sem limitações Classe Il
Capacidade funcional adequada para realizar as atividades normais, apesar das limitações de desconforto ou mobilidade limitada de uma ou mais articulações Classe Ill
Capacidade funcional adequada para realizar apenas algumas ou nenhuma das tarefas de ocupação usual ou dos cuidados pessoais Classe IV
Totalmente ou grandemente incapacitado com o indivíduo aca- mado ou confinado à cadeira de rodas, permitindo poucos ou nenhum cui- dado pessoal
- Recebendo tratamento para RA em caráter ambulatorial
- Atividade documentada de RA moderada a severa ativa na se- leção da seguinte forma:
TJC ≥ 8 (contagem de 68 articulações), e SJC ≥ 8 (contagem de 66 articulações), e CRP anormal de ≥ 0,6 mg/dl, ou ESR de ≥ 28 mm/h
Resposta inadequada documentada ao tratamento prévio ou atual com um ou mais dos seguintes: etanercept, infliximab e/ou adalimumab por causa de toxicidade ou eficácia inadequada Eficácia inadequada consiste no tratamento com etanercept por
≥3 meses, em doses de 25 mg duas vezes por semana ou 50 mg semanal- mente, pelo menos quatro infusões de ≥ 3 mg/kg infliximab, ou 40 mg de adalimumab em semanas alternadas por ≥ 3 meses.
- Uso de 10-25 mg/semana de MTX por ≥ 12 semanas, antes do 1o Dia, em uma dose estável por ≥ 4 semanas
- Disposição para receber ácido fólico oral
- Caso faça uso de corticosteroide de base (≤10 mg/dia de prednisona ou equivalente), o uso do corticosteroide deve ocorrer em uma dose estável durante as 4 semanas anteriores ao 1° Dia
- Uso de um NSAID é permitido, caso a dose seja estável por ≥ 2 semanas antes do 1° Dia
- Para homens e mulheres de potencial reprodutivo, disposição
para o uso de um meio de contracepção confiável (por exemplo, contracepti- vo hormonal, dispositivo intrauterino, barreira física) por ≥ 30 dias antes do 1° Dia e pela duração do estudo ou a duração pela qual as células B CD19+ periféricas do indivíduo estiverem eliminadas, o que for mais longo
Os indivíduos que preencherem qualquer um dos critérios se- guintes serão excluídos da inclusão no estudo:
a. Geral
- Outra doença reumática autoimune que não RA, ou envolvi- mento sistêmico significativo secundário a RA (por exemplo, vasculite, fibro- se pulmonar, ou síndrome de Felty)
Síndrome de Sjõgren secundária com RA é permitida.
- História ou doença articular inflamatória atual que não a RA (por exemplo, gota, artrite reativa, artrite psoriática, espondilo-artropatia so- ronegativa ou doença de Lyme) ou outro distúrbio reumático sistêmico (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, doença inflamatória do intestino, es- clerodermia, miopatia inflamatória, ou síndrome sobreposta)
- Classe Funcional IV, como definida pela Classificação do Es- tado Funcional da ACR na artrite reumatoide
- Quaisquer procedimentos cirúrgicos, incluindo cirurgi-
a/sinovectomia óssea/articular (incluindo fusão ou substituição articular), em até 12 semanas antes do 1° Dia ou planejada até 48 semanas após o 1° Dia
- Hipersensibilidade conhecida a qualquer componente de um anticorpo monoclonal humanizado ou de murino
- Receber uma vacinação de vírus vivo em até 4 semanas antes do 1° Dia
- Doença cardíaca ou pulmonar significativa, incluindo doença pulmonar obstrutiva - Evidências de doença concomitante significativa não- controlada, como, por exemplo, mas sem limitação, distúrbios do sistema nervoso, renais, hepáticos, endócrinos ou gastrointestinais
- Infecção bacteriana, viral, fúngica, micobacteriana ativa co- nhecida, ou outra infecção (incluindo tuberculose ou doença micobacteriana
atípica, mas excluindo infecções fúngicas dos leitos ungueais), ou qualquer episódio importante de infecção que necessite de hospitalização ou trata- mento com antibióticos IV em até 4 semanas do 1° Dia, ou antibióticos orais em até 2 semanas do 1° Dia
- História de infecção séria recorrente ou crônica (para pesquisa de uma infecção pulmonar, será realizada uma radiografia do tórax na sele- ção, caso não tenha sido realizada 12 semanas antes da seleção)
- História ou presença atual de imunodeficiência primária ou secundária, incluindo infecção pelo HIV
- História de câncer, incluindo tumores sólidos e doenças hema- tológicas malignas (exceto carcinoma de célula basal ou de células escamo- sas da pele que tenha sido removido e curado)
- História de citopenias significativas ou outros distúrbios da medula óssea
- História de uso abusivo de álcool, fármacos ou substâncias químicas em até 24 semanas antes do 1° Dia
- Gravidez ou lactação
- Neuropatias e neuropatias vasculares que possam interferir com a avaliação da dor
- Acesso venoso periférico ruim
- Intolerância ou contraindicações aos corticosteroides orais ou IV
b. Critérios laboratoriais de exclusão
- Hemoglobina < 8,0 g/dl
- Contagem absoluta de neutrófilos < 1,5 χ 103/μl
- IgM < 0,40 mg/ml
- IgG < 5,0 mg/ml
- Aspartato aminotransferase (AST) ou alanina aminotransfera- se (ALT) > 2,5 χ o limite superior do normal
- Antígeno de superfície da hepatite B ou sorologia para anti- corpo da hepatite C positivos
- Para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aque- las que fizeram ligaduras das trompas), um teste sérico de gravidez positivo na seleção
- Medicações prévias ou concomitantes excluídas
- Uso concomitante de qualquer DMARD diferente de MTX
- Tratamento concomitante com qualquer agente biológico
O tratamento deve ser suspenso pelo menos 4 semanas antes do 1° Dia, exceto pelos seguintes: Ieflunomida por ≥ 8 semanas (ou ≥ 14 di- as após 11 dias de um período padronizado de eliminação), infliximab ≥ 8 semanas e adalimumab ≥ 8 semanas
- Tratamento com qualquer agente em investigação em até
4 semanas antes do 1° Dia ou cinco meias-vidas do fármaco em investiga- ção (o que for mais longo)
- Qualquer tratamento prévio com rituximab ou outras terapias de eliminação de células, incluindo CAMPATH, anti-CD4, anti-CD5, anti-CD3, anti- CD19, anti-CD11a, anti-CD22, BLys/ BAFF, e outros agentes anti-CD20
- Tratamento prévio com um agente anti-integrina α 4, incluindo natalizumab
- Tratamento prévio em até 6 meses da seleção com γ globulina IV ou a Coluna Prosorba®
Com o término de todas as avaliações de seleção e a verifica- ção de que o indivíduo preencheu todos os critérios de inclusão e exclusão, a equipe do local irá contatar o sistema interativo de resposta por voz (ivrs) para obter o número do indivíduo e confirmar a inclusão do indivíduo para o gerenciamento do fármaco do estudo. Todos os indivíduos arrolados recebe- rão rituximab como seu curso de tratamento inicial.
Durante as 24a-40a Semanas, os indivíduos que são elegíveis para o retratamento serão randomizados em uma proporção de 2:1 para o Grupo A (retratamento com rituximab) ou Grupo B (placebo; veja a Tabe- la 1). Caso um indivíduo preencha os critérios de elegibilidade para o retra- tamento durante as 24a-40a Semanas, a equipe do local irá entrar em conta- to com o IVRS para iniciar a randomização do indivíduo e para obter o nú- mero do kit do fármaco do estudo.
Um fornecedor independente do IVRS irá realizar a randomiza- ção e guardar os códigos de distribuição dos tratamentos. A randomização será estratificada por centro de estudo, estado do RF no nível de base (RF- positivos, RF+negativos), e melhoras na 24a Semana da contagem das arti- culações edemaciadas e sensíveis melhora de > 20% ou melhora de ≤ 20%). No momento da desocultação os códigos de distribuição dos trata- mentos e os códigos do kit de tratamento serão requisitados ao fornecedor do IVRS. A documentação da transferência e os dados incluídos na transfe- rência serão mantidos em arquivo.
Tabela 1 Grupos de tratamento do estudo
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Durante o retratamento, a designação do grupo de tratamento ficará oculta para a equipe do local e Genentech. Para evitar a divulgação potencial por causa da eficácia observada ou por alterações laboratoriais durante o retratamento, será usada uma abordagem de avaliadores duplos para avaliar a eficácia e a segurança.
As contagens de células B CD19 periféricas serão ocultas para a equipe do local e Genentech1 até o momento do fechamento da base de dados para o resultado primário final na 48a Semana para todos os indiví- duos arrolados no experimento. Portanto, todos os indivíduos que completa- ram o período de tratamento e SFU antes do fechamento da base de dados serão considerados perifericamente depletados e permanecerão em acom- panhamento de células B.
O Avaliador da Eficácia (ou encarregado) deve ser um reumato- logista ou avaliador de artrite experiente. O Avaliador da Eficácia não deve ser o Investigador Principal. O Avaliador da Eficácia só terá acesso aos da- dos de eficácia e será responsável somente por completar as contagens ar- ticulares e a Avaliação Global pelo Médico da VAS da atividade da doença.
Para assegurar uma avaliação articular consistente por todo o experimento, os indivíduos específicos devem ser avaliados pelo mesmo avaliador articu- lar em todas as consultas do estudo. Durante uma consulta do estudo, todos os resultados finais devem ser completados antes de todas as outras avalia- ções.
O Avaliador da Segurança (ou encarregado) deve ser um reu- matologista e só terá acesso aos dados tanto de segurança quanto de eficá- cia. O Avaliador da Segurança pode ser o Investigador Principal. O Avaliador da Segurança terá acesso aos documentos-fonte, aos resultados laboratori- ais e aos Formulários de Relato de Caso (CRFs)1 e será responsável pelo cálculo da DAS 28-ESR e por tomar as decisões de tratamento com base na resposta clínica e nos parâmetros laboratoriais do indivíduo. O Avaliador da Segurança não completará nenhuma avaliação da eficácia ou registro dos resultados de quaisquer avaliações da eficácia em nome do Avaliador da Eficácia.
O rituximab para uso nesse estudo é um concentrado líquido sem conservante, estéril, transparente, incolor, para administração IV. Ritu- ximab é fornecido em uma concentração de 10 mg/ml em frascos de uso único de 500 mg (50 ml). O produto é formulado para administração IV em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/ml de di-hidrato de citrato de sódio, 0,7 mg/ml de polissorbato 80 e Água Estéril para Injeção. O pH é ajustado em 6,5.
