CN103705395B

CN103705395B - 乳清蛋白组合物及其在美容中的用途

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Publication number: CN103705395B
Application number: CN201410004016.XA
Authority: CN
Inventors: 黄亚东; 王丽杰; 项琪; 贝煜
Original assignee: Medical And Biological Technology Research And Development Center Jinan Univ G; Guangzhou Jin Yang Cosmetics Co Ltd
Current assignee: Medical And Biological Technology Research And Development Center Jinan Univ G; Guangzhou Jin Yang Cosmetics Co Ltd
Priority date: 2014-01-03
Filing date: 2014-01-03
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2034-01-03
Also published as: CN103705395A

Abstract

本发明提供一种以乳清蛋白为核心的组合物，具体是以乳清蛋白纳米粒为主要材质，其包含0.1～50重量％的乳清蛋白，0～1重量％的表皮细胞生长因子(EGF)，所述组合物可单独使用，和/或作为载体及传递介质，负载表皮细胞生长因子生物活性蛋白进一步制备成化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂或膏霜剂。优选地，所述乳清蛋白以纳米粒形式存在，其粒径为100nm～2μm，优选100nm～500nm，并且所述纳米粒负载有EGF，形成负载有EGF的乳清蛋白纳米粒。本发明还提供制备负载有EGF的乳清蛋白纳米粒的方法。

Description

乳清蛋白组合物及其在美容中的用途

技术领域

本发明提供一种以乳清蛋白为核心的组合物，具体是以乳清蛋白纳米粒为主要材质，其可单独使用，和/或作为载体及传递介质，负载有表皮细胞生长因子(EGF)生物活性蛋白进一步制备成化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。属于美容护肤品的技术领域。

技术背景

乳清蛋白(wheyprotein)被称为蛋白之王，是从牛奶中提取的一种蛋白质，牛乳中87％是水分，13％是乳固体；乳固体中37％是乳糖，30％是脂肪，27％是乳蛋白。而乳蛋白中80％是酪蛋白，20％是乳清蛋白，后者是牛乳中的精华。以其纯度高、吸收率高、氨基酸组成最合理等诸多优势被推为“蛋白之王”。它是由干酪生产过程中所产生的副产品乳清经过特殊工艺浓缩精制而成的一类蛋白质，乳清浓缩蛋白(wheyproteinconcentration，WPC)是指从巴氏杀菌的乳清中尽量去除非蛋白质成分，蛋白质含量在34％～82％的产品[张丹凤.乳清蛋白的特性及其在乳制品生产中的应用[J].中国乳业，2007(3)：27-28.]。乳清蛋白中含有β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白和乳过氧化物酶等人体必需的多种活性蛋白，且配比合理，接近人体的需求比例，是人体生长、发育、抗衰老等生命活动不可缺少的精华物质。其中，β-乳球蛋白具有增强细胞清除自由基，提高细胞膜抗氧化性的能力；α-乳白蛋白与乳铁蛋白等成分富含胱氨酸残基，能促进GSH的合成，维持细胞和组织的GSH水平，并具有在细胞分裂过程中稳定DNA的功能，具有营养细胞，调节细胞正常代谢，避免表皮细胞的过早凋亡和角质细胞的堆积，起到美白嫩肤的作用。

作为天然乳液的典型例子，牛奶从古代就被用于化妆品，也被认为是中国历史上第一个“美容秘密”。古埃及艳后克利欧佩特拉和许多公主都用牛奶沐浴为了保持她们皮肤的柔软。后来，印第安女性用牛奶来做成可撕掉的美容面膜，用于她们的面部和身体，也把牛奶混合于植物制品里来清洁、纯化和滋养她们的皮肤和头发。法国Lactofil.GatteffoSSe公司开发了Lactofil等一系列以牛奶乳清蛋白质衍生物为基础的化妆品。这一系列包括三种产品：LactofilMoist，不仅含有乳糖，脂肪含量低，具有滋养和保湿的活性，保湿性能优越；LactofilFoam，天然的发泡增强剂，富含酪蛋白酸钠，提供保湿和发泡特性，用于身体护理，头发护理和化妆品；LactofilSensitive，具有使敏感肌肤正常化和固化的活性，能在皮肤上能起到缓冲的作用，保持皮肤的湿度平衡进而带来皮肤紧实的效果。上述产品已经上市且得到了广泛的应用。

雀巢技术公司的已授权的发明专利CN101031208，发明名称为“纳米微粒化的乳清蛋白”(对应的国际公布为WO2006/034857)，该专利技术通过将乳清蛋白水溶液pH值从5.6调整至6.4或者在保持pH值恒定的同时调节离子强度并且将水溶液加热80℃至95℃之间的温度持续10秒至30分钟，以得到微粒大小小于1μm的纳米微粒化乳清蛋白。

然而，这一技术需要调整pH值和进行高温变性操作，这些对蛋白的生物活性具有不良影响。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明分别采用溶剂蒸发法和乳化交联法制备负载有表皮细胞生长因子(EGF)(例如，重组人表皮细胞生长因子(rhEGF))的乳清蛋白纳米粒，无须调整pH值和进行高温变性操作，避免了剧烈条件对蛋白生物活性的影响。这是本发明的独特之处。

本发明还公开了一种以乳清蛋白为核心的组合物，具体是以乳清蛋白纳米粒为主要材质，其可单独使用，和/或作为载体及传递介质，负载表皮细胞生长因子(EGF)生物活性蛋白进一步制备成化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。所述组合物具有滋润、保湿、祛角质、抗衰、抗氧化的作用，乳清蛋白纳米粒还能使携带的活性成分深入深层皮肤，清除皮肤内部自由基，活化深层皮肤细胞，特别适用于敏感肌肤，起到重建表皮，修复敏感肌肤，抗皱嫩肤的作用。

在本发明的第一个方面，提供了一种以乳清蛋白为核心的组合物，其包含0.1～50重量％的乳清蛋白，0～1重量％的EGF。

其中所述乳清蛋白来源于哺乳动物，优选来源于牛，可以是市售的乳清蛋白分离物和浓缩物，特别优选是蛋白质含量在34％～82％的乳清浓缩蛋白。

其中所述乳清蛋白是以纳米粒的形态存在，其粒径为100nm～2μm，优选100nm～500nm。

其中所述EGF优选为基因工程技术获得的重组人EGF(rhEGF)，其氨基酸序列为SEQIDNO：1所示：

AsnSerAspSerGluCysProLeuSerHisAspGlyTyrCysLeuHisAspGlyValCysMetTyrIleGluAlaLeuAspLysTyrAlaCysAsnCysValValGlyTyrIlleGlyGluArgCysGlnTyrArgAspLeuLysTrpTrpGluLeuArg(53aa，SEQIDNO：1)。

在本发明的第二个方面，提供了一种以乳清蛋白纳米粒为载体的负载EGF的活性半成品(在本发明中还称为EGF乳清蛋白纳米粒)及其制备方法。

在制备所述EGF乳清蛋白纳米粒时，所用的各原料的质量百分比如下：

其中所述溶剂为蒸馏水或NaCl溶液，优选为10mMNaCl溶液；

其中所述脱水剂为甲醇、乙醇或丙酮中的任一种，优选乙醇，更优选95％的乙醇；

其中所述交联剂为戊二醛、甲基聚乙烯-右旋糖苷中的任一种，优选戊二醛。

本发明的EGF乳清蛋白纳米粒可采用下述步骤制备：

其中制备所述EGF乳清蛋白纳米粒所用的各原料的质量百分比如下：

(1)精密称取上述处方量的乳清蛋白，溶解于溶剂中；

(2)精密称取EGF加入步骤(1)获得的乳清蛋白溶液中，室温搅拌下(300转/min)以0.5ml/min的速率持续加入脱水剂，再加入交联剂，25℃交联固化12h；

(3)减压浓缩除去脱水剂，得到乳清蛋白纳米粒-EGF胶体溶液；

(4)将步骤(3)得到的乳清蛋白纳米粒-EGF胶体溶液经超速冷冻(4℃)离心(40,000r·min^-1)1～3h，得到的沉淀物即为所述负载有EGF的乳清蛋白纳米粒组合物。

上述制备方法在本发明中还称为溶剂蒸发法(也称为溶剂挥散法)。

其中所述乳清蛋白来源于哺乳动物，优选来源于牛，可以是市售的乳清蛋白分离物和浓缩物，优选蛋白质含量在34％～82％的乳清浓缩蛋白。

其中所述EGF优选自基因工程技术获得的重组人EGF(rhEGF)，其氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。

其中所述溶剂为蒸馏水或NaCl溶液，优选为10mMNaCl溶液；所述脱水剂为甲醇、乙醇或丙酮中的任一种，优选为乙醇，更优选为95％的乙醇；所述交联剂为戊二醛、甲基聚乙烯-右旋糖苷中的任一种，优选为戊二醛。

优选地，本发明的EGF乳清蛋白纳米粒可采用下述步骤制备：其中制备所述EGF乳清蛋白纳米粒所用的各原料的质量百分比如下：

制备过程：

精密称上述处方量的乳清蛋白，溶解于NaCl水溶液中；精密称取EGF加入乳清蛋白溶液中，室温搅拌下(300转/min)以0.5ml/min的速率持续加入乙醇，再加入戊二醛溶液，25℃交联固化12h；减压浓缩除去乙醇，得乳清蛋白纳米粒-EGF胶体溶液；此胶体溶液经超速冷冻(4℃)离心(40，000r·min^-1)1～3h，沉淀即为所需要的纳米粒。

本发明的第三个方面，还可采用乳化交联法来制备负载有EGF的乳清蛋白纳米粒，所述采用特定的交联剂转谷氨酰胺酶(Tgase)进行，所述方法包括下述步骤：

(1)将EGF母液与预热到40℃的乳清蛋白溶液混合后，快速加入1～50U/g转谷氨酰胺酶并漩涡震荡使其分散均匀，

(2)将步骤(1)的混合液加入到盛有预热到40℃的大豆油的锥形瓶中，然后在40℃在搅拌下反应60～240min，待混合物液滴在酶的作用下转化为凝胶颗粒后离心，收集微胶囊颗粒形式的沉淀物并用林格氏试剂清洗两次，再次离心，重新收集胶体颗粒形式的沉淀物，得到所述负载有EGF的乳清蛋白纳米粒。

乳化交联法中所用到的转谷氨酰胺酶可从试剂公司商购得到。

通过上述乳化交联法得到的负载有EGF的乳清蛋白纳米粒需要在4℃保存。也可以将通过上述乳化交联法得到的负载有EGF的乳清蛋白纳米粒重悬在蔗糖溶液中，然后在-70℃下冷冻4h，最后将冻实的悬液进行冷冻干燥得到可在常温下保存的EGF乳清蛋白纳米粒。

本发明所述的以乳清蛋白为核心的组合物，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。具有滋润、保湿、祛角质、抗衰、抗氧化的作用，用于制备抗衰嫩肤系列化妆品。

在本发明的另一个方面中，本发明提供一种抗衰嫩肤系列化妆品，其包含本发明的以乳清蛋白为核心的组合物，优选包含本发明的负载EGF的乳清蛋白纳米粒。

因此，本发明提供下述：

1.一种以乳清蛋白为核心的组合物，其包含0.1～50重量％的乳清蛋白，0～1重量％的表皮细胞生长因子EGF。

2.根据第1项所述的组合物，其中所述乳清蛋白来源于哺乳动物，优选来源于牛，特别优选是蛋白质含量在34％～82％的乳清浓缩蛋白。

3.根据第1项所述的组合物，其中所述乳清蛋白是以纳米粒的形态存在，其粒径为100nm～2μm，优选100nm～500nm。

4.根据第1项所述的组合物，其中EGF为通过基因工程技术获得的重组人EGF(rhEGF)，其氨基酸序列为SEQIDNO：1。

5.根据第1项所述的组合物，其中所述乳清蛋白以纳米粒形式存在，并且所述纳米粒负载有EGF，形成负载有EGF的乳清蛋白纳米粒，其中各原料的质量百分比如下：

6.根据第5项所述的组合物，其中所述溶剂为蒸馏水或NaCl溶液，优选为10mMNaCl溶液。

7.根据第5项所述的组合物，其中所述脱水剂为甲醇、乙醇或丙酮中的任一种，优选乙醇，更优选为95％的乙醇。

8.按照第5项所述的组合物，其中所述交联剂为戊二醛、甲基聚乙烯-右旋糖苷中的任一种，优选为戊二醛。

9.一种制备第5项的负载有EGF的乳清蛋白纳米粒的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)精密称处方量的乳清蛋白，溶解于溶剂中；

(2)精密称取EGF加入步骤(1)获得的乳清蛋白溶液中，室温搅拌下以0.5ml/min的速率持续加入脱水剂，再加入交联剂，25℃交联固化12h；

(3)减压浓缩除去脱水剂，得到乳清蛋白纳米粒-EGF胶体溶液；

(4)将步骤(3)得到的乳清蛋白纳米粒-EGF胶体溶液经超速冷冻离心1～3h，得到的沉淀物即为所述负载有EGF的乳清蛋白纳米粒组合物。

10.根据第9项所述的方法，其中步骤(1)的溶剂为蒸馏水或NaCl溶液，优选为10mMNaCl溶液；步骤(2)的脱水剂为甲醇、乙醇或丙酮中的任一种，优选乙醇，更优选为95％的乙醇，所述交联剂为戊二醛、甲基聚乙烯-右旋糖苷中的任一种，优选为戊二醛。

11.一种制备第5项的负载有EGF的乳清蛋白纳米粒的方法，所述方法包括下述步骤：

12.一种抗衰嫩肤系列化妆品，其包含第1-8项中任一项所述的组合物。

附图简述

图1显示转谷氨酰胺酶(Tgase)酶促交联制备EGF乳清蛋白纳米粒的工艺流程。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

本领域技术人员应该理解，如无特别说明，下述实施例中所用的试剂均为市售分析纯级别的试剂。

实施例1.溶剂挥散法制备的乳清蛋白纳米粒

所用的各原料的质量百分比如下(质量％)：

制备过程：

精密称取0.25g乳清蛋白，溶解于40mL10MmNaCl水溶液中备用。精密称取EGF(SEQIDNO：1)(2×10⁵IU/mg)1mg加入乳清蛋白溶液中，室温搅拌下(300转/min)以0.5ml/min的速率持续加入110mL95％的乙醇，再加入8％的戊二醛溶液60μL，25℃交联固化12h。减压浓缩除去乙醇，得EGF乳清蛋白纳米粒混悬液。采用常规方法冷冻干燥得到EGF乳清蛋白纳米粒冻干粉末。

经过激光光散射仪检测，所得EGF乳清蛋白纳米粒平均粒径为(180±2.7)nm，粒径分布为86.5％。透射电镜下观察纳米粒形态圆整，粒径分布较窄。

实施例2.负载有表皮生长因子(EGF)的乳清蛋白纳米粒凝胶剂的制备

按照实施例1制备包含表皮生长因子(EGF)的乳清蛋白纳米粒备用，并按照下述方法制备凝胶剂：

各组分的质量百分比如下(质量％)：

将实施例1制备的EGF乳清蛋白纳米粒粉末100g用蒸馏水溶解备用，加入卡波姆50g、甘油80g、山梨酸钾1g，搅拌溶解，加入三乙醇胺20g调节pH值到6-7，加入蒸馏水至全量，搅拌均匀，制成凝胶1000g，即得到负载有表皮生长因子(EGF)的乳清蛋白纳米粒凝胶剂。

该凝胶剂同样具有良好的创面修复作用，由于凝胶的胶黏特性，作用时间更持久，保湿效果更好，并能有效的隔绝作用部位与空气的接触，并降低过敏的发生率。使用方便，清洗简单。

实施例3.乳清蛋白纳米粒促进人皮肤表皮细胞增殖作用

将处于对数生长期的Hacat细胞(Hacat细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)用含10％FBS(FBS购自杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM培养基(DMEM培养基购自美国Gibco公司)常规培养至80％～90％汇合，用0.25％胰酶消化，以1×10⁵个/ml的细胞数目接种于96孔板，培养24h后，换无血清DMEM培养基培养，24h后将培养基吸出后分别加入浓度为100、50、25、12.5、6.25μg/mL的实施例1制备的乳清蛋白纳米粒，每个浓度设3个复孔，空白组为六个复孔。给药后放入培养箱继续培养24h，加入10μlMTT(0.5mg/ml)，培养箱中孵育4h后，吸出孔中溶液并加入150μlDMSO，振荡后于570nm波长下检测吸光度OD值。

增殖率％＝(给药组OD值/空白对照组OD值-1)×100％。结果见表1。

表1.Hacat细胞增殖率(％)(n＝3，)

表1的结果显示，本发明的乳清蛋白纳米粒具有促进皮肤表皮细胞(Hacat)增殖的作用，且具有浓度依赖性。表明本发明的乳清蛋白纳米粒具有活化皮肤表皮细胞，促进细胞代谢，抑制细胞老化的作用。

实施例4.乳化交联法制备的EGF乳清蛋白纳米粒

将2mLEGF母液与30mL预热(40℃)的乳清蛋白溶液(10％，w/v)混合后，快速加入转谷氨酰胺酶(Tgase)(1000U/g，购自江苏一鸣生物科技有限公司)并漩涡震荡使其分散均匀，将此混合液加入到250mL锥形瓶中，该锥形瓶中盛有150g预热的(40℃)大豆油，然后使该体系在磁力搅拌器的作用下(900rpm，40℃)反应180min，待液滴在酶的作用下转化为凝胶颗粒后离心(500×g，1min)，收集纳米颗粒并用林格氏试剂清洗两次，在700g下离心5min，重新收集胶体颗粒，储藏于4℃备用。

实施例5.冷冻干燥法制备EGF乳清蛋白纳米粒

实施例4通过乳化交联法得到的负载有EGF的乳清蛋白纳米粒需要在4℃保存。也可以将上述实施案例4最后一步得到的EGF乳清蛋白纳米粒20g重悬于30mL蔗糖(20％)溶液中，然后让此悬液在-70℃下冷冻4h，最后将冻实的悬液进行冷冻干燥，冷冻干燥的工艺参数是：冷阱温度为-50℃；真空度为4Pa；工作时间为48h。经过冷冻干燥后的EGF乳清蛋白纳米粒可在常温下保存。

实施例6.乳清蛋白纳米粒对人永生表皮细胞(Hacat)的抗氧化作用

按细胞生长速率，将一定数量处于对数生长期的Hacat细胞株接种于直径为6mm培养皿内，密度为90％左右。每块培养皿作为一个组别，分为空白组、H₂O₂模型组和给药组，给药组分别加入100、50、25μg/mL的实施例4制备的乳清蛋白纳米粒、100μg/mL乳清蛋白以及100IU/mLEGF原液。24h后，换无血清培养基培养并按分组加入药物，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育30min，取出H₂O₂模型组和给药组培养皿，分别加入0.8mM的30％的H₂O₂，放回培养箱培养24h。24h后加入0.25％胰酶消化细胞，培养液终止消化，分别收集细胞悬液，1000r/min离心5min，弃去培养液，PBS洗两次，每次1000r/min离心5min，弃去PBS，0.5mlPBS重悬细胞后超声波破碎，收集胞质匀浆。参照SOD、MDA、GSH-PX、CAT等试剂盒中的方法测定细胞裂解液中各项抗氧化指标。结果见表2。

表2.细胞内各抗氧化指标检测(n＝3，)

^*与H₂O₂组对比P＜0.05，^**与H₂O₂组对比P＜0.01

表2的结果表明细胞内各抗氧化指标与H₂O₂模型组比较，高(100μg·ml^-1)、中(50μg·ml^-1)、低(25μg·ml^-1)浓度的乳清蛋白纳米粒以及乳清蛋白组都具有显著提高SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)和GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)的酶活性，同时显著降低MDA(丙二醛)的含量，具有显著抗氧化，保护皮肤表皮细胞，抑制细胞老化的作用。而且与单独的乳清蛋白组和EGF组相比，EGF乳清蛋白纳米粒组随着浓度的提高，抗氧化效果越发明显，其中以高剂量组最为显著。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims

1.一种以乳清蛋白为核心的化妆品组合物，其中所述乳清蛋白以纳米粒形式存在，并且所述纳米粒负载有EGF，形成负载有EGF的乳清蛋白纳米粒，其中所述组合物通过下述方法制备：

各原料的质量百分比如下：

(1)精密称取所述处方量的乳清蛋白，溶解于溶剂中；

(3)减压浓缩除去脱水剂，得到乳清蛋白纳米粒-EGF胶体溶液；

(4)将步骤(3)得到的乳清蛋白纳米粒-EGF胶体溶液经超速冷冻离心1～3h，得到的沉淀物即为所述负载有EGF的乳清蛋白纳米粒组合物；

其中所述溶剂为蒸馏水或NaCl溶液，

所述脱水剂为甲醇、乙醇或丙酮中的任一种，

所述交联剂为戊二醛、甲基聚乙烯一右旋糖苷中的任一种。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述溶剂为10mMNaCl溶液。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脱水剂为乙醇。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述脱水剂为95％的乙醇。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述交联剂为戊二醛。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乳清蛋白来源于哺乳动物。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述乳清蛋白来源于牛。

8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述乳清蛋白是蛋白质含量在34％～82％的乳清浓缩蛋白。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纳米粒的粒径为100nm～2μm。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述纳米粒的粒径为100nm～500nm。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述EGF为通过基因工程技术获得的重组人EGF，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

12.一种制备权利要求1的负载有EGF的乳清蛋白纳米粒的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)精密称取处方量的乳清蛋白，溶解于溶剂中；

(3)减压浓缩除去脱水剂，得到乳清蛋白纳米粒-EGF胶体溶液；

其中所述溶剂为蒸馏水或NaCl溶液，

所述脱水剂为甲醇、乙醇或丙酮中的任一种，

所述交联剂为戊二醛、甲基聚乙烯-右旋糖苷中的任一种。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述溶剂为10mMNaCl溶液。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述脱水剂为乙醇。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脱水剂为95％的乙醇。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述交联剂为戊二醛。

17.根据权利要求12所述的方法，其中所述乳清蛋白来源于哺乳动物。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述乳清蛋白来源于牛。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述乳清蛋白是蛋白质含量在34％～82％的乳清浓缩蛋白。

20.根据权利要求12所述的方法，其中所述EGF为通过基因工程技术获得的重组人EGF，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。