KR20070057877A - 나노입자화된 유장 단백질 - Google Patents

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KR20070057877A
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리오넬 보베토
크리스토프 제이 이 슈미트
마틴 보리우
니콜라 카르리에
게를린데 운테르하슬베르거
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Abstract

본 발명은 나노입자화된 형태의 유장 단백질을 제조하는 방법 및 그에 의해 얻어진 나노입자화된 유장 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이러한 나노입자화된 유장 단백질의 유화제, 지방 대체물, 미셀라 카세인 대체물, 증백제, 발포제, 조밀화제 및/또는 충진제로서의 용도에 관한 것이다.
나노입자화된 유장 단백질

Description

나노입자화된 유장 단백질 {NANOPARTICULATED WHEY PROTEINS}
본 발명은 나노입자화된 형태의 유장 단백질을 제조하는 방법 및 그에 의해 얻어진 나노입자화된 유장 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이러한 유장 단백질의, 유화제, 지방 대체물, 미셀라 카세인 (micellar casein) 대체물, 증백제, 발포제, 조밀화제 및/또는 충진제 (filling agent) 로서의 용도에 관한 것이다.
지방 함유 식품 재료는 많은 사람들의 식단에서 상당한 비율을 차지한다. 이러한 제품의 생산에서 발생하는 문제 중 하나는, 지방이 제품의 전체 저장 수명 동안에 안정하게 유지되어, 상 분리가 발생하지 않아야 한다는 데 있다.
이러한 목적을 위하여, 일단 형성된 에멀션의 안정성을 제공하는 유화제가 이용되는데, 이는 각각 친지방성 또는 소수성 부분은 비-수용성 상에 용해되고, 극성 또는 친수성 부분은 물에 용해되는 고유 성질에 기초하여, 상기 분자를 다른 상 속에 하나의 상으로 유화하는 것을 촉진한다. 또한, 유화제는 일단 형성된 작은 방울을 응집 및 유착으로부터 보호하기도 한다. 유화제로서 하이드로콜로이드, 인지질 (레시딘) 또는 당지질과 같은 자연적으로 발생하는 물질, 및 다른 한편으로는 스테아릴-2-락틸레이트 또는 모노-, 디아실글리세라이드 등과 같은 합성제 가 사용된다.
상기 유화제의 주요한 결점중 하나는 이러한 유화제가 때때로 최종 생성물의 비용을 상당히 증가시키고, 생성물의 영양적 가치를 증가시키지는 못한다는 데 있다. 때때로, 이러한 종류의 물질들은 단백질과의 계면 경쟁을 이유로 적합한 안정성 또한 보이지 않는다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 고유한 단점을 보이지 않고 쉽게 이용 가능한, 기존 유화제의 대체물을 공급하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 높은 단백질 효율비 (Protein Efficiency Ratio (PER)) 를 갖는 지방 대체물, 증백제, 발포제, 조밀화제 및/또는 충진제를 제공하는 데 있다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 유장 단백질을 포함하는 용액을 특정한 온도에서 특정한 시간 동안 및 좁은 pH 범위에 두어, 직경 1 ㎛ 미만, 바람직하게는 100 내지 990 ㎚ 의 직경을 갖는 유장 단백질 응집체를 생산하는 단계를 포함하는 나노입자화된 유장 단백질 제조 방법이 제안된다.
특히, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 나노입자화된 유장 단백질의 제조 방법에 관한 것이다:
ⅰ) 유장 단백질 수용액을 좁은 범위의 pH 에 맞추거나, pH 를 일정하게 유지하면서 유장 단백질 제조에서 이온 강도를 조절하는 단계, 및
ⅱ) 수용액을 80 ℃ 내지 95 ℃ 의 온도에서, 10 초 내지 30 분의 시간 동안 두어, 1 ㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 구형의 나노입자화된 유장 단백질 분산액을 얻는 단계.
상기 나노입자화된 유장 단백질 분산액은, 특히 냉동-건조 또는 분무-건조에 의해 추가적으로 건조될 수 있다. 분무-건조 분말의 재조립 (reconstitution) 후 용액에서 유장 단백질 나노입자가 관찰된다는 것이 발견되어왔다. 형태 및 구조에서 어떠한 차이점도 발견되지 않았는데, 이는 유장 단백질 나노입자가 분무 건조에 대해 물리적으로 안정하다는 것을 확인시켜주는 것이다.
상기 나노입자는 100 이상의 단백질 효율비를 갖는다.
본 발명으로 이끄는 광범위한 실험 도중, 본 발명의 발명자들은, 놀랍게도, 유장 단백질 수용액 또는 그의 하나 이상의 주요 성분의 수용액을 열 처리 (80 내지 95 ℃ 의 온도, 목적하는 온도에서 10 초 내지 30 분의 시간 동안 유지) 하기 전에 매우 특정한 좁은 범위 (± 0.2 pH 단위를 의미함) 로 pH 를 맞추었을 때, 그렇게 얻어진 유장 단백질은 구형 형태이고 직경 1 ㎛ 미만의 입자 크기를 가진 미립자 형태를 보임을 발견하였다. 본 발명에 따라 제조된 유장 단백질 입자의 장점은, 전통적인 공정과는 달리, 입자 크기 감소를 유발하는 임의의 기계적 스트레스에 굴복하지 않는다는 데 있다. 본 방법은 전단 변형 없는 열 처리 도중 유장 단백질을 자발적으로 나노입자화하게 유도한다.
나노입자화된 유장 단백질은 연장된 기간 동안 수용액 시스템 내에서 지방 및/또는 공기를 안정화할 수 있기 때문에, 유화제, 지방 대체물, 미셀라 카제인 또는 발포제의 대체물로서 사용하기에 이상적으로 적합하다고 알려져 있다. 또한, 본 나노입자화된 유장 단백질은 증백제로서 사용될 수 있어, 하나의 화합물로 여러 일을 수행할 수 있다. 유장은 풍부하게 사용가능한 물질이기 때문에, 이의 사용은, 영양적 가치를 증대시키는 것과 동시에, 유화제, 충진제, 증백제 또는 발포제가 필요한 제품의 비용을 줄인다.
도면에서:
도 1 은 β-락토글로불린의 나노입자화에서의 pH 및 열처리 효과를 보여주는 실험 결과를 나타낸다.
도 2 는 500 nm 에서 탁도 측정을 이용하여 상업적 제제 (Bipro®, Batch JE032-1-420) 에서의 나노입자화 pH 를 결정하는 방법을 나타낸다.
도 3 은 pH 7.4에서 나노입자화된 유장 단백질 (2 중량%, WPI 95, Lactalis) 의 투과 전자 현미경의 마이크로그래프이다. 기준자 (scale bar) 는 200 nm 이다.
도 4 는 일정한 pH 7.0에서 단백질 나노입자의 형성에서의 이온 강도 (아르기닌 염산) 의 영향을 측정하는 실험 결과를 나타낸다.
도 5 는 나노입자화되지 않은 β-락토글로불린과 비교하여, 60 mM 의 아르기닌 염산 존재하에 pH 7.0에서 1 중량%의 β-락토글로불린 나노입자 (Davisco) 에 의해 안정화된 거품의 부피 안정성 (FVS) 을 나타낸다.
도 6 은 1 중량%의 β-락토글로불린 분산액을 85 ℃에서 15 분 동안 pH 4.25 (약 +25 mV 의 제타 전위 양전하를 띔) 및 pH 6.0 (약 -30 mV 의 제타 전위로 음전 하를 띔) 에서 열처리하여 얻은 나노입자의 강도에 기초한 (intensity-based) 크기 분포를 나타낸다. 나노입자의 Z-평균 수력학적 직경 (hydrodynamic diameter) 은 pH 4.25에서 229.3 mm이고, pH 6.0 에서 227.2이다. 음전하를 띄게한 후 TEM에 의해 얻어진, 나노입자에 대응하는 마이크로그래프를 나타내었다. 기준자는 1 ㎛ 이다.
본 방법에서 사용되는 유장 단백질로서, 임의의 상업적으로 이용 가능한 분리 유장 단백질 또는 농축 유장 단백질이 사용 될 수 있다, 즉 유장 단백질은 당업계에 공지된 임의의 유장 단백질 제조 공정, 또한 그로부터 제조된 유장 단백질 분획, 또는 β-락토글로불린 (BLG), α-락트알부민 및 세럼 알부민과 같은 단백질에 의해 얻을 수 있다. 특히, 치즈의 제조에서 부산물로 얻어진 감미 유장 (sweet whey), 및 산 카세인 생산의 부산물인 산 유장 (acid whey), 우유를 미세여과하여 얻어지는 천연 유장 또는 레닛 (rennet) 카세인 제조에서 부산물인 레닛 유장이 유장 단백질로서 사용될 수 있다. 특히 비용적 측면에서, 생산 후 추가적인 분획 공정에 투입하지 않는 유장 단백질 제제가 출발 물질로서 바람직하다. 본 발명은 소에서 얻어지는 분리 유장만으로 제한하는 것이 아니라, 양, 염소, 말 및 낙타와 같은 모든 포유류 동물 종으로부터의 분리 유장에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따른 공정은 다른 임의의 탈염 또는 약간 미네랄화한 구상 단백질, 예컨대 난 (egg) 단백질, 콩, 시리얼, 지방 종자 또는 다른 채소 또는 동물로부터 얻어지는 것에 관한 것이다. "약간 미네랄화된"의 의미는, 투석되거나 여과될 수 있는 유리 미네랄 (free mineral) 의 제거, 미네랄과 단백질의 결합 유지, 또는 농축 유장 단백질 또는 분리 유장 단백질의 제조 후 특정 미네랄 강화 없이 천연 미네랄화하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
유장 단백질은 용액의 전체 중량을 기준으로, 0.1 중량% 내지 12 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 8 중량%, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 내지 7 중량%, 더더욱 바람직하게는 0.5 중량% 내지 6 중량%, 특히 1 중량% 내지 4 중량% 양으로 수용액에 존재할 수 있다.
나노입자화 단계 전의 본 유장 단백질 제제의 수용액은, 각각의 유장 제조 공정의 부산물, 기타 단백질, 검 (gum) 또는 탄수화물과 같은 추가적인 화합물을 포함할수도 있다. 상기 용액은 또한 기타 식품 성분 (지방, 탄수화물, 식물 추출물 등) 을 포함할 수 있다. 상기 추가적인 화합물의 양은 용액의 총 중량을 기준으로 50 중량%, 바람직하게는 20 중량%, 더욱 바람직하게는 10 중량%를 넘지 않는다.
유장 단백질은, 예컨대 카세인 118/100과 비교하여 더 우수한 단백질 효율비 (PER) 를 갖는다.
PER = 신체 성장 중량 (g) / 단백질 섭취 중량 (g)
예: PER % 카세인
카세인 3.2 100
난(egg) 3.8 118
유장 3.8 118
모든 콩 2.5 78
소맥 글루텐 0.3 9
유장 단백질은 필수 아미노산 (AA) 의 훌륭한 원천이다(45%). AA 요구량은 스트레스 상태 및 중장년층에게는 증가할 수 있다: 카세인 (0.3 g 시스테인/100 g 단백질) 에 비교하여, 감미 유장 단백질은 7 배 더 많은 시스테인을 함유하고, 산 유장은 10 배 더 많은 시스테인을 함유한다. 시스테인은 글루타티온 (GSH) 합성에서 속도 결정 아미노산이고, 글루타티온은 글루타메이트 시스테인 및 글리신으로 만들어진 트리펩티드이다. 글루타티온은 스트레스 상태에서 신체 방어에 있어서 1차적으로 중요한 기능을 갖는다. 유장 단백질의 경구 보충은 HIV 감염 환자의 플라즈마 GSH 수준을 증가시킨다 (Eur. J. Clin. Invest. 2001; 31, 171-178).
본 발명에 따른 나노입자는 100 이상, 바람직하게는 118 이상의 PER 을 갖는다.
유장 단백질, 또한 그의 분획 및/또는 주요 단백질은 정제된 형태 또는 조 생성물 (crude product) 형태로도 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 나노입자화된 유장 단백질 제제를 위한 출발 물질의 염 함량은 2가의 양이온에서 2.5 % 미만, 더욱 바람직하게는 2 % 미만일 수 있다.
선택적으로, pH 조절 단계가 필요하지 않다면, pH 를 일정하게 유지하면서 유장 단백질 제제 이온 강도를 조절하는 것이 가능하다. 그때, 이온 강도는 일정한 pH 에서 나노입자화되도록 하는 방식으로 유기 또는 무기 이온에 의해 조절될 수 있다.
그 후, 출발 물질은 열처리 된다. 이와 관련하여, 약 80 내지 약 95 ℃, 바람직하게는 약 82 내지 약 89 ℃, 더욱 바람직하게는 약 84 내지 약 87 ℃ 범위, 가장 바람직하게는 약 85 ℃의 온도를 갖게 하는 것이 나노입자화된 유장 단백질을 얻는데 중요하다는 것이 발견되었다.
목적하는 온도에 도달하게 되면, 최소 10 초 및 최대 30 분 동안 (목적하는 온도에서) 유지될 것이다. 유장 단백질 수용액이 목적하는 온도 범위에서 유지되는 시간은 바람직하게는 12 내지 25 분, 더욱 바람직하게는 12 내지 20 분, 또는 더욱 바람직하게는 약 15분이다.
본원 명세서에서, 나노입자는 직경 1 ㎛ 미만의 입자, 바람직하게는 100 내지 700 nm 의 입자로 이해한다. 나노입자의 평균 직경은 투과 전자 현미경 (TEM) 을 이용하여 측정될 수 있다. 이 경우, 액상의 나노입자화된 샘플은 한천 겔 튜브에서 캡슐화된다. 고정은 2.5 % 글루타르알데히드 용액 0.1M, pH 7.4 의 카코딜레이트 (cacodylate) 버퍼에 투입하여 수행되고, 후-고정은 동일한 버퍼에서 2 % 오스뮴 테트록사이드로 수행되며, 양 용액은 0.04 % 루테늄 레드를 포함한다. 에탄올 등급 열 (70, 80, 90, 96, 100 % 에탄올) 에서 탈수소 후, 샘플을 스퍼 수지 (Spurr resin) (스퍼/에탄올 1:1, 2:1, 100%) 에 넣는다. 상기 수지의 중합 후 (70 ℃, 48 시간), 반-박형 (semi-thin) 및 초-박형 (ultra-thin) 섹션을 Leica ultracut UCT ultra-microtome 을 이용하여 자른다. 수용성 우라닐-아세테이트 및 납 시트레이트로 착색된 초-박형 섹션은 투과 전자 현미경 (Philips CM12, 80 kV) 에서 관측된다.
본 발견에 따르면, pH 및 이온 강도는 본 방법에서 중요한 요소이다. 따라서, Ca, K, Na, Mg 와 같은 유리 양이온이 실질적으로 없거나 감소시킨, 광범위하게 투석된 샘플에서, 지시된 시간 동안 열처리를 수행할 때, pH 5.4 미만에서는 응유(凝乳)가 생기고, 반면에 pH 6.8 초과에서는 가용성 유장 단백질이 생기는 것이 발견되었다. 따라서, 이러한 다소 좁은 pH 창에서만, 직경 1 ㎛ 미만의 크기를 갖는 입자 형태의 유장 단백질을 얻을 수 있다. 동일한 미립자 형태는 등전위성 pH 미만, 즉 3.5 내지 5.0에서 대칭적으로 얻게 된다.
바람직한 구현예에 따르면, 음전하를 띄는 나노입자를 얻기 위하여, 2가 양이온 속에서 낮은 함량 (100 g 의 초기 유장 단백질 분말에 대해 0.2 g 미만) 에 대해, pH 는 5.6 내지 6.4, 더욱 바람직하게는 5.8 내지 6.0의 범위로 조절된다. 유장 단백질 원료 (농축 또는 분리) 의 미네랄 함량에 따라, pH 는 8.4까지도 증가할 수 있다. 특히, 많은 양의 유리 미네랄 존재하에 음전하를 띄는 나노입자를 얻기 위해서는 pH 를 7.5 내지 8.4, 바람직하게는 7.6 내지 8.0으로 조절하고, 중간 정도 양의 유리 미네랄 존재하에 음전하를 띄는 나노입자를 얻기 위해서는 pH 를 6.4 내지 7.4, 바람직하게는 6.6 내지 7.2로 조절한다. pH 는, 산, 바람직하게는 식품 등급의 산, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 시트르산, 글루콘산 또는 락트산을 첨가하여 일반적으로 조절한다. 미네랄 함량이 높은 경우, 알칼리 용액, 바람직하게는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄과 같은 식품 등급의 알칼리 용액을 첨가하여 pH 를 일반적으로 조절한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 양전하를 띄는 나노입자를 얻기 위해서 는 유장 단백질의 나노입자화는 단백질 원료의 미네랄 함량에 따라 3.5 내지 5.0으로 조절된 pH 하에 염이 없는 용액에서 수행된다.
바람직한 구현예에 따르면, 유장 단백질 분말에 0.2 % 내지 2.5 % 포함된 2가 양이온의 함량에서, pH는 6.3 내지 9.0로 조절된다.
또 다른 구현예에 따르면, 유장 단백질의 열처리 도중 pH 값의 실질적인 변화를 막기 위해, 버퍼가 유장 단백질 수용액에 첨가될 수 있다. 원칙적으로, 버퍼는 임의의 식품 등급 버퍼 시스템, 즉 아세트산 및 그의 염, 예컨대 아세트산 나트륨 또는 아세트산 칼륨, 인산 및 그의 염, 예컨대 NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4 또는 시트르산 및 그의 염 등에서부터 선택될 수 있다.
본 방법에 따라 얻어진 나노입자화된 유장 단백질은 직경 1 ㎛ 미만, 바람직하게는 100 내지 900 nm, 더욱 바람직하게는 100 내지 700 nm 의 크기를 갖는 한편, 목적하는 적용에 따라 나노입자 비율은 80 % 이상이고 잔류 가용성 응집체 또는 가용성 단백질은 20% 미만이다. 평균 나노입자 크기는 다분산 지수 (polydispersity index) 0.200 미만을 특징으로 한다. 결론적으로, 본 발명에 의해 얻어진 백색 현탁액은 안정하고 pH 3-8의 넓은 범위에서 우유와 같은 외관을 갖는다.
500 nm 에서 흡광도에 의해 측정된 탁도는, 1 % 단백질 용액에서 3 흡광도 유닛 (absorbance unit) 이상이지만, 나노입자화 수율이 80 % 를 넘을 경우에는 16 흡광도 유닛에 도달할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 나노입자화된 유장 단백질의 순도는 잔류 가용성 단백질의 양을 측정하여 얻을 수 있다. 나노입자는 20 ℃ 및 15 분 동안 26900 g에서 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 상청액 (supernatant) 은 280 nm에서 석영 큐벳 안의 단백질 함량을 결정하기 위해 사용된다. 값은 열처리 전 초기값의 백분율로 표현된다.
나노입자의 비율 = (초기 단백질 양 - 가용성 단백질 양) / 초기 단백질 양
어떤 이론에 의존할 것 없이, 전술한 본 방법은 매우 작은 유장 단백질 응집체, 즉 상기 나타낸 크기를 갖고, 단백질의 표면에 존재하는 인력과 척력의 정전기적 균형에서 야기된 특별히 변형된 상태에 있는 응집체를 형성하고, 이 응집체가 상기 관찰된 특성을 만든다고 생각된다. 특히, 나노입자화된 유장 단백질은 완벽한 유화 및 발포 성질을 갖기 때문에, 단백질의 변형된 상태는 소수성 상, 예컨대 지방적 (fat droplet) 또는 공기와 친수성 상, 즉 수용액과의 상호작용을 일으키게 하는 것 같다.
따라서, 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 유화제로서의 나노입자화된 유장 단백질의 용도에 관한 것인데, 상기 물질은 중성적인 맛, 즉 그러한 물질을 사용시에 생성되는 이취 (off-flavor) 가 없기 때문에, 이상적으로 적합하다. 또한 상기 물질은 미셀라 카세인으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 얻어진 나노입자화된 유장 단백질은, 예컨대 무스 (mousse) 또는 아이스크림, 커피 크리머, 또는 저지방 또는 본질적으로 무지방 유제품, 또는 미셀라 카세인 대체물로서의 적용이 발견될 수 있는 곳과 같이 에멀션 또는 거품의 안정화를 필요로 하는 모든 종류의 식품 제품의 제조에 사용될 수 있다. 본 나노입자화된 유장 단백질이 적용될 수 있는 대표적인 제품의 예는 저온 살균 UHT 우유, 가당 우유, 요구르트, 발효유, 우유-베이스 발효제품, 밀크 초콜릿, 무스, 거품, 에멀션, 아이스 크림, 발효 시리얼 베이스 제품, 우유 베이스 분말, 유아용 유동식, 다이어트 강화제, 펫 (pet) 푸드, 정제, 액상 박테리아 현탁물, 건조 경구 보조제, 습식 경구 보조제이다.
특히, 본 나노입자화된 유장 단백질은, 다당류 (예컨대 아카시아 검 또는 카라기난) 와 같은 기타 활성 물질과 함께 또는 단독으로 사용되어 매트릭스, 예컨대 우유와 같은 거품 매트릭스를 안정화할 수 있다. 열처리에 수반되는 그들의 중성적인 맛, 증백력 (whitening power) 및 안정성으로 인해, 본 나노입자화된 유장 단백질은 탈지유의 백색 및 입맛 증대를 위해 사용될 수 있다.
동일한 총 단백질 함량에서 유제품 계 (system) 의 증백력을 증대시키는 것과 별도로, 동시에 식품 매트릭스 내의 지방 함량은 줄어들 수 있다. 이러한 특성은, 예컨대, 우유 그 자체에서 유도된 지방을 추가로 첨가함 없이, 우유 크리머를 첨가하게 하기 때문에, 본 나노입자화된 유장 단백질의 특별한 장점이 된다.
따라서, 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 본원에서 기술한 나노입자화된 유장 단백질을 함유하는 식품 제품, 식품 보조제, 영양 및/또는 약학 조성물도 포함한다.
다음의 실시예는 본 발명을 실시예로만 한정함 없이 본 발명을 설명한다.
본 발명은, 본 발명의 나노입자의 제조를 상세히 설명하는 다음의 실시예를 참조로 하여 더욱 잘 정의된다. 이러한 구현예들은 본 발명의 몇몇 측면만을 설명하기 위함이기 때문에, 본원에서 청구하고 설명된 본 발명은 본원에 개시된 특정한 구현예에 의해 범위가 제한되는 것은 아니다. 모든 동등한 구현예들은 본 발명의 범위 내임을 의도한다. 실제로, 본원에서 기술하고 구현한 것과 더불어, 전술한 것으로부터 본 발명의 다양한 변형들은 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형들은 또한 본원 청구항의 범위 내에 해당함을 의도한다.
실시예 1: 나노입자화된 β- 락토글로불린
Davisco (Le Sueur, MN, 미국) 로부터 β-락토글로불린 (로트 JE002-8-922, 13-12-2000) 을 얻었다. 상기 단백질을 감미 유장으로부터 초미세-여과 및 이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 분말의 조성은 단백질 89.7 %, 수분 8.85 %, 회분 (ash) 1.36 % (0.079 % Ca2 +, 0.013 % Mg2 +, 0.097 % K+, 0.576 % Na+, 0.050 % Cl-) 이다. 사용된 다른 모든 시약은 분석 등급이었다 (Merck Darmstadt, 독일). β-락토글로불린을 MilliQ® 물 (Millipore) 에 용매화하고 20 ℃ 에서 2 시간 동안 교반하여, 0.2 % 농도의 단백질 용액을 제조하였다. 그 후 염산을 첨가하여, 분취액 (aliquot) 의 pH 를 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0으로 맞추었다. 상기 용액을 20 ml 유리 바이알 (Agilent Technologies) 에 채우고 규소/PTFE 실링을 포함하는 알루미늄 캡슐로 봉하였다. 상기 용액을 85 ℃에서 15 분 동안 가열하였다 (상기 온도에 도달하는 시간은 2.30 - 3.00 분). 상기 열처리 후, 샘플을 얼음물에서 20 ℃ 로 냉각하였다.
제품의 외관 양상 (도 1) 은 나노입자화의 최적 pH 가 5.8 임을 나타낸다.
실시예 2: 분리 유장 단백질의 나노입자화
분리 유장 단백질 (WPI) (Bipro®, 배치 JE032-1-420) 을 Davisco (Le Sueur, MN, 미국) 로부터 얻었다. 상기 분말의 조성을 표 1 에 나타낸다.
유장 단백질 분말을 MilliQ® 물 (Millipore) 에 용매화하고, 20 ℃ 에서 2 시간 동안 교반하여, 3.4 % 단백질 농도의 단백질 용액을 제조하였다. 초기 pH는 7.2였다. 그 후 0.1N 염산을 첨가하여 분취액의 pH를 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4 및 6.6으로 맞추었다. 상기 용액을 20 ml 유리 바이알 (Agilent Technologies) 에 채우고 규소/PTFE 실링을 포함하는 알루미늄 캡슐로 봉하였다. 상기 용액을 85 ℃에서 15 분 동안 가열하였다 (상기 온도에 도달하는 시간은 2.30 - 2.50 분). 상기 열처리 후, 샘플을 얼음물에서 20 ℃로 냉각하였다.
가열된 유장 단백질 탁도를 500 nm 및 25℃에서 측정하였고, 샘플을 0.1-3 Abs 유닛 (Spectrophotometer Uvikon 810, Kontron Instrument) 의 범위에서 측정하도록 희석하였다. 초기 단백질 농도 3.4 % 에 대한 측정값을 계산하였다.
나노입자화의 pH 는, 도 2 에서 나타나듯이, 동일한 샘플에 대하여 10 분 간격으로 500 nm 에서 측정된 흡광도에서 안정화 (초기 값의 5% 차이 미만) 에 도달한다고 여겨졌다. 이 생성물에서, 나노입자화 최적 pH 는 6.0 내지 6.2이었다. 열처리 전에 맞춘 이 pH 에 있어서, 안정적인 탁도는 21 이였고 원심 분리 후 280 nm 에서 흡광도에 의해 평가된 잔류 가용성 단백질은 1.9 % 이었다. 45 % 의 초기 단백질이 pH 6.0 에서 나노입자로 바뀌었다고 결론지을 수 있다.
표 1: WPI의 조성 및 나노입자화 후의 샘플의 특성
공급자 Davisco
제품명 Bipro
배치 번호 JE 032-1-420
조성 (mg/100g)
나트륨 650
칼륨 44
염화물*10 ≤40가정 10
칼슘 82
인 49
마그네슘 6
초기 pH 7.2
pH 나노입자화 6.0
3.4 % 단백질 용액의 탁도(500 nm) 21
280 nm 에서의 흡광도에 의한 잔존 가용성 단백질(%) 1.9
실시예 3: 나노입자의 미세 관찰
나노입자의 제조:
유장 단백질 분말 (WPI 90 batch 989/2, Lactalis, Retier, 프랑스) 을 MilliQ® 물 (Millipore) 에 용매화하고, 20 ℃ 에서 2 시간 동안 교반하여 2 % 단백질 농도의 단백질 용액을 제조하였다. 그 후 분취액의 pH 를 0.1 N 염산 또는 0.1 N NaOH 를 이용하여 맞추었다. 상기 용액을 20 ml 유리 바이알 (Agilent Technologies) 에 채우고 규소/PTFE 실링을 포함하는 알루미늄 캡슐로 봉하였다. 상기 용액을 85 ℃ 에서 15 분 동안 가열하였다 (상기 온도에 도달하는 시간은 2.30 - 2.50 분). 상기 열처리 후, 샘플을 얼음물에서 20 ℃ 로 냉각하였다. 이 생성물에서 최적의 나노입지화 pH 는 7.4이었다.
미시 관찰:
액상의 나노입자화된 샘플을 한천 겔 튜브에서 캡슐화하였다. 2.5 % 글루타르알데히드 0.1 M 용액, pH 7.4의 카코딜레이트 버퍼에 투입하여 고정을 수행하였고, 후-고정은 동일한 버퍼에서 2 % 오스뮴 테트록사이드를 투입하여 수행하였으며, 양 용액은 0.04 % 루테늄 레드를 함유하였다. 에탄올 등급 열 (70, 80, 90, 96, 100 % 에탄올) 에서 탈수소 후, 샘플을 스퍼 수지 (Spurr resin) (스퍼/에탄올 1:1, 2:1, 100%) 에 넣었다. 상기 수지의 중합 후 (70 ℃, 48 시간), 반-박형 및 초-박형 섹션을 Leica ultracut UCT ultra-microtome 을 이용하여 잘랐다. 수용성 우라닐-아세테이트 및 납 시트레이트로 염색된 초-박형 섹션을 투과 전자 현미경 (Philips CM12, 80 kV) 에서 관찰하였다.
도 3 에 TEM 마이크로그래프를 나타내었다. 얻어진 나노입자는 직경 200 nm 의 구형을 나타낸다.
입자 크기 분포
1 중량% 의 β-락토글로불린 분산액을 85 ℃에서 15 분 동안 pH 4.25 (약 +25 mV 의 제타 전위로 양전하를 띔) 및 pH 6.0 (약 -30 mV 의 제타 전위로 음전하를 띔) 에서 열처리하여 얻은 나노입자에 대해 나노입자의 강도에 기초한 크기 분포를 측정하였다. 나노입자의 Z-평균 수력학적 직경 (hydrodynamic diameter) 은 pH 4.25에서 229.3 nm, pH 6.0 에서 227.2 nm 이었다. 그 후 β-LG 및 유장 단백질 응집체를 동적 광산란 (Dynamic Light Scattering) 하였다. 4.0 mW 전력으로 633 nm 에서 방출되는 레이저가 장착된 Nanosizer ZS 장치 (Malvern Instruments, UK) 를 사용하였다. 173 °의 산란각에서 검출이 시행되고, 후방산란 배열 상태에서 상기 장치를 사용하였다. 이것은 탁한 샘플에서 발견되는 다중 산란 신호를 상당히 감소시키게 한다. 샘플을 정사각형의 석영 셀 (Hellma, 경로 길이 1 cm) 에 넣었다. 샘플의 탁도 (희석) 에 따라, 광 빔의 경로 길이가 장치에 의해 자동으로 설정되었다. 자기상관 (autocorrelation)　함수를 산란된 강도의 변동으로부터 계산하였다. 상기 결과를 도 6 에 나타낸다. 이는 평균 나노입자 크기는 매우 좁은 다분산 지수 (polydispersity index) (< 0.200) 임을 특징으로 함을 보여준다. 결론적으로, 본 발명에 의해 얻어진 백색 현탁액은 안정하고 pH 3-8의 넓은 범위에서 우유와 같은 형상을 띈다.
실시예 4: 일정한 pH 에서의 β- 락토글로블린의 나노입자화
2 % β-락토글로블린 수용액을 사용하는 조건으로, 실시예 1 에서 기술된 방법을 반복하였다. 아르기닌이 HCl 용액을 첨가한 후 용액의 pH 를 7.0으로 맞추어 최종 염 농도 5 내지 200 mM 범위 및 최종 β-락토글로블린 농도 1% 를 얻었다. 이어서, 나노입자를 생산하기 위해 열처리 (80 ℃, 10 분, 온도도달시간 약 2분) 를 실시하였다.
상기 결과가 도 4 에 나타나고, 이는 약 50 내지 70 mM 범위의 이온 강도에서만, 나노입자화된 유장 단백질의 존재를 나타내는 실질적인 탁도가 관찰되었음을 분명히 보여준다.
실시예 5: 증백제의 제조
천연 유장 단백질 (WPI 95 배치 848, Lactalis; 8 중량% 수용액) 을 실시예 2 에 따라 처리하였다. 2 mm 측정 셀이 장착된 MacBeth CE-XTH D65 10°SCE 장치를 사용하여 투과-반사 모드에서 생성 제품의 밝기 (L) 를 측정하였다. 완전-지방 우유의 L = 74.5의 값과 비교되는, 상기 생성 제품의 밝기는 L = 74.8이었다.
실시예 6: 커피 크리머의 제조
천연 유장 단백질 (Bipro®, 로트 JE 032-1-420, 0.5 중량% 수용액) 을 50 ℃ 에서 10 중량% 의 부분적으로 수소화된 야자유, 14 중량% 의 말토덱스트린(DE 21) 과 혼합하고, 50 mM의 인산염-구연산염 버퍼의 존재하에 상기 Bipro®의 나노입자화 pH 를 6.0으로 맞추었다. Rannie 균질기 (homogeniser) 를 이용하여 400/50 바 (bar) 에서 상기 혼합물을 균질화하였고, 이어서 85 ℃ 에서 15 분간 열처리하였다.
얻어진 에멀션은 4 ℃ 의 저장 조건에서 한 달 이상의 기간 동안 높은 안정성을 보였고, 15 % 지방을 함유하고 밝기 L = 75.9를 갖는 참조 액상 크리머 (Creme a Cafe, Emmi, 스위스) 와 비교하여, L = 78의 밝기를 나타내었다.
실시예 7: 수용성 거품 ( foam ) 의 제조
천연 β-락토글로불린 (Biopure, Davisco, 로트 JE 002-8-922, 2 중량% 수용액) 을 120 mM 의 아르기닌 HCl 용액과 혼합하여 최종 β-락토글로불린 농도 1 중량% 및 아르기닌 HCl 60 mM 이 되었다. 1 N HCl 을 첨가하여 pH 를 7.0으로 맞추었다. 이후 상기 혼합물을 80 ℃ 에서 10 분 동안 열처리하여 초기 β-락토글로불린의 90 % 가 z-평균 직경 130 nm 를 갖는 나노입자로 전환되도록 하였다. 이 경우, 나노입자의 직경을 Nanosizer ZS 장치 (Malvern Instruments, 영국) 를 사용하여 측정하였다. 상기 샘플을 석영 큐벳에 넣고, 산란 광의 변화를 자동으로 기록하였다. 수득한 자기상관 (autocorrelation)　함수를 큐뮬런트 (cumulant) 방법을 사용하여 적용하여, 입자의 확산 계수를 계산할 수 있었고 그 후 Stokes-Einstein 법칙을 이용하여 z-평균 수력학적 직경을 계산할 수 있었다. 이 측정에서, 용매의 굴절률은 1.33이었고, 나노입자의 굴절률은 1.45이었다. 부피 50 mL 의 β-락토글로불린 나노입자의 생성 분산액을 12 - 16 ㎛ 의 거품을 발생시키는 유리 프릿을 통해 질소를 주입하여 거품으로 만들어 표준화된 FoamscanTM (ITConcept) 장치를 이용하여 부피 180 ㎤ 의 거품을 생성하였다. 거품의 부피 안정성을 이미지 분석기를 이용하여 26 ℃ 에서 시간 경과에 따라 관찰하였고, 동일한 조건이지만 아르기닌 HCl 없이 처리된, 나노입자 없는 β-락토글로불린에서 얻어진 거품의 안정성과 비교하였다. 도 5 는 거품 부피 안정성이 β-락토글로불린 나노입자의 존재에 의해 크게 향상되었음을 보여준다.
실시예 8: 유장 기초 발효 유제품 - 발효 실험
재료
Davisco (Le Sueur, MN, 미국) 에서 얻은 분리 유장 단백질 (WPI) (Bipro®)(단백질 농도 92.7 %)
분무 건조 유장 퍼미에이트 (permeate) (Variolac 836): 락토스 농도: 83 % -미네랄: 8 %
락트산 50 %
식용 락토스 (Lactalis)
탈-이온 수
방법
4.6 % 의 단백질 농도, 즉 WPI 분말 154.5 g 및 물 2845.5 g 의 3 리터의 용액을 갖게 하기 위해, Bipro® 분말을 탈-이온수에 용해시켰다. 수화 시간은 3 시간이었다. 수화 후, 상기 용액을 다른 실험을 하기 위해 200 ml 의 샘플로 나누었다.
실험 유장 퍼미에이트(%) 락토스(%) pH 조절 85 ℃가열/ 15 분
1 2.9 2.5 6.5 +
2 0 5 6 +
3 0 5 6.7 -
4 0 5 6.7 +
5 0 5 6.1 +
6 0 0 6 +
7 0 5 (pH 조절 후 첨가) 6 -
8 0 5 (pH 조절 후 첨가) 6 +
각 용액에 대하여, 가열 전에 50 % 락트산을 pH 조절을 위해 첨가하였다. 샘플을 이중 보일러로 85 ℃ 로 가열하고 15 분 동안 상기 온도를 유지하였다. 가열 후, 용액을 40 ℃ 로 냉각하고 불가리아 젖산간균 (Lactobacillus bulgaricus) 및 스트렙토코쿠스 테르모필루스 (Streptococcus thermophilus) 를 섞어 넣었다. 샘플을 6 ℃ 의 냉장실에 두기 전에 41 ℃ 의 한증실에 5 시간 30 분 동안 두었다.
상기 결과를 표 3 에 나타내었다.
실험 유장 퍼미에이트 락토스 pH 가열 5 시간 30 분 후 pH 외관
1 + + 6.5 + 4.68 매우 단단함
2 - + 6 + 4.7 단단함
3 - + 6.7 - 5.78 액상
4 - + 6.7 + 4.81 매우 단단함
5 - + 6.1 + 4.59 매우 단단함
6 - - 6 + 4.99 매우 단단함
7 - -pH 조절 후 첨가 6 - 4.87 백색 얼룩있는 액상
8 - -pH 조절 후 첨가 6 + 4.77 단단함
실시예 9: 감소된 지방 함량의 유장 단백질 증대 아이스크림
재료
단백질 함량 90 % 의 분리 유장 단백질 (WPI, Lactalis 제조 Prolacta90®, Retiers, 프랑스)
단백질 함량 35 % 의 탈지유 분말
수크로스
말토덱스트린 DE39
무수 우유 지방
유화제
탈-이온수
식용 염산 1 M
방법
이중으로 싸인 80 L 탱크를 이용하여, Prolacta90® 분말을 거품 형성을 피하기 위해 서서히 저으면서 50 ℃ 의 탈-이온수에 단백질 농도가 9.67 중량% 되도록, 즉 3.3 kg 의 Prolacta90® 을 31.05 kg 의 탈 이온수에 분산하였다. 분산 1 시간 후, HCl 을 첨가하여 상기 분산액의 pH 를 나노입자화 pH 로 맞추었다. 유장 단백질 나노입자를 생성하기 위하여 분산액의 온도를 85 ℃ 로 높이고, 15 분간 유지하였다. 15 분 후, 온도를 50 ℃ 로 낮추었고 추가 성분들을 차례로 나노입자 분산액에 투입하였다 (즉, 탈지유, 분말, 말토덱스트린 DE39, 수크로스, 유화제 및 무수 우유 지방). 최종 혼합물 양은 50 kg 로, 총 고체 함량 39.5 % 및 지방 함량 5 중량% 이었다. 수화 30 분 후, 상기 혼합물을 두-단계 균질화하였고 (80/20 바), 밤새 숙성하기 전에 저온 살균하였다 (86 ℃/30초).
하루 후, 아이스 크림 혼합물을 Hoyer MF50 장치를 이용하여 100 % 오버런으로 냉동하고 -20 ℃ 로 저장하기 전에 -40 ℃ 로 경화시켰다. 최종 아이스 크림은 아이스 크림 혼합물 기준으로, 8 중량% 의 단백질 (20 % 카세인, 80 % 유장 단백질) 및 5 중량% 지방을 포함하였다.
실시예 10: 분무 건조로 얻어진 분말화된 유장 단백질 나노입자
재료
단백질 함량 90 % 의 분리 유장 단백질 (WPI, Lactalis 제조 Prolacta90®, Retiers, 프랑스)
식용 락토스
말토덱스트린 DE39
탈-이온수
식용 염산 1 M
방법
이중으로 싸인 100 L 탱크를 이용하여, Prolacta90® 분말을 거품 형성을 피하기 위해 서서히 저으면서 50 ℃ 의 탈-이온수에 단백질 농도가 10 중량% 되도록, 즉 11 kg 의 Prolacta90® 을 89 kg 의 탈-이온수에 분산하였다. 분산 1 시간 후, HCl 을 첨가하여 상기 분산액의 pH 를 나노입자화 pH (이 경우 약 6.3) 로 맞추었다. 유장 단백질 나노입자를 생성하기 위하여 분산액의 온도를 85 ℃ 로 높이고, 15 분간 유지하였다. 15 분 후, 온도를 50 ℃ 로 낮추었고, 10 중량% 의 유장 단백질 나노입자 분산액을 50 kg 의 두 배치로 나누었다. 첫 번째 실험에서, 20 kg 의 락토스를 50 ℃ 에서 50 kg 의 나노입자 분산액에 분산시키고 30 분 동안 교반하였다. 유사하게, 20 kg 의 말토덱스트린 DE39 를 남아있는 50 kg 유장 단백질 나노입자 분산액에 첨가하였다.
이후 상기 두 혼합물을 15 L/h 의 유속으로 NIRO SD6.3N 타워에 분무 건조하였다. 투입 공기 온도는 140 ℃ 이었고, 유출 공기 온도는 80 ℃ 이었다. 수득된 분말의 함수량은 5 % 미만이었다.
유장 단백질 나노입자의 크기를, 분무 건조 전과 후에, 동적 광산란을 이용하여 물속의 락토스 및 말토덱스트린 (DE39) 의 존재하에 측정하였다. 유장 단백질 나노입자의 희석된 점도 영역에 있게 하기 위해, 분무 건조 또는 분말의 재조립 전에 분산액을 희석하여 총 단백질 농도를 0.4 중량% 로 맞추었다. Nanosizer ZS 장치 (Malvern Instruments) 를 사용하였고 나노입자의 직경을 20 회 측정하여 평균 내었다.
락토스 및 말토덱스트린 (DE39) 의 존재하의 측정된 유장 단백질 나노입자의 입자 직경은 각각 310.4 nm, 306.6 nm 이었다. 분말의 재조립 후, 각각의 직경은 265.3 nm, 268.5 nm 이었다. 상기 측정결과는 유장 단백질 나노입자는 분무 건조에 대하여 물리적으로 안정함을 확신시켜준다. 상기 결과는 pH 7 의 1 % 포스포텅그스트산 존재하의 음전하 염색 (staining) 을 이용하여 물속의 0.1 중량% 의 유장 단백질 나노입자 분산액의 TEM 미시 관측에 의해 보강되었다. 80 kV 에서 작동하는 Philips CM12 투과 전자 현미경을 사용하였다. 유장 단백질은 분무 건조 전과 분무 건조된 분말의 재조립 후에 용액에서 관찰되었다. 형태 및 구조에서 차이점은 발견되지 않았다.

Claims (18)

  1. 하기 단계를 포함하는, 나노입자화된 유장 단백질의 제조 방법:
    ⅰ) 유장 단백질 수용액의 pH 를 매우 정확하고 좁은 범위로 조절하거나, pH 를 일정하게 유지하면서 유장 단백질 제제의 이온 강도를 조절하는 단계, 및
    ⅱ) 상기 수용액을 80 ℃ 내지 95 ℃ 의 온도에서, 10 초 내지 30 분의 시간 동안 두어, 1 ㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 구형 나노입자화된 유장 단백질 분산액을 얻는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 전단 변형 없는 열 처리 동안 유장 단백질의 자발적인 나노입자화를 유도하며, 분산액의 나노입자 비율이 20 % 이상이고 잔류 가용성 응집체 또는 가용성 단백질의 비율은 80 % 미만인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 평균 나노입자 크기가 다분산 지수 (polydispersity index) 0.200 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 시간이 15 분이고 온도가 85 ℃ 인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하기인 것인 방법:
    음전하를 띄는 나노입자를 얻기 위해서, pH 가 5.6 내지 6.4, 바람직하게는 5.6 내지 6.0이거나.
    많은 양의 유리 (free) 미네랄 존재하에 음전하를 띄는 나노입자를 얻기 위해서, pH 가 7.5 내지 8.4, 바람직하게는 7.6 내지 8.0이거나,
    중간 정도 양의 유리 미네랄 존재하에 음전하를 띄는 나노입자를 얻기 위해서, pH 가 6.4 내지 7.4, 바람직하게는 6.6 내지 7.2인 것인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 양전하를 띄는 나노입자를 얻기 위해서, pH 가 3.5 내지 5.0 인 것인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 나노입자 분산액이 건조되는 것인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유장 단백질 수용액이 본질적으로 염이 없거나 일정한 pH 에서 나노입자화되도록하는 방식으로 유기 또는 무기 이온에 의해 이온 강도가 조절되는 것인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유장 단백질이 수용액 속에 용액의 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 12 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 8 중량%, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 내지 7 중량%, 더더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 4 중량% 의 양으로 존재하는 것인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유장이 미네랄이 제거된 또는 미네랄을 약간 함유한 구상 단백질, 특히 난 (egg), 콩, 시리얼, 지방종자 또는 다른 채소 또는 동물로부터 얻어지는 구상 단백질에 의해 치환되는 것인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는, 나노입자화된 유장 단백질.
  12. 제 11 항에 있어서, 단백질 효율이 118 이상인 나노입자화된 유장 단백질.
  13. 단백질 효율비가 100 이상인 제 11 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는, 나노입자화된 단백질.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 하나의 항에 따른 나노입자화된 유장 단백질의, 식품 제품, 식품 보조제, 영양 및/또는 약학 조성물 제조를 위한 용도.
  15. 제 14 항에 있어서, 저지방 제품을 위한 용도.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 커피 크리머, 요구르트, 저온살균 UHT 우유, 가당 우유 (sweet condensed milk), 발효유, 우유-베이스 발효제품, 밀크 초콜 릿, 무스 (mousses), 거품 (foam), 에멀션, 아이스 크림, 우유 베이스 분말, 유아용 유동식, 다이어트 강화제, 펫 (pet) 푸드, 또는 정제 (tablet), 건조 경구 보충제, 습식 경구 보충제를 위한 용도.
  17. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 하나의 항에 따른 나노입자화된 유장 단백질을 함유하는, 식품 제품, 식품 보충제, 영양 및/또는 약학 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 조성물이 커피 크리머, 요구르트, 발효유, 우유-베이스 발효제품, 무스, 아이스 크림, 우유 베이스 분말, 유아용 유동식, 다이어트 강화제, 펫 (pet) 푸드, 정제, 또는 건조 경구 보충제, 습식 경구 보충제인 것인 조성물.
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