CN100488965C - 用于光动力学治疗的水溶性卟啉衍生物、其用途和制备 - Google Patents

用于光动力学治疗的水溶性卟啉衍生物、其用途和制备 Download PDF

Info

Publication number
CN100488965C
CN100488965C CNB028111419A CN02811141A CN100488965C CN 100488965 C CN100488965 C CN 100488965C CN B028111419 A CNB028111419 A CN B028111419A CN 02811141 A CN02811141 A CN 02811141A CN 100488965 C CN100488965 C CN 100488965C
Authority
CN
China
Prior art keywords
alk
water
oalk
porphyrin
coo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB028111419A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1512994A (zh
Inventor
尼古拉·E·尼凡蒂耶夫
德米特里·V·亚顺斯基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biolitec Pharma Marketing Ltd
Original Assignee
Ceramoptec Industries Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/871,772 external-priority patent/US20030004334A1/en
Application filed by Ceramoptec Industries Inc filed Critical Ceramoptec Industries Inc
Publication of CN1512994A publication Critical patent/CN1512994A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100488965C publication Critical patent/CN100488965C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

通式(1)或(2)的高纯度药物级水溶性卟啉衍生物，及其新的制备方法和应用，这些卟啉衍生物为：其中B是具有结构(a)(b)(c)(d)(e)的环，其中：R1＝-CH＝CH2、-CH(OAlk)CH3、-CHO、-C(O)CH3、-CH2CH3、-CH(Alk)CH(COAlk)2、-CH2CH(COAlk)2、-CH(Alk)CH2COAlk、-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3和-CH2CH2CH(OH)CH3；R2＝-CH3、-CHO、-CH(OH)Alk、-CH＝CHAlk、CH2OH和CH2OAlk；R3＝-OH、-OAlk、-NH-Alk、NH-X-COO-(HG)+、-NH-Y-NR8R9和-NH-Y-OH；R4＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和NH-X-COO-(HG)+；R5＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和-NH-X-COO-(HG)+；R6＝H和-COOAlk；R7＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和-NH-X-COO-(HG)+；R8＝H和Alk；R9＝H和Alk；其中：-NH-X-COO-＝有机氨基酸的残基；X＝亚烷基、肽、寡肽和-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；Y＝亚烷基和-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；G＝亲水性有机胺(例如，N-甲基-D-葡糖胺以及其它含氨基的碳水化合物衍生物、TRIS、氨基酸、寡肽)；和Alk＝烷基取代基。本发明的一个实施方案包含一种制备水溶性卟啉衍生物的方法，该方法包括以下步骤：生物原料的一步或两步直接酸性醇解，得到脱镁叶绿酸烷基酯的晶体；将得到的脱镁叶绿酸烷基酯转化为酸性卟啉；以及酸性卟啉与亲水性有机胺在选自水和含水有机溶液的介质中反应。本发明的另一个实施方案包含一种制备水溶性卟啉衍生物的方法，该方法包括以下步骤：使酸性卟啉与亲水性有机胺在选自水和含水有机溶液的介质中按任何已知方法反应。本发明的另一个实施方案还包括使用挥发性溶剂用反相色谱纯化水溶性卟啉衍生物的步骤。本发明的化合物可以在癌症、感染和其它需要光辐射治疗的疾病的光动力学治疗中用作光敏剂。

Description

用于光动力学治疗的水溶性卟啉衍生物、其用途和制备
相关情况的参考
本申请是发明人Nikolay E.Nifantiev在2001年6月1日提交的同时待审美国专利申请09/871,772的部分继续申请，该美国专利申请的发明名称是：“水溶性卟啉衍生物及其制备方法”，其内容在此引入作为参考。
发明领域
本发明涉及生物活性化合物化学，即涉及一种新的制备水溶性卟啉衍生物，特别是类型1和2的二氢卟酚、菌绿素、脱镁叶绿酸和细菌脱镁叶绿酸的衍生物的制备方法。本发明的化合物可以在癌症、感染及其它疾病的光动力学治疗中，以及在其它情况下的光辐射疗法中用作光敏剂。
Figure C02811141D00061
其中B是具有下面结构的环：
Figure C02811141D00071
或
Figure C02811141D00072
或
Figure C02811141D00073
或或
其中：
R1＝-CH＝CH2、-CH(OAlk)CH3、-CHO、-C(O)CH3、-CH2CH3、
-CH(Alk)CH(COAlk)2、-CH2CH(COAlk)2、-CH(Alk)CH2COAlk、
-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3和-CH2CH2CH(OH)CH3；
R2＝-CH3、-CHO、-CH(OH)Alk、-CH＝CHAlk、CH2OH和CH2OAlk；
R3＝-OH、-OAlk、-NH-Alk、NH-X-COO-(HG)+、-NH-Y-NR8R9和-NH-Y-OH；
R4＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和NH-X-COO-(HG)+；
R5＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和-NH-X-COO-(HG)+；
R6＝H和-COOAlk；
R7＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和-NH-X-COO-(HG)+；
R8＝H和Alk
R9＝H和Alk
其中：
-NH-X-COO-＝有机氨基酸的残基；
X＝亚烷基、肽、寡肽和-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；
Y＝亚烷基和-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；
G＝亲水性有机胺(例如，N-甲基-D-葡糖胺以及其它含氨基的碳水化合物衍生物、TRIS、氨基酸、寡肽)；和
Alk＝烷基取代基。
发明背景
在各种医学应用中，光动力学治疗(PDT)是一种最有前途的新技术(Photodynamic therapy，basic principles and clinical applications，编辑B.W.Henderson，Th.J.Dougherty，Marcel Dekker，1992，New York}，并且光动力学治疗特别是公认的治疗肿瘤的方法(Photodynamic tumortherapy.2nd and 3rd generation photosensitizers，J.G.Moser编辑，HarwoodAcademic Publishers，1998，Amsterdam)。在PDT中，卟啉是广泛使用的化合物。但是在卟啉的药物应用中，一个主要的问题是它们在生理溶液中的溶解度很低。这使得它几乎不可能制备用于PDT及其它应用的有效的药物级的可注射溶液。
制备用于PDT的水溶性卟啉衍生物的方法是本领域已知的。Smith等的USP 5,330,741公开了一种制备赖氨酰-二氢卟酚P6三钠的方法，该方法包括：在吡啶存在下，由脱镁叶绿酸甲酯a转变得到的红紫素18甲酯和含水赖氨酸在二氯甲烷中反应。混合物在室温下搅拌反应12小时，接着高真空下除去溶剂。这样制得的粗产物用反相高压液相色谱法进行提纯，随后冷冻干燥。为了制备用于癌症PDT的可注射溶液，首先将其溶于磷酸盐缓冲液中，然后加入0.1N的氢氧化钠，用0.1N的HCl将溶液的pH值调节到7.35，接着通过微孔过滤器进行灭菌过滤。
上述方法的缺点包括缺少重现性、后处理困难以及使用有毒试剂，这使得其几乎不适合于制备药物。另外，在4℃下并且在黑暗中，制得的水溶性目标产物在水溶液中仅稳定存在24小时；在4℃以及在黑暗中，固态形式的水溶性目标产物仅稳定存在4个月[M.W.Leach，R.J.Higgins，J.E.Boggan，S.-J.Lee，S.Autry，K.M.Smith，Effectivenessof a Lysylchlorin P6/Chlorin P6 mixture in Photodynamic Therapy of theSubcutaneous 9L Glioma in the Rat，Cancer Res.，1992，52，1235-1239；USP 5,330,741}。
Nakazato在USP 5,378,835中描述了水溶性脱镁叶酸a(3)钠盐的制备方法。根据该发明，将脱镁叶绿酸a(4)溶于乙醚中，然后向其中非常缓慢地滴加碱在正丙醇、异丙醇或者它们的混合物中的非常稀的溶液。保持反应，直至完全析出脱镁叶绿酸a盐沉淀，离心分离并在真空中干燥。然后将产物溶于水中，得到浓度为0.5％、pH为9.2-9.5的溶液，然后用pH为7.4-7.8的磷酸盐缓冲剂稀释该溶液。
Nakazato描述的方法的缺点是：通过该技术不能得到浓的(>1％)可注射的脱镁叶绿酸a的水溶液。另外，该发明的作者证明了这样的盐在干燥储存时的化学不稳定性，并且它们在干燥状态下储存后，不能在水中完全溶解。
与本发明方法最相似的方法公开在G.V.Ponomarev等的俄罗斯专利RU2144538中，通过多级简单序列化学反应，用空间大的有机胺包括N-甲基-D-葡糖胺制备二氢卟酚e6(7)的水溶性络合物，该方法包括从盘状螺旋蓝细菌(Spirulina Platensis)的蓝细菌(cyanobacteria)叶绿素A，然后按照标准方法将其进一步转化为二氢卟酚e6[S.，P.H.Hynninen，An improved method for the preparation of(10R)-and(10S)-pheophytins a and b，Synthesis，1983，705-708；P.H.Hynninen，S.，Preparation of phorbin derivatives from chlorophyll mixtureutilizing the principle of selective hydrolysis，Synthesis，1980，539-541；S.，P.H.Hynninen，A convenient method for the preparation of wetchlorin e6 and rhodin g7 trimethyl esters，Synthesis，1980，541-543]，通过逐步加入水至它的丙酮溶液中，析出二氢卟酚e6沉淀，接着离心分离沉淀，用3倍的水洗涤沉淀，然后用2g-eq.空间大的有机胺水溶液处理湿的二氢卟酚e6，得到总收率超过50％的产物。
该方法的主要缺点使得很难合成水溶性二氢卟酚、特别很难在工业上合成水溶性二氢卟酚以及难以进行药物制备，该方法的主要缺点如下：
1.作为中间产物的二氢卟酚e6是湿块，未知其确定的含量，所得到的二氢卟酚e6含量上的不稳定性造成了下一步所得溶液的标准化能力的不确定性。
2.在合成工序中的关键中间体是脱镁叶绿酸a(4)，由于它的酸性，其很难提纯并且难以标准化，通过重复沉淀方法(如用Ponomarev的方法)分离得到的脱镁叶绿酸a(4)是不定量的，因此不利于大规模制备。
3.通过指出的方法得到的脱镁叶绿酸a(4)包含难以分离的杂质。该缺点引起脱镁叶绿酸a(4)定量上的不确定，并且在脱镁叶绿酸a(4)转变为二氢卟酚的过程中扰乱了环戊酮环的化学开环。
4.应该注意到，按照Ponomarev制得的二氢卟酚e6水溶性盐的样品包含各种非卟啉型和卟啉型杂质，用其中描述的方法并不能将这些杂质与目标产物二氢卟酚e6分离。具体地说，通过TLC和HPLC方法，人们应该注意到卟啉的杂质是脱镁叶绿酸a(4)、红紫素18(8)、二氢卟酚p6(9)以及其它一些附随物。
人们认为，与它们各自的二氢卟酚e6盐相比，上述发明的类型(4)、(8)和(9)的化合物与亲水性胺形成的盐的特征是水溶性显著降低。然而类型(4)、(8)和(9)的化合物与上述发明的亲水性胺形成的盐却大大提高了水溶性，这可能是因为与二氢卟酚e6盐形成了络合物，这种现象使得不可能通过利用它们的不同的水溶性从杂质，例如类型(4)、(8)和(9)的化合物中分离二氢卟酚e6产物。
5.被Ponomarev用于制备水溶性二氢卟酚的有机胺在实际应用中不是最佳的，特别是D-葡糖胺，其与具有较高溶解度的二氢卟酚形成络合物，由于其醛基可能氧化，因此是不够稳定的。同时，D-葡糖胺在溶液中可以以各种异构体形式存在，这引起结构上的不确定性，很难进行各自详细的结构表征，不能满足药物制备上质量控制的需要。另一个Ponomarev使用的空间大的胺，即N-甲基-D-葡糖胺，其与上述的D-葡糖胺具有相同的缺点，而且由于它很难制备，因此不容易得到。
6.Ponomarev认为二氢卟酚e6衍生物与空间大的有机胺形成的水溶性盐是很不确定的，因为通常的空间大的有机胺，例如包含叔丁基、新戊基、金刚烷基、环己基基团的那些胺，由于空间大的有机部分的高疏水性，不能用于制备水溶性二氢卟酚e6盐。
由于上述提及的这方面以及其它方面的缺点，使得Ponomarev要求保护的方法不可能用于制备GMP标准的有效药物级组合物。
用于合成本发明化合物的初始卟啉衍生物通常从纯的和标准的粗卟啉材料脱镁叶绿酸a甲酯(5)或脱镁叶绿酸a乙酯(6)中获得。目前已知的用于从生物原料中分离卟啉的一般方法为：用有机溶剂繁重的洗涤和/或冷冻步骤以破坏生物材料的细胞壁，以及重复萃取并且化学处理生物质，首先转化为叶绿素，然后其变为脱镁叶绿素以及随后水解得到脱镁叶绿酸(K.M.Smith，D.A.Goff和D.J.Simpson，J.Amer.Chem.Soc.，1985，107，4946-4954；R.K.Pandey，D.A.Bellnier，K.M.Smith和T.J.Dougherty，Photochem.Photobiol.，1991，53，65-72}。
因此，需要提供一种容易的并且有效的方法，用于制备纯的和在化学上稳定的水溶性药物级卟啉衍生物，该水溶性药物级卟啉衍生物具有标准含量的所需物质并且适用于医学应用，特别是光动力学治疗应用。本发明实现了这种需要并进一步提供了其它相关的优点。
发明目的和概述
本发明的一个目的是提供化学上稳定的并具有标准含量的所要物质的水溶性卟啉衍生物，其适用于各种医学应用，特别是PDT应用。
本发明另一个目的是提供药物级高纯度的水溶性卟啉衍生物，其在药物组合物中是有效的。
本发明另一个目的是提供一种制备化学上稳定的水溶性卟啉衍生物的方法。
本发明还有一个目的是提供一种容易的并且节省时间的从生物原料制备化学上稳定的水溶性卟啉衍生物的方法，该方法其避免了现有技术中存在的缺点。
本发明还有一个目的是提供在药学上可接受的制剂中化学稳定的水溶性卟啉衍生物，其用于医学应用，例如用于治疗癌症及其它过度增生性疾病、感染等等。
本发明的一个实施方案是一种制备水溶性卟啉衍生物的方法，其包括：一步或两步的生物原料的直接酸性醇解，制备脱镁叶绿酸烷基酯的晶体，然后将得到的脱镁叶绿酸烷基酯转变为酸性卟啉，接着酸性卟啉在水中或在一种含水有机溶液中与亲水性有机胺反应。
本发明的另一实施方案是一种制备水溶性卟啉衍生物的方法，其包括酸性卟啉在水中或在含水有机溶液中与亲水性有机胺反应。
本发明的另一实施方案是制备水溶性卟啉衍生物的方法，该方法包括下述多个步骤：一步或两步的生物原料的直接酸性醇解，制备脱镁叶绿酸烷基酯的晶体，将得到的脱镁叶绿酸烷基酯转变为酸性卟啉，然后使所述酸性卟啉在水中或在含水有机溶液中与亲水性有机胺反应，并通过反相色谱法使用挥发性溶剂提纯所得的水溶性卟啉衍生物。
在另一实施方案中，本发明提供一种制备水溶性卟啉衍生物的方法，该方法包括使酸性卟啉在水中或在含水有机溶液中与亲水性有机胺反应，并通过反相色谱法使用挥发性溶剂提纯水溶性卟啉衍生物。
此外，本发明还提供通过本发明方法得到的式(1)和(2)的水溶性卟啉衍生物，其用于光动力学治疗和其它医学应用中的药物组合物。
附图的简要说明
图1：测定用二氢卟酚e6(7)与N-甲基—D-葡糖胺(10)制得的本发明(实施例9)水溶性盐(A)和根据Ponomarev(RU2144538)制得的水溶性盐(B)的暗毒性(dark toxicity)(细胞毒性，实施例14)；测试在OV2774细胞中进行，加入不同浓度的如下指出的光敏剂。
图2：测定用二氢卟酚e6(7)与N-甲基—D-葡糖胺(10)制得的本发明(实施例9)水溶性盐(A)和根据Ponomarev(RU2144538)制得的水溶性盐(B)的光毒性(phototoxicity)(实施例15)的测定；测试在OV2774细胞中进行，加入不同浓度的如下指出的光敏剂并且在670nm处辐射。
优选实施方案的详细说明
在描述本发明之前，规定用于本发明公开中使用的某些术语的定义是有帮助的。
卟啉是大环化合物，分别具有一个碳原子或一个氮原子的桥，连接多个吡咯以形成特征性的四吡咯环状结构。有许多不同类型的卟啉衍生物，包括那些含二氢吡咯单元的卟啉衍生物。在此使用的术语卟啉是指适用于PDT和药物制剂的卟啉、酞菁、二氢卟酚、脱镁叶绿酸、其金属衍生物以及其它拟卟啉化合物。
在此使用的生物原料是用于制备本发明化合物的原料，例如包括植物、藻类、血液组分和昆虫分泌物。
本发明的目的通过下面描述的方法得以实现，该方法包括：酸性卟啉在水中或在含水有机溶液中与亲水性有机胺反应，亲水性有机胺优选为N-甲基-D-葡糖胺(10)，其是一种多羟基化的稳定并且是无毒的用于制备药物的化合物，或者与氨基烷基和氨基芳基苷，例如麦芽糖衍生物(11)和(12)，或者与碳水化合物衍生物相连的其它氨基基团反应。其它可行的试剂包括但不限于，三(羟甲基)氨基甲烷(亦称为TRIS)(13)，它也是一种稳定的和无毒的用于制备药物的化合物，或者是TRIS衍生物例如化合物(14)和(15)，以及其它类型的亲水性胺例如双(2-羟乙基)胺(16)。根据本发明，氨基酸或寡肽例如赖氨酸低聚物，优选是五和六赖氨酸，也可以用作制备水溶性卟啉衍生物的亲水性有机胺。
Figure C02811141D00141
Figure C02811141D00151
根据本发明的一个优选实施方案，如实施例9中所述，在室温下以及惰性气氛下，在黑暗中进行化学纯的卟啉(如游离酸)和合适的亲水性有机胺的定量化学计量反应。所用的溶剂或者是用惰性气体(例如氩气、氦气、或其它气体)脱气的化学纯的水，或者如有必要，可以是水与合适的化学纯的并脱气的有机溶剂的混合物。有机溶剂随后在不加热的情况下在真空中蒸发(以避免初始卟啉的可能破坏)，并将产物冷冻干燥。在某些情况下，有必要加入有机溶剂以溶解初始卟啉，以便于卟啉(如游离酸)和合适的亲水性有机胺发生反应。可能的有机溶剂的例子是丙酮或二氯甲烷和甲醇的混合物。所得的冷冻干燥的水溶性卟啉是化学纯的，无需更进一步的提纯，灭菌后即可以用于医学或生物应用。
根据本发明的另一优选实施方案，可以使用的不纯成分包括初始卟啉的湿糊。除了用过量亲水性有机胺与所有卟啉组分反应外，反应类似于如上所述的方法进行。反应混合物在真空中浓缩后，所得水溶性卟啉用具有合适的反相吸附剂的柱子，优选是RP C-8或C-18型柱，进行色谱提纯。收集含目标产物的馏分，不加热下在真空中蒸发以除去有机溶剂，然后冷冻干燥，得到所要的水溶性卟啉衍生物。通过反相色谱法使用挥发性溶剂提纯水溶性卟啉衍生物，得到标准的高质量产物，这对于制备医用制剂是重要的。
本发明又一个实施方案是一种容易的并且有效的从生物原料中得到卟啉化合物的方法。该方法包括：对生物原料进行一步或两步的直接酸性醇解，优选甲醇醇解或乙醇醇解，得到关键中间体脱镁叶绿酸烷基酯(优选甲基酯和乙基酯)的晶体，然后将该关键中间体进一步进行多种化学转化以得到目标卟啉衍生物。这种方法可以从生物原料中简单并且相对快速的制备卟啉衍生物，而无需通过用有机溶剂对初始生物材料进行繁重的洗涤或冷冻(以破坏细胞壁)以及前述已知方法中需要的重复萃取。
使用脱镁叶绿酸烷基酯的晶体(优选甲基酯和乙基酯)作为合成的中间产物，使得简单的提纯和标准化成为可能，这对制备医疗方法如PDT中使用的药物制剂中是关键的。
醇解的性能取决于初始生物原料的质量，特别是它的干燥程度，在醇解期间，保持必要的酸浓度是很重要的。因此，在充分干燥的材料中，例如干燥的螺旋兰细菌属(Spirulina)或小球藻属(Chlorella)生物质或粉末状干燥荨麻叶(参见实施例1-5)有可能进行直接的一步醇解以制备脱镁叶绿酸烷基酯。
在不充分干燥的原料中，通过两步醇解以制备脱镁叶绿酸烷基酯，例如从菠菜(参见实施例6)中制备脱镁叶绿酸a(5)和b(17)甲基酯。在该情况中，在初始原料中存在的大量水阻止了形成适合于裂解植醇酯的合适的酸浓度。然而，在第一步醇解之后得到的脱镁叶绿素是足够干燥的，可以在第二步醇解中用于制备脱镁叶绿酸烷基酯的晶体。
根据本发明描述的方法，通过卟啉原料的化学转化，例如由生物原料得到的脱镁叶绿酸烷基酯晶体制备酸性卟啉，该酸性卟啉适用于进一步转变为水溶性的形式。
Figure C02811141D00171
具体地，2-脱乙烯基-2-(1-烷氧基乙基)-二氢卟酚e6例如乙氧基衍生物(19)可以通过脱镁叶绿酸a的甲酯或乙酯用HBr在乙酸中的饱和溶液进行溴氢化作用得到，各自生成2-脱乙烯基-2-(1-溴甲基)-脱镁叶绿酸a，进一步醇解得到2-脱乙烯基-2-(1-烷氧基乙基)-脱镁叶绿酸a(例如化合物18)(C.Rimington，A.Roennestad，A.Western，和J.Moan，Int.J.Biochem.，1988，20，1139-1149；K.R.Adams，C.R.Berembaum，R.Bonnett，A.N.Nizhnik，A.Salgado，和M.A.Valles，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1，1992，1465-1470)，并且随后进行皂化反应，分别形成三酸化合物2-脱乙烯基-2-(1-烷氧基乙基)-二氢卟酚e6(19)或者例如与N-甲基-D-葡糖胺(10)形成水溶性盐(实施例10)。
根据本发明，其它类型的亲核试剂与2-脱乙烯基-2-(1-溴甲基)-脱镁叶绿酸可以按类似方式进行反应，而不是它们的醇解，形成各种可能的卟啉衍生物，用于制备它们的水溶性形式。
此外，本发明用于制备不同的二氢卟酚和脱镁叶绿酸衍生物的水溶性形式的方法可以通过实施例15-30(下面提供)进行说明，以制备酸(4)和(20)-(33)与胺(10)的水溶性盐。
Figure C02811141D00181
根据本发明，酸性卟啉衍生物与亲水性胺的反应形成水溶性盐。具体地，在脱镁叶绿酸衍生物的情况中生成的是单盐，而二盐则是由三酸二氢卟酚(34)形成[通过形成一种可能的单盐中间体，例如中间体(35)，如反应流程1中所示]，因为6位的羧基(原子编号如化合物4-6所示)没有显现出足够的用于形成盐的酸性。
反应流程1.
Figure C02811141D00192
G-亲水性胺
因为本发明的水溶性卟啉盐在溶于水的同时可以进行水解(例如反应流程2中的二氢卟酚)，所以需要在过量亲水性胺存在下制备本发明的水溶盐并将它们在溶解状态下储存。
本发明的水溶性二氢卟酚二盐可以通过如实施例9B中描述的柱色谱法提纯而以单个状态得到。将提纯过的二盐溶于水中进行可逆水解，得到单盐(例如，类型35，参见反应流程2)，该单盐与其二盐相比，甚至与在水中溶解度差的母体二氢卟酚(1)相比，水溶性可能降低。这种方法可导致在溶液储存期间形式少量的沉淀。
反应流程2.
Figure C02811141D00201
G-亲水性胺
为了避免这种不理想的方法并使溶液保持澄清和均相，在医学应用中例如PDT中使用这些溶液时是有严格要求的，优选在少量和已知量的亲水性胺(例如小于2摩尔当量，更优选在0.05-0.5当量之间)存在下将二盐溶于水中，以使所要的卟啉衍生物保持二盐的形式，从而避免了由于二盐的水解而形成单盐和母体二氢卟酚。
本文公开的二氢卟酚和脱镁叶绿酸衍生物与亲水性胺形成的盐具有0.1mg/L数量级的水溶性，这使得它们能够在各种应用中使用。本发明的另一个目的是制备带有通过肽键连接的氨基酸单元的脱镁叶绿酸衍生物，以便与亲水胺形成盐，所述盐的特征在于与没有氨基酸片段的母体脱镁叶绿酸化合物相比，其水溶性高出100以上。
具体地，脱镁叶绿酸衍生物(36)与N-甲基-D-葡糖胺(10)形成的盐的溶解度为40mg/L，而带有连接氨基酸残基的肽键的衍生物(7，20-33)的溶解度大于5g/L。
Figure C02811141D00211
本发明的另一个目的是将化学稳定的并且是水溶性的式(1)和(2)的卟啉衍生物用于各种医学应用。所述化合物特别优选用于PDT以治疗癌症和其它过度增生性疾病、感染、牛皮癣、动脉粥样硬化、AMD以及其它适于用光动力治疗的疾病和感染。由于其水溶性，所述化合物可以制成各种药学上可接受的并且是活性的制剂，以用于不同的给药方法，例如注射。
本发明还提供了根据本发明制得的高纯度水溶性卟啉衍生物在癌症和其它过度增生性疾病以及感染的光动力学治疗中的应用。PDT通过如下方法实现：首先将所述的衍生物与药学上可接受的应用赋形剂混合，然后将衍生物输送到特定的治疗部位。在一个实施方案中，对于疾病例如皮肤癌或其它皮肤病，应用的赋形剂通常是皮肤用的乳膏、凝胶或者有时是气雾剂的液体分散剂。将赋形剂中的衍生物给予治疗区域之后，使药物在治疗区域停留足够的时间，优选在患病组织中积累卟啉衍生物。最后，将治疗区域在合适波长和足够能量的光下进行辐射，以激活卟啉衍生物，从而使其杀死所述患病组织的细胞。
本发明的卟啉衍生物之一，即由二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)根据实施例9B中的方法制得的水溶性盐在细胞培养实验中测定的暗毒性(实施例31，图1)和光毒性(实施例32，图2)的结果表明，本发明化合物用于PDT时表现出极好的性能。而用根据Ponomarev技术(RU2144538)制得的相同化合物进行同样的实验，该化合物却表现出差的特性(高的暗毒性和低的光毒性)。
然而，在特定情况下，如果不同卟啉衍生物的亲水性胺盐的特定混合物对患病组织表现出较高的光毒性时，给予这些混合物可能是有利的。这种提高的光毒性可能是由于在二氢卟酚e6的相同盐存在下，化合物(4)、(7)和(8)与亲水性胺形成的盐的混合物的水溶性提高，这种现象是可以观察到的。
本发明其它实施例的水溶性形式的良好光毒性提供在表1和2中，酸(4)、(7)、(22)和(25)与N-甲基-D-葡糖胺(10)形成的水溶盐在HeLa细胞中的暗毒性和光毒性实验结果总结在表1和2中。
本发明的另一个目的是公开的二氢卟酚和脱镁叶绿酸衍生物的水溶性形式在抗微生物光动力疗法中的应用。这通过表3中的数据说明，表3总结了使用酸(4)、(7)、(22)和(25)与N-甲基-D-葡糖胺(10)形成的水溶性盐对一些微生物进行光动力疗法处理的结果。
实施例
下面的实施例为本领域普通技术人员提供全面和说明性的公开和描述，描述了如何制备本发明的水溶性卟啉衍生物，该水溶性卟啉衍生物用于制备药物组合物，这些实施例并不是用来限制本发明的范围。虽然在实验中尽量保证使用的数据(例如数量、温度等等)的准确性，但是也应该考虑到某些实验误差和偏差。
实施例1
从盘状螺旋蓝细菌(Spirulina platesis)中获得脱镁叶绿酸甲酯(5)
(A)将20g盘状螺旋蓝细菌、60mL甲醇和10mL浓硫酸的混合物在室温下搅拌3小时，接着用30mL甲醇稀释，然后用硅藻土(Celite)垫过滤。用甲醇(70mL)洗涤过滤漏斗中的物质，用己烷(2 x 30mL)萃取上述溶液，用氯仿(100mL)稀释，然后将其倒入饱和氯化钾水溶液(300mL)中。所得混合物用硅藻土垫过滤，水相用氯仿(2 x 50mL)萃取。用水洗涤合并的萃取液，用棉花过滤后浓缩。将残余物溶解在氯仿-己烷(1:1，30mL)的混合物中，用氧化铝垫过滤，首先用己烷(以除去非极性非-二氢卟酚组分)洗涤，接着用二氯甲烷(以得到脱镁叶绿酸甲酯)洗涤。将二氯甲烷溶液浓缩，残余物首先用二氯甲烷-甲醇(3mL+7mL)进行重结晶，然后用二氯甲烷-甲醇(1mL+10mL)进行重结晶，最后用甲醇(10mL)洗涤，得到113mg纯的脱镁叶绿酸甲酯a(5)。1H-NMR光谱：9.41，9.23，8.56(3H，全部s，meso-H)；7.88(1H，q，-CH＝CH2)，6.25-6.10(2H，CH＝CH 2)，6.28(1H，s，环戊酮-H)，4.50，4.25(2H，m，7-H，8-H)；3.55(2H，q，4-CH 2CH3)；3.93，3.70，3.63，3.39，3.15(15H，全部s，5x-CH3)；2.75-2.20(4H，m，-CH 2CH 2COOCH3)；1.85(3H，d，8-CH 3)；1.71(3H，m，4-CH2CH 3)；0.55和-1.68ppm(2H，2br s，2x-NH-)。经鉴定该产物与从Porphylin Products Inc.，USA得到的化合物相同。
(B)将10g盘状螺旋蓝细菌、30mL甲醇和5mL浓硫酸的混合物在室温(r.t.)下搅拌3小时，然后用冷水(70mL)稀释，用硅藻土垫过滤。用水将过滤漏斗中的物质洗至pH为7，乙醇(50mL)，己烷(4 x 30mL)，用丙酮(120mL)将所需的脱镁叶绿酸甲酯从过滤漏斗中的物质中移出。将上述溶液浓缩，并溶于氯仿中，用无水硫酸钠垫(无水)过滤，浓缩，残余物首先用二氯甲烷-甲醇(1.5mL+5mL)进行重结晶，然后用二氯甲烷-甲醇(1.5mL+10mL)进行第二次重结晶，最后用甲醇(15mL)洗涤，得到60mg纯的脱镁叶绿酸甲酯a(5)。
(C)在室温以及搅拌下将浓硫酸(250mL)加入到500g盘状螺旋蓝细菌在甲醇(1500mL)中的悬浮液中。形成的混合物在室温下保持3小时，然后倒入水(6L)中，用硅藻土垫(直径12cm，高度2cm；在过滤器Schott N3上)过滤。过滤器上的糊状物质用水(3 x 800mL)洗涤，直至pH为6，然后用乙醇(3 x 300mL)和石油醚(40-60℃，3 x 250mL)洗涤。接着用丙酮(总共1.2L)从垫上移出目标产物，浓缩，并将残余物溶于氯仿(200mL)中，用棉絮过滤，然后在真空中浓缩，残余物用二氯甲烷(40mL)和甲醇(200mL)的混合物结晶，得到2.45g脱镁叶绿酸甲酯a，约90％的纯度(TLC，95:5的氯仿/丙酮)。将后者溶于氯仿(20mL)中，并将其通过氧化铝垫(中性，Grade II；直径8cm，高度5cm)，用氯仿进行洗脱；浓缩并用二氯甲烷(50mL)和甲醇(250mL)的混合物进行重结晶，得到2.38g纯的(TLC对照)脱镁叶绿酸甲酯a(5)。其它数量的脱镁叶绿酸甲酯a(约10-15％)可以通过对两次结晶的母液进行常规后处理(色谱法和重结晶)得到。
实施例2
从盘状螺旋蓝细菌中得到脱镁叶绿酸乙酯a(6)
将20g盘状螺旋蓝细菌在60mL 96％的含水乙醇和10mL浓硫酸中进行乙醇解，随后按照实施例1A中描述的制备脱镁叶绿酸a甲酯(5)的方法进行后处理，只是在所有步骤中用乙醇代替甲醇，得到110mg脱镁叶绿酸乙酯a(6)的晶体。1H-NMR光谱：9.57，9.42，8.61(3H，全部s，meso-H)；7.99(1H，q，-CH＝CH2)，6.32，6.26(2H，dd，-CH＝CH 2)，6.27(1H，s，环戊酮-H)，4.51，4.28(2H，m，7-H，8-H)；4.07(2H，q，-COOCH 2CH3)；3.71(2H，q，4-CH 2CH3)；3.89，3.72，3.41，3.27(12H，全部s，4x-CH3)；2.69，2.47，2.37，2.22(4H，m，-CH 2CH 2COOCH2CH3)；1.83(3H，d，8-CH 3)；1.73(3H，t，4-CH2CH 3)；1.12(3H，t，-COOCH2CH 3)；0.57，-1.46ppm(2H，2br s，2x-NH-)。
实施例3
从最大螺旋蓝细菌(Spirulina maxima)中得到脱镁叶绿酸甲酯a(5)
用30mL甲醇和5mL浓硫酸处理10g最大螺旋蓝细菌，随后按照实施例1B所述制备脱镁叶绿酸甲酯a(5)的方法进行后处理，得到64mg脱镁叶绿酸a甲酯(5)。
实施例4
从小球藻中得到脱镁叶绿酸a甲酯(5)和b甲酯(17)
将10g干燥的小球藻生物质进行甲醇解，随后按照实施例3中描述的方法进行后处理，得到20:7的脱镁叶绿酸a甲酯和脱镁叶绿酸b甲酯的混合物(140mg)，由1H NMR光谱测得。用硅胶60(Fluka，70-230目)柱色谱进行分离，用15:30:1.5的氯仿-甲苯-丙酮作为洗脱液进行洗脱，得到单一的脱镁叶绿酸a甲酯(5)和脱镁叶绿酸b甲酯(17)。脱镁叶绿酸a甲酯(5)与上述描述的产物相同。脱镁叶绿酸b甲酯(17)的1H-NMR光谱数据：11.0(1H，s，CHO)，10.22，9.50，8.55(3H，全部s，meso-H)；7.98(1H，q，-CH＝CH2)，6.40-6.15(2H，-CH＝CH 2)，6.25(1H，s，环戊酮-H)，4.48，4.20(2H，m，7-H，8-H)；3.60(2H，q，4-CH 2CH3)；3.93，3.78，3.75，3.40(12H，全部s，4x-CH3)；2.75-2.20(4H，m，-CH 2CH 2COOCH3)；1.85(3H，d，8-CH 3)；1.71(3H，m，4-CH2CH 3)；0.48和-1.60ppm(2H，2br s，2x-NH-)。
实施例5
从粉末状干荨麻叶中得到脱镁叶绿酸a甲酯(5)和脱镁叶绿酸b甲酯(17)
将500g粉末状干荨麻叶进行甲醇解，随后按照实施例1C中描述的方法进行后处理，由1H NMR光谱测定得知，得到6.5:1的脱镁叶绿酸a甲酯(5)和脱镁叶绿酸b甲酯(17)的混合物(1.74g)。
实施例6
从冷冻菠菜叶中得到脱镁叶绿酸a甲酯(5)和脱镁叶绿酸b甲酯(17)
在室温和搅拌下，将浓硫酸(5mL)加入到100g冷冻菠菜叶和甲醇(100mL)的混合物中。形成的混合物在室温下保持16小时，用水(100mL)稀释，用硅藻土过滤。残余物用丙酮(3 x 50mL)洗涤，丙酮萃取物用二氯甲烷-水(1:1，100mL)稀释，分离有机相并浓缩，残余物在100mL含5％浓硫酸的甲醇中进行甲醇解，随后按照实施例1C中描述的方法进行后处理，由1H NMR光谱测定得知，得到2:1脱镁叶绿酸a甲酯(5)和脱镁叶绿酸b甲酯(17)的混合物(40mg)。
实施例7
2-脱乙烯基-2-(1-乙氧基乙基)-脱镁叶绿酸a甲酯(18)的制备
将脱镁叶绿酸a甲酯(5)(3.5g，5.8mmol)溶于溴化氢和乙酸(密度1.44，50mL)的混合物中，并放置18小时。然后在真空中将混合物在50℃蒸发至干，搅拌下加入无水乙醇(100mL)。18小时后，搅拌下将反应混合物倒入碎冰中并用二氯甲烷(3 x 40mL)萃取。合并的萃取物用水(4 x 70mL)洗涤，并在真空中蒸发至干。残余物用硅胶(40-63μm，Merck)柱色谱进行分离，用二氯甲烷作为洗脱液进行洗脱，得到2.95g产物(18)，收率77％。1H-NMR光谱：9.82，9.58，8.55(3H，全部s，meso-H)；6.31(1H，s，10-H)，5.96(1H，q，2-CHCH3)；4.53，4.25(2H，m，7-H，8-H)；3.71(4H，dq，4-CH 2CH3，-OCH 2CH3)；3.93，3.87，3.63，3.41，3.28(15H，全部s，5x-CH3)；2.67，2.51，2.37，2.23(4H，m，-CH 2CH 2COOCH3)；2.11(3H，d，2-CHCH 3)；1.80(3H，d，8-CH 3)；1.75(3H，t，4-CH2CH 3)；1.36(3H，t，-OCH2CH 3)；0.55，-1.41(2H，2br s，2x-NH)。
实施例8
二氢卟酚e6(7)的制备
在氩气氛中，搅拌下将氢氧化钾水溶液(脱气，10％的溶液，10mL)加入到140mg(231μmol)脱镁叶绿酸a甲酯(35)在脱气(用氦气)丙酮(12mL)中的溶液。混合物在40℃下搅拌40分钟，加热至65℃，然后加入3％的氢氧化钾水溶液(由5mL脱气的10％的氢氧化钾水溶液和11mL脱气的水制备)。在氩气氛下以及65℃下，将所得混合物加热搅拌2.5小时，然后冷却至室温，用100mL水稀释，用2N HCl(12mL)酸化。离心分离沉淀物(3分钟，5000rpm)，然后用水(3 x 30mL)洗涤，再次离心分离，再次悬浮在10mL水中，冷冻干燥得到游离酸形式的粗二氢卟酚e6(120mg，87％，约90％的纯度，用TLC对照)。TLC：RP-18 TLC板(Merck)，甲醇-二氯甲烷(3:1)，Rf为0.6；污染物：Rf<0.3的极性更大的杂质。最后纯化：将20mg粗二氢卟酚e6溶于甲醇-二氯甲烷-水(3:1:1，4mL)中，然后在RP-8柱(Merck，#11447，240 x 10，40-63μm)上进行MPLC分离，用甲醇-二氯甲烷-水(4:3:1，2mL/min)进行洗脱，得到纯的二氢卟酚e6(7)(15mg，75％)。杂质用甲醇-二氯甲烷(3:1)洗出。1H-NMR光谱(DMSO-d6)：9.88，9.78，9.18(3H，全部s，meso-H)；8.33(1H，dd，-CH＝CH2)；6.47(1H，d，cis-CH＝CH 2)；6.22(1H，d，trans-CH＝CH 2)；5.38(2H，m，-CH 2COOH)；4.62(1H，m，-CHCH3)；4.48(1H，m，-CHCH2)；3.83(2H，m，-CH 2CH3)；3.59，3.53，3.33(9H，全部s，-CH 3)；2.62，2.27，2.14，(4H，m，-CH 2CH 2COOH)；1.70，1.66(6H，m，-CHCH 3+-CH2CH 3)；1.64，-1.90(2H，2 br s具有不同的强度，2x-NH-)。13C-NMR光谱(DMSO-d6)特征信号仅为：174.15，173.46，172.34(COOH)；129.21(-CH＝CH2)；122.25(-CH＝CH2)；103.74(γ)；101.12(β)；98.09(α)；94.67(δ)；52.66(CHCH2)；48.19(CHCH3)；37.80(-CH2COOH)；30.82，29.50(-CHCH2 CH2COOH)；22.92(CHCH3)；18.91(CH2CH3)；17.58(CH2 CH3)；11.00，10.98(ArMe)。
实施例9
二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
(A)将N-甲基-D-葡糖胺(10)(4mg，21μmol)在水(4mL)中的溶液加入到5mg(8.4μmol)二氢卟酚e6(7)在甲醇-二氯甲烷(3:1，20mL)(或在丙酮中)中的溶液中。在真空中蒸发除去有机溶剂。所得水溶液用膜(20μm)过滤，冷冻干燥，定量得到水溶性盐(9mg，包括过量的N-甲基-D-葡糖胺)。
(B)将10％脱气的氢氧化钾水溶液(10mL)加入到50mg脱镁叶绿酸a甲酯(5)在脱气丙酮(12mL)中的溶液。在惰性气体(氩气)气氛中，将混合物在40℃搅拌30分钟，接着加入15mL 3％的脱气的氢氧化钾水溶液。所得混合物在惰性气体(氩气)气氛下于65℃搅拌2小时，然后用水(100mL)稀释，加入2N HCl水溶液(直至pH为6)，析出二氢卟酚e6(7)。离心分离沉淀物(3000rpm，5分钟)，然后沉淀物用水(3 x 10mL)进行洗涤。得到二氢卟酚e6的湿饼，可直接用于下一步反应，无需进一步纯化。在氩气氛下，将得到的全部二氢卟酚e6(7)样品与N-甲基-D-葡糖胺(10)(30mg，2eq.)和水(10mL)混合，得到约5％的水溶性盐的溶液。将所得混合物进行搅拌直至其完全溶解，蒸发至干，然后使用RP C-8柱进行HPLC分离，用水-甲醇进行梯度洗脱(从40％至80％)。收集含目标产物的混合物样品，将其冷冻干燥，得到约75-80％收率的水溶性二盐。它的结构通过1H NMR光谱确认。具体地，二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)部分的比例为1:2的水溶性二盐通过葡糖胺组分中N-Me基团的信号(在2.70ppm)和二氢卟酚单元的8-Me基团(在1.75ppm)信号的结合确认。
(C)在氩气氛及黑暗中，将50mg(84μmol)粉末状二氢卟酚e6(7)、40mg(0.21mmol)N-甲基-D-葡糖胺(10)和水(50mL，预先用惰性气体脱气)的混合物进行搅拌，直至完全溶解。用膜(20μm)将所得溶液过滤，冷冻干燥得到定量的水溶性盐(90mg，包括过量的N-甲基-D-葡糖胺)。
实施例10
2-脱乙烯基-2-(1-乙氧基乙基)-二氢卟酚e6(19)的制备
按照制备二氢卟酚e6(实施例8)的方法，将2-脱乙烯基-2-(1-乙氧基乙基)-脱镁叶绿酸a甲酯(18)(2.8g，4.1mmol)进行皂化，柱色谱分离后，得到2.1g产物(19)，收率79％。1H-NMR光谱(DMSO-d6)：9.88，9.78，9.18(3H，全部s，meso-H)；6.47(1H，d，cis-CH＝CH 2)；6.22(1H，d，trans-CH＝CH 2)；5.5.1(2H，m，-OCH 2CH3)；5.38(2H，m，-CH 2COOH)；4.62(1H，m，-CHCH3)；4.48(1H，m，-CHCH2)；4.29(1H，q，-CHCH3)；3.83(2H，m，-CH 2CH3)；3.59，3.53，3.33(9H，全部s，-CH 3)；2.62，2.27，2.14(4H，m，-CH 2CH 2COOH)；1.83(1H，d，-CH(O-)CH 3)；1.70，1.66(6H，m，-CHCH 3+-CH2CH 3)；1.54(3H，t，-OCH2CH 3)；-1.90(2H，2 br s具有不同的强度，2x-NH-)。13C-NMR光谱(DMSO-d6)特征峰仅为：174.15，173.46，172.34(COOH)；129.21(-CH＝CH2)；103.74(γ)；101.12(β)；98.09(α)；94.67(δ)；67.97(-CH(O-)CH3)；63.49(-OCH2CH3)；52.66(CHCH2)；48.19(CHCH3)；37.80(CH2COOH)；30.82，29.50(-CHCH2 CH2COOH)；22.92(CHCH3)；20.20(-CH(O-)CH3)；18.91(CH2CH3)；17.58，15.23(CH2 CH3+-OCH2 CH3)；11.00，10.98(ArMe).
实施例11
二氢卟酚e6衍生物(19)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
按照实施例9C中描述的方法，将30mg 2-脱乙烯基-2-(1-乙氧基乙基)-二氢卟酚e6(19)与20mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，冷冻干燥，定量得到50mg水溶性盐。
实施例12
双[2-(β-麦芽糖氧基)乙基]胺(11)的制备
在-20℃下，搅拌下，将过-O-乙酰基-麦芽糖基溴化物(500mg，0.7mmol)、N-苄氧基羰基-N，N-双(2-羟乙基)胺(56mg，0.233mmol)和2，4，6-三甲基吡啶(80μl，0.605mmol)的溶液滴加到三氟甲磺酸银(208mg，0.805mmol)和1.5mL无水二氯甲烷的混合物中。将混合物温热至室温，然后用0.5mL三乙胺处理，用200mL二氯甲烷稀释，用饱和Na2S2O3水溶液(50mL)和水(50mL)洗涤，浓缩，使用乙酸乙酯-石油醚(1:1)进行快速色谱纯化，得到粗的N-苄氧基羰基-N，N-双[2-(七-O-乙酰基-β-麦芽糖氧基)乙基]胺(57mg)。选择结构的特定13C NMR数据(500MHz，CDCl3)：20.41(CH3CO)；46.92.47.24，48.00和48.02(OCH2CH2N和OCH2 CH2N)；61.30，61.5061.98，和62.52(葡萄糖部分的C-6)；67.18(NCOOCH2C6H5)；67.81，68.33，69.14，69.84，72.02，72.55，75.10(C-2-C-5，葡萄糖部分)；95.38(C-1，α-葡萄糖部分)；100.18和101.10(C-1，β-葡萄糖部分)；127.73，128.01和128.40(OCH2 C 6H5)；164.00(NCOO)；169.24，169.42，169.76，169.98，170.35(CH3 CO)。[α]D38.9°(cl，乙酸乙酯)。将得到的产物溶解在0.1M甲醇钠的无水甲醇溶液中，并放置2小时，然后用离子交换树脂KU-2(H+)中和并过滤。滤液在Pd/C催化剂下氢化反应过夜，过滤，冷冻干燥得到23mg化合物(11)，[α]D7
Figure C02811141D0030165849QIETU
1，水)。选择结构的特定13C NMR数据(500 MHz，D2O)：48.74(OCH2 CH2N)，50.85(OCH2CH2N)；61.72(C-6，α-葡萄糖部分)，61.92(C-6，β-葡萄糖部分)，77.28(C-4，β-葡萄糖部分)；100.83(C-1，α-葡萄糖部分)；103.40(C-1，β-葡萄糖部分)。
实施例13
二氢卟酚e6(7)与双[2-(β-麦芽糖氧基)乙基]胺(11)的水溶性盐的制备
按照实施例9C描述的方法，使5mg二氢卟酚e6(7)与18.6mg胺(11)反应，几乎定量地得到23mg冷冻干燥的水溶性盐。
实施例14
制备中脱镁叶绿酸-a甲酯(37)
将脱镁叶绿酸-a甲酯(5)(130mg，0.2mmol)溶于5mL四氢呋喃，在室温和约1大气压的H2以及在30mg碳载的10％Pd(OH)2上氢化反应1小时。过滤除去催化剂，将溶液进行浓缩，得到纯的中(meso)脱镁叶绿酸-a甲酯(37)(125mg，定量)。
实施例15
制备中二氢卟酚-e6(20)
按照实施例9B中的方法将中脱镁叶绿酸-a甲酯(37)(20mg，0.033mmol)进行碱性水解，得到中二氢卟酚-e6(17mg，86％)。MS(-)(电雾化)：597.3(M-H)。
实施例16
中二氢卟酚e6(20)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
按照实施例9C中描述的方法，15mg中二氢卟酚e6(20)与12mgN-甲基-D-葡糖胺(10)反应，定量得到27mg冷冻干燥的水溶性盐。
实施例17
脱镁叶绿酸a(4)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
将脱镁叶绿酸a甲酯(5)(30mg，0.049mmol)溶于2mL 50％的硫酸，混合物在室温下搅拌2小时，用冰水稀释，然后用氯仿萃取。萃取物用水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗脱镁叶绿酸-a(4)。然后将后者溶于3mL N-甲基-D-葡糖胺(10)(11.6mg，1.2eq.)的水溶液中。用45μm过滤器过滤所得溶液，冷冻干燥后得到29mg冷冻干燥的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸4组分)：591.2(M-H)。
实施例18
二氢卟酚e6二甲酯(21)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
二氢卟酚-e6三甲酯(38)[根据
Figure C02811141D0032165943QIETU
 S.，Hynninen P.H.，Synthesis，1980，541-543制备](25mg，0.039mmol)用50％硫酸进行酸性水解，然后按照实施例17中描述的方法与9mg N-甲基-D-葡糖胺(10)进行反应，冷冻干燥后得到32mg的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸21组分)：623.5(M-H)。
实施例19
中(meso)焦(pyro)脱镁叶绿酸a衍生物(25)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
将脱镁叶绿酸-a甲酯(5)(1.3g，2.09mmol)溶于100mL吡啶，在氮气氛及黑暗中，搅拌回流反应8小时。蒸发除去吡啶，残余物用二氯甲烷/甲醇进行重结晶，得到1.08g(92％)的焦(pyro)脱镁叶绿酸-a甲酯(39)。UV/vis λ max(ε)(CH2Cl2)：410(112500)，509(11400)，537(9800)，611(8500)，669(47000)nm。
焦脱镁叶绿酸a甲酯(39)(1.0g，1.78mmol)溶于100mL丙酮，在室温和约8-10大气压的H2中，在300mg10％的碳载Pd催化剂中进行氢化反应2小时。过滤除去催化剂，浓缩溶液得到纯的中焦脱镁叶绿酸-a甲酯(40)(1.0g，定量的)。UV/vis λmax(ε)(CH2Cl2)：408(136000)，501(12400)，534(11800)，603(10500)，656(54600)nm；1H-NMR(200MHz，CDCl3)：9.40(s，1H，(β-meso H)，9.16(s，1H，α-meso H)，8.46(s，1H，δ-meso H)，5.26和5.08(AB，J＝19.7Hz，10-CH2)，4.46(dq，1H，J7，8＝2.0Hz，8-H)，4.27(dt，1H，7-H)，3.80和3.64(每个q，4H，J＝7.5Hz，2a-和4a-CH2)，3.63，3.52，3.28和3.21(每个s，12H，1-、3-、5-Me和COOMe)，2.80-2.20(m，4H，7a，b-CH2CH2)，1.80(d，3H，J＝7.3Hz，8-Me)，1.71和1.63(每个t，6H，J＝7.5Hz，2b-和4b-Me)，0.60和-1.60(每个br s，2H，NH)。
将中焦脱镁叶绿酸a甲酯(40)(250mg，0.443mmol)溶于5mL50％的硫酸，混合物在室温下搅拌反应2小时，用冰水稀释，并用氯仿萃取。萃取物用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗中焦脱镁叶绿酸a(36)。然后将后者溶于20mL二氯甲烷中，然后向其中加入0.3mL(2.22mmol，约5eq.)的三乙胺，接着加入0.1mL(0.576mmol，1.3eq.)的三氟乙酸五氟苯基酯。混合物在室温下搅拌反应20分钟(以制备化合物41)，向其中加入0.5mL水，然后向其中加入化合物42(200mg，GlycoSense AG的产品，Jena，Germany)的5mL二氯甲烷溶液。混合物在室温下搅拌30分钟，用二氯甲烷稀释，然后用水和5％的硫酸洗涤，干燥，浓缩。残余物用硅胶快速色谱法进行纯化，使用丙酮-二氯甲烷(20:80)作为洗脱液进行洗脱，得到290mg(88％)胺43。UV/visλmax(ε)(CH2Cl2)：408(136500)，501(12300)，534(11800)，603(10000)，656(54500)nm；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：9.41(s，1H，β-meso H)，9.20(s，1H，α-meso H)，8.47(s，1H，δ-meso H)，6.08(br s，1H，CONH)，5.26和5.08(AB，J＝19.7Hz，10-CH2)，4.51(br q，1H，8-H)，4.32(br d，1H，7-H)，3.82和3.66(每个q，4H，J＝7.5Hz，2a-和4a-CH2)，3.78(s，2H，OCH 2COOMe)，3.63，3.32和3.21(每个s，9H，1-、3-和5-Me)，3.52(s，3H，COOMe)，3.28(brs，12H，NHCH 2CH 2OCH 2CH 2OCH 2CH 2O)，2.80-1.90(m，4H，7a，b-CH2CH2)，1.80(d，3H，J＝7.3Hz，8-Me)，1.72和1.68(每个t，6H，J＝7.5Hz，2b-和4b-Me)，0.70和-1.60(每个br s，2H，NH)。13C-NMR(75MHz，CDCl3)：196.3，172.4，172.3，160.2，155.2，150.3，149.0，145.0，142.3，141.6，137.3，136.9，135.6，131.3，130.1，127.8，105.9，104.1，95.8，92.5，70.5，70.2，69.9，69.6，68.2，51.6，50.1，48.0，39.1，39.0，32.6，30.2，23.1，19.5，19.4，17.5，17.0，12.0，11.3，11.0。
将胺43(195mg，0.263mmol)溶于4mL 50％的硫酸，混合物在室温下搅拌2小时，用冰冷的水稀释，离心分离所得沉淀物(5000rpm，3分钟)，然后沉淀物用水(2 x 50mL)洗至pH为7(形成25)，然后将其溶于丙酮(50mL)、甲醇(15mL)和水(6mL)的混合物中。然后向上述溶液中加入N-甲基-D-葡糖胺(10)(56mg，0.29mmol，1.1eq.)。在40℃下将所得溶液在真空(约20mmHg)中浓缩，除去有机溶剂。将浓缩后的残余物溶于40mL水中，用45μm过滤器过滤，冷冻干燥后得到239mg水溶性盐。UV/vis λmax(ε)(H2O)：375(46550)，514(5750)，548(5750)，608(6320)，660(21260)。MS(-)(电雾化)(酸25组分)：724.7(M-H)。
Figure C02811141D00341
实施例20
细菌脱镁叶绿酸衍生物(29)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
搅拌下，将0.5mL吡啶加入到中焦脱镁叶绿酸-a甲酯(40)(650mg，1.152mmol)的130mL二氯甲烷溶液中，接着向其中加入600mg(2.361mmol，2.05eq.)的四氧化锇。反应混合物在室温下搅拌48小时，然后向溶液中鼓入H2S气体5分钟以将锇酸盐转化为游离二醇(44)，混合物用硅胶柱进行分离，使用丙酮-氯仿(5:95)作为洗脱液进行洗脱，得到初始化合物40(190mg，29％)。用丙酮-氯仿(15:85)进行洗脱得到二醇(44)(350mg，51％)。后者在室温下用20mL浓硫酸处理30分钟。反应混合物用冰水稀释，接着用氯仿萃取。萃取物分别用碳酸氢钠水溶液和水洗涤，在无水硫酸钠中干燥，浓缩。残余物用硅胶柱色谱进行纯化，使用丙酮-氯仿(1:99)作为洗脱液进行洗脱，得到酮(45)(180mg，从化合物(40)开始计算的收率为27％)[参见R.K.Pandey等人，J Org.Chem.，1997，62，1463-1472]。将后者溶于5mL50％的硫酸中，然后将混合物在室温下搅拌2小时，用冰冷却的水稀释，用氯仿萃取。萃取物用水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗化合物46。将后者溶于20mL二氯甲烷中，接着加入0.2mL(1.58mmol，约5eq.)的三乙胺，然后加入70μL(0.411mmol，1.3eq.)的三氟乙酸五氟苯基酯。混合物在室温下搅拌20分钟(以得到47)，然后向其中加入0.5mL的水，接着加入化合物42(150mg，GlycoSense AG的产品，Jena，Germany)在5mL二氯甲烷中的溶液。混合物在室温下搅拌30分钟，用二氯甲烷稀释，用水和5％硫酸洗涤，干燥，浓缩。残余物用硅胶进行快速色谱纯化，使用丙酮-二氯甲烷(20:80)洗脱，得到205mg(85％)的酰胺(48)。UV/vis λmax(ε)(CH2Cl2)：394(42300)，412(44100)，506(7650)，539(9100)，597(4500)，652(15750)，712(30600)nm；1H-NMR(250MHz，CDCl3)：9.18，8.72，8.50(每个s，3H，meso H)，6.10(br s，1H，CONH)，5.20(m，2H，10-CH2)，4.50和4.30(两个都是m，2H，8-H和7-H)，3.88(s，2H，OCH 2COOMe)，3.58，3.41和3.21(每个s，9H，1-、3-和5-Me)，3.51(s，3H，COOMe)，3.30(brs，12H，NHCH 2CH 2OCH 2CH 2OCH 2CH 2O)，2.80-1.90(m，4H，7a，b-CH2CH2)，1.90-1.65(m，6H，2xCH2CH 3)，0.5(m，3H，CH2CH 3)，-0.10和-1.70(每个br s，2H，NH)。13C-NMR(75MHz，CDCl3)：201.4，199.2，172.3，171.7，153.3，141.0，137/2，98.2，95.0，91.3，89.7，87.1，79.4，70.7，70.4，70.1，69.8，68.4，53.4，51.8，49.9，48.0，39.3，36.2，32.9，32.1，30.5，28.5，25.9，23.2，19.3，16.9，11.9，11.0，9.0，8.1。
将所述酰胺衍生物(48)(205mg，0.270mmol)溶于4mL50％的硫酸中，混合物在室温下搅拌2小时，用冰冷却的水稀释。离心分离所得沉淀物(5000rpm，3分钟)，用水(2 x 50mL)洗涤至pH为7(以得到29)，并将其溶于丙酮(50mL)、甲醇(15mL)和水(6mL)的混合物中。将N-甲基-D-葡糖胺(10)(56mg，0.29mmol，1.1eq.)加入到该溶液中。所得溶液在40℃下真空(约20mmHg)浓缩以除去有机溶剂。将残余物溶于40mL水中，用45μm过滤器过滤，溶液在40℃下真空(约20mmHg)浓缩，并在40℃下真空(约1mmHg)干燥，得到240mg水溶性盐。UV/visλmax(ε)(H2O)：420(40400)，515(5380)，561(6150)，668(9610)，776(51200)。MS(-)(电雾化)(酸29组分)：740.7(M-H)。
实施例21
脱镁叶绿酸a衍生物(22)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化脱镁叶绿酸a(4)(17mg，0.028mmol)，接着在过量三乙胺存在下与化合物42(25mg，GlycoSense AG的产品，Jena，Germany)反应，然后用50％的硫酸进行酸性水解，并按照实施例19中描述的方法与6.5mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，冷冻干燥后得到23mg水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸22组分)：780.1(M-H)。
实施例22
焦脱镁叶绿酸a衍生物(23)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
用50％的硫酸对焦脱镁叶绿酸a甲酯(39)(15mg)进行酸性水解，接着用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化，然后在过量三乙胺存在下与化合物42(25mg，GlycoSense AG的产品，Jena，Germany)反应，然后用50％的硫酸进行酸性水解，按照实施例19中描述的方法与6mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，得到19mg冷冻干燥的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸23组分)：722.1(M-H)。
实施例23
中脱镁叶绿酸a衍生物(24)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
用50％的硫酸对中脱镁叶绿酸a甲酯(37)(16mg)进行酸性水解，接着用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化，然后在过量三乙胺存在下与化合物42(25mg，GlycoSense AG的产品，Jena，Germany)反应，然后用50％的硫酸进行酸性水解，按照实施例19中描述的方法与6mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，得到18mg冷冻干燥的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸24组分)：782.1(M-H)。
实施例24
中焦脱镁叶绿酸a衍生物(26)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
用三氟乙酸五氟苯基酯(20μL)活化中焦脱镁叶绿酸a(36)(20mg，0.034mmol)，接着在过量三乙胺存在下与化合物49(40mg，GlycoSenseAG的产品，Jena，Germany)反应，然后按照实施例19中描述的方法与7mg的N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，得到32mg冷冻干燥的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸26组分)：856.7(M-H)。
实施例25
中焦脱镁叶绿酸a衍生物(27)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化中焦脱镁叶绿酸a(36)(15mg，0.026mmol)，接着在过量三乙胺存在下与20mg甘氨酸甲酯反应，接着用50％的硫酸进行酸性水解，然后按照实施例19中描述的方法与5mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，得到19mg冷冻干燥的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸27组分)：592.6(M-H)。
实施例26
中焦脱镁叶绿酸a衍生物(28)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化中焦脱镁叶绿酸a(36)(14mg，0.024mmol)，接着在过量三乙胺存在下与25mg ε-氨基己酸甲酯反应，接着用50％的硫酸进行酸性水解，然后按照实施例19中描述的方法与5mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，得到20mg冷冻干燥的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸28组分)：648.5(M-H)。
实施例27
二氢卟酚-e6衍生物(30)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
将脱镁叶绿酸a甲酯(5)(38mg，0.063mmol)与N，N-二甲基-1，3-二氨基丙烷(100μL)在1，4-二噁烷(3mL)中的混合物在室温下保持10小时(以制备化合物50)。向该溶液中加入6M NaOH水溶液(0.1mL)，将所得混合物回流10分钟。然后加入5mL水，再回流10分钟。将混合物冷却，用30mL水稀释，用乙酸酸化至pH为4.5。离心分离形成的沉淀物(5000rpm，3分钟)，用水洗涤沉淀物，得到二酸衍生物(30)。将后者溶于7mL N-甲基-D-葡糖胺(10)(30mg，1.2eq.)水溶液中。用45μm过滤器过滤所得溶液，冷冻干燥后得到62mg水溶性盐。MS(+)(电雾化)(酸30组分)：681.3(M+H)。
实施例28
二氢卟酚e6衍生物(31)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
将脱镁叶绿酸a甲酯(5)(22mg，0.036mmol)与1，7-二氨基庚烷(100μL)反应，接着用NaOH水溶液进行碱性水解，然后按照实施例27中描述的方法与18mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，得到41mg冷冻干燥的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸31组分)：709.4(M+H)。
实施例29
二氢卟酚e6衍生物(32)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
将脱镁叶绿酸a(4)(20mg，0.033mmol)和ε-氨基己酸甲酯(50mg，约10eq.)在1，4-二噁烷(3mL)中的溶液在室温下保持120小时。混合物用二氯甲烷稀释，然后用0.5N HCl水溶液和水洗涤，干燥，浓缩，用硅胶快速色谱法进行纯化，使用3％的甲醇-二氯甲烷作为洗脱液进行洗脱，得到22mg(88％)的酰胺衍生物(51)。后者用50％硫酸进行酸性水解，然后按照实施例17中描述的方法与13.5mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，得到33mg冷冻干燥的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸32组分)：722.3(M-H)。
实施例30
二氢卟酚e6衍生物(33)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的制备
将脱镁叶绿酸a(4)(20mg，0.034mmol)和2-氨基乙醇(50μL)在1，4-二噁烷(3mL)中的溶液在室温下保持1小时。混合物用二氯甲烷稀释，用0.5N HCl水溶液和水洗涤，干燥，浓缩，用硅胶快速色谱法，使用3％的甲醇-二氯甲烷作为洗脱液进行纯化，得到20mg(91％)的酰胺衍生物(33)。然后按照实施例17中描述的方法与8mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反应，得到28mg冷冻干燥的水溶性盐。MS(-)(电雾化)(酸33组分)：652.2(M-H)。
实施例31
在OV2774细胞中，测定根据本发明制得的二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐与根据Ponomarev等(RU2144538)制得的二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的暗毒性(细胞毒性)
为了测定根据本发明实施例9B制得的二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐(化合物A)和根据Ponomarev等人的RU2144538制得的二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐(化合物B)的细胞毒性(暗毒性)，将OV2774细胞(接种密度：50-75细胞/mm2在RPMI-1640 w.P.(用酚红)中，5％胎牛血清，2mM Glutamax I，100μg/mL青霉素/链霉素)用逐渐增加至50μM的浓度培育24小时。在无敏化剂的介质中再经过24小时后，使用中性红分析法测定细胞的存活率。细胞存活率的数值以未培育的对照样品的百分比表示。对于每个培育浓度，三个独立实验都重复进行4次。实验数据列于图1中。化合物A与化合物B相比，其对OV2774细胞的毒性更低。培育浓度至25μM(化合物B：10μM)时，细胞存活率没有明显降低。在此范围内不能测定IC50值(培育浓度，与对照组相比，细胞生长降低50％)。最高测试培育浓度的细胞存活率大于80％。
实施例32
在OV2774细胞中，测定根据本发明制得的二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐与根据Ponomarev等(RU2144538)制得的二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的光毒性(细胞毒性)
为了测定根据本发明实施例9制得的二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐(化合物A)和根据Ponomarev等人的RU2144538制得的二氢卟酚e6(7)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐(化合物B)的光毒性，将OV2774细胞(接种密度：50-75细胞/mm2在RPMI-1640 w/oP.(用酚红)，5％胎牛血清，2mM Glutamax I，100μg/mL青霉素/链霉素)用前面实验中使用的的相同浓度化合物B(10μM，24h)培育。在无光敏剂和无酚红的介质中进行第二阶段的培育，然后用670nm的光(10-25mW/cm2，0.1-2.5J/cm2)进行照射，使用中性红分析法测定细胞的存活率。细胞存活率的数值以培育的、但未照射的对照组的百分比表示。五个独立实验都重复进行4次。样品的ID50值(能流(能量密度)，与对照组相比，细胞生长降低50％)用作光毒性的定量测定。实验数据列于图2中。实验结果表明，化合物A与化合物B相比，其对OV2774细胞的光毒性更高一些。化合物A的ID50值约为化合物B的ID50值的一半(0.1J/cm2对0.2J/cm2)。
实施例33
在HeLa细胞中，测定二氢卟酚(7)和脱镁叶绿酸[(4)、(22)和(25)]衍生物与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的暗毒性(细胞毒性)
为了测定根据实施例9、17、19和21制得的二氢卟酚e6(7)和脱镁叶绿酸a衍生物(4、22、25)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的暗毒性，在光敏剂浓度从2μg/mL增加至500μg/mL的同时，将HeLa(人类颈部癌细胞)细胞单层培养物在96孔板(接种密度：7000细胞/孔，具有10％胎牛血清的Dulbeco改性的必需培养基(Dulbeco-modifiedessentional medium)(DMEM))中培育48小时。
该细胞用纯的DMEM进行洗涤，然后在室温下用10％的福尔马林处理15分钟。用水洗涤细胞两次，细胞用0.1％的结晶紫(50μl/孔)溶液培育15分钟，然后用水洗涤，用乙醇(100μl/孔)处理。形成的乙醇溶液的光密度用Specord 100(Analytik Jena AG，Germany)分光光度计在594nm处测定，以检测细胞的存活率。
细胞存活率的数值以未培育的对照组的百分比表示。对于每个培育浓度，进行八个实验。实验数据列于表1中，表1中列出IC50和IC80值(培育浓度，与对照组相比，细胞生长降低达到50％和20％)。
表1.在HeLa细胞中，二氢卟酚(7)和脱镁叶绿酸[(4)、(22)和(25)]衍生物与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的暗毒性(细胞毒性)数据(实施例33)
 
母体酸组分 IC<sub>50</sub>(μg/mL) IC<sub>80</sub>(μg/mL)
(4) 20 100
(7) 150 200
(22) 300 400
(25) * *
*不能测定(>1000μg/mL)。
实施例34
在HeLa细胞中，测定在662nm的辐射下二氢卟酚(7)和脱镁叶绿酸[(4)、(22)和(25)]衍生物与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的细胞毒性
为了测定根据实施例9、17、19和21制得的二氢卟酚e6(7)和脱镁叶绿酸a衍生物(4、22、25)与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的细胞毒性，在光敏剂浓度从0.01μg/mL增加至40μg/mL的同时，将HeLa(人类颈部癌细胞)细胞单层培养物在96孔板(接种密度：30,000细胞/孔，在含10％胎牛血清的DMEM中)中培育。培育30分钟后，用662nm的光[Ceralas PDT激光器，BioLitec AG，德国；150mW/cm2，5-20J/cm2]照射。用MTT分析法测定细胞存活率。细胞存活率的值以辐射的、但未培育的对照组的百分比表示。实验重复进行8次。实验数据列于表2中，表2中列出在进行10J/cm2辐射后的IC50和IC90值。
表2.在HeLa细胞中，二氢卟酚(7)和脱镁叶绿酸[(4)、(22)和(25)]衍生物与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的细胞毒性数据(实施例34)
 
母体酸组分 IC<sub>50</sub>(μg/mL) IC<sub>90</sub>(μg/mL)
(4) 8.0 22.0
(7) 3.0 9.0
(22) 1.25 5.0
(25) 0.05 0.17
实施例37
在抗菌光动力治疗实验中，测定二氢卟酚(7)和脱镁叶绿酸[(4)、(22)和(25)]衍生物与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐的细胞毒性
使用的微生物是馆藏的和临床的菌株，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC25923)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(ATCC29212)和假丝酵母菌属种(Candida spp)(临床的)。
菌落在下面类型的固体介质上培养：金黄色葡萄球菌在葡萄球菌琼脂110上培养、粪肠球菌在带5％马血的Columbia琼脂上培养、假丝酵母菌属种在Saburo葡萄糖琼脂上培养。
根据McFarland标准制备等渗NaCl溶液中的最初细菌悬浮液(IBS)，该悬浮液的数值为0.5-1.0(在1mL悬浮液中有1.5-5 x 108个细菌细胞)，接着按1:100进行稀释。
为了正确控制细菌细胞数，IBS的一部分用等渗NaCl溶液稀释1:1000(直到为最初浓度的10-3)，取出3等分的0.1mL，每个接种在单独的含微生物合适的介质的培养皿中。菌落在37℃培育24小时(对于金黄色葡萄球菌，培育48小时)，然后对菌落进行计数，取3个培养皿的平均值用作对照值。
A).控制温度和激光辐射行为
将2.0mL最初细菌悬浮液(IBS)在37℃储存30分钟，然后用等渗NaCl溶液稀释1:1000(直到为最初浓度的10-3)，取出3个等分试样，每个0.1mL，将每个试样接种在单独的培养皿中，每个培养皿含有微生物合适的介质。将菌落在37℃培育24小时，然后对菌落进行计数，取3个培养皿的平均值用作对照值。
将IBS(2.0mL)的另一个样品在37℃储存30分钟，然后在40mm的培养皿(悬浮液层的厚度-2mm)中用输出功率为3W的“CeralasPDT”激光辐射210秒，以使输出光能的剂量是50J/cm2。混合物用等渗NaCl溶液稀释至1:1000(直到为最初浓度的10-3)，取3个等分试样，每个0.1mL，并将它们在单独的培养皿中培养，按上述方法计数。
表3中的数据[处理体系B和C表示(7)]表明：IBS在37℃下储存30分钟，在没有光敏剂和在剂量为50J/cm2的激光辐射下几乎没有影响细菌的成活力。
B).暗毒性测定
将0.5mL浓度为500μg/mL的光敏剂的储备溶液加入到2.0mLIBS中，使所得光敏剂的浓度为100μg/mL。将形成的悬浮液在37℃下储存30分钟，然后用等渗NaCl溶液稀释至1:1000(直到为最初浓度的10-3)，取3个等分试样，每个0.1mL，并将它们在单独的培养皿中培养，按上述方法计数。
表3中的数据表明：本发明的光敏剂在浓度为100μg/mL的情况下培育30分钟几乎没有暗毒性作用。
C).光毒性测定
将0.125或0.5mL浓度为500μg/mL的光敏剂的储备溶液加入到2.0mL IBS中，使所得光敏剂的浓度分别为25和100μg/mL。形成的悬浮液在37℃下储存30分钟，然后用强度为50J/cm2的激光进行辐射。取3个等分试样，每个0.1mL，并将它们在单独的培养皿中培养，剩余悬浮液部分用等渗NaCl溶液稀释至1:100或1:1000(直到为最初浓度的10-2或10-3)，取3个等分试样，每个0.1mL，并将它们在单独的培养皿中培养，按上述方法计数。
表3中的数据说明本发明的水溶性盐可以作为抗菌光动力疗法的光敏剂。
表3.二氢卟酚(7)和脱镁叶绿酸[(4)、(22)和(25)]衍生物与N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性盐在抗菌光动力治疗实验中的应用(实施例35)
*处理体系：
A，使用的最初细菌悬浮液(IBS)中对照组细菌数目；
B，IBS在37℃恒温储存30分钟后的细菌数目；
C，用剂量为50J/cm2的激光(Ceralas PDT，3W，210秒)辐射后的细菌数目；
D，用光敏剂(浓度100μg/mL)培育30分钟后的细菌数目；
E，用浓度为25μg/mL的光敏剂进行光动力学处理后的细菌数目；
F，用浓度为100μg/mL的光敏剂进行光动力学处理后的细菌数目；
上述实施例公开了本发明优选的实施方案，但是应该理解的是，本发明并不限于这些具体的实施方案，本领域熟练技术人员在不脱离后附的本发明权利要求书的范围内和精神下，可以作出各种变化和改变。

Claims (5)

1.一种制备高纯度药物级水溶性通式1或2的卟啉衍生物的方法，该方法包括以下步骤：
Figure C02811141C00021
其中B是具有下面结构的环：
或
Figure C02811141C00023
或
或
Figure C02811141C00025
或
Figure C02811141C00026
其中：
R1＝-CH＝CH2、-CH(OAlk)CH3、-CHO、-C(O)CH3、-CH2CH3、-CH(Alk)CH(COAlk)2、-CH2CH(COAlk)2、-CH(Alk)CH2COAlk、-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3或-CH2CH2CH(OH)CH3；
R2＝-CH3、-CHO、-CH(OH)Alk、-CH＝CHAlk、CH2OH或CH2OAlk；
R3＝-OH、-OAlk、-NH-Alk、NH-X-COO-(HG)+、-NH-Y-NR8R9或-NH-Y-OH；
R4＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk或NH-X-COO-(HG)+；
R5＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk或-NH-X-COO-(HG)+；
R6＝H或-COOAlk；
R7＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk或-NH-X-COO-(HG)+；
R8＝H或Alk
R9＝H或Alk
其中：
-NH-X-COO-＝有机氨基酸的残基；
X＝亚烷基、肽或-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；
Y＝亚烷基或-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；
G＝亲水性有机胺，选自由含氨基的碳水化合物衍生物、三(羟甲基)氨基甲烷、氨基酸和肽组成的组；
Alk＝烷基取代基；
条件是：当R3为-NH-Y-NR8R9，R4和R5不同时为-OAlk，以及
当R1＝-CH＝CH2时，R6为-COOAlk以及R7为-OAlk这两者不同时出现；
该方法包括步骤：
a.生物原料的一步或两步直接酸性醇解，得到脱镁叶绿酸烷基酯的晶体；
b.将得到的脱镁叶绿酸烷基酯转化为酸性卟啉；和
c.使酸性卟啉与亲水性有机胺在选自水和含水有机溶液的介质中反应；
d.使用挥发性溶剂用反相色谱法纯化水溶性卟啉衍生物。
2.权利要求1的方法，其中所述的生物原料选自由天然存在的植物、藻类、血液组分、昆虫分泌物和微生物组成的组。
3.权利要求1的方法，其中所述的亲水性有机胺选自N-甲基-D-葡糖胺、氨基烷基苷、氨基糖类、三(羟甲基)氨基甲烷和其衍生物、氨基酸和肽。
4.高纯度药物级水溶性通式1或2的卟啉衍生物：
Figure C02811141C00041
其中B是具有下面结构的环：
Figure C02811141C00042
或
Figure C02811141C00043
或
Figure C02811141C00044
或
Figure C02811141C00045
或
Figure C02811141C00046
其中：
R1＝-CH＝CH2、-CH(OAlk)CH3、-CHO、-C(O)CH3、-CH2CH3、-CH(Alk)CH(COAlk)2、-CH2CH(COAlk)2、-CH(Alk)CH2COAlk、-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3或-CH2CH2CH(OH)CH3；
R2＝-CH3、-CHO、-CH(OH)Alk、-CH＝CHAlk、CH2OH或CH2OAlk；
R3＝-OH、-OAlk、-NH-Alk、NH-X-COO-(HG)+、-NH-Y-NR8R9或-NH-Y-OH；
R4＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk或NH-X-COO-(HG)+；
R5＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk或-NH-X-COO-(HG)+；
R6＝H或-COOAlk；
R7＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk或-NH-X-COO-(HG)+；
R8＝H或Alk
R9＝H或Alk
其中：
-NH-X-COO-＝有机氨基酸的残基；
X＝亚烷基、肽或-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；
Y＝亚烷基或-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；
G＝亲水性有机胺，选自由含氨基的碳水化合物衍生物、三(羟甲基)氨基甲烷、氨基酸和肽组成的组；
Alk＝烷基取代基；
条件是：当R3为-NH-Y-NR8R9，R4和R5不同时为-OAlk，以及
当R1＝-CH＝CH2时，R6为-COOAlk以及R7为-OAlk这两者不同时出现。
5.用于治疗癌症和其它过度增生性疾病的药物组合物，包括权利要求4所述的高纯度水溶性卟啉衍生物作为活性组分。
CNB028111419A 2001-06-01 2002-05-31 用于光动力学治疗的水溶性卟啉衍生物、其用途和制备 Expired - Fee Related CN100488965C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/871,772 US20030004334A1 (en) 2001-06-01 2001-06-01 Water-soluble porphyrin derivatives and methods of their preparation
US09/871,772 2001-06-01
US10/151,764 2002-05-20
US10/151,764 US6777402B2 (en) 2001-06-01 2002-05-20 Water-soluble porphyrin derivatives for photodynamic therapy, their use and manufacture

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910130260A Division CN101638411A (zh) 2001-06-01 2002-05-31 用于光动力学治疗的水溶性卟啉盐的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1512994A CN1512994A (zh) 2004-07-14
CN100488965C true CN100488965C (zh) 2009-05-20

Family

ID=26848944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028111419A Expired - Fee Related CN100488965C (zh) 2001-06-01 2002-05-31 用于光动力学治疗的水溶性卟啉衍生物、其用途和制备

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20030088092A1 (zh)
EP (1) EP1404678B1 (zh)
JP (1) JP4510440B2 (zh)
CN (1) CN100488965C (zh)
AT (1) ATE336497T1 (zh)
AU (1) AU2002312154B2 (zh)
CA (1) CA2449031C (zh)
DE (1) DE60213996T2 (zh)
WO (1) WO2002098882A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102363619A (zh) * 2011-11-18 2012-02-29 中国医学科学院生物医学工程研究所 水溶性原卟啉化合物及制备方法及用途

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7897140B2 (en) 1999-12-23 2011-03-01 Health Research, Inc. Multi DTPA conjugated tetrapyrollic compounds for phototherapeutic contrast agents
WO2004002476A2 (en) 2002-06-27 2004-01-08 Health Research, Inc. Fluorinated chlorin and bacteriochlorin photosensitizers for photodynamic therapy
IL152900A0 (en) 2002-11-17 2003-06-24 Yeda Res & Dev Water-soluble bacteriochlorophyll derivatives and their pharmaceutical uses
AU2003272116A1 (en) * 2003-01-16 2004-08-10 Techno Mart Co., Ltd Porphyrin derivatives
US6949581B2 (en) * 2003-03-21 2005-09-27 Ceramoptec Industries, Inc. Water-soluble mono-PEGylated tetrapyrrole derivatives for photodynamic therapy and method of production
PT1753457T (pt) * 2004-06-07 2016-11-10 Yeda Res & Dev Derivados catiónicos de bacterioclorofilas e utilizações dos mesmos
CN1712404B (zh) * 2004-06-15 2010-06-02 上海复旦张江生物医药股份有限公司 卟啉类药物的纯化方法
US7825153B2 (en) * 2004-08-16 2010-11-02 Ceramoptec Industries, Inc. Photosensitizer formulations and their use
JPWO2006095708A1 (ja) * 2005-03-08 2008-08-14 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 ポルフィリン化合物及びその利用
US7947827B2 (en) * 2006-06-30 2011-05-24 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Pharmaceutical formulation comprising a metaloporphyrin and method for its purification and use
GB0904825D0 (en) * 2009-03-20 2009-05-06 Photobiotics Ltd Biological materials and uses thereof
ES2354096B1 (es) * 2009-07-27 2012-02-23 Nuevas Tecnologias Cientificas, S.A. Procedimiento para la obtencion de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinamica y fotosensibilizante.
WO2011043369A1 (ja) 2009-10-07 2011-04-14 国立大学法人宮崎大学 水溶性ポルフィリン及びその製造方法
CN103224499B (zh) * 2013-04-07 2015-06-03 华南理工大学 具有光敏活性的脱镁叶绿酸姜黄素酯及其制备方法与应用
KR101586849B1 (ko) * 2013-06-12 2016-01-19 다이아텍코리아 주식회사 신규한 클로린 e6의 트로메타민 염, 및 그 제조방법 및 그 용도
RU2565755C2 (ru) * 2014-06-10 2015-10-20 Ольга Ивановна Гущина Способ получения фотосенсибилизаторов на основе хлорина е6
CN104496996A (zh) * 2014-12-12 2015-04-08 哈尔滨师范大学 一种荧光探针的制备方法及应用
CN107987081B (zh) * 2016-10-26 2019-12-06 刘辉 一种二氢卟吩e6衍生物及其药学上可接受的盐、其制备方法和应用
WO2018101434A1 (ja) * 2016-11-30 2018-06-07 公立大学法人名古屋市立大学 グリコシル化クロリンｅ６誘導体、または、その薬学的に許容される塩、医薬組成物、標的を破壊する方法、および、グリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法
RU2646477C1 (ru) * 2017-04-05 2018-03-05 Елена Вячеславовна Филоненко Фотосенсибилизатор для лечения онкологических заболеваний и способ его получения
CN107722075A (zh) * 2017-10-09 2018-02-23 大连理工大学 一类二氢卟吩葡萄糖苷类化合物及其制备方法与应用
CN112521393A (zh) * 2019-09-18 2021-03-19 康俄(上海)医疗科技有限公司 一种脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法
CN116162092B (zh) * 2023-03-03 2023-10-10 康俄(上海)医疗科技有限公司 二氢卟吩e6三葡甲胺盐的制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2963178B2 (ja) * 1990-09-27 1999-10-12 株式会社エス・エル・ティ・ジャパン 水溶性フェオホーバイドａの製造方法
JP3253663B2 (ja) * 1992-01-20 2002-02-04 タマ生化学株式会社 放射線増感剤
US5330741A (en) * 1992-02-24 1994-07-19 The Regents Of The University Of California Long-wavelength water soluble chlorin photosensitizers useful for photodynamic therapy and diagnosis of tumors
RU2144538C1 (ru) * 1998-01-22 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "Вета" Способ получения водорастворимых хлоринов

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102363619A (zh) * 2011-11-18 2012-02-29 中国医学科学院生物医学工程研究所 水溶性原卟啉化合物及制备方法及用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP1404678B1 (en) 2006-08-16
WO2002098882A1 (en) 2002-12-12
CA2449031A1 (en) 2002-12-12
AU2002312154B2 (en) 2008-05-15
DE60213996T2 (de) 2007-09-06
JP2004532890A (ja) 2004-10-28
ATE336497T1 (de) 2006-09-15
US20030088092A1 (en) 2003-05-08
JP4510440B2 (ja) 2010-07-21
CA2449031C (en) 2010-07-27
CN1512994A (zh) 2004-07-14
EP1404678A4 (en) 2004-09-22
EP1404678A1 (en) 2004-04-07
DE60213996D1 (de) 2006-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100488965C (zh) 用于光动力学治疗的水溶性卟啉衍生物、其用途和制备
CN101638411A (zh) 用于光动力学治疗的水溶性卟啉盐的制备方法
AU2002312154A1 (en) Water-soluble porphyrin derivatives for photodynamic therapy, their use and manufacture
EP0804439B1 (en) Beta, beta &#39;-dihydroxy meso-substituted chlorins, isobacteriochlorins, bacteriochlorins, and methods for making the same from beta ,beta &#39;-unsubstituted tetrapyrrolic macrocycles
US5591847A (en) Long wavelength absorbing photosensitizers related to purpurin-18, bacteriopurpurin-18 and related compounds with imide linkages
US7169753B2 (en) Chlorophyll and bacteriochlorophyll esters, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
CA2353554C (en) Palladium-substituted bacteriochlorophyll derivatives and use thereof
HU223379B1 (hu) Eljárás szintetikus fém-szubsztituált bakterio-klorofill-származékok előállítására, a vegyületek alkalmazása és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
EP1164136B1 (en) Long wavelength absorbing bacteriochlorin alkyl ether analogs
Lee et al. Use of the chlorophyll derivative, purpurin-18, for syntheses of sensitizers for use in photodynamic therapy
CN105669831B (zh) 一类具有光疗和化疗协同抗癌效应的酞菁锌阿霉素偶联物
CN104844645B (zh) 一种轴向ala修饰的硅酞菁及其制备方法和应用
CN103435639A (zh) 一种轴向核苷不对称修饰的硅酞菁及其制备方法和应用
RU2123005C1 (ru) Алкалоидные соединения, способ их получения, фармацевтическая композиция
WO2019047846A1 (zh) 一种竹红菌素迫位和2-位同时氨基取代的衍生物及其制备方法和应用
RU2382787C2 (ru) Водорастворимые моно-пэгилированные производные тетрапиррола для фотодинамической терапии и способ их получения
CN102268004A (zh) 一种叶绿酸盐化合物及其制备方法
ES2333006T3 (es) Macrociclos tetrapirrolicos como agentes fotodinamicos.
CN102827226B (zh) 一种尿苷衍生物修饰的硅酞菁及其制备方法和应用
RU2783726C1 (ru) Способ получения монокарбоксилпроизводных деметаллированных нефтяных порфиринов
MXPA97003013A (en) Beta chlorines, beta&#39;-dihydroxy meso substitute, isobacterioclorines and methods to manufacture themselves from macrocicles tetrapirrolicosbeta, beta&#39;-without substitute
NZ501912A (en) Synthetic metal-substituted bacteriochlorophyll derivatives and use for killing viruses and microorganisms

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: BIOLITEC PHARMA MARKETING LTD.

Free format text: FORMER OWNER: CERAMOPTEC IND INC.

Effective date: 20120424

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20120424

Address after: Malaysia, Bazhou, Labuan

Patentee after: Biolitec Pharma Marketing Ltd.

Address before: Massachusetts, USA

Patentee before: Ceramoptec Ind Inc.

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20090520

Termination date: 20150531

EXPY Termination of patent right or utility model