BRPI0614475A2 - composições e processos para a produção de imunoglobulinas - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES E PROCESSOS PARA A PRODUçãO DE IMUNOGLOBULINAS. A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos para o isolamento de cDNAs de anticorpos humanos partindo de células ou linhagens de células, tais como hibridomas. A invenção fornece ainda cDNAs que codificam pelo menos uma CDR fornecida de uma cadeia pesada ou de uma cadeia leve de um anticorpo monoclonal humano que se liga ao antígeno protetor de B. anthracis; e cDNAs que codificam pelo menos uma CDR fornecida de uma cadeia pesada ou de uma cadeia leve de um anticorpo monoclonal humano que se liga ao fator letal de B. anthracis. A invenção fornece ainda vetores de expressão que contêm um ou mais cDNAs isolados de acordo com os processos da invenção, células hospedeiras que expressam um ou mais cDNAs da invenção e plantas e animais transgênicos que expressam um ou mais cDNAs da invenção. Em certas modalidades da invenção, o sistema de expressão é um sistema de expressão baseado em plantas. A invenção fornece ainda composições de anticorpos que compreendem um ou mais anticorpos produzidos através de expressão de um cDNA isolado de acordo com os processos da invenção em um sistema de expressão adequado. São adicionalmente abrangidos na invenção kits que contêm uma ou mais das composições fornecidas, assim como processos de produção e uso das composições fornecidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES E PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS".

PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS

Este pedido de patente reivindica prioridade a e o benefício dopedido de Patente U.S. Provisório N2 60/705.653, depositado em 3 de agos-to de 2005, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência em sua totali-dade.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

Antraz é uma doença infecciosa bem-caracterizada causada pe-la bactéria esporulante Bacillus anthracis. A doença está historicamente as-sociada com infecções de animais, especialmente herbívoros tais como va-ca, ovelha e cabras e não é tipicamente observada em seres humanos. En-tretanto, os seres humanos que trabalham com produtos animais em que ainfecção ocorre estão em risco de contrair antraz. Algumas regiões do cen-troeste e da África sub Saara são hiperendêmicas em relação ao antraz,embora o organismo possa freqüentemente ser encontrado em muitas áreasdo mundo. A doença se manifesta de três maneiras diferentes: antraz cutâ-neo, gastrointestinal e por inalação que resultam da exposição de uma feridaaberta aos esporos, da ingestão dos esporos em produtos de carne conta-minados ou da inalação dos esporos, respectivamente. Embora o antraz cu-tâneo tenha uma taxa de fatalidade de até 25 por cento, o antraz gastrointes-tinal ou por inalação resulta em quase 100 por cento de fatalidades. O diag-nóstico definitivo da infecção por antraz freqüentemente ocorre muito tardepara fornecer cuidado para ressuscitação.

O fator de virulência principal de B. anthracis é uma toxina comvários componentes secretada pelo organismo. A toxina consiste em trêsproteínas denominadas de antígeno protetor (PA), fator letal (LF) e fator deedema (EF), que são codificadas pelos genes pag, Iefe cya, respectivamen-te. PA é uma proteína de 735 aminoácidos de peso molecular 83 kDa. Seliga ao receptor da toxina do antraz (ATR) sobre uma superfície celular demamífero e sofre subseqüentemente uma clivagem mediada por furina paraproduzir um produto ligado ao receptor de 63 kDa. O fragmento de PA de 63kDa forma um complexo heptamérico sobre a superfície celular que é capazde interagir com LF ou EF e este complexo é subseqüentemente internaliza-do. LF é uma metaloprotease de zinco que diva várias isoformas de MAPquinase quinase, interrompendo assim os eventos de transdução de sinaldentro de uma célula, levando eventualmente à morte celular. LF é conside-rado responsável pelo resultado letal da infecção por antraz. EF é uma ade-nilato ciclase dependente da calmodulina que causa a desregulação da fisio-logia celular, levando às manifestações clínicas que incluem edema. PA e LFjuntas são referidas como a toxina letal.

O CDC lista o antraz como um agente de doença dè categoria Ae estima que o custo de um ataque por antraz exceda $26 bilhões por100.000 pessoas expostas. Atualmente, a única vacina licenciada para usohumano nos EUA, Biothrax (anteriormente vacina adsorvida para Antraz ouAVA), é uma vacina de subunidade tratada com formalina adsorvida em Μ-dróxido de alumínio baseada no antígeno protetor, PA. É fornecida atravésde injeção subcutânea e induz imunidade contra a toxina letal secretada pelobacilo. A vacina é produzida partindo da fração de sobrenadante de culturafiltrada da cepa V770-NP1-R de B. anthracis. O processo de produção écomplexo, há uma variação de batelada à batelada nos lotes de preparaçãoda vacina e a composição precisa da vacina é indeterminada. Além disso,uma vez que o alúmen é incluído como um adjuvante na vacina atual, umacorrente gelada tem que ser mantida durante o armazenamento e a distribui-ção da vacina, adicionando inconveniente e custo. A vacina é administradaatravés de injeção, que pode complicar a logística de tratamentos em mas-sa. Assim, seria desejável ter reagentes adicionais capazes de agir contra opotencial infeccioso de um surto ou ataque pelo antraz.

Anticorpos monoclonais têm importância crescente para umavariedade de finalidades terapêuticas assim como de diagnóstico, industriaise de pesquisa. Por exemplo, vários estudos com animais demonstraram queos anticorpos específicos para a toxina do antraz provenientes de animaisvacinados podem proteger passivamente os receptores dos efeitos letais dainfecção. Entretanto, os soros derivados de animais possuem inconvenientesóbvios que previnem o uso amplamente espalhado como agentes terapêuti-cos. Os anticorpos monoclonais produzidos por hibridomas têm que ser cole-tados do meio em que os hibridomas são cultivados ou coletados de fluidode ascitos de camundongos. Infelizmente, os sistemas de produção são dis-pendiosos, trabalhosos e possuem outras desvantagens significativas. Porestas e outras razões seria desejável ser capaz de utilizar sistemas de pro-dução alternativos para anticorpos monoclonais tais como sistemas de pro-dução que envolvem a tecnologia do DNA recombinante.

Preocupações em relação ao acesso suficiente e o fornecimentolimitado de reagentes, ao custo do produto e à pureza dos reagentes ressal-tam a necessidade urgente de produtos e reagentes melhorados. Assim,existe uma necessidade e uma urgência evidente de abordagens melhora-das para agir contra a infecção por antraz, assim como de métodos melho-rados de detecção para diagnóstico e ferramentas de pesquisa úteis na veri-ficação do mecanismo de infecção do antraz. Além disso, é desejável forne-cer métodos de produção que permitam a produção em massa de produtosúteis em tais aplicações a custos razoáveis.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece seqüências de ácidos nucléicos ede proteínas úteis na preparação de anticorpos em sistemas recombinantes.Em particular, são fornecidas seqüências de iniciadores de oligonucleotídeoúteis para a preparação de seqüências de ácidos nucléicos que codificamuma seqüência de anticorpo de cadeia leve e uma seqüência de anticorpode cadeia pesada. Adicionalmente, é fornecida uma seqüência de ácido nu-cléico de anticorpo que codifica um polipeptídeo que consiste em pelo me-nos um polipeptídeo de cadeia pesada ou um fragmento funcional do mes-mo; e uma seqüência de ácido nucléico de anticorpo que codifica pelo me-nos um polipeptídeo de cadeia leve ou um fragmento funcional do mesmo.São também fornecidos polipeptídeos de cadeia pesada e leve e fragmen-to(s) funcional(is) dos mesmos. A invenção fornece adicionalmente seqüên-cias de anticorpo de anticorpos PA-1 e LF-1 cada uma compreendendo in-dependentemente pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada CDR epelo menos um polipeptídeo de cadeia leve CDR. São também fornecidasseqüências de anticorpo de anticorpos PA-1 e LF-1 cada uma compreen-dendo independentemente uma ou mais CDRs que possuem pelo menosuma substituição de aminoácido, em que a atividade de ligação de PA-1 ouLF-1 é aumentada. São adicionalmente fornecidos os ácidos nucléicos quecodificam as cadeias pesadas e leves de PA-1 e LF-1 assim como os ácidosnucléicos que codificam os anticorpos de PA-1 e LF-1. Os fragmentos fun-cionais de tais ácidos nucléicos codificadores são similarmente fornecidos.Os métodos de produção e de uso de composições fornecidas também sãos' 10 fornecidos aqui.

Breve Descrição da figura

A figura 1 é uma fotografia de um gel que mostra a análise deSDS-PAGE de anticorpos produzidos em plantas PA e PANG (não glicosila-dos). Os padrões de IgG são IgG humana total purificada. As posições dascadeias pesada (H) e leve (L) são indicadas pelas setas.

A figura 2 é um gráfico que representa os resultados de estudosde meia-vida em ratos de anticorpo PA (PA) ou PANG (PANG), LF (LF) pro-duzido em plantas.

Definições

Os termos "anticorpo", "cadeia de anticorpo", "região ou domíniovariável", "região ou domínio constante", "cadeia gama", "cadeia kappa","cadeia lâmbada", "cadeia pesada", "cadeia leve" e outros termos relevantespara os anticorpos são utilizados aqui de acordo com seus significados acei-tos na técnica como descrito, por exemplo, em Goldby, R.A., Kuby Immuno-logy, supra e/ou Harlow, supra.

O termo "cDNA" se refere a uma molécula de DNA de filamentosimples que é complementar a um mRNA ou a uma molécula de DNA defilamento duplo que compreende um filamento que é complementar a ummRNA. O outro filamento de cDNA de filamento duplo terá a mesma se-qüência que o mRNA e codificará assim o mesmo polipeptídeo que o mRNA.

Um "vetor de expressão" é um vetor que contém seqüências re-guladoras (por exemplo, promotores e/ou outros sinais de expressão e, op-cionalmente, seqüências a 3', tais como seqüências reguladoras a 3' ou si-nais de término suficientes para controlar a transcrição de um segmento deácido nucléico ao qual estão ligadas de forma operacional. O vetor de ex-pressão pode ainda compreender seqüências ligadas de forma operacionalnecessárias para a tradução apropriada do segmento de ácido nucléico. Osegmento de ácido nucléico pode, mas não precisa ser uma seqüência codi-ficadora de proteína. O segmento de ácido nucléico pode ser quimérico, sig-nificando que inclui mais de uma seqüência de origem distinta que são liga-das juntas através de técnicas do DNA recombinante, resultando em umaseqüência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente. O termo "vetor deexpressão" pode se referir a um vetor antes ou após a inserção do segmentode ácido nucléico ligado de forma operacional. Certos vetores de expressãopermitem o "vai-e-vem" de DNA entre hospedeiros tais como células de bac-téria-levedura ou bactéria-animal ou células dè bactéria-fungo ou células debactéria-invertebrado ou células de bactéria-vegetais. Um vetor de expres-são típico conterá uma origem de replicação para a replicação autônoma emcélulas hospedeiras, um ou mais marcadores selecionáveis, um ou mais sí-tios de enzimas de restrição (tipicamente vários), freqüentemente um poten-cial para alto número de cópias e um ou mais promotores.

"Identidade" se refere à extensão até a qual a seqüência de doisou mais ácidos nucléicos é a mesma. A porcentagem de identidade entre oprimeiro e o segundo ácidos nucléicos ao longo de uma janela de avaliaçãopode ser computada através do alinhamento dos ácidos nucléicos, determi-nando o número de nucleotídeos dentro da janela de avaliação que ficamopostos a um nucleotídeo idêntico permitindo a introdução de espaços paramaximizar a identidade, da divisão pelo número total de nucleotídeos na ja-nela e da multiplicação por 100. Quando o número de nucleotídeos idênticosnecessários para atingir uma % de identidade particular é computado, asfrações devem ser arredondadas para o número inteiro mais próximo. Quan-do duas ou mais seqüências são comparadas, qualquer uma delas pode serconsiderada a seqüência de referência.

A porcentagem de identidade pode ser calculada utilizando umavariedade de programas de computador conhecidos na técnica. Por exem-plo, programas de computador tais como BLASTN, BLASTP, GappedBLAST etc., geram alinhamentos e fornecem % de identidade entre uma se-qüência de interesse e seqüências em qualquer uma de uma variedade debancos de dados públicos. O algoritmo de Karlin e Altschul (Karlin e Altschul,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 22264-2268, 1990) modificado como em Kar-lin e Altschul, Proc. NatL Acad. Sei. USA 90: 5873-5877, 1993 é incorporadonos programas NBLAST e XBLAST de Altschul e outros (Altschul e outros, J.MoL Biol. 215: 403-410, 1990). Para a obtenção de alinhamentos espaçadoscom a finalidade de comparação, o Gapped BLAST é utilizado como descritoem Altschul e outros (Altschul e outros Nucieic Acids Res. 25: 3389-3402,1997). Quando os programas BLAST e Gapped BLAST são utilizados, sãoutilizados os parâmetros pré-estabelecidos dos respectivos programas. Ver osite da Web que possui URL www.ncbi.nlm.nih.gov. Pode ser utilizada umamatriz PAM250 ou BLOSUM62.

O termo "isolado" significa 1) separado de pelo menos parte doscomponentes com os quais está geralmente associado na natureza; 2) pre-parado ou purificado através de um processo que envolve a mão humana;e/ou 3) que não ocorre na natureza. Um ácido nucléico que é cortado ouamplificado de um ácido nucléico maior (por exemplo, um cromossomo, e-pissomo, genoma viral ou bacteriano) no qual é encontrado naturalmente éconsiderado isolado. Em algumas modalidades o ácido nucléico cortado ouamplificado não está mais ligado às regiões não codificadoras (mas podeestar ligado as suas regiões reguladoras nativas ou partes das mesmas) oua outros genes, que ficam localizados a montante ou a jusante do ácido nu-cléico isolado como é encontrado no ácido nucléico maior. Os ácidos nucléi-cos isolados incluem ácidos nucléicos inseridos em plasmídeos, cosmídeos,cromossomos artificiais, vetores virais e similares, isto é, um ácido nucléicoque faz parte de um constructo de ácido nucléico recombinante é considera-do isolado. Um ácido nucléico isolado pode ser um produto de amplificação(por exemplo, um produto da PCR), um mRNA isolado, um cDNA, um frag-mento de restrição etc. Um polipeptídeo isolado pode ser um polipeptídeoexpresso em um sistema de expressão heterólogo, isto é, expresso por umacélula que não expressa o polipeptídeo na natureza. Um anticorpo isoladopode ser um anticorpo que está presente em uma composição sem ser san-gue ou soro. Um anticorpo que é expresso partindo de um ácido nucléicoisolado é considerado como sendo um anticorpo isolado. Qualquer um dosácidos nucléicos, cadeias de anticorpo ou anticorpos da invenção podem serfornecidos na forma isolada.

Os termos "ácido nucléico", "polinucleotídeo" e "oligonucleotí-deo" são utilizados aqui de forma intercambiável para se referir a um políme-ro de pelo menos três nucleotídeos. Um nucleosídeo compreende uma basenitrogenada ligada a uma molécula de açúcar. Em um polinucleotídeo, gru-pos fosfato se ligam covalentemente adjacentes aos nucleosídeos para for-mar um polímero. O polímero pode incluir nucleosídeos naturais (por exem-plo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, deso-xitimidina, desoxiguanosina e desoxicitidina), análogos de nucleosídeos, ba-ses quimicamente modificadas, bases biologicamente modificadas (por e-xemplo, bases metiladas), bases intercaladas, açúcares modificados (porexemplo, purinas ou pirimidinas modificadas). Ver Kornberg e Baker, DNAReplication, 2- Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), Scheit, NucIeotideAna-Iogs (John Wiley, Nova York, 1980) e Publicação de Patente U.S. N220040092470 e referências contidas na mesma para discussão adicional devários nucleotídeos, nucleosídeos e estruturas básicas que podem ser utili-zados nos polinucleotídeos descritos aqui e métodos para a produção dosmesmos. Análogos tais como ácidos nucléicos peptídicos, ácidos nucléicosbloqueados etc., estão também dentro do âmbito da invenção. Um polinu-cleotídeo pode ter qualquer tamanho ou seqüência e pode ter filamento sim-ples ou duplo. Um oligonucleotídeo é tipicamente menor que 100 nucleotí-deos de comprimento. Qualquer ácido nucléico descrito aqui pode estar naforma de filamento simples ou duplo. Quando a invenção fornece uma se-qüência de ácido nucléico, a seqüência complementar também é fornecida.

Além disso, quando uma seqüência é fornecida na forma de DNA, a seqüên-cia de RNA correspondente (isto é, a seqüência em que T é substituído porU, também é fornecida).

O termo "constructo de ácido nucléico" é utilizado para se referira um ácido nucléico que foi modificado pela mão humana ou que é derivadode tal ácido nucléico. Por exemplo, um constructo de ácido nucléico podeconter uma mutação, uma deleção ou uma substituição em relação a umamolécula de ácido nucléico que ocorre naturalmente. Um constructo de ácidonucléico pode compreender dois ou mais segmentos de ácidos nucléicosque são derivados de ou originados de fontes diferentes tais como organis-mos diferentes, por exemplo, um polinucleotídeo recombinante. A seqüênciade uma ou mais partes de um constructo de ácido nucléico pode ser inteira-mente inventada pelo ser humano.

O termo "seqüência de ácido nucléico" como utilizado aqui podese referir ao próprio material de ácido nucléico material e não está restrito àinformação de seqüência (isto é, à sucessão de letras escolhidas entre ascinco letras de bases A, G1 C, T ou U) que caracteriza bioquimicamente umácido nucléico específico, por exemplo, uma molécula de DNA ou de RNA.

"Ligado de forma operacional" ou "associado de forma operacio-nal" se refere a uma relação funcional entre dois ácidos nucléicos, em que aexpressão, a atividade, a localização etc., de uma das seqüências é contro-lada, direcionada, regulada, modulada etc., pelo outro ácido nucléico. É ditoque os dois ácidos nucléicos estão ligados de forma operacional ou associa-dos de forma operacional. "Ligado de forma operacional" ou "associado deforma operacional" se refere ainda a uma relação entre dois polipeptídeosem que a expressão de um dos polipeptídeos é controlada, direcionada, re-guiada, modulada etc., pelo outro polipeptídeo. É dito que os dois ácidosestão ligados de forma operacional ou associados de forma operacional. Porexemplo, a transcrição de um ácido nucléico é direcionada por um promotorligado de forma operacional; o processamento pós-transcrição de um ácidonucléico é direcionado por uma seqüência de processamento ligada de for-ma operacional; a tradução de um ácido nucléico é direcionada por uma se-qüência reguladora da tradução ligada de forma operacional tal como umaseqüência de início da tradução; o transporte, a estabilidade ou a localizaçãode um ácido nucléico ou de um polipeptídeo é direcionada por uma seqüên-cia de transporte ou de localização ligada de forma operacional tal comouma seqüência sinal de secreção; e o processamento pós-tradução de umpolipeptídeo é direcionado por uma seqüência de processamento ligada deforma operacional. Preferencialmente uma primeira seqüência de ácido nu-cléico que está ligada de forma operacional com uma segunda seqüência deácido nucléico ou um primeiro polipeptídeo que está ligado de forma opera-cional a um segundo polipeptídeo, está ligado covalentemente, direta ou in-diretamente, a tal seqüência, embora qualquer associação tridimensionaleficiente seja aceitável. Um versado na técnica considerará que vários áci-dos nucléicos ou vários polipeptídeos, podem estar ligados ou associados deforma operacional.

O termo "iniciador" se refere a um oligonucleotídeo de filamentosimples que atua como um ponto de início da síntese de DNA direcionadapor um molde sob condições apropriadas (por exemplo, na presença de qua-tro trifosfatos de nucleosídeo diferentes e um agente de polimerização, talcomo DNA polimerase, RNA polimerase ou transcriptase reversa) em umasolução tampão apropriada contendo quaisquer co-fatores necessários e auma temperatura adequada. O comprimento apropriado de um iniciador de-pende do uso pretendido do iniciador, mas varia tipicamente de aproxima-damente 10 até aproximadamente 50 nucleotídeos. Um iniciador não precisaser perfeitamente complementar ao molde, mas deve ser suficientementecomplementar para se hibridizar ao mesmo. Um iniciador pode ser fornecidona forma de filamento duplo, isto é, hibridizado com seu complemento.

"Purificada", como utilizado aqui, significa que uma entidade ouuma substância está separada de uma ou mais outras entidades ou subs-tâncias com as quais foi anteriormente encontrada antes de ser purificada.Uma entidade ou uma substância pode estar parcialmente purificada, subs-tancialmente purificada ou pura. Uma substância ou uma entidade tal comoum ácido nucléico ou um polipeptídeo é considerada pura quando é removi-da de substancialmente todos os outros compostos ou entidades sem serum solvente e quaisquer íons contidos no solvente, isto é, constitui pelo me-nos aproximadamente 90%, mais preferencialmente pelo menos aproxima-damente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais que99% do peso seco da composição. Um composto ou uma entidade parcial-mente ou substancialmente purificada tal como um ácido nucléico ou umpolipeptídeo pode ser removido de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelomenos 70% ou pelo menos 80% do material com o qual é naturalmente en-contrado, por exemplo, material celular tal como proteínas e/ou ácidos nu-cléicos celulares. Em certas modalidades um ácido nucléico ou um polipep-tídeo purificado constitui pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,80%, 90%, 95%, 99% ou ainda mais, em peso seco, do ácido nucléico ou dopolipeptídeo total, respectivamente, em uma composição. Os métodos paraavaliação da pureza são conhecidos na técnica e incluem métodos cromato-gráficos, métodos imunológicos, métodos eletroforéticos etc.

O termo "elemento regulador" ou "seqüência reguladora" em re-ferência a um ácido nucléico é geralmente utilizado aqui para descrever umaparte de ácido nucléico que direciona ou controla uma ou mais etapas naexpressão (particularmente na transcrição, mas em alguns casos em outroseventos tais como no "fatiamento" ou outro processamento) de seqüência(s)de ácido(s) nucléico(s) com a(s) qual(is) está ligada de forma operacional. Otermo inclui promotores e também pode se referir a intensificadores, silenci-adores e outros elementos de controle da transcrição. Os promotores sãoregiões de ácido nucléico que incluem um sítio ao qual a RNA polimerase seliga antes do início da transcrição e que são tipicamente necessários paraque mesmo níveis basais de transcrição ocorram. Geralmente, tais elemen-tos compreendem uma caixa TATA. Os intensificadores são regiões de ácidonucléico que abrangem sítios de ligação para proteína(s) que elevam a ativi-dade de transcrição de um promotor próximo ou localizado distantemente,tipicamente acima de algum nível basal de expressão que existiria na au-sência do intensificador. Em algumas modalidades da invenção, as seqüên-cias reguladoras podem direcionar a expressão constitutiva de uma seqüên-cia de nucleotídeos, por exemplo, a expressão pode ocorrer na maior parteou em todos os tipos de células e/ou sob a maior parte ou todas as condi-ções; em outras modalidades, as seqüências reguladoras podem direcionara expressão específica à célula ou ao tecido e/ou que pode ser induzida. Porexemplo, a expressão pode ser induzida pela presença ou pela adição deum agente indutor tal como um hormônio ou outra molécula pequena, atra-vés de um aumento na temperatura etc. Os elementos reguladores podemainda inibir ou diminuir a expressão de um ácido nucléico ligado de formaoperacional. Os elementos reguladores que se comportam desta maneiraserão referidos aqui como "elementos reguladores negativos".

Em geral, o nível de expressão pode ser determinado utilizandotécnicas padronizadas para medir mRNA ou proteína. Tais métodos incluemNorthern blotting, hibridização in situ, RT-PCR, seqüenciamento, métodosimunológicos tal como imunoblotting, imunodetecção ou detecção fluores-cente após coloração com anticorpos marcados de forma fluorescente, aná-lise de microarranjo de oligonucleotídeo ou dé cDNA ou de arranjo de mem-branas, de arranjo de proteínas, espectrometria de massa etc. Uma maneiraconveniente para determinar o nível de expressão é colocar um ácido nu-cléico que codifica um marcador que pode ser facilmente detectado (por e-xemplo, uma proteína fluorescente ou Iuminescente tal como a proteína fluo-rescente verde ou a luciferase, uma enzima tal como a fosfatase alcalinaetc.) em associação operacional com o elemento regulador em um vetor deexpressão, introduzir o vetor em um tipo celular de interesse ou em um or-ganismo, manter a célula ou o organismo durante um período de tempo eentão medir a expressão do marcador que pode ser facilmente detectado,tirando vantagem de qualquer que seja a propriedade que o torna facilmentedetectável (por exemplo, fluorescência, luminescência, alteração de proprie-dade óptica de um substrato etc.). A comparação da expressão na ausênciae na presença do elemento regulador indica o grau até o qual o elementoregulador afeta a expressão de uma seqüência ligada de forma operacional.

"Ligação específica" se refere geralmente a uma associação físi-ca entre um polipeptídeo-alvo (ou, mais geralmente, uma molécula-alvo) euma molécula de ligação tal como um anticorpo ou um ligante. A associaçãoé tipicamente dependente da presença de uma característica estrutural par-ticular do alvo tal como um determinante antigênico ou um epitopo reconhe-cido pela molécula de ligação. Por exemplo, se um anticorpo for específicopara o epitopo A, a presença de um polipeptídeo contendo o epitopo A ou apresença de A não marcado livre em uma reação contendo tanto A marcadolivre quanto a molécula de ligação que se liga ao mesmo, reduzirá a quanti-dade de A marcado que se liga à molécula de ligação. Deve ser entendidoque a especificidade não precisa ser absoluta, mas se refere geralmente aocontexto em que a ligação ocorre. Por exemplo, é bem-conhecido na técnicaque vários anticorpos fazem ligação cruzada com outros epitopos em adiçãoaos presentes na molécula-alvo. Tal reatividade cruzada pode ser aceitáveldependendo da aplicação para a qual o anticorpo está sendo utilizado. Umversado na técnica será capaz de selecionar anticorpos ou Iigantes que pos-suem um grau suficiente de especificidade para a execução apropriada emqualquer aplicação fornecida (por exemplo, para a detecção de uma molécu-la-alvo, para finalidades terapêuticas etc.). Deve também ser entendido quea especificidade pode ser avaliada no contexto de fatores adicionais tal co-mo a afinidade da molécula de ligação em relação ao alvo versus a afinidadeda molécula de ligação em relação a outros alvos, por exemplo, competido-res. Se uma molécula de ligação exibir uma alta afinidade por uma molécula-alvo que é desejada que seja detectada e baixa afinidade por moléculas quenão são alvo, o anticorpo será provavelmente um reagente aceitável. Umavez que a especificidade de uma molécula de ligação é estabelecida em umou mais contextos, esta pode ser empregada em outros contextos, preferen-cialmente similares, sem necessariamente reavaliar sua especificidade. Aligação de duas ou mais moléculas pode ser considerada específica se aafinidade (constante de dissociação em equilíbrio, Kd) for de pelo menos 10'3 M, preferencialmente 10"4M, mais preferencialmente 10'5 M, por exemplo,10"6 Μ, 10"7 Μ, 10"8 M ou 10"9 Μ sob as condições testadas, por exemplo, sobcondições fisiológicas.

"Indivíduo", como utilizado aqui, se refere a um indivíduo ao qualuma composição de anticorpo será fornecida, por exemplo, para finalidadesexperimentais, de diagnóstico e/ou terapêuticas. Os indivíduos preferidossão mamíferos, particularmente mamíferos domesticados (por exemplo, ca-se, gatos etc.), primatas ou seres humanos.

"Tratamento", como utilizado aqui, pode incluir geralmente a re-versão, o alívio, a redução, a inibição da progressão de ou a redução daprobabilidade da doença, do distúrbio ou do estado de saúde ao qual taltermo se aplica ou um ou mais sintomas ou manifestações de tal doença,distúrbio ou estado de saúde. "Prevenção" se refere ao fato de que uma do-ença, um distúrbio, um estado de saúde ou um sintoma ou uma manifesta-ção do mesmo ou uma piora da gravidade do mesmo não ocorra.

"Vetor" é utilizado aqui para se referir a um ácido nucléico ou aum vírus, genoma viral ou parte do mesmo (por exemplo, um capsídeo viralou um componente de um genoma viral) capaz de mediar a entrada, por e-xemplo, a transferência, o transporte etc., de uma molécula de ácido nucléi-co em uma célula. Quando o vetor for um ácido nucléico, a molécula de áci-do nucléico que será transferida está geralmente ligada, por exemplo, inseri-da dentro da molécula de ácido nucléico do vetor. Um vetor de ácido nucléi-co pode incluir seqüências que direcionam a replicação autônoma dentro decélulas hospedeiras adequadas (por exemplo, uma origem de replicação) oupode incluir seqüências suficientes para permitir a integração de parte detodo o ácido nucléico dentro do DNA da célula hospedeira. Os vetores deácidos nucléicos úteis incluem, por exemplo, plasmídeos de DNA ou deRNA, cosmídeos e genomas virais que ocorrem naturalmente ou modifica-dos ou partes dos mesmos ou ácidos nucléicos (DNA ou RNA) que podemser empacotados dentro de capsídeos virais. Os vetores plasmideais inclu-em tipicamente uma origem de replicação e um ou mais marcadores sele-cionáveis. Os plasmídeos podem incluir parte ou todo um genoma viral (porexemplo, um promotor viral, um intensificador, sinais de processamento oude empacotamento etc.). Os vírus ou as partes dos mesmos (por exemplo,capsídeos virais) que podem ser utilizados para a introdução de moléculasde ácidos nucléicos nas células são referidas como vetores virais. Os veto-res virais animais úteis incluem adenovirus, retrovirus, lentivírus, vírus vacci-nia e outros poxvírus, vírus herpex simplex e outros. Os vetores virais deplantas úteis incluem aqueles baseados nos tobamovírus, ilarvírus etc. Osvetores virais podem ou não conter informação genética viral suficiente paraa produção de vírus infeccioso quando introduzidos nas células hospedeiras,isto é, os vetores virais podem ser defeituosos em relação à replicação e taisvetores virais defeituosos em relação à replicação podem ser preferidos paracertas modalidades da invenção. Quando informação suficiente estiver fal-tando, esta pode, mas não precisa ser, fornecida por uma célula hospedeiraou por um outro vetor introduzido na célula.

Descrição Detalhada de Certas Modalidades da Invenção

A invenção se direciona a ácidos nucléicos que codificam o anti-corpo monoclonal (MAb) PA e a ácidos nucléicos que codificam o anticorpomonoclonal LF. Os anticorpos codificados pelos ácidos nucléicos e fragmen-tos funcionais dos mesmos, reconhecem especificamente as proteínas deantraz PA e LF, respectivamente e inibem a atividade e a infecção produtivapor antraz. A invenção também se direciona a ácidos nucléicos que codifi-cam e a polipeptídeos que compreendem formas modificadas de PA e/ou LFe fragmentos funcionais dos mesmos. Estes anticorpos e fragmentos funcio-nais mantêm a especificidade de ligação e a atividade inibidora do anticorpomurino original PA e/ou LF. A invenção se direciona adicionalmente a formasotimizadas dos anticorpos PA e/ou LF que exibem maior afinidade e especi-ficidade de ligação comparadas com as formas originais do anticorpo PAe/ou LF.

O método de hibridoma, primeiramente descrito por Kohler &Milstein, Nature 256: 495, 1975, é amplamente utilizado para a identificaçãode anticorpos monoclonais que exibem propriedades de ligação desejadas.Sucintamente, a técnica envolve de forma geral o isolamento de linfócitos deum mamífero, a fusão dos linfócitos com células de mieloma e o isolamentode linhagens de células clonais (hibridomas) geradas partindo da fusão. Es-tas linhagens de células são selecionadas para a identificação daquelas queproduzem um anticorpo que se liga ao polipeptídeo de interesse ou a umaparte particular ou um determinante antigênico do mesmo. As linhagenstambém podem ser selecionadas para a identificação daquelas que produ-zem um anticorpo que possui uma afinidade desejada pelo polipeptídeo-alvo. O mamífero imunizado pode ter sido deliberadamente imunizado, porexemplo, vacinado ou pode ter sido infectado pelo organismo infeccioso,exposto a um antígeno etc. Assim um "mamífero imunizado" se refere aqualquer mamífero que produza um anticorpo que se liga especificamente aum polipeptídeo de interesse. Em uma modalidade preferida da presenteinvenção o mamífero é um ser humano, por exemplo, um ser humano que foivacinado contra um agente infeccioso, exposto a um agente infeccioso etc.

A presente invenção fornece iniciadores de oligonucleotídeo econjuntos de iniciadores para uso no isolamento de cDNAs que codificam ascadeias pesadas ou leves do anticorpo partindo de hibridomas, por exemplo,utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR).

Em uma modalidade, um oligonucleotídeo compreende qualqueruma das SEQ ID NOs: 1 - 44. Em uma outra modalidade, um oligonucleotí-deo consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-44. Em outros aspectos,o sítio de enzima de restrição fornecido em certos iniciadores pode ser modi-ficado em qualquer sítio de enzima de restrição preferido, para adaptar osiniciadores aos sítios de inserção desejáveis do vetor.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de isola-mento de um ácido nucléico que codifica uma cadeia de anticorpo ou umaparte da mesma. Em uma modalidade, o método compreende as etapas de:(a) contato dos ácidos nucléicos obtidos partindo de uma célula produtora deanticorpos com pelo menos um iniciador de oligonucleotídeo selecionada dogrupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-44; e (b) realização de uma reaçãode amplificação. A reação de amplificação é tipicamente uma reação em ca-deia da polimerase (PCR). Em certas modalidades da invenção a etapa (a)compreende o contato dos ácidos nucléicos com pelo menos dois iniciadoresde oligonucleotídeo selecionados do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1-44. Será considerado que embora os iniciadores e os métodos da presenteinvenção possam ter uso particular para a clonagem de cDNAs das cadeiasdo anticorpo (isto é, cDNAs que codificam uma cadeia de anticorpo) partindode hibridomas, estes não estão de forma alguma limitados a tal finalidade,mas podem ser utilizados para a clonagem de cDNAs de cadeias do anticor-po partindo de células, linhagem de células produtoras de anticorpo etc. Pre-ferencialmente, a cadeia de anticorpo é uma cadeia de anticorpo humano.

Em um outro aspecto, a invenção fornece composições de áci-dos nucléicos que codificam cadeias polipeptídicas de anticorpo ou fragmen-tos funcionais das mesmas que se ligam com uma proteína de antraz. Emuma modalidade, as composições de ácidos nucléicos que codificam a ca-deia polipeptídica do anticorpo ou um fragmento funcional da mesma com-preendem uma proteína funcional que se liga a um antígeno protetor de B.anthracis. Em uma modalidade é fornecido um ácido nucléico que codificauma cadeia leve kappa de um anticorpo monoclonal ou de um fragmentofuncional da mesma, que se liga a um antígeno protetor de B. anthracis. Emuma modalidade o ácido nucléico é ou compreende a seqüência de um cD-NA. Em uma outra modalidade, é fornecido um ácido nucléico que codificauma cadeia pesada gama de um anticorpo monoclonal ou um fragmentofuncional da mesma, que se liga a um antígeno protetor de B. anthracis. Emuma modalidade o ácido nucléico é ou compreende a seqüência de um cD-NA.

Em uma modalidade, as composições de ácidos nucléicos quecodificam a cadeia polipeptídica do anticorpo ou um fragmento funcional damesma compreendem uma proteína funcional que se liga a um fator letal deB. anthracis. Em uma modalidade, é fornecido um ácido nucléico que codifi-ca uma cadeia leve kappa de um anticorpo monoclonal ou um fragmentofuncional da mesma, que se liga a um fator letal de B. anthracis. Em umamodalidade o ácido nucléico é ou compreende a seqüência de um cDNA.

Em uma outra modalidade, é fornecido um ácido nucléico que codifica umacadeia pesada gama de um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcionalda mesma, que se liga a um fator letal de B. anthracis. Em uma modalidadeo ácido nucléico é ou compreende a seqüência de um cDNA.

É adicionalmente fornecida uma variedade de constructos deácido nucléico que compreendem um ou mais ácidos nucléicos da invenção,por exemplo, um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada ou umacadeia leve de anticorpo, em que o dito ácido nucléico foi isolado de umacélula ou de uma linhagem de células que expressa a cadeia pesada ou levedo anticorpo utilizando um ou mais dos iniciadores da invenção. Por exem-plo, a invenção fornece vetores, por exemplo, vetores de expressão, quecontêm um ou mais ácidos nucléicos da invenção. Em certas modalidadesum vetor é um vetor binário adequado para transformação mediada por A-grobacteríum. Em certas modalidades um vetor é um vírus vegetal. Em cer-tas modalidades um vetor se baseia em um vírus vegetal, isto é, contém umou mais componentes genômicos de um vírus vegetal.

A invenção fornece ainda células hospedeiras que expressamum ou mais dos ácidos nucléicos fornecidos e produzem uma cadeia pesadaou leve de um anticorpo monoclonal ou fragmentos funcionais da mesma.

A invenção fornece ainda um método de produção de uma ca-deia pesada ou leve de anticorpo que compreende: (i) o fornecimento de umsistema de expressão que contém um ácido nucléico que codifica uma ca-deia pesada ou leve de um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcionalda mesma, em que o dito ácido nucléico foi isolado utilizando um ou maisiniciadores da invenção, em que o dito ácido nucléico está ligado de formaoperacional a um elemento regulador tal como um promotor que direciona aexpressão do ácido nucléico no sistema de expressão; (ii) a manutenção dosistema de expressão sob condições em que a expressão ocorre. O métodopode compreender ainda (iii) a coleta do anticorpo ou de um fragmento fun-cional do mesmo.

O anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode serpurificado utilizando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidasna técnica. O sistema de expressão pode ser qualquer sistema de expressãoadequado, por exemplo, uma cultura de células, uma planta ou um animaltransgênico, uma raiz clonal ou uma linhagem vegetal etc. Um anticorpocompleto pode ser produzido permitindo que as cadeias pesada e leve seassociem uma com a outra.

A invenção fornece ainda um método de produção de um anti-corpo que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve ou fragmen-tos funcionais das mesmas que compreende: (i) o fornecimento de um sis-tema de expressão que contém um ácido nucléico que codifica uma cadeiapesada de anticorpo ou um fragmento funcional da mesma e contém aindaum ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de anticorpo ou um frag-mento funcional da mesma, em que qualquer um ou ambos os ditos ácidosnucléicos foram isolados utilizando um ou mais iniciadores da presente in-venção e em que cada um dos ditos ácidos nucléicos está ligado de formaoperacional a um elemento regulador tal como um promotor que direciona aexpressão no sistema de expressão; (ii) a manutenção do sistema de ex-pressão sob condições em que a expressão ocorre. As cadeias do anticorposão ambas produzidas pelo sistema de expressão e podem se associar umacom a outra no sistema de expressão. O método pode incluir ainda uma eta-pa de coleta do anticorpo. Qualquer sistema de expressão adequado podeser utilizado.

A invenção fornece ainda um método de tratamento de um indi-víduo que compreende a administração de um anticorpo que compreendeuma cadeia pesada e leve ou fragmentos funcionais da mesma, em quequalquer uma ou ambas as cadeias foram produzidas de acordo com ummétodo da invenção descrito aqui.

Este pedido de patente se refere a várias patentes, pedidos depatentes, artigos de jornais e outras publicações, dos quais todos são incor-porados aqui como referência. Em adição, os trabalhos de referência padro-nizados a seguir são incorporados aqui como referência: Ausubel1 F., (ed.),Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology,Current Protocols in Protein Science and Current Protocols in Cell Biology,John Wiley & Sons, N.Y., edição como a de julho de 2002; Sambrook, Rus-sell e Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3â ed., Cold S-pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001; Harlow, E. e ou-tros, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2âed. 1988); Goldsby, R.A. e outros, (eds.), Kuby Immunology, 4âed.,W.H. Freeman & Company, Nova York1 2000; e Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics, 10a Ed. McGraw Hillt 2001. No even-to de um conflito ou incoerência entre qualquer uma das referências incorpo-radas e o presente relatório descritivo ou o entendimento de um versado natécnica, o relatório descritivo deve controlar, sendo entendido que a determi-nação do fato de um conflito ou de uma incoerência existir está dentro docritério dos inventores e pode ser feita a qualquer momento.

A presente invenção fornece novos iniciadores de oligonucleotí-deos e conjuntos de iniciadores para uso no isolamento de ácidos nucléicos,por exemplo, cDNAs, que codificam cadeias pesada ou leve do anticorpopartindo de hibridomas, por exemplo, utilizando a reação em cadeia da poli-merase (PCR). A PCR é bem-conhecida na técnica e é descrita, por exem-pio, em PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach, C.W. e Dveksler, G.S. (Eds.); PCR Basics: From Background to Bench, Springer Verlag, 2000;M. J. McPherson e outros; Mattila e outros, Nucleic Acids Res., 19: 4967(1991); Eckert e outros, PCR Methods and Applications, 1: 17 (1991); PCR(eds. McPherson e outros, IRL Press, Oxford); e Patente U.S. N2 4.683.202.Em certas modalidades da invenção o RNA, por exemplo, o mRNA, é isola-do de uma célula ou de uma linhagem de células tal como um hibridoma. ORNA é submetido à transcrição inverse para produzir cDNA. Um ácido nu-cléico que codifica uma cadeia pesada ou leve do anticorpo é amplificadoutilizando um ou mais iniciadores de oligonucleotídeos ou conjuntos de inici-adores da invenção. Os iniciadores da invenção podem ser utilizados para aamplificação utilizando outras técnicas de amplificação também.

Os oligonucleotídeos da invenção estão listados na Tabela 1,que também indica a parte do gene ou do cDNA do anticorpo com a qual oiniciador se hibridiza, por exemplo, a região constante de uma cadeia gama(CG), a região constante de uma cadeia lâmbada (CL), a região constantede uma cadeia kappa (CK), a região variável de uma cadeia pesada (VG), aregião variável de uma cadeia lâmbada (VL) ou a região variável de umacadeia kappa (VK). Será considerado que certos iniciadores se hibridizamcom um filamento codificador ou não codificador, portanto, é pretendido que"se hibridiza com" abranja qualquer uma destas possibilidades. A Tabela 1também indica o número de seqüências individuais disponíveis no GenBankque podem ser agrupadas em uma "família" que deve ser possível amplificarutilizando um iniciador particular. Certos dos iniciadores, indicados como"curtos" não contêm sítios de restrição engenheirados. Os outros iniciadores,que são mais longos, contêm um sítio de restrição para Sfil localizado a 5'em relação à parte que se hibridiza com o gene ou com o cDNA do anticor-po. Estes iniciadores contêm ainda CTC ou CTCGC na extremidade a 5' pa-ra aumentar a eficiência de cIivagem pela enzima de restrição. A invençãoabrange oligonucleotídeos adicionais que compreendem uma parte que pos-sui a seqüência de um iniciador "curto" da Tabela 1 e compreendem aindaum sítio de restrição localizado a 5' em relação à parte que possui a seqüên-cia de um iniciador curto. Os iniciadores que compreendem um sítio de Sfil(indicado em negrito) fornecem um exemplo de como os iniciadores curtosda invenção podem ser modificados para incorporarem um sítio de restrição.

Assim em um aspecto, a invenção fornece um oligonucleotídeocuja seqüência compreende ou consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:1 - 44. Em um outro aspecto, a invenção fornece uma mistura de iniciadoresque contém pelo menos dois oligonucleotídeos selecionados do grupo queconsiste em: SEQ ID NOs: 1-44. Em um outro aspecto, a invenção forneceuma mistura de iniciadores que contém pelo menos três oligonucleotídeosselecionados do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1-44. Em um outroaspecto, a invenção fornece uma mistura de iniciadores que contém pelomenos quatro oligonucleotídeos selecionados do grupo que consiste em:SEQ ID NOs: 1-44. Em um outro aspecto, a invenção fornece uma misturade iniciadores que contém pelo menos cinco oligonucleotídeos selecionadosdo grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1-44. Em um outro aspecto, a in-venção fornece uma mistura de iniciadores que contém pelo menos seis oli-gonucleotídeos selecionados do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1-44.Em certas modalidades da invenção pelo menos um iniciador em uma mistu-ra de iniciadores é um iniciador de região constante e pelo menos um inicia-dor na mistura de iniciadores é um iniciador de região variável.

Em algumas modalidades a mistura de iniciadores contém pelomenos um iniciador que se hibridiza com uma seqüência que codifica pelomenos uma parte da região constante de uma cadeia gama (um iniciadorCG) e pelo menos um iniciador que se hibridiza com uma seqüência quecodifica pelo menos uma parte da região variável de uma cadeia pesada (uminiciador VG). Em algumas modalidades a mistura de iniciadores contém pe-lo menos um iniciador que se hibridiza com uma seqüência que codifica pelomenos uma parte da região constante de uma cadeia lâmbada (um iniciadorCL) e pelo menos um iniciador que se hibridiza com uma seqüência que co-difica pelo menos uma parte da região variável de uma cadeia lâmbada (uminiciador VL). Em algumas modalidades a mistura de iniciadores contém pelomenos um iniciador que se hibridiza com uma seqüência que codifica pelomenos uma parte da região constante de uma cadeia kappa (um CK) e pelomenos um iniciador que se hibridiza com uma seqüência que codifica pelomenos uma parte da região variável de uma cadeia kappa (um iniciador VK).

Em algumas modalidades da invenção a mistura de iniciadores contém pelomenos 2 ou 3 iniciadores VG e pelo menos um iniciador CG. Em algumasmodalidades da invenção a mistura de iniciadores contém pelo menos 2 ou 3iniciadores VL e pelo menos um iniciador CL. Em algumas modalidades dainvenção a mistura de iniciadores contém pelo menos 2 ou 3 iniciadores VKe pelo menos um iniciador CK. Em qualquer uma das modalidades anterio-res, os iniciadores podem ser curtos ou longos. Em algumas modalidades dainvenção uma primeira reação da PCR é realizada utilizando um conjunto deiniciadores ou um par de iniciadores curtos e uma segunda reação da PCR érealizada utilizando um conjunto de iniciadores ou um par de iniciadores quecontém um sítio de restrição (iniciadores longos). Os iniciadores longos po-dem compreender uma seqüência de um iniciador curto como descrito noExemplo 1.

Tabela 1. Iniciadores de RT-PCR

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Será considerado que as seqüências listadas na Tabela 1 repre-sentam uma molécula de oligonucleotídeo isolada que possui a seqüêncialistada ou uma população de moléculas de oligonucleotídeos das quais cadauma possui a seqüência listada. Certos dos iniciadores listados na Tabela 1são degenerados, isto é, a população de moléculas de oligonucleotídeosrepresentada pela seqüência contém membros individuais cuja seqüênciadifere na posição degenerada. O termo "posição" se refere a um valor numé-rico que é atribuído a cada nucleosídeo em um polinucleotídeo, geralmenteem relação à extremidade a 5'.

O conceito de iniciadores degenerados é bem-conhecido na téc-nica e é utilizado aqui de forma coerente com o entendimento na técnica. ATabela 2 contém o código de ambigüidade da IUPAC1 que lista as abrevia-ções que representam os nucleotídeos que podem estar presentes em umaposição degenerada. Por exemplo, K representa G ou T.

Tabela 2: Código de Ambigüidade

Letra de Abreviação Nucleotídeo Representado

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Se houverem "Ν" nucleotídeos possíveis em uma certa posiçãoem um oligonucleotídeo, é dito que a posição é N vezes degenerada. Assima seqüência do iniciador "CG", isto é, 5'-CTCGCGGCCTCCGAGGCCTCATTTACCCKGAGACAGG-3' (SEQ ID NO:1) representa uma população de oligonucleotídeos que contém algunsmembros em que a posição 29 está ocupada por um G e alguns membrosem que a posição 29 está ocupada por um Τ. A invenção inclui oligonucleo-tídeos em que a posição degenerada é ocupada por qualquer uma das alter-nativas possíveis em tal posição. Por exemplo, a invenção abrange um oli-gonucleotídeo que possui a seqüência da SEQ ID NO: 1, em que a posição29 está ocupada por um G e abrange ainda um oligonucleotídeo que possuia seqüência da SEQ ID NO: 1, em que a posição 29 está ocupada por um T.

Todas as possibilidades são abrangidas. Por exemplo, o iniciador "VG1+7curto" (SEQ ID NO: 13) é 2 vezes degenerado nas posições 9 e 11. Assim ainvenção abrange 4 variações não degeneradas da SEQ ID NO: 13 em adi-ção ao fato de abranger o oligonucleotídeo degenerado representado pelaSEQ ID NO: 13, que contém moléculas de oligonucleotídeos que possuemqualquer uma das 4 seqüências diferentes. A invenção abrange ainda moda-lidades em que menos posições são degeneradas do que é indicado na Ta-bela 1. Por exemplo, a invenção abrange modalidades em que apenas a po-sição 9 da SEQ ID NO: 13 é degenerada (e a posição 11 é qualquer um dosnucleotídeos representados por Y) e modalidades em que apenas a posição11 da SEQ ID NO: 13 é degenerada (e a posição 9 é qualquer um dos oligo-nucleotídeos representados por S).

A proporção dos oligonucleotídeos diferentes na população deoligonucleotídeos de um oligonucleotídeo degenerado pode variar. Tipica-mente cada seqüência é representada aproximada e igualmente na popula-ção. Entretanto, pode ser desejável influenciar a composição da mistura.Qualquer composição com porcentagem específica de um oligonucleotídeodegenerado na Tabela 1 está dentro do âmbito da invenção. A degeneraçãoglobal de um oligonucleotídeo é o número total de seqüências diferentes quepodem estar presentes na população de oligonucleotídeos. Por exemplo, sehouverem 3 posições degeneradas, das quais cada uma é 2 vezes degene-rada, a degeneração da população de oligonucleotídeos é de 23 = 8.

Sistemas de Expressão e Produção de Anticorpos

Um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada ou leve doanticorpo isolado utilizando qualquer um dos iniciadores de oligonucleotí-deos da invenção pode ser expresso em qualquer um de uma ampla varie-dade de sistemas de expressão. Um sistema de expressão é qualquer sis-tema biológico adequado tal como uma linhagem de células ou um animal ouplanta transgênica capaz de sintetizar um polipeptídeo. Tipicamente o ácidonucléico é inserido dentro de um vetor de expressão cuja uma ampla varie-dade é conhecida. Os métodos adequados para a expressão de um polinu-cleotídeo de interesse são conhecidos na técnica e são descritos em Ausub-el, supra e em Sambrook, supra. Ver também, as Patentes U.S. N—4.816.567 e 6.331.415. Qualquer sistema de expressão procariótico ou eu-cariótico pode ser utilizado. Em certas modalidades da invenção o sistemade expressão não é um hibridoma e não é um ser humano, isto é, o sistemade expressão é um que não produz naturalmente a cadeia de anticorpo.

Em certas modalidades da invenção é utilizado um sistema deexpressão baseado em plantas. Um sistema de expressão baseado emplantas é qualquer sistema de expressão que emprega células de uma plan-ta ou uma parte das mesmas. O sistema de expressão pode ser uma linha-gem de células vegetais, uma planta inteira, uma linhagem de raiz clonal etc.A linhagem de células vegetais, a planta inteira, a linhagem de raiz clonaletc. e podem ser transgênicas ou não transgênicas.

Os métodos e os vetores para a expressão de um polinucleotí-deo de interesse, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de anticorpo emum sistema de expressão baseado em plantas são bem-conhecidos na téc-nica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N- 6.852.319. Em certas modalidadesda invenção é utilizado um vetor baseado em um genoma viral de planta.Sem limitação, a invenção abrange o uso de qualquer vetor baseado em umvírus vegetal ou um genoma viral, por exemplo, um vírus vegetal ou um ge-noma viral de RNA, um vírus vegetal ou um genoma viral de DNA etc. Ver,por exemplo, as Patentes U.S. N- 5.602.242, 5.500.360 e 5.846.795.

Em certas modalidades da invenção brotos transgênicos ou nãotransgênicos são utilizados como um sistema de expressão. Ver, por exem-plo, a Pub. U.S. N2 20040093643 e a U.S.S.N. 60/652.186, depositada em11 de fevereiro de 2005, intitulada "Production of Foreign Nucleic Acids andPolypeptides in Sprout Systems" por Ensley e outros. Em certas modalida-des da invenção uma linhagem de raiz clonal ou outra linhagem clonal é uti-lizada. Ver, por exemplo, a U.S.S.N. 11/061.980, depositada em 18 de feve-reiro de 2005, intitulada "SYSTEMS AND METHODS FOR CLONAL EX-PRESSION IN PLANTS". Outros pedidos de patente contendo informaçãorelevante para a expressão de um polinucleotídeo de interesse incluem asPub. U.S. N— 20050026291, 20050114920, a WO2005026375, aWO0046350, a WO0025574, a WO2005049839 e a Patente U.S. N2US6448070.

A presente invenção considera especialmente a expressão deum ácido nucléico que codifica uma cadeia leve ou uma cadeia pesada deum anticorpo, em que o dito ácido nucléico é isolado utilizando um métodoe/ou um iniciador descrito aqui utilizando os sistemas de expressão e os mé-todos descritos ou referidos em qualquer um dos pedidos de patentes e pu-blicações listados nesta seção. Qualquer planta, vírus vegetal, replicon viralvegetal específico etc., descrito aqui pode ser utilizado. Em algumas modali-dades o replicon viral contém elementos de seqüência suficientes de formaque pode ser replicado em uma célula vegetal, utilizando opcionalmentecomponentes tal como uma RNA polimerase fornecida pela planta em trans(por exemplo, a planta é transgênica ou compreende um outro vetor que ex-pressa a RNA polimerase). O replicon pode ou não incluir um gene de prote-ína de revestimento ou um gene de proteína de movimento. Qualquer méto-do particular de introdução de um vírus ou um replicon vegetal em uma plan-ta ou célula vegetal ou parte de uma planta pode ser utilizado. Os exemplosincluem aplicação em uma parte da planta tal como uma folha, abrasão (porexemplo, para introduzir um produto da transcrição viral em uma folha), a-groinfiltração, transformação mediada por Agrobacterium, biolística etc. Ainvenção abrange qualquer vetor ou replicon viral de planta que compreendaum ácido nucléico isolado de acordo com um método descrito aqui, por e-xemplo, um vetor ou um replicon viral de planta recombinante e abrange a-inda uma planta, uma parte de planta ou uma cultura clonal derivada de umaplanta, que compreende o vetor. A invenção abrange ainda uma plantatransgênica cujo genoma compreende o ácido nucléico.

Em algumas modalidades da invenção as seqüências de ácidosnucléicos que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve são co-expressas de forma que as cadeias podem se associar uma com a outra pa-ra formar um anticorpo completo antes da coleta.

Qualquer método adequado pode ser utilizado para coletar eopcionalmente purificar uma cadeia de anticorpo ou um anticorpo produzidode acordo com os métodos da invenção.

Evidentemente, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpotambém pode ser quimicamente sintetizada. O fato de se possuir a seqüên-cia de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada ou leve fornece a seqüên-cia de aminoácidos.

Um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada ou leve doanticorpo isolado utilizando qualquer um dos iniciadores de oligonucleotí-deos da invenção pode ser modificado em qualquer uma de uma variedadede maneiras. Por exemplo, este pode ser modificado de forma a interromperum evento de glicosilação ou outro evento de processamento pós-traduçãoque ocorreria de outra maneira nas células eucarióticas. Por exemplo, podeser feita uma mutação que altera um aminoáçido que seria glicosilado ou umsítio adjacente ou próximo. Como é bem-conhecido na técnica, Asn-X-(Ser/Thr) é uma seqüência que pode ser reconhecida pela maquinária deglicosilação ligada a Nde eucariotos. O(s) sítio(s) particular(es) que será(ão)modificado(s) pode(m) ser selecionado(s) levando em consideração a ma-quinaria de glicosilação particular encontrada no sistema de expressão queserá utilizado. Este pode ser modificado para incluir uma parte que codificauma marcação de polipeptídeo (por exemplo, para facilitar a purificação),uma seqüência que direciona a cadeia de anticorpo para uma organela par-ticular etc. Uma ampla variedade de alterações pode ser empregada seminterferir com as propriedades de ligação específica ao antígeno do anticorpoe está dentro do âmbito da invenção. Em certas modalidades a(s) altera-ção(ões) resulta(m) em um anticorpo que é pelo menos 80% idêntico, pelomenos 85% idêntico, pelo menos 90% idêntico, pelo menos 95% idêntico emseqüência ao anticorpo que ocorre naturalmente.

Um anticorpo produzido de acordo com os métodos da invençãopode ser um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fab', F(ab')2,scFv (variável de cadeia única) ou outro que mantenha um sítio de ligaçãoao antígeno. O fragmento pode ser expresso na forma de um fragmento, istoé, um ácido nucléico que codifica apenas o fragmento pode ser expresso ouum anticorpo completo pode ser processado para produzir um fragmentoutilizando técnicas conhecidas, por exemplo, clivagem ou digestão.Vetores

Como mencionado anteriormente, um cDNA isolado utilizandoos iniciadores e os métodos da invenção pode ser inserido em uma amplavariedade de vetores e expresso em uma ampla variedade de tipos celularese sistemas de expressão. A invenção fornece vetores adicionais adequadospara a inserção de um ácido nucléico isolado utilizando os iniciadores dainvenção que compreendem um sítio de restrição. O vetor contém o mesmosítio de restrição que o presente nos iniciadores. O sítio de restrição estápresente em uma ou mais localizações no vetor. Em algumas modalidadesum sítio de restrição em uma localização indesejada do vetor é removido,por exemplo, utilizando mutagênese direcionada ao sítio. Em algumas moda-lidades o sítio de restrição é um sítio de restrição para Sfil.

Em uma modalidade específica a invenção fornece uma versãomodificada do vetor binário pBI121, adequado para a transformação media-da por Agrobacterium, em que o sítio de Sfil interno na posição 11031 sofreumutagênese e em que um ou mais novos sítios para Sfil são criados. Sucin-tamente, pBI121 carrega o gene da neomicina fosfotransferase (NPTIf) e ogene da α-glucuronidase (GUS) (Jefferson e outros, EMBO J, 6: 3901-3907,1987). O gene da neomicina fosfotransferase (NPTII) está sob o controle dopromotor da nopalina sintase (nos) e do terminador da nopalina sintase (nos)que fornece sinal de políadenilação. O gene da neomicina fosfotransferase(NPTII) confere resistência à canamicina. A atividade da a-glucuronidase(GUS) está sob o controle do promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor eo terminador da nopalina sintase (nos) fornece a políadenilação. A invençãofornece uma forma modificada de pBI121 em que o sítio de Sfil original émutagenizado e em que dois novos sítios de Sfil são introduzidos para per-mitir a inserção conveniente de um ácido nucléico heterólogo tal como umácido nucléico que codifica uma cadeia pesada ou leve do anticorpo.

Kits

A invenção fornece um kit que compreende um ou mais oligonu-cleotídeos listados na Tabela 1. Preferencialmente o kit contém pelo menosdois oligonucleotídeos. Em modalidades específicas o kit contém pelo me-nos qualquer número de oligonucleotídeos entre 3 e 44. Em geral, o kit con-tém um par ou um conjunto de oligonucleotídeos adequados para a amplifi-cação de um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada, por exemplo,uma cadeia pesada gama e/ou um par ou um conjunto de oligonucleotídeosadequados para a amplificação de um ácido nucléico que codifica uma ca-deia leve, por exemplo, uma cadeia leve kappa ou lâmbada. Em algumasmodalidades o kit contém um par ou um conjunto de oligonucleotídeos ade-quados para a amplificação de uma cadeia pesada gama, um par ou umconjunto de oligonucleotídeos adequados para a amplificação de uma cadeialeve kappa e um par ou um conjunto de oligonucleotídeos adequados para aamplificação de uma cadeia leve lâmbada. Qualquer par ou conjunto de oli-gonucleotídeos descrito anteriormente pode ser incluído no kit. O kit incluirátipicamente instruções para a utilização do kit para isolar ácidos nucléicosque codificam uma ou mais cadeias de um anticorpo partindo de uma célulaou linhagem de células tal como um hibridoma.

Em adição a um ou mais oligonucleotídeos, o kit pode compre-ender ainda de um número de reagentes adicionais. Por exemplo, o kit podeconter reagentes para a realização de uma reação de PCR1 por exemplo,uma reação de RT-PCR. O kit pode, portanto, conter, por exemplo, umatranscriptase reversa, uma DNA polimerase termoestável, nucleotídeos,tampões etc. O kit pode conter reagentes para a purificação de RNA partindode um hibridoma ou outra fonte celular de RNA.

O kit pode conter um ou mais vetores nas quais um ácido nucléi-co amplificado utilizando o kit pode ser inserido. O vetor pode ser um vetorde expressão que contém elementos reguladores, por exemplo, um promo-tor, suficiente para direcionar a expressão em uma célula, por exemplo, umacélula vegetal, uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma célula de in-seto, uma célula de mamífero etc. Outros elementos apropriados tais comoterminadores da transcrição etc., também podem ser incluídos. Uma amplavariedade de vetores de expressão está disponível na técnica e qualquer umdestes pode ser incluído no kit. Em uma modalidade o vetor é um vetor biná-rio adequado para a transformação mediada por Agrobacteríum.

O vetor pode conter um ou mais sítios de restrição convenientesde forma que a clivagem do vetor com uma enzima de restrição resulta emuma "extremidade coesiva" que é compatível com, isto é, se hibridiza a umsítio de restrição presente em um ou mais dos iniciadores de oligonucleotí-deos presentes no kit. Em algumas modalidades o vetor contém um ou maissítios de restrição para uma enzima que reconhece um sítio de reconheci-mento de 8 nucleotídeos. Os 8 nucleotídeos podem ser contínuos ou podemestar separados por um ou mais outros nucleotídeos (por exemplo, 1-10 nu-cleotídeos) que não são especificamente reconhecidos, embora o espaça-mento possa ser essencial para o reconhecimento. Por exemplo, em certasmodalidades a enzima corta dentro de XXXXNNNNNXXXX, em que N signi-fica qualquer nucleotídeo e X significa qualquer nucleotídeo específico (istoé, cada X é independentemente selecionado). Tais sítios podem ser vantajo-sos uma vez que permite a realização da clonagem direcional utilizando a-penas uma enzima pelo fato de ter uma seqüência diferente de 5 nucleotí-deos nas extremidades a 5' e a 3' do inserto. Em algumas modalidades ovetor contém um ou mais sítios de restrição para Sfil, que corta dentro dosítio GGCCNNNNNGGCC. O vetor pode ser fornecido na forma Iinearizadaou circular. Também pode ser fornecida uma enzima de restrição para a cli-vagem do vetor. Os reagentes para a realização de uma ligação, por exem-plo, ligase, tampão da Iigase etc., podem ser incluídos.

Um identificador, por exemplo, um código de barras, uma mar-cação de ID por freqüência de rádio etc., pode estar presente dentro ou nokit. O identificador pode ser utilizado, por exemplo, para identificar exclusi-vamente o kit com a finalidade de controle de qualidade, de controle da in-venção, de rastreamento, de movimento entre as estações de trabalho etc.

Os kits incluirão geralmente um ou mais frascos ou recipientesde forma que certos reagentes individuais possam ser armazenados separa-damente. Os kits também podem incluir um meio para encerrar os recipien-tes individuais em confinamento relativamente próximo para venda comerci-al, por exemplo, uma caixa de plástico, em que as instruções, os materiaisde embalagem tal como styrofoam etc., podem ser encerrados.Seqüências de Nucleotídeos que Codifica Anticorpos Monoclonais Humanospara Antígenos do Antraz e Cadeias Pesadas e Leves Isoladas

Como descrito em maiores detalhes no Exemplo 1, os iniciado-res listados na Tabela 1 foram utilizados para isolar seqüências de cDNAque codificam a cadeia pesada gama e a cadeia leve kappa de dois anticor-pos monoclonais humanos diferentes (huMAbs). O isolamento destes cDNAsé um exemplo do uso dos iniciadores de oligonucleotídeos da invenção. Umdos huMAbs se liga especificamente ao domínio 4 do polipeptídeo do antí-geno protetor de Bacillus anthracis (PA), denominado PA-1. O outro huMAbse liga especificamente ao polipeptídeo do fator letal de Bacillus anthracis(LF)1 denominado LF-1. O Bacillus anthracis é o agente causador do antraz.

As funções de PA e LF na patogênese bacteriana e na resposta imunológicasão bem-conhecidas na técnica. As seqüências de cDNA foram isoladas par-tindo de linhagens de células de hibridoma que foram obtidas através da fu-são de linfócitos provenientes de um indivíduo que tinha recebido uma vaci-nação para antraz com células de mieloma e da seleção de anticorpos espe-cíficos para B. anthracis utilizando métodos padronizados.

São fornecidos ácidos nucléicos isolados que compreendemuma seqüência de DNA do cDNA da cadeia leve Kappa do huMAb PA-1(SEQ ID NO: 45), uma seqüência de DNA do cDNA da cadeia pesada Gamado huMAb PA-1 (SEQ ID NO: 47), uma seqüência de DNA do cDNA da ca-deia leve Kappa do huMAb LF-1 (SEQ ID NO: 49) ou uma seqüência deDNA do cDNA da cadeia pesada Gama do huMAb LF-1 (SEQ ID NO: 51). Ainvenção fornece ainda seqüências de RNA correspondentes, em que T ésubstituído por U.

A invenção fornece ainda um polipeptídeo isolado codificado porqualquer uma das SEQ ID NOs 45, 47, 49 ou 51. As seqüências de aminoá-cidos destes polipeptídeos são apresentadas nas SEQ ID NOs 46, 48, 50 e52. A invenção fornece ainda um polipeptídeo isolado que é pelo menos80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais idênticoa um polipeptídeo das SEQ ID NOs 46, 48, 50 ou 52. A invenção forneceainda composições de anticorpos em que uma ou mais das SEQ ID NOs 45,47, 49 ou 51 são expressas em um sistema de expressão sem ser um hibri-doma ou um ser humano.

Seqüência de DNA do cDNA da cadeia leve Kappa do huMAb PA-1: 5'-

ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG

ATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTT

GTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGT

TAGCTACAGCTCCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCC

CAGCCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGA

CAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGCCAGACTTCACTCTCACCATCAG

CAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCACTATGGT

AACTCACCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGA

ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGT

TGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGT

AACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC

AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC

AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC

ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG-3' (SEQ ID NO: 45)

Seqüência de aminoácidos da cadeia leve Kappa do huMAb PA-1:

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSYS

SLAWYQQKPGQAPSLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGPDFTLTISRLEPED

FAVYYCQHYGNSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV

CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK

ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 46)

As seqüências de CDR da cadeia leve Kappa do huMAb PA-1são representadas em negrito e correspondem aos resíduos de aminoácidos50-61 (PA-1CDR1), aos resíduos de aminoácidos 77-83 (PA-1CDR2) e aosresíduos de aminoácidos 116-124 (PA-1CDR3) da SEQ ID NO: 46. Isoladas,cada uma das seqüências de CDR consiste em:

PA-1 CDR1: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO: 59)PA-1 CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 60)PA-1CDR3: QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61)Seqüência de DNA do cDNA da cadeia pesada Gama de huMAb PA-1: 5'-ATGGACTGGATCTGGAGGATCCTCTTTTTGGTGGCAGCAGCCACAGGTGCCCACTCCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACCTTCACTAGCAATGCTATACAATGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGGTGGGATGGATCAACGGTGGCGATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTAGTAGGGACATATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCGTTTGCAAAGAGGGGGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCTTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC

CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA

TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATC

TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG

GGG G G ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAG G ACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC

CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG

GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG

TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAT

GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCC

ATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG

GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC

AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG

GAGTG G G AG AGC AATG G G CAG CCG G AG AACAACTACAAG ACCACGCCT

CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCG

TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA

TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT

CTCCGGGTAAATGA-3'(SEQ ID NO: 47)

Seqüência de aminoácidos da cadeia pesada Gama do huMAb PA-1:

MDWIWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTS

NAIQWVRQAPGQRLEWVGWINGGDGNTKYSQKFQGRVTISRDISASTAY

MELSSLRSEDTAVYYCARHRLQRGGFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL

APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSG

LYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC

PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA

PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE

SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 48)

As seqüências de CDR da cadeia pesada Gamma do huMAbPA-1 são representadas em negrito e correspondem aos resíduos de amino-ácidos 51-60 (PA-hCDR1), aos resíduos de aminoácidos 75-90 (PA-hCDR2)e aos resíduos de aminoácidos 124-133 (PA-hCDR3) da SEQ ID NO: 48.

PA-hCDR1: GYTFTSNAIQ (SEQ ID NO: 62)

PA-hCDR2: WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 63)

PA-hCDR3: HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64)

Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende uma oumais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve(LC) selecionadas de (i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% deidentidade de seqüência com PA-1CDR1: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO:59); (ii) uma CDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade deseqüência com PA-1CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 60); e (iii) uma CDR3de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüência com PA-1CDR3: QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61) e o anticorpo ou fragmento funcio-nal do mesmo pode se ligar ao antígeno protetor de B. anthracis. Em algu-mas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou um fragmento funcio-nal do mesmo, em que o anticorpo compreende duas ou mais regiões dedeterminação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) seleciona-das de (i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade deseqüência com PA-1CDR1: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO: 59); (ii) umaCDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüência comPA-1CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 60); e (iii) uma CDR3 de cadeia levecom pelo menos 90% de identidade de seqüência com PA-1CDR3:QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61) e o anticorpo ou o fragmento funcional domesmo pode se ligar especificamente ao antígeno protetor de B. anthracis.

Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou um fragmen-to funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende três regiões de de-terminação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consis-tem em (i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade deseqüência com PA-1CDR1: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO: 59); (ii) umaCDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüência comPA-1CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 60); e (iii) uma CDR3 de cadeia levecom pelo menos 90% de identidade de seqüência com PA-1CDR3:QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61) e o anticorpo ou fragmento funcional domesmo pode se ligar especificamente ao antígeno protetor de B. anthracis.As composições de ácidos nucléicos que codificam o anticorpo ou as se-qüências de fragmentos anteriroes são adicionalmente fornecidas.

Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende uma oumais uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs)de cadeia pesada (HC) selecionadas de (i) uma CDR1 de cadeia pesadacom pelo menos 90% de identidade de seqüência com PA-hCDR1:GYTFTSNAIQ (SEQ ID NO: 62); (ii) uma CDR2 de cadeia pesada com pelomenos 90% de identidade de seqüência com PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 63); e (iii) uma CDR3 de cadeiapesada com pelo menos 90% de identidade de seqüência com PA-hCDR3:HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64) e o anticorpo ou o fragmento funcional domesmo pode se ligar especificamente ao antígeno protetor de B. anthracis.

Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou um fragmen-to funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende duas ou mais regi-ões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HC)selecionadas de (i) uma CDR1 de cadeia pesada com pelo menos 90% deidentidade de seqüência com PA-hCDR1: GYTFTSNAIQ (SEQ ID NO: 62);(ii) uma CDR2 de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade de se-qüência com PA-hCDR2: WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 63); e (iii)uma CDR3 de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade de se-qüência com PA-hCDR3: HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64) e o anticorpo ouo fragmento funcional do mesmo pode se ligar especificamente ao antígenoprotetor de B. anthracis. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpoisolado ou um fragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compre-ende três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeiapesada (HC) que consistem em (i) uma CDR1 de cadeia pesada com pelomenos 90% de identidade de seqüência com PA-hCDR1: GYTFTSNAIQ(SEQ ID NO: 62); (ii) uma CDR2 de cadeia pesada com pelo menos 90% deidentidade de seqüência com PA-hCDR2: WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQID NO: 63); e (iii) uma CDR3 de cadeia pesada com pelo menos 90% de i-dentidade de seqüência com PA-hCDR3: HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64) eo anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode se ligar especificamen-te ao antígeno protetor de B. anthracis. As composições de ácidos nucléicosque codificam o anticorpo ou as seqüências de fragmentos anteriores sãoadicionalmente fornecidas.

Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ouum fragmento funcional em que o anticorpo compreende três regiões de de-terminação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consis-tem em: (i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidadede seqüência com PA-1CDR1: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO: 59), (ii) umaCDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüência comPA-1CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 60) e (iii) uma CDR3 de cadeia levecom pelo menos 90% de identidade de seqüência com PA-1CDR3:QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61); e três regiões de determinação de comple-mentaridade (CDRs) de cadeia pesada que consistem em (i) uma CDR1 decadeia pesada com pelo menos 90% de identidade de seqüência com PA-hCDR1: GYTFTSNAIQ (SEQ ID NO: 62), (ii) uma CDR2 de cadeia pesadacom pelo menos 90% de identidade de seqüência com PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 63); e (iii) uma CDR3 de cadeiapesada com pelo menos 90% de identidade de seqüência com PA-hCDR3:HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64); e o anticorpo ou o fragmento funcional domesmo pode se ligar especificamente ao antígeno protetor de B. anthracis.

Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende um ou maisregiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC)selecionadas de (i) um PA-1CDR1 de cadeia leve: RASQSVSYSSLA (SEQID NO: 59); (ii) um PA-1CDR2 de cadeia leve: GASSRAT (SEQ ID NO: 60);e (iii) um PA-1CDR3 de cadeia leve: QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61) e o an-ticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode se ligar especificamente aoantígeno protetor de B. anthracis. Em algumas modalidades, é fornecido umanticorpo isolado ou um fragmento funcional do mesmo, em que o anticorpocompreende duas ou mais regiões de determinação de complementaridade(CDRs) de cadeia leve (LC) selecionadas de (i) um PA-1CDR1 de cadeialeve: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO: 59); (ii) um PA-1CDR2 de cadeia leve:GASSRAT (SEQ ID NO: 60); e (iii) um PA-1CDR3 de cadeia leve:QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61) e o anticorpo ou o fragmento funcional domesmo pode se ligar especificamente ao antígeno protetor de B. anthracis.

Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou um fragmen-to funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende três regiões de de-terminação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consis-tem em (i) um PA-1CDR1 de cadeia leve: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO:59); (ii) um PA-1CDR2 de cadeia leve: GASSRAT (SEQ ID NO: 60); e (iii) umPA-1CDR3 de cadeia leve: QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61) e o anticorpo ouo fragmento funcional do mesmo pode se ligar especificamente ao antígenoprotetor de B. anthracis. As composições de ácidos nucléicos que codificamo anticorpo ou as seqüências de fragmentos anteriores são adicionalmentefornecidas.

Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende uma oumais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pe-sada (HC) selecionadas de (i) um PA-hCDR1 de cadeia pesada: GYTFTS-NAIQ (SEQ ID NO: 62); (ii) um PA-hCDR2 de cadeia pesada:WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 63); e (iii) um PA-hCDR3 de cadeiapesada: HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64) e o anticorpo ou o fragmento fun-cional do mesmo pode se ligar especificamente ao antígeno protetor de B.anthracis. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende duas oumais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pe-sada (HC) selecionadas de (i) um PA-hCDR1 de cadeia pesada: GYTFTS-NAIQ (SEQ ID NO: 62); (ii) um PA-hCDR2 de cadeia pesada:WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 63); e (iii) um PA-hCDR3 de cadeiapesada: HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64) e o anticorpo ou o fragmento fun-cional do mesmo pode se ligar especificamente ao antígeno protetor de B.anthracis. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende três regiõesde determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HC) queconsistem em (i) um PA-hCDR1 de cadeia pesada: GYTFTSNAIQ (SEQ IDNO: 62); (ii) um PA-hCDR2 de cadeia pesada: WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO: 63); e (iii) um PA-hCDR3 de cadeia pesada: HRLQRGGFDP(SEQ ID NO: 64) e o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao antígeno protetor de B. anthracis. As composiçõesde ácidos nucléicos que codificam o anticorpo ou as seqüências de fragmen-tos anteriores são adicionalmente fornecidas.

Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ouum fragmento funcional em que o anticorpo compreende três regiões de de-terminação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consis-tem em: (i) um PA-1CDR1de cadeia leve: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO:59), (ii) um PA-1CDR2 de cadeia leve: GASSRAT (SEQ ID NO: 60) e (iii) umPA-1CDR3 de cadeia leve: QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61); e três regiõesde determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada que con-sistem em (i) um PA-hCDR1 de cadeia pesada: GYTFTSNAIQ (SEQ ID NO:62), (ii) um PA-hCDR2 de cadeia pesada: WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQID NO: 63); e (iii) um PA-hCDR3 de cadeia pesada: HRLQRGGFDP (SEQ IDNO: 64); e o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode se ligar es-pecificamente ao antígeno protetor de B. anthracis.

Em certas modalidades, um fragmento funcional de um anticorpoPA-1 é qualquer um de um fragmento funcional Fv, Fab, F(ab)2 ou scFV.Seqüência de DNA do cDNA de cadeia leve Kappa de huMAb LF-1:ATGTTGCCATCACAACTCATTGGGTTTCTGCTGCTCTGGGTTCCAGCCTCCAGGGGTGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGAGTCCAAAGGAGAAAGTCACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAGAGCGTTGGTAGTAGCTTACACTGGTACCAGCAGAAACCAGATCAGTCTCCAAAGCTCCTCATCAAGTATGCTTCCC AGTCCTTCTCAG G GGTCCCCTCG AG GTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATCAATAGCCTGGAAACTGAAGATGCTGCAACGTATTACTGTCATCAGAGTAGTAGTTTACCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTG

CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGG

AACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC

AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG

GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC

AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGC

TTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 49)

Seqüência de aminoácidos da cadeia leve Kappa do huMAb LF-1:

MLPSQLIGFLLLWVPASRGEIVLTQSPDFQSVSPKEKVTITCRASQSVGSSL

HWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLETEDAA

TYYCHQSSSLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 50)

As seqüências de CDR da cadeia leve Kappa do huMAb LF-1são representadas em negrito e correspondem aos resíduos de aminoácidos51-60 (LF-1CDR1), aos resíduos de aminoácidos 75-90 (LF-1CDR2) e aosresíduos de aminoácidos 124-133 (LF-1CDR3) da SEQ ID NO: 50.LF-1 CDR1: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65)LF-1 CDR2: YASQSFS (SEQ ID NO: 66)LF-1CDR3: HQSSSLPLT (SEQ ID NO: 67)Seqüência de DNA do cDNA de cadeia pesada Gama do huMAb LF-1:ATGGAGTTGGGGCTGTGCTGGCI I I I ICTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTTCTGGCTCTGGATTCATGTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGAATTAGTGGTAGCGGTGGTACTACAAACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATATGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATGGGGTATATGGCCGACTGGGGGGTTCTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCAGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT

GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT

CCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT

GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT

GAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAA

ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC

CTG GGG G G ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAG G ACACC

CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG

AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG

GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGC

ACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG

AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC

CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA

CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAG

GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC

GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC

GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC

CGTGATGCATGAGGGTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC

CCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 51)

Seqüência de aminoácidos da cadeia pesada Gama do huMAb LF-1:

MELGLCWLFLVAILKGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCSGSGFMFSS

YAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGTTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLY

MQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVYGRLGGSDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV

FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS

SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP

PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY

VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL

PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EGLHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 52)

As seqüências de CDR da cadeia pesada Gama do huMAb LF-1são representadas em negrito e correspondem aos resíduos de aminoácidos51-60 (LF-hCDR1), aos resíduos de aminoácidos 75-90 (LF-hCDR2) e aosresíduos de aminoácidos 124-133 (LF-hCDR3) da SEQ ID NO: 52.

LF-hCDR1: GFMFSSYAMS (SEQ ID NO: 68)

LF-hCDR2: GISGSGGTTNYADSVKG (SEQ ID NO: 69)

LF-hCDR3: DGVYGRLGGSDY (SEQ ID NO: 70)

Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende uma oumais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve(LC) selecionadas de (i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% deidentidade de seqüência com LF-1CDR1: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65),(ii) uma CDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de se-qüência com LF-1CDR2: YASQSFS (SEQ ID NO: 66); e (iii) uma CDR3 decadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüência com LF-1CDR3: HQSSSLPLT (SEQ ID NO: 67) e o anticorpo ou o fragmento funcio-nal do mesmo pode se ligar especificamente ao fator letal de B. anthracis.

Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou um fragmen-to funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende duas ou mais regi-ões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC)selecionadas de (i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-1 CDR1: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65), (ii)uma CDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüênciacom LF-1CDR2: YASQSFS (SEQ ID NO: 66) e (iii) uma CDR3 de cadeialeve com pelo menos 90% de identidade de seqüência com LF-1CDR3:HQSSSLPLT (SEQ ID NO: 67) e o anticorpo ou o fragmento funcional domesmo pode se ligar especificamente ao fator letal de B. anthracis. Em al-gumas modalidades, è fornecido um anticorpo isolado ou um fragmento fun-cional do mesmo, em que o anticorpo compreende três regiões de determi-nação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consistem em(i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de se-qüência com LF-1CDR1: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65), (ii) uma CDR2de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüência com LF-1CDR2: YASQSFS (SEQ ID NO: 66) e (iii) uma CDR3 de cadeia leve compelo menos 90% de identidade de seqüência com LF-1CDR3: HQSSSLPLT(SEQ ID NO: 67); e o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao fator letal de B. anthracis. As composições de áci-dos nucléicos que codificam o anticorpo ou as seqüências de fragmentosanteriores são adicionalmente fornecidas.

Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende uma oumais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pe-sada (HC) selecionadas de (i) uma CDR1 de cadeia pesada com pelo menos90% de identidade de seqüência com LF-hCDR1: GFMFSSYAMS (SEQ IDNO: 68); (ii) uma CDR2 de cadeia pesada com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-hCDR2: GISGSGGTTNYADSVKG (SEQ ID NO:69); e (iii) uma CDR3 de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidadede seqüência com LF-hCDR3: DGVYGRLGGSDY (SEQ ID NO: 70) e o anti-corpo ou o fragmento funcional do mesmo pode se ligar especificamente aofator letal de B. anthracis. Em algumas modalidades, é fornecido um anticor-po isolado ou um fragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo com-preende duas ou mais regiões de determinação de complementaridade (C-DRs) de cadeia pesada (HC) selecionadas de (i) uma CDR1 de cadeia pe-sada com pelo menos 90% de identidade de seqüência com LF-hCDR1:GFMFSSYAMS (SEQ ID NO: 68); (ii) uma CDR2 de cadeia pesada com pelomenos 90% de identidade de seqüência com LF-hCDR2: GISGSGGTTN-YADSVKG (SEQ ID NO: 69); e (iii) uma CDR3 de cadeia pesada com pelomenos 90% de identidade de seqüência com LF-hCDR3: DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO: 70) e o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao fator letal de B. anthracis. Em algumas modalida-des, é fornecido um anticorpo isolado ou um fragmento funcional do mesmo,em que o anticorpo compreende três regiões de determinação de comple-mentaridade (CDRs) de cadeia pesada (HC) que consistem em (i) uma C-DR1 de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade de seqüênciacom LF-hCDR1: GFMFSSYAMS (SEQ ID NO: 68); (ii) uma CDR2 de cadeiapesada com pelo menos 90% de identidade de seqüência com LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG (SEQ ID NO: 69); e (iii) uma CDR3 de cadeia pe-sada com pelo menos 90% de identidade de seqüência com LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY (SEQ ID NO: 70) e o anticorpo ou o fragmento funcionaldo mesmo pode se ligar especificamente ao fator letal de B. anthracis. Ascomposições de ácidos nucléicos que codificam o anticorpo ou as seqüên-cias de fragmentos anteriores são adicionalmente fornecidas.

Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ouum fragmento funcional em que o anticorpo compreende três regiões de de-terminação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consis-tem em: (i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidadede seqüência com LF-1CDR1: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65), (ii) umaCDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüência comLF-1CDR2: YASQSFS (SEQ ID NO: 66); e (iii) uma CDR3 de cadeia levecom pelo menos 90% de identidade de seqüência com LF-1CDR3: HQSSS-LPLT (SEQ ID NO: 67) e três regiões de determinação de complementarida-de (CDRs) de cadeia pesada que consistem em (i) uma CDR1 de cadeiapesada com pelo menos 90% de identidade de seqüência com LF-hCDR1:GFMFSSYAMS (SEQ ID NO: 68); (ii) uma CDR2 de cadeia pesada com pelomenos 90% de identidade de seqüência com LF-hCDR2: GISGSGGTTN-YADSVKG (SEQ ID NO: 69); e (iii) uma CDR3 de cadeia pesada com pelomenos 90% de identidade de seqüência com LF-hCDR3: DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO: 70) e o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao fator letal de B. anthracis.

Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende uma oumais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve(LC) selecionadas de (i) um LF-1CDR1 de cadeia leve: RASQSVGSSLH(SEQ ID NO: 65), (ii) um LF-1CDR2 de cadeia leve: YASQSFS (SEQ ID NO:66); e (iii) um LF-1CDR3 de cadeia leve: HQSSSLPLT (SEQ ID NO: 67) e oanticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode se ligar especificamenteao fator letal de B. anthracis. Em algumas modalidades, é fornecido um anti-corpo isolado ou um fragmento funcional do mesmo, em que o anticorpocompreende duas ou mais regiões de determinação de complementaridade(CDRs) de cadeia leve (LC) selecionadas de (i) um LF-1CDR1 de cadeialeve: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65), (ii) um LF-1CDR2 de cadeia leve:YASQSFS (SEQ ID NO: 66) e (iii) um LF-1CDR3 de cadeia leve: HQSSSL-PLT (SEQ ID NO: 67) e o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo po-de se ligar especificamente ao fator letal de B. anthracis. Em algumas moda-lidades, é fornecido um anticorpo isolado ou um fragmento funcional domesmo, em que o anticorpo compreende três regiões de determinação decomplementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consistem em (i) umLF-1CDR1 de cadeia leve: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65), (ii) um LF-1CDR2 de cadeia leve: YASQSFS (SEQ ID NO: 66) e (iii) um LF-1CDR3 decadeia leve: HQSSSLPLT (SEQ ID NO: 67); e o anticorpo ou o fragmentofuncional do mesmo pode se ligar especificamente ao fator letal de S. ant-hracis. As composições de ácidos nucléicos que codificam o anticorpo ou asseqüências de fragmentos anteriores são adicionalmente fornecidas.

Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende uma oumais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pe-sada (HC) selecionadas de (i) um LF-1CDR1 de cadeia pesada: GFMFSS-YAMS (SEQ ID NO: 68); (ii) um LF-1CDR2 de cadeia pesada:GISGSGGTTNYADSVKG (SEQ ID NO: 69); e (iii) um LF-1CDR3 de cadeiapesada: DGVYGRLGGSDY (SEQ ID NO: 70) e o anticorpo ou o fragmentofuncional do mesmo pode se ligar especificamente ao fator letal de B. ant-hracis. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende duas oumais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pe-sada (HC) selecionadas de (i) um LF-1CDR1 de cadeia pesada: GFMFSS-YAMS (SEQ ID NO:68); (ii) um LF-1CDR2 de cadeia pesada:GISGSGGTTNYADSVKG (SEQ ID NO: 69); e (iii) um LF-1CDR3 de cadeiapesada: DGVYGRLGGSDY (SEQ ID NO: 70) e o anticorpo ou o fragmentofuncional do mesmo pode se ligar especificamente ao fator letal de B. ant-hracis. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ou umfragmento funcional do mesmo, em que o anticorpo compreende três regiõesde determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HC) queconsistem em (i) um LF-1CDR1 de cadeia pesada: GFMFSSYAMS (SEQ IDNO: 68); (ii) um LF-1CDR2 de cadeia pesada: GISGSGGTTNYADSVKG(SEQ ID NO: 69); e (iii) um LF-1CDR3 de cadeia pesada: DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO: 70) e o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao fator letal de B. anthracis. As composições de áci-dos nucléicos que codificam o anticorpo ou as seqüências de fragmentosanteriores são adicionalmente fornecidas.

Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado ouum fragmento funcional em que o anticorpo compreende três regiões de de-terminação de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consis-tem em: (i) um LF-1CDR1 de cadeia leve: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO:65), (ii) um LF-1CDR2 de cadeia leve: YASQSFS (SEQ ID NO: 66); e (iii) umLF-1CDR3 de cadeia leve: HQSSSLPLT (SEQ ID NO: 67) e três regiões dedeterminação de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada que consis-tem em (i) um LF-1CDR1 de cadeia pesada: GFMFSSYAMS (SEQ ID NO:68); (ii) um LF-1CDR2 de cadeia pesada: GISGSGGTTNYADSVKG (SEQ IDNO: 69); e (iii) um LF-1CDR3 de cadeia pesada: DGVYGRLGGSDY (SEQ IDNO: 70) e o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode se ligar es-pecificamente ao fator letal de B. anthracis.

Em certas modalidades, um fragmento funcional do anticorpoLF-1 é qualquer um de um fragmento funcional Fv, Fab, F(ab)2 ou scFV.

Composições de Anticorpos e Veículos e Métodos de Fornecimento

A invenção fornece composições de anticorpos que compreen-dem um ou mais anticorpos preparados de acordo com os métodos da in-venção. Uma "composição de anticorpos" se refere a uma composição quecompreende um ou mais anticorpos ou fragmento(s) funcional(ais) dosmesmos e, opcionalmente, qualquer componentes do sistema de produçãoque não são removidos durante o processo de purificação do anticorpo. As-sim, será considerado que uma primeira composição de anticorpos quecompreende um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo preparadoatravés da expressão de um cDNA isolado utilizando os iniciadores de oligo-nucleotídeos da invenção em um sistema de expressão de escolha, por e-xemplo, um sistema de expressão baseado em planta, pode não ser identi-cal a uma segunda composição de anticorpos que compreende o mesmoanticorpo em que a segunda composição de anticorpos é preparada utilizan-do um sistema de expressão diferente. Por exemplo, uma composição deanticorpos que compreende um anticorpo produzido por um hibridoma man-tido em cultura de tecido pode conter componentes residuais encontrados nomeio de cultura de tecido, enquanto que um anticorpo produzido utilizandoum sistema de expressão baseado em planta não conteria geralmente certosdestes componentes. Assim, em certas modalidades as composições de an-ticorpos da invenção são distintas de outras composições de anticorpos quecontêm o mesmo anticorpo ou anticorpos.

Em algumas modalidades é fornecido um ou mais anticorpospreparados de acordo com os métodos da invenção em uma composiçãofarmacêutica adequada para a administração a um indivíduo com a finalida-de de diagnóstico e/ou terapêutica, em que "finalidades terapêuticas" sãoentendidas como incluindo finalidades profiláticas (isto é, a administraçãoantes que qualquer sinal ou sintoma de uma doença ou estado de saúdetenha ocorrido) e finalidades de tratamento (isto é, administração após umou mais sinais ou sintomas de uma doença ou estado de saúde terem ocor-rido). Os anticorpos da invenção podem, sem limitação, ser utilizados paradiagnóstico, profilaticamente e/ou para o tratamento de doenças infecciosas(por exemplo, doença bacteriana, viral, fúngica ou parasitária), câncer (cujotermo abrange carcinomas, sarcomas, limfoma, leucemia, síndromes mielo-displásicas, tumores benigos etc.), estados de saúde inflamatórios, distúr-bios caracterizados por angiogênese indesejável, rejeição a transplantes,doença de enxerto vs hospedeiro etc. Outras aplicações para os anticorposda invenção incluem a diminuição imunológica in vitro de células indesejadastais como células cancerosas, linfócitos etc. Os anticorpos também podemser utilizados para direcionar outros agentes (por exemplo, um agente paradiagnóstico ou terapêutico) para um local no corpo em que o antígeno reco-nhecido pelo anticorpo é expresso.

Preparações adequadas, por exemplo, preparações substanci-almente puras dos anticorpos podem ser combinadas com veículos, diluen-tes, solventes farmaceuticamente aceitáveis etc., para a produção de umacomposição farmacêutica apropriada. A invenção fornece, portanto, umavariedade de composições farmaceuticamente aceitáveis para a administra-ção a um indivíduo que compreende (i) um anticorpo; e (ii) um veículo ou umadjuvante farmaceuticamente aceitável. Deve ser entendido que as compo-sições farmacêuticas da invenção, quando administradas a um indivíduo,são preferencialmente administradas durante um período de tempo e emuma quantidade suficiente para tratar ou prevenir a doença ou o estado desaúde para tal tratamento ou prevenção são administradas.

Em várias modalidades da invenção é administrada uma quanti-dade eficiente da composição farmacêutica a um indivíduo através de qual-quer rota de administração adequada incluindo, mas não limitada a intrave-nosa, intramuscular, por inalação, por cateter, de forma intraocular, oral, re-tal, intradermal, por aplicação na pele etc.

As composições da invenção podem ser formuladas para o for-necimento através de qualquer rota disponível incluindo, mas não limitada àsrotas parenteral, oral, por inalação nos pulmões, nasal, bronquial, oftálmica,transdermal (tópica), transmucosa, retal e vaginal. O termo "parenteral" co-mo utilizado aqui inclui técnicas de injeção ou de infusão subcutânea, intra-venosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intrasternal, intratecal,intrahepática, intralesional e intracraniana.

O termo "veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável" serefere a um veículo ou um adjuvante não tóxico que não destrói a atividadefarmacológica do composto com o qual é formulado. Os veículos ou os adju-vantes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados nas composi-ções desta invenção incluem, mas não estão limitados a trocadores de íons,alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas do soro, tal como a albu-mina do soro humano, substâncias tamponantes tais como fosfatos, glicina,ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeos parciais de áci-dos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato deprotamina, bifosfato dissódico, bifosfato de potásio, cloreto de sódio, sais dezinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substân-cias à base de cellulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, po-liacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno-polioxipropileno, polieti-leno glicol e gordura de lã. Os solventes, os meios de dispersão, os revesti-mentos, os agentes antibacterianos e antifúngicos, os agentes isotônicos ede retardo da absorção e similares, compatíveis com a administração farma-cêutica podem ser incluídos. Compostos ativos suplementares, por exemplo,compostos independentemente ativos contra a doença ou o estado de saúdeclínico que será tratado ou compostos que aumentam a atividade de umcomposto, podem também ser incorporados nas composições.

Sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta inven-ção incluem aqueles derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicosfarmaceuticamente aceitáveis. Os exemplos de sais ácidos adequados in-cluem acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato,bissulfato, butirato, citrato, camforato, camforsulfonato, ciclopentanopropio-nato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formiato, fumarato, gluco-heptanoato, glicerofosfato, glicolato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato,cloridrato, bromidrato, iodidrato, 2-hidroxietanossulfonato, lactato, maleato,malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oxala-to, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivala-to, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, tosilato eundecanoato. Outros ácidos, tal como o oxálico, embora não sejam por si sófarmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregados na preparação desais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção eseus sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis.

Os sais derivados de bases apropriadas incluem sais de metaisalcalinos (por exemplo, de sódio e de potássio), de metais alcalinos-terrosos(por exemplo, magnésio), amônio e N+(C1-4 aquil)4. Esta invenção tambémprevê a quaternização de quaisquer grupos básicos contendo nitrogênio doscompostos descritos aqui. Produtos solúveis ou que podem ser dispersosem água ou em óleo podem ser obtidos através de tal quaternização.

Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatívelcom sua rota pretendida de administração. As soluções ou as suspensõesutilizadas para aplicação parenteral (por exemplo, intravenosa), intramuscu-lar, intradermal ou subcutânea podem incluir os componentes a seguir: umdiluente esterilizado tal como água para injeção, solução salina, oleos fixos,polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos;agentes antibacterianos tal como álcool benzílico ou metil parabenos; antio-xidantes tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantestal como o ácido etilenodiaminatetraacético; tampões tais como acetatos,citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade tal como cloreto desódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tal comoácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser in-serida em ampolas, seringas descartáveis ou frascos com várias doses fei-tos de vidro ou de plástico.

As composições farmacêuticas adequadas para o uso injetávelincluem tipicamente soluções aquosas esterilizadas (quando solúveis emágua) ou disperses e pós esterilizados para a preparação extemporânea desoluções ou disperses injetáveis esterilizadas. Para a administração intrave-nosa, os veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacte-riostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ), solução salina tampona-da com fosfato (PBS) ou solução de Ringer.

Os óleos fixos esterilizados, são convencionalmente aplicadoscomo um solvente ou um meio de suspensão. Para esta finalidade, qualqueróleo fixo brando pode ser empregado incluindo mono ou diglicerídeos sinté-ticos. Os ácidos graxos, tal como o ácido oléico e seus derivados de glicerí-deo são úteis na preparação de produtos injetáveis, uma vez que são óleosfarmaceuticamente aceitáveis naturais, tal como azeite de oliva ou óleo demamona, especialmente em suas versões polioxietiladas. Estas soluções oususpensões oleosas também podem conter um diluente ou um agente dedispersão de álcool de cadeia longa, tal como carboximetil celulose ou agen-tes de dispersão similares que são comumente utilizados na formulação deformas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões esuspensões. Outros tensoativos comumente utilizados, tais como Tweens,Spans e outros agentes emulsificantes ou intensificadores da disponibilidadebiológica que são comumente utilizados na produção de formas de dosagemsólidas, líquidas ou outras farmaceuticamente aceitáveis também podem serutilizados para a finalidade de formulação.

Em todos os casos, a composição deve ser esterilizada, se pos-.sível e deve ser fluida até a extensão que exista fácil propriedade de ser uti-lizada com seringa.

As formulações farmacêuticas preferidas são estáveis sob ascondições de produção e de armazenamento e têm que ser preservadascontra a ação contaminante de microorganismos tais como bactérias e fun-gos. Em geral, o veículo relevante pode ser um solvente ou um meio de dis-persão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol,propileno glicol e polietileno glicol líquido e similares) e misturas adequadasdos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, atravésdo uso de um revestimento tal como Iecitinar através da manutenção do ta-manho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de ten-soativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser conseguidaatravés de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, para-benos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitoscasos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, po-liálcoois tal como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absor-ção de composições injetáveis pode ser realizada através da inclusão nacomposição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestea-rato de alumínio e gelatina. A absorção prolongada de composições oraispode ser conseguida através de vários meios incluindo o encapsulamento.

As soluções injetáveis esterilizadas podem ser preparadas atra-vés da incorporação do composto ativo na quantidade necessária em umsolvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumera-dos anteriormente, quando necessário, seguida por esterilização por filtra-ção. Preferencialmente as soluções para injeção são isentas de endotoxina.Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação docomposto ativo em um veículo esterilizado que contém um meio de disper-são básico e os outros ingredientes necessários partindo daqueles enume-rados anteriormente. No caso de pós esterilizados para a preparação de so-luções injetáveis esterilizadas, os métodos preferidos de preparação sãosecagem a vácuo e secagem por congelamento que fornecem um pó do in-grediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional partindo deuma solução previamente esterilizada por filtração do mesmo.

As composições orais incluem geralmente um diluente inerte eum veículo comestível. Para a finalidade de administração terapêutica oral, ocomposto ativo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na formade comprimidos, pastilhas ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina.As composições orais também podem ser preparadas utilizando um fluidoveículo para uso como um líquido para limpeza bucal. Os agentes de ligaçãoe/ou os materiais adjuvantes farmaceuticamente compatíveis podem ser in-cluídos como parte da composição. Os comprimidos, as pílulas, as cápsulas,as pastilhas e similares podem conter qualquer um dos ingredientes oucompostos a seguir de uma natureza similar: um agente aglutinante tal comocelulose microcristalina, goma adragante ou gelatina; um excipiente tal comoamido ou lactose, um agente de desintegração tal como ácido algínico, Pri-mogel ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ouSterotes; um agente de deslizamento tal como dioxide de silício coloidal; umagente adoçante tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizantetal como hortelã-pimenta, salicilato de metila ou aromatizante de laranja. Asformulações para fornecimento oral podem vantajosamente incorporar agen-tes para aumentar a estabilidade dentro do trato gastrointestinal e/ou paraaumentar a absorção.

Para a administração por inalação, as composições da invençãosão preferencialmente fornecidas na forma de um spray em aerossol partin-do de um recipiente ou um distribuidor pressurizado que contém propelenteadequado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono ou um nebuli-zador. O aerossol líquido ou seco (por exemplo, pós secos, partículas poro-sas grandes etc.) pode ser utilizado. A presente invenção considera ainda ofornecimento de composições utilizando um spray nasal.

Para as aplicações tópicas, as composições farmaceuticamenteaceitáveis podem ser formuladas em um ungüento adequado contendo ocomponente ativo suspenso ou dissolvido em um ou mais veículos. Os veí-culos para a administração tópica dos compostos desta invenção incluem,mas não estão limitados a óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco,propileno glicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsifi-cante e água. Alternativamente, as composições farmaceuticamente aceitá-veis podem ser formuladas em uma loção ou um creme adequado contendoos componentes ativos suspensos ou dissolvidos em um ou mais veículosfarmaceuticamente aceitáveis. Os veículos adequados incluem, mas nãoestão limitados a óleo mineral, monostearato de sorbitano, polissorbato 60,cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2doctildodecanol, álcool benzíli-co e água.

Para o fornecimento local nos olhos, as composições farmaceu-ticamente aceitáveis podem ser formuladas na forma de suspensões micro-nizadas em solução salina esterilizada isotônica com o pH ajustado ou, pre-ferencialmente, na forma de soluções em solução salina esterilizada isotôni-ca com o pH ajustado, corn ou sem um conservante tal como cloreto de ben-zil alcônio. Alternativamente, para usos oftálmicos, as composições farma-ceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em um ungüento tal comopetrolato.

As composições farmaceuticamente aceitáveis desta invençãotambém podem ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais com-posições são preparadas de acordo com técnicas bem-conhecidas na técni-ca de formulação farmacêutica e podem ser preparadas na forma de solu-ções em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservan-tes adequados, promotores de absorção para aumentar a disponibilidadebiológica, fluorocarbonos e/ou outros agentes solubilizantes ou de dispersãoconvencionais.A administração sistêmica também pode ser através de meiostransmucosa ou transdermais. Para a administração transmucosa ou trans-dermal, são utilizados na formulação agentes de penetração apropriadospara a barreira que será permeada. Tais agentes de penetração são geral-mente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para a administraçãotransmucosa, detergentes, sais biliares e derivados do ácido fusídico. A ad-ministração transmucosa pode ser realizada através do uso de sprays nasaisou de supositórios. Para a administração transdermal, os anticorpos sãoformulados em ungüentos, pomadas, géis ou cremes como é geralmenteconhecido na técnica.

As composições de anticorpos também podem ser preparadasna forma de supositórios (por exemplo, com bases para supositório conven-cionais tais como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas deretenção para o fornecimento retal.

Em adição aos agentes descritos anteriormente, em certas mo-dalidades da invenção, âs composições de anticorpos são preparadas comveículos que protegerão os anticorpos contra a eliminação rápida do corpo,tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sis-temas de fornecimento microencapsulados. Podem ser utilizados polímerosbiocompatíveis biodegradáveis, tais como vinil acetato de etileno, polianidri-dos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, poliéteres e ácido polilácti-co. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes aosversados na técnica. Certos dos materiais podem também ser obtidos co-mercialmente na Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspen-sões lipossomais podem também ser utilizadas como veículos farmaceuti-camente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodosconhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, como descrito na Pa-tente U.S. Ne 4.522.811 e outras referências listadas aqui. Os lipossomos,incluindo lipossomos direcionados (por exemplo, lipossomos direcionados aoanticorpo) e lipossomos peguilados foram descritos (Hansen CB e outros,Biochim Biophys Acta. 1239(2): 133-44, 1995; Torchilin VP e outros, BiochimBiophys Acta, 1511 (2): 397-411, 2001; Ishida T e outros, FEBS Lett. 460(1):129-33, 1999). Um versado na técnica considerará que os materiais e osmétodos selecionados para a preparação de uma formulação, um implantede liberação controlada etc., devem ser tais que mantenham a atividade doanticorpo. Por exemplo, pode ser desejável evitar o aquecimento excessivode polipeptídeos tais como anticorpos, que poderia lever à desnaturação e àperda da atividade.

É tipicamente vantajoso formular composições orais ou parente-rais na forma de dosagem unitária para a facilidade de administração e uni-formidade de dosagem. A forma de dosagem unitária, como utilizado aqui,se refere a unidades fisicamente distintas apropriadas como dosagens unitá-rias para o indivíduo que será tratado; cada unidade contendo uma quanti-dade predeterminada de anticorpo calculada para produzir o efeito terapêuti-co desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido.

A toxicidade e a eficiência terapêutica de tais composições po-dem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padroniza-dos em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para adeterminação da LDs0 (a dose letal para 50% da população) e da ED5O (adose terapeuticamente eficiente em 50% da população). A proporção de do-se entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode serexpresso na forma da proporção de LD50/ ED50. São preferidas as composi-ções que exibem altos índices terapêuticos. Embora as composições queexibem efeitos colaterais tóxicos possam ser utilizadas, deve-se tomar cui-dado para planejar um sistema de fornecimento que direciona tais composi-ções para o local do tecido afetado a fim de minimizar os danos potenciaisnas células não afetadas e, dessa maneira, reduzir os efeitos colaterais.

Os dados obtidos partindo dos ensaios de cultura de células ede estudos com animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa dedosagem para uso em seres humanos. A dosagem fica preferencialmentedentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 compouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixadependendo da forma de dosagem empregada e da rota de administraçãoutilizada. Para qualquer anticorpo ou outro composto utilizado no método dainvenção, a dose terapeuticamente eficiente pode ser estimada inicialmentepartindo de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada emmodelos de animais para atingir uma faixa de concentração no plasma circu-lante que inclui a ED50 como determinado na cultura de células. Tal informa-ção pode ser utilizada para determinar de forma mais acurada as doses úteisem seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo,através de cromatografia líquida de alto desempenho.

Uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma composiçãofarmacêutica varia tipicamente de aproximadamente 0,001 até 100 mg/kg depeso corporal, preferencialmente de aproximadamente 0,01 até 25 mg/kg depeso corporal, mais preferencialmente de aproximadamente 0,1 até 20mg/kg de peso corporal e ainda mais preferencialmente de aproximadamen-te 1 até 10 mg/kg, 2 até 9 mg/kg, 3 até 8 mg/kg, 4 até 7 mg/kg ou 5 até 6mg/kg de peso corporal. A composição farmacêutica pode ser administradaem vários intervalos e ao longo de períodos de tempo diferentes quando ne-cessário, por exemplo, várias vezes ao dia, diariamente, em dias alternados,uma vez por semana durante entre aproximadamente 1 até 10 semanas,entre 2 até 8 semanas, entre aproximadamente 3 até 7 semanas, aproxima-damente 4, 5 ou 6 semanas etc. O versado na técnica considerará que cer-tos fatores podem influenciar a dosagem é a sincronia necessária para tratareficientemente um indivíduo, incluindo, mas não limitados à gravidade dadoença ou do distúrbio, a tratamentos anteriores, à saúde geral e/ou à idadedo indivíduo e a outras doenças presentes. Geralmente, o tratamento de umindivíduo com uma composição da invenção pode incluir um único tratamen-to ou, em muitos casos, pode incluir uma série de tratamentos. Será consi-derado que uma faixa de combinações de dosagem diferentes (isto é, dosesde dois ou mais anticorpos ou um ou mais anticorpos e um ou mais agentesativos adicionais) pode ser utilizada.

Os exemplos de doses incluem quantidades em miligrama oumicrograma dos anticorpos por quilograma de peso do indivíduo ou da a -mostra (por exemplo, aproximadamente 1 micrograma por quilograma atéaproximadamente 500 miligramas por quilograma, aproximadamente 100microgramas por quilograma até aproximadamente 5 miligramas por quilo-grama ou aproximadamente 1 micrograma por quilograma até aproximada-mente 50 microgramas por quilograma). Para a administração local (por e-xemplo, intranasal), doses muito menores que estas podem ser utilizadas. É,além disso, entendido que as doses apropriadas dependem da potência doagente e podem opcionalmente ser adaptada para o receptor particular, porexemplo, através da administração de doses crescentes até uma respostapré-selecionada desejada ser atingida. É entendido que o nível de dose es-pecífica para qualquer indivíduo particular pode depender de uma variedadede fatores incluindo a atividade do composto específico empregado, a idade,o peso corporal, a saúde geral, o gênero e a dieta do indivíduo, o tempo deadministração, a rota de administração, a taxa de excreção, qualquer combi-nação de fármacos e o grau de expressão ou de atividade que será modulado.

A invenção fornece ainda composições farmacêuticas que com-preendem dois ou mais anticorpos da invenção e, opcionalmente, um oumais agentes ativos adicionais.

Exemplos

Os Exemplos abaixo descrevem cDNAs que foram clonados delinhagens de células de hibridoma humano que produzem anticorpos que seligam especificamente à proteína PA ou LF de B. anthracis. Os cDNAs paraas cadeias pesada e leve humanas de anticorpo monoclonal que reconheceespecificamente PA (denominado aqui PA) ou LF (denominado aqui LF) fo-ram isolados de linhagens de células de hibridoma que foram geradas par-tindo de células isoladas de um paciente humano imunizado com uma vaci-na para antraz licenciada.

Exemplo 1: Isolamento de cDNAs que Codificam Anticorpos MonoclonaisHumanos partindo de Hibridomas

Este exemplo descreve o uso de alguns dos iniciadores de oli-gonucleotídeos listados na Tabela 1 para isolar cDNAs que codificam anti-corpos monoclonais humanos. Todos os kits foram utilizados de acordo comas diretrizes do fabricante.Purificação do RNA partindo de linhagens de células de hibridoma.

O RNA total foi purificado partindo de 105 células de qualquerlinhagem de células de hibridoma fornecida utilizando o RNeasy Mini Kit (Qi-agen). O RNA foi eluído em 50 pL de água (não foi calculado o rendimento)e 5 μι. foram utilizados em cada reação de RT-PÇR.

PCR com Transcrição Inversa.

Os iniciadores utilizados para a RT-PCR estão listados na Tabe-la 1. A RT-PCR foi realizada com Superscript One-Step RT-PCR com Plati-num Taq DNA polimerase (Invitrogen). Para direcionar eficientemente todasas regiões variáveis possíveis em uma certa seqüência de cadeia pesada ouleve foi utilizada uma combinação de iniciadores para cada reação da RT-PCR e várias reações da RT-PCR foram realizadas simultaneamente para aamplificação de cada gene de anticorpo.

Para as cadeias pesadas, 2 μΜ de cada um dos iniciadoresVG1+7 curto, VG2 curto e VG3 curto foram combinados com 2 μΜ do inicia-dor gama constante curto (CG curto) em uma reação e 2 μΜ de cada um dosiniciadores VG4-curto, VG5-curto e VG6-curto foram combinados com 2 μΜdo iniciador gama constante curto (CG-curto) em uma segunda reação.Qualquer produto foi então purificado utilizando Qiaex Il (Qiagen) e, se oproduto viesse da primeira reação inicial, era reamplificado com 2 μΜ de ca-da um dos iniciadores VG1, VG2 e VG3 em combinações com 2 μΜ do inici-ador CG ou, se o produto viesse da segunda reação de RT-PCR, era ream-plificado com 2 μΜ de cada um dos iniciadores VG4, VG5 e VG6 em combi-nações com 2 μΜ do iniciador CG utilizando Platinum PCR SuperMix HighFidelity (Invitrogen) para introduzir sítios de restrição de Sfi I a 5' e a 3' dife-rentes.

Para as cadeias leves, o rendimento do produto da RT-PCR erasempre suficiente para a subclonagem imediata do produto, eliminando as-sim a necessidade de uma RT-PCR inicial com iniciadores curtos. Ao invésde 2 μΜ, cada um dos três iniciadores de região variável foi combinado com2 μΜ do iniciador de região constante (Tabela 1), resultando em três reaçõesseparadas para lâmbada e duas reações separadas para as cadeias levekappa. Especificamente, as reações continham 2 ou três iniciadores variá-veis, como a seguir:

CK + VK1, 2+1.8 e 3

CK + VK 4 e 5

CL + VL1, 2 e 3

CL + VL4, 5 e 6+9

CL + VL7 e 10+8

Será considerado que outras combinações poderiam ter sidoutilizadas.

As condições de ciclos da PCR foram adaptadas de Krebber, A.,Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard1 H.R. ePluckthun1 A. (1997). Reliable cloning of funcional antibody variable domainsfrom hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered pha-ge display system. J Immunol Methods 201, 35-55. Para a RT-PCR as con-dições de ciclos eram as seguintes: 30 min a 45 °C, 2 min a 94 °C, sete ci-clos de: 1 min a 94 °C, 30 s a 63 °C, 50 s a 58 °C, 3 min a 72 °C e 33 ciclosde: 1 min a 94 °C, 1 min a 63 °C e 3 min a 72 °C, seguidos por 7 min a 72°C.Para a PCR regular (sem ser RT-PCR) as etapas iniciais de 30 min a 45°C e2 min a 94 °C foram omitidas.

Os produtos da amplificação foram clonados no vetor bínáriopBISfi, cuja constructo é descrita no Exemplo 2.

Exemplo 2: Constructo do vetor pBISfi

Este exemplo descreve a modificação do vetor binário pBI121para facilitar seu uso para a expressão de anticorpos em plantas. Primeira-mente, o sítio de Sfi I interno a 11031 pb do vetor pBI121 sofreu mutagênesecomo a seguir: o vetor foi digerido com Sfi I e as pontas coesivas de filamen-to simples resultantes foram preenchidas utilizando Klenow e as extremida-des cegas resultantes foram religadas. Para crier um único sítio de Sfi I a 5'os oligonucleotídeos BamSfi 1 (5'-GATCCGGCCCAGCCGGCCG-3'; SEQ IDNO: 53) e BamSfi 2 (5'-GATCCGGCCGGCTGGGCCG-3'; SEQ ID NO: 54)foram anelados um no outro e ligados no sítio de BamH I do vetor pBI121(faltando o sítio interno de Sfi I). Similarmente, o anelamento dos oligonucle-otídeos SacSfi 1 (5'-GCCTCGGGGGCCGAGCT-3'; SEQ ID NO: 55) e SacS-fi 2 (5'-GCCCCCGAGGCCGAGCT-3'; SEQ ID NO: 56) e a ligação dentro dosítio de Sac I do pBI121 (faltando o sítio interno de Sfi I) criaram um únicosítio de Sfi I a 3'.

Exemplo 3: Mutaaênese do cDNA que Codifica a cadeia pesada do anticor-po PA.

O cDNA que codifica a cadeia gama de PA sofreu mutagêneseutilizando o lnvitrogen's GeneTaiIor kit de acordo com as recomendações dofabricante de forma a alterar o sítio de N-glicosilação na posição 318 da ca-deia gama de PA. Foi utilizado o iniciador mutante a seguir: 5'-ccgcgggaggagcagtacCAAagcacgtaccgt-3' (SEQ ID NO: 57). O iniciador in-verso era: gtactgctcctcccgcggctttgtcttggca (SEQ ID NO: 58). Como um resul-tado da mutagênese, o códon AAC foi substituído por um códon CAA1 resul-tando em uma alteração Asn->Gln.

Exemplo 4: Produção do anticorpo PA Glicosilado e Não Glicosilado emplantas.

O anticorpo PA glicosilado e não glicosilado (PA e PANG, res-pectivamente) foram purificados partindo de folhas de plantas de Nicotianabenthamiana após a agroinfiltração com uma mistura 1:1 de culturas de A-grobacterium carregando os cDNAs de cadeia leve ou pesada sob o promo-tor 35S em pBISfil. Os anticorpos foram purificados utilizando cromatografiaem gel A e T de proteína e comparados utilizando SDS-PAGE. A figura 1mostra uma imagem do gel, que demonstra claramente uma diferença namobilidade eletroforética de cadeias pesadas de PANG por causa da falta deglicosilação, isto é, a cadeia pesada de PANG migra mais rápido que a ca-deia pesada de PA uma vez que é mais leve. Análises de Western blot eELISA confirmaram a atividade de ligação específica dos anticorpos PA,PANG e LF em relação a PA e LF, respectivamente, indicando que a produ-ção em plantas não prejudica a especificidade de ligação do anticorpo.

Exemplo 5: Estudo de Meia-Vida de Anticorpos Monoclonais Humanos anti-PA e anti-LF em Ratos

Ratos Fischer do sexo masculine receberam uma injeção intra-peritoneal com 50 pg de PA produzido em planta, PANG produzido em plan-ta ou LF produzido em planta. Amostras de soro foram tiradas antes da inje-ção, assim como em 2 h e em 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 e 20 dias após a injeção.

O soro foi analisado com ELISA que se liga especificamente a PA ou a LF. OPA e o PANG produzido em planta exibiam meias-vidas similares, enquantoque os anticorpos LF tinham de alguma maneira uma meia-vida menorquando comparada com a de ambos os anticorpos PA produzidos em planta.

Exemplo 6: Estudos de Proteção de Animais

A capacidade do PA produzido em plantas para proteger ca-mundongos A/J contra o desafio com esporos da cepa Sterne de B. anthra-cis foi determinada de acordo com o método de Beedham e colegas. Umgrupo de cinco camundongos receberam 180 pg de mAb PA produzido emplantas através da rota intraperitoneal em PBS. Os camundongos de contro-le receberam PBS. 2,5 horas após a imunização passive, os animais recebe-ram esporos de B. anthracis a uma dose de 1 X 104 esporos em 0,1 mL dePBS (aproximadamente 30 da dose letal media). Após serem desafiados, osanimais foram monitorados diariamente durante 14 dias em relação à evi-dência de morbidade e mortalidade. Os animais que receberam mAb produ-zido em plantas não desenvolveram sintomas da doença, permaneceramsaudáveis e sobreviveram ao desafio, enquanto que todos os animais docontrole desenvolveram doença e morreram dentro do período de 3 dias a -pós o desafio.

Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de de-terminer utilizando não mais que experimentação de rotina, muitos equiva-Ientespara as modalidades específicas da invenção descritas aqui. Não épretendido que o âmbito da presente invenção seja limitado à Descrição an-terior, mas ao invés disso seja como apresentado nas reivindicações em a-nexo. Nas reivindicações, os artigos tais como "um", "uma", "o" e "a" podemsignificar um ou mais de um a não ser que seja indicado ao contrário ou dife-rentemente evidente partindo do contexto. As reivindicações ou as descri-ções que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são conside-radas satisfatórias se um, mais de um ou todos os membros do grupo estive-rem presentes em, empregados em ou de outra maneira relevantes a umcerto produto ou processo a não ser que seja indicado o contrário ou diferen-temente evidente partindo do contexto. Além disso, deve ser entendido quea invenção abrange todas as variações, combinações e permutações emque uma ou mais limitações, elementos, cláusulas, termos descritivos etc.,de uma ou mais das reivindicações listadas são introduzidas em uma outrareivindicação. Em particular, qualquer reivindicação que é dependente deuma outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais limita-ções encontradas em qualquer outra reivindicações que é dependente damesma reivindicação de base. Em adição, deve ser entendido que qualquermodalidade particular da presente invenção que se encaixa dentro da técni-ca anterior pode ser explicitamente excluída das reivindicações. Uma vezque tais modalidades são consideradas como sendo conhecidas por um ver-sado na técnica, podem ser excluídas mesmo se não forem apresentadasexplicitamente aqui. Por exemplo, qualquer oligonucleotídeo, cDNA, ácidonucléico ou anticorpo específico, pode ser excluído das reivindicações.Listagem de Seqüência

<110> Yusibov, et-al

<120> COMPOSIÇÕES E PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS

<130> 2002645-0103

<140> PCT/US06/030545

<141> 2006-08-03

<160> 70

<170> versão de Patente 3.2

<210> 1

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<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Gamaconstante

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ctcgcggcct ccgaggcctc atttaccckg agacagg

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<212> ONA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Gama constante

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<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

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<223> Lambdaconstante

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<213> Seqüência Artificial

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<223> Lambdaconstante

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<212> DNA

<213> Seqüência Artificial2002645-0102.ST25.txt

<220>

<223> Kappaconstante<400> 5

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<213> Seqüência Artificial

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<223> Kappaconstante

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<213> Seqüência Artificial

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<223> variável pesada

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<213> Seqüência Artificial

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<223> variável pesada<400> 8

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<213> Seqüência Artificial<220>

<223> variável pesada

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Seqüência Artificial

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<223> varjável pesada

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<213> Seqüência Artificial

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<223> variavel pesada

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<213> Seqüência Artificial<220>

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<213> Seqüência Artificial<220>

<223> variável pesada

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<213> Seqüência Artificial<220>

<223> variável pesada

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<213> Seqüência Artificial<220>

<223> variável pesada

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<213> Seqüência Artificial

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<213> Seqüência Artificial

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<213> Seqüência Artificial2002645-0102.ST2 5.txt

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<213> Seqüência Artificial<220>

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<213> Seqüência Artificial

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<2i3> Seqüência Artificial

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<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> variável de Kappá

<400> 42

atggaarccc cagcgcagct

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> variável de Kappa

<400> 43

atggtgttgc agacccaggt

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<22 3> variável de Kappa

<400> 44

atggggtccc aggttcacct

<210> 45<211> 708

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22Β> Seqüência de DNA da cadeia leve Kappa cDNA de PA-1 huMab

<400> 45

atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc tacagctcct tagcctggta ccagcagaaa 180

cctggccagg ctcccagcct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggcca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300

cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cactatggta actcaccgta cacttttggc 360

caggggacca agctggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708

<210> 46

<211> 235

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de aminoácidos de cadeia leve Kappa de PA-1 huMab

<400> 46

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile vai Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu ser20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln ser35 40 45

Val Ser Tyr Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala50 55 60

Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro65 70 75 80

Asp Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile85 90 95

ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala vai Tyr Tyr Cys Gln His Tyr2002645-0102.ST25. txt100 105 110

Gly Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125

Arg Thr vai Ala Ala pro ser vai Phe Ile Phe Pro Pro ser Asp Glu130 135 140

Gln Leu Lys ser Gly Thr Ala Ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys vai Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln165 170 175

ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp ser180 185 190

Thr Tyr ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr Glu195 200 205

Lys His Lys vai Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235

<210> 47

<211> 1407

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de DNA dè cadeia pesada Gama e DNA de PA-1 huMab

<400> 47

atggactgga tctggaggat cctctttttg gtggcagcag ccacaggtgc ccactcccag 60gtccagcttg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gàaggtttcc 120tgcaaggcct ctggatacac cttcactagc aatgctatac aatgggtgcg ccaggccccc 180ggacaaaggc ttgagtgggt gggatggatc aacggtggcg atggtaacac aaaatattca 240cagaagttcc agggcagagt caccattagt agggacatat ccgcgagcac agcctacatg 300gagctgagca gcctgagatc tgaagacacg gctgtgtatt actgtgcgag acatcgtttg 360caaagagggg ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccttcctcca agagcacctc tgggggcaca 480gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 720tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctccggg taaatga 1407

<210> 48<211> 468<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de aminoácidos de cadeia pesada Gama de PA-1 huMab<400> 48

Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly1 5 10 15

Ala His Ser Gln vai Gln Leu vai Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30

Pro Gly Ala Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45

Thr ser Asn Ala Ile Gln Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu50 55 60

Glu Trp Val Gly Trp Ile Ásn Gly Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Ser65 70 75 80

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ilè Ser Arg Asp Ile Ser Ala ser85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu ser ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala vai100 105 UO

Tyr Tyr Cys Ala Arg His Arg Leu Gln Arg Gly Gly Phe Asp Pro Trp115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr vai Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro2002645-0102.ST25.txt130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys ser Thr Ser Gly Gly Thr145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr165 170 175

vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser Ser Val vai Thr195 200 205

vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn210 215 220

His Lys Pro ser Asn Thr Lys vai Asp Lys Arg vai Glu Pro Lys Ser225 230 235 240

cys Asp Lys Thr His Thr cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu245 250 255

Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu260 265 270

Met lie ser Arg Thr Pro Glu vai Thr Cys vai Val Val Asp Val Ser275 280 285

His Glu Asp Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glii290 295 300

vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg" Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr305 310 315 320

Tyr Arg Val vai Ser vai Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln355 360 365

vai Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln vai370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala vai385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro2002645-0102.ST25.txt405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr420 425 430

vai Asp Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser vai435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu450 455 460

ser Pro Gly Lys465

<210> 49

<211> 702

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de DNA da cadeia leve Kappa cDNA de LF-1 hubMab

<400> 49

atgttgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcctc caggggtgaa 60attgtgctga ctcagtctcc agactttcag tctgtgagtc caaaggagaa agtcaccatc 120acctgccggg ccagccagag cgttggtagt agcttacact ggtaccagca gaaaccagat 180cagtctcca:a agctcctcat caagtatgct tcccagtcct tctcaggggt cccctcgagg 240ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc accctcacca tcaatagcct ggaaactgaa 300gatgctgcaa cgtattactg tcatcagagt agtagtttac ctctcacttt cggcggaggg 360accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660agctcgcccg tcacaaagag cttcáacagg ggagagtgtt ag 702

<210> 50 -

<211> 233<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de aminoácidos da cadeia leve Kappa de LF-1 huMab<400> 50

Met Leu Pro ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala1 5 10 15

Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser vai2002645-0102.ST25.txt20 25 30

Ser Pro Lys Glu Lys vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser vai35 40 45

Gly Ser ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys50 55 60

Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly vai Pro Ser Arg65 70 75 80

Phe ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn ser85 90 95

Leu Glu Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser ser100 105 110

Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys Arg Thr115 120 125

Val Ala Ala Pro ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys vai Gln Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly165 170 175

Asn Ser Gln Glu ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro vai210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230

<210> 51<211> 1413<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de DNA da cadeia pesada Gama cDNA de LF-1 huMab<400> 51

atggagttgg ggctgtgctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagccgg gggggtccct gagactctcc 120tgttctggct ctggattcat gtttagcagt tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtgggt ctcaggaatt agtggtagcg gtggtactac aaactacgca 240

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatatg 300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agatggggta 360

tatggccgac tggggggttc tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420

gcctccacca agggcccatc agtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg caçaccttcc cggctgtcct àcagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg gtctgcacaa ccactacacg 1380

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

<210> 52<211> 470<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de aminoácidos da cadeia pesada Gama de LF-1 huMab<400> 52

Met Glu Leu Gly Leu Cys Trp Leu Phe Leu vai Ala Ile Leu Lys Gly15 10 15

vai Gln Cys Glu vai Gln Leu Leu Glu ser Gly Gly Gly Leu vai Gln20 25 30

Prò Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser cys ser Gly Ser Gly Phe Met Phe35 40 45

Ser Ser Tyr ATa Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu2002645-0102.ST25.txt50 55 60

Glu Trp vai Ser Gly Ile ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95

Thr Leu Tyr Met Gln Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly vai Tyr Gly Arg Leu Gly Gly ser Asp115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu vai Thr vai Ser ser Ala Ser Thr Lys130 135 140

Gly Pro ser vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys ser Thr ser Gly145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175

vai Thr vai ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai His Thr180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln ser ser Gly Leu Tyr ser Leu ser Ser vai195 200 205

vai Thr vai Pro Ser Ser ser Leu Gly Thr Gln Thir Tyr Ile Cys Asn210 215 220

vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys vai Asp Lys Lys vai Glu Pro225 230 235 240

Lys ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp260 265 270

Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu vai Thr Cys vai Val Val Asp275 280 285

vai Ser His Glu Asp Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly290 295 300

vai Glu vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn305 310 315 320

ser Thr Tyr Arg vai Val ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp2002645-0102.ST25.txt325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val ser Asn Lys Ala Leu pro340 345 350

Ala Pro Xle Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu355 360 365

Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn370 375 380

Gln Val ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr405 410 415

Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys420 425 430

Léu Thr Val Asp Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe Ser Cys435 440 445

ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu450 455 460

Ser Leu ser Pro Gly Lys465 470

<210> 53

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotídeos Bamsfi 1

<400> 53

gatccggccc agccggccg

<210> 54<211> 19<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotídeos Bamsfi 1

<400> 54

gatccggccg gctgggccg

<210> 55

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial2002645-0102.ST25.txt

<220> <223> oligonucleotideos SacSfi 1

<400> 55

gcctcggggg ccgagct 17

<210> 56

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<223> oligonucleotideos SacSfi 1

<400> 56

gcccccgagg ccgagct 17

<210> 57

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador reverso

<400> 57

ccgcgggagg agcagtacca aagcacgtac cgt 33

<210> 58

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador reverso

<400> 58

gtactgctcc tcccgcggct ttgtcttggc a 31

<210> 59

<211> 12

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<223> cadeia leve CDRI com pelo menos 90% de identidade com a seqüência de PA-LCDR1

<400> 59

Arg Ala Ser Gln ser vai Ser Tyr Ser Ser Leu Ala1 5 10

<210> 60<211> 7<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<223> cadeia leve CDR2 com pelo menos 90% de identidade com a seqüência de PA-LCDR2<400> 602002645-0102.ST25.txt

Gly Ala Ser ser Arg Ala Thr1 5

<210> 61<211> 9<212> PRT<213> Seqüência artificial

<220><223> cadeia leve CDR3 com pelo menos 90% de identidade com a seqüência PA-LCDR3

<400> 61

Gln His Tyr Gly Asn Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 62<211> 10<212> PRT<213> Seqüência artificial

<220><223> cadeia pesada CDR1 com pelo menos 90% de identidade com a seqüência PA-LCDR1<400> 62

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn Ala Xle Gln1 5 10

<210> 63<211> 17<212> PRT<213> Seqüência artificial

<220><223> cadeia pesada CDR2 com pelo menos 90% de identidade com a seqüência PA-LCDR2

<400> 63

Trp Ile Asn Gly Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln1 5 10 15

Gly

<210> 64<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220><223> cadeia pesada CDR3 com pelo menos 90% de identidade com a seqüência PA-LCDR3

<400> 64

His Arg Leu Gln Arg Gly Gly Phe Asp Pro1 5 102002645-0102.ST25.txt

<210> 65<211> 11<212> PRT

<2ΐΒ> Seqüência artificial<220>

<22Β> resíduos de aminoácidos<400> 65

Arq Ala ser Gln ser Val Gly ser ser Leu His1 5 10

<210> 66

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> resíduos de aminoácidos

<400> 66

Tyr Ala Ser Gln ser Phe Ser1 5

<210> 67

<211> 9

<212> PRT<213>

<220>

<223> resíduos de aminoácidos<400> 67

His Gln ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr1 5

<210> 68

<211> 10

<212> PRt

<213> Seqüência artificial<220>

<223> resíduos de aminoácidos

<400> 68

Gly Phe Met Phe Ser Ser Tyr Ala Met ser1 5 10

<210> 69

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> resíduos de aminoácidos

<400> 69

Gly Ile ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser vai Lys2002645-0102.ST2 5.txt15 10

Gly

<210> 70

<211> 12

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> reSídUos de aminoácido

<400> 70

Asp Gly vai Tyr Gly Arg Leu Gly Gly ser Asp Tyr1 5 ■LU

Claims (32)

1. Anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo, quecompreende: (a) uma ou mais regiões determinadoras da complementarida-de (CDRs) de cadeia leve (LC) selecionadas do grupo que consiste em:(i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com PA-1CDR1: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO: 59);(ii) uma CDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com PA-1CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 60); e(iii) uma CDR3 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com PA-1 CDR3: QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61); e(b) uma ou mais regiões determinadoras de complementaridade(CDRs) de cadeia pesada (HC) selecionadas do grupo que consiste em:(iv) uma CDR1 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com PA-hCDR1: GYTFTSNAIQ (SEQ ID NO: 62);(v) uma CDR2 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com PA-hCDR2: WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQ IDNO: 63); e(vi) uma CDR3 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com PA-hCDR3: HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64);em que o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao antígeno protetor de B. anthracis.

2. Anticorpo ou fragmento funcional de acordo com a reivindica-ção 1, que compreende: (a) duas ou mais regiões determinadoras da com-plementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) selecionadas do grupo que con-siste em:(i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com PA-1CDR1: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO: 59);(ii) uma CDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com PA-1CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 60);(iii) uma CDR3 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com PA-1CDR3: QHYGNSPYT (SEQ ID NO: 61); e(b) duas ou mais regiões determinadoras da complementaridade(CDRs) de cadeia pesada selecionadas do grupo que consiste em:(iv) uma CDR1 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com PA-hCDR1: GYTFTSNAIQ (SEQ ID NO: 62);(v) uma CDR2 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com PA-hCDR2: WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQ IDNO: 63); e(vi) uma CDR3 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com PA-hCDR3: HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64);em que o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao antígeno protetor de B. anthracis.

3. Anticorpo ou fragmento funcional de acordo com a reivindica-ção 1, que compreende: (a) três regiões determinadoras da complementari-dade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consistem em:(i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com PA-1CDR1: RASQSVSYSSLA (SEQ ID NO: 59);(ii) uma CDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com PA-1CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 60); e(iii) uma CDR3 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com PA-1 CDR3: QHYGNSPYT (SEQ ID N2: 61); e (b) três regiões determinadoras da complementaridade (CDRs)de cadeia pesada que consistem em:(iv) uma CDR1 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com PA-hCDR1: GYTFTSNAIQ (SEQ ID NO: 62);(v) uma CDR2 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com PA-hCDR2: WINGGDGNTKYSQKFQG (SEQ IDNO: 63); e(vi) uma CDR3 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com PA-hCDR3: HRLQRGGFDP (SEQ ID NO: 64);em que o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao antígeno protetor de B. anthracis.

4. Anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo que com-preende: (a) uma ou mais regiões determinadoras da complementaridade(CDRs) de cadeia leve (LC) selecionadas do grupo que consiste em:(i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-1CDR1: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65);(ii) uma CDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-1CDR2: YASQSFS (SEQ ID NO: 66); e(iii) uma CDR3 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-1CDR3: HQSSSLPLT (SEQ ID NO: 67);e (b) uma ou mais regiões determinadoras da complementa-ridade (CDRs) de cadeia pesada (HC) selecionadas do grupo que consisteem:(iv) uma CDR1 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-hCDR1: GFMFSSYAMS (SEQ ID NO: 68);(v) uma CDR2 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-hCDR2: GISGSGGTTNYADSVKG (SEQ IDNO: 69); e(vi) uma CDR3 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-hCDR3: DGVYGRLGGSDY (SEQ ID NO: 70);em que o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao fator letal de B. anthracis.

5. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de acordo com areivindicação 4, que compreende: (a) duas ou mais regiões determinadorasda complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) selecionadas do grupoque consiste em:(i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-1 CDR1: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65);(ii) uma CDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-1CDR2: YASQSFS (SEQ ID NO: 66); e(iii) uma CDR3 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-1 CDR3: HQSSSLPLT (SEQ ID NO: 67);e (b) duas ou mais regiões determinadoras da complementaridade(CDRs) de cadeia pesada (HC) selecionadas do grupo que consiste em:(iv) uma CDR1 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-hCDR1: GFMFSSYAMS (SEQ ID NO: 68);(v) uma CDR2 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-hCDR2: GISGSGGTTNYADSVKG (SEQ IDNO: 69); e(vi) uma CDR3 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-hCDR3: DGVYGRLGGSDY (SEQ ID NO: 70);em que o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao fator letal de B. anthracis.

6. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com areivindicação 4, que compreende: (a) três regiões determinadoras da com-plementaridade (CDRs) de cadeia leve (LC) que consistem em:(i) uma CDR1 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-1CDR1: RASQSVGSSLH (SEQ ID NO: 65);(ii) uma CDR2 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-1CDR2: YASQSFS (SEQ ID NO: 66); e(iii) uma CDR3 de cadeia leve com pelo menos 90% de identida-de de seqüência com LF-1CDR3: HQSSSLPLT (SEQ ID NO: 67);e (b) três regiões determinadoras da complementaridade (CDRs)de cadeia pesada (HC) que consistem em:(iv) uma CDR1 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-hCDR1: GFMFSSYAMS (SEQ ID NO: 68);(v) uma CDR2 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-hCDR2: GISGSGGTTNYADSVKG (SEQ IDNO: 69); e(vi) uma CDR3 de cadeia pesada com pelo menos 90% de iden-tidade de seqüência com LF-hCDR3: DGVYGRLGGSDY (SEQ ID NO: 70);em que o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo pode seligar especificamente ao fator letal de B. anthracis.

7. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o dito fragmento funcional éselecionado do grupo que consiste em Fv, Fab, F(ab)2 e scFV.

8. Ácido nucléico que codifica o anticorpo ou o fragmento funcio-nal como definido na reivindicação 1.

9. Composição que compreende o anticorpo ou o fragmento fun-cional como definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamenteaceitável.

10. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, de acordo coma reivindicação 4, em que o dito fragmento funcional é selecionado do grupoque consiste em Fv, Fab, F(ab)2 e scFV.

11. Ácido nucléico que codifica o anticorpo ou o fragmento fun-cional como definido na reivindicação 4.

12. Composição que compreende o anticorpo ou o fragmentofuncional como definido na reivindicação 4, e um veículo farmaceuticamenteaceitável.

13. Polipeptídeo isolado que compreende uma seqüência de po-lipeptídeo que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 46, 48, 50 ou 52.

14. Polipeptídeo isolado que consiste em uma seqüência de po-lipeptídeo de qualquer uma da SEQ ID NO: 46, 48, 50 ou 52.

15. Polipeptídeo como definido na reivindicação 13 ou da reivin-dicação 14, em que o dito polipeptídeo não é glicosilado.

16. Ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo comodefinido na reivindicação 13.

17. Ácido nucléico isolado como definido na reivindicação 16, emque a dita seqüência de ácido nucléico não é uma seqüência que ocorre na-turalmente.

18. Iniciador de oligonucleotídeo cuja seqüência consiste em oucompreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 -44.

19. Mistura de iniciadores que contém pelo menos dois iniciado-res de oligonucleotídeo como definido na reivindte^

20. Mistura de iniciadores como definido na reivindicação 19,que contém pelo menos dois iniciadores, em que os pelo menos dois inicia-dores são de uso em uma reação de amplificação para amplificar uma ca-deia pesada ou uma cadeia leve de anticorpo.

21. Ácido nucléico amplificado partindo de uma célula ou de umalinhagem de células produtora de anticorpo utilizando um iniciador como de-finido na reivindicação 18.

22. Vetor de expressão, célula, animal transgênico ou plantatransgênica que contém o ácido nucléico como definido na reivindicação 21.

23. Vetor viral de planta ou replicon que compreende o ácidonucléico como definido na reivindicação 21.

24. Processo de produção de uma cadeia de anticorpo quecompreende a expressão do ácido nucléico como definido na reivindicação-21, em um sistema de expressão adequado.

25. Processo como definido na reivindicação 24, em que o sis-tema de expressão é um sistema de expressão baseado em plantas.

26. Processo de isolamento de um ácido nucléico que codificauma cadeia pesada ou uma cadeia leve de anticorpo que compreende aamplificação do dito ácido nucléico partindo de uma célula ou de uma Iinha-gem de células que produz a cadeia pesada ou a cadeia leve do anticorpoutilizando um ou mais iniciadores selecionados do grupo que consiste nasSEQ ID NOs: 1-44.

27. Ácido nucléico isolado que compreende uma seqüência deácido nucléico que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 45, 47, 49 ou 51.

28. Ácido nucléico isolado que consiste em uma seqüência deácido nucléico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 45, 47, 49 ou 51.

29. Vetor de expressão que compreende um ácido nucléico co-mo definido na reivindicação 27 ou na reivindicação 28.

30. Célula hospedeira que compreende o vetor de expressãocomo definido na reivindicação 29.

31. Célula hospedeira como definido na reivindicação 30, que éuma célula vegetal.

32. Processo de produção de um anticorpo ou de um fragmentofuncional do mesmo, que compreende o cultivo da célula hospedeira como de-finido na reivindicação 30 ou na reivindicação 31, sob condições suficientes pa-ra a produção de anticorpo e para a purificação do anticorpo produzido.