BRPI0515955B1 - Proteína do soro do leite nanoparticulada, seu método de produção e produto alimentar, suplemento alimentar, composição farmacêutica e/ou nutricional - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA DO SORO DO LEITE NANOPARTICULADA, SEU MÉTODO DE PRODU- ÇÃO E PRODUTO ALIMENTAR, SUPLEMENTO ALIMENTAR, COMPO- SIÇÃO FARMACÊUTICA E/OU NUTRICIONAL". A presente invenção se refere a um método para a produção de proteínas extraídas do soro do leite em forma de nanopartículas e das prote- ínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas então obtidas. Especifica- mente, a presente invenção inclui o uso dessas proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas como emulsificadores, substituto de gordura, bran- queador, espumante, texturizador e/ou agentes de preenchimento.

Material de alimento contendo gordura faz parte de uma propor- ção considerável das dietas de muitas pessoas. Um dos problemas encon- trados com a produção de tais produtos reside em que a gordura deve per- manecer estabilizada em toda a vida de armazenamento do produto, tal que não ocorra fase de separação.

Para este fim, agentes emulsificantes são utilizados, os quais for- necem uma estabilização da emulsão uma vez formada, baseado em sua pro- priedade inerente de uma parte lipofílico ou hidrofóbica; respectivamente; sendo solúvel na fase não-aquosa e uma parte hidrofílica ou polar sendo solúvel em água tal que ditas moléculas têm emulsificação de uma fase facilitada na outra fase. Adicionalmente, os agentes emulsificantes também protegem as gotas uma vez formadas de agregação e coalescência. Como agentes emulsificantes, substâncias de ocorrência natural são usadas, como hidrocolóides, fosfolipí- deos (lecitina) ou glicolipídeos e, por outro lado, podem ser usados também agentes sintéticos como estearil-2-lactato ou mono-, diacilglicerídeos, etc.

Uma das maiores desvantagens dos agentes reside em que es- ses agentes algumas vezes substancialmente adicionam-se ao custo do produto final, e não adiciona ao valor nutricional do produto. Algumas vezes, tais tipos de materiais também não mostram propriedades de estabilização adequadas pelo fato de haver competição interfacial com proteínas.

Logo, um objetivo da invenção reside no fornecimento de uma alternativa aos emulsificantes existentes, que não mostram as desvantagens inerentes e estão facilmente disponíveis.

Outro objetivo da invenção é fornecer um substituto de gordura, um branqueador, espumante, texturízante e/ou agente preenchedor com uma alta Razão de Eficiência de Proteína (PER).

Para alcançar esse objetivo, um método para a produção de pro- teína extraída do soro do leite nanoparticulada é proposta tal que inclua a etapa de sujeição da solução contendo proteínas extraídas do soro do leite a uma temperatura específica para um período de tempo específico e em uma faixa de pH de estreita para resultar na produção de agregados de proteínas extraídas do soro do leite com diâmetro de menos de 1 pm, preferivelmente de 100 a 990 nm.

Em particular, a presente invenção refere-se a um método para a produção de proteína extraída do soro do leite nanoparticulada incluindo a etapa de: i) ajuste de pH de a uma faixa estreita de uma solução aquosa de proteína extraída do soro do leite, ou ajuste de força iônica da preparação de proteína extraída do soro do leite enquanto se mantém o pH de constan- te, e ii) sujeição da solução aquosa a uma temperatura de entre 80°C a 95°C, durante um período de tempo de 10 segundos a 30 minutos, para obter uma dispersão líquida de proteína extraída do soro do leite esférica nanoparticulada com tamanho de partícula menor que 1 pm. A dispersão de proteínas extraídas do soro do leite nanoparticu- ladas pode ser adicionalmente seca, em particular por secagem por conge- lamento ou secagem por atomização. Descobriu-se que nanopartículas de proteína extraída do soro do leite foram observadas em solução após re- constituição do pó seco por atomização. Diferenças na morfologia e na es- trutura não puderam ser detectadas, confirmando que as nanopartículas de proteína extraída do soro do leite são fisicamente estáveis com respeito à secagem por atomização.

Ditas nanopartículas têm uma Razão de Eficiência de Proteína (PER) de pelo menos 100.

Durante os extensos experimentos, levando à presente inven- ção, os inventores desta notaram que, surpreendentemente, quando há ajus- te de pH a uma faixa estreita muito precisa (significando cerca de ± 0,2 uni- dade de pH) antes de tratamento de uma solução aquosa de proteínas extra- ídas do soro do leite, ou uma ou mais de seus maiores constituintes, a uma temperatura de entre cerca de 80° a 95°C, por um período de tempo de cer- ca de 10 s a 30 min na temperatura desejada, as proteínas extraídas do soro do leite logo obtidas mostram uma forma particulada, com formato esférico e com diâmetro de partículas de menos de 1 pm. Uma vantagem é que as par- tículas de proteína extraída do soro do leite preparadas de acordo não foram submetidas a qualquer força mecânica levando à redução do tamanho de partícula, contrário ao processo convencional. Esse método induz nanopartí- culas espontâneas de proteínas extraídas do soro do leite durante tratamen- to térmico na ausência de cisalhamento.

As proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas mostra- ram-se idealmente apropriadas para uso como emulsificante, substituto de gordura, substituto para caseína micelar ou agente espumante, já que eles são capazes de estabilizar gordura e/ou ar em um sistema aquoso por um período prolongado. Adicionalmente, as proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas presentes estão ainda em uma condição para servir como agente branqueador, tal que com um composto, várias tarefas podem ser cumpridas. Já que a proteína extraída de soro do leite é um material abun- dantemente disponível, o uso deste reduz o custo de um produto necessi- tando de um agente emulsificador, preenchedor, branqueador ou espuman- te, enquanto ao mesmo tempo adicionando a seu valor nutricional.

Figuras Nas figuras: A figura 1 mostra o resultado de um experimento demonstrando o efeito de pH de e tratamento térmico na nanoparticulação de β- lactoglobulina. A figura 2 está mostrando um meio para determinar o pH de na- noparticulação para uma preparação comercial (Bipro®, Batelada JE032-1- 420) usando medidas de turbidez a 500 nm. A figura 3 é um micrógrafo de Microscopia de Transmissão de Elétron de proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas (2 % em peso, WPI 95, Lactalis) a pH de 7.4. A barra de escala é de 200 nm. A figura 4 mostra o resultado de um experimento avaliando o impacto da força iônica (Arginina HCI) na formulação de nanopartícuias de proteína a um pH constante de 7.0. A figura 5 mostra o volume de estabilidade (FVS) de espuma estabilizada por nanopartícuias de β-lactoglobulina a 1% em peso (Davisco) a pH de 7.0 na presença de Arginina HCI a 60 mM comparado à β- lactoglobulina não-particulada. A figura 6 mostra a distribuição de tamanho baseado em intensi- dade de nanopartícuias obtidas por tratamento térmico de uma dispersão de β-lactoglobulina a 1% em peso por 15 min a 85°C a pH de 4,25 (positiva- mente carregados com um potencial zeta de cerca de +25mV) e a pH de 6.0 (negativamente carregado com um potencial zeta de -30mV). O diâmetro hidrodinâmico Z-médio das nanopartícuias foi de 229,3 nm a pH de 4,25 e 227,2 a pH de 6,0. Os micrógrafos correspondentes das nanopartícuias obti- das por TEM após das marcações negativas são mostrados. As barras de escala são de 1 pm.

Quanto à proteína extraída do soro do leite a ser usada no pre- sente método, quaisquer isolados ou concentrados de proteína extraída do soro do leite comercialmente disponíveis podem ser usados, ou seja, proteí- na extraída do soro do leite obtida por qualquer processo para a preparação de proteína extraída do soro do leite conhecida na técnica, bem como fra- ções de proteína extraída do soro do leite preparadas destas ou proteínas como β-lactoglobulina (BLG), α-lactalbumina e albumina de soro. Em particu- lar, proteína extraída do soro do leite doce obtida como um subproduto na fabricação do queijo, e proteína extraída do soro do leite ácido como sub- produto na fabricação de caseína ácida, proteína extraída do soro do leite nativo obtido pela microfiltração do leite ou proteína extraída do soro do leite subforma de coalho como subproduto em fabricação de caseína de coalho podem ser usados como a proteína extraída do soro do leite. Preferivelmen- te, em particular sob aspectos de custo, preparação da proteína extraída do soro do leite, que não foi sujeita a processos de fraccionação adicionais a- pós sua produção, é preferido como material inicial. A presente invenção não é restrita a isolados de proteína extraída do soro do leite de origem bovina, mas pertence a isolados de proteína extraída do soro do leite de todas as espécies mamíferas, como de ovelha, cabras, cavalos e camelos. Também, o processo de acordo com a presente invenção também se aplica a qualquer outra proteína globular desmineralizada ou levemente mineralizada, como proteína de leite, soja, cereais, óleos de sementes, ou de outros de origem animal ou vegetal. Deve ser entendido que por 'levemente mineralizado", a eliminação de minerais livres que são dialisáveis ou diafiltráveis, se mantém minerais associados a proteína ou mineralização após preparação de con- centrado de proteína extraída do soro do leite ou isolado sem enriquecimen- to mineral específico.

Proteínas extraídas do soro do leite podem estar presentes em solução aquosa em uma quantidade de 0,1% em peso a 12% em peso, pre- ferivelmente em uma quantidade de 0,1% a 8% em peso, mais preferivel- mente em uma quantidade de 0.2% a 7% em peso, ainda mais preferivel- mente em uma quantidade de 0.5% a 6% em peso, em particular em uma quantidade de 1 % a 4% em uma quantidade, cada um na base de peso total da solução. A solução aquosa da preparação de proteína extraída do soro do leite como presente antes da etapa de nanoparticulação pode ainda incluir compostos adicionais, como subprodutos dos processos de produção de whey respectivos, outras proteínas, gomas ou carboidratos. A solução pode também conter outros ingredientes de alimentos (gordura, carboidratos, ex- tratos de planta, etc.). A quantidade de tais compostos adicionais preferivel- mente não excede 50% em peso, preferivelmente 20% em peso, e mais pre- ferivelmente 10% em peso do peso total da solução.

Proteínas extraídas do soro do leite têm uma razão de eficiência de proteína (PER) melhor comparado, por exemplo, à caseína 118/100. PER = crescimento de peso corporal (g)/ entrada de proteína em peso (g).

Exemplos: PER % de Caseína Caseína 3,2 100 Ovo 3,8 118 Soro do leite 3,8 118 "Soja integral" 2,5 78 Glúten de trigo 0,3 9 Proteínas extraídas do soro do leite são uma fonte excelente de aminoácidos essenciais (AA) (45%). Ricos em AA cujos requerimentos po- dem ser aumentados em caso de estresse e em pessoas mais idosas: com- parados com a caseína (0,3g de cisteína/1 OOg de proteína), proteínas extra- ídas do soro do leite doces contêm 7 vezes mais cisteína e soro do leite áci- do, 10 vezes mais cisteína. Cisteína é o aminoácido de taxa limitante para síntese de glutationa (GSH), glutationa tem funções primárias importantes na defesa do corpo no caso de estresse. Suplementação oral com proteína ex- traída do soro do leite aumenta os níveis de GSH no plasma de pacientes infectados com HIV (Eur. J. Clin. Invest. 2001; 31,171-178).

As nanopartículas de acordo com a presente invenção têm um PER de pelo menos 100, preferivelmente a cerca de 118. A proteína extraída do soro do leite, bem como as frações e/ou as proteínas principais deste podem ser usados em formas purificadas ou, similarmente, em forma de um produto bruto. De acordo com uma modalida- de preferida de conteúdo de sal do material inicial para a preparação da pro- teína extraída do soro do leite nanoparticulada pode ser menor que 2,5% em cátions divalentes, mais preferivelmente menos que 2%.

Alternativamente, se nenhuma etapa de ajuste de pH de for de- sejada, é possível ajustar a força iônica da preparação de proteína extraída do soro do leite enquanto se mantém o pH de constante. Logo, a força iônica pode ser ajustada por íons orgânicos ou inorgânicos em tal maneira que permita a nanoparticulação a um pH constante. O material inicial é então sujeito ao tratamento térmico. A esse respeito, descobriu-se ser importante para a obtenção de proteína extraída do soro do leite nanoparticulada ter a temperatura na faixa de cerca de 80 a 95°C, preferivelmente de cerca de 82 a 89°C, mais preferivelmente de cerca de 84 a 87°C, mais preferivelmente a cerca de 85°C.

Quando a temperatura desejada tiver sido alcançada, será man- tida por um mínimo de 10 segundos e um máximo de 30 minutos (à tempera- tura desejada). Preferivelmente, o período de tempo durante o qual a solu- ção de proteína extraída do soro do leite aquosa é mantida às faixas de temperaturas desejadas de cerca de 12 a 25 minutos, mais preferivelmente de 12 a 20 minutos, ou mais preferivelmente a cerca de 15 minutos.

Por nanopartículas, na presente descrição, entendemos que par- tículas com um diâmetro menor que 1 pm, preferivelmente entre 100 e 700 nm. O diâmetro médio das nanopartículas pode ser determinado usando Mi- croscopia de Transmissão de Elétron (TEM). Nesse caso, as amostras na- noparticuladas líquidas foram encapsuladas em tubos de gel de agar. A fixa- ção foi alcançada por imersão em uma solução de 2,5% de glutaraldeído a 0,1 M, pH de 7,4, tampão de cacodilato e pós-fixação com 2% de tetróxido de Ósmio no mesmo tampão, ambas as soluções contendo 0,04% de vermelho de rutênio. Após desidratação em uma série de etanol graduada (70,80, 90, 96, 100% de etanol), as amostras foram embebidas em resina de Spurr (Spurr/ etanol 1:1, 2:1, 100%). Após polimerização da resina (70°C, 48 ho- ras), seções semifinas e ultrafinas foram cortadas com um ultramicrotomo Leica ultracut UCT. Seções ultrafinas, marcadas com uranil-acetato e citrato de chumbo, foram examinadas em microscopia de transmissão de elétron (Philips CM12, 80 kV).

De acordo com a presente descoberta, o pH e a forca iônica são fatores importantes no presente método. Logo, para amostras extensamente dializadas que não têm virtualmente cátions livres, como Ca, K, Na, Mg, ou tem estes retirados, foi descoberto que quando há realização do tratamento térmico durante o período de tempo indicado a um pH de 5,4, produto bruto seria obtido, enquanto a um pH que excede 6,8, o resultado será proteína extraída do soro do leite solúvel. Logo, apenas nessa faixa de pH relativa- mente estreita, a proteína extraída do soro do leite na forma particulada com um diâmetro de menos de 1 pm serão obtidas. A mesma forma particulada é obtida simetricamente abaixo do pH isoeiétrico, ou seja, 3,5 a 5,0.

De acordo com uma modalidade preferida, para obter nanopartí- culas negativamente carregadas, o pH é ajustado em uma faixa de 5,6 a 6,4, mais preferivelmente de 5,8 a 6,0 por um conteúdo baixo (menos de 0,2g por 100g de um pó de proteína extraída do soro do leite inicial) em cátions diva- lentes. O pH pode ser aumentado até 8,4 dependendo do conteúdo mineral de fonte de proteína extraída do soro do leite (concentrado ou isolado). Em particular, o pH pode estar entre 7,5 a 8,4, preferivelmente 7,6 a 8,0 para obter nanopartículas negativamente carregadas na presença de uma grande quantidade de minerais livres e o pH pode estar entre 6,4 a 7,4, preferivel- mente 6,6 a 7,2 para obter nanopartículas negativamente carregadas na presença de um teor moderado de minerais livres. O pH é geralmente ajus- tado pela adição do ácido, que preferivelmente é de grau de alimentação, como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cí- trico, ácido glucônico ou ácido lático. Quando o teor mineral é alto, o pH é geralmente ajustado por adição de solução alcalina, que é preferivelmente de grau de alimentação, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou hidróxido de amônio.

De acordo com outra modalidade preferida, para obter nanopar- tículas positivamente carregadas, nanoparticulação de proteínas extraídas do soro do leite é feita em solução livre de sal a um pH ajustado entre 3,5 e 5,0 dependendo do teor mineral de fonte de proteína.

De acordo com uma modalidade preferida, o pH é ajustado em uma faixa de 6,3 a 9,0, para um teor de cátions divalentes incluindo entre 0,2% e 2,5% em pó de proteína extraída do soro do leite.

De acordo com outra modalidade, um tampão pode ser adicio- nado à solução de proteína extraída do soro do leite tal que evite uma mu- dança substancial de valor de pH durante tratamento térmico da proteína extraída do soro do leite. A princípio, o tampão pode ser selecionado de qualquer sistema de tampão de qualidade de alimento, ou seja, ácido acético e seus sais, como, por exemplo, acetato de sódio ou acetato de potássio, ácido fosfórico e sais deste, por exemplo, NaH2P04, Na2HP04, KH2P04, K2HP04, ou ácido cítrico e seus sais, etc.

As proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas obtidas de acordo com o presente método deverão ter um diâmetro de menos de 1 pm, preferivelmente de 100 a 990 nm, mais preferivelmente de 100 a 700 nm, dependendo da aplicação desejada, a proporção de nanopartículas é de pelo menos 80% e a dos agregados solúveis residuais ou proteína solúvel abaixo de 20%. O diâmetro médio de nanopartícula é caracterizado por um índice de polidispersidade abaixo de 0,200. Em conseqüência, a suspensão branca obtida pela presente invenção é estável e tem aparência leitosa em uma grande faixa de pH de 3-8. A turbidez medida por absorbância a 500 nm é de pelo menos 3 unidades de absorbância por 1 % de solução de proteína, mas pode alcançar 16 unidades de absorbância quando o rendimento de nanoparticuiação for maior que 80%. A pureza de proteína extraída do soro do leite nanoparticulada produzida de acordo com o método da presente invenção pode ser obtido por determinação da quantidade de proteínas solúveis residuais. Nanopartí- culas são eliminadas por centrifugação a 20°C e 26900 g por 15 min. O so- brenadante é usado para determinar a quantidade de proteína em cuvetas de quartzo a 280 nm. Valores são expressos como porcentagem do valor inicial antes do tratamento térmico.

Proporção de nanopartículas = (Quantidade de proteínas inicial - quantidade de proteínas solúveis)/ Quantidade de proteínas inicial Sem ligar-se a qualquer teoria, acredita-se atualmente que o mé- todo como descrito resulta na formação de agregados muito pequenos de proteínas extraídas do soro do leite, ou seja, agregados com o diâmetro indi- cado, sendo, em particular, de estado desnaturado resultantes de um equilí- brio eletrostático entre forças atrativas e repulsivas presente na superfície das proteínas, que produzem as propriedades observadas. Particularmente, já que proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas têm proprieda- des emulsificantes e espumantes perfeitas, o estado desnaturado da proteí- na parece permitir interação com a fase hidrofóbica, por exemplo, uma gota grande de ar, e uma fase hidrofílica, a solução aquosa.

Logo, de acordo com outra modalidade, apresente invenção também se relaciona ao uso de proteínas extraídas do soro do leite nanopar- ticuladas como um agente emulsificador, para qual o material é idealmente apropriado, já que ele tem um sabor natural, ou seja, nenhum sabor diferen- te é criado pelo uso de tal material. Eles podem ser usados também como substituto de caseína micelar.

As proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas obtidas de acordo com o método da presente invenção podem ser usadas para a preparação de qualquer tipo de produto alimentar necessitando estabilização de uma emulsão ou uma espuma, como, por exemplo, presente em musses ou sorvetes, em cremes para café, ou também em produtos de leite de pou- ca gordura ou essencialmente livres de gordura, ou também onde eia encon- tre aplicação como substituinte de caseína micelar. Exemplos de produtos onde as proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas podem ter a- plicação são exemplarmente, leite UHT pasteurizado, leite condensado do- ce, iogurte, leites fermentados, produtos fermentados baseados em leite, chocolate ao leite, musses, espumas, emulsões, sorvetes, produtos basea- dos em cereal fermentado, pós baseados em leite, formulações para bebês, fortificações diet, comida de animais, comprimidos, suspensões bacterianas líquidas, suplemento oral seco, suplemento oral úmido.

Particularmente, as proteínas extraídas do soro do leite nanopar- ticuladas podem ser usadas tanto sozinhas como em combinação com ou- tros materiais ativos, como polissacarídeos (por exemplo, goma acácia ou carrageenans) para estabilizar matrizes e, por exemplo, matrizes de espuma de leite. Devido a seu sabor natural, o pó branqueador e a estabilidade sub- seqüente ao tratamento térmico, as presentes proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas podem ser usadas para aumentar a brancura de leite desnatado e a perceptividade ao paladar.

Além de aumentar o poder branqueador de sistemas de produ- tos lácteos para o mesmo teor de proteína total, ao mesmo tempo, o conteú- do de gordura na matriz alimentar pode ser reduzido. Essa característica representa uma vantagem particular das presentes proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas, já que elas permitem, por exemplo, adição de um creme de leite sem adição de gordura derivada do leite como tal.

Logo, de acordo com outra modalidade da presente invenção, também é envolvido um produto alimentar, um suplemento alimentar, uma composição nutricional e/ou farmacêutica contendo proteínas extraídas do soro do leite nanoparticuladas como descrito aqui.

Os seguintes exemplos ilustram a presente invenção sem limita- ção desta.

Exemplos A invenção é adicionalmente definida por referência aos seguin- tes exemplos descrevendo detalhadamente a preparação das nanopartículas da presente invenção. A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ser limitada em extensão pelas modalidades específicas divulgadas aqui, já que essas modalidades têm a intenção de ilustrar vários aspectos da invenção.

Quaisquer modalidades equivalentes têm a intenção de estar dentro da ex- tensão dessa invenção. Certamente, várias modificações da invenção em adição àquelas mostradas e descritas aqui tornar-se-ão aparentes àqueles versados na técnica da descrição precedente. Tais modificações têm a in- tenção de estar dentro da extensão das reivindicações anexadas.

Exemplo 1: Nanoparticulação de β-lactoqlobulina β-lactoglobulina (lote JE002-8-922, 13-12-2000) foi obtida de Davisco (Le Sueur, MN, EUA). A proteína foi purificada de a partir de soro de leite doce por ultra-filtração e cromatografia de troca de íons. A composição do pó é 89,7% proteína, 8,85% umidade, 1,36% cinzas (0.079% de Ca2+, 0,013% de Mg2\ 0,097% de K+, 0,576% de Na+, 0,050% de Cl"). Todos os outros reagentes usados foram de grau analítico (Merck Dermstadt, Alema- nha). A solução de proteína foi preparada a uma concentração de 0,2% por solvatação de β-lactoglobulina em água MilliQ® (Millipore), e agitação a 20°C por 2 h. Então, alíquotas de pH foram ajustadas a 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0 por adição de HCI. As soluções foram coloca- das em recipientes de vidro de 20 mL (Agilent Technologies) e seladas com cápsulas de alumínio contendo uma tampa de silício/PTFE. As soluções fo- ram aquecidas a 85°C por 15 min (tempo para alcançar a temperatura 2,30 - 3,00 min). Após o tratamento térmico, as amostras foram resfriadas em água com gelo a 20°C. O aspecto visual dos produtos (figura 1) indica que o pH ótimo de nanoparticulação é de 5,8.

Exemplo 2: Nanoparticulação de isolado de proteína extraída do soro do leite Isolado de proteína extraída do soro do leite (WPI) (Bipro®, Ba- telada JE032-1-420) foi obtido de Davisco (Le Sueur, MN, EUA). A composi- ção do pó é relatada na tabela 1. A solução de proteína foi preparada a uma concentração de 3,4% por solvatação de pó de proteína extraída do soro do leite em água MilliQ® (Millipore), e agitação a 20°C por 2 h. O pH inicial era de 7,2 Então, alíquotas de pH foram ajustadas a 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4 e 6,6 por adição de HCI 0,1 N. As soluções foram colocadas em recipientes de vidro de 20 mL (Agilent Technologies) e seladas com cápsulas de alumínio contendo uma tampa de silício/PTFE. As soluções foram aquecidas a 85°C por 15 min (tempo para alcançar a temperatura 2,30 - 2,50 min). Após o tratamento térmico, as amostras foram resfriadas em água com gelo a 20°C, A turbidez das proteínas extraídas do soro do leite aquecidas foi determinada a 500 nm e 25°C, as amostras foram diluídas para permitir a medição da faixa de 0.1-3 unidade Abs (Espectrofotômetro Uvikon 810, Kon- tron Instrument). Valores foram calculados para a concentração de proteína inicial 3,4%. O pH da nanoparticulação foi considerado alcançado sob estabi- lidade (menos que 5% de variação do valor inicial) da absorbância medida a 500 nm dentro de um intervalo de 10 minutos para a mesma amostra como ilustrado pela figura 2. Para este produto, o pH ótimo para nanoparticulação foi de 6,0 a 6,2. Para este pH ajustado antes de turbidez estável do trata- mento térmico foi de 21 e a proteína solúvel residual avaliada por absorbân- cia a 280 nm após centrifugação foi de 1,9%. Podemos concluir que 45% das proteínas iniciais foram transformadas em nanopartículas ao pH 6,0.

Exemplo 3: Observação microscópica de nanopartículas Produção de nanopartículas: A solução de proteína foi preparada a uma concentração de 2% de proteína por solvatação de pó de proteína extraída do soro do leite (WPI 90, batelada 989/2, Lactalis, Retier, França) em água MilliQ® (Millipore), e agitação a 20°C por 2 h. Então, alíquotas de pH foram ajustadas usando HCI 0,1 N ou NaOH 0,1 N. As soluções foram colocadas em recipientes de vidro de 20 mL (Agilent Technologies) e seladas com cápsulas de alumínio con- tendo uma tampa de silício/PTFE. As soluções foram aquecidas a 85°C por 15 min (tempo para alcançar a temperatura 2,30 - 3,00 min). Após o trata- mento térmico, as amostras foram resfriadas em água com gelo a 20°C. Pa- ra este produto, o pH ótimo para nanoparticulação foi de 7,4.

Observações microscópicas: Amostras nanoparticuladas líquidas foram encapsuladas em tu- bos de gel de ágar. A fixação foi alcançada por imersão em uma solução de 2,5% de glutaraideído em 0,1 M, pH de 7,4, tampão de cacodilato e pós- fixação com 2% de tetróxido de ósmio no mesmo tampão, ambas as solu- ções contendo 0,04% de vermelho de rutênio. Após desidratação em uma série de etanol graduada (70, 80, 90, 96,100% de etanol), as amostras fo- ram embebidas em resina de Spurr (Spurr/ etanol 1:1, 2:1,100%). Após po- limerização da resina (70°C, 48 horas), seções semifinas e ultrafinas foram cortadas com um ultramicrotomo Leica ultracut UCT. Seções ultrafinas, mar- cadas com uranil-acetato e citrato de chumbo, foram examinadas em mi- croscopia de transmissão de elétron (Philips CM12, 80 kV). O micrógrafo TEM é apresentado na figura 3. As nanopartículas obtidas apresentam for- mato esférico com um diâmetro de 200 nm.

Distribuição de qranulométrica As distribuições granulométricas baseadas em intensidade de nanopartículas obtidas por tratamento térmico de uma dispersão de β- lactoglobulina a 1% em peso por 15 min a 85°C a pH de 4,25 (positivamente carregados com um potencial zeta de cerca de +25mV) e a pH de 6,0 (nega- tivamente carregado com um potencial zeta de cerca de -30mV). O diâmetro hidrodinâmico Z-médio das nanopartículas foi de 229,3 nm a pH de 4,25 e 227,2 a pH de 6,0. Agregações de β-LG e de proteínas extraídas do soro do leite foram seguidas usando dispersão de luz dinâmica. Um aparelho Nano- sizer ZS (Melvern Instruments, UK) equipado com um laser emitindo a 633 nm e com poder de 4,0 mW foi usado. O instrumento foi usado na configura- ção de contradispersão, onde a detecção é feita a um ângulo de dispersão de 173°. Isso permite redução considerável de múltiplos sinais de dispersão encontrados em amostras turvas. As amostras foram colocadas em uma cé- lula de quartzo quadrada (Hellma, comprimento de 1 cm). O comprimento do raio de luz foi automaticamente estabelecido pelo aparelho, dependendo da turbidez (atenuação) da amostra. A função de autocorrelação foi calculada a partir da flutuação da intensidade dispersada. Os resultados são apresenta- dos na figura 6. Ela mostra que a partícula média é caracterizada por um índice de polidispersividade muito estreito (<0,200). Em conseqüência, a suspensão branca obtida pela presente invenção é estável e tem uma apa- rência leitosa em uma larga faixa de pH 3-8.

Exemplo 4: Nanoparticulação de uma β-lactoqlobulina a um pH constante O método descrito no exemplo 1 foi repetido com a condição de usar uma solução aquosa de 2% de β-lactoglobulina. O pH dessa solução foi ajustado a 7,0 após adição de soluções de Arginina HCI para obter uma con- centração de sal final variando de 5 a 200 mM e uma concentração final de β-lactoglobulina de 1%. Tratamento térmico subseqüente (80°C, 10 min, cer- ca de 2 min de aquecimento) foi realizado para produzir nanopartículas.

Os resultados são mostrados na figura 4 e indicam claramente que apenas na faixa de força iônica de 50 a 70 mM uma turbidez substanci- al, indicando a presença de proteínas extraídas do soro do leite nanoparticu- ladas, foi observada.

Exemplo 5: Preparação de um agente branqueador Proteínas extraídas do soro do leite nativos (WPl 95, batelada 848, Lactalis; 8% em peso de solução aquosa) foram tratadas de acordo com o exemplo 2. A luminosidade (L) resultante do produto foi medida em modo de transreflectância usando um aparelho MacBeth CE-XTH D65 10° SCE equipado com uma célula de medição de 2 mm. A luminosidade resul- tante foi L = 74.8, que podería ser comparado ao valor de L = 74.5 do leite com gordura.

Exemplo 6: Preparo de um creme para café Proteínas extraídas do soro do leite nativos (Bipro®, lote JE 032- 1-420,0,5% em peso de solução aquosa) foram misturadas a 50°C com óleo de palma parcialmente hidrogenado, 14% em peso de maltodextrina (DE 21) e em presença de tampão de fosfato-citrato 50 mM ajustado ao pH de nano- particulação de 6,0 para este Bipro®. A mistura foi homogeneizada sob 40.000/5000 kPa (400/50 bar) usando um homogeneizador Rannie e subse- qüentemente tratado com calor por 15 minutos a 85°C. A emulsão obtida mostrou uma alta estabilidade sobre um perío- do de tempo de pelo menos um mês nas condições de armazenamento a 4°C e gerou uma brancura de L = 78 comparado ao conteúdo de gordura de 15% e uma luminosidade de L = 75.9.

Exemplo 7: Preparação de uma espuma aquosa β-lactoglobulina nativa (Biopure, Davisco, lote JE 002-8-922, so- lução aquosa 2% em peso) foi misturada com solução de Arginina HC1120 mM tal que a concentração de β-lactoglobulina final fosse de 1% em peso e a de Arginina HCI fosse de 60 mM. O pH foi, então, ajustado para 7,0 por adição de HCI 1N. A mistura foi então tratada por calor a 80°C por 10 minu- tos tal que 90% da β-lactoglobulina inicial fosse convertida em nanopartícu- las com diâmetro z-médio de 130 nm. Nesse caso, o diâmetro das nanopar- tículas foi determinado usando um aparelho Nanosizer ZS (Melvern Instru- ments, UK). A amostra foi despejada em uma cuverta de quartzo e as varia- ções da luz dispersada foram automaticamente registradas. A função de au- tocorrelação obtida foi ajustada usando o método de cumulantes tal que o coeficiente de difusão das partículas pudesse ser calculado e, depois, o mesmo foi feito com o diâmetro hidrodinâmico z-médio usando a lei de Sto- kes-Einstein. Para esta medição, o índice de refração do solvente foi tomado como 1,33 e o das nanopartículas foi tomado como 1,45. Um volume de 50 mL da dispersão resultante de nanopartículas de β-lactoglobulina é então espumada por borbulhamento de nitrogênio através de uma frita de vidro geradora de bolhas de 12-16 pm para produzir um volume de espuma de 180 cm3 usando o aparelho Foamscan® padronizado (ITConcept). A estabili- dade do volume da espuma foi então seguida com tempo a 26°C usando análise de imagem e comparada à estabilidade da espuma obtida com β- lactoglobulina tratada nas mesmas condições, mas sem Arginina HCI, onde nenhuma das nanopartículas foram formada. A figura 5 mostra que a estabi- lidade do volume da espuma é grandemente melhorada pela presença de nanopartículas de β-lactoglobulina.

Exemplo 8; Produto de leite fermentado baseado em soro de leite - amos- tras de fermentação Material Isolado de proteína extraída do soro do leite (WPI) (Bipro®) foi obtido de Davisco (Le Sueur, MN, EUA) (concentração de proteína de 92.7%).

Permeato de proteína extraída do soro do leite seco por atomi- zação (Variolac 836): Concentração de lactose: 83% - Minerais: 8% - Ácido lático: 50%.

Lactose comestível (Lactalis) Água desionizada Método O pó Bipro® foi dissolvido em água desionizada para ter uma concentração de proteína de 4,6%, ou seja para 3 litros de solução, há 154,5 g de pó de WPI e 2845,5 g de água. O tempo de hidratação foi de 3 horas.

Após hidratação, a solução foi dividida em amostras de 200 mL para prepa- rar as diferentes amostras: Para cada solução, ácido lático a 50% foi adicionado para ajus- tar o pH antes do aquecimento. As amostras foram aquecidas com uma cal- deira dupla até 85°C e mantidos a esta temperatura durante 15 minutos. A- pós aquecimento, as soluções foram resfriadas a 40°C e inoculadas com Lactobacillus bulgaricus e Streptococus thermophilus. As amostras foram mantidas por 5h e 30 min em uma sala de vapor a 41 °C antes de serem co- locadas em uma sala fria a 6°C.

Os resultados são representados na Tabela 3.

Exemplo 9: Sorvete enriquecido com proteína extraída do soro do leite com teor reduzido de gordura Material Isolado de proteína extraída do soro do leite (WPI), Prolacta90® de Lactalis, Rétiers, França) com teor de proteína de 90% Pó de leite desnatado com teor de proteína de 35% Saca rose Maltodextrinas DE39 Gordura de leite anidro Emulsificador Água desionizada Ácido clorídrico comestível 1M Método Usando um tanque de 80 L duplamente revestido, o pó Prolac- ta90® foi dispersado a 50°C em água desionizada a uma concentração de proteína de 9,67% sob agitação branda para evitar formação de espuma, ou seja, 3,3 kg de Prolacta® foram dispersados em 31,05 kg de água desioniza- da. Após 1 hora de dispersão, o pH da dispersão foi ajustado para o pH de nanoparticulação por adição de HCI. A temperatura da dispersão foi aumen- tada para 85°C e mantida por 15 minutos para gerar as nanopartículas de proteína extraída do soro do leite. Após 15 minutos, a temperatura foi dimi- nuída para 50°C e os ingredientes adicionais foram sequencialmente adicio- nados à dispersão de nanopartículas (ou seja, pó de leite desnatado, malto- dextrinas DE39, sacarose, emulsificador e gordura de leite anidro). A quanti- dade final de mistura foi de 50 kg com teor de sólidos total de 39.5% e um teor de gordura de 5% em peso. Após 30 minutos de hidratação, a mistura foi homogeneizada em duas etapas (barras de 80/20) e pasteurizada (86°C/30s) antes da cura da noite para o dia.

No dia seguinte, a mistura de sorvete foi congelada a uma pro- dução adicional de 100% usando um aparelho Hoyer MF50 e endurecido a - 40°C antes de armazenamento a -20°C. O sorvete final contendo 8% em peso (20% de caseínas, 80% de proteínas extraídas do soro do leite) e 5% em peso de gordura na base de mistura de sorvete.

Exemplo 10: Nanopartículas de proteína extraída do soro do leite em pó ob- tidas por secagem por atomização Material Isolado de proteína extraída do soro do leite (WPI), Prolacta90® de Lactalis, Rétiers, França) com teor de proteína de 90% Lactose comestível Maltodextrinas DE39 Água desionizada Ácido clorídrico comestível 1M Método Usando um tanque de 100 L duplamente revestido, o pó Prolac- ta90® foi dispersado a 50°C em água desionizada a uma concentração de proteína de 10% sob agitação branda para evitar formação de espuma, ou seja, 11 kg de Prolacta® foram dispersados em 89 kg de água desionizada.

Após 1 hora de dispersão, o pH da dispersão foi ajustado para o pH de na- noparticulação (cerca de 6,3 nesse caso) por adição de HCI. A temperatura da dispersão foi aumentada para 85°C e mantido por 15 minutos para gerar as nanopartículas de proteína extraída do soro do leite. Após 15 minutos, a temperatura foi diminuída para 50°C e a dispersão de nanopartículas foi di- vidida em duas bateladas de 50 kg. Na primeira batelada, 20 kg de lactose foram dispersados em 50 kg de dispersão de nanopartículas a 50°C e mistu- rados por 30 min. Similarmente, 20 kg de maltodextrinas DE39 foram adicio- nados aos 50 kg restantes de dispersão de nanopartículas de proteína extra- ída do soro do leite.

As duas misturas foram, então, secadas por atomização em uma torre NIRO SD6.3N a uma vazão de 15 L/h. A temperatura de entrada de ar foi de 140°C e a temperatura de saída de ar foi de 80°C. O teor de água dos pós obtidos foi menor que 8%. O diâmetro de nanopartículas de proteína extraída do soro do leite foi determinado em presença de lactose e maltodextrina (DE39) em á- gua usando dispersão de luz dinâmica antes e após secagem por atomiza- ção. A concentração de proteína total foi estabelecida em 0,4% em peso por diluição de dispersão antes de secagem por atomização ou reconstituição do pó a fim de estar em regime diluído de viscosidade para as nanopartículas de proteína extraída do soro do leite. Um aparelho Nanosizer ZS (Melvern Instruments) foi usado e o diâmetro da nanopartícula foi a média de 20 me- dições. O diâmetro de partícula determinado para nanopartículas de pro- teína extraída do soro do leite na presença de lactose e maltodextrinas (DE39) foi de 310,4 nm e 306,6, respectivamente. Após reconstituição dos pós, os diâmetros respectivos foram de 265,3 nm e 268,5, respectivamente.

Essas medições confirmam que as nanopartículas de proteína extraída do soro do leite foram fisicamente estáveis em relação à secagem por atomiza- ção. Os resultados foram corrobarados por observações de microscopia TEM de 0,1% em peso de dispersões de nanopartículas de proteína extraída do soro do leite em água usando marcação negativa em presença de 1% de ácido fosfotungístico a pH 7. Um microscópico de transmissão de elétron Philips CM12 operando a 80 kV foi usado. Nanopartículas de proteína extra- ída do soro do leite foram observadas em solução antes de secagem por atomização e após reconstituição de pó seco por atomização. Nenhuma dife- rença de morfologia ou estrutura pôde ser detectada.

Claims (18)

1. Método para a produção de proteína do soro do leite nanopar- ticulada, caracterizado pelo fato de que compreende: tratar uma solução aquosa de proteína do soro do leite ajustando 0 pH em uma faixa muito estreita e precisa de ± 0,2 unidades de pH e entre 3,5 e 9 dependendo do conteúdo de metal bivalente da solução ou ajustando a força iônica da solução de proteína do soro do leite enquanto se mantém o pH constante, sendo que (a) para obter partículas carregadas negativamente, o tratamento da solução de proteína do soro do leite realizado pelo ajuste do pH para 5,6 a 6,4, quando o conteúdo de metal bivalente é abaixo de 0,2 g para 100 g de pó de proteína do soro do leite inicial ou pelo ajuste do pH para 6,3, quando o conteúdo de metal bivalente é acima de 0,2 g para 100 g mas abaixo de 2,5 g para 100 g de pó de proteína do soro do leite inicial; e (b) para obter partículas carregadas positivamente, o tratamento da solução aquosa de proteína do soro do leite inclui remover cátions livres de Ca, K, Na e Mg e ajustar o pH para 3,5 a 5; e submeter a solução aquosa tratada a uma temperatura de entre cerca de 82 °C a cerca de 89 °C, durante um período de tempo de 12 se- gundos a 25 minutos, para obter uma dispersão líquida de nanopartículas de proteína do soro do leite esférica com diâmetro de partícula menor que 1 pm; sendo que a solução não é submetida a estresse mecânico para obtenção das nanopartículas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanoparticulação espontânea de proteínas do soro do leite é induzida durante tratamento com calor em ausência de cisalhamento, em que a proporção de nanopartículas na dispersão líquida é de pelo menos 20% com a proporção de agregados solúveis residuais ou proteína solúvel sendo abaixo de 80%.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tamanho da nanopartícula apresenta um índice de polidisper- sidade abaixo de 0,2.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento com calor é realizado por um período de 15 minu- tos e a temperatura é de 85 °C.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução a um pH de 7,0 apresenta um teor de sal de 5 a 200 mM.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda secar a dispersão de nanopartículas para formar quando os agregados de nanopartículas de proteínas possuem um tamanho de 100 a 990 nM.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa de proteína do soro do leite é essencial mente livre de sais ou em que a forca iônica tenha sido ajustada por íons orgânicos ou inorgânicos de tal maneira que permita nanoparticulação a um pH cons- tante.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as proteínas do soro do leite estão presentes em uma solução aquosa em uma quantidade de 0,1% em peso a 12% em peso, com base no peso total da solução.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar outra proteína globular desminerali- zada ou levemente mineralizada à dispersão.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a outra proteína é de ovo, cereais, sementes de óleo, ou outra proteína de origem vegetal ou animal.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar um tampão à solução para evitar mudanças substanciais no pH durante o tratamento com calor.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tampão é um tampão de grau alimentício compreendendo ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico ou um sal dos mesmos.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento com calor é conduzido a uma temperatura de cerca de 84 °C a cerca de 87 °C por um tempo de 12 a 20 minutos.

14. Proteína do soro do leite nanoparticulada, caracterizada pelo fato de que é obtenível por um método, como definido na reivindicação 1, apresentando uma razão de eficiência de proteína de pelo menos 100 e a- presentando um tamanho de partícula de 100 a 990 nm e um índice de poli- dispersidade abaixo de 0,2.

15. Proteína do soro do leite nanoparticulada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que apresenta uma razão de eficiência de proteína de pelo menos 118 e um tamanho de partícula de 100 a 700 nm.

16. Produto alimentar, suplemento alimentar, composição farma- cêutica e/ou nutricional, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína do soro do leite nanoparticulada, como definida na reivindicação 14.

17. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 16, carac- terizado pelo fato de que é um produto com pouca gordura.

18. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 16, carac- terizado pelo fato de que está na forma de um creme para café, iogurte, leite UHT, pasteurizado, leite condensado doce, leites fermentados, produtos de leite fermentado, chocolate ao leite, musses, espumas, emulsões, sorvetes, pós baseados em leite, formulações para bebês, fortificantes dietéticos, co- mida de animais, comprimidos, suplemento oral seco, suplemento oral úmi- do.