BRPI0316319B1 - Alcohol soluble bacterioclorofila derivatives, pharmaceutical composition, derivative uses and method for preparing themselves - Google Patents

Alcohol soluble bacterioclorofila derivatives, pharmaceutical composition, derivative uses and method for preparing themselves Download PDF

Info

Publication number
BRPI0316319B1
BRPI0316319B1 BRPI0316319-9A BR0316319A BRPI0316319B1 BR PI0316319 B1 BRPI0316319 B1 BR PI0316319B1 BR 0316319 A BR0316319 A BR 0316319A BR PI0316319 B1 BRPI0316319 B1 BR PI0316319B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
compound
derivatives
group
pharmaceutical composition
palladium
Prior art date
Application number
BRPI0316319-9A
Other languages
English (en)
Other versions
BRPI0316319B8 (pt
BR0316319A (pt
Inventor
Scherz Avigdor
Brandis Alexander
Mazor Ohad
Salomon Yoram
Scheer Hugo
Original Assignee
Yeda Research And Development Co. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=30011928&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0316319(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Yeda Research And Development Co. Ltd. filed Critical Yeda Research And Development Co. Ltd.
Publication of BR0316319A publication Critical patent/BR0316319A/pt
Publication of BRPI0316319B1 publication Critical patent/BRPI0316319B1/pt
Publication of BRPI0316319B8 publication Critical patent/BRPI0316319B8/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F9/00—Methods or devices for treatment of the eyes; Devices for putting-in contact lenses; Devices to correct squinting; Apparatus to guide the blind; Protective devices for the eyes, carried on the body or in the hand
    • A61F9/0008—Introducing ophthalmic products into the ocular cavity or retaining products therein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0076—PDT with expanded (metallo)porphyrins, i.e. having more than 20 ring atoms, e.g. texaphyrins, sapphyrins, hexaphyrins, pentaphyrins, porphocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0036—Porphyrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/0624—Apparatus adapted for a specific treatment for eliminating microbes, germs, bacteria on or in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F1/00—Compounds containing elements of Groups 1 or 11 of the Periodic System
    • C07F1/08—Copper compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F13/00—Compounds containing elements of Groups 7 or 17 of the Periodic System
    • C07F13/005—Compounds without a metal-carbon linkage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System compounds of the platinum group
    • C07F15/006—Palladium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System compounds of the platinum group
    • C07F15/006—Palladium compounds
    • C07F15/0066—Palladium compounds without a metal-carbon linkage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System
    • C07F15/04—Nickel compounds
    • C07F15/045—Nickel compounds without a metal-carbon linkage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F3/00—Compounds containing elements of Groups 2 or 12 of the Periodic System
    • C07F3/02—Magnesium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F3/00—Compounds containing elements of Groups 2 or 12 of the Periodic System
    • C07F3/06—Zinc compounds

