DE60213996T2 - Wasserlösliche porphyrinderivate für die photodynamische therapie, ihre verwendung und herstellung - Google Patents

Wasserlösliche porphyrinderivate für die photodynamische therapie, ihre verwendung und herstellung Download PDF

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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
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    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Description

  • Diese Patentanmeldung ist eine teilweise Fortsetzung der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung 09/871,772, eingereicht am 01.06.2001 von Nikolay E. Nifantiev als Erfinder, mit dem Titel: "Wasserlösliche Porphyrinderivate und Methoden zu ihrer Herstellung". Diese Patentanmeldung ist als Referenz in diesen Patentantrag eingeschlossen.
  • Die Erfindung bezieht sich auf die Chemie biologisch aktiver Verbindungen, insbesondere auf eine neue Methode, um wasserlösliche Porphyrinderivate, speziell Chlorin-, Bakteriochlorin-, Phäophorbid- und Bakteriophäophorbid-Derivate der Typen 1 und 2 herzustellen. Die Substanzen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können als Photosensibilisatoren für die photodynamische Therapie von Tumorerkrankungen, von Infektionen und anderen Erkrankungen wie auch für eine Behandlung unter Lichtanregung in anderen Fällen genutzt werden.
  • Figure 00010001
  • Worin B ein Ring mit folgender Struktur ist:
    Figure 00010002
  • Wobei:
    R1 = -CH=CH2, -CH(OAlk)CH3, -CHO, -C(O)CH3, -CH2CH3, -CH(Alk)CH(COAlk)2, -CH2CH(COAlk)2, -CH(Alk)CH2COAlk, -CH(Alk)CH2CH(OH)CH3, oder -CH2CH2CH(OH)CH3
    R2 = -CH3, -CHO, -CH(OH)Alk, -CH=CHAlk, CH2OH, oder CH2OAlk;
    R3 = -OH, -OAlk, -NH-Alk, -NH-X-COO–(HG)+, -NH-Y-NR8R9, oder -NH-Y-OH;
    R4 = -O–(HG)+, -OAlk, -NH-Alk, oder -NH-X-COO–(HG)+;
    R5 = -O–(HG)+, -OAlk, -NH-Alk, oder NH-X-COO–(HG)+;
    R6 = -H oder -COOAlk;
    R7 = -O–(HG)+, -OAlk, -NH-Alk, oder -NH-X-COO–(HG)+;
    R8 = -H oder -Alk;
    R9 = -H oder -Alk
  • Wobei:
    -NH-X-COO– = ein organischer Aminosäurerest;
    X = Alkyliden, Peptide, Oligopeptide oder -(CH2CH2O)nCH2CH2-, wobei n = 1 – 30;
    Y = Alkyliden oder -(CH2CH2O)nCH2CH2-, wobei n = 1 – 30;
    G = ein hydrophiles organisches Amin (z. B. N-Methyl-D-glucamin oder andere Aminogruppen-enthaltende Kohlenhydrat-Derivate, TRIS, Aminosäuren, Oligopeptide); und
    Alk = ein Alkyl-Substituent.
  • Die Photodynamische Therapie (PDT) ist eine der vielversprechendsten neuen Techniken, die auf ihre Eignung für eine Vielzahl von medizinischen Anwendungen hin überprüft wird (Photodynamic therapy, basic principles and clinical applications. Eds. B.W. Henderson, Th.J. Dougherty, Marcel Dekker, 1992, New York). Sie ist insbesondere anerkannt für die Zerstörung von Tumorgewebe (Photodynamic tumor therapy. 2nd and 3rd generation photosensitizers. Ed. J.G. Moser, Harwood Academic Publishers, 1998, Amsterdam). Porphyrine sind Substanzen, die häufig für die PDT genutzt werden. Ein zentrales Problem für die pharmazeutische Anwendung von Porphyrinen ist ihre geringe Löslichkeit in physiologischen Lösungen. Dies macht es beinahe unmöglich, effektive injizierbare Lösungen in pharmazeutischer Qualität für PDT und andere Anwendungen herzustellen.
  • Methoden zur Herstellung wasserlöslicher Porphyrinderivate für die PDT sind bereits Stand der Technik bekannt. Das U.S.-Patent Nr. 5,330,741 von Smith et al. beschreibt eine Methode, um Trinatrium-lysyl-chlorin p6 darzustellen, indem man Purpurin-18-methlyester, hergestellt durch Modifikation von Methylphäophorbid a, mit wässerigem Lysin in Dichlormethan in Gegenwart von Pyridin umsetzt. Das Gemisch wird für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend werden die Lösungsmittel im Hochvakuum entfernt. Das auf diese Weise hergestellte Rohprodukt wird mittels Reversed-Phase-HPLC gereinigt und anschließend lyophylisiert. Um hieraus eine injizierbare Lösung für die PDT-Tumorbehandlung herzustellen, wird das Produkt zuerst in Phosphatpufferlösung gelöst und anschließend wird 0,1 N Natriumhydroxid hinzugefügt. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zusatz von 0,1 N HCl auf pH 7,35 eingestellt, dann folgt eine Sterilfiltration durch einen mikroporösen Filter.
  • Die Nachteile der oben erwähnten Methode umfassen u. a. eine mangelnde Reproduzierbarkeit, Schwierigkeiten bei der Aufarbeitung und die Verwendung toxischer Reagenzien. Daher ist diese Methode nicht geeignet für die pharmazeutische Produktion. Darüber hinaus ist das auf diese Weise hergestellte wasserlösliche Produkt in wässeriger Lösung lediglich für 24 h bei 4°C im Dunkeln stabil, in fester Form beträgt die Stabilität nur bis zu 4 Monaten bei 4°C im Dunkeln [M.W. Leach, R.J. Higgins, J.E. Boggan, S.-J. Lee, S. Autry, K.M. Smith, Effectiveness of a Lysylchlorin p6/Chlorin p6 mixture in Photodynamic Therapy of the Subcutaneous 9L Glioma in the Rat. Cancer Res., 1992, 52, 1235 – 1239; U.S. Patent Nr. 5,330,741].
  • Im U.S. Patent Nr. 5,378,835 von Nakazato et al. wird eine Methode zur Darstellung eines wasserlöslichen Natriumsalzes von Phäophorbid a (3) beschrieben. Nach der Beschreibung dieser Erfindung wird Phäophorbid a (4) in Diethylether gelöst. Hierzu wird eine sehr verdünnte Lösung von Alkali in n-Propanol, iso-Propanol oder einer Mischung dieser beiden Lösungsmittel sehr langsam hinzugetropft. Die Reaktion wird so lange fortgeführt, bis das Phäophorbid-a-Salz vollständig ausgefallen ist, dieses wird dann durch Zentrifugieren abgetrennt und in vacuo getrocknet. Das Produkt wird in Wasser gelöst, wobei eine Lösung mit einer Konzentration von 0,5% und einem pH-Wert von 9,2 – 9,5 entsteht, diese wird dann mit Phosphatpuffer verdünnt auf einen pH-Wert von 7,4 – 7,8.
  • Der Nachteil der von Nakazato beschriebenen Methode liegt in der Tatsache, dass es mit dieser Methode nicht möglich ist, eine konzentrierte (> 1%) injizierbare Lösung von Phäophorbid a in Wasser herzustellen. Darüber hinaus haben die Autoren der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass diese Salze bei trockener Lagerung chemisch instabil sind, und dass sie sich nur unvollständig in Wasser auflösen, nachdem sie in trockenem Zustand gelagert worden sind.
  • Figure 00040001
  • Die dem vorliegenden Patent ähnlichste Methode ist in dem russischen Patent Nr RU 2144538 von G.V. Ponomarev et al. offen gelegt. Darin wird die Darstellung wasserlöslicher Komplexe von Chlorin e6 beschrieben (7) und zwar mit Hilfe raumerfüllender organischer Amine unter Einschluss von N-Methyl-D-glucosamin in einer Multischritt-Reaktionssequenz: Gewinnung von Chlorophyll a aus der Biomasse von Cyanobakterien der Art Spirulina Platensis, Umwandlung in Chlorin e6 mit Hilfe von Standardmethoden [S. Lötjönen, P.H. Hynninen, An improved method for the preparation of (10R)- and (10S)- pheophytins a and b. Synthesis, 1983, 705 – 708; P.H. Hynninen, S. Lötjönen, Preparation of phorbin derivatives from chlorophyll mixture utilizing the principle of selective hydrolysis. Synthesis, 1980, 539 – 541; S. Lötjönen, P.H. Hynninen, A convenient method for the preparation of wet chlorin e6 and rhodin g7 trimethyl esters. Synthesis, 1980, 541 – 543] mit einer Gesamtausbeute von über 50% nach Ausfällung des Chlorins e6 durch schrittweise Zugabe von Wasser zu dessen Lösung in Aceton, anschließende Abtrennung durch Zentrifugieren, dreimaliges Waschen mit Wasser, gefolgt von der Umsetzung des feuchten Chlorins e6 mit einer wässrigen Lösung von 2 g-eq. des raumerfüllenden organischen Amins.
  • Die entscheidenden Nachteile dieser Methode, die zu deutlichen Schwierigkeiten bei der präparativen Synthese wasserlöslicher Chlorine, insbesondere für industrielle Synthesen und für die Arzneimittelherstellung führen, sind die folgenden:
    • 1. Das als Zwischenprodukt auftretende Chlorin e6 fällt als feuchte Masse mit einem nicht genau bestimmbaren Gehalt an Chlorin e6 an. Diese Schwankung im Chlorin-e6-Gehalt führt zu Unsicherheiten, die es sehr schwierig machen, die daraus gewonnenen Lösungen zu standardisieren.
    • 2. Das wichtigste Zwischenprodukt in der Synthesesequenz ist Phäophorbid a (4), welches wegen seiner sauren Eigenschaften schwer für Reinigung und Standardisierung zu handhaben ist. Die Abtrennung von Phäophorbid a (4) durch wiederholtes Ausfällen (wie bei Ponomarev) gelingt nicht quantitativ und ist daher für die Darstellung großer Mengen ungeeignet.
    • 3. Phäophorbid a (4), das auf diese Weise gewonnen wird, enthält Verunreinigungen, die schwierig abzutrennen sind. Dieser Nachteil führt zu Unsicherheiten bei der Quantifizierung von Phäophorbid a (4) und stört bei der Öffnung des Cyclopentanon-Ringes im Rahmen der Umwandlung von Phäophorbid a (4) zu Chlorinen.
    • 4. Es muss darauf hingewiesen werden, dass die Proben wasserlöslicher Chlorin-e6-Salze, die entsprechend der Vorschrift von Ponomarev hergestellt wurden, eine Vielzahl porphyrinartiger und nicht-porphyrinartiger Verunreinigungen enthalten, die sich mit den im Patent beschriebenen Methoden nicht von der Zielverbindung Chlorin e6 abtrennen ließen. Unter den auftretenden Verunreinigungen konnten mittels Dünnschichtchromatographie und HPLC unter anderem Phäophorbid a (4), Purpurin 18 (8), Chlorin p6 (9) und andere begleitende Verunreinigungen nachgewiesen werden.
      Figure 00060001
    • Es wurde festgestellt, dass Verbindungen der Typen (4), (8) und (9) der oben erwähnten Erfindung als Salze mit hydrophilen Aminen durch eine, verglichen mit ihren entsprechenden Chlorin-e6-Salzen, deutlich geringere Wasserlöslichkeit charakterisiert sind. Dennoch sind die Verbindungen des Typs (4), (8) und (9) als Salze mit hydrophilen Aminen, wie in der oben erwähnten Erfindung, in Gegenwart von Chlorin-e6-Salzen deutlich besser wasserlöslich, als man dies mit einer möglichen Komplexbildung mit den Chlorin-e6-Salzen erklären könnte. Dieses Phänomen macht eine Abtrennung der Chlorin-e6-Produkte von Verunreinigungen wie den Verbindungen der Typen (4), (8) und (9) etwa unter Ausnutzung ihrer unterschiedlichen Wasserlöslichkeit unmöglich.
    • 5. Die organischen Amine, die von Ponomarev für die Darstellung wasserlöslicher Chlorine verwendet wurden, sind für eine praktische Anwendung nicht optimal. Insbesondere D-Glucosamin, welches Komplexe mit Chlorinen bildet, die durch eine höhere Löslichkeit gekennzeichnet sind, ist aufgrund der möglichen Oxidation seiner Aldehydgruppe nicht stabil genug. Gleichzeitig kann D-Glucosamin in der Lösung in mehreren isomeren Formen vorliegen, was Unsicherheiten in Bezug auf die Struktur mit sich bringt und dementsprechend auch Schwierigkeiten bei der genauen Charakterisierung der Struktur, was dazu führt, dass die Qualitätskontrollanforderungen für eine pharmazeutische Herstellung nicht eingehalten werden können. Ein weiteres raumerfüllendes Amin, das von Ponomarev benutzt wird, N-Methyl-D-glucosamin, besitzt dieselben Nachteile wie das oben erwähnte D-Glucosamin und ist darüber hinaus wegen seiner aufwendigen Herstellung nur schlecht verfügbar.
    • 6. Ponomarev behauptet die Bildung wasserlöslicher Salze von Chlorin e6 mit raumerfüllenden organischen Aminen, was als sehr fragwürdig angesehen werden muss, weil übliche raumerfüllende organische Amine, z. B. solche, die tert-Butyl-, Neopentyl-, Adamantyl- oder Cyclohexyl-Gruppen enthalten, wegen der hohen Hydrophobie der raumerfüllenden organischen Reste nicht für die Darstellung wasserlöslicher Chlorin-e6-Salze verwendet werden können.
    • Dieser Aspekt zusammen mit den anderen oben erwähnten Gründen macht die von Ponomarev beanspruchte Methode ungeeignet für die Herstellung von Zubereitungen in pharmazeutischer Qualität nach den GMP-Anforderungen.
  • Geeignete Porphyrinderivate, die als Edukte für die im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung interessierenden Synthesen dienen können, werden herkömmlicherweise aus den gereinigten bzw. Standard-Rohmaterialien Methylphäophorbid a (5) oder Ethylphäophorbid a (6) gewonnen. Die heute allgemein bekannten Methoden zur Abtrennung von Porphyrinen von biologischem Rohmaterial bestehen aus einer langen Abfolge von mühsamen Waschvorgängen mit organischen Lösungsmitteln und/oder dem Einfrieren der Zubereitung, um die Zellwände des Biomaterials zu zerstören, und wiederholten Extraktionen in Verbindung mit der Behandlung der Biomasse mit verschiedenen Chemikalien, um zuerst Chlorophyll zu erhalten, welches dann in Phäophytin überführt wird, das dann zu Phäophorbid a hydrolysiert wird (K.M. Smith, D.A. Goff and D.J. Simpson, J. Amer. Chem. Soc., 1985, 107, 4946 – 4954; R.K. Pandey, D.A. Bellnier, K.M. Smith and T.J. Dougherty, Photochem. Photobiol., 1991, 53, 65 – 72).
  • Somit gibt es Bedarf, eine einfache und effiziente Methode zur Herstellung reiner und chemisch stabiler wasserlöslicher Porphyrinderivate mit einem standardisierten Anteil der gewünschten Substanz zur Verfügung zu stellen, die sich für medizinische Anwendungen, insbesondere die photodynamische Therapie, eignet. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem und besitzt darüber hinaus noch weitere Vorteile.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, chemisch stabile wasserlösliche Porphyrinderivate mit einen standardisierten Anteil der gewünschten Substanz zur Verfügung zu stellen, die für verschiedenste medizinische Anwendungen, insbesondere die PDT, geeignet sind.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, hochreine, wasserlösliche Porphyrinderivate in pharmazeutischer Qualität zur Verfügung zu stellen, die in pharmazeutischen Zubereitungen wirksam sind.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Methode zur Darstellung chemisch-stabiler wasserlöslicher Porphyrinderivate zur Verfügung zu stellen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine einfache und zeitsparende Methode zur Darstellung chemisch stabiler, wasserlöslicher Porphyrinderivate ausgehend von biologischen Rohmaterialien zur Verfügung zu stellen, die gleichzeitig die Nachteile des bisherigen Standes der Technik vermeidet.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, chemisch-stabile, wasserlösliche Porphyrinderivate in einer pharmazeutisch akzeptablen Zubereitung zur Verfügung zu stellen, die für medizinische Anwendungen, wie z. B. die Behandlung von Tumorerkrankungen und anderen hyperproliferativen Erkrankungen, von Infektionen und anderen Erkrankungen, benutzt werden kann.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Methode zur Darstellung wasserlöslicher Porphyrinderivate, die folgende Schritte umfasst: ein- oder zweischrittige direkte saure Alkoholyse von biologischem Rohmaterial, die zu kristallinem Alkylphäophorbid führt, Umwandlung des erhaltenen Alkylphäophorbids in ein saures Porphyrin und die Reaktion des sauren Porphyrins mit einem hydrophilen organischen Amin in Wasser oder einer wässerigen organischen Lösung.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Methode zur Darstellung wasserlöslicher Porphyrinderivate, die die Reaktion eines sauren Porphyrins in Wasser oder einer wässerigen organischen Lösung mit einem hydrophilen organischen Amin umfasst.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Methode zur Darstellung wasserlöslicher Porphyrinderivate, die folgende Schritte umfasst: ein- oder zweischrittige direkte saure Alkoholyse von biologischem Rohmaterial, die zu kristallinem Alkylphäophorbid führt, Umwandlung des erhaltenen Alkylphäophorbids in ein saures Porphyrin, Reaktion des sauren Porphyrins mit einem hydrophilen organischen Amin in Wasser oder einer wässerigen organischen Lösung und Reinigung des entstandenen wasserlöslichen Porphyrinderivates durch Reversed-Phase-Chromatographie mit Hilfe flüchtiger organischer Lösungsmittel.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Darstellung wasserlöslicher Porphyrinderivate zur Verfügung, die folgende Schritte umfasst: Reaktion des sauren Porphyrins mit einem hydrophilen organischen Amin in Wasser oder einer wässerigen organischen Lösung und Reinigung eines wasserlöslichen Porphyrinderivates durch Reversed-Phase-Chromatographie mit Hilfe flüchtiger organischer Lösungsmittel. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung wasserlösliche Porphyrinderivate der Formeln (1) und (2) zur Verfügung, die für pharmazeutische Zubereitungen nützlich sind, die durch die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Methoden erhalten werden können und die in der photodynamischen Therapie und anderen medizinischen Anwendungen benutzt werden können.
  • 1: Bestimmung der Dunkeltoxizität (Cytotoxizität, Beispiel 14) des wasserlöslichen Salzes von Chlorin e6 (7) mit N-Methyl-D-glucamin (10) hergestellt (A) entsprechend der vorliegenden Erfindung (Beispiel 9) und (B) nach Ponomarev ( RU 2144538 ); der Test wurde mit OV2774-Zellen unter Zusatz der jeweils angegebenen Photosensibilisator-Konzentrationen durchgeführt.
  • 2: Bestimmung der Phototoxizität (Beispiel 15) des wasserlöslichen Salzes von Chlorin e6 (7) mit N-Methyl-D-glucamin (10) hergestellt (A) entsprechend der vorliegenden Erfindung (Beispiel 9) und (B) nach Ponomarev ( RU 2144538 ); der Test wurde mit OV2774-Zellen unter Zusatz der jeweils angegebenen Photosensibilisator-Konzentrationen und einer Bestrahlung bei 670 nm durchgeführt.
  • Vor einer Beschreibung der Erfindung mag es hilfreich sein, hier einige Definitionen bestimmter Begriffe zugeben, die in der folgenden Patentschrift benutzt werden.
  • Porphyrine sind makrozyklische Verbindungen mit Brücken von einem Kohlenstoffatom bzw. einem Stickstoffatom, die Pyrrole so verbinden, dass eine charakteristische Tetrapyrrol-Ringstruktur entsteht. Es gibt viele verschiedene Klassen von Porphyrinderivaten, eingeschlossen Derivate mit Dihydropyrrol-Einheiten. Der Ausdruck Porphyrine wird hier so verwendet, dass er Porphyrine, Phthalocyanine, Chlorine, Phäophorbide und die jeweiligen Metallkomplexe sowie andere porphyrinartige Verbindungen einschließt, die für die PDT und pharmazeutische Anwendungen geeignet sind.
  • In der hier verwendeten Bedeutung sind biologische Rohmaterialien Materialien zur Darstellung von Verbindungen aus der vorliegenden Erfindung. Diese umfassen z. B. Pflanzen, Algen, Blutkomponenten und Insektenabsonderungen.
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird durch die beschriebene Methode erreicht, welche die Reaktion eines sauren Porphyrins in Wasser oder wässeriger organischer Lösung mit einem hydrophilen organischen Amin umfasst, vorzugsweise N-Methyl-D-glucamin (10), welches eine polyhydroxylierte stabile und nicht-toxische Verbindung für die Arzneimittelherstellung ist, oder mit Aminoalkyl- und Aminoarylglykosiden wie den Maltosederivaten (11) und (12) oder anderen Aminogruppen-enthaltenden Kohlenhydratderivaten. Weitere mögliche Reagenzien schließen folgende Verbindungen ein, sind aber nicht auf diese be schränkt: Tris(hydroxymethyl)aminomethan (auch bekannt als TRIST) (13), ebenfalls eine stabile und nicht-toxische Verbindung, die für die Arzneimittelherstellung geeignet ist, oder TRIS-Derivate, wie die Verbindungen (14) und (15), wie auch andere Arten hydrophiler Amine, wie z. B. Bis(2-hydroxyethyl)amin (16). Aminosäuren oder Oligopeptide wie z. B. Oligolysine, vorzugsweise Penta- und Hexalysine, können ebenfalls als hydrophile organische Amine genutzt werden, die für die Darstellung wasserlöslicher Porphyrinderivate gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
  • Figure 00100001
  • Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie sie in Beispiel 9 beschrieben ist, wird die quantitative stöchiometrische Reaktion eines chemisch reinen Porphyrins (als freie Säure) und eines geeigneten hydrophilen aromatischen Amins bei Raumtemperatur unter Inertgas und im Dunkeln durchgeführt. Das benutzte Lösungsmittel ist entweder chemisch reines Wasser, das unter Inertgas (z. B. Argon, Helium oder ähnliche Gase) entgast worden ist, oder aber, falls dies notwendig ist, ein Gemisch aus Wasser mit einem geeigneten chemisch reinen und entgasten organischen Lösungsmittel. Das organische Lösungsmittel wird anschließend ohne Erhitzen im Vakuum entfernt (um eine mögliche Zerstörung des Ausgangsporphyrins zu verhindern) und das Produkt wird dann gefriergetrocknet. In manchen Fällen ist es notwendig, ein organisches Lösungsmittel hinzuzufügen, um die Reaktion durch Lösung des Ausgangsporphyrins zu unterstützen, so dass die Reaktion des Porphyrins (als freie Säure) mit dem hydrophilen organischen Amin stattfindet. Beispiele für mögliche organische Lösungsmittel sind Aceton oder eine Mischung aus Dichlormethan und Methanol. Das erhaltene gefriergetrocknete, wasserlösliche Porphyrin ist chemisch rein und bedarf für medizinische und biologische Anwendungen keiner weiteren Reinigung außer der Sterilisierung.
  • Entsprechend einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, können nicht-reine Ausgangsstoffe einschließlich feuchter Rohporphyrin-Pasten benutzt werden. Die Reaktion wird genauso wie oben beschrieben durchgeführt, aber es wird ein Überschuss des hydrophilen organischen Amins benutzt, um alle Porphyrinkomponenten zur Reaktion zu bringen. Nachdem das Reaktionsgemisch im Vakuum aufkonzentriert worden ist, wird das erhaltene wasserlösliche Porphyrin dann chromatographisch gereinigt und zwar auf einer Säule mit einem geeigneten Reversed-Phase-Adsorbens, vorzugsweise vom RP C-8- oder RP C-18-Typ. Die Fraktionen mit den Zielprodukten werden gesammelt, im Vakuum ohne Erhitzen eingeengt, um das organische Lösungsmittel zu entfernen, und dann gefriergetrocknet, um das gewünschte wasserlösliche Porphyrinderivat zu erhalten. Hierfür wurden Protokolle entwickelt, die es erlauben, wasserlösliche Porphyrinderivate mit Reversed-Phase-Chromatographie unter Zuhilfenahme flüchtiger organischer Lösungsmittel zu reinigen und so Produkte mit einem hohen qualitativen Standard zu erhalten, wie er für die Herstellung medizinischer Zubereitungen erforderlich ist.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine einfache und effiziente Methode, um Porphyrinverbindungen aus biologischen Rohmaterialien zu erhalten. Die Methode umfasst folgende Schritte: ein- oder zweischrittige direkte saure Alkoholyse von biologischem Rohmaterial, vorzugsweise Methanolyse oder Ethanolyse, die zu kristallinen Alkylphäophorbiden führt (vorzugsweise Methyl- oder Ethylphäophorbid). Diese sind als entscheidende Zwischenprodukte für eine Vielzahl von chemischen Transformationen geeignet, um so die Ziel-Porphyrinderivate zu erhalten. Diese einfache und vergleichsweise schnelle Methode erlaubt die Darstellung von Porphyrinderivaten aus biologischen Rohmaterialien, ohne dass auf mühsame Waschvorgänge mit organischen Lösungs mitteln, das Einfrieren (um die Zellwände zu zerstören) und wiederholte Extraktionen zurückgegriffen werden muss, wie sie bei den bisher bekannten Prozeduren erforderlich sind.
  • Der Einsatz kristalliner Alkylphäophorbide (vorzugsweise Methyl- oder Ethylphäophorbid) als synthetische Zwischenprodukte ermöglicht eine einfache Reinigung und Standardisierung, wie sie für die Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen zum Einsatz in der Medizin wie etwa in der PDT notwendig ist.
  • Die Durchführung der Alkoholyse hängt von der Qualität des biologischen Rohmaterials ab, von dem ausgegangen wird, insbesondere von seiner Trockenheit, die wichtig ist, um bei der Alkoholyse die notwendige Säurekonzentration aufrecht zu erhalten. Im Falle ausreichend trockenen Materials, z. B. von getrockneten Spirulina- oder Chlorella-Biomassen oder getrockneten, pulverisierten Brennnesselblättern (vgl. Beispiele 1 – 5) ist es möglich, eine direkte einschrittige Herstellung von Alkylphäophorbiden durchzuführen.
  • Falls nur ungenügend getrocknetes Rohmaterial zur Verfügung steht, wird die Herstellung der Alkylphäophorbide mit einer zweischrittigen Alkoholyse durchgeführt, hier beispielhaft gezeigt durch die Herstellung der Methylphäophorbide a (5) und b (17) aus Spinat (siehe Beispiel 6). In diesen Fällen verhindert das Vorhandensein einer zu großen Menge Wasser die Einhaltung einer Säurekonzentration, wie sie für die Spaltung des Phytolesters notwendig ist. Dennoch sind die nach dem ersten Alkoholyseschritt erhaltenen Phäophytine trocken genug, um in einem zweiten Alkoholyseschritt zur Herstellung kristalliner Alkylphäophorbide benutzt zu werden.
  • Die Herstellung saurer Porphyrine, die für eine weitere Umwandlung in wasserlösliche Formen geeignet sind, erfolgt durch chemische Umwandlung der Porphyrin-Rohmaterialien, wie z. B. kristalline Alkylphäophorbide, die wiederum aus biologischen Rohmaterialien mit Hilfe der in dieser Erfindung beschriebenen Vorgehensweise erhalten werden.
  • Figure 00120001
  • Speziell 2-Devinyl-2-(1-alkoxyethyl)-chlorine e6 können auf folgende Weise erhalten werden: Durch Hydrobromierung von Methyl- oder Ethylphäophorbiden a mit einer gesättigten Lösung von HBr in Essigsäure erhält man die entsprechenden 2-Devinyl-2-(1-bromethyl)-phäophorbide a, aus denen man durch weitere Alkoholyse die 2-Devinyl-2-(1-alkoxyethyl)-phäophorbide a erhält (z. B. Verbindung 18) (C. Rimington, A. Roennestad, A. Western, and J. Moan, Int. J. Biochem., 1988, 20, 1139 – 1149; K.R. Adams, C.R. Berembaum, R. Bonnett, A.N. Nizhnik, A. Salgado, and M.A. Valles, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1992, 1465 – 1470), anschließende Verseifung führt zu den entsprechenden 2-Devinyl-2-(1-alkoxyethyl)-chlorinen e6 in Form der Tricarbonsäuren (19) oder ihren wasserlöslichen Salzen, z. B. mit N-Methyl-D-glucamin (10) (Beispiel 10).
  • In gleicher Weise führt die Reaktion der 2-Devinyl-2-(1-bromethyl)-phäophorbide mit anderen Nukleophilen statt mit Alkoholen zu einer Vielzahl von möglichen Porphyrinderivaten, die sich mit den in dieser Erfindung beschriebenen Methoden in ihre wasserlöslichen Formen umwandeln lassen.
  • Die Methode aus der vorliegenden Erfindung zur Herstellung wasserlöslicher Formen verschiedener Chlorin- und Phäophorbidderivate wird auch durch die Beispiele 15 – 30 (unten aufgeführt) für die Herstellung der wasserlöslichen Salze der Säuren (4) und (20) – (33) mit dem Amin (10) illustriert.
  • Figure 00130001
  • Figure 00140001
  • Die Reaktion saurer Porphyrinderivate mit hydrophilen Aminen gemäß der vorliegenden Erfindung führt zur Bildung der entsprechenden wasserlöslichen Salze. Speziell im Fall der Phäophorbide sind dies Mono-Salze, während Bis-Salze von Tricarbonsäure-Chlorinen (34) (über die Bildung eines der möglichen Mono-Salze als Zwischenprodukt, wie das Zwischenprodukt (35), vgl. Schema 1) gebildet werden, da die Carboxylgruppe an Position 6 (Die Atomnummerierung ist für die Verbindungen 4 – 6 gezeigt.) nicht genügend Azididät für eine Salzbildung besitzt.
  • Figure 00150001
  • Da die wasserlöslichen Porphyrine der vorliegenden Erfindung in wässeriger Lösung der Hydrolyse unterliegen können (wie für die Chlorine in Schema 2 beispielhaft gezeigt), ist es wünschenswert, wasserlösliche Salze gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen und sie in gelöstem Zustand in Gegenwart eines Überschusses von hydrophilem Amin zu lagern.
  • Die wasserlösliche Chlorin-Bis-Salze aus der vorliegenden Erfindung können in gereinigter Form durch Reinigung mittels Säulenchromatographie erhalten werden, wie dies in Beispiel 9(B) gezeigt ist. Das Auflösen der gereinigten Bis-Salze in Wasser ist von einer reversiblen Hydrolyse begleitet, die zu Mono-Salzen führt (z. B. vom Typ 35, vgl. Schema 2), die eine verringerte Wasserlöslichkeit verglichen mit Bis-Salzen besitzen, oder sogar dem Ausgangschlorin (34), welches nur eine sehr geringe Wasserlöslichkeit aufweist. Diese Prozesse können zur Bildung geringer Mengen von Präzipitat während der Lagerung der Lösungen führen.
  • Figure 00160001
  • Um diese unerwünschten Prozesse zu vermeiden und um klare und homogene Lösungen aufrecht zu erhalten, die unbedingt notwendig sind, wenn diese Lösungen für medizinische Anwendungen wie die PDT benutzt werden sollen, ist es vorteilhaft, die Bis-Salze in Wasser in Gegenwart kleiner, bekannter Mengen des entsprechenden hydrophilen Amins (z. B. kleiner als 2 Moläquivalente, besser zwischen 0,05 und 0,5 Äquivalenten), so dass die gewünschten Porphyrinderivate weiter in Form ihrer Bis-Salze vorliegen und auf diese Weise die Bildung der Mono-Salze und der Ausgangschlorine durch Hydrolyse der Bis-Salze verhindert wird.
  • Die Salze von Chlorin- und Phäophorbidderivaten, die in dieser Erfindung beschrieben sind, besitzen eine Wasserlöslichkeit in einer Größenordnung von einigen 10 mg/l, wodurch sie für eine Vielzahl von Anwendungen geeignet sind. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Phäophorbidderivate herzustellen, die eine durch eine Peptidbindung verknüpfte Aminosäureneinheit enthalten, und die Salze mit hydrophilen Aminen bilden. Diese Salze sind im Vergleich mit den Ausgangsphäophorbidderivaten ohne Aminosäureeinheiten durch eine mehr als hundertfach höhere Wasserlöslichkeit gekennzeichnet. Speziell das Salz des Phäophorbidderivates (36) mit N-Methyl-D-glucamin (10) besitzt eine Löslichkeit von 40 mg/l, wohingegen die Derivate, die über eine Peptidbindung mit Aminosäureresten verknüpft sind, eine Löslichkeit größer als 5 g/l besitzen.
  • Figure 00170001
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, chemisch stabile und wasserlösliche Porphyrinderivate der Formeln (1) und (2) für verschiedenste medizinische Anwendungen zu nutzen. Solche Verbindungen sind besonders geeignet für eine Anwendung in der PDT, um damit Tumorerkrankungen und andere hyperproliferative Krankheiten, Infektionen, Psoriasis, Arteriosklerose, AMD und andere Krankheiten und Infektionen, die mit der photodynamischen Therapie behandelt werden können, zu behandeln. Wegen der Wasserlöslichkeit können besagte Verbindungen in verschiedensten pharmazeutisch akzeptablen und aktiven Zubereitungen für verschiedene Verabreichungsformen, wie z. B. Injektionen, hergestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung erlaubt außerdem den Einsatz hochreiner wasserlöslicher Porphyrinderivate, die nach den Ausführungen in der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, für die photodynamische Therapie von Tumorerkrankungen und anderen hyperproliferativen Erkrankungen und von Infektionen. Die PDT wird durchgeführt, indem die Derivate zuerst in ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel für eine Abgabe am Ort der Behandlung überführt werden. In einer Ausführungsform, für Erkrankungen wie z. B. Hautkrebs oder anderen dermatologischen Erkrankungen, ist dieses Vehikel zur Verabreichung im allgemeinen eine dermatologische Creme, ein Gel oder manchmal ein Aerosol-Flüssigkeitsdispergiermittel. Nachdem die Derivate mit Hilfe dieses Vehikels am Behandlungsareal verabreicht worden sind, wird lange genug gewartet, so dass sich die Porphyrinderivate bevorzugt im erkrankten Gewebe anreichern. Zum Schluss wird das Behandlungsareal mit Licht geeigneter Wellenlänge und ausreichender Leistung bestrahlt, so dass die Porphyrinderivate aktiviert werden, um die Zellen des besagten Gewebes zu nekrotisieren.
  • Die Bestimmung der Dunkeltoxizität (Beispiel 31, 1) und der Phototoxizität (Beispiel 32, 2) eines der Porphyrinderivate der vorliegenden Erfindung, speziell des wasserlöslichen Salzes von Chlorin e6 (7) mit N-Methyl-D-glucamin (10), hergestellt ent sprechend dem Beispiel 9(B), zeigte in Zellkulturexperimenten beispielhaft die hervorragenden Eigenschaften der Verbindungen für einen Einsatz in der PDT. Die Experimente wurden auch deshalb durchgeführt, um die deutlich schlechteren Eigenschaften (höhere Dunkeltoxizität, geringere Phototoxizität) derselben Verbindung zu zeigen, wenn sie nach der von Ponomarev beschriebenen Technologie hergestellt wird ( RU 2144538 ).
  • In besonderen Fällen jedoch kann die die Verabreichung von definierten Mischungen der Salze hydrophiler Amine mit verschiedenen Porphyrinderivaten vorteilhaft sein, wenn diese Mischungen gegenüber erkranktem Gewebe eine höhere Phototoxizität aufweisen. Diese erhöhte Phototoxizität könnte durch das hier beschriebene Phänomen der erhöhten Wasserlöslichkeit des Gemisches der Verbindungen (4), (7) und (8) (als Salze mit hydrophilen Aminen) in Gegenwart derselben Chlorin-e6-Salze verursacht sein.
  • Weitere Beispiele der guten phototoxischen Eigenschaften der wasserlöslichen Formen entsprechend der hier vorliegenden Erfindung sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengestellt, die die Ergebnisse von Dunkel- und Phototoxizitätsexperimenten mit HeLa-Zellen mit den wasserlöslichen Salzen der Säuren (4), (7), (22) und (25) mit N-Methyl-D-glucamin zusammenfassen (10).
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der beschriebenen wasserlöslichen Formen von Chlorin- und Phäophorbidderivaten in der antimikrobiellen photodynamischen Therapie. Dies wird durch die Daten in Tabelle 3 veranschaulicht, die die Ergebnisse der photodynamischen Behandlung einer Reihe von Mikroorganismen mit den wasserlöslichen Salzen der Säuren (4), (7), (22) und (25) mit N-Methyl-D-glucamin (10) zusammenfasst.
  • Die im folgenden gezeigten Beispiele sollen dem Fachmann eine umfassende und anschauliche Beschreibung davon geben, wie wasserlösliche Porphyrinderivate gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, um für die Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen genutzt zu werden; die Beispiele sind nicht dazu bestimmt, den Umfang dessen, was der Erfinder als Gegenstand der Erfindung erachtet, zu beschränken. Es wurde nach Möglichkeit dafür Sorge getragen, dass die angegebenen Zahlenwerte (z. B. Mengenangaben, Temperatur etc.) korrekt sind, aber dennoch können einige experimentelle Abweichungen auftreten.
  • Beispiel 1: Gewinnung von Methylphäophorbid (5) aus Spirulina platensis
    • (A) Ein Gemisch von 20 g Spirulina platensis, 60 ml Methanol und 10 ml konzentrierter Schwefelsäure wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt, mit 30 ml Methanol verdünnt und dann durch eine Schicht Celite filtriert. Der Inhalt des Filtertrichters wird mit Methanol gewaschen (70 ml). Die erhaltene Lösung wird mit Hexan extrahiert (2 × 30 ml), mit Chloroform verdünnt (100 ml) und dann zu einer gesättigten Natriumchloridlösung hinzugegeben (300 ml). Das entstandene Gemisch wird durch eine Schicht Celite filtriert und die wässerige Phase mit Chloroform extrahiert (2 × 50 ml). Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, durch Baumwolle filtriert und aufkonzentriert. Der Rückstand wird in einem Gemisch aus Chloroform-Hexan (1:1, 30 ml) gelöst und dann durch eine Schicht Aluminiumoxid filtriert, wobei zuerst mit Hexan gewaschen wird (um unpolare Nicht-Chlorin-Komponenten zu entfernen) und dann mit Dichlormethan (um Methylphäophorbid zu extrahieren). Die Methylenchloridlösung wird aufkonzentriert und der Rückstand wird zuerst aus Dichlormethan-Methanol (3 ml + 7 ml), dann noch einmal aus Dichlormethan-Methanol (1 ml + 10 ml) umkristallisiert und anschließend mit Methanol (10 ml) gewaschen, um 113 mg reines Methylphäophorbid a (5) zu erhalten. 1H-NMR-Spektrum: 9,41, 9,23, 8,56 (3H, alle s, meso-H); 7,88 (1H, q, -CH=CH2), 6,25 – 6,10 (2H, -CH=CH 2), 6,28 (1H, s, Cyclopentanon-H), 4,50, 4,25 (2H, m, 7-H, 8-H); 3,55 (2H, q, 4-CH 2CH3); 3,93, 3,70, 3,63, 3,39, 3,15 (15H, alle s, 5 × -CH3); 2,75 – 2,20 (4H, m, -CH 2CH 2COOCH3); 1,85 (3H, d, 8-CH 3); 1,71 (3H, m, 4-CH2CH 3); 0,55 und –1,68 ppm (2H, 2 breite s, 2 × -NH-). Das Produkt ist identisch mit derselben Verbindung, die von Porphyrin Products Inc., USA bezogen wurde.
    • (B) Ein Gemisch von 10 g Spirulina platensis, 30 ml Methanol und 5 ml konzentrierter Schwefelsäure wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt, mit kaltem Wasser (70 ml) verdünnt und dann durch eine Schicht Celite filtriert. Der Inhalt des Filtertrichters wird mit Wasser bis pH 7 gewaschen, dann mit Ethanol (50 ml), Hexan (4 × 30 ml) und das gewünschte Methylphäophorbid wird aus dem Inhalt des Filtertrichters mit Aceton extrahiert (120 ml). Die erhaltene Lösung wird aufkonzentriert, in Chloroform gelöst, durch eine Schicht Natriumsulfat filtriert und erneut aufkonzentriert. Der Rückstand wird zuerst aus Dichlormethan-Methanol (1.5 ml + 5 ml), dann noch einmal aus Dichlormethan-Methanol (1.5 ml + 10 ml) umkristallisiert und anschließend mit Methanol (15 ml) gewaschen, um 60 mg reines Methylphäophorbid a (5) zu erhalten.
    • (C) Schwefelsäure (konz., 250 ml) wurde zu einer Suspension von 500 g Spirulina platensis in Methanol (1500 ml) bei Raumtemperatur unter Rühren hinzugegeben. Das gebildete Gemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur gehalten, dann in Wasser (6 l) eingegossen und durch eine Schicht Celite filtriert (Durchmesser 12 cm, Höhe 2 cm, Filter Schott N3). Der Rückstand auf dem Filter wurde mit Wasser gewaschen (3 × 800 ml, bis pH 6), dann mit Ethanol (3 × 300 ml) und mit Petrolether (Sdp. 40 – 60°C, 3 × 250 ml). Als nächstes wurde das Zielprodukt vom Filter mit Aceton (insgesamt 1,21) herunter gewaschen, aufkonzentriert, in Chloroform gelöst (200 ml), durch Baumwolle filtriert und wieder im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde aus einem Gemisch aus Dichlormethan (40 ml) und Methanol (200 ml) umkristallisiert, um 2,45 g Methylphäophorbid a in 90%iger Reinheit (TLC in CHCl3/Aceton, 95:5) zu erhalten. Dieses wurde in Chloroform gelöst (20 ml) und durch eine Schicht Aluminiumoxid (neutral, Grad II, Durchmesser 8 cm, Höhe 5 cm) filtriert (Nachwaschen mit Chloroform), aufkonzentriert und dann aus einem Gemisch aus Dichlormethan (50 ml) und Methanol (250 ml) umkristallisiert. Es wurden 2,38 g reines (TLC Kontrolle) Methylphäophorbid a erhalten. Zusätzliche Mengen an Methylphäophorbid a können durch Standard-Aufarbeitung (Chromatographie und Umkristallisation) der Mutterlaugen der beiden Umkristallisationen erhalten werden.
  • Beispiel 2: Gewinnung von Ethylphäophorbid (6) aus Spirulina platensis
  • Die Ethanolyse von 20 g Spirulina platensis in 60 ml 96%igem Ethanol und 10 ml konzentrierter Schwefelsäure und anschließender Aufarbeitung wie in Beispiel 1(A) für die Darstellung von Methylphäophorbid a (5) beschrieben, nur dass in allen Schritten Ethanol statt Methanol verwendet wurde, ergab 110 mg kristallines Ethylphäophorbid a (6). 1H-NMR-Spektrum: 9,57, 9,42, 8,61 (3H, alle s, meso-H); 7,99 (1H, q, -CH=CH2), 6,32, 6,26 (2H, dd, -CH=CH 2), 6,27 (1H, s, Cyclopentanon-H), 4,51, 4,28 (2H, m, 7-H, 8-H); 4,07 (2H, q, -COOCH 2CH3); 3,71 (2H, q, 4-CH 2CH3); 3,89, 3,72, 3,41, 3,27 (12H, alle s, 4 × -CH3); 2,69, 2,47, 2,37, 2,22 (4H, m, -CH 2CH 2COOCH2CH3); 1,83 (3H, d, 8-CH 3); 1,73 (3H, t, 4-CH2CH 3); 1,12 (3H, t, -COOCH2CH 3); 0,57, –1,46 ppm (2H, 2 breite s, 2 × -NH-).
  • Beispiel 3: Gewinnung von Methylphäophorbid a (5) aus Spirulina maxima
  • Die Behandlung von 10 g Spirulina maxima mit 30 ml Methanol und 5 ml konzentrierter Schwefelsäure und anschließender Aufarbeitung wie für die Darstellung von Methylphäophorbid a (5) in Beispiel 1B beschrieben ergab 64 mg reines Methylphäophorbid a (5).
  • Beispiel 4: Gewinnung von Methylphäophorbid a (5) and b (17) aus Chlorella
  • 10 g trockene Chlorella-Biomasse wurden einer Methanolyse und anschließenden Aufarbeitung gemäß dem Beispiel 3 unterworfen, um ein Gemisch (140 mg) der Methylphäophorbide a und b in einem Verhältnis von 20:7 zu erhalten (Bestimmung des Verhält nisses mit 1H-NMR-Spektroskopie). Eine Säulenchromatographie des erhaltenen Gemisches mit Silicagel 60 (Fluka, 70 – 230 mesh), Eluierung mit Chloroform-Toluen-Aceton 15:30:1.5 ergab die beiden einzelnen Methylphäophorbide a (5) und b (17). Das Methylphäophorbid a (5) war mit dem in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Produkt identisch. 1H-NMR-spektroskopische Daten von Methylphäophorbid b (17): 11,0 (1H, s, CHO), 10,22, 9,50, 8,55 (3H, alle s, meso-H); 7,98 (1H, q, -CH=CH2), 6,40 – 6,15 (2H, -CH=CH 2), 6,25 (1H, s, Cyclopentanon-H), 4,48, 4,20 (2H, m, 7-H, 8-H); 3,60 (2H, q, 4-CH 2CH3); 3,93, 3,78, 3,75, 3,40 (12H, alle s, 4 × -CH3); 2,75 – 2,20 (4H, m, -CH 2CH 2COOCH3); 1,85 (3H, d, 8-CH 3); 1,71 (3H, m, 4-CH2CH 3); 0,48 und –1,60 ppm (2H, 2 breite s, 2 × -NH-).
  • Beispiel 5: Gewinnung von Methylphäophorbid a (5) und b (17) aus pulverisierten trockenen Brennnesselblättern
  • Die Methanolyse von 500 g trockenen und pulverisierten Brennnesselblättern und anschließende Aufarbeitung wie in Beispiel 1C beschrieben ergab ein Gemisch (1,74 g) der Methylphäophorbide a (5) und b (17) in einem Verhältnis von 6.5:1 (Bestimmung des Verhältnisses mit 1H-NMR-Spektroskopie).
  • Beispiel 6: Gewinnung von Methylphäophorbid a (5) und b (17) aus gefrorenen Spinatblättern
  • Schwefelsäure (konz., 5 ml) wurde bei Raumtemperatur zu einer Mischung von 100 g gefrorenen Spinatblättern und Methanol (100 ml) unter Rühren hinzugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 16 h bei Raumtemperatur gehalten, dann mit Wasser verdünnt (100 ml) und durch Celite filtriert. Der Rückstand wurde mit Aceton gewaschen (3 × 50 ml), die Aceton-Extrakte wurden mit Dichlormethan-Wasser (1:1, 100 ml) verdünnt, die organische Phase wurde abgetrennt und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde einer Methanolyse in 100 ml 5%iger Schwefelsäure in Methanol unterworfen, und die anschließende Aufarbeitung gemäß dem Beispiel 1(C) ergab 40 mg eines Gemisches der Methylphäophorbide a (5) und b (17) in einem Verhältnis von 2:1 (Bestimmung des Verhältnisses mit 1H-NMR-Spektroskopie).
  • Beispiel 7: Darstellung von Methyl 2-devinyl-2-(1-ethoxyethyl)-phäophorbid a (18)
  • 3,5 g (5,8 mmol) Methylphäophorbid a (5) wurden in einem Gemisch von Bromwasserstoff und Essigsäure (d 1,44, 50 ml) gelöst und für 18 h stehen gelassen. Das Gemisch wurde dann im Vakuum bei 50°C bis zur Trockne eingeengt, dann wurden 100 ml absolutes Ethanol hinzugegeben. Nach 18 h wurde das Reaktionsgemisch unter Rühren auf zerstoßenes Eis gegossen und mit Dichlormethan extrahiert (3 × 40 ml). Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen (4 × 70 ml) und dann im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Säulenchromatographie auf Kieselgel (40 – 63 μm, Merck) mit Dichlormethan als Elutionsmittel ergab 2,95 g des Produktes (18), Ausbeute 77%. 1H-NMR-Spektrum: 9,82, 9,58, 8,55 (3H, alle s, meso-H); 6,31 (1H, s, 10-H), 5,96 (1H, q, 2-CHCH3); 4,53, 4,25 (2H, m, 7-H, 8-H); 3,71 (4H, dq, 4-CH 2CH3, -OCH 2CH3); 3,93, 3,87, 3,63, 3,41, 3,28 (15H, alle s, 5 × -CH3); 2,67, 2,51, 2,37, 2,23 (4H, m, -CH 2CH 2COOCH3); 2,11 (3H, d, 2-CHCH 3); 1,80 (3H, d, 8-CH 3); 1,75 (3H, t, 4-CH2CH 3); 1,36 (3H, t, -OCH2CH3); 0,55, –1,41 (2H, 2 breite s, 2 × -NH-).
  • Beispiel 8: Darstellung von Chlorin e6 (7)
  • Eine wässerige KOH-Lösung (entgast, 10%ige Lösung, 10 ml) wurde unter Argon zu einer gerührten Lösung von 140 mg (231 μmol) Methylphäophorbid a (5) in mit Helium entgastem Aceton (12 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 40 min bei 40°C gerührt, auf 65°C erwärmt, und dann wurde eine 3%ige Lösung von Kaliumhydroxid (hergestellt aus 5 ml entgaster 10%iger wässeriger Kaliumhydroxidlösung und 11 ml entgastem Wasser) hinzugegeben. Die entstandene Lösung wurde für 2,5 h unter Argon gerührt und auf 65°C erwärmt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 100 ml Wasser verdünnt und mit 2 N Salzsäure (12 ml) angesäuert. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt (3 min bei 5000 U/min), bei erneutem Zentrifugieren mit Wasser gewaschen (3 × 30 ml), in 10 ml Wasser resuspendiert und gefriergetrocknet, um Rohchlorin e6 als freie Säure zu erhalten (120 mg, 87%, ~ 90% Reinheit, überprüft durch TLC). TLC: RP-18-TLC-Platten (Merck), MeOH-CH2Cl2 (3:1), Rf 0,6; Begleiter: polarere Verunreinigungen mit Rf < 0,3. Endreinigung: 20 mg Rohchlorin e6 wurden in MeOH-CH2Cl2-Wasser (3:1:1, 4 ml) gelöst und per MPLC auf einer RP-18-Säule chromatographiert (Merck, #11447, 240 × 10, 40 – 63 μm), Eluierung mit MeOH-CH2Cl2-Wasser (4:3:1, 2 ml/min), um reines Chlorin e6 (7) (15 mg, 75%) zu erhalten. Eine begleitende Verunreinigung wurde mit MeOH-CH2Cl2 (3:1) eluiert. 1H-NMR-Spektrum (DMSO-d6): 9,88, 9,78, 9,18 (3H, alle s, meso-H); 8,33 (1H, dd, -CH=CH2); 6,47 (1H, d, cis-CH=CH 2); 6,22 (1H, d, trans-CH=CH 2); 5,38 (2H, m, -CH 2COOH); 4,62 (1H, m, -CHCH3); 4,48 (1H, m, -CHCH2); 3,83 (2H, m, -CH 2CH3); 3,59, 3,53, 3,33 (9H, all s, -CH 3); 2,62, 2,27, 2,14, (4H, m, -CH 2CH2COOH); 1,70, 1,66 (6H, m, -CHCH 3 + -CH2CH 3); 1,64, –1,90 (2H, 2 breite s mit unterschiedlicher Intensität, 2 × -NH-). 13C-NMR-Spektrum (DMSO-d6) nur charakteristische Signale: 174,15, 173,46, 172,34 (COOH); 129,21 (-CH=CH2); 122,25 (-CH=CH2); 103,74 (γ); 101,12 (β); 98,09 (α); 94,67 (δ); 52,66 (CHCH2); 48,19 (CHCH3); 37,80 (-CH2COOH); 30,82, 29,50 (-CHCH2 CH2COOH); 22,92 (CHCH3); 18,91 (CH2 CH3); 17,58 (CH2CH3); 11,00, 10,98 (ArMe).
  • Beispiel 9: Herstellung des wasserlöslichen Salzes von Chlorin e6 (7) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
    • (A) Eine Lösung von N-Methyl-D-glucamin (10) 4 mg, 21 μmol) in Wasser (4 ml) wurde zu einer Lösung von 5 mg (8.4 μmol) Chlorin e6 (7) in MeOH-CH2Cl2 (3:1, 20 ml) (oder in Aceton) hinzugegeben, und die organischen Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt. Die erhaltene wässerige Lösung wurde durch eine Membran filtriert (20 μm) und gefriergetrocknet, um quantitativ das wasserlösliche Salz zu erhalten (9 mg, dies schließt einen Überschuss von N-Methyl-D-glucamin ein).
    • (B) Eine 10%ige wässerige entgaste Lösung von Kaliumhydroxid (10 ml) wurde zu einer Lösung von 50 mg Methylphäophorbid a (5) in entgastem Aceton (12 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 30 min bei 40°C unter Inertgasatmosphäre (Argon) gerührt, anschließend wurden 15 ml einer 3%igen wässerigen entgasten Lösung von Kaliumhydroxid hinzugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 2 h bei 65°C unter Inertgasatmosphäre (Argon) gerührt, mit Wasser verdünnt (100 ml), und das Chlorin e6 (7) wurde durch Zugabe von 2 N wässeriger HCl-Lösung (bis zu pH 6) ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren (5 min bei 3000 U/min) abgetrennt, mit Wasser gewaschen (3 × 10 ml), wobei eine feuchte Masse von Chlorin e6 erhalten wurde, die für die nächste Stufe ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde. Die gesamte erhaltene Menge an Chlorin e6 (7) wurde unter Argon mit N-Methyl-D-glucamin (10) (30 mg, 2 Äquiv.) und Wasser (10 ml) gemischt, um eine etwa 5%ige Lösung des wasserlöslichen Salzes zu erhalten. Das erhaltene Gemisch wurde gerührt, bis es sich vollständig auflöste, bis zur Trockne eingeengt und dann per HPLC auf einer RP C-8-Säule mit einem Wasser-Methanol-Gradienten (von 40% bis 80%) chromatographiert. Die Fraktionen mit dem Zielprodukt wurden gesammelt und lyophilisiert, um das wasserlösliche Bis-Salz mit etwa 75 – 80% Ausbeute zu erhalten. Die Struktur wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestätigt. Speziell das 1:2 Verhältnis von Chlorin e6 (7) zu den N-Methyl-D-glucamin-(10)-Resten wurde durch die Integration der Signale der N-Me-Gruppe der Glucaminkomponente (bei 2,70 ppm) und der 8-Me-Gruppe der Chlorineinheit (bei 1,75 ppm) bestätigt.
    • (C) Das Gemisch aus 50 mg (84 μmol) gepulvertem Chlorin e6 (7), 40 mg (0,21 mmol), N-Methyl-D-glucamin (10) und Wasser (50 ml, vorher mit Inertgas entgast) wurde unter Argon im Dunkeln gerührt, bis es sich vollständig auflöste. Die entstandene Lösung wurde durch eine Membran (20 μm) filtriert und gefriergetrocknet, um quantitativ das wasserlösliche Salz zu erhalten (90 mg, dies schließt einen Überschuss von N-Methyl-D-glucamin ein).
  • Beispiel 10: Herstellung von 2-Devinyl-2-(1-ethoxyethyl)-chlorin e6 (19).
  • Methyl-2-devinyl-2-(1-ethoxyethyl)-phäophorbid a (18) (2,8 g, 4,1 mmol) wurde wie für die Herstellung von Chlorin e6 beschrieben verseift (Beispiel 8), um nach Säulenchromatographie 2,1 g des Produktes (19) zu erhalten, Ausbeute 79%. 1H-NMR-Spektrum (DMSO-d6): 9,88, 9,78, 9,18 (3H, alle s, meso-H); 6,47 (1H, d, cis-CH=CH 2); 6,22 (1H, d, trans-CH=CH 2); 5.5.1 (2H, m, -OCH 2CH3); 5,38 (2H, m, -CH 2COOH); 4,62 (1H, m, -CHCH3); 4,48 (1H, m, -CHCH2); 4,29 (1H, q, -CHCH3); 3,83 (2H, m, -CH 2CH3); 3,59, 3,53, 3,33 (9H, alle s, -CH 3); 2,62, 2,27, 2,14, (4H, m, -CH 2CH 2COOH); 1,83 (1H, d, -CH(O-)CH 3); 1,70, 1,66 (6H, m, -CHCH 3 + -CH2CH 3); 1,54 (3H, t, -OCH2CH 3); –1,90 (2H, 2 breite s mit unterschiedlicher Intensität, 2 × -NH-). 13C-NMR-Spektrum (DMSO-d6) nur charakteristische Signale: 174,15, 173,46, 172,34 (COOH); 129,21 (-CH=CH2); 103,74 (γ); 101,12 (β); 98,09 (α); 94,67 (δ); 67,97 (-CH(O-)CH3); 63,49 (-OCH2CH3); 52,66 (CHCH2); 48,19 (CHCH3); 37,80 (-CH2COOH); 30,82, 29,50 (-CHCH2 CH2COOH); 22,92 (CHCH3); 20,20 (-CH(O-)CH3); 18,91 (CH2CH3); 17,58, 15,23 (CH2CH3 + -OCH2 CH3); 11,00, 10,98 (ArMe).
  • Beispiel 11: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Chlorin-e6-Derivates (19) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Die Reaktion von 30 mg 2-Devinyl-2-(1-etoxyethyl)-chlorin e6 (19) mit 20 mg N-Methyl-D-glucamin (10) wie in Beispiel 9(C) beschrieben ergab quantitativ 50 mg des gefriergetrockneten Salzes.
  • Beispiel 12: Herstellung von Bis[2-(β-maltosyloxy)ethyl]amin (11)
  • Eine Lösung von Per-O-acetyl-maltosylbromid (500 mg, 0,7 mmol), N-Benzyloxycarbonyl-N,N-bis(2-hydroxyethyl)amin (56 mg, 0,233 mmol) und 2,4,6-Trimethylpyridin (80 μl, 0,605 mmol) wurde tropfenweise zu einem gerührten Gemisch von Silbertrifluormethanesulfonat (208 mg, 0,805 mmol) und 1,5 ml absolutem CH2Cl2 bei –20°C hinzugegeben. Man ließ das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen, dann wurde es mit 0,5 ml Triethylamin behandelt, mit 200 ml Dichlormethan verdünnt, mit einer gesättigten wässerigen Lösung von Na2S2O3 (50 ml) und Wasser (50 ml) gewaschen, aufkonzentriert und in Ethyl acetat-Petrolether (1:1) Flash-chromatogaphiert, um das rohe N-Benzyloxycarbonyