BRPI0616962A2 - uso de lactobacillus para o tratamento de doenças autoimunes - Google Patents

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Anna Bergen
Carola Rask
Agnes Wold
Shahram Aghaibeik-Lavasani
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Probi Ab
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Abstract

USO DE LACTOBACILLUS PARA O TRATAMENTO DE DOENçAS AUTOIMUNES. A presente invenção refere-se ao uso de pelo menos uma cepa de bactérias probiáticas selecionadas de Lactobacilius para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença auto-imune.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DELACTOBACILLUS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMU-NES".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao uso de pelo menos uma cepabacteriana probiótica selecionada de Lactobacillus para a fabricação de umacomposição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de uma doen-ça autoimune.
Antecedentes da Técnica
Bactérias probióticas são definidas como micro-organismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, afetam benefi-camente o hospedeiro. Lactobacilli e bifidobacteria são as bactérias usadasmais freqüentemente em produtos probióticos. Essas bactérias são geral-mente seguras, uma vez que são probióticos baseados nesses organismos.A ausência de patogenicidade se estende através de todas as faixas etáriase a indivíduos imunocomprometidos. Demonstrou-se que a ingestão de dife-rentes bactérias probióticas possui benefícios clínicos em várias situaçõesfisiológicas ou patológicas. Os efeitos mais marcantes foram na diarréia cau-sada por tratamento antibiótico ou infecção por rotavírus. Também há estu-dos que demonstram efeitos clínicos positivos em doenças inflamatórias dointestino, dermatite atópica e hipercolesterolemia após a ingestão de bacté-rias probióticas. O mecanismo pelo qual as bactérias probióticas contribuempara esses benefícios clínicos ainda não está muito claro. Estudos humanosin vitro, bem como estudos animais tanto in vivo quanto in vitro, demonstra-ram que diferentes espécies de LactobaciHi afetam o sistema imunológicoinato e adquirido de muitas formas diferentes.
Os estudos clínicos demonstraram principalmente estimulaçãodo sistema imunológico celular inato e aumento das respostas imunes humo-rais às infecções naturais e à imunização sistêmica ou oral. Em relação aosefeitos do sistema imunológico inato, foi relatado aumento da atividade fago-cítica de células polimorfonucleares (PMN) e aumento da atividade de mortetumoral por células NK (natural killers). Pelo que sabemos, não há estudosclínicos que apresentem efeitos sobre o sistema imunológico celular especí-fico após a ingestão de bactérias probióticas.
No presente pedido, os efeitos sobre o sistema imunológico inato eadquirido após a ingestão diária de Lactobacilli ou da bactéria gram-negativa P.Lundensis foram cuidadosamente investigados, dentre outras coisas. Curiosa-mente, foi observada uma ativação do sistema imunológico celular específicoem indivíduos que recebem L. Plantarum, e indicações de que o mesmo ocorraem indivíduos que recebem L. paracasei. Além disso, os efeitos de aumento daimunidade sobre o sistema imunológico inato, por exemplo, expansão da popu-lação de células NKT e aumento da atividade fagocítica, foram observados emindivíduos que recebem diferentes espécies de Lactobacilli. A ingestão da bac-téria gram-negativa P. Lundensis não teve nenhum efeito sobre os diferentesparâmetros imunológicos medidos nesse estudo.
Um problema crescente no mundo ocidental consiste nas doen-ças autoimunes e relacionadas à autoimunidade nas quais o sistema imuno-lógico do indivíduo humano o ataca por engano, e o indivíduo acometido po-de ficar muito doente. As doenças autoimunes podem afetar tecidos conjun-tivos e muitas outras partes do corpo como, por exemplo, órgãos específicoscomo a pele, os nervos, o cérebro, pulmões, rins e articulações. Um exemplode uma doença autoimune nos nervos e no cérebro é a esclerose múltipla e,sobre a pele, um exemplo é a psoríase. A doença autoimune pode assumirmuitas formas diferentes e também há muitos tratamentos para elas. O tra-tamento depende do tipo da doença e do órgão afetado.
Há uma necessidade na técnica para aliviar e tratar os sintomas re-acionados às doenças autoimunes, bem como fornecer um tratamento profiláti-co, antes da doença se desenvolver. Essas questões são o assunto principal dapresente invenção que ficará evidente a partir da especificação a seguir.
Sumário da Invenção
Um objeto da presente invenção é o uso de pelo menos umacepa de bactérias probióticas selecionadas de Lactobacillus para a fabrica-ção de uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevençãode uma doença autoimune.Outro objeto da presente invenção é um método para o trata-mento de uma doença autoimune, em que pelo menos uma cepa de bacté-rias probióticas selecionadas de Lactobacillus é administrada a um indivíduo.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 mostra os números de voluntários que relatam qual-quer efeito gastrointestinal adverso leve durante o experimento.
A Figura 2 mostra números da linha de base (dia 0) dos diferen-tes linfócitos por ml de sangue (média ± (erro padrão da média - EPM)).
A Figura 3 mostra as percentagens ou intensidades de fluores-cência (GMFI) da linha de base (dia 0) (média ± (EPM)) de linfócitos positi-vos para diferentes marcadores de ativação celular e de memória.
Figura 4. Os indivíduos foram distribuídos aleatoriamente emnove grupos de estudo diferentes. O experimento começou com um períodode lavagem de duas semanas. A seguir, iniciava-se o período de estudo ati-vo. Durante esse período, os indivíduos consumiram uma dose de produtode estudo por dia por 14 (grupos de L. Plantarum Heal 19, L. fermentum, L.paracasei, L. gasseri, L. rhamnosus, P. Lundensis) ou 35 dias (L Plantarum299v e grupo de placebo). Cada dose continha 1010 unidades de formaçãode colônias (CFU) (grupos de Lactobacilli) ou 109 CFU de bactérias (grupode P. Lundensis).
Figura 5. Percentagens de linfócitos que expressam os fenótiposde ativação CD8CD25, CD8HLA-DR, CD4CD25 e CD4HLA-DR foram anali-sadas por citometria de fluxo. São mostradas as médias por grupo (± EPM)com base nas proporções individuais, 14° dia/dia 0 e 35° dia/dia 0 (somentepara o grupo de L. Plantarum 299v e para o grupo de placebo).
Figura 6. As percentagens de linfócitos que expressam os fenó-tipos de memória CD8CD45RO e CD4CD45RO foram analisadas por cito-metria de fluxo. São mostradas as médias por grupo (± EPM) com base nasproporções individuais, 14° dia/dia 0 e 35° dia/dia 0 (somente para o grupode L. Plantarum e para o grupo de placebo).
Figura 7. As percentagens de linfócitos positivos para os marca-dores de células NKT (CD56CD16CD3) foram analisadas por citometria defluxo. Os cálculos por grupo se baseiam nas proporções individuais (14° di-a/dia 0).
Figura 8. A atividade fagocítica de neutrófilos foi analisada porincubação de células sangüíneas inteiras com E. coli ou S. Aureus marcadocom FITC. A proporção entre os valores médios da fluorescência obtidos no14° dia e no dia 0 foi determinada individualmente, e os cálculos por gruposão mostrados nessa figura.
A Figura 9 mostra o tratamento profilático de desenvolvimentode encefalomielite autoimune experimental (EAE), peso corporal e os sinto-mas clínicos (experimento 3).
A Figura 10 mostra o tratamento terapêutico de inflamação crôni-ca no tratamento de EAE iniciado no dia após o surgimento (experimento 3).
As Figuras 11 e 12 mostram o retardo do surgimento de EAE poradministração de L. Paracasei 8700:2 ou de L. Plantarum HEAL 9, compara-do com controle.
A Figura 13 mostra que EAE foi suprimida por uma mistura decepas probióticas de L Paracasei 8700:2, L. Plantarum HEAL 9 e L Planta-rum HEAL 19. Ela mostra ainda que o efeito de supressão foi rompido porremoção de células T CD4+.
A Figura 14 mostra que EAE foi suprimida por uma mistura de L.Paracasei 8700:2, L. Plantarum HEAL 9 e L Plantarum HEAL 19 comparadocom controle, metotrexato e L. Delbrueckii.
A Figura 15 mostra a proporção de linfócitos que expressam osfenótipos de ativação CD4CD25 do experimento 2.
A Figura 16 mostra a proporção de linfócitos que expressam osfenótipos de ativação CD4+CD25++ do experimento 2.
A Figura 17 mostra a proporção de linfócitos que expressam osfenótipos de ativação CD8+HLA-DR+do experimento 2.
A Figura 18 mostra a proporção de linfócitos que expressam osfenótipos de ativação CD8+CD25+ do experimento 2.
A Figura 19 mostra a proporção de linfócitos que expressam osfenótipos de ativação CD4CD45RO do experimento 2.Descrição Detalhada da Invenção
Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma cepa de bac-térias probióticas selecionadas de Lactobacillus é usada na fabricação deuma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença autoimuneselecionada, sem limitação, de uma autoimunidade específica de um órgão,por exemplo, esclerose múltipla (MS), alergia, psoríase, artrite reumatoide,doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes melito do tipo I, doenças infla-matórias do intestino ou lúpus sistêmico.
Quaisquer outras doenças autoimunes não mencionadas especi-ficamente nesse pedido, nas quais as bactérias probióticas possuam um e-feito (preventivo ou tratável), também estão dentro do escopo da presenteinvenção.
No presente contexto, a palavra "tratamento e/ou prevenção"inclui um tratamento profilático de um indivíduo, ou seja, o tratamento comas bactérias probióticas é iniciado antes de a doença ter se desenvolvido afim de evitar a doença, bem como um tratamento de uma doença que já sedesenvolveu em um indivíduo. Nesse último caso, espera-se, por exemplo,um alívio dos sintomas ou uma melhora da condição geral do paciente, ouque o paciente fique curado da doença. Dessa forma, o indivíduo pode seruma pessoa em risco ou não de desenvolver uma doença autoimune, ou jáser um paciente doente.
O Lactobacillus usado de acordo com a invenção pode ser sele-cionado, sem limitação, do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum,Lactobacillus rhamnsosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus paraeaseie Lactobacillus gasseri.
Outras cepas bacterianas probióticas, diferentes daquelas aquiexplicitamente apresentadas, podem naturalmente ser usadas de acordo coma presente invenção, e estão incluídas no escopo da invenção, desde quegerem os efeitos desejados, ou seja, possuam um efeito preventivo sobreuma doença autoimune, ou aliviem os sintomas de uma doença autoimune.
O Lactobacillus plantarum usado de acordo com a invenção po-de ser selecionado, sem limitação, do grupo que consiste em Lactobacillusplantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299ν, DSM 9843, Laeto-bacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19,DSM 15313 e Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316.
O Lactobacillus paraeasei usado de acordo com a invenção po-de ser selecionado, sem limitação, do grupo que consiste em Laetobaeillusparaeasei 8700:2, DSM 13434, e Laetobaeillus paraeasei 02A, DSM13432.
O Laetobaeillus gasseri usado de acordo com a invenção podeser selecionado, sem limitação, de Laetobaeillus gasseri VPG44, DSM 16737.
Em outra modalidade da invenção, são usadas pelo menos duascepas probióticas para o tratamento e/ou a prevenção da referida doençaautoimune. Essas pelo menos duas cepas são selecionadas de Laetobaeil-lus, de preferência de Laetobaeillus plantarum, Laetobaeillus rhamnsosus,Laetobaeillus fermentum, Laetobaeillus paraeasei e Laetobaeillus gasseri.
Na modalidade em que são usadas pelo menos duas cepas pro-bióticas para o tratamento desejado, as referidas pelo menos duas cepas sedestinam a ser administradas seqüencial ou simultaneamente. Dessa forma,as cepas podem ser administradas em uma mistura em uma composição, oupodem ser administradas em uma seqüência separadamente em composi-ções diferentes.
Em uma modalidade adicional da invenção, a referida composi-ção farmacêutica é uma formulação líquida ou uma formulação sólida, em quea referida formulação sólida é selecionada do grupo que consiste em compri-midos, comprimidos para chupar, balas, comprimidos de mascar, gomas demascar, cápsulas, sachês, pós, grânulos, partículas revestidas e comprimidosrevestidos, comprimidos e cápsulas com revestimento entérico e tiras e pelí-culas que derretem, e a referida formulação líquida é selecionada do grupoque consiste em soluções, suspensões, emulsões e xaropes orais.
Ainda em uma modalidade adicional da invenção, a referidacomposição compreende um material de transporte, em que o referido mate-rial de transporte é selecionado independentemente, sem limitação, do grupoque consiste em mingau de farinha de aveia, alimentos fermentados de áci-do lático, amido resistente, fibras dietéticas, carboidratos, proteínas e proteí-nas glicosiladas.
Em uma modalidade adicional da invenção, a referida composi-ção farmacêutica é selecionada, sem limitação, de um alimento medicinal,um alimento funcional, um suplemento dietético, um produto nutricional ouuma preparação alimentícia. Dessa forma, a palavra "composição farmacêu-tica", como aqui usada, não significa necessariamente uma composição far-macêutica em seu sentido normal, por exemplo, um medicamento, mas tam-bém pode ser um produto que faz parte do grupo dos alimentos medicinais,alimentos funcionais, suplementos dietéticos, e produtos nutricionais e pro-dutos alimentícios. Quando for um produto alimentício, ele poderá ser sele-cionado, sem limitação, de bebidas, iogurtes, sucos, sorvetes, pães, biscoi-tos, cereais, barras de cereais e pastas.
Dessa forma, o uso de uma composição de acordo com a inven-ção pode ser muito benéfico em termos de ser útil profilaticamente, ou seja,antes de a doença autoimune ter se desenvolvido. Como a composição far-macêutica usada não é necessariamente um medicamento em seu significa-do normal, mas também pode ser um suplemento dietético ou um alimentofuncional, é muito conveniente que um indivíduo normal saudável consuma acomposição da invenção profilaticamente.
Em uma modalidade da invenção, cada uma das referidas cepasestá presente na composição em uma quantidade de cerca de 1 χ 106 a cer-ca de 1 χ 1014 CFU, de preferência de cerca de 1 χ 108 a cerca de 1 χ 1012 e,mais preferivelmente, de cerca de 1 χ 109 a cerca de 1 χ 1011.
A composição farmacêutica de acordo com a invenção tambémpode compreender outras substâncias como, por exemplo, um veículo inerteou adjuvantes, veículos, conservantes farmacêuticos aceitáveis etc., osquais são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica.Exemplos
Exemplo 1
Indivíduos e Critérios do Experimento
Cinqüenta e sete voluntários aparentemente saudáveis dentroda faixa etária de 18-55 anos (média de 26 anos) foram selecionados paraesse estudo controlado duplo-cego, com placebo. Os indivíduos foram distri-buídos aleatoriamente em oito grupos que recebem uma das seguintes bac-térias gram-positivas, L. Plantarum 299v (n = 7), L. Plantarum Heal 19 (n =7), L. Fermentum 35D (n = 7), L. Paracasei 8700:2 (n = 7), L. gasseri VPG44(n = 7), L. rhamnosus 271 (n = 7), ou a bactéria gram-negativa P. Lundensis(n = 7) ou placebo (n=10). A dose de bactérias foi de 1010 bactérias/dia paraLactobacilli e 109 bactérias/dia para P. Lundensis. O grupo de controle con-sumiu leite em pó desnatado (1 g). Dependendo do grupo, o estudo teve umperíodo de duração de 6 ou 9 semanas, consistindo em período de lavagemde duas semanas, um período de estudo ativo de 2 ou 5 semanas e um pe-ríodo de acompanhamento de duas semanas (Figura 4). Cada indivíduo re-cebeu uma lista de produtos que contêm produtos probióticos que não devi-am ser consumidos durante todo o período do estudo. Foram coletadas a- mostras de sangue periférico dos indivíduos por punção venosa em dois outrês pontos do tempo, dia 0, 14° dia e 35° dia. Foi mantido durante o experi-mento um diário no qual cada indivíduo relatava os efeitos adversos, as con-dições de saúde e a ingestão confirmada do produto de estudo.Citometria de Fluxo
A análise fenotípica de linfócitos no sangue total foi realizada porcitometria de fluxo. Foram usados os seguintes anticorpos monoclonais anti-humanos como marcadores de superfície para diferentes populações de célu-las: CD3 FITC (SK7), CD4 APC (SK3), CD8 PerCP (SK1), CD19 PerCP(SJ25C1), CD56 PE (MY31), CD16 PE (B73.1) e CD5 FITC (L17F12). A se- guir, os anticorpos monoclonais anti-humanos foram usados para a detecçãode diferentes marcadores de ativação e de memória: CD25 FITC (2A3), HLA-DR PE (L243), CD45RO PE (UCHL-1), CD38 PE (HB7), CD27 PE (L128) eCD11b PE (D12). Todos os anticorpos foram adquiridos de Becton-Dickinson(Erembodegum, Bélgica). O sangue total (100 μΙ) foi incubado com anticorpos (10 μΙ/anticorpo) por 30 minutos a 4°C no escuro. A seguir, 2 ml de solução deIise FACS (Becton-Dickinson) foram adicionados e incubados por 15 minutosa 20°C no escuro. As células foram lavadas pela adição de 3 ml de FACS-Flow1 e centrifugadas a 300 χ g por 5 minutos. As células lavadas foram res-suspensas em 200 μΙ de FACSFIow e foram analisadas em um FacsCaIibur(Becton-Dickinson) com o programa de computador CeIIQuest.
Ensaio de Fagocitose
A atividade fagocítica de granulócitos e monócitos foi quantifica-da com PHAGOTEST® (Orpegen Pharma, Heidelberg1 Alemanha) de acordocom as instruções do fabricante, com algumas modificações. Resumidamen-te, 20 χ 106 de E. coli marcada com FITC ou S. Aureus marcado com FITCforam adicionados a sangue total pré-resfriado (100 μΙ). As células sanguí-neas e as bactérias foram incubadas a 37°C para 10 FacsCaIibur com o pro-grama de computador CeIIQuest.
Cálculos
Foram determinadas as alterações individuais em relação aos dife-rentes parâmetros imunológicos por cálculo da proporção entre os valores indi-viduais obtidos no 14° dia e no dia 0, ou os valores no 35° dia e no dia 0. Essasproporções foram usadas para todos os cálculos e estatísticas por grupo.Estatísticas
Todas as análises estatísticas foram realizadas com o uso deStatview. O teste U de Mann-Whitney U foi usado para comparar grupos di-ferentes.
Resultados
Observações Clínicas
Cinqüenta e quatro de um total de cinqüenta e sete voluntárioscompletaram o estudo. Duas pessoas foram excluídas por causa de infecçãoe tratamento antibiótico (uma no grupo de placebo e uma no grupo que re-cebeu P. Lundensis). Uma pessoa foi excluída no 16° dia em função de gra-videz (grupo de placebo). Foram relatados apenas efeitos colaterais gastro-intestinais leves após a ingestão dos produtos de estudo (Figura 1).A ingestão de Lactobacilli Ativa Células T
Houve grandes variações individuais no nível de base (dia 0) emrelação aos marcadores de ativação em células T CD4+ e CD8+. As percen-tagens de células no nível de base que expressam diferentes marcadores dasuperfície celular são mostradas na Figura 2. Não foram observadas diferen-ças significativas entre os diferentes grupos nesse ponto do tempo. Comoforam observadas grandes variações entre indivíduos, optou-se por compa-rar os valores de proporção no 14° dia e 35° dia, comparados com os do dia0, para cada indivíduo. Todos os cálculos e comparações foram feitos sobreesses valores de proporção (14° dia/dia 0 e 35° dia/dia 0). Após 14 dias deingestão do produto de estudo contendo L Plantarum 299v, houve um au-mento de aproximadamente duas vezes na expressão do marcador de ativa-ção CD25 em células T CD8+ (p = 0,01) (Figura 5). Houve também uma forteindicação, embora não significante (p = 0,12), de suprarregulação de HLA-DR em células CD8+ após a ingestão de L. Plantarum 299v. Além disso,também foi observada uma tendência em direção à ativação de células TCD4+ após a ingestão de L. Plantarum 299v. A ingestão de outras espéciesde Lactobacilli incluídas nesse estudo, bem como da bactéria gram-negativaP. Lundensis, não ativou células T CD8+ nem CD4+. No entanto, houve umatendência de que a ingestão de L Paracasei aumentava a expressão deHLA-DR em células T CD4+ (p = 0,18).
A ingestão de Lactobacilli Induz um Fenótipo de Memória de Células T CD4+As médias geométricas da intensidade de fluorescência (GMFI)da expressão de CD45RO em células T CD4+ e CD8+ foram comparadasentre grupos que receberam os diferentes produtos de estudo. Como acima,os cálculos por grupo baseados nos valores individuais de proporção (14°dia/dia 0 e 35° dia/dia 0) foram usados para comparações. Após 35 dias daingestão do produto de estudo contendo L Plantarum 299v, as GMFI deCD45RO em células T CD4+ aumentaram significativamente (p = 0,03).Também houve uma tendência em direção ao aumento da expressão deCD45RO em células T CD8+ após a ingestão de L. Plantarum (Figura 6).Além disso, a ingestão de L. Paracasei parece ter um efeito positivo sobre asuprarregulação de CD45RO em células T CD8+ (p = 0,10) (Figura 6).
Efeito Sobre Diferentes Populações de Células Após Ingestão do Produto deEstudo
Após a ingestão de L. Paracasei, houve um aumento na percen-tagem de linfócitos identificados como células NKT (P = 0,06) (Figura 7).
O aumento e a diminuição relativos comparados com o dia 0 não puderamser detectados em relação a outras populações de células, por exemplo, cé-lulas T CD4+, células T CD8+, células B1 células B-1 (CD19+CD5+), célulasNK1 granulócitos e monócitos.
Atividade Fagocítica
Foram identificados granulócitos e monócitos no diagrama deFSC-SSC. Foi testada a capacidade dessas células para fagocitar bactériasgram-positivas ou gram-negativas marcadas com FITC. Como mostrado naFigura 8, os granulócitos de voluntários que receberam L. Plantarum 299v (p= 0,064), L. Plantarum Heal 19 (p = 0,064), L Fermentum (p = 0,064) ou LParacasei (p = 0,05) foram mais eficientes do que os granulócitos dos volun-tários tratados com placebo na fagocitose da bactéria gram-negativa E. coli.No entanto, não houve diferença entre os grupos na fagocitose da bactériagram-positiva S. Aureus. Não puderam ser detectadas diferenças na ativida-de fagocítica de monócitos (dados não mostrados).
Discussão
A tarefa primária do sistema imunológico é reagir rápida e violen-tamente aos micro-organismos evitando e curando, dessa forma, infecções.
A morte de micro-organismos emprega mecanismos poderosos que tambémdanificam nossos próprios tecidos. Portanto, é necessário que ele não reajaa nossos próprios tecidos, nem às substâncias inócuas presentes no ambi-ente. Portanto, o sistema imunológico desenvolve e mantém tolerância tantoaos componentes do nosso próprio corpo quanto a alimentos e proteínasinaladas. Caso isso não ocorra, podem surgir diversas doenças. Meios parao desenvolvimento de tolerância imunológica específica constituem uma ta-refa essencial do sistema imunológico.
Um papel central de todas as reações imunológicas é desempe-nhado pela célula T auxiliar. Quando uma célula T auxiliar se torna ativadapor seu antígeno específico, ela se torna ativada, se divide, amadurece eproduz uma gama da citocinas que dirigem a ação de outros tipos de célulasno sistema imunológico, por exemplo, células T citotóxicas e células Β. Aativação de células T auxiliares é necessária a fim de produzir a maioria dostipos de reações imunológicas, incluindo a produção de anticorpos. Inversa-mente, caso a ativação de células T auxiliares seja evitada, a maioria dostipos de reações imunológicas é paralisada.
Há vários mecanismos pelos quais a ativação de células T auxi-liares e a manutenção de tolerância são asseguradas. Um mecanismo é aeliminação no timo de células T com capacidade para reconhecer e reagiraos próprios tecidos. No entanto, essa eliminação não é completa e, alémdisso, também precisamos desenvolver tolerância imunológica específicaaos antígenos exógenos. Caso contrário, reagiríamos violentamente a todosos tipos de substâncias inaladas e ingeridas, levando a uma inflamação ma-ciça e ao esgotamento dos recursos imunológicos.
Um tipo de célula que é crucial para a manutenção de tolerânciaé a célula T reguladora. Esse tipo de célula pode ser reconhecido por certosmarcadores, por exemplo, expressão de superfície de CD4 e CD25, existên-cia da CTLA-4 intracelular e transcrição da proteína nuclear Foxp3. As célu-las T reguladoras são capazes de evitar que outras células T se tornem ati-vadas quando encontrarem substâncias danosas e, dessa forma, evitar to-dos os tipos de reações imunológicas indesejadas.
No presente contexto, o símbolo "+", em relação a certo marca-dor, por exemplo, CD4+ e CD25+, significa que o marcador é expresso emuma célula T. Por exemplo, células T CD4+CD25+ são células T que ex-pressam tanto o marcador CD4 quanto o marcador CD25 em sua superfície.No entanto, nada se informa sobre a quantidade do marcador que é expres-sa, apenas que ele está presente. No presente contexto, o símbolo "++", emrelação a um marcador como, por exemplo, CD4++ ou CD25++, significaque há grande quantidade de marcador expressa. As células T reguladorassão aquelas células com muito CD25 na superfície, ou seja, célulasCD4+CD25++. Por outro lado, células T CD4+CD25+ são apenas células Tativadas. Algumas vezes os símbolos específicos "+" e "++" não são usados,por exemplo, apenas CD4CD25, e isso significa que as células são ativadas,como células CD4+CD25+. Dessa forma, CD4CD25 é o mesmo queCD4+CD25+. Quando se discutem células T reguladoras, elas sempre sãoescritas como células CD4+CD25++.
Esse estudo duplo cego controlado por placebo é único, na me-dida em que é o primeiro estudo que compara a influência de vários parâme-tros imunológicos após a ingestão de diferentes Lactobacilli gram-positivosou da bactéria gram-negativa P. Lundensis. Curiosamente, a ingestão de P.Lundensis não influencia nenhum dos parâmetros medidos. Em contraste, aingestão de Lactobacilli afetou diferentes componentes do sistema imunoló-gico tanto específico quanto inato. Um achado inédito desse estudo foi que aingestão de L. Plantarum teve um efeito positivo pronunciado sobre a ativa-ção e indução de células de memória nas populações de células T. Houveuma suprarregulação significativa da cadeia α do receptor IL-2 (CD25) euma forte tendência em direção à suprarregulação de HLA-DR em células Tcitotóxicas. Uma tendência em direção à suprarregulação desses marcado-res de ativação também foi observada em células T auxiliares após ingestãode L. Plantarum. A expressão de marcadores de ativação indica que as célu-las T começaram a proliferar em resposta a estímulos antígeno-específicosou inespecíficos, e que essas células exercem mais facilmente suas funçõesefetoras, comparadas com células T em repouso. Os mecanismos por trásda ativação de células T induzida por L. Plantarum poderiam ser através decélulas de apresentação de antígeno que são ativadas por ligação de recep-tores toll-like a compostos microbianos. A ativação de células de apresenta-ção de antígeno as torna mais eficiente na apresentação de antígeno às cé-lulas T. Além disso, demonstrou-se que tanto as células T auxiliares quantoas células T citotóxicas possuem várias expressões de receptores toll-like, oque provavelmente torna essas células sensíveis à ativação inespecífica porcomponentes e produtos microbianos.
Em analogia ao compartimento de células T auxiliares, a expres-são de CD45RO parece marcar uma população de memória também entrecélulas T citotóxicas. Constatou-se um aumento significativo na expressãodesse marcador de célula de memória em células T auxiliares, e uma ten-dência em direção à suprarregulação em células T citotóxicas após ingestãopor 35 dias de L. Plantarum. Além disso, a ingestão de L. Paracasei tambémapresentou uma tendência em direção à suprarregulação de CD45RO emcélulas T citotóxicas. Em relação às células T naíve, células T CD45RO+podem secretar um amplo espectro de citocinas. Além disso, células TCD45RO+ podem proliferar e produzir IL-2 quando o complexo CD3-TCR forestimulado sob condições subótimas, enquanto as células T naíve necessi-tam de um forte estímulo de CD3-TCR para realizar essas funções. A forma-ção de células T de memória é importante para indução de uma respostaimunológica eficiente após infecção e vacinação.
O sistema imunológico celular inato também foi afetado pela in-gestão de bactérias probióticas. Demonstrou-se que a população de célulasT natural killer (NKT) expandia-se após a ingestão de L paracasei. As célu-las NKT constituem uma subpopulação de linfócitos que coexpressam omarcador de célula NK CD56 e o complexo marcador de célula T CD3-receptor de célula T. Estudos em humanos e camundongos demonstraramque células NKT têm uma participação central na regulação de doenças au-toimunes, por exemplo, esclerose múltipla, diabetes do tipo I e lúpus sistêmi-co. As células NKT também exercem funções efetoras contra células tumo-rais e infectadas por vírus. Dessa forma, células NKT são pleotrópicas emsuas funções. Outros estudos clínicos que avaliam os efeitos imunológicosde bactérias probióticas demonstraram que a ingestão de L rhamnosusHN001 e Bifidobacterium Iactis HN019 aumenta a atividade de morte de cé-lulas tumorais por NK (incluindo NKT) de células K562. Nesse estudo, tam-bém foi confirmado que a atividade fagocítica de células polimorfonuclearesestá aumentada após ingestão de Lactobacilli diferentes. A conseqüênciados efeitos observados sobre os diferentes parâmetros imunológicos no pre-sente estudo é que se pode especular que a ativação coincidente de célulasT citotóxicas e a expansão de células NKT apontam para uma defesa imuno-lógica fortalecida contra infecções virais e/ou tumores. O achado in vitro deque Lactobacilli induzem células mononucleares a secretarem IL-12 e IL-18apoia a teoria de que a ingestão dessas bactérias estimula a atividade medi-ada por células.De acordo com a presente invenção, concluiu-se que a ingestãode L. Plantarum e L. Paracasei tem um efeito profundo sobre o sistema imu-nológico celular específico e inato.
Exemplo 2
O objetivo desse exemplo foi investigar o efeito sobre o sistemaimunológico pela administração da mesma espécie de Lactobacilli por umperíodo de tempo mais longo, comparado com vários Lactobacilli (espéciesdiferentes) administrados em uma seqüência, um depois do outro.
Os voluntários receberam a administração de um pó com bacté-rias Iiofilizadas durante 14 ou 35 dias. Como bactéria gram-positiva, a bacté-ria probiótica Lactobacillus plantarum 299v é usada isoladamente ou emcombinação com L. rhamnosus, L. fermentum, L. Paracasei e L. gasseri.
Como bactéria gram-negativa, é administrada Pseudomonas lundensis.
Foram estudados os seguintes grupos:
1) Lactobacillus plantarum 299v 35 dias.
2) L. Plantarum 299v 7d, L. rhamnosus 271 7 dias, L. Fermen-tum 35D 7 dias, L paracasei 8700:2 7 dias, L gasseri VPG44 7 dias. Total de35 dias (Seqüência).
3) Uma mistura de L Plantarum 299v, L. rhamnosus 271, L.Fermentum 35D, L. Paracasei 8700:2, L. gasseri VPG44. Total de 14 dias.
4) L. rhamnosus 271, 14 dias.
5) L. Fermentum 35D, 14 dias.
6) L Paracasei 8700:2, 14 dias.
7) L. gasseri VPG44, 14 dias.
8) Pseudomonas lundensis, 14 dias.
Grupo de controle 1) Placebo, 35 dias.
Grupo de controle 2) Placebo, 14 dias.
Foram coletadas amostras de sangue no dia 0, e nos 14° e 35°dias. A quantidade de células T auxiliares (CD4+) que expressam quantida-des elevadas de CD25 foi definida em cada grupo por citometria de fluxo,como foi especificado acima no experimento 1.Resultados
No 14° dia, houve uma significância limítrofe da expansão decélulas T CD4+CD25++ em indivíduos que consumem a seqüência de cincocepas diferentes de Lactobacilli.
Discussão
Demonstrou-se em outros estudos que as células T auxiliares(CD4+) que expressam uma densidade elevada da molécula de CD25(CD4+CD25++) são importantes a fim de proteger contra doenças autoimu-nes, alergias e doenças inflamatórias do intestino. O achado de que essascélulas estão expandidas após a ingestão de uma seqüência de diferentesLactobacilli indica que a ingestão dessas bactérias pode ser benéfica para oindivíduo em relação ao risco de desenvolvimento das doenças menciona-das anteriormente.Exemplo 3
Animais
Camundongos C57BL/6 de oito semanas de idade foramadquiridos de Taconic Europe (Dinamarca). Os animais foram mantidos ealimentados nas instalações convencionais de animais do departamento debiologia celular e de organismos, na Universidade de Lund, e todos osexperimentos foram realizados de acordo com o Comitê de Ética em Malmõ-Lund1 Suécia. Os camundongos foram alimentados com dieta normal e águaad libitum, e permitiu-se um período de aclimatização ao novo ambiente porpelo menos uma semana antes do início dos experimentos. Oscamundongos usados no experimentos de EAE foram pesados, examinadosquanto aos sinais clínicos de EAE, e pontuados de acordo com a esacaladescrita na avaliação clínica todos os dia por todo o experimento. Oscamundongos que recebiam uma pontuação de 6 eram suplementados umavez ao dia com 0,5 ml de solução de soro fisiológico por via subcutânea paraevitar desidratação. A ração era colocada no chão da gaiola sempre quequalquer camundongo apresentava sinais de doença clínica. Oscamundongos que obtiveram uma pontuação de 7 foram sacrificados porrazões éticas. Os experimentos eram finalizados 24 dias após a imunização.Antígenos
Foi usado um peptídeo encefalogênico da glicoproteína demielina de oligodendrócito (MOG) para induzir EAE (encefalomielitieautoimune experimental) em camundongos. O peptídeo sintético,aminoácidos 35-55 (MEVGWYRSPFSRWHLYRNGK), foi adquirido deSchafer-N, Copenhagen, Dinamarca. O peptídeo usado era 99% puro.
Imunização
A EAE foi induzida, como descrito anteriormente, em fêmas decamundongos C57BL/6. Resumidamente, cada animal foi imunizado sobanestesia com isoflurano por uma injeção subcutânea no flanco com 100 μΙde uma emulsão 1:1 de 200 pg de MOG35-S5 em PBS e CFA contendoMycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco, Detroit, Ml). Imediatamentedepois e 48 horas após imunização, os camundongos recebiam uma injeçãointraperitoneal de 0,1 ml de 4 pg/ml de toxina de pertussis (Sigma).
Avaliação Clínica
Os sinais clínicos de EAE foram pontuados de acordo com umaescala de 0 a 8 da seguinte forma: 0, sem sinais de doença clínica; 1,fraqueza na cauda; 2, cauda paralisada; 3, paresia das patas traseiras edistúrbios do modo de andar; 4, paralisia de uma das patas traseiras; 5,paralisia total das patas traseiras com paresia da parte posterior do corpo, ocamundongo é ativo e se move pelo ambiente usando suas patas dianteiras;6, paralisia total das patas traseiras com paresia da parte posterior do corpoe mobilidade acentuadamente comprometida; 7, quadriplegia, semmobilidade, estado moribundo; 8, morto.
Cepas bacterianas e tratamento
L. Plantarum HEAL 9e L. Paracasei 8700:2 foram fornecidos porProbi AB (ldeon, Lund, Suécia). As bactérias foram coletadas porcentrifugação, lavadas uma vez e ressuspensas em água corrente, até umaconcentração final de 2 χ 109 unidades de formação de colônias (CFU)/100ml em uma garrafa. Uma terceira garrafa foi preparada com uma mistura deL. Plantarum HEAL 9e L. Paracasei 8700:2, até uma concentração final de 2x 109 CFU/100 ml. As garrafas foram lavadas, e foram preparados veículosque incluíam as bactérias a cada dia. Os experimentos foram realizados comdez camundongos em cada grupo de tratamento. Cada animal bebeu 4-5 mlde veículo/dia, incluindo aproximadamente 108 CFU. Os animais de controlereceberam água corrente.
Resultados
O tratamento probiótico suprimiu o desenvolvimento de EAE induzida porMOG
A fim de estudar o efeito anti-inflamatório de probióticos, trêsgrupos de animais foram pré-tratados com probióticos, L. Plantarum HEAL 9,L. Paracasei 8700:2 e uma mistura de L. Plantarum HEAL 9 e L Paracasei8700:2, em doze dias, e imunizados para EAE com uma emulsão de CFA eMOG35-55 no dia 0. Os animais foram então tratados por todo o experimento(até o 24° dia). Um quarto grupo de animais recebeu apenas água correntecomo controle. Como mostrado na Figura 10, o tratamento com L. PlantarumHEAL 9 ou L. Paracasei 8700:2 evitou com sucesso o desenvolvimento deEAE crônica por 10 dias, comparado com os camundongos de controle queapresentaram uma EAE grave, com início no 11° dia. Os camundongostratados com uma mistura de bactérias também apresentaram um retardo nosurgimento de cerca de cinco dias, comparados com o controle. Essescamundongos desenvolveram uma EAE mais grave, comparados com oscamundongos tratados com bactérias únicas. No 24° dia, a incidência deanimais doentes estava significativamente reduzida, 14% nos animaistratados com bactérias únicas, comparados com os 91% em camundongosde controle. A incidência para os animais que receberam uma mistura debactérias foi de 60%. Quando foram analisadas as alterações no peso dosanimais durante o experimento, constatou-se surpreendentemente que otratamento com uma mistura de duas bactérias inibiu uma diminuição depeso que normalmente ocorre antes do surgimento da doença (Figura 9). Osanimais tratados com bactérias únicas tiveram o peso diminuído como oscamundongos de controle, apesar de não apresentarem sinais de paralisia.
Tratamento Profilático de EAE
Os animais foram tratados com probióticos 12 dias antes da i-munização e por todo o experimento.
Cem ml de água de beber incluindo bactérias diferentes erampreparados a cada dia.
Aproximadamente 1.108 bactérias/camundongo/dia. Os camun-dongos de controle receberam apenas água.
Npiantarum= 7, Nparacasei= 7, Nmíx= 10, Ncontrol = 11
Os resultados são mostrados na Figura 9.Tratamento Terapêutico de Inflamação Crônica em EAE
Tratamento oral com Probióticos um dia após o surgimento deEAE. Os animais foram tratados individualmente por uma agulha de alimen-tação.
Aproximadamente 1.108 bactérias/camundongo/dia. Os camun-dongos de controle receberam 9 mg/ml de NaCI estéril.
Npiantarum= 6, Nparacasei= 6. Nmíx = 8, Ncontrol = 8
Os resultados são mostrados na Figura 10.
Experimento 4
Supressão de Inflamação Crônica no Sistema Nervoso Central porAdministração Oral de Lactobacillus paracaseie Lactobacillus plantar
O objetivo desse estudo foi examinar se os probióticos poderiamafetar a inflamação crônica mediada por células T no sistema nervosocentral. Criamos a hipótese de que o tratamento oral de probióticos exerceum efeito anti-inflamatório por modulação imune de efetores patogênicos decélulas T.
Material e métodos
Modelo animal
A Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE), um modelo dedoença animal de esclerose múltipla, é induzido por imunização compeptídeo 35-55 de glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG) emAdjuvante de Freund Completo. Toxina pertussis também é injetadaassociada à imunização para aumentar ainda mais as respostasinflamatórias. Os animais começaram a apresentar os sintomas clínicosapós duas semanas. Os sinais de EAE são pontuados em oito categorias:0-, sem sinais de doença clínica; 1- fraqueza na cauda; 2- cauda paralisada;3- paresia e distúrbios do modo de andar; 4- paralisia de uma pata; 5-paralisia de duas patas; 6- duas patas paralisadas e paresia de uma terceirapata, o camundongo ainda é capaz de se movcer para frente; 7-quadriplegia, sem mobilidade e estado moribundo; 8- morto.
Cepas Bacterianas Probióticas
Lactobacillus paracasei 8700:2, Lactobacillus paracasei defacti,Lactobacillus plantarum Heal 9, Lactobacillus plantarum Heal 19,Lactobacillus plantarum 299v e Lactobacillus delbrueekii foram fornecidospor Probi AB.
Protocolos de Tratamento
Tratamento profilático: cem ml de água de beber incluindo 1,109- 1,1010 bactérias diferentes eram preparados a cada dia. Cada camundongobebeu aproximadamente 5 ml »1,108- 1,109 bactérias/camundongo/dia. Osanimais foram tratados em 7-14 dias, antes da imunização e por todo oexperimento. Os camundongos de controle receberam apenas água. Emnosso experimento recente, os animais foram tratados com agulhas dealimentação 10 dias após a imunização, a cada segundo dia por todo oexperimento.
Tratamento terapêutico: dez dias após o surgimento, cadaanimal recebeu 1,109 bactérias por tratamento individual com agulhas dealimentação, a cada segundo dia por todo o experimento. Os camundongosde controle receberam soro fisiológico.
Metatraxato (MTX): MTX foi administrado por via intraperitonealem uma concentração final de 2,5 mg/kg, a cada segundo dia por todo oexperimento.Análise
Foram isolados diferentes órgãos e materiais dos animais parainvestigações posteriores: cérebro, medula vertebral, baço, Iinfonodos(mesentéricos, inguinais), intestino (regiões incluindo as placas de Peyer) esangue. Alguns órgãos foram tratados com isopentano para análise imuno-histoquímica. Algumas células do baço e de Iinfonodos foram analisadas porcitometria de fluxo (FACS) ou colocadas em culturas e estimuladas compeptídeo de MOG, anti-CD3 e LPS para investigações de citocinaposteriores por ELISA.
Resultados
Tratamento profilático
Os animais foram tratados com 1,108 Lactobacillus paracasei8700:2 ou Lactobacillus plantarum Heal 19 por sete dias, antes daimunização. A EAE foi suprimida significativamente por um curto período detempo.
Os animais foram tratados com 1,109 Lactobacillus paracasei8700:2 ou Lactobacillus plantarum Heal 9 por doze dias, antes daimunização. O surgimento de EAE foi retardado por mais de uma semana, eresultou em um desenvolvimento mais leve de EAE (vejas as figuras 11 e 12).
A análise imuno-histoquímica da medula vertebral mostrouquantidades significativamente menores das células T inflamatórias nosanimais tratados com probiótico. O ensaio de proliferação de esplenócitos invitro revelou proliferação específica para MOG igual de células T, mas,curiosamente, eles produziram quantidades significativamente menores decitocinas inflamatórias TNF-α e IFN-γ, e quantidades maiores de IL-4 e IL-10.
Os animais tratados com Paracasei mostraram níveis maiselevados anticorpos IgG e IgA totais no plasma. A análise FACS dosIinfonodos mesentéricos mostrou um aumento de células T CD4+CD25+. Aanálise imuno-histoquímica do baço mostrou um aumento de células Foxp3+ (Treg).
Varredura 1
Cinco Lactobacilli diferentes (Lactobacillus paracasei 8700:2,Lactobacillus paracasei defacti, Lactobacillus plantarum Heal 9, Lactobacillusplantarum Heal 19 e Lactobacillus plantarum 299v) foram avaliadas quanto àsupressão de EAE por um protocolo de tratamento profilático. A melhorsupressão foi obtida com a utilização de Lactobacillus paracasei 8700:2,Lactobacillus plantarum Heal 9, e Lactobacillus plantarum 299v.Transferência 1
Os animais foram tratados com Lactobacillus paracasei 8700:2,Lactobacillus plantarum Heal 9, ou uma mistura de ambas as cepas, porduas semanas. As células de Iinfonodos mesentéricos foram então coletadase transferidas aos receptores (por via endovenosa) que foram imunizadoscontra EAE um dia após a transferência. A EAE foi significativamentesuprimida por células de animais tratados com uma mistura de duas cepas.O efeito de supressão foi rompido pela remoção de células T CD4+. (veja aFigura 13).
Esse experimento foi repetido novamente, incluindo um grupo deanimais tratados com uma mistura de três cepas, incluindo Lactobacillusparacasei 8700:2, Lactobacillus plantarum Heal 9 e Lactobacillus plantarumHeal 19.
Os animais foram imunizados contra EAE. Dez dias após osurgimento de EAE, eles foram tratados individualmente com uma misturade Lactobacillus paracasei 8700:2, Lactobacillus plantarum Heal 9 eLactobacillus plantarum Heal 19. A doença EAE estabelecida foisignificativamente suprimida, em comparação com os controles quereceberam soro fisiológico. Esse experimento foi repetido com sucesso comresultados similares. O tratamento com bactérias inespecíficas LactobacillusDelbrueekii ou Metotraxato (como fármaco anti-inflamatório geral) foi ineficazna exibição do efeito terapêutico único desse protocolo.
Os mecanismos anti-inflamatórios da ação desses tratamentosainda são incertos, mas nossos resultados mostram claramente um papelfundamental da população de células T reguladoras CD4+CD25+ Foxp3+.INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO
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Form PCT/RO/134 (Julho 1998, reimpresso em janeiro de 2004)INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICRO-ORGANISMO DEPOSITADO(PCT Rule 13bis)
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Form PCT/RO/134 (Julho 1998, reimpresso em janeiro de 2004)INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO(PCT Rule 13bis)
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(PCT Rule 13bis)
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(PCT Rule 13bis)
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Claims (16)

1. Uso de pelo menos uma cepa de bactérias probióticas de Lac-tobacillus selecionadas a partir do grupo constituído de Lactobacillus planta-rum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillusplantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM-15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus para-easei 8700:2, DSM 13434, e Lactobacillus paraeasei 02A, DSM 13432, paraa fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou a pre-venção de uma doença autoimune.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida do-ença autoimune é selecionada do grupo que consiste em uma autoimunida-de específica de um órgão, por exemplo, esclerose múltipla (MS), alergia,psoríase, artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetesmelito do tipo I, doenças inflamatórias do intestino e lúpus sistêmico.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que pelo me-nos duas cepas são usadas para o tratamento e/ou prevenção da referidadoença autoimune.
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, em que pelo menos du-as cepas são intencionadas para serem administrada seqüencial ou simulta-neamente.
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,em que a referida composição farmacêutica é uma formulação líquida ouuma formulação sólida.
6. Uso de acordo com a reivindicação 5, em que a referida for-mulação sólida é selecionada a partir do grupo que consiste em comprimi-dos, comprimidos para chupar, balas, comprimidos de mascar, gomas demascar, cápsulas, sachês, pós, grânulos, partículas revestidas e comprimi-dos revestidos, comprimidos e cápsulas com revestimento entérico e tiras epelículas que derretem.
7. Uso de acordo com a reivindicação 5, em que a referida for-mulação líquida é selecionada do grupo que consiste em soluções, suspen-sões, emulsões e xaropes orais.
8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,em que a referida composição compreende um material de veículo.
9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,em que a referida composição farmacêutica é um alimento medicinal, umalimento funcional, um suplemento dietético, um produto nutricional ou umapreparação alimentícia.
10. Uso de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que o referidomaterial de veículo é selecionado independentemente do grupo que consisteem mingau de farinha de aveia, alimentos fermentados por fermentação láti-ca, amido resistente, fibras dietéticas, carboidratos, proteínas e proteínasglicosiladas.
11. Uso de acordo com a reivindicação 9, em que a referida pre-paração alimentícia é escolhida do grupo que consiste em bebidas, iogurtes,sucos, sorvetes, pães, biscoitos, cereais, barras de cereais e pastas.
12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11,em que cada uma das referidas cepas está presente na composição em umaquantidade de cerca de 1 χ 10^6 a cerca de 1 χ 10^14 CFU, de preferência decerca de 1 χ 10^8 a cerca de 1 χ 10^12 e, mais preferivelmente, de cerca de 1 χ- 10^9 a cerca de 1 χ 10^11.
13. Método para o tratamento de uma doença autoimune, emque pelo menos uma cepa de bactérias probióticas de Lactobacillus selecio-nadas a partir do grupo constituído de Lactobacillus plantarum 299, DSM- 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarumHEAL 9, DSM 15312, Lactobacillusplantarum HEAL 19, DSM 15313, Laeto-baeillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus paraeasei 8700:2,DSM 13434, e Lactobacillus paraeasei 02A, DSM 13432 é administrado aum indivíduo.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a referidadoença autoimune é uma autoimunidade específica de um órgão, por exem-plo, esclerose múltipla (MS), alergia, psoríase, artrite reumatoide, doença deCrohn, colite ulcerativa, diabetes melito do tipo I, doenças inflamatórias dointestino ou lúpus sistêmico.
15. Método de acordo com as reivindicações 13 ou 14, em quepelo menos duas cepas de bactérias probióticas são administradas a umindivíduo.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que as referi-das cepas são administradas em uma seqüência ou simultaneamente.
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