Abstract

"derivados de bacterioclorofila aniônicos solúveis em água e seus usos". a presente invenção refere-se a derivados de bacteriociorofila tetracíclicos e pentacíclicos solúveis em água aniônicos (bchls) contendo pelo menos um, de preferência dois ou três, grupos negativamente carregados e/ou grupos ácidos que são convertidos em grupos negativamente carregados no ph fisiológico, de preferência bchls tendo um grupo coo^ -^, cos^ -^, so~ 3~^ -^ po~ 3~^ 2-^, cooh, cosh, so~ 3h e/ou po~ 3~h~ 2~ ligado através de uma ligação éster ou amida a uma ou mais das posições 17^ 3^, 13^ 3^ e 3^ 2^ da molécula de bchl tetracíclica ou pentacíclica, para terapia fotodinâmica e diagnóstico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção pata "DERIVADOS DE BAC-TERIOCLOROFILA ANIÔNICOS SOLÚVEIS EM ÁGUA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA USO DOS DERIVADOS E MÉTODO PARA PREPARO DOS MESMOS".
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a derivados de bacterioclorofila aniônicos solúveis em água, à sua preparação e seu uso em métodos de terapia fotodinâmica in vivo e diagnóstico de tumores e diferentes doenças vasculares tal como degeneração macular relacionada à idade, bem como em métodos de morte in vivo e ex vivo de vírus e microorganismos. Definições d Abreviações AMD: degeneração macular relacionada à idade;
Bchl: bacteriofila - uma 7,8,17,18-tetraidroporfirina pentacíclica com um 5o anel isocíclico, um átomo de Mg central, um grupo fitila ou gera-nilgeranila na posição 173, um grupo COOCH3 na posição 132, um átomo de H na posição 132, um grupo metila nas posições 2,7,12,18, um grupo aceti-la na posição 3 e um grupo etila na posição 8;
Bhphe: bacteriofeofitina a (Bchl onde o Mg central é substituído por dois átomos de H);
Bpheid: bacteriofeoforbida a (o derivado de ácido carboxílico livre C-172 derivado de Bphe);
Pd-Bpheid: Pd-bacteriofeoforbida a; PDT: terapia fotodinâmica;
Rodobacterioclorina: 7,8,17,18-tetraidroporfirina tetracíclica tendo um gruop -CH2CH2COOH na posição 17, um -COOH na posição 13, grupos metila nas posições 2,7,12,8 e grupos etila nas posições 3 e 8. A numeração IUPAC dos derivados de bacterioclorofila é usada em todo o relatório descritivo. Usando essa nomenclatura, as bacterioclorofi-las naturais carregam dois ésteres de ácido carboxílico nas posições 132 e 172, no entanto, elas são esterificadas nas posições 133 e 173.
Antecedentes da Invenção Terapia fotodinâmica (PDT) é um tratamento não-cirúrgico de tumores onde as drogas não-tóxicas e irradiação fotossenslbilizadora não- prejudicial são combinadas para gerar espécies de oxigênio reativo citotóxi-cas in situ. Essa técnica é mais seletiva do que a quimioterapia e radioterapia de tumor geralmente usadas. Até agora as porfirinas têm sido empregadas como os agentes fotossensibilizadores primários em clínicas. No entanto, os sensibilizadores atuais sofrem de várias deficiências que limitam sua aplicação, incluindo principalmente: (1) absorção relativamente fraca na faixa espectral visível que limita o tratamento de tumores superficiais; (2) acúmulo e retenção longa do sensibilizador na pele do paciente, levando à fototoxici-dez da pele prolongada (dias a meses); e (3) pequena ou até mesmo nenhuma diferenciação entre o efeito de PDT sobre tecidos de tumor e não-tumor iluminados. Os inconvenientes de drogas atuais inspiraram uma extensiva pesquisa quanto a sensibilizadores de segunda geração de absorção de comprimento de onda longo que exibem melhor diferenciação entre sua retenção em células de tumor e pele ou outros tecidos normais. A fim de otimizar o desempenho das drogas de porfirina em a-gentes terapêuticos e diagnóstico, vários derivados de porfirina foram propostos, onde, por exemplo, há um átomo de metal central (outro que não Mg) complexado para os quatro anéis pirrol e/ou substituintes periféricos dos anéis pirrol são modificados e/ou o macrociclo é diidnogenado para derivados de clorofila (clorinas) ou tetraidrogenado para derivados de bacterioclo-rofila (bacterioclorinas).
Devido à sua intensa absorção em regiões espectrais favoráveis (680-850 nm) e sua pronta degradação após tratamento, os derivados de clorofila e bacterioclorofila foram identificados como excelentes sensibilizadores para PDT de tumores e por ter propriedades superiores em comparação com porfirinas, mas eles são menos prontamente disponíveis e mais difíceis de manusear.
Bacterioclorofilas são de vantagem potencial comparado com as clorofilas porque elas mostram faixas quase infravermelhas intensas, isto é, em comprimentos de onda consideravelmente mais longos do que os derivados de clorofila.
Os espectros, fotofísica e fotoquímica de bacterioclorofilas nati- vas (Bchfs) fizeram delas ótimas moléculas de colheita de luz com claras vantagens sobre outros sensibilizadores atualmente usados em PDT. Em particular, essas moléculas têm um coeficiente de extinção muito alto em comprimentos de onda longos (Amax=760-780 nm, ε =(4-10)x104 M'1 cm'1), onde a luz penetra profundamente nos tecidos. Elas também geram espécies de oxigênio reativo (ROS) em um rendimento quantum alto (dependendo do metal central).
Sob condições de liberação normal, isto é, na presença de oxigênio em temperatura ambiente e sob condições de luz normais, as porções de BChl são labeis e têm rendimentos quantum um pouco menores para formação de estado tripleto, quando comparado com, por exemplo, derivado de hematoporfirina (HPD). No entanto, sua possível iniciação de reações redox biológicas, características espectrais favoráveis e sua imediata degradação in vivo resultam na superioridade potencial das bacterioclorofilas sobre outros compostos, por exemplo, porfirinas e clorofilas, para terapia de PDT e diagnóstico e para morte de células, vírus e bactérias em amostras e em tecido vivo. Modificação química de bacterioclorofilas é esperada melhorar mais suas propriedades, mas isso tem sido muito limitado devido à falta de métodos adequados para preparação de tais bacterioclorofilas modificadas. A absorção biológica e eficácia de PDT de derivados de Bchi livres de metal têm sido estudadas com o objetivo de manipular a afinidade dos sensibilizadores ao compartimento celular do tumor. Primordial para essa abordagem é o uso de drogas altamente lipofílicas que podem aumentar o acúmulo da drogas nas células de tumor, mas também torna sua liberação difícil. Ainda, a biodistribuição descrita mostra níveis de droga fototóxicos significantes em tecidos de não-tumor durante períodos prolongados (pelo menos dias) após administração da droga.
Na patente Israel No. 102645 anterior da requerente e EP 0584552, US 5.726.169, US 5.726.169, US 5.955.585 e US 6.147.195 correspondentes, uma abordagem diferente foi tomada pelos inventores. Sensibilizadores antivasculares altamente eficientes que não extravasam da circu- lação após administração e têm período de vida curto no sangue foram estudados. Era esperado que a diferença inerente entre vasos de tecidos normais e anormais tal como tumores ou outros tecidos que se apoiam sobre neovasos permitisse destruição relativamente seletiva do tecido anormal. Desse modo, era um objetivo sintetizar derivados de Bchl que fossem mais polares e, então, tivessem melhor chance de ficar no compartimento vascular, onde eles conduzem o efeito fotodinâmico primário. Para essa finalidade, o resíduo de geranilgeranila na posição C17 de Bchl a (Composto 1, mostrado no Esquema 1 aqui) foi substituído por vários resíduos tal como aminoá-cidos, peptídeos, ou proteínas, que aumentam a hidrofilicidade do sensibili-zador. Um derivado particular, Bchl-Ser (Esquema 1, Composto 1, onde R é serila), foi verificado ser solúvel em água e altamente fototóxico em culturas celulares. Seguindo injeção intraperitoneal, Bchl-Ser depurou do sangue do camundongo e tecidos biexponencialmente em um tempo relativamente curto (ti/2 -2 e 16, horas, respectivamente). Depuração da circulação foi ainda mais rápida seguindo injeção intravenosa. Sob o protocolo de tratamento selecionado (aplicação de luz dentro de minutos após injeção da droga), a fototoxicidez foi predominantemente conferida à vascuíatura do tumor (Ro-senbach-Belkin e outros, 1996; Zilberstein e outros, 2001 e 1997). No entanto, infelizmente, tal como Bchl nativa, o derivado de Bchl-Ser sofre fotooxi-dação rápida, formando o éster de 2-desvinit-2-a cet i l-c I o rofi I i d a correspondente e outros produtos.
Para aumentar a estabilidade dos derivados de Bchl, o átomo de Mg central foi substituído por Pd na última Publicação PCT WO 00/33833 da requerente e US 6.569.846. Esse átomo pesado foi anteriormente mostrado para aumentar bastante o potencial de oxidação do macrocíclico de Bchl e, ao mesmo tempo, aumentar bastante a taxa de cruzamento interssistema (ISC) da molécula para seu estado tripleto. A substituição de metal foi realizada através de incorporação direta de íon de Pd2+ à molécula de Bpheid, conforme descrito no WO 00/33833. Com base na biodistribuição de pigmento e farmacocinética, foi suposto que o derivado de Pd-Bpheid permanecesse na circulação por um tempo muito curto com praticamente nenhum extra- vasamento para outros tecidos, e é então um bom candidato para PDT de direcionamento vascular que evita fototoxicidez à pele. O efeito do tratamento sobre os vasos sangüíneos foi demonstrado através de microscopia intravital de vasos sangüíneos tratados e tingimento com azul Evans. Usando um protocolo de tratamento com um intervalo de droga-para-luz mínimo, Pd-Bpheid (também chamado Tookad) foi verificada ser eficaz na erradicação de tumores diferentes em camundongos, ratos e outros modelos de animal e está atualmente entrando em testes clínicos de Fase l/ll em pacientes com câncer de próstata que falharam com a terapia de radiação (Chen e outros, 2002; Schreiber e outros, 2002; Koudinova e outros, 2003).
Por causa de sua baixa soiubilidade em soluções aquosas, o uso clínico de Pc-Bpheid requer o uso de agentes de solubilização tal como Cremophor que pode causar efeitos colaterais em altas doses. Seria altamente desejável tornar Pd-Bpheid solúvel em água enquanto retendo suas propriedades físico-químicas. Alternativamente, seria desejável preparar derivados de Bchl que fossem citofototóxicos e, ao mesmo tempo, mais solúveis em água do que a própria Pd-Bpheid. Tal soiubilidade em água é esperada para ainda aumentar mais a retenção de droga na circulação e, então, a seletividade acima mencionada. Ainda, não tendo nenhuma necessidade de usar veículos tal como detergentes ou lipossomas, pode prevenir efeitos colaterais.
Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a um derivado de bacterioclorofila contendo pelo menos um, de preferência dois ou três, grupos negativamente carregados e/ou grupos ácidos que são convertidos em grupos negativamente carregados no pH fisiológico, excluindo derivados de bacterioclorofila pentacíclicos tendo um grupo CH2CH2COOH ou CH2CH2COO' livre na posição 17, e derivados de bacterioclorofila tetracíclicos destituídos de um átomo de metal central e tendo um grupo -CH2CH2COOH na posição 17, um grupo CH2COOH ou -COOH na posição 15, um grupo -COOH na posição 13, grupos metila nas posições 2,7,12,18 e grupos etila nas posições 3 e 8.
Os grupos negativamente carregados de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a, carboxilato (COO'), tiocarboxilato (COS), sulfonato (SO3") e fosfonato (P032'), e os grupos ácidos a partir dos quais os ditos grupos carregados se originam no pH fisiológico são os grupos de ácidos carboxílico (COOH), tiocarboxílico (COSH), sulfônico (S03H) e fosfô-nico {PO3H2), respectivamente.
Em uma modalidade, 0 derivado de bacterioclorofila tem a fórmula I ou II: (i) (II) onde M representa 2H ou um átomo de metal selecionado do grupo consistindo em Pd, Pt, Co, Sn, Ni, Cu, Zn e Mn divalentes e Fe, Mn e Cr tri-valentes; R1, R2 e R4 são cada um independentemente Y- R5; Y é O, S ou NR5R6; R3 é selecionado do grupo consistindo em -CH=CH2, -C(=0)-CH3, -C(=0)-H, -CH=NR7, -C(CH3)=NR7, -ch2-or7, -CH2-SR7, -CH2-NR7R'7, -CH(CH3)-OR7i - CH(CH3)-SR7, -CH(CH3)-NR7R'7i -CH(CH3)Hal, -CH2-Hal, -CH2-R7, -CH=CR7R'7í -C(CH3)=CR7R'7, -CH=CR7Hal, -C(CH3)=CR7Hal e -CECR7;
Rg, R6, R7 e R’7 são cada um independentemente H ou selecionados do grupo consistindo em: (a) C1-C25 hidrocarbila opcionalmente contendo um ou mais he-teroátomos, porções carbocíclicas ou heterocíclicas, e/ou opcionalmente substituída por um ou mais grupos funcionais selecionados do grupo consistindo em halogênio, oxo, OH, SH, CHO, NH2, CONH2, um grupo negativamente carregado, e um grupo ácido que é convertido em um grupo negativamente carregado no pH fisiológico; (b) um resíduo de um aminoácido, um peptídeo ou de uma proteína; e (c) quando Y for O ou S, R5 pode ainda ser R8+; m é 0 ou 1; e R8+ é H+ ou um cátion; contanto que: (i) pelo menos um, de preferência dois, de R5, R6, R7 e R7' sejam uma cadeia de hidrocarboneto conforme definido em (a) acima substituída por um grupo negativamente carregado ou por um grupo ácido que é convertido em um grupo negativamente carregado no pH fisiológico; ou (ii) pelo menos um, de preferência dois, de R1, R2 e R4 é OH, SH, 0'R8+ ou S'R8+; ou (iii) pelo menos um de R1, R2 e R4 é OH, SH, OR8+ ou S'R8+ e pelo menos um de R5, R6, R7 e R7' é uma cadeia hidrocarboneto substituída por um grupo negativamente carrregado ou por um grupo ácido que é convertido em um grupo negativamente carregado no pH fisiológico; ou (iv) pelo menos um de R1, R2 e R3 é OH, SH, 0‘R8+ ou S-R8+ e pelo menos um de R5, R6, R7 e R7’ é um resíduo de um aminoácido, um peptídeo ou de uma proteína; ou (v) pelo menos um de R5, R6, R7 e R7' é uma cadeia hidrocarboneto substituída por um grupo negativamente carregado ou por um grupo ácido que é convertido em um grupo negativamente carregado no pH fisiológico e pelo menos um de R5, R8, R7 e R7 é um resíduo de um aminoácido, um peptídeo ou de uma proteína; mas excluindo os compostos da Fórmula I onde M é conforme definido, R3 é -C(=0)CH3, R1 é OH ou OR8+ e R2 é -OCH3, e 0 composto da Fórmula II onde M é 2 H, R3 é -C(=0)CH3, R1f R2 e R4 são OH e m é 0 ou 1. A invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas com- preendendo um derivado de bacterioclorofila conforme acima definido para terapia fotodinâmica (PDT), particutarmente para PDT de direcionamento vascular, por exemplo, para PDT de tumores ou de degeneração macular relacionada à idade (AMD) ou para morte de células ou agentes infecciosos compreendendo bactérias e vírus in vivo ou in vitro, bem como para propósitos de diagnóstico. A invenção provê um método para terapia fotodinâmica usando um fotossensibilizador, onde o aperfeiçoamento consiste no fato de que o dito fotossensibilizador é um derivado de bacterioclorofila da invenção. De acordo com esse aspecto, a invenção refere-se a um método para tratamento através de PDT que compreende administrar a um indivíduo com necessidade uma quantidade eficaz de um derivado de bacterioclorofila da invenção, seguido por irradiação local. A invenção provê ainda um método para diagnóstico de tumores usando um fotossensibilizador, onde o aperfeiçoamento consiste no fato de que o dito fotossensibilizador é um derivado de bacterioclorofila da invenção. De acordo com esse aspecto, a invenção refere-se a um método para diagnóstico de tumores que compreende administrar a um indivíduo suspeito de ter um tumor uma quantidade eficaz de um derivado de bacterioclorofila da invenção, seguido por irradiação local e medição da fluorescência da área suspeita, onde uma fluorescência maior indica locais de tumor. A invenção provê ainda um método para morte de células ou agentes infecciosos compreendendo bactérias e vírus, usando um fotossensibilizador, o aperfeiçoamento onde o dito fotossensibilizador é um derivado de bacterioclorofila da invenção. De acordo com esse aspecto, a invenção refere-se a um método para esterilização de produtos biológicos, por exemplo, sangue, que compreende adição ao dito produto biológico, por exemplo, sangue, de uma quantidade eficaz de um derivado de bacterioclorofila da invenção, seguido por irradiação.