Todos os indivíduos arrolados receberão um curso de rituximab (1.000 mg de rituximab por infusão IV no 1o e 15° Dias) como seu tratamento inicial. Durante as 24a-40a Semanas, os indivíduos elegíveis para o retrata- mento serão randomizados para o Grupo A para receberem um curso adi- cional (duas doses) de rituximab 1.000 mg IV com intervalo de 14 dias, ou para o Grupo B para receberem um curso (duas doses) de placebo 1.000 mg IV com intervalo de 14 dias.
Uma pré-medicação com 1.000 mg de acetaminofeno oral e 50 mg de difenidramina oral é recomendada para todos os indivíduos, e são necessários 100 mg de metilprednisolona IV a serem completados em até 30-60 minutos antes de cada infusão de rituximab/placebo.
Todos os indivíduos continuarão a receber MTX em uma dose estável de 10-25 mg/semana, e recebem uma dose estável de folato (≥ 5 mg/semana), dada como uma dose única ou como uma dose semanal dividida.
As infusões de rituximab/placebo devem ser administradas aos indivíduos sob a supervisão próxima do investigador ou do encarregado em um hospital ou uma clínica onde haja recursos completos para ressucita- mento que possam ser disponíveis imediatamente. Embora rituximab possa ser administrado em caráter ambulatorial, os indivíduos podem ser hospitali- zados para observação a critério do investigador. Rituximab/placebo devem ser administrados como uma infusão IV lenta. Não administrar como uma infusão IV rápida ou em bolo. Ao final de cada infusão, a sonda IV deve ficar no lugar por pelo menos uma hora para permitir a administração de fárma- cos IV, se necessário. Caso não ocorra evento adverso durante esse perío- do, a sonda IV pode ser removida.
Com o uso de uma técnica asséptica apropriada, retirar a quan- tidade necessária de rituximab/placebo, e diluir até uma concentração final de 4 mg/ml em uma bolsa de infusão contendo Cloreto de Sódio a 0,9%, USP, ou Dextrose a 5% em Água, USP. Inverter suavemente a bolsa para misturar a solução. Os frascos de rituximab são biológica e quimicamente estáveis a 2°C-8°C (36°F-46°F). Os frascos não devem ser usados após a data de validade. Rituximab deve ser protegido da exposição à luz do sol direta.
Uma vez reconstituídas em bolsas IV, as soluções de rituximab para infusões devem ser estocadas a 2°C-8°C por 24 horas. As soluções de rituximab para infusão demonstraram que são estáveis por mais 24 horas em temperatura ambiente (23°C). No entanto, à medida que as soluções de rituximab não-contêm conservantes, as soluções diluídas devem ser refrige- radas (2°C-8°C). Não foram observadas incompatibilidades entre rituximab e bolsas de cloreto de polivinila ou polietileno.
Quanto ao retratamento, DAS 28-ESR será calculado com o uso da contagem articular e da Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS) da consulta atual, e a ESR da consulta atual ou prévia somente se a ESR da consulta atual estiver indisponível. Os indivíduos que preenchem os critérios seguintes em qualquer consulta durante as 24a-40a Semanas são elegíveis para receber retratamento com fármaco do estudo (rituximab ou placebo):
- DAS 28-ESR > 2,6
- Teste de gravidez na urina negativo para mulheres com po- tencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
Além disso, os indivíduos que se qualificam para o retratamento por DAS 28-ESR > 2,6 durante as 24a~40a Semanas também devem preen- cher os seguintes critérios a fim de serem tratado novamentes com base nos resultados da consulta prévia, caso os resultados atuais estejam indisponí- veis:
- Hemoglobina > 8,0 g/dl
- Contagem absoluta de neutrófilos > 1,5 μ 103/μΙ
- IgM > 0,40 mg/ml - IgG >5,0 mg/ml
- Ausência de doença cardíaca ou pulmonar significativa (inclu- indo doença pulmonar obstrutiva)
- Ausência de imunodeficiência primária ou secundária, incluin- do história conhecida de infecção pelo HIV
- Ausência de evidências de doença concomitante significativa não-controlada, como, por exemplo, mas sem limitação, distúrbios do siste- ma nervoso, renais, hepáticos, endócrinos ou gastrointestinais
- Ausência de infecção ativa de qualquer tipo, (excluindo infec- ções fúngicas dos leitos ungueais), ou qualquer episódio importante de in- fecção que necessite de hospitalização ou tratamento com IV antibióticos em até 4 semanas de infusão ou término de antibióticos orais em até 2 semanas antes da infusão
Não é permitida a modificação da dose de rituximab durante esse estudo. No caso de uma reação relacionada à infusão, a taxa de infu- são pode ser ajustada. Caso um indivíduo apresente uma reação relaciona- da à infusão que necessite de uma interrupção na infusão e o investigador determine que a infusão não deva ser reiniciada, o indivíduo deve ser retira- do do período de tratamento do estudo e incluído no SFU.
Todos os indivíduos receberão MTX concomitante a 10- 25 mg/semana, como prescrito por seu médico responsável pelo tratamento.
Os indivíduos devem ter sido tratados com MTX por > 12 semanas antes de serem incluídos no estudo, e devem permanecer em uma dose estável de MTX por > 4 semanas antes do 1o Dia e durante o estudo, a menos que seja necessária uma modificação em função de toxicidade.
Podem ocorrer certos eventos adversos que são comumente associados ao tratamento com MTX. A fim de minimizar a toxicidade do MTX, todos os indivíduos tratados com MTX também receberão uma dose estável de ácido fólico (> 5 mg/semana) dada como uma dose única por se- manal ou como uma dose diária dividida. O regime de dosagem fica a crité- rio do investigador.
O tratamento diário com < 10 mg de prednisona ou equivalente é permitido caso a dose seja estável por > 4 semanas antes do 1o Dia. A do- se deve permanecer estável por todo o estudo, a menos que seja necessária uma modificação em função de toxicidade.
O uso de um NSAID é permitido caso a dose seja estável por ≥2 semanas antes do 1° Dia. A dose deve permanecer estável por todo o estudo, a menos que seja necessária uma modificação em função de toxici- dade.
Além disso, o tratamento diário com ≤ 325 de mg ácido acetilsa- licílico é permitido para profilaxia cardiovascular.
Podem ser usados analgésicos adicionais para a dor, se neces- sário. No entanto, os indivíduos não devem tomar analgésicos em até 12 horas antes de uma consulta na qual serão feitas avaliações da eficácia. Podem ser feitos ajustes do regime de analgésicos, mas a mudança deve ser documentada nos CRFs apropriados.
As injeções intra-articulares de corticosteroide são desestimula- das, particularmente durante as primeiras 48 semanas; no entanto, elas po- dem ser usadas de forma limitada para administrar a atividade da RA de um indivíduo durante o estudo. No máximo uma articulação por um período de 24 semanas deve ser injetada, e a mesma articulação não deve ser injetada mais de uma vez em um período de 48 semanas. Nenhuma injeção isolada deve exceder 40 mg de triancinolona (ou equivalente), e a dose total de cor- ticosteroide não deve exceder 80 mg de triancinolona (ou equivalente) du- rante qualquer período de 48 semanas.
Durante o estudo, os indivíduos podem continuar a receber um corticosteroide de base com uma dose de ≤ 10 mg/dia de prednisona (ou equivalente). No caso de uma crise da doença ou uma condição diferente de RA, por exemplo, asma, que necessite de tratamento com corticosteroides orais, devem ser administradas doses adequadas por um máximo de duas semanas e eles devem ser reduzidos ao nível prévio tão rapidamente quanto medicamente possível.
O aumento da dose de corticosteroides será considerado uma piora da condição do indivíduo a partir do nível de base, e deve ser registra- do como um evento adverso no CRF.
Corticosteroides IV ou intramusculares não são permitidos no estudo, além daqueles especificados nos tratamentos do protocolo.
O aumento da dose de corticosteroides será considerado uma piora da condição do indivíduo a partir do nível de base, e deve ser registra- do como um evento adverso no CRF.
Os indivíduos devem permanecer em uma dose estável de MTX por ≥ 4 semanas antes do 1o Dia e durante o estudo, a menos que seja ne- cessária uma modificação em função de toxicidade.
Com 16 semanas ou mais após o retratamento, os indivíduos que não obtiveram uma melhora de 20% tanto nos TJCs quanto nos SJCs, comparados com o nível de base, podem iniciar o tratamento de resgate com um DMARD não biológico, cuja escolha fica a critério do médico assis- tente. Os indivíduos que recebem o resgate não serão retirados do estudo.
As amostras laboratoriais devem ser coletadas antes das infu- sões de metilprednisolona IV e rituximab/placebo.
Os dados relatados pelo indivíduo (por exemplo, Avaliação Glo- bal pelo Paciente da Atividade da Doença, Avaliação da Dor pelo Paciente) só podem ser registrados pela enfermeira/investigador do estudo em nome do indivíduo caso o indivíduo tenha dificuldade para escrever durante a con- sulta, ou não-consiga ler. Isso deve ser claramente documentado nas obser- vações do indivíduo.
Para evitar a identificação potencial, será usada uma aborda- gem de avaliadores duplos (Avaliador da Eficácia e Avaliador da Segurança) para avaliar a eficácia e a segurança. É essencial que as avaliações comple- tadas pelo indivíduo e pelo Avaliador da Eficácia sejam feitas antes daquelas do Avaliador da Segurança.
A avaliação global do indivíduo de sua atividade da doença du- rante as últimas 24 horas deve ser descrita com o uso da VAS horizontal de 10O mm, em que a posição na extrema esquerda da linha representa ausên- cia de atividade da doença (sem sintomas e sem sintomas de artrite), e a posição na extrema direita representa atividade máxima da doença (ativida- de máxima da doença artrítica).
A avaliação do indivíduo de seu nível de dor durante as últimas 24 horas deve ser descrita com o uso do VAS horizontal de 100 mm, em que a posição na extrema esquerda da linha representa ausência de dor, e a po- sição na extrema direita representa dor insuportável.
O índice de incapacidade Stanford HAQ é um questionário pre- enchido pelo indivíduo específico para a RA. Ele consiste em 20 questões que se referem a oito conjuntos de componentes: capacidade de se ves- tir/cuidados pessoais, despertar, alimentação, marcha, higiene, alcance, preensão, e atividades. O questionário será classificado com base nas ins- truções do "Stanford University Medicai Center" (Fries et ai Arthrítis Rheum 23: 137-145 (1980)).
O FACIT-F será usado para avaliar fadiga. Ele é um questioná- rio de 13 itens no qual pede-se que os indivíduos classifiquem cada questão em uma escala de 0-4. Essa avaliação foi desenvolvida originalmente para doenças crônicas e é agora validada para indivíduos com RA (Cella et al. J. Rheumatology 32(5): 811-819 (2005)).
O SF-36 é um instrumento genérico de qualidade de vida rela- cionada à saúde que foi amplamente testado quanto às suas propriedades psicométricas, e é amplamente usado em estudos clínicos e epidemiológicos (Ware et ai "How to Score Version Two of the SF-36 Health Survey". Lin- coln, R.I.: "Qualitymetric Incorporated", 2000). O SF-36 (Versão 2) é forneci- do por "Medicai Outcomes Trust" (Boston, MA, EUA).
Deve ser realizada uma avaliação de 66 articulações quanto ao edema e 68 articulações quanto à sensibilidade por um reumatologista ou avaliador articular experiente. As articulações serão avaliadas e classificadas como edemaciadas ou não edemaciadas e sensíveis ou não sensíveis com base na pressão e manipulação da articulação mediante exame físico. As articulações com prótese articular total ou artrodese não devem ser avalia- das; no entanto, todas as outras articulações devem ser avaliadas. As articu- lações a serem avaliadas quanto ao edema e à sensibilidade são apresenta- das abaixo: Articulação temporomandibular
Articulação esternoclavicular
Articulação acrômio-clavicular
Ombrosa
Cotovelos*
Punhos*
Interfalangiana no dedo 1a
Articulações interfalangianas distais nos dedos 2-5
Articulações interfalangianas proximais nos dedos 2-5a
Articulações metacarpofalangianas nos dedos 1-5a
Quadris (somente sensibilidade)
Joelhos3
Tornozelos
Metatársicas
Articulações interfalangianas nos dedos dos pés 1-5 Articulações metatarsofalangianas nos dedos dos pés 1-5 aIncIui as 28 articulações usadas para calcular a Classificação de Atividade da Doença (DAS)28.
As articulações que foram submetidas a um procedimento de- vem ser avaliadas da seguinte forma:
- Cirurgia: qualquer articulação que tenha sido substituída ou fundida em qualquer momento antes ou durante o estudo deve ser docu- mentada como não avaliável (NE) pela duração do estudo.
Qualquer articulação que tenha sido submetida a sinovectomia (incluindo sinovectomia química e radiológica) deve ser documentada como não feita (ND) por 24 semanas após a sinovectomia. Após esse período, a articulação pode ser novamente avaliada.
- Injeção intra-articular: qualquer articulação que tenha recebido uma injeção intra-articular de um corticosteroide deve ser documentada co- mo ND pelas 12 semanas seguintes. Após esse período, a articulação pode ser novamente avaliada.
- Artrocentese: qualquer articulação que seja submetida à aspi- ração do líquido sinovial não será avaliada na consulta programada seguinte e será classificada como ND. Após esse período, a articulação pode ser no- vamente avaliada.
A avaliação pelo médico da atividade da doença de um indiví- duo durante as últimas 24 horas deve ser descrita com o uso do VAS hori- zontal de 100 mm, em que a posição na extrema esquerda da linha repre- senta ausência de atividade da doença (sem sintomas e sem sintomas de artrite) e a posição na extrema direita representa atividade máxima da doen- ça. Isso deve ser completado pelo Avaliador da Eficácia, que pode ou não ser um médico.
CRP será analisada em um laboratório central. ESR será de- terminada com o uso do método de Westergren no laboratório local.
Uma DAS 28-ESR > 2,6 foi selecionada como um limiar para re- tratamento nesse experimento. Indivíduos com uma DAS 28-ESR >2,6 du- rante as 24a-40a Semanas podem ser elegíveis para receber um segundo curso de fármaco do estudo (rituximab ou placebo).
Um exame físico geral (incluindo os sistemas cardiovascular, respiratório, gastrointestinal e neurológico) deve ser realizado nos momentos indicados na Agenda de Avaliações. Quaisquer anormalidades persistentes devem ser especificadas a cada vez que o exame for realizado. O diagnósti- co de novas anormalidades deve ser registrado como evento adverso, se adequado.
Os sinais vitais (freqüência cardíaca, pressão arterial sistólica e diastólica e temperatura) serão medidos nos momentos indicados na Agen- da de Avaliações. As avaliações devem ser feitas após o indivíduo ficar em uma posição semissupina por pelo menos 5 minutos.
Eletrocardiogramas (ECGs) com doze eletrodos devem ser rea- lizados nos momentos indicados na Agenda de Avaliações.
Radiografias do tórax ântero-posterior e lateral devem ser obti- das na seleção e revisadas pelo investigador ou encarregado. Na seleção, caso as radiografias do tórax feitas nas últimas 12 semanas não mostrem anormalidades clinicamente significativas, e não haja sinais ou sintomas su- gestivos de doença pulmonar que pudesse excluir o indivíduo do experimen- to, as radiografias do tórax não precisariam ser repetidas.
Serão realizadas por um laboratório central análises de hemato- logia, sorologia, bioquímica, exame de urina, teste sérico de gravidez, cito- metria de fluxo, imunologia e CRP; análises farmacocinéticas e de HACA serão realizadas por Genentech; e teste de gravidez na urina e avaliações de ESR serão realizados localmente nos locais do estudo. Manuais de ins- truções e kits de suprimentos, incluindo suprimentos para farmacocinética e HACA, serão fornecidos para todas as avaliações laboratoriais. As avalia- ções laboratoriais incluirão as seguintes:
- Hematologia/CBC: Hemoglobina, hematócrito, células sangüí- neas vermelhas (RBC), células sangüíneas brancas (WBC) com contagem diferencial e contagens plaquetárias.
Sorologia: antígeno de superfície de hepatite B (HBsAg) e anti- corpo contra vírus da hepatite C (HCV).
- Química do soro sangüíneo: AST/SGOT, ALT/SGPT, fosfatase alcalina, proteína total, albumina, bilirrubina total, nitrogênio da uréia sangüí- nea (BUN)1 ácido úrico, creatinina, glicose aleatória, potássio, sódio, cloreto, cálcio e fósforo.
- Exame de urina: sangue, proteína e glicose (exame microscó- pico, se anormal e aplicável).
- Teste de gravidez: todas as mulheres com potencial para en- gravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária) farão um teste sérico de gravidez na seleção. Além disso, serão administrados regu- larmente testes de gravidez na urina em todas as outras consultas. Caso um teste de gravidez na urina seja positivo, ele deve ser confirmado por um tes- te sérico de gravidez.
- Níveis séricos de complemento C3 e C4.
- Avaliações imunológicas: imunoglobulinas quantitativas (lg To- tal, IgG1 IgA e IgM), RF (total e concentrações de isótipo), e anticorpo (IgG)de peptídeo citrulinado anticíclico (CCP).
- Análise de classificação celular expandida ativada por flúores- cência (FACS): as populações celulares avaliadas incluirão monócitos (CD14 e CD16), células NK (CD56), subconjuntos de células T (CD3, CD4, CD8, CD45RO e CD45RA) e subconjuntos de células B (CD19, CD27, CD38 e IgD). Marcadores de ativação também podem ser avaliados (CD25, CD69, CD40L e CD80).
- Análise FACS de células B: somente células B absolutas (CD19).
- Análise da resposta de HACA será realizada com o uso de um ELISA para todos os indivíduos arrolados.
- Ensaios farmacocinéticos: amostras séricas serão obtidas pa- ra o ensaio farmacocinético nas consultas indicadas no SOA, e também nos mesmos momentos que HACA. As concentrações séricas de rituximab são necessárias para interpretar com exatidão os resultados de HACA.
- Amostras opcionais de biomarcador:
Para os indivíduos que autorizarem separadamente, amostras de pesquisa opcionais (sangue total, soro) serão coletadas durante a dura- ção do estudo para avaliações exploratórias do biomarcador. Amostras de sangue total, coletadas com o uso de tubos de RNA PAXgene®, serão usa- das para a criação de perfis de expressão gênica. As avaliações da amostra de soro dos marcadores relacionados a RA ou ao rituximab podem incluir, sem limitação, medidas e quantificação de citocina/quimiocina de marcado- res de remodelação óssea e de cartilagem. Todas as amostras serão coleta- das nos mesmos momentos para uma perfeita comparabilidade dos dados.
Prevê-se que as informações dessa análise promoverão e facili- tarão uma assistência médica individualizada por meio de uma melhor com- preensão do modo de ação do rituximab, da eficácia e segurança relaciona- das, de indicadores de uma boa resposta e, possivelmente, determinantes da progressão da RA (e de outras doenças autoimunes). Essas amostras serão estocadas por até 15 anos após o fechamento da base de dados.
Todos os indivíduos devem fornecer um consentimento infor- mado por escrito, antes da realização de quaisquer procedimentos ou avali- ações específicos do estudo, incluindo alterações do regime de tratamento atual do indivíduo. As avaliações de seleção podem ser realizadas durante um período de 56 dias, antes da primeira infusão de rituximab no 1o Dia. As avaliações relatadas pelo indivíduo devem ser feitas antes de outras avalia- ções clínicas.
Caso um indivíduo seja reprovado em um critério laboratorial de exclusão na seleção, o investigador poderá repetir o teste até duas vezes durante o período de seleção. Caso o indivíduo seja reprovado nesse critério laboratorial uma terceira vez, ele será considerado reprovado na seleção. Uma amostra de sangue ou um teste laboratorial não será considerado co- mo retestada, caso a amostra seja retirada por causa de problemas relacio- nados à manipulação da amostra, quebra ou integridade da amostra. Um indivíduo reprovado na seleção poderá ser selecionado novamente.
Um indivíduo pode ser selecionado novamente caso ele não preencha todos os critérios de elegibilidade em até 56 dias após a consulta de seleção original. Um indivíduo submetido a uma nova seleção repetirá todo o processo de seleção e será reaprovado antes de quaisquer procedi- mentos específicos do estudo. Os indivíduos podem ser resselecionados apenas uma vez.
a. Consulta de seleção (56° Dia)
- Consentimento informado por escrito
- Revisão dos critérios de inclusão e exclusão
- Contatar o IVRS para designação do número de seleção do indivíduo
- Dados demográficos (por exemplo, sexo, idade, raça/etnia)
- História médica completa (incluindo história de vacinação)
- Medicações concomitantes tomadas até 12 semanas antes da seleção, incluindo vacinas, todos os DMARDs e agentes biológicos anterio- res
- Sinais vitais (freqüência cardíaca, pressão arterial e tempera- tura)
- Exame físico completo, incluindo a medida da altura e do peso
- Avaliação articular - ECG com 12 eletrodos
- Raios X do tórax
Caso uma radiografia do tórax tenha sido realizada em até 12 semanas antes da seleção e não tenha mostrado anormalidades clinicamen- te significativas, não é necessária uma radiografia do tórax na seleção.
- Avaliações no laboratório central
Hematologia/CBC
Antígeno de superfície de hepatite B e anticorpo de hepatite C
Teste sérico de gravidez para mulheres com potencial para en- gravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
Química do soro sangüíneo
Exame de urina
CRP
IgG e IgM RFtotaI
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
Todas as avaliações durante o período de tratamento devem ser realizadas dentro do intervalo de tempo especificado para cada consulta. As avaliações e os procedimentos programados nos dias quando rituximab é administrado devem ser realizados antes da infusão de rituximab, a menos que indicado de forma diferente. Para esse estudo, o 1o Dia é o dia da infu- são inicial de rituximab. A consulta do 1o Dia deve ser realizada em um dia que permita as consultas subsequentes (por exemplo, Consulta do 15° Dia) ocorram sem atraso. As avaliações relatadas pelo indivíduo devem ser reali- zadas antes de outras avaliações clínicas. Para os indivíduos elegíveis para retratamento, a consulta na qual o indivíduo preenche os critérios de elegibi- Iidade para o retratamento é considerada a consulta de qualificação. a. 1° Dia
Todas as avaliações serão realizadas 30 minutos antes da infu- são, a menos que especificado de forma diferente.
- Revisão dos critérios de inclusão e exclusão
- Contatar o IVRS para o número de inclusão do indivíduo e in- ventário do fármaco do estudo
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS)
- HAQ
- FACIT-F
- SF-36
- Sinais vitais (freqüência cardíaca, pressão arterial e tempera- tura): pré-infusão, durante a infusão (a cada 15 minutos por 1 hora e, a se- guir, a cada 30 minutos, até o final da infusão), e pós-infusão (a cada 30 mi- nutos por uma hora pós-infusão)
- Exame físico, incluindo a medida do peso corporal
- Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central Hematologia/CBC (em até 30 minutos pré- e pós-infusão) Química do soro sangüíneo Exame de urina FACS expandida (em até 30 minutos pré- e pós-infusão) células B CD19 (em até 30 minutos pré- e pós-infusão) CRP Imunoglobulinas RF Anticorpo anti-CCP C3, C4 Amostra para farmacocinética (30 minutos pré- e pós-infusão) Amostra para HACA
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Amostras opcionais do biomarcador da pesquisa (amostras de sangue total e de soro)
- Administração de metilprednisolona - Administração de rituximab
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
b. 15° Dia (± 1 dia)
- Todas as avaliações serão realizadas 30 minutos antes da in-
fusão, a menos que especificado de forma diferente.
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Sinais vitais (freqüência cardíaca, pressão arterial e tempera- tura): pré-infusão, durante a infusão (a cada 15 minutos por 1 hora e, a se- guir, a cada 30 minutos, até o final da infusão), e pós-infusão (a cada 30 mi- nutos por 1 hora pós-infusão)
- Avaliações no laboratório central
Hematologia/CBC (em até 30 minutos pré- e pós-infusão de ri-
tuximab)
Química do soro sangüíneo Exame de urina C3, C4
Amostra para farmacocinética (30 minutos pré- e pós-infusão) - Administração de metilprednisolona
- Administração de rituximab
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
c. 4a, 12a e 20a Semanas (28°, 84° e 140° Dias, respectivamen-
te; ± 3 dias)
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS) -HAQ
- FACIT-F (somente na 12a Semana) - Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central
Hematologia/CBC
Química do soro sangüíneo
Exame de urina
FACS expandida (somente na 12a Semana)
células B CD19 (somente nas 4a e 20a Semanas)
CRP
C3, C4 (somente na 4a Semana)
Amostra para farmacocinética
Imunoglobulinas
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Amostras opcionais do biomarcador da pesquisa (amostras de sangue total e de soro) (somente na 12a Semana)
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes d. 24a Semana (168° Dia ± 3 dias)
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS)
- HAQ
- FACIT-F
- SF-36
- Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- Calcular DAS 28-ESR usando a contagem articular e a Avalia- ção Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS) dessa consulta e a ESR da consulta prévia, caso o resultado da ESR não-esteja disponível
Avaliar a elegibilidade do indivíduo para o retratamento com base no DAS 28-ESR calculado e nos resultados laboratoriais da consulta prévia.
Caso o indivíduo seja elegível para o retratamento, proceder pa- ra o 1° Dia de Retratamento e completar avaliações da forma especificada.
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central
Hematologia/CBC
Química do soro sangüíneo
Exame de urina
FACS expandida
CRP
Imunoglobulinas
RF
Anticorpoanti-CCP
Amostra para farmacocinética
Amostra para HACA
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Amostras opcionais do biomarcador da pesquisa (amostras de sangue total e de soro)
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
e. 28a Semana (196° Dia ± 3 dias)
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS)
HAQ
- Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- Completar somente se o indivíduo não foi tratado novamente. Calcular DAS 28-ESR usando a contagem articular e a Avaliação Global pe- lo Paciente da Atividade da Doença (VAS) dessa consulta e a ESR da con- sulta prévia, caso o resultado da ESR não-esteja disponível.
Avaliar a elegibilidade do indivíduo para o retratamento com base no DAS 28-ESR calculado e nos resultados laboratoriais da consulta prévia.
Caso o indivíduo seja elegível para o retratamento, proceder pa- ra o 1o Dia de Retratamento e completar avaliações da forma especificada.
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliação do laboratório central
Hematologia/CBC
Química do soro sangüíneo
Exame de urina
células B CD19
CRP
Imunoglobulinas
Amostra para farmacocinética
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
f. 32a, 40a e 44a Semanas (224°, 280° e 308° Dias, respectiva- mente; ± 3 dias)
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS) HAQ
- FACIT-F (somente na 32a Semana)
- Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- Completar somente se o indivíduo não foi tratado novamente. Calcular DAS 28-ESR usando a contagem articular e a Avaliação Global pe- lo Paciente da Atividade da Doença (VAS) dessa consulta e a ESR da con- sulta prévia, caso o resultado da ESR não-esteja disponível (Semanas 32 e 40 apenas)
Avaliar a elegibilidade do indivíduo para o retratamento com ba- se no DAS 28-ESR calculado e nos resultados laboratoriais da consulta pré- via.
Caso o indivíduo seja elegível para o retratamento, proceder para o 1° Dia de Retratamento e completar avaliações da forma especifica- da.
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central Hematologia/CBC
Química do soro sangüíneo
Exame de urina
FACS expandida (realizar somente se o indivíduo não foi trata- do novamente; somente na 44a Semana) células B CD19
Imunoglobulinas
CRP
Amostra para farmacocinética
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
g. 48a Semana (336° Dia ± 3 dias)
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS)
HAQ
- FACIT-F
- SF-36
- Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central
Hematologia/CBC
Química do soro sangüíneo
Exame de urina
FACS expandida
CRP
Imunoglobulinas
RF Anticorpo anti-CCP Amostra para farmacocinética Amostra para HACA
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Amostras opcionais do biomarcador da pesquisa (amostras de
sangue total e de soro)
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
h. 60a Semana (420° Dia ± 7 dias) - Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS) -HAQ
- FACIT-F
- Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central Hematologia/CBC
Química do soro sangüíneo
Exame de urina FACS expandida CRP
Imunoglobulinas
Amostra opcional do biomarcador da pesquisa (amostras de
sangue total e de soro)
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
i. 72a Semana (504° Dia ± 7 dias)
Os indivíduos cujas contagens de células B (CD19+) periféricas não se recuperaram ao término dessa consulta, entrarão no período de a- companhamento de células Β. A recuperação das células B é definida como contagens periféricas de CD19+ que retornaram aos valores de base ou ao limite inferior dos valores normais, o que for menor.
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS)
-HAQ
- FACIT-F
- SF-36
- Sinais vitais (freqüência cardíaca, pressão arterial e temperatura)
- Exame físico, incluindo a medida do peso corporal
- Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- ECG com 12 eletrodos
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central
Hematologia/CBC
Química do soro sangüíneo
Exame de urina
FACS expandida
CRP
Imunoglobulinas
RF
Anticorpo anti-CCP
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Amostras opcionais do biomarcador da pesquisa (amostras de sangue total e de soro)
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
Os indivíduos elegíveis para o retratamento durante as 24a-40a Semanas serão randomizados para receber um curso adicional do fármaco do estudo. Os indivíduos devem completar todas as avaliações do 1o Dia de Retratamento que não foram realizadas durante a consulta de qualificação. As avaliações realizadas a partir da consulta de qualificação não precisam ser repetidas.
Caso a infusão não possa ser dada no mesmo dia que a con- sulta de qualificação, o indivíduo deve retornar para a infusão em até 72 horas apos a consulta de qualificação.
Após o curso de retratamento (1° e 15° Dias de Retratamento), o indivíduo deve retornar na sua consulta programada seguinte com base no curso de avaliações em cujo ponto o indivíduo se qualificou para o retrata- mento. Por exemplo, caso um indivíduo tenha se qualificado para o retrata- mento na consulta da 32a Semana, após o curso de retratamento (1o e 15° Dias de Retratamento), a consulta programada seguinte do indivíduo deve ser a consulta da 40a Semana. a. 1° Dia de Retratamento (R1)
Todas as avaliações serão realizadas 30 minutos antes da infu- são, a menos que especificado de forma diferente.
- Randomização e atribuição do fármaco do estudo pelos IVRS
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS)
- HAQ
- FACIT-F
- SF-36
- Sinais vitais (freqüência cardíaca, pressão arterial e tempera- tura): pré-infusão, durante a infusão (a cada 15 minutos por uma hora e, a seguir, a cada 30 minutos, até o final da infusão), e pós-infusão (a cada 30 minutos por uma hora pós-infusão)
- Exame físico, incluindo a medida do peso corporal
- Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central Hematologia/CBC (em até 30 minutos pré- e pós-infusão)
Química do soro sangüíneo
Exame de urina
CRP
FACS expandida (em até 30 minutos pré- e pós-infusão)
Células B CD19 (em até 30 minutos pré- e pós-infusão)
Imunoglobulinas
RF
Anticorpo anti-CCP C3,C4
Amostra para farmacocinética (30 minutos pré- e pós-infusão) Amostra para HACA
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Amostras opcionais do biomarcador da pesquisa (amostras de sangue total e de soro)
- Administração de metilprednisolona
- Administração do fármaco do estudo
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
b. 15° Dia de Retratamento (R15; ± 1 dia)
Todas as avaliações serão realizadas 30 minutos antes da infu- são, a menos que especificado de forma diferente.
- Sinais vitais (freqüência cardíaca, pressão arterial e tempera- tura): pré-infusão, durante a infusão (a cada 15 minutos por uma hora e, a seguir, a cada 30 minutos, até o final da infusão), e pós-infusão (a cada 30 minutos por uma hora pós-infusão)
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central
Hematologia/CBC (em até 30 minutos pré- e pós-infusão)
Química do soro sangüíneo
Exame de urina C3, C4
Amostra para farmacocinética (30 minutos pré- e pós-infusão)
- Administração de metilprednisolona
- Administração do fármaco do estudo
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
Os indivíduos que foram retirados precocemente do período de tratamento por qualquer motivo serão solicitados a retornar para uma consul- ta de retirada precoce do tratamento (até 14 dias após a retirada), e depois retornar em 4 semanas após a consulta de retirada e, a seguir, a cada 12 semanas por pelo menos 48 semanas a partir do momento de retirada do indivíduo. As avaliações seguintes serão realizadas na consulta de retirada precoce do tratamento:
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS) - Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS) HAQ
- FACIT-F
- SF-36
- Sinais vitais (freqüência cardíaca, pressão arterial e temperatura)
- Exame físico, incluindo a medida do peso corporal
- Avaliação articular
- Avaliação Global pelo Médico da Atividade da Doença (VAS)
- ECG com 12 eletrodos
- Teste urinário de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (incluindo aquelas que se submeteram à ligadura tubária)
- Avaliações no laboratório central
Hematologia/CBC
Química do soro sangüíneo
Exame de urina
CRP
células B CD19 Imunoglobulinas RF
Anticorpo anti-CCP
Amostra para farmacocinética
Amostra para HACA
Amostra opcional do biomarcador da pesquisa (amostras de sangue total e de soro)
- ESR (laboratório local; método de Westergren)
- Eventos adversos
- Medicações concomitantes
Serão realizadas avaliações de acompanhamento de segurança (SFU) nas 4a, 12a, 24a, 36a e 48a Semanas de SFU após a retirada precoce ou o término do período de tratamento, como definido para os seguintes indivíduos:
- Indivíduos que foram tratado novamentes durante as 24a-40a Semanas e completaram o período de tratamento (ou seja, a consulta da 72a Semana)
- Indivíduos retirados precocemente do período de tratamento Serão realizadas as seguintes avaliações em cada consulta de SFU:
- Todos os eventos adversos até a 4a semana
- Eventos adversos sérios e eventos adversos infecciosos após a 4a semana
- Medicações concomitantes usadas para tratar esses eventos
- Avaliações no laboratório central Hematologia/CBC
Imunoglobulinas
Amostra para farmacocinética
Amostra para HACA
células B CD19
Na última consulta de SFU, os indivíduos cujas contagens de células B (CD19+) periféricas não se recuperaram, entrarão no período de acompanhamento de células Β. A recuperação das células B é definida co- mo contagens periféricas de CD19+ que retornaram aos valores de base ou ao limite inferior dos valores normais, o que for menor. Para todos os even- tos adversos infecciosos sérios relatados, CBC com diferenciais, contagens quantitativas de Ig e de CD19 devem ser determinadas em até 1 semana após o surgimento.
Os indivíduos cujas contagens de células B (CD19+) periféricas não se recuperaram na última consulta definida pelo protocolo (72a Semana ou ao final do SFU) entrarão no período de acompanhamento de células B e retornarão às consultas do estudo a cada 12 semanas a partir da última con- sulta até a recuperação das células Β. A recuperação das células B é defini- da como contagens periféricas de CD19+ que retornaram aos valores de ba- se ou ao limite inferior dos valores normais, o que for menor.
Serão realizados as seguintes avaliações e procedimentos em cada consulta de acompanhamento de células B:
- Eventos adversos sérios e eventos adversos infecciosos
- Medicações concomitantes usadas para tratar esses eventos
- Avaliações no laboratório central
Hematologia/CBC
Imunoglobulinas
Citometria de fluxo: contagem de células B (CD19+) Para todos os eventos adversos infecciosos sérios relatados, CBC com contagens diferenciais, contagens quantitativas de Ig e de CD19 devem ser determinados em até uma semana após o surgimento.
Serão obtidas amostras de sangue, soro e urina em momentos especificados. Serão fornecidas instruções quanto ao processamento, esto- cagem e envio das amostras à Genentech e ao laboratório clínico central nos manuais de laboratório. Serão usados ensaios padronizados para análi- se de hematologia, sorologia, bioquímica, β-hCG sérica, citometria de fluxo, imunologia e exame de urina.
ELISA da farmacocinética de rituximab mede os níveis de ritu- ximab em amostras de soro humano. Ele usa anti-rituximab policlonal de cabra purificado por afinidade como reagente de captura e anticorpo de ca- bra para F(ab)2 de IgG de camundongo conjugado a peroxidase de raiz-forte (HRP) como reagente de detecção.
O ELISA de HACA anti-rituximab é um ensaio-ponte, que usa ri- tuximab como reagente de captura e rituximab biotinilado e estreptavidina- HRP para detecção. O ensaio usa uma curva de calibração preparada com anticorpos policlonais de cabra purificados por afinidade para rituximab, e é confirmado por imunoeliminação com rituximab. Os resultados desse ensaio serão relatados em relação a esse anticorpo policlonal em termos de unida- des relativas (RU)/ml.
Os indivíduos podem ser retirados ou suspensos do período de tratamento em qualquer momento, mas devem retornar ao centro de estudo em até 14 dias para uma consulta de retirada precoce do tratamento, SFU e, potencialmente, para acompanhamento de células B. Os indivíduos suspen- sos do período de tratamento serão acompanhados quanto às avaliações de segurança. Devem ser feitos todos os esforços para se obter essas avalia- ções para indivíduos com retirada precoce. A razão primária para a retirada precoce deve ser registrada na página apropriada do CRF.
As razões para a retirada do indivíduo pelo investigador inclu- em, sem limitação, as seguintes:
- Retirada voluntária por consentimento
- Qualquer condição médica que possa pôr em risco a segurança do indivíduo caso ele continue no estudo, como determinado pelo investigador
- Determinação do investigador de que a continuação no estudo não será o melhor para o indivíduo
- Pacientes que apresentam um teste urinário ou sérico de gra- videz positivo em qualquer momento durante o estudo.
Os pacientes retirados precocemente não serão substituídos.
Genentech tem o direito de terminar esse estudo em qualquer momento. As razões para o término do estudo podem incluir, sem limitação, as seguintes:
- A incidência ou gravidade de eventos adversos nesse ou em outros estudos indica um risco potencial para a saúde dos indivíduos.
- A inclusão dos indivíduos é insatisfatória. - O registro de dados é impreciso ou incompleto.
Esse estudo é projetado para avaliar a eficácia de um curso de retratamento com rituximab ou placebo para indivíduos elegíveis, e a segu- rança do tratamento com rituximab em indivíduos com RA ativa que recebem MTX e que tiveram uma resposta inadequada prévia ou atual a uma ou mais terapias anti-TNF. A elegibilidade de um indivíduo para o retratamento é ba- seada no critério de remissão DAS 28-ESR (DAS 28-ESR ≥ 2,6). Aproxima- damente 555 indivíduos serão incluídos. O estudo é em aberto pelo primeiro curso de tratamento (com rituximab) e cego para os indivíduos elegíveis para um curso de retratamento (fármaco do estudo). Durante as 24a-40a Sema- nas, os indivíduos que preenchem os critérios de retratamento serão rando- mizados em uma proporção de 2:1 para rituximab ou placebo.
A menos que especificado de forma diferente, todos os testes estatísticos são bipolares, e serão realizados no nível de significância □=0,05.
O resultado primário final é a proporção de indivíduos com uma resposta do ACR20 na 48a Semana em relação ao nível de base (1° Dia). A análise de dados não ocultos começará após as avaliações da 48a Semana de todos os indivíduos que estão na base de dados, e a base de dados é depurada e congelada.
Para o segmento de tratamento com rituximab em aberto (primei- ras 24 semanas do estudo), o número de indivíduos incluídos será tabulado por centro. Para indivíduos retirados do segmento de tratamento em aberto, as razões para a retirada serão resumidas. Violações dos critérios fundamen- tais de elegibilidade, outros desvios importantes do protocolo e o número de indivíduos que completaram cada dose programada serão resumidos.
Para o segmento de retratamento cego com o fármaco do estu- do, o número de indivíduos randomizados será tabulado por centro e grupo de tratamento. A disposição de indivíduos será resumida por grupo de tratamento com relação à randomização do indivíduo, tratamento e conclusão do estudo. Violações dos critérios fundamentais de elegibilidade, outros desvios impor- tantes do protocolo e o número de indivíduos que completaram cada dose programada serão resumidos por grupo de tratamento. Para indivíduos retira- dos precocemente do segmento de retratamento controlado por placebo, as razões para a retirada serão resumidas e listadas por grupo de tratamento.
O nível de base dos grupos de tratamento será avaliado quanto à comparabilidade com relação aos dados demográficos (ou seja, idade, se- xo, raça/etnia) e características de base (por exemplo, peso corporal, dura- ção da RA, estado do RF no nível de base, SJC/TJC de base, DAS 28-ESR de base e número de terapias anteriores com TNF). O valor de base de qual- quer variável será definido como o último valor disponível, antes da primeira administração de rituximab (1o Dia).
A segurança será avaliada através do resumo de eventos ad- versos, morte, resultados dos testes laboratoriais, sinais vitais e HACAs. Es- ses resumos serão produzidos como um resumo global para o segmento de tratamento em aberto e por grupo de tratamento para o segmento de retra- tamento controlado por placebo. As análises de segurança serão baseadas nos indivíduos que receberam qualquer quantidade de fármaco do estudo. Os indivíduos serão analisados de acordo com o real tratamento recebido.
Os seguintes resumos de segurança serão incluídos nas análi- ses de segurança.
As descrições de Verbatim dos eventos adversos surgidos com o tratamento serão equiparadas aos termos léxicos MedDRA. Os eventos adversos serão tabulados de acordo com a classe de órgão sistêmico, rami- ficação de tratamento, e grau NCI CTCAE. As tabulações dos eventos ad- versos para os eventos adversos sérios, eventos adversos relacionados à infecção, reações à infusão relacionadas ao rituximab e eventos adversos que levam à suspensão do fármaco do estudo serão baseadas em todos os indivíduos tratados, e tabuladas após a primeira infusão do curso inicial de rituximab e o curso de retratamento.
Além disso, os eventos adversos sérios serão resumidos como in- cidência por 100 pacientes/ano após a primeira infusão do curso inicial de rituxi- mab e o curso de retratamento, bem como para todo o período de observação.
As mortes dos indivíduos e a causa primária da morte serão lis- tadas e/ou resumidas.
Serão fornecidos resumos descritivos dos valores laboratoriais e das alterações em relação ao nível de base por todo o estudo. A proporção de indivíduos que apresentam anormalidades laboratoriais decorrentes do tratamento será resumida.
Serão fornecidos resumos dos sinais vitais e das alterações em relação ao nível de base por todo o estudo por grupo de tratamento.
Será resumida a proporção de indivíduos com uma resposta de anticorpo mensurável ao rituximab.
A população-alvo para o tratamento (ITT) consiste em todos os in- divíduos que foram randomizados no segmento de retratamento controlado por placebo e receberam qualquer fármaco do estudo. A população ITT é a popula- ção de análise primária para os resultados finais primários e secundários. Os indivíduos serão analisados de acordo com seu tratamento randomizado.
O resultado primário final é a proporção de indivíduos tratado novamentes com uma resposta do ACR20 na 48a Semana comparado com o nível de base (1o Dia).
A obtenção de uma ACR20 exige uma melhora > 20% compa- rado com o nível de base tanto nos TJCs quanto nos SJCs, além de uma melhora > 20% em três de cinco medidas adicionais, da seguinte forma:
- Avaliação Global pelo Médico da atividade da doença
- Avaliação Global pelo Paciente da Atividade da Doença (VAS)
- Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS)
- HAQ
- Reagente da fase aguda (CRP ou ESR)
A CRP será usada no cálculo de ACR20. Caso esteja faltando a CRP ou ela nao tenha sido realizada, será usada a ESR.
A análise primária da diferença nas taxas de resposta do ACR20 entre as ramificações de retratamento com placebo e retratamento com rituxi- mab será apresentada com o uso de estatísticas do teste de Cochran-Mantel Haenszel, estratificadas por estado do RF no nível de base. Os resultados se- rão resumidos de forma descritiva por grupo de tratamento, e expressos como proporções, com os intervalos de confiança de 95% (CIs) ajustados da diferen- ça entre as taxas de resposta e os valores ρ correspondentes.
As taxas de resposta do ACR20 também serão analisadas com o uso de regressão logística e testes para uma associação entre resposta do ACR20 na 48a Semana e ramificação de tratamento, controlando o estado do RF no nível de base com o uso de um modelo de regressão logística. As estimativas do parâmetro do modelo serão examinadas por tabulação dos erros-padrão, estatísticas de Wald e proporções de probabilidades com os 95% de Cls e valores ρ correspondentes.
As análises de sensibilidade também serão realizadas ajustan- do-se os termos explanatórios potenciais para a resposta do ACR20 (por exemplo, SJC de base).
Os resultados finais secundários serão analisados da seguinte forma:
- A proporção de indivíduos com resposta do ACR50 e ACR70 na 48a Semana será analisada da mesma forma especificada para o resulta- do primário final.
- A mudança em DAS 28-ESR do nível de base até a 48a Se- mana será avaliada com o uso de um modelo de análise de variância (ANO- VA), com grupo de retratamento com placebo/rituximab e estado do RF no nível de base como termos explanatórios no modelo.
- A categoria ordenada de resposta ACR (indivíduos com res- posta ACR70, indivíduos com resposta ACR50-70, indivíduos com resposta ACR20-50 e indivíduos sem resposta ACR20) na 48a Semana será analisa- da com o uso do modelo de lógica cumulativa, estratificado por estado do RF no nível de base. As estimativas do parâmetro pelo modelo serão examina- das por tabulação dos erros-padrão, estatística de Wald, e proporções de probabilidades com 95% de Cls e valores ρ correspondentes.
- As taxas de resposta EULAR (boa ou moderada) na 48a Se- mana serão analisadas da mesma forma especificada para o resultado pri- mário final.
- A alteração no conjunto de ACR (SJC, TJC1 HAQ1 avaliações globais pelo paciente e pelo médico, dor, CRP e ESR) do nível de base até a 48a Semana será analisada em um modelo ANOVA1 com grupo de retrata- mento com placebo/rituximab e estado do RF no nível de base como termos explanatórios no modelo.
- ACRn da 48a Semana e AUC de ACRn na 48a semana serão
avaliados com o uso de um modelo de análise de variância (ANOVA)1 com grupo de retratamento com placebo/rituximab e estado do RF no nível de base como termos explanatórios no modelo.
- A mudança na subescala SF-36 e nas classificações resumi- das do nível de base até a 48a Semana será registrada pelas classificações de oito domínios e pelas classificações do componente mental e físico com o uso de um modelo ANOVA1 com grupo de retratamento com place- bo/rituximab e estado do RF no nível de base como termos explanatórios no modelo. Além disso, as classificações do componente mental e físico serão ainda categorizadas e analisadas.
- A mudança da avaliação FACIT-F do nível de base até a 48a Semana será analisada com o uso de um modelo ANOVA1 com grupo de retratamento com placebo/rituximab e estado do RF no nível de base como termos explanatórios no modelo.
-A proporção de indivíduos que obtêm remissão de DAS 28- ESR (DAS 28-ESR < 2,6) na 48a Semana será analisada da mesma forma especificada para o resultado primário final.
- A proporção de indivíduos que obtêm redução da doença DAS 28-ESR (DAS 28-ESR < 3,2) na 48a Semana será analisada da mesma for- ma especificada para o resultado primário final.
Os parâmetros farmacocinéticos (PK) derivados das concentra- ções séricas de rituximab, incluindo concentração sérica máxima (Cmax), tem- po de concentração sérica máxima (Tmax)1 área sob a curva de concentração versus tempo (AUC), depuração sistêmica (CL)1 volume de distribuição (V) e meia-vida (ty2), serão estimados para todos os indivíduos com o uso de um modelo PK da população. Por causa da amostragem esparsa, a fase de dis- tribuição pode não ser bem caracterizada. Os dados de PK desse estudo se- rão combinados com dados de outros estudos para análise PK da população.
Para a análise PK da população, parâmetros PK médios globais serão estimados para toda a população do estudo, juntamente com estimati- vas da variância intra- e interindivíduos e uma estimativa do erro aleatório.
As estimativas dos parâmetros individuais dos pacientes serão computadas com o uso de procedimentos de análise post hoc. Um planejamento de aná- lise prospectivo será preparado, e a análise PK da população será apresen- tada em um relatório separado do relatório do estudo clínico.
As análises PK da população incluirão uma análise exploratória para identificar covariáveis de base que afetem a farmacocinética de rituxi- mab nessa população de pacientes. As covariáveis de base a serem exami- nadas incluirão dados demográficos e outras características do indivíduo, tais como gravidade da doença e medidas laboratoriais selecionadas.
Os dados serão resumidos com o uso de estatística descritiva, incluindo média, desvio padrão, média geométrica, coeficiente de variação, mediana e amplitude.
Os marcadores farmacodinâmicos potenciais de amostras de sangue, incluindo contagens de células B, níveis quantitativos de Ig, subtipos de linfócitos e concentração de HACA, serão resumidos de forma descritiva. Para essas análises, os valores de base medidos a partir da amostra de pré- dose do 1° Dia serão usados para calcular a mudança a partir do nível de base em cada momento de coleta de amostras.
Serão realizadas análises exploratórias para avaliar o possível relacionamento entre marcadores farmacodinâmicos, medidas PK e resposta clínica, e serão especificadas no Planejamento da Análise Estatística.
Aproximadamente 555 indivíduos serão incluídos. Presumindo- se uma taxa de abandono de até 25% durante o segmento de tratamento em aberto e de até 10% dos indivíduos que obtêm remissão de DAS 28-ESR na 24a Semana e não são tratado novamentes, com uma proporção de rando- mização de 2:1, esse tamanho de amostra terá um poder de 80% para de- tectar uma diferença de 16% nas taxas de resposta do ACR20 do nível de base até a 48a Semana entre o grupo de retratamento com rituximab (50% dos indivíduos com resposta ACR20) e o grupo de placebo (34% dos indiví- duos com resposta ACR20) usando o teste exato de Fisher.
As avaliações de segurança consistirão no monitoramento e re- gistro de eventos adversos definidos pelo protocolo (AEs) e eventos adver- sos sérios (SAEs), da medida de variáveis laboratoriais especificadas pelo protocolo (hematologia, bioquímica clínica e exame de urina), da medida de sinais vitais especificados pelo protocolo e de outros testes especificados pelo protocolo que sejam considerados críticos para a avaliação de seguran- ça do fármaco do estudo.
Para monitorar as reações relacionadas à infusão, os sinais vi- tais serão obtidos imediatamente pré-infusão, a cada 15 minutos pela primei- ra hora durante a infusão e, a seguir, a cada 30 minutos pelo restante da infusão, e a cada 30 minutos por uma hora pós-infusão, nos dias de adminis- tração do fármaco do estudo. Leituras adicionais podem ser obtidas no caso de uma reação relacionada à infusão (por exemplo, hipotensão e/ou febre).
Um AE é qualquer sinal, sintoma ou doença desfavorável e in- desejado temporalmente associado ao uso de um produto em investigação (medicinal) ou a outra intervenção imposta pelo protocolo, independente- mente da atribuição.
Esses eventos incluem os seguintes: - AEs não observados previamente no indivíduo que surgem durante o período de relato de AE especificado pelo protocolo, incluindo si- nais ou sintomas associados a RA que não-estavam presentes antes do pe- ríodo de relato de AE
- Complicações que ocorrem em conseqüência de intervenções determinadas pelo protocolo (por exemplo, procedimentos invasivos como, por exemplo, biópsias)
- Se aplicável, AEs que ocorrem antes da designação do trata- mento de estudo associado à eliminação de medicação, sem prova de tra- tamento ou outra intervenção determinada pelo protocolo
- Condições médicas preexistentes (além da condição que está sendo estudada) avaliadas pelo investigador como tendo piorado em termos de gravidade ou freqüência, ou com mudança de característica durante o período de relato de AE especificado pelo protocolo
Um AE deve ser classificado como um SAE caso preencha os seguintes critérios:
- Cause a morte (ou seja, o AE realmente causa ou leva à morte).
- Seja potencialmente fatal (ou seja, o AE, na visão do investi- gador, coloca o indivíduo em risco imediato de morte. Ele não inclui um AE que, tendo ocorrido em uma forma mais severa, possa ter causado a morte).
- Exige ou prolonga a hospitalização do paciente.
- Resulte em incapacidade/incapacidade persistente ou signifi- cativa (ou seja, o AE resulta em uma ruptura substancial da capacidade do indivíduo de efetuar as funções normais da vida).
- Resulte em uma anomalia congênita/defeito de nascimento em um neonato/bebê cuja mãe foi exposta ao produto em investigação.
É considerado um evento médico significativo pelo investigador com base na avaliação médica (por exemplo, pode pôr em risco o indivíduo ou pode exigir intervenção médica/cirúrgica para evitar um dos resultados finais listados acima).
Todos os AEs que não preenchem qualquer um dos critérios para serem considerados sérios devem ser considerados AEs não sérios.
Os termos "grave" e "sério" não são sinônimos. Gravidade (ou in- tensidade) refere-se ao grau de um AE específico, por exemplo, infarto do miocárdio leve (Grau 1), moderado (Grau 2) ou grave (Grau 3). "Sério" é uma definição reguladora, e se baseia em critérios do indivíduo ou do resultado final do evento ou de ação normalmente associados a eventos que possuem uma ameaça à vida ou ao funcionamento de um indivíduo. Severidade (e não gravidade) serve como diretriz para a definição de obrigações de relatórios reguladores pelo Patrocinador para as autoridades reguladoras aplicáveis.
Gravidade e severidade devem ser avaliadas independente- mente quando se relatam AEs e SAEs no CRF.
Os investigadores avaliarão a ocorrência de AEs e SAEs em todos os momentos de avaliação do indivíduo durante o estudo. Todos os AEs e SAEs1 sejam eles declarados pelo indivíduo, descobertos pela equipe do estudo durante questionamento ou detectados através do exame físico, testes laboratoriais ou outros meios, serão registrados no prontuário médico do indivíduo e na página apropriada de AE ou SAE do CRF.
Cada AE ou SAE registrado será descrito por sua duração (ou seja, datas de início e fim), gravidade (veja Tabela 2), critérios reguladores de severidade, se aplicável, relacionamento suspeito com o produto em in- vestigação (veja as diretrizes a seguir), e ações tomadas.
A escala de graduação do AE (gravidade) encontrada no NCI CTCAE, V3.0, será usada para registro de AEs.
Tabela 2
<table>table see original document page 187</column></row><table>
Observação: Independentemente da gravidade, alguns eventos também podem preen- cher os critérios reguladores de gravidade. Veja as definições de um SAE. aUsar essas definições alternativas para eventos de Grau 1, 2, 3, e 4 quando o AE ob- servado ou relatado não-estiver na listagem do NCI CTCAE.
Para assegurar a consistência de avaliações de causalidade de AE e SAE, os investigadores devem aplicar as seguintes diretrizes gerais:
- Sim
Há um relacionamento temporal plausível entre o surgimento do AE e a administração do produto em investigação, e o AE não pode ser fa- cilmente explicado pelo estado clínico do indivíduo, doença intercorrente ou terapias concomitantes; e/ou o AE segue um padrão conhecido de resposta ao produto em investigação; e/ou o AE é reduzido ou desaparece com a suspensão do produto em investigação ou redução da dose e, se aplicável, reaparece com o reataque.
- Não
Existem evidências de que o AE tem uma etiologia diferente do produto em investigação (por exemplo, condição médica preexistente, doen- ça subjacente, doença intercorrente ou medicação concomitante); e/ou o AE não tem relacionamento temporal plausível com a administração do produto em investigação (por exemplo, câncer diagnosticado 2 dias após a primeira dose de fármaco do estudo).
Observação: A avaliação de causalidade do investigador para os relatos de AE do indivíduo é parte do processo de documentação do es- tudo. Independentemente da avaliação de causalidade "Sim" ou "Não" para relatos de AE do indivíduo, o Patrocinador irá prontamente avaliar todos os SAEs relatados contra a experiência acumulada do produto para identificar e comunicar o mais rápido possível os novos achados sobre a segurança aos investigadores e às autoridades reguladoras aplicáveis.
RA deve ser relatado como um AE ou SAE apenas se conside- rado pelo investigador como tendo uma piora inesperada em termos de gra- vidade e/ou freqüência, ou como tendo sua natureza alterada em qualquer momento durante o estudo. Quando se relata uma piora não prevista da ar- trite reumatoide na página de AE ou SAE do CRF, é importante transmitir o conceito de que a condição se alterou incluindo-se os descritores aplicáveis (por exemplo, "artrite reumatoide acelerada").
Espera-se que o retratamento sob o protocolo aqui apresentado (ou com um anticorpo CD20 diferente) seja eficaz na prevenção ou redução da velocidade da progressão da lesão articular estrutural e da erosão causa- das pela RA. Contempla-se que ocorreriam resultados eficazes caso MTX não fosse empregado, ou seja, a monoterapia com o anticorpo CD20 é usa- da.
Exemplo 4
Estudo da eficácia de rituximab em pacientes com artrite psoriática
É seguido o protocolo do Exemplo 2, exceto que os pacientes são tratados de lesão articular causada por artrite psoriática. Espera-se que sejam observados resultados similares (com o uso de rituximab ou um anti- corpo 2H7 humanizado) aos da artrite reumatoide, ou seja, que a progressão da lesão articular estrutural seja evitada mediante uma primeira dose de an- ticorpo CD20 (com ou sem metotrexato, dependendo, por exemplo, das do- sagens, que podem ser ajustadas adequadamente) em pelo menos cerca de um mês após o nível de base ou início do tratamento, de preferência, pelo menos 24 semanas após o nível de base, mais preferivelmente pelo menos 52 semanas após o nível de base, e em momentos adicionais, até 104 se- manas após o nível de base.
Esses regimes de tratamento que se baseiam em rituximab de- safiam o padrão atual de tratamento, e espera-se que demonstrem benefí- cios clínicos acentuados, com o objetivo primário de evitar a progressão da lesão articular. Espera-se que esses resultados sejam significativamente melhores do que os do barco de controle.
Espera-se e prevê-se que a administração de rituximab ou um 2H7 humanizado ao indivíduo no protocolo de redosagem programada apre- sentado no Exemplo 2 seja eficaz na prevenção da progressão de lesão arti- cular estrutural na 52a semana ou posteriormente. Espera-se que esses re- sultados sejam significativamente melhores do que os do controle.
Espera-se também que em torno da 48a-54a semana, outra do- se de 1 g ou 2 g do anticorpo CD20 (por exemplo, rituximab ou um 2H7 hu- manizado), dada de uma só vez ou espalhada ao longo de 14-16 dias em quantidades de 0,5 grama ou 1 grama, seja eficaz para tratar lesão articular por todo o segundo ano, com ou sem um ou mais segundos medicamentos como, por exemplo, agentes imunossupressores. Dessa forma, o anticorpo CD20 seria administrado inicialmente dentro de um período de tempo de aproximadamente duas semanas, seguido por outro tratamento em cerca de 4-8 meses, seguido por outro tratamento em cerca de um ano a partir do tratamento inicial (medido a partir do momento em que qualquer uma das doses foi dada), seguido por tratamento em cerca de dois anos a partir do tratamento inicial, com o sucesso esperado, em uma dosagem de cerca de meio grama ou um grama x 2-4 para cada tratamento, administradas em conjunto, aproximadamente uma vez por semana ou aproximadamente em semanas alternadas, ao longo de aproximadamente duas a quatro semanas. Supostamente, os resultados desse tratamento seriam bem melhores do que os do controle com placebo. Espera-se que esse protocolo de retratamento seja usado com sucesso por vários anos, com poucos ou sem efeitos adver- sos.
Exemplo 5
Estudo da eficácia do tratamento com rituximab em pacientes com osteoartrite e doença de Crohn
Espera-se que os resultados do Exemplo 2 sejam bem- sucedidos se os pacientes tiverem lesão articular em conseqüência de oste- oartrite ou doença de Crohn, seja usado rituximab ou outro anticorpo CD20 como, por exemplo, 2H7 humanizado, e seja ou não usado um agente imu- nossupressor, com ajuste de doses, como é do conhecimento daqueles ver- sados na técnica. Além disso, se estes pacientes forem tratados inicialmente com anticorpo CD20 e depois retratados com este anticorpo cerca de seis meses ou cerca de um ano após o primeiro tratamento, com o uso da mes- ma dosagem e de outro protocolo do Exemplo 2, espera-se que eles conti- nuem a apresentar prevenção da progressão da lesão articular por um perí- odo de tempo prolongado.
Espera-se também que rituximab ou outro anticorpo CD20 seja pelo menos tão eficaz quanto o regime de tratamento convencional para in- dução e manutenção de remissão da lesão articular, oferecendo vantagens substanciais em relação à terapia-padrão em função de seu perfil superior de efeitos colaterais, por exemplo, é bem menos tóxico do que os esteroi- des, e melhor na restauração de tolerância.
Espera-se que os pacientes na ramificação de tratamento tole- rem bem as infusões rituximab, e que suas células B sejam eliminadas rapi- damente. Além do metotrexato, se necessário, espera-se que nenhum agen- te imunossupressor adicional seja necessário para indução de remissão e manutenção de remissão sustentada (6 meses ou mais) nos pacientes trata- dos com anticorpo CD20. Listagem de Seqüências
<110> Mark Totoritis
<120> Usos de rituximab
<130> 39766-0192
<140> Ainda não atribuído
<141> Incluso
<150> 60/737,291
<151> 2005-11-15
<150> 60/864,463
<151> 2006-11-06
<160> 43
<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> domínio variável da cadeia leve de 2H7 humanizado <400> 2 Asp Ile 1
Asp Arg His Trp Ala Pro
1 5 50
Gly Ser 65
Asp Phe
Phe Gly
<210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 1 5 10 15
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
20 25
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 55
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 70
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 30
Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 45
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
75 80
Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 90 95
Lys Arg Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 4 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> 2H7 CDRl <400> 4
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 5 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> 2H7 CRD2 <400> 5
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 6 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> 2H7 CDR3 <400> 6
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 7 <211> 122 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 7
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 8 <211> 122 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Domínio variável da cadeia pesada de 2H7 humanizado <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 10 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de consenso humana do subgrupo III <400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 10 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> CDRl de cadeia pesada <400> 10
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
1 5 10
<210> 11 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> CDR2 de cadeia pesada <400> 11
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly <210> 12 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220> <223> CDR3 de cadeia pesada <400> 12
Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 15 10
<210> 13
<211> 213 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de cadeia leve de 2H7 humanizado <400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 165
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 180
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 195 200
Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 14 <211> 452 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de cadeia pesada de 2H7 humanizado <400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
170 175
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 185 190
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 205 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 385 390
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 420 425
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440
Ser Pro Gly Lys
450 <210> 15 <211> 451 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Domínio variável da cadeia pesada de 2H7 humanizado <400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 445 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450 <210> 16 <211> 285 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 16
Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu
15 10 15
Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
20 25 30
Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
50 55 60
Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg 65 70 75 80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
85 90 95
Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu 100 105 HO Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn
115 120 125
Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln
130 135 140
Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys 145 150 155 160
Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser
165 170 175
Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr
180 185 190
Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met
195 200 205
Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu
210 215 220
Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240
Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly
245 250 255
Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
260 265 270
Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 275 280 285
<210> 17 <211> 309 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 17
Met Asp Glu Ser Ala Lys Thr Leu Pro Pro Pro Cys Leu Cys Phe Cys
15 10 15
Ser Glu Lys Gly Glu Asp Met Lys Val Gly Tyr Asp Pro Ile Thr Pro 20 25 30 Gln Lys Glu Glu Gly Ala Trp Phe Gly Ile Cys Arg Asp Gly Arg Leu 35 40 45
Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Phe Thr Ala 50 55 60
Met Ser Leu Tyr Gln Leu Ala Ala Leu Gln Ala Asp Leu Met Asn Leu 65 70 75 80
Arg Met Glu Leu Gln Ser Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Pro Ala Ala Ala 85 90 95
Gly Ala Pro Glu Leu Thr Ala Gly Val Lys Leu Leu Thr Pro Ala Ala 100 105 110
Pro Arg Pro His Asn Ser Ser Arg Gly His Arg Asn Arg Arg Ala Phe 115 120 125
Gln Gly Pro Glu Glu Thr Glu Gln Asp Val Asp Leu Ser Ala Pro Pro 130 135 140
Ala Pro Cys Leu Pro Gly Cys Arg His Ser Gln His Asp Asp Asn Gly 145 150 155 160
Met Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp 165 170 175
Ser Asp Thr Pro Thr Ile Arg Lys Gly Thr Tyr Thr Phe Val Pro Trp 180 185 190
Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Asn Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys 195 200 205
Ile Val Val Arg Gln Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Ser Gln Val Leu 210 215 220
Tyr Thr Asp Pro Ile Phe Ala Met Gly His Val Ile Gln Arg Lys Lys 225 230 235 240
Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys 245 250 255
Ile Gln Asn Met Pro Lys Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala 260 265 270
Gly Ile Ala Arg Leu Glu Glu Gly Asp Glu Ile Gln Leu Ala Ile Pro 275 280 285 Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr Phe Phe Gly
290 295 300
Ala Leu Lys Leu Leu 305 <210> 18 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Antagonista de BAFF <220>
<221> VARIANTE <222> 1
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220>
<221> VARIANTE <222> 3
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220>
<221> VARIANTE <222> 5
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220>
<221> VARIANTE <222> (7)... (12)
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220>
<221> VARIANTE <222> 14, 15
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220>
<221> VARIANTE <222> (16)...(16)
<223> X pode ser L, F, I ou V
<220>
<221> VARIANTE <222> (17) ... (17)
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteína <400> 18
Xaa Cys Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa
<210> 19 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de Fórmula 1 <400> 19
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Ser Val Leu
1 5 10 15
Lys <210> 20 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de Fórmula 1 <400> 20
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Trp Val Pro Cys Gly Leu Leu
1 5 10 15
Arg <210> 21 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de Fórmula 1 <400> 21
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Glu Met Leu
15 10 15
Gly <210> 22 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de Fórmula 1 <400> 22
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys His Met Leu
15 10 15
Arg
<210> 23 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de Fórmula 1 <400> 23
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Trp Val Ala Cys Gly Leu Leu
15 10 15
Arg
<210> 24 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de Fórmula 1 <400> 24
Gln Cys Phe Asp Arg Leu Asn Ala Trp Val Pro Cys Ser Val Leu Lys 1 5 10 15
<210> 25 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fórmula II do antagonista de BAFF <220>
<221> VARIANTE <222> (1)...(1) <223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220>
<221> VARIANTE <222> (3)...(3)
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220>
<221> VARIANTE <222> (5)...(5)
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220>
<221> VARIANTE <222> (8)...(9)
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220>
<221> VARIANTE
<222> (14)...(15)
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteina <220> <221> VARIANTE <222> (17) ... (17)
<223> X pode ser qualquer aminoácido, exceto cisteína <400> 25
Xaa Cys Xaa Asp Xaa Leu Val Xaa Xaa Trp Val Pro Cys Xaa Xaa Leu
1 5 10 15
Xaa <210> 26 <211> 184 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 26
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly
50 55 60
Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly 65 70 75 80
Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val
85 90 95
Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser
100 105 110
Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp
115 120 125
Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala
130 135 140
Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser 145 150 155 160 Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr
165 170 175
Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln 180
<210> 27 <211> 26 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Mini-BR3 <400> 27
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
1 5 10 15
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg 20 25
<210> 28 <211> 213 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Região da cadeia leve de Hu2H7.vl38 <400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 29 <211> 452 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Região da cadeia pesada de Hu2H7.vl38 <400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 30 <211> 213 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de cadeia leve de 2H7 humanizado <400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu lie Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 ^ . 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 31 <211> 452 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Região de cadeia pesada de 2H7.V511 <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450 <210> 32 <211> 107 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> região variável da cadeia leve do anticorpo 2H7 humanizado <4 00> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 33 <211> 122 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> região variável da cadeia pesada do anticorpo 2H7 humanizado <400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 34 <211> 356 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Domínio variável da cadeia pesada de 2H7 humanizado <400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu 355
<210> 35 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> 2Η7 CDRl <220>
<221> VARIANTE
<222> 9
<223> Xaa = Qualquer aminoácido <400> 35
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa His 15 10
<210> 36
<211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> 2Η7 CDR3 <220>
<221> VARIANTE <222> 4
<223> Xaa = Qualquer aminoácido
<400> 36
Gln Gln Trp Xaa Phe Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 37 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> 2Η7 CDR2 <220>
<221> VARIANTE <222> 8
<223> Xaa = Qualquer aminoácido <400> 37
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> 2H7 CDR3
<220>
<221> VARIANTE
<222> 6, 7
<223> Xaa = Qualquer aminoácido
<400> 38
Val Val Tyr Tyr Ser Xaa Xaa Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Domínio variável da cadeia leve de 2H7 humanizado
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 40 <211> 122 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Domínio variável da cadeia pesada de 2H7 humanizado <400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 41 <211> 451 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Domínio variável da cadeia pesada de 2H7 humanizado <400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450 <210> 42 <211> 451 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Domínio variável da cadeia pesada de 2H7 humanizado <400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450 <210> 43 <211> 451 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Domínio variável da cadeia pesada de 2H7 humanizado <400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser 210
Cys Asp Lys Thr 225
Gly Gly Pro Ser
Met Ile Ser Arg 260
His Glu Asp Pro 275
Val His Asn Ala 290
Tyr Arg Val Val 305
Gly Lys Glu Tyr
Ile Ala Ala Thr 340
Val Tyr Thr Leu 355
Ser Leu Thr Cys 370
Glu Trp Glu Ser 385
Pro Val Leu Asp
Val Asp Lys Ser 420
Met His Glu Ala 435
Ser Pro Gly 450
Asn Thr Lys Val Asp Lys 215
His Thr Cys Pro Pro Cys 230
Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250
Thr Pro Glu Val Thr Cys 265
Glu Val Lys Phe Asn Trp 280
Lys Thr Lys Pro Arg Glu 295
Ser Val Leu Thr Val Leu 310
Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330
Ile Ser Lys Ala Lys Gly 345
Pro Pro Ser Arg Glu Glu 360
Leu Val Lys Gly Phe Tyr 375
Asn Gly Gln Pro Glu Asn 390
Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410
Arg Trp Gln Gln Gly Asn 425
Leu His Asn His Tyr Thr 440
Lys Val Glu Pro Lys Ser 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu 255
Val Val Val Asp Val Ser 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu 285
Glu Gln Tyr Asn Ala Thr 300
His Gln Asp Trp Leu Asn 315 320
Ala Ala Leu Pro Ala Pro 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln 350
Met Thr Lys Asn Gln Val 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 415
Val Phe Ser Cys Ser Val 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu 445

Claims (11)

1. Uso de rituximab caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de artrite reumatóide (RA) em um indivíduo, em que (a) o indivíduo recebeu pelo menos um curso de tratamento anterior com ritu- ximab, e (b) o tratamento compreende pelo menos um curso de tratamento adicio- nal com rituximab.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo exibiu uma resposta inadequada a um ou mais inibidores anti-fator de necrose tumoral (TNF);
3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo respondeu a pelo menos um curso de tratamento anterior com ritu- ximab.
4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a RA é RA ativa.
5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido tratamento é bem sucedido em parar ou reduzir a progressão de le- são articular ou estrutural causada por artrite reumatóide ou na prevenção do de- senvolvimento de lesão articular causada por artrite reumatóide.
6. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende a administração de rituximab e metotrexato.
7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o curso de tratamento compreende a administração de duas doses de 1000 mg intravenosas com intervalo de 14 dias.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o curso de tratamento adicional é administrado durante 24-40 semanas após o referido tratamento anterior com rituximab.
9. Uso de rituximab caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar lesão estrutural articular em um indivíduo, em que o referido tratamento compreende administrar um curso de tratamento com rituximab ao indivíduo, e submeter o indivíduo, pelo menos cerca de um mês após a adminis- tração, a um teste radiográfico que mede uma redução na lesão articular como comparado com o de base antes da administração, em que o curso de tratamento administrado é eficaz para reduzir a progressão da referida lesão estrutural articular como medido por teste radiográfico.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o curso de tratamento compreende a administração de duas doses de 1000 mg intravenosas com intervalo de 14 dias.
11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tratamento adicional compreende a administração de metotrexato.
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