Breve Descrição das Figuras Os compostos diferentes da invenção são representados na descrição que segue dos desenhos por um numeral em negrito e sublinhado.
Sua identificação completa é encontrada na Lista de Compostos no início da Seção Química a seguir.
As Figuras 1A-1B são gráficos mostrando a fototoxicidez do composto sulfonado 8 sobre células endoteliais de camundongo H5V (Figura 1A) e células de melanoma de camundongo M2R (Figura 1B). As células foram incubadas com concentrações altas de 8 por 4 horas, lavadas e iluminadas (moldes abertos) ou mantidas no escuro (controle escuro, moldes fechados). Os pontos são médias de triplicatas ± STD.
As Figuras 2A-2B são gráficos mostrando a fototoxicidez do composto sulfonado 4 sobre células endoteliais de camundongo H5V (Figura 2A) e células de melanoma de camundongo M2R (Figura 2B). As células foram incubadas com concentrações altas de 4 por 4 horas, lavadas e iluminadas (moldes abertos) ou mantidas no escuro (controle escuro, moldes fechados). Os pontos são médias de triplicatas + STD. A Figura 3 é um gráfico mostrando a fototoxicidez do composto sulfonado 5 sobre células de melanoma de camundongo M2R. As células foram incubadas com concentrações altas do composto 5 por 4 horas, lavadas e iluminadas (círculos) ou mantidas no escuro (controle escuro, diamantes). Os pontos são médias de triplicatas. A Figura 4 é um gráfico mostrando a fototoxicidez do composto sulfonado H sobre células de melanoma de camundongo M2R. As células foram incubadas com concentrações altas do composto H por 4 horas, lavadas e iluminadas (círculos) ou mantidas no escuro (controle escuro, diamantes). Os pontos são médias de triplicatas. A Figura 5 é um gráfico mostrando farmacocinética do composto 4_em sangue de camundongos nus CD1. Seguindo injeção do composto 4 (6 mg/kg), amostras de sangue foram coletadas do mesmo camundongo nos tempos indicados e Pd foi determinado. Cada ponto de tempo representa a média de três camundongos ± STD. A Figura 6 mostra biodistribuição do composto 4 em camundongos nus CD1. Os camundongos foram sacrificados em tempos diferentes seguindo injeção do composto 4.(6 mg/kg), e o teor de Pd foi determinado para os órgãos indicados. Cada ponto de tempo representa a média de três camundongos ± STD. A Figura 7 mostra PDT de xenoenxertos de melanoma com composto 4. Camundongos carregando xenoenxertos de melanoma M2R foram intravenosamente injetados com composto 4 (6 mg/k'1) e iluminados por 5 minutos com intensidade de luz de 30J/cm2 (n=14, quadrados cheios), 39J/cm2 (n=8, diamantes cheios) ou 45J/cm2 (n=10, triângulos cheios). Os camundongos que foram injetados com 9 mg/kg'1 de composto 4 foram iluminados por 5 minutos com 30J/cm2 (n=10, círculos cheios). Grupos de controle: não-tratado (n=4, quadrados abertos), controle no escuro recebeu 6 mg/kg'1 (n=4, círculos abertos) ou 9 mg/kg'1 (n=5, triângulos abertos) de composto 4 e controle de luz (n=6, diamantes abertos, 45J/cm2).
As Figuras 8a-8h são fotografias mostrando o efeito seletivo de PDT em camundongos carregando xenoenxertos de glioma C6 de rato e tratados com composto 4. (a-d) animais tratados com PDT; (e-h) animal não-tratado. (a) antes do tratamento; (b) 3 horas após PDT e injeção de azul Evans (EB); (c) irritação da pele da área tratada, 24 horas após PDT; (d) lâmina axial do tumor tratado 24 horas após PDT; (e) antes da injeção de EB; (f) 3 horas após injeção de EB; (g) irritação da pele após injeção de EB; (h) lâmina axial do tumor não-tratado, 24 horas após injeção de EB. T-tumor; S-pele; M-músculo; E-edema.
As Figuras 9A-9D mostram seções semifinas do centro de lesão e TEM 2 horas após PDT oclusivo em um modelo de olho de coelho com composto 4 (fluência 50J/cm2, dose de 5 mg/kg e um DLI de 1 minuto). Es-tase e dilatação de vasos coroidais com células de RPE relativamente bem-preservadas e retina são observadas (9A e 9B). TEM mostra hemólise das células sangüíneas vermelhas dentro do lúmen coriocapilar (setas marrons de 9D) e monócitos rompidos (setas brancas). Membrana de Bruch (Bm) são células do epitélio do pigmento retinal bem-identificadas com proteção intacta (RPE). Algumas das células endoteliais coriocapilares são acentuadamen-te alteradas demonstrando cromatina condensada (estrela branca em 9C). Abreviações: ONL: camada nuclear externa, ROS: segmentos externos de haste, CC: Coriocapilares, e: células endoteliais coriocapilares.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção provê, em um amplo aspecto, derivados de bacterioclorofila contendo pelo menos um, de preferência dois ou três, grupos negativamente carregados e/ou grupos ácidos que são convertidos em grupos negativamente carregados no pH fisiológico, excluindo derivados de bacterioclorofila pentacíclicos tendo um grupo CH2CH2COOH ou CH2CH2COO' livre na posição 17, e derivados de bacterioclorofila tetracíclicos destituídos de um átomo de metal central e tendo um grupo -CH2CH2COOH na posição 17, um grupo CH2COOH ou -COOH na posição 15, um grupo -COOH na posição 13, um grupo metila em cada uma das posições 2, 1, 12, 18 e um grupo etila em cada uma das posições 3e8.
Os derivados de bacterioclorofila podem ser derivados de um derivado natural ou sintético de bacterioclorofila, incluindo compostos onde 0 átomo de Mg central foi deletado ou substituído por outros átomos de metal tal como Pd, Pt, Co, Sn, Ni, Cu, Zn e Mn divalentes e Fe, Mn e Cr trivalentes. Em modalidades preferidas, 0 átomo de metal está ausente ou é Pd, Cu, Zn ou Mn. Na modalidade mais preferida, 0 átomo de metal central é Pd.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um derivado de bacterioclorofila da fórmula I ou II conforme acima definido.
De acordo com a invenção, "hidrocarbila" conforme definido para R5, Re, R7 e R’7 significa quaisquer radicais hidrocarbila retos ou ramificados, saturados ou insaturados, acíclicos ou cíclicos, incluindo aromáticos, de 1-25 átomos de carbono, de preferência de 1 a 20, com mais preferência 1 a 6, com mais preferência 2-3 átomos de carbono. A hidrocarbila pode ser um radical alquila, de preferência de 1-4 átomos de carbono, por exemplo, metila, etila, propila, butila ou alquenila, alquinila, cicloalquila, arila tal como um grupo fenila ou aralquila tal como benzila, ou na posição 17 ela é um radical derivado de compostos Chi e Bchl naturais, por exemplo, geranilgeranila (2,6-dimetil-2,6-octadienila) ou fitil {2,6,10,14-tetrametil-hexadec-14-em-16-ila). A cadeia hidrocarboneto de R5, Re, R7 e/ou R'7 pode conter op- cionalmente um ou mais heteroátomos tal como O, S e/ou NH, e /ou um ou mais anel carbocíclico, por exemplo, fenila, ou anei heterocíclico, por exemplo, porções piridila. Em uma modalidade, a cadeia hidrocarbila contém um ou mais átomos de O e tem um grupo final OH conforme representado pelo resíduo de oligooxietilenoglicol de 4 a 10 átomos de carbono, de preferência pentaoxietilenoglicol.
Rs, Rç, Rr e/ou R'7 pode ser também hidrocarbila substituído por um ou mais grupos funcionais, tal como Cl, CHO, OH, SH, NH2, CONH2, COOH, COSH, S03H, PO3H2, ou por um grupo negativamente carregado tal como COO", COS', S03" ou PO32'. Em uma modalidade preferida, 0 grupo funcional COOH, COSH, S03H, PO3H2, COO', COS', SO3' ou P032' é um grupo funcional final. Em modalidades mais preferidas, a hidrocarbila tem 2 ou 3 átomos de carbono e um grupo final selecionado de COO-, P032', ou, com mais preferência, S03\ Ainda em uma modalidade adicional, R5, Rs, R7 e/ou RV pode ser substituído por mais de um grupo OH e opcionalmente NH2 e pode ser 0 resíduo de um monossacarídeo, por exemplo, glicosamina.
Em uma outra modalidade, R5, Re, R7 e/ou R'7 pode ser 0 resíduo de um aminoácido, um peptídeo ou uma proteína. Em uma modalidade preferida, R5 em qualquer uma das posições, mas de preferência na posição 173, é 0 resíduo de um aminoácido, peptídeo ou uma proteína. O aminoácido, peptídeo ou proteína pode ser a fonte do grupo negativamente carregado se eles contiverem um grupo carboxila terminal e/ou um resíduo de um aminoácido contendo um grupo carboxílico livre não-terminal, por exemplo, ácido glutâmico ou aspártico.
Em uma modalidade, R5, R6, R7 e/ou R'7 é 0 resíduo de um aminoácido ou peptídeo (oligopeptídeo ou polipeptídeo) contendo um grupo hi-dróxi, tal como serina, treonína e tirosina, ou peptídeos contendo-os, ou um derivado do dito aminoácido ou peptídeo selecionado de ésteres tal como alquila, de preferências metila, ésteres e derivados N-protegidos, onde 0 grupo de proteção N é, por exemplo, terc-butilóxi, carbobenzóxi ou tritila, e 0 dito aminoácido ou peptídeo ou seu derivado hidroxilado é ligado ao grupo COO" do derivado BChl através de seu grupo hidróxi. Exemplos de tais derivados de aminoácido são metil éster de serina, N-terc-butiloxicarbonil-serina, metil éster de N-tritil-serina, metil éster de tirosina e metil éster de N-terc-butóxi-tirosina, e um exemplo de tal peptídeo é metil éster de N-carbobenzóxi-serila, todos eles preparados conforme descrito na EP 0584552 acima mencionada.
Em uma outra modalidade, Rs, Re, R7 e/ou R'7 é 0 resíduo de um aminoácido ou peptídeo (oligo ou polipeptídeo) ligado a 0 grupo -CO através de uma ligação amida (Y é NH).
Em uma modalidade adicional, R5, R6, R7 e/ou R'7 é 0 resíduo de um ligante específico de célula ou específico de tecido selecionado de peptí-deos e proteínas, que são exemplificados por, mas não limitados a, peptí-deos de hormônio, por exemplo, hormônios de estimulação de melanócito, por exemplo, α-MSH, e anticorpos, por exemplo, imunoglobulinas e anticorpos específicos de tumor. O peptídeo ou proteína pode ser ligado diretamente ao grupo -CO através de uma ligação éster, tioéster ou amida, ou ele pode ser ligado através de uma ligação éster ou amida a um grupo funcional final do radical C1-C25 hidrocarbila selecionado de OH, COOH e NH2.
Conforme descrito na EP 0584552 acima mencionada, através de conjugação de Bchl com aminoácidos diferentes, e conjugação adicional dos conjugados de aminoácido Bchl com hormônios, fatores de crescimento ou seus derivados, ou anticorpos específicos de tumor, ou quaisquer outros lígantes específicos de célula, fotossensibilízadores direcionados ao local adequados são obtidos.
Em uma modalidade, 0 grupo negativamente carregado COO", COS", SO3" ou PO32" de acordo com a invenção se origina do grupo funcional COOH, COSH, SO3H ou PO3H2, respectivamente, de cadeias hidrocarbila substituídas de R5, R6, R7 e/ou R'7. Em uma outra modalidade, 0 grupo COOH, COSH, COO" e/ou COS" é derivado de Rt, R2 e R4 sendo OH ou SH, 0' R8+ ou S"R8\ respectivamente, isto é, quando um grupo carboxílico ou tioca-boxílico ou um ânion carboxilato ou tiocarboxilato está presente na posição 131,151 (méO), 152(m é 1) e/ou 173. 0 cátion R8+ pode ser um cátion monovalente ou divalente derivado de um metai alcalino ou alcalino-terroso tal como K+, Na+, Li+, NH/, Ca+, com mais preferência, K+; ou Rg+ é um cátion derivado de uma amina.
Em uma modalidade preferida, o derivado de bacterioclorofila da invenção tem a Fórmula I onde: M representa Pd divalente;
Ri é -NH-(CH2)n-S03‘R8+, -NH-(CH2)n-COO-R8+; -NH(CH2)-P032- (R8+)2; R2 é metóxi; e R3 é -C(=0)-CH3; R8+ é um cátion monovalente tal como K+, Na\ Li+, NlV; e n é um número inteiro de a partir de 1 a 10, de preferência 2 ou 3.
De acordo com essa modalidade, no composto da Fórmula I, R·] é de preferência um grupo -NH-(CH2)n-S03-R8+, onde n é 3 e R8+ é K+.
Em uma outra modalidade preferida, o derivado de bacterioclorofila da invenção tem a Fórmula II onde: M representa 2H, Pd, Cu ou Zn divalente ou Mn trivalente;
Ri é -0'R8\ -NH-(CH2)n-S03'R8+, -NH-(CH2)n-COO-R8+; -NH-(CH2)n-P032XRs+)2; ou Y-R5 onde Y é O, S ou NH e R5 é o resíduo de um aminoácido, um peptídeo ou uma proteína; R2 é CrC6 alcóxi tal como metóxi, etóxi, propóxi, butóxi, com mais preferência metóxi; R3 é -C(=0)-CH3, -CH=N-(CH2)n-S03-Rs+; -CH=N-(CH2)n-COO-R8+; -CH=N(CH2)n-P032'(R8+)2; -CH2-NH-{CH2)n-S03-R8+; -NH-(CH2)-COO-R8+; ou -NH-(CH2),-P032-(R3+)2; R4 é -NH-(CH2)n-S03R8+; -NH-(CH2)n-COO-R3+; -NH-(CH2)n- P032-(R8+)2; R8+ é um cátion monovalente tal como K+, Na+, Li+, NH4+, com mais preferência K+; m é 1 e n é um número inteiro de a partir de 1 a 10, de preferência 2 ou 3.
Em uma modalidade mais preferida da invenção, o derivado de bacterioclorofila tem a fórmula II e M é Pd.
Em uma modalidade mais preferida, a invenção refere-se a um derivado de bacterioclorofila da Fórmula II onde: M é Pd;
Ri é -0-R8+, -NH-(CH2)rfS03-R8+ ou Y-R5, onde Y é O, S ou -NH e R5 é o resíduo de uma proteína, de preferência imunoglobulina; R2 é CrC6 alcóxi tal como metóxi, etóxi, propóxi, butóxi, com mais preferência metóxi; R3 é -C(=0)-CH3, -CH=N-(CH2)n-S03-R8+; ou -CH2-NH-(CH2)n- S03-R8+; R4 é -NH-(CH2)n-S03-R8+; NH-(CH2)n-COO-R8+; NH-(CH2)n-P032' (R8+)2; R8+ é um cátion monovalente tal como K\ Na+, Li+, NH4+, com mais preferência K+; m é 1 e n é 2 ou 3, com mais preferência 2.
Um exemplo de um derivado de bacterioclorofila da invenção tendo um grupo negativamente carregado único (SO3') na posição 17 é representado pelo composto da Fórmula I identificado na Lista de Compostos daqui em diante como composto 7.
Exemplos de derivados de bacterioclorofila da invenção tendo dois grupos negativamente carregados nas posições 13 e 17 incluem os compostos da Fórmula II identificados na Lista de Composição a seguir como compostos 4, 5, 8,10,11,12,13,14.15. Em uma modalidade mais preferida, 0 composto da invenção é 0 composto 4.
Exemplos de derivados de bacterioclorofila da invenção tendo três grupos negativamente carregados nas posições 3, 13 e 17 incluem os compostos da Fórmula II identificados na Lista de Compostos a seguir como compostos 9 e 16. O composto 13 tem um grupo negativamente carregado na posição 13 e um grupo -COOH como parte da molécula de proteína na posição 173, e 0 composto 15 tem um grupo divalente negativamente carregado na posição 13 e um grupo -COO- na posição 173.
Os compostos da invenção podem ser preparados, por exemplo, através dos métodos conforme mostrado no Esquema 1 aqui. Para a preparação de compostos onde R5 é 0 resíduo de um aminoácido, peptídeo ou proteína, os métodos descritos na EP 0584552 acima mencionada, particularmente o método de condensação catalítica, podem ser usados conforme mostrado no Esquema 1 para a reação com os ácidos aminossulfônicos tau-rina e homotaurina.
Desse modo, um método para a preparação de compostos da Fórmula II onde Ri é -0'R8+; R2 é -OCH3; R3 é acetila; R4 é um grupo -NH-(ChhVSOjR/; R§+ é um cátion monovalente; m é 1 e n é 1 a 10, compreende: (i) reação da M-bacteriofeoforbida correspondente da Fórmula I onde R1 é OH com um ácido aminossulfônico da Fórmula Η2Ν-(0Η2)η-503Η em um tampão de FV; e (ii) isolamento do composto desejado da Fórmula II.
Para preparação do composto 4, 0 método compreende reagir Pd-bacteriofeoforbida a 3 com taurina da fórmula H2N-(CH2)2-S03H em um tampão de K+ e isolamento do composto desejado.
Para preparação do composto 5, 0 método compreende reação de bacteriofeoforbida a 2 com taurina da fórmula H2N-(CH2)2-S03H em um tampão de K+ e isolamento do composto desejado.
Para a preparação de compostos de Cu e Zn 10, 11, 0 método compreende inserção direta do átomo de Cu ou Zn de metal central através de reação do composto 5 com acetato de cobre ou acetato de zinco, respectivamente, enquanto para preparação do composto de Mn 12, inserção do átomo de Mn de metal central é realizada através de transmetalação primeiro reagindo 0 composto 5 com acetato de cádmio e então com cloreto de manganês.
Um método para preparação de compostos da Fórmuía íí onde R1 é -0'R3+; R2 é -OCH3; R3 é acetila; R4 é um grupo -NH-(CH2)n-COO"R8+; R3+ é um cátion monovalente; m é 1 e n é 1 a 10 compreende: (i) reação da M-bacteriofeoforbida correspondente da Fórmula I onde R1 é OH com um ácido aminocarboxílico da Fórmula H2N-(CH2)n-COOH em um tampão R8+; e (ii) isolamento do composto da Fórmula II desejado.
Desse modo, para preparação do composto 14, 0 método compreende reação de Pd-bacteriofeoforbida a 3 com β-alanina da fórmula H2N-(CH2)2-COOH em um tampão de K+ e isolamento do composto desejado.
Um método para a preparação de compostos da Fórmula II onde Ri é -0'R8+; R2 é -OCH3; R3 é acetila; R4 é um grupo -NH-(CH2)n-P032' (Rs+); Rs+ é um cátion monovalente; mé1ené1a10, compreende: (i) reação da M-bacteriofeoforbida correspondente da Fórmula I onde R1 é OH com um ácido aminofosfônico da Fórmula H2N-(CH2)n-P03H2 em um tampão Rs+; e (ií) isolamento do composto da Fórmula II desejado.
Desse modo, para preparação do composto 15, 0 método compreende reação de Pd-bacteriofeoforbida a 3 com um ácido 3-amino-1-propanofosfônico da fórmula H2N-(CH2)3-P03H2 em um tampão de K+ e isolamento do composto desejado.
Para a preparação de compostos tendo os mesmos grupos negativamente carregados nas posições 13 e 17, a M-bacteriofeoforbida correspondente pode ser reagida com um excesso do reagente tal como ácido aminossulfônico, aminocarboxílico ou aminofosfônico conforme acima descrito, e isolamento do derivado da Fórmula II 13,17-dissubstituído desejado, ou uma via diferente pode ser seguida conforme mostrado no Esquema 1 aqui e descrito abaixo.
Desse modo, um método para a preparação de compostos da Fórmula II onde R1 e R4 são, cada um, um grupo -NH-(CH2)n-S03"R8+; R2 é -OCH3; R3 é acetila; R8+ é um cátion monovalente; m é 1 e n é 1 a 10, compreende: (i) acoplamento da M-bacteriofeoforbida da Fórmula I correspondente onde R1 é OH com N-hidróxi-sulfossuccinimida (sulfo NHS) na presença de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC); (ii) reação do éster de M-bacteriofeoforbida-173-N-hidroxissulfossuccinimida resultante com um excesso de ácido aminossulfônico da fórmula H2N-(CH2)n-S03H em um tampão de R8+, desse modo obtendo-se um composto da Fórmula I tendo um grupo negativamente carregado único na posição 17; (iii) reação desse produto com um excesso de H2N-(CH2)n-S03H em um tampão de R8+; e isolamento do composto desejado da Fórmula II.
Para a preparação do Composto 8, a reação é realizada com um excesso de homotaurina da Fórmula H2N-(CH2)3-S03H.
Quando 0 ácido aminossulfônico é substituído por ácido amino- carboxilico ou aminofosfônico, os derivados carboxilato e fosfonato correspondentes são obtidos.
Os compostos da invenção, também referidos aqui algumas vezes pelo termo "pigmentos", apresentam polaridade alta suficiente para serem solúveis em água e injetados em soluções aquosas sem quaisquer ten-soativos adicionados. Em uma modalidade, para o composto Pd-Bch1 4 sul-fonado preferido, também distribuição e farmacocinéticas são mostradas e, com base nisso, é suposto que esse e outros derivados da invenção permaneçam na circulação, e por um tempo muito curto. Desse modo, eles são bons sensibilizadores para PDT de direcionamento vascular. Tratamento de xenoenxertos de melanoma melanótico M2R e carcinoma de colo humano HT-29 em camundongos mostrados aqui demonstra o efeito seletivo do pigmento sobre a vasculatura do tumor. O protocolo sugerido com Pd-Bch1 4 sulfonado considerou o tempo de depuração curto da droga. Com base em seu efeito seletivo sobre a vasculatura do tumor, esses compostos podem ser usados para tumor bem como degeneração macular relacionada com a idade e outras anormalidades de tecido que dependam de naovascularíza-ção.
Desse modo, em um outro aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um derivado de bacterioclo-rofila da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende um derivado de bacterioclorofila de Fórmula I ou II aqui, com mais preferência um derivado sulfonado da Fórmula II, com mais preferência o composto 4.
Os derivados de bacterioclorofila aniônicos da presente invenção são formulados em composições farmacêuticas finais para administração ao paciente ou aplicados a um alvo in vitro usando técnicas bem conhecidas no campo, por exemplo, conforme resumido em Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co., Easton, Penna, última edição. As composições podem ser administradas sistemicamente, em particular através de injeção, ou podem ser usadas topicamente.
Os compostos Bchl aniônicos da invenção têm características de absorção óptica e fotofísicas similares aos Bchls não-aniônicos respectivos e, então, uma vez residindo dentro do tecido tratado, eles são esperados ser agentes fotodínâmícos eficientes. Eles podem então ser úteis como fotos-sensibilizadores como agentes terapêuticos e de diagnóstico, por exemplo, para tratamento de vários tipos de câncer tal como, mas não limitado a, me-lanoma, cânceres de próstata, cérebro, colo, ovário, mama, pele, pulmão, esôfago e bexiga e outros tumores sensíveis a hormônio, bem como para tratamento de degeneração macular relacionada à idade, e para matar células, vírus, fungos e bactérias em amostras e tecidos vivos bem como bem sabido na técnica de PDT e outras aplicações de fotossensibilizador.
Os novos derivados Bchl solúveis em água da invenção são úteis, por exemplo, em células neoplásticas de sensibilização ou outros tecidos de animais para destruição através de irradiação ou ín vivo ou ex vivo usando luz de comprimento de onda apropriado. É acreditado que a energia de fotoativação seja transferida para oxigênio endógeno para convertê-lo em oxigênio singleto, e/ou outras espécies de oxigênio reativo (ROS) tal com radicais superóxido ou hidroxila, que são considerados ser responsáveis pelo efeito citotóxico. Ainda, as formas fotoativadas do Bchsl fluorescem, cuja fluorescência pode ajudar na localização de tumores ou outros locais aos quais derivado de Bchl é administrado.
Exemplos de indicações, conhecidas na técnica, que podem ser tratadas com os derivados de bacterioclorofila da presente invenção incluem destruição de tecido de tumor em tumores sólidos e dissolução de placas em vasos sanguíneos (vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.512.762). Particularmente, esses derivados são adequados para PDT de direcionamento vascular por causa de sua retenção mínima na circulação e porque eles são tomados apenas minimamente por tecidos de não-circulação tal com pele e músculo. Desse modo, esses compostos permitem geração de espécies oxigênio reativo (ROS) limitada aos vasos interiores quando da excitação e, desse modo, causam resposta seletiva de vasos anormais tal como aqueles presentes em tumores e degeneração macular relacionada com a idade. A- inda, os derivados de bacterioclorofila são úteis para destruição seletiva em tratamento de condições tópica tal como acne, pé-de-atleta, verrugas, papi-loma e psoríase, para tratamento de hipertrofia da próstata benigna e para esterilização de produtos biológicos tal como sangue para transfusão, através de destruição de agentes infecciosos.
As composições farmacêuticas da invenção serão administradas ao paciente através de procedimentos padrão usados em PDT. A quantidade do derivado Bchl aniônico da invenção a ser administrada a um indivíduo com necessidade e a via de administração serão estabelecidas de acordo com a experiência acumulada com outras porfirinas usadas em PDT, e vão variar dependendo da escolha do derivado usado como ingrediente ativo, a condição, por exemplo, o tipo de tumor, a ser tratado, o estágio da doença, idade e condições de saúde do paciente, e o julgamento do médico, mas será muito menor do que a dosagem atualmente usada de Fotofrin II de cerca de 20-40 mg de HPD/kg de peso do corpo. As vias de administração preferidas são injeção intravenosa ou direta no tumor sólido da solução aquosa do composto ativo compreendendo veículos e aditivos farmaceuticamente aceitáveis convencionais e tratamento tópico de tumores de pele com composições tópicas adequadas. O comprimento de onda de luz de irradiação é de preferência escolhido para corresponder à absorbância máxima do fotossensibilizador de bacterioclorofila. O comprimento de onda adequado para qualquer um dos compostos pode ser prontamente determinado a partir de seu espectro de absorção.
Em adição ao uso in vivo, os derivados de Bchl aniônicos da invenção podem ser usados no tratamento de materiais in vitro para matar vírus ou agentes infecciosos prejudiciais, tal com bactérias prejudiciais. Por exemplo, sangue e plasma sanguíneo a serem usados para transfusão futura podem ser tratados com um Bchl da invenção e irradiados para realizar esterilização. A conjugação de proteínas, por exemplo, hormônios, fatores de crescimento ou seus derivados, anticorpos, peptídeos que se ligam especifi- camente a receptores de células alvo, e de nutrientes de célula, por exemplo tirosina, à porção de Bch1 pretende aumentar sua retenção no tumor e locais tratados. Aumento da transferência vermelha permite uma profundidade maior de penetração, enquanto mantendo a ubiqüidade do sistema natural. Substituição do Mg por outros metais pretende otimizar a estabilidade intrínseca e metabólica da porção de Bchl e seu cruzamento intersistema ao estado tripleto excitado, e também abre a possibilidade para novos procedimentos de diagnóstico.
Anticorpos e peptídeos específicos de tumor que têm grande afinidade com células neoendoteliais vão de preferência direcionar as porções de Bchl ao tumor ou local tratado, embora hormônios e nutrientes celulares possam também ser tomados pelos pares não-transformados normais. No entanto, as células selecionadas como alvos para hormônios e nutrientes celulares, tal como melanócitos e células neoendoteliais, são espalhadas dentre outras células sob condições normais e quando transformadas em células malignas, se agrupam para tumores sólidos. Como resultado, a concentração do fotossensibilizador nos compartimentos vasculares e/ou celulares do tecido maligno é esperada aumentar drasticamente com relação à sua concentração no tecido normal, onde células são mais dispersas, assegurando amplificação do efeito de PDT no local de tumor. Isso permite uso eficaz de doses suaves, menores do que o limiar de dano do tecido normal, desse modo reduzindo a necessidade de irradiação espacialmente bem-definida. Ainda, tendo fluorescência muito forte, o Bchl direcionado ao local pode ser usado para marcação com fluorescência do(s) local(ais) de tumor ou outros alvos.
Em uma modalidade mais preferida da presente invenção, o alvo para tratamento com os sensibilizadores da invenção são vasos sanguíneos anormais, particularmente vasos sangüíneos de tumores sólidos e degene-ração macular relacionada à idade, devido à diferença inerente de sensibilidade de vasos sangüíneos normais e anormais para os protocolos de PDT sugeridos descritos aqui. A invenção refere-se ainda a um método de terapia fotodinâmi- ca, que compreende administração a um indivíduo com necessidade de uma quantidade eficaz de um derivado de Bchl da invenção, seguido por irradiação local.
Em uma modalidade, o método de PDT da invenção é usado para tratamento de câncer e compreende administrar a um paciente afligido com um câncer de tumor sólido uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado de Bchl de acordo com a invenção, e então irradiação do local do tumor com fontes de luz fortes a 670-780 nm.
Os derivados de Bchl da invenção são também úteis para foto-destruição de células animais normais ou malignas bem como de microorganismos em cultura, permitindo fotodestruição seletiva de certos tipos de célula ou agentes infecciosos; para direcionamento da porção porfirina a células selecionadas através de ligação a polipeptídeos específicos, tal como hormônios ou outros ligantes de receptor, a anticorpos específicos de célula ou tecido ou a outros ligantes, por exemplo, lecitinas; para marcação/rotulagem fluorescente de moléculas para propósitos analíticos em aplicações de laboratório, diagnóstico e industrial; e para marcação fluorescente de células animais ou microorganismos ou partículas para aplicações de laboratório, diagnóstico ou industrial. Eles podem substituir vários dos rótulos de fluorescência atualmente usados, tal como isocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina, devido aos seus coeficientes de extinção superiores e rendimento de fluorescência maior.
Para propósitos de diagnóstico, os derivados de Bchl da invenção podem ser usados sozinhos ou podem ser marcados com um radioisó-topo ou outro meio de detecção conforme sabido na técnica. Por exemplo, o derivado de Bchl pode ser radioativamente marcado através de procedimentos padrão, por exemplo, com 67Ga, 111ln, 201T1, "mTc e o agente de diagnóstico radiativo é administrado ao paciente, de preferência através de injeção intravenosa. Após algumas horas, o local do câncer pode ser visto com imagem através de procedimentos padrão. A invenção provê ainda o uso dos derivados de Bchl da invenção para morte ex vivo ou in vitro de células ou agentes infecciosos tal como bactérias, vírus, parasitas e fungos em um produto biológico, por exemplo, sangue, que compreende tratamento da amostra infectada com o composto da invenção seguido por iluminação da amostra. A invenção será agora ilustrada pelos Exemplos não-limitativos que seguem.
EXEMPLOS
Para conveniência e melhor compreensão, a seção dos Exemplos é dividida em duas subseções: (I) a Seção Química, descrevendo a síntese dos derivados solúveis em água e intermediários 4-16 e (II) a Seção Biológica, descrevendo a atividade biológica dos novos derivados de Bchl.
I. SEÇÃO QUÍMICA
Nos presentes Exemplos, os derivados da invenção (4-5, 7-9 e 10-6) e os intermediários (1-3 e 6) serão apresentados pelos seus respectivos números Arábicos em negrito e sublinhado de acordo com a Lista de Compostos que segue. As fórmulas correspondentes aparecem no Esquema no final do relatório, um pouco antes das reivindicações.
Lista de Compostos 1. Bacterioclorofila a (Bchl a) 2. Bacteriofeoforbida a (Bpheid a) 3. Pd-Bacteriofeoforbida a (Pd-Bpheid a) 4. Sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de paládio 5. Sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida [Exemplo 2] 6. Sal de sódio de bacteriofeoforbida a 173-(3-sulfo-1-oxissuccinimida)éster de paládio [Exemplo 6] 7. Sal de potássio de bacteriofeoforbida a 173-(3-sulfopropil)amida de paládio [Exemplo 7] 8. Sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(3-sulfopropil)amida de paládio [Exemplo 8] 9. Sal de tripotássio de 31-(3-sulfopropilimino)-15-metoxicarbonilmetil-Rodo-bacteríoclorina 131,173-dí(3-sulfopropil)amida de paládio [Exemplo 9] 10. Sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de cobre(ll) [Exemplo 3] 11. Sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacteriocíorina 131-(2-sulfoetil)amida de zinco [Exemplo 4] 12. Sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarboniimetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de manganês(lll) [Exemplo 5] 13. Sal de potássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida, 173-(N-imunoglobulina G)amida de paládio [Exemplo 10] 14. Sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-carboxietil)amida de paládio [Exemplo 11] 15. Sal de tripotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-fosfopropil)amida de paládio [Exemplo 12] 16. Sal de tripotássio de 31-(3-sulfopropilamíno)-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(3-sulfopropil)amida de paládio [Exemplo 13] Materiais e Métodos (i) Bchl a (1) foi extraída e purificada a partir de células liofiliza-das de Rhodovolum Sulfifophilum conforme anteriormente descrito (WO 00/33833). (ii) Bacteriofeoforbida de paládio (Pd-Bpheid, 2) foi preparada ou conforme anteriormente descrito (WO 00/33833) ou foi obtida da Steba Biotech Ltd. através da Negma-Lerads, França. (iii) Ácido 3-amino-1-propano sulfônico (homotaurina) e ácido 3-amino-1-propano fosfônico foram comprados da Aldrich (USA) e ácido 2-aminoetano sulfônico (taurina) e ácido 3-aminopropiônico (β-alanina) foram comprados da Sigma (USA), N-hídróxi-sulfossuccinimida (sulfo-NHS) foi comprado da Pierce (USA), 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDO) foi comprado da Fluka (Suíça). (iv) Agentes químicos e solventes de grau analítico foram geralmente usados exceto quando realizando HPLC, onde solventes de grau de HPLC foram aplicados. (v) TLC: placas de sílica (Kieselgel-60, Merck, Alemanha); cloro- fórmio-metanol (4:1, v/v). (vi) Espectros de ressonância magnética nuclear 1H (RMN) foram registrados em instrumento Avance DPX 250 (Bruker, França) e descritos em ppm (δ) a jusante a partir de tetrametilsilano com picos de solvente residuais como os padrões internos. (vii) Os coeficientes de extinção dos derivados de Pd foram determinados através de correlação da concentração de Pd (usando fotometria de chama com PdCI2 como um padrão) com a densidade óptica da solução examinada no comprimento de onda particular. (viii) Espectros de massa de ionização de eletropulverização (E-SI-MS) foram registrados em um espectrômetro de plataforma LCZ (Micro-mass, Inglaterra). (ix) Espectrometria de Massa de Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-MS) foi realizada para determinação das concentrações de Pd usando um instrumento ELAN-6000 (Perkin Elmer, CT). (x) Absorção óptica dos complexos diferentes foi registrada com espectrômetros Genesis-2 (Milton Roy, Inglaterra) e V-570 (JASCO, Japão).
(xi) HPLC foi realizada usando um instrumento LC-9000 (JASCO, Japão) equipado com um detector de disposição de diodo UV-915. EXEMPLOS QUÍMICOS
Exemplo 1. Sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacte-rioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de paládio Novecentos e trinta e cinco (935) mg de Pd-Bpheid (3) foram dissolvidos em um frasco de fundo redondo de 1L com 120 ml de DMSO enquanto agitando sob Argônio (borbulhado com a solução). Taurina (1288 mg) foi dissolvida em 40 ml de tampão K2HP041M e o pH da solução foi ajustado para 8,2 (com HCI). Essa solução foi adicionada à solução de DMSO enquanto agitando, e o Argônio foi borbulhado na solução por mais 20 minutos. Então a mistura de reação foi evaporada a 30° C por 3,5 horas sob ~2 mbar e então por mais 2 horas a 37° C para uma secagem completa. Os sólidos secos foram dissolvidos em 300 ml de MeOH e a solução colorida foi filtrada em lã de algodão para se livrar de excesso de sais de tampão e tau- rina. 0 progresso da reação foi determinado através de TLC (Rf da Pd-Bpheid não-reagida é 0,8-0,85 e do produto de reação (aminóiise) é 0,080,1) e seguindo o espectro de absorção óptica da mistura de reação após liofilização e ressolubilização em MeOH. O espectro de absorção foi caracterizado por uma mudança de transição Qy de a partir de 756 nm (para B-pheid) a 747 nm (para o produto 4) e através de mudança Q* a partir de 534 nm de Pd-Bpheid a 519 nm (do produto 4). O MeOH foi evaporado e o produto 4 foi purificado através de HPLC com coluna ODS-A 250x20 S10P pm (YMC, Japão). Solvente A: 95% de tampão de fosfato 0,005M, pH 8,0 e 5% de MeOH. Solvente B: 100% de MeOH. O sólido seco foi dissolvido em 42 ml de água destilada e injetado em porções de 1,5 ml cada. O perfil de eluição é descrito na Tabela 1.0 produto 4 (Esquema 1, visto abaixo) foi eluído e coletado a ~9-11 minutos. A impurezas principais, coletadas após 4-7 minutos (ca 5-10%), correspondiam a subproduto(s) com a estrutura 7 proposta. Picos a 22-25 min (ca. 2-5%) possivelmente correspondiam à isoforma do produto principal 4 e resíduos de Pd-Bpheid não-tratados.
Tabela 1. Perfil de gradiente de purificação do composto 4 O solvente (metanol aquoso) foi evaporado sob pressão reduzida. Então o produto purificado 4 foi novamente dissolvido em ~150 ml de MeOH e filtrado em lã de algodão. O solvente foi evaporado novamente e o pigmento sólido 4 foi armazenado sob Ar no escuro a -20° C. O rendimento da reação: -90% (em peso, relativo a 3). A estrutura do produto 4 foi confirmada através de espectrosco-pia de massa de eletropulverização. (ESI-MS, modo negativo, Figura 2), (picos a 875 (M-K-H), 859(M~-2K-H+Na), 837(M"-2K), 805 (M2K-H-OMe), 719) e espectro de 1H-RMN (Figura 4 em MeOH-d4). A Tabela 4 provê as mudanças (em unidades ppm) dos picos de RMN principais.
Espectro de absorção óptica (UV-VIS) (MeOH): λ, 747 (1,00), 5.16 (0,13), 384 (0,41), 330 (0,50); ε747 (MeOH) é 1,2 x 105 mol'1 cm'1. RMN (MeOH-d4): 9,38 (5-H, s), 8,78 (10-H, s), 8,59 (20-H, s), 5,31 e 4,95 (151-CH2, dd), 4,2-4,4 (7,8,17,18-H, m), 3,88 (153-Me, s), 3,52 (21-Me, s), 3,19 (121-Me, s), 3,09 (32-Me, s), 1,92-2,41, 1,60-1,75 (171, 172-CH2, m), 2,19 (81-CH2, m), 1,93 (71-Me, d), 1,61 (181-Me, d), 1,09 (82-Me, t), 3,62, 3,05 (CH2's de taurina).
Razão de divisão de octanol/água é 40:60.
Exemplo 2. Preparação de sal de dipotássio de S^oxo-15-metoxicarbonilme-til-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetiltamida (Composto 5) Cento e sessenta (160) mg de taurina foram dissolvidos em 5 ml de tampão de K2HP041M, e o pH da solução foi ajustado para 8,2. Essa solução foi adicionada a 120 mg de composto 2 dissolvido em 15 ml de DM-SO, e a reação e purificação seguinte eram análogas àquelas descritas no Exemplo anterior.
Espectro de absorção (MeOH): λ, 750 (1,00), 519 (0,30), 354 (1,18) nm. ESI-MS (-): 734 (M'-2K). RMN (MeOH-d4): 9,31 (5-H, s), 8,88 (10-H, s), 8,69 (20-H, s), 5,45 e 5,25 (151-CH2, dd), 4,35 (7,18-H, m), 4,06 (8,17-H, m), 4,20 e 3,61 (2-CH2, m de taurina), 3,83 (153-Me, s), 3,63 (21-Me, s), 3,52 (3-CH2, m de taurina), 3,33 (121-Me, s), 3,23 (32-Me, s), 2,47 and 2,16 (171-CH2, m), 2,32 e 2.16 (81-CH2, m), 2,12 e 1,65 (172-CH2, m), 1,91 (71-Me, d), 1,66 (181-Me, d), 1,07 (82-Me, t). A razão de divisão de octanol/água é 60:40.
Exemplo 3. Preparação de saí de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonií- metil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de cobre(ll) (Composto 10) Cinquenta (50) mg de composto 5 do Exemplo 2 e 35 mg de acetato de cobre (II) foram dissolvidos em 40 ml de metanol e argônio foi borbu-Ihado na solução por 10 minutos. Então 500 mg de ascorbato de palmitoíla foram adicionados, e a solução foi agitada por 30 minutos. O espectro de absorção era caracterizado por uma mudança de transição Qy de a partir de 750 nm (para 5) a 768 nm (para o produto 10) e por mudança Qx de a partir de 519 nm de 5 a 537 nm (do produto 10). Então a mistura de reação foi evaporada, redissolvida em acetona e filtrada em lã de algodão para se livrar de excesso de sal de acetato. A acetona foi evaporada e o produto foi adicionalmente purificado através de HPLC nas condições mencionadas acima com o perfil de eluição, descrito na Tabela 2. O solvente (metanol aquoso) foi evaporado sob pressão reduzida. Então, o pigmento purificado 10 foi redissolvido em metanol e filtrado em lã de algodão. O solvente foi evaporado novamente e o pigmento sólido 10 foi armazenado sob Ar no escuro a -20°C. Rendimento da reação: -90%. Tabela 2. Perfil de gradiente de purificação do composto 10 Espectro de absorção (MeOH): λ, 768 (1,00), 537 (0,22), 387 (0,17) e 342 (0,79) nm. ESI-MS (-): 795 (WT-2K). A razão de divisão de octanol/água é 40:60.
Exemplo 4. Preparação de sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbo-nilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de zinco (Composto 111 Inserção de Zn no composto 5 foi realizada com acetato de Zn em ácido acético conforme anteriormente descrito (Patente U.S. No. 5.726.169). A purificação final foi realizada através de HPLC nas mesmas condições que para o composto 5 no Exemplo 2 acima.
Espectro de absorção (MeOH): λ, 762 (1,00), 558 (0,26), 390 (0,62) e 355 (0,84) nm. A razão de divisão de ocíanol/água é 50:50.
Exemplo 5: Preparação de sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilme-til-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoniletil)amida de manganêsílll) (Composto 12) Inserção de Mn no composto 5 foi realizada com acetato de Zn em ácido acético conforme anteriormente descrito (WO 97/19081; US 6.333.319) com algumas modificações. Desse modo, cinqüenta (50) mg de composto 5 em 10 ml de DMF foram agitados com 220 mg de acetato de cádmio e aquecidos sob atmosfera de argônio a 110°C por cerca de 15 minutos (formação de complexo de Cd é monitorada mudando a faixa de absorção de transição de Qy de 519 a 585 nm em acetona). Então a mistura de reação foi resfriada e evaporada. O resíduo seco foi redissolvido em 15 ml de acetona e agitado com cloreto de manganês(ll) para formar o produto de Mn(lll) 12. A formação de produto é monitorada mudando a faixa de transição Qx de 585 para 600 nm e a faixa de transição Qy de 768 para 828 nm em acetona. A acetona foi evaporada e o produto 12 foi adicionalmente purificado através de HPLC nas condições mencionadas no Exemplo 2 acima com o perfil de eluição descrito na Tabela 3 abaixo onde o sistema de solvente consiste em: A-5% de metanol aquoso, B-metanol.
Tabela 3. Perfil de gradiente de purificação do composto 12 0 solvente (metanol aquoso) foi evaporado sob pressão reduzida e o pigmento sólido 12 foi armazenado sob Ar no escuro a -20°C.
Espectro de absorção (MeOH): λ, 828 (1,00), 588 (0,32) e 372 (0,80) nm. A razão de divisão de octanol/água é 5:95.
Exemplo 6. Preparação de sal de sódio de bacteriofeoforbida a 173-(3-sulfo-1-óxi-succinimida)ésterde paládio (Composto 6) Cinqüenta (50) mg de Pd-Bpheid (composto 2), 80 mg de N-hidroxissulfossuccinimida (sulfoNHS) e 65 mg de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etiicarbodiimida (EDC) foram misturados em 7 ml de DMSO seco da noite para o dia em temperatura ambiente. O solvente foi evacuado sob pressão reduzida. O resíduo seco foi redissolvido em clorofórmio (ca de 50 mL), filtrado do material insolúvel e evaporado. A conversão era 95% ab. (TLC). O produto 6 foi usado mais tarde sem purificação cromatográfica adicional. ESI-MS (-): 890 (M'-Na). RMN (CDCIs): 9,19 (5-H, s), 8,49 (10-H, s), 8,46 (20-H, s), 5,82 (132-H, s), 4,04-4,38 (7,8,17,18-H, m), 3,85 (134-Me, s), 3,47 (21-Me, s), 3,37 (12-Me, s), 3,99 (32Me, s), 1,77 (71-Me, d), 1,70 (181-Me, d), 1,10 (82'Me, t), 4,05 (CH2 de sNHS), 3,45 (CH de s NHS).
Exemplo 7, Preparação de sal de potássio de bacteriofeoforbida a 173-(3-sulfopropiDamida de paládio (Composto 7) Dez (10) mg de composto 6 em 1 ml de DMSO foram misturados com 20 mg de homotaurina (ácido 3-amino-1-propano-sulfônico) em 1 ml de tampão de fosfato K 0,1 M, pH 8,0, da noite para o dia. Então a mistura de reação foi dividida em clorofórmío/água. A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro e evaporada. O resíduo seco foi redissolvido em cloro-fórmio-metanol (19:1) e aplicado a uma coluna cromatográfica com sílica. O produto 7 foi obtido com eluição de clorofórmio-metanol (4:1). O rendimento era cerca de 80-90%. . ESI-MS (-): 834 (M-K) m/z. RMN (MeOH-d4): 9,16 (5-H, s), 8,71 (10-H, s), 8,60 (20-H, s), 6,05 (132-H, s), 4,51,4,39, 4,11,3,98 (7,8,17,18-H, todos m), 3,92 (134-Me, s), 3,48 (21-Me, s), 3,36 (121-Me, s), 3,09 (32-Me, s), 2,02-2,42 (171 e 172-CH2, m), 2,15 (81-CH2, q), 1,81 {71-Me, d), 1,72 (181-Me, d), 1,05 (82-Me, t), 3,04, 2,68, e2,32 (CH2'sde homotaurina, m).
Exemplo 8. Preparação de sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilme-til-Rodobacteríoclorina 131.173-di(3-sulfopropil)amida de paládio (Composto S) Dez (10) mg de composto 6 ou 7 foram dissolvidos em 3 ml de DMSO, misturados com 100 mg de homotaurina em 1 ml de tampão de fosfato K 0,5M, pH 8,2 e incubados da noite para 0 dia em temperatura ambiente. O solvente foi então evacuado sob pressão reduzida conforme acima descrito, e 0 produto 8 foi purificado através de HPLC. Rendimento 83%.
Espectro de absorção (MeOH): 747 (1,00), 516 (0,13), 384 (0,41), 330 (0,50), £747 = 1,3x105 mol'1 cm'1. ESi-MS(-): 1011 (M'-K), 994 (M'-2K+Na),972 (M'-2K), 775 (M-2K-C02Me-homotaurina NHCH2CH2CH2SO3), 486 ([M-2K]/2) RMN (MeOH-d4): 9,35 (5-H, s), 8,75 (10-H, s), 8,60 (20-H, s), 5,28 e 4,98 (15~1-CH2, dd), 4,38, 4,32, 4,22, 4,15 (7,8,17,18-H, todos m), 3,85 (15~3-Me, s), 3,51 (21-Me, s), 3,18 (121-Me, s), 3,10 (32-Me, s 2,12-2,41 (171-CHZ, m), 2,15-2,34 (81-CH2, m), 1,76-2,02 (172-CH2, m), 1,89 (71-Me, d), 1,61 (181-Me, d), 1,07 (82-Me, t), 3,82,3,70, 3,20, 3,10, 2,78, 2,32, 1,90 (CH2's de homotaurina a C-131 e C-173).
Exemplo 9. Sal de tripotássio de 31-(3-sulfopropilimino)-15-metoxicarbonil-metil-Rodobacterioclorina 131,173-dif3-sulfopropilamida) de paládio (Composto 9) O composto 9 foi obtido de HPLC como produto em quantidade menor durante síntese de 8.
Espectro de absorção (MeOH): 729 (1,00), 502 (0,10), 380 (0,69), 328 (0,57). ESI-MS (30.4.2000): 1171 (M-K+H), 1153 (M'-2K-H+Na), 1131 (M-2K), 566 ([MK]/2), 364 ([M-3K]/3). RMN (MeOH-d4): 8,71 (1H), 8,63 (1,5H), 8,23 (0,5H) (5-, 10- e 20-H, todos-m), 5,30 e 4,88 (151-CH2, dd), 4,43 e 4,25 (7,8,17,18-H, m), 3,85 (I5~3-Me, s), 3,31 (21Me, s), 3,22 (121-Me, s), 3,17 (32-Me, m), 1,89-2,44 (171 e 172-CH2, m), 2,25 (81-CH2| m), 1,91 (71-Me, s), 1,64 (181-Me, s), 1,08 (82-Me, t), 4,12, 3,56,3,22, 3,16,2,80 o 2,68 (CH2's de homotaurina).
Exemplo 10, Sal de potássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterio-clorina 13í-(2-sulfoetil)amida, 173-(N-imunoqlobulina G)de paládio (Composto 13) Dez (10) mg de composto 4 foram reagidos com 20 mg de sulfo-NHS e 15 mg de EDC em 1 ml de DMSO seco por 1 hora em temperatura ambiente, então IgG de coelho (0,6 mg) em PBS (2,5 ml) foi adicionado e a mistura foi adicionalmente incubada da noite para o dia em temperatura ambiente. A mistura foi evaporada até secar, então redissolvida em 1 ml de PBS e carregada em coluna Sephadex G-25 equilibrada com PBS. Uma faixa colorida foi eluída com 4-5 ml de PBS. A razão de pigmento/proteína no conjugado obtido 13 foi determinada através de densidade óptica a 753 e 280 nm, respectivamente, e variada entre 0,1/1 a 1/1 de pigmento 13/proteína.
Exemplo 11. Preparação de sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonil-metil-Rodobacterioclorina 131-(2-carboxíetil)amida de paládio (Composto 14) A preparação e purificação do composto do título 14 foram realizadas conforme descrito no Exemplo 2, através de reação do composto 2 com ácido 3-aminopropiônico (β-alanina) (150 mg) ao invés de taurina. Rendimento: 85%.
Exemplo 12: Preparação de sal de tripotássio de 31-oxo-15-metoxicarbo-nilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-fosfopropil)amida de paládio (Composto 15) A preparação e purificação do composto do título 15 foram realizadas conforme descrito no Exemplo 2, através de reação do composto 2 com ácido 3-amino-1-propanofosfônico (180 mg) ao invés de taurina. Ren- dimento: 68%).
Exemplo 13: Sal de tripotássio de 31-(3-sulfopropilamino)-15-metoxicarbonil-metii-Rodobacterioclorina 131,173-di(3-sulfopropi0amida de paládio (Composto 16) Para redução do grupo imina em 31-(3-sulfopropilimino) no grupo 31-(3-sulfopropilamino) correspondente, o composto 9 (8 mg) foi reagido agitando com cianoboroidreto de sódio (15 mg) em 5 ml de metanol da noite para o dia em temperatura ambiente. Então a mistura de reação foi tratada com HCI 0,05M (5 ml), neutralizada com KOH 0,01 M e evaporada. O produto título 16 foi purificado através de condições de HPLC conforme descrito no Exemplo 2. Rendimento: 80-90%. II. SECÃO BIOLÓGICA Materiais e Métodos Estudos In Vitro (i) Cultura de Célula. Células de melanoma de camundongo M2R, endoteliais de camundongo H5V e de glioma de rato C6 foram cultura-das como monocamadas em meio da Eagle modificado da Dulbecco (DMEM)/F12 contendo 25 mM de HEPES, pH 7,4, soro bovino fetal a 10% (FBS), glutamina (2 mM), penicilina (0,06 mg/mi) e estreptomicina (0,1 mg/ml) (daqui em diante referido como o "Meio de Cultura"). As células cresceram a 37°C em uma atmosfera umidificada de CO2 a 8%. (ii) Ensaio de Fototoxicidez. Para determinar a eficácia fotodinâ-mica, as células foram pré-incubadas com concentrações altas de pigmentos no escuro para os tempos e condições conforme indicado para os experimentos individuais. Sensibilizador não-ligado foi removido através de lavagem das células uma vez com meio de cultura, e as placas foram iluminadas em temperatura ambiente a partir do fundo (λ>650 nm, 12 J/cm2). A fonte de luz era lâmpada de Halogênio de 100W (Osram, Alemanha) equipada com um filtro de água de 4 cm. As culturas foram postas na incubadora de cultura e a sobrevivência celular foi determinada 24 horas após iluminação, através de ensaio de viabilidade Vermelho Neutro. Três tipos de controles foram usados: (i) controle de luz: células iluminadas na ausência de pigmentos; (ii) controle no escuro: células tratadas com pigmentos mas mantidas no escuro; e (iii) células não-tratadas que foram mantidas no escuro.
Estudos In Vivo (iii) Implante de tumor. Células M2R ou C6 (2x106} foram implantadas subcutaneamente no dorso dos camundongos; os tumores se desenvolveram para o tamanho de tratamento {6-8 mm) dentro de 2-3 semanas. (iv) Preparação de Sensibilizador. Soluções estoque dos compostos da invenção foram preparadas antes do uso através de dissolução do pigmento seco diretamente em PBS para a concentração desejada para injeção. (v) Biodistribuição e Farmacocinética. O pigmento 4 da invenção (6 mg/kg de corpo) foi injetado em camundongos nus CD1 através da veia do rabo. Os camundongos foram sacrificados nos tempos indicados e amostras dos órgãos ou tecidos indicados foram postas e pesadas em frascos pré-pesados e imediatamente congeladas em gelo seco. Para exame, cada amostra foi descongelada e homogeneizada (1:10 p/v) em água duplamente destilada. Alíquotas do homogenato {0,5 ml) foram liofilizadas em tubos de teste Eppendorff. Então 0,2 ml de HN03 (70%, TraceSelect, Fluka) foi adicionado a cada amostra seca, incubado por 1 hora a 90°C e diluído em água duplamente destilada para 10 ml. As concentrações de paládio foram determinada através de ICP-MS. A base foi determinada para cada órgão/tecido em amostras idênticas tomadas de camundongos não-tratados, e os valores foram subtraídos dessa maneira. (vi) Protocolo de PDT. Os camundongos carregando o tumor M2R foram anestesiados e o pigmento foi injetado intravenosamente (i.v.) através da veia do rabo. Os tumores foram imediatamente iluminados trans-cutaneamente por 5 minutos por laser de diodo de 755 nm (CeramOptec, Alemanha) com dose de luz ou de 30J/cm2 (100mW/cm2), 39J/cm2 (130mW/cm2) ou 45J/cm2 (150mW/cm2). Após o tratamento, os camundongos foram retornados para a gaiola. No grupo de controle de escuro, os camundongos foram injetados i.v. com sensibilizador e postos na gaiola escura por 24 horas. No grupo de controle com luz, os camundongos foram ilumina- dos com 45J/cm2. (vii) Fechamento e Permeabilidade Vascular. Camundongos carregando xenoenxertos de tumor de glioma C6 foram tratados com pigmento 4 (9 mg/kg) e luz (100 mW/cm2 por 5 minutos). Imediatamente após tratamento, Azul Evans (EB; 1% em PBS) foi injetado (0,5 ml, i.p.). Os camundongos foram fotografados em 3 e 24 horas após tratamento. Os camundongos foram sacrificados 24 horas após tratamento e a presilha da pele foi feita para cada camundongo e fotografada. Então o tumor foi removido com a pele acima dele, congelado por 1 hora a -20°C e então uma lâmina axial foi feita e a lâmina foi fotografada. Os camundongos de controle foram injetados com Azul Evans ao mesmo tempo que os camundongos tratados, e o protocolo foi continuado conforme acima descrito para todos os camundongos juntos.
Exemplo 14. Citofototoxidez dos derivados de bacterioclorofila sulfonados contra culturas de célula de tumor A fototoxicidez dos compostos 4 e 8 foi determinada conforme descrito em (ii) acima em células de melanoma de camundongo M2R e en-doteíiais de camundongo H5V. As células foram pré-incubadas com concentrações altas do composto por 4 horas, lavadas e iluminadas ou mantidas no escuro.
Os resultados são mostrados nas Figuras 1A-1B para o composto bi-sulfonado 8 em células HV5 e MR2, respectivamente, e nas Figuras 2A-2B para composto mono-sulfonado 4 (comparação) em células H5V e MR2, respectivamente. Como pode ser visto, a fototoxicidez de ambos pigmentos 4 e 8 é dependente da luz e concentração, sem qualquer toxidez no escuro na faixa testada. O LD50 de ambos pigmentos é o mesmo (~2 μΜ), e é similar em ambos tipos de célula. A fototoxicidez dos pigmentos sulfonados 5_e 11 foi determinada em células de melanoma de camundongo M2R. Como pode ser visto nas Figuras 3 e 4, a fototoxicidez dos pigmentos 5 e H é dependente da concentração e luz e o LD5o de ambos pigmentos é o mesmo (~5 μΜ). Não há nenhuma toxidez no escuro dentro da faixa testada.
Exemplo 15. Farmacocinética e biodistribuição de composto 4 A primeira etapa antes do teste de fitotoxidez de 4 com relação a PDT de xenoenxertos de melanoma sólidos era determinar a farmacocinética e biodistribuição do pigmento in vivo conforme descrito na seção (iv) acima. Como pode ser visto na Figura 5, cerca de 90% do pigmento 4 depuraram dentro dos primeiros 10 minutos após injeção i.v. com um padrão de cinética monofásica com um t0,5 de 1,65 minuto (Tabela 4). A depuração rápida de 4 do sangue pode implicar que apenas uma pequena fração {se algum) é ligada aos componentes do plasma, de outro modo a depuração seria mais lenta.
Tabela 4. Parâmetros farmacocinéticos de 4 em sangue de camundonqo.
Ker taxa de eliminação; Vd- volume de distribuição; CL- depuração. A biodistribuição do composto 4 mostra que, na maioria dos órgãos de camundongos examinados, os níveis de pigmento são altos imediatamente após injeção e caem para níveis quase de base dentro de 20-30 minutos, similar às suas taxas de depuração do sangue (Figura 6). Esses resultados provavelmente representam o nível de pigmento no sangue preso na vasculatura do órgão conforme visto no baço, pulmão e coração. Ainda, os resultados também sugerem que a difusão do pigmento para os órgãos é insignificante. O pigmento 4 rapidamente depura do corpo do camundongo, e dentro de 30 minutos após injeção ele está nos níveis de base em todos os tecidos. A taxa de depuração de 4 do corpo do camundongo é muito mais rápida do que Pd-Bpheid (3), que atinge níveis de base apenas 48 horas após injeção (não-mostrado).
Exemplo 16. Tratamento fotodinâmico de xenoenxertos de melanoma M2R em camundongos nus CD1 com pigmento 4 suifonado Com base nos resultados de farmacocinética do Exemplo 15 acima, o protocolo de tratamento para o composto 4 foi ajustado para 5 minutos de iluminação imediatamente após injeção de pigmento. Nesses experimentos (vide seção (vii) acima), um laser médico dedicado igualando à absorção de pico de 4 (CeramOptec, Alemanha, 755 nm) foi usado. A fim de determinar o protocolo de droga/luz ótimo, os camundongos foram tratados com uma dose de droga de 6 mg/kg e aumentando a intensidade de luz (Figura 7). Como pode ser visto na curva de sobrevivência Kaplan-Meier, aumento na intensidade de luz aperfeiçoa a taxa de cura dos camundongos de 43% a 60% com 30 e 45 J/cm3, respectivamente. Quando a dose de droga foi elevada para 9 mg/kg com intensidade de luz de 30 J/cm3, houve um aumento significante na sobrevivência de camundongos para 70% (Figura 7). Nenhuma toxidez no escuro foi vista em animais tratados com 6 ou 9 mg/kg e mantidos no escuro.
Exemplo 17. Efeito seletivo de tratamento fotodinâmico com composto 4 Esse experimento foi realizado conforme descrito na seção (vii) acima. A Figura 8 ilustra o efeito de tratamento fotodinâmico sobre a perfu-são sangüínea em xenoenxertos C6 implantados em camundongos (a, e). O animal tratado que foi administrado com Azul Evans imediatamente após PDT mostrou edema e derrame vascular aumentado de EB no interstício conforme demonstrado através da cor azul (devido ao derrame de albumina-Azul Evans) na área iluminada quando comparado com a área não-iluminada no mesmo animal e ao animal tratado (b, f). Vinte e quatro horas mais tarde, pode ser visto que nos camundongos tratados, o entorno do tumor é bastante colorido de azul (edema; c), enquanto que o tumor permanece branco (nenhuma cor EB) devido ao fechamento vascular que aconteceu imediatamente após PDT (d). O tecido muscular sob o tumor bem como a pele acima e em torno do tumor (mas dentro da área tratada) são azuis, indicando que nenhum fechamento vascular aconteceu (c, d). No animal não-tratado, o tumor é colorido de azul igual aos outros tecidos (g, h). O fechamento seletivo de novos vasos no tumor indica que os compostos da invenção podem ser usados para tratamento seletivo de vasculatura anormal co* mo em degeneração macular relacionada com a idade (AMD).
Exemplo 18. Tratamento PDT com Composto 4 - modelo de animal de AMD
Terapia fotodinâmica (PDT) foi desenvolvida com o objetivo de induzir oclusão vascular localizada das membranas vasculares recém-formadas emanando da coróide {neovascularização coroidal - CNV). Em degeneração macular relacionada com a idade (AMD), PDT usando verteporfi-na reduz o risco de perda visual secundária para CNV. O mecanismo de ação de PDT é imaginado envolver a liberação de espécies oxigênio reativo que danificam as células endoteliais e ativam cascata de coagulação suben-dotelial. Esses eventos levam à formação de trombos dentro do lúmen do vaso.
Para o tratamento de neovascularização coroidal, parâmetros altamente seletivos (Densidade ou fluência de força de laser, dose de fotos-sensibilizador e distância para iluminação com luz (DLI)) foram desenvolvidos permitindo foco e direcionamento precisos dos vasos patológicos e efeitos de dano secundários mínimos à retina e tecidos coroidais saudáveis. No entanto, usando o único fotossensibilizador (verteporfina) atualmente disponível para uso clínico, tratamentos repetidos são geralmente requeridos para atingir os efeitos oclusivos de CNV desejados. Desse modo, o perigo para dano a tecido colateral é aumentado e pode se tornar um efeito colateral significante de tratamento.
Nesse experimento, foi avaliado o potencial de tratamento foto-dinâmico (PDT) do fotossensibilizador hidrossolúvel aqui chamado WST11 ou composto 4 e suas características comparadas àquelas da verteporfina. O composto 4 é um derivado de bacterioclorofila puro e estável isolado como um pó cristalino púrpura preto. Ele tem um peso molecular de 916 e é solúvel em solução aquosa. Ele é caracterizado pelas propriedades que seguem: (a) 4 picos de absorção principais (750, 530, 385 e 330 nm). A absorbâncía mais forte de luz é próxima à infravermelha (« 750 nm) onde a transmitância do tecido é a mais alta; (b) uma citotoxidez muito baixa no escuro. Desse modo, dano ao tecido pode ser controlado pela dose de luz e duração de exposição; (c) ele é rapidamente depurado do corpo após admi- nistração. Desse modo, dano de fotossensibilização à pele potencial quando da exposição à luz ambiente ou à luz do sol é mínimo; (d) degeneração de espécies oxigênio reativo (ROS) é alta por causa do cruzamento inter-sistema eficiente (ISC). O pó de WST11 foi diluído em água estéril sem endotoxina em uma concentração de 10 mg/ml e agitado até dissolução completa. Essa formulação permanece estável por 24 horas a 4°C protegida da luz. Para calcular o volume a ser injetado, ajuste foi feito de acordo com o peso do coelho. A solução de volume apropriado foi injetada intravenosamente como um bólus através da veia da orelha marginal. O potencial do composto 4 para PDT de degeneração macular relacionada à idade (AMD) foi comparado com verteporfin (Visudyne®, No-vartis, Suíça) usando um modelo de olho de camundongo. Os coelhos pig-mentados (136 coelhos "Fauve de Bourgogne", 10-12 semanas de vida, 2,53 kg; Elevage des Pins, Epeigne-sur-Dême, França) foram usados. Efeitos de PDT agudos e a longo prazo sobre o olho do coelho foram investigados para os parâmetros que seguem: 1) fluência de laser de 753 nm (25 e 50J/cm2), doses de composto 4 (também chamado WST11) (2,5 e 5 mg/kg) e distância para iluminação de luz (DLI) de 1,5,10 e 15 minutos. 2) fluência de laser de 689 nm (10, 50, 100 J/cm2), doses de verteporfina (3, 6, e 12 mg/m2) e um DLI constante de 5 minutos. Esses parâmetros de PDT compreendiam uma disposição de efeitos sobre a coróide e a retina de cobertura que foram liberados por 83 segundos para induzir casos vasculares oclusi-vos, oclusivos de limiar e não-oclusivos. Os olhos de coelho tratados foram examinados e seguido por oftalmoscopia indireta, angiografia de fluoresceí-na (FA) e histologia em vários intervalos após PDT. PDT de WST11 usando uma fluência de 50 J/cm2, 5 mg/kg de dose de droga e DL1 de 1 minuto induziu oclusão coroidal total associada com lesões estruturais da RPE e retina de cobertura em 100% dos olhos tratados (Figuras 9A-9D). Parâmetros de PDT mais fracos, não-oclusivos, (25 J/cm2, 5 mg/kg de dose de droga e DLI de 10 minutos) não induziram oclusão de coriocapilares nem lesões na retina. PDT de verteporfina usando 12 mg/m2 de dose de droga em uma flu- ência de 100 J/cm2 e DLI de 5 minutos induziu eventos oclusivos (observados através de FA) em 89% dos olhos e dano de histologia da retina e camada de RPE de sobreposição em todos os oíhos. Parâmetros de PDT de verteporfina não-oclusivos, mais fracos, usando 3 mg/m2 de dose de droga, fluência de 10 J/cm2 e DLI de 5 minutos não induziram qualquer oclusão de coriocapilares em FA. No entanto, nesses olhos, dano estrutural definido da retina e tecidos coroidais foi observado em histologia. Similar à verteporfina, PDT de WST11 induz ociusão transiente dos coriocapilares observada até uma semana após tratamento. Diferente da Verteporfina, os parâmetros de PDT de WST11 não induzindo oclusão do vaso não causam dano estrutural à RPE ou retina. Desse modo, apesar de sua capacidade em induzir obstrução do vaso, o PDT de WST11 não causa dano à RPE e resina de sobreposição quando nenhuma oclusão dos coriocapilares acontece. As vantagens dessas características indicam que WST11 é um candidato adequado para tratamento de PDT de CNV em degeneração macular relacionada com a idade.
Para a histologia, olhos enucleados foram dissecados sob um microscópio binocular. Uma punção de biópsia de 4 mm foi usada para exci-sar a espessura completa de zonas tratadas. Esses tecidos foram fixados em glutaraldeído, processados em tampão de cacodilato e embebidos em plástico. Seções semifinas foram obtidas usando um micrótomo e contratin-gidas com hematoxilina-eosina. Essas seções foram analisadas usando mi-croscopia de contraste de fase. Locais específicos de interesse foram adicionalmente processados para TEM. Seções ultrafinas foram obtidas usando um ultramicrótomo e contratingidas com acetato de uranila.
REFERÊNCIAS
Chen Q, Huang Z, Luck D, Beckers J, Brun PH, Wilson BC, Scherz A, Salomon Y, Hetzel FW. (2002) Preclinical studies in normal canine prostate of a novel palladiumbacteriopheophorbide (WST09).photosensitizer for photodynamic therapy of prostate cancers. Photochem Photobiol. 76(4):438-45.
Koudinova NV, Pinthus JH, Brandis A, Brenner O, Bendel P, Ramon J, Eshhar Z, Scherz A, Salomon Y. (2003) Photodynamic therapy with Pd-Bacteriopheophorbide (TOOKAD): successful in vivo treatment of human prostatic small cell carcinoma xenografts. Int J Câncer 104(6):782-9.
Rosenbach-Belkin, V., Chen, L, Fiedor, L., Tregub, L, Pavlotsky, F., Brumfeld, V., Salomon, Y., Scherz, A. (1996) Serine conjugates of chlorophyll and bacteriochlorophytl: Photocytotoxicity in vitro and tissue distribution in mice bearing melanoma tumors. Photochem. Photobiol. 64:174-181.
Schreiber S, Gross S, Brandis A, Harmelin A, Rosenbach-Belkin V, Scherz: A, Salomon Y. (2002) Local phoíodynamíc tfierapy (PDT) of raí C6 glioma xenografts with Pd-bacteriopheophorbide leads to decreased metas-tases and increase of animal cure compared with surgery. Int J Câncer. 99(2):279-85.
Zilberstein, J., Schreiber, S., Bloemers, MCWM, Bendel, P., Ne-eman, M., Schechtman, E., Kohen, F., Scherz, A. Salomon, Y. (2001) Antivascular treatment of solid melanoma tumors with bacteriochIorophyIl-serine-based photodynamic therapy. Photochem. Photobiol. 73:257-266.
Zilberstein, J., Bromberg, A., Franz, A., RosenbachBelkin, V., Kritzmann, A., Pfefermann, R., Salomon, Y., Scherz, A. (1997) Light-dependent oxygen consumption in bacteriochlorophyll-serine-treated melanoma tumors: On-line determination using a tissue-inserted oxygen microsensor. Photochem. Photobiol. 65:1012-1019. 1: M=Mg, R = fenila geranilgeranila (Bchl a) R = Serila (Bchl-Ser) 7 2 Esquema 1 REIVINDICAÇÕES

Claims (15)

1. Derivado de bacterioclorofila, caracterizado pelo fato de que é 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de paládio na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.
2. Derivado de bacterioclorofila de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é formado com um cátion monovalente tal como K+, Na+, Li+ ou NH4+.
3. Derivado de bacterioclorofila de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido cátion é K+.
4. Derivado de bacterioclorofila de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de paládio.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um derivado de bacterioclorofila, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de o derivado de bacterioclorofila é sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de paládio.
7. Uso de um derivado de bacterioclorofila, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para uso em terapia fotodinâmica de direcionamento vascular.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para terapia fotodinâmica de direcionamento vascular de tumores, incluindo tumores metastáticos.
9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os referidos tumores são selecionados dentre melanoma ou câncer de colo, mama, pulmão, cérebro, ovário, pele, esôfago, bexiga ou próstata.
10. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser para terapia fotodinâmica de direcionamento vascular de degeneração macular relacionada com a idade.
11. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para diagnóstico de tumores.
12. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para morte de células ou agentes infecciosos compreendendo bactérias e vírus.
13. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o derivado de bacterioclorofila é sal de dipotássio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de paládio.
14. Método para preparação de um sal farmaceuticamente aceitável de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida de paládio, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) reação da Pd-bacteriofeoforbida com taurino da Fórmula H2N-(CH2)2-S03ÍH em um tampão contendo um cátion farmaceuticamente aceitável, como definido na reivindicação 2 ou 3; e (ii) isolamento do composto.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o cátion farmaceuticamente aceitável é K+.
BRPI0316319A 2002-11-17 2003-11-17 derivados de bacterioclorofila aniônicos solúveis em água, composição farmacêutica, usos dos derivados e método para preparo dos mesmos BRPI0316319B8 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL15290002A IL152900A0 (en) 2002-11-17 2002-11-17 Water-soluble bacteriochlorophyll derivatives and their pharmaceutical uses
IL152900 2002-11-17
PCT/IL2003/000973 WO2004045492A2 (en) 2002-11-17 2003-11-17 Water-soluble anionic bacteriochlorophyll derivatives and their uses

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BR0316319A BR0316319A (pt) 2005-09-27
BRPI0316319B1 true BRPI0316319B1 (pt) 2017-06-27
BRPI0316319B8 BRPI0316319B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=30011928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0316319A BRPI0316319B8 (pt) 2002-11-17 2003-11-17 derivados de bacterioclorofila aniônicos solúveis em água, composição farmacêutica, usos dos derivados e método para preparo dos mesmos

Country Status (24)

Country Link
US (6) US7947672B2 (pt)
EP (2) EP1567147B1 (pt)
JP (3) JP4922559B2 (pt)
CN (2) CN102002048B (pt)
AU (1) AU2003282354C1 (pt)
BE (1) BE2018C018I2 (pt)
BR (1) BRPI0316319B8 (pt)
CA (1) CA2506296C (pt)
CY (2) CY1115458T1 (pt)
DK (1) DK1567147T3 (pt)
ES (1) ES2489516T3 (pt)
FR (1) FR18C0002I2 (pt)
HK (1) HK1081858A1 (pt)
HU (1) HUS1800020I1 (pt)
IL (2) IL152900A0 (pt)
LU (1) LUC00073I2 (pt)
MX (1) MXPA05005262A (pt)
NL (1) NL300934I2 (pt)
NO (2) NO334978B1 (pt)
NZ (1) NZ540790A (pt)
PL (1) PL216661B1 (pt)
PT (1) PT1567147E (pt)
RU (1) RU2353624C2 (pt)
WO (1) WO2004045492A2 (pt)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL152900A0 (en) * 2002-11-17 2003-06-24 Yeda Res & Dev Water-soluble bacteriochlorophyll derivatives and their pharmaceutical uses
HUE030586T2 (en) 2004-06-07 2017-06-28 Yeda Res & Dev Cationic bacteriochlorophyll derivatives and their uses
US9957293B2 (en) * 2006-08-23 2018-05-01 Yeda Research And Development Company Ltd. Conjugates of RGD peptides and porphyrin or (bacterio)chlorophyll photosynthesizers and their uses
EP2257309B1 (en) 2008-02-27 2019-10-16 Yeda Research And Development Company Ltd. Rgd-(bacterio)chlorophyll conjugates for use in diagnosis of tumors comprising necrotic domains
EP2425873A1 (fr) 2010-09-07 2012-03-07 Steba Maor SA Modélisation de l'action d'une fibre optique dans un traitement par therapie photodynamique, et assistance à la planification d'un tel traitement
BR112013023162A2 (pt) 2011-03-11 2017-07-25 Abenhaim Lucien métodos de terapia fotodinâmica focal
PT2747763T (pt) 2011-08-23 2021-02-22 Yeda Res & Dev Fotossensibilizadores de (bacterio)clorofila para o tratamento de doenças e distúrbios oculares
EP2971026B1 (en) 2013-03-11 2020-11-18 Tookad Ip Sarl Method for producing bacteriochlorophyll a
CA2907356C (en) 2013-03-15 2022-07-12 Sherri Ann MCFARLAND Metal-based coordination complexes as photodynamic compounds and their use
RU2021110230A (ru) * 2016-04-10 2021-05-26 Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко. Лтд. Комбинированные способы терапии для лечения злокачественной опухоли
CN107987081B (zh) * 2016-10-26 2019-12-06 刘辉 一种二氢卟吩e6衍生物及其药学上可接受的盐、其制备方法和应用
AU2017384348B2 (en) * 2016-12-22 2024-03-07 Daiichi Sankyo Company, Limited Peptide for treating age-related macular degeneration
US10933134B2 (en) 2017-03-16 2021-03-02 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Combination therapies for treatment of cancer
WO2019116376A1 (en) * 2017-12-17 2019-06-20 Yeda Research And Development Co. Ltd. Cop9 signalosome (csn) complex modulators and uses thereof
CN111848656B (zh) * 2020-06-24 2023-03-14 天津大学 离子修饰的原卟啉镓化合物及其制备方法和应用
CN116033913A (zh) * 2020-07-29 2023-04-28 国立大学法人北陆先端科学技术大学院大学 癌症的治疗药或诊断药
CN115843960A (zh) * 2022-11-03 2023-03-28 中国农业科学院农产品加工研究所 一种提高叶绿素稳定性的方法

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4512762A (en) 1982-11-23 1985-04-23 The Beth Israel Hospital Association Method of treatment of atherosclerosis and a balloon catheter for same
US4693885A (en) * 1984-07-18 1987-09-15 Nippon Petrochemicals Co., Ltd. Tetrapyrrole therapeutic agents
US4675338A (en) * 1984-07-18 1987-06-23 Nippon Petrochemicals Co., Ltd. Tetrapyrrole therapeutic agents
US4977177A (en) * 1985-04-30 1990-12-11 Nippon Petrochemicals Company, Ltd. Tetrapyrrole polyaminomonocarboxylic acid therapeutic agents
US4656186A (en) * 1985-04-30 1987-04-07 Nippon Petrochemicals Co., Ltd. Tetrapyrrole therapeutic agents
JPS63196586A (ja) * 1987-02-12 1988-08-15 Toyo Hatsuka Kogyo Kk バクテリオフエオホ−バイド誘導体
DE3853995T2 (de) * 1987-04-17 1995-11-23 David H Dolphin Porphyrine, verfahren zu deren herstellung und verwendungen.
US5004811A (en) 1987-12-24 1991-04-02 Nippon Petrochemicals Company, Ltd. Tetrapyrrole aminocarboxylic acids
US5171741A (en) * 1989-04-21 1992-12-15 Health Research, Inc. Bacteriochlorophyll-a derivatives useful in photodynamic therapy
DE4121876A1 (de) * 1991-07-02 1993-01-14 Scheer Hugo Modifizierte bakteriochlorophylle, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JP3191223B2 (ja) * 1991-10-04 2001-07-23 株式会社光ケミカル研究所 ポルフィリン誘導体とその用途
JPH08506566A (ja) * 1992-06-19 1996-07-16 ザ・ユニバーシティ・オブ・トリド ポルフィリン系イミンの製造方法及び使用方法
IL102645A (en) * 1992-07-26 1998-02-22 Yeda Res & Dev Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
US6147195A (en) * 1993-07-26 2000-11-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
FR2712493B1 (fr) * 1993-11-16 1996-01-19 Centre Nat Rech Scient Utilisation de photosensibilisateurs dérivés du noyau phorbine pour la décontamination du sang infecté par des parasites et/ou des virus.
JPH09110872A (ja) 1995-10-23 1997-04-28 Eiken Chem Co Ltd ヨードポルフィリン誘導体
IL116126A0 (en) 1995-11-24 1996-01-31 Yeda Res & Dev Process for the preparation of bacteriochlorophyllis some novel compounds of this type and pharmaceutical compositions comprising them
GB9524553D0 (en) * 1995-11-30 1996-01-31 Britton Charles J Plastic lever lid tins
US5770730A (en) * 1996-03-08 1998-06-23 Health Research, Inc. Synthesis of carbodimide analogs of chlorins and bacteriochlorins and their use for diagnosis and treatment of cancer
US6063777A (en) * 1996-10-01 2000-05-16 Wyeth Lederle Japan, Ltd. Iminochlorinaspartic acid derivatives
IL129929A0 (en) * 1996-12-17 2000-02-29 Du Pont Polymerization of ethylene with specific iron or cobalt complexes novel pyridinebis (imines) and novel complexes of pyridinebis(imines) with iron and cobalt
DE69934328T2 (de) * 1998-12-09 2007-07-19 Yeda Research And Development Co., Ltd. Palladiumsubstituierte bakteriochlorophyllderivate und deren verwendung
IL133253A0 (en) 1999-12-01 2001-04-30 Yeda Res & Dev Chlorophyll and bacteriochlorophyll esters, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
JP4277159B2 (ja) 2000-06-02 2009-06-10 独立行政法人科学技術振興機構 新規なテトラピロリル置換ポルフィリン及びその製法
WO2002013820A1 (en) 2000-08-11 2002-02-21 Ceramoptec Industries, Inc. Photosensitizing ointment
WO2002098882A1 (en) 2001-06-01 2002-12-12 Ceramoptec Industries, Inc. Water-soluble porphyrin derivatives for photodynamic therapy, their use and manufacture
IL152900A0 (en) * 2002-11-17 2003-06-24 Yeda Res & Dev Water-soluble bacteriochlorophyll derivatives and their pharmaceutical uses

Also Published As

Publication number Publication date
EP1567147B1 (en) 2014-05-07
CN1741801B (zh) 2010-12-22
FR18C0002I1 (pt) 2018-06-15
US7947672B2 (en) 2011-05-24
DK1567147T3 (da) 2014-08-11
US20110117029A1 (en) 2011-05-19
AU2003282354A1 (en) 2004-06-15
US20170143988A1 (en) 2017-05-25
BRPI0316319B8 (pt) 2021-05-25
CA2506296A1 (en) 2004-06-03
HK1081858A1 (en) 2006-05-26
BE2018C018I2 (pt) 2023-03-07
CN1741801A (zh) 2006-03-01
US20200094069A1 (en) 2020-03-26
US20130345417A1 (en) 2013-12-26
IL168480A (en) 2015-01-29
US8461142B2 (en) 2013-06-11
RU2353624C2 (ru) 2009-04-27
JP2011162551A (ja) 2011-08-25
PL216661B1 (pl) 2014-04-30
ES2489516T3 (es) 2014-09-02
NO2018012I1 (no) 2018-04-10
LUC00073I2 (en) 2018-06-20
CY2018012I2 (el) 2018-09-05
CY2018012I1 (el) 2018-09-05
CA2506296C (en) 2012-09-11
IL152900A0 (en) 2003-06-24
US20060142260A1 (en) 2006-06-29
CY1115458T1 (el) 2017-01-04
NZ540790A (en) 2009-12-24
NO334978B1 (no) 2014-08-11
AU2003282354C1 (en) 2009-10-29
PL376734A1 (pl) 2006-01-09
NO20052925L (no) 2005-06-15
JP2011148822A (ja) 2011-08-04
WO2004045492A2 (en) 2004-06-03
MXPA05005262A (es) 2005-07-25
US20150238773A1 (en) 2015-08-27
JP5555659B2 (ja) 2014-07-23
NO20052925D0 (no) 2005-06-15
JP2006515836A (ja) 2006-06-08
PT1567147E (pt) 2014-08-25
JP5566945B2 (ja) 2014-08-06
WO2004045492A3 (en) 2004-07-08
AU2003282354B2 (en) 2009-04-23
RU2005118771A (ru) 2006-01-20
BR0316319A (pt) 2005-09-27
AU2003282354B8 (en) 2009-05-14
NO2018012I2 (no) 2018-04-10
FR18C0002I2 (fr) 2020-03-13
CN102002048A (zh) 2011-04-06
EP2522349A1 (en) 2012-11-14
CN102002048B (zh) 2012-11-28
HUS1800020I1 (hu) 2018-05-28
JP4922559B2 (ja) 2012-04-25
EP1567147A4 (en) 2008-07-09
NL300934I2 (nl) 2018-05-22
EP1567147A2 (en) 2005-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200094069A1 (en) Water soluble anionic bacteriochlorophyll derivatives and their uses
JP3612343B2 (ja) クロロフィルとバクテリオクロロフィルの誘導体、それらの製造法及びそれら誘導体を含んで成る製剤組成物
AU2005251556B2 (en) Cationic bacteriochlorophyll derivatives and uses thereof
US20030148926A1 (en) Chlorophyll and bacteriochlorophyll esters, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
PT1137411E (pt) Processo para inibir respostas ao etileno em plantas
CN112263566A (zh) 白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒、制备方法及用途
WO2008018063A2 (en) Tetraarylporphine derivatives and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B15K Others concerning applications: alteration of classification

Free format text: PARA:INT.CI. A61K 31/40, A61P 35/00, A61P 31/00

Ipc: A61K 31/40 (2011.01), A61P 35/00 (2011.01), A61P 3

B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]
B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 17/11/2003 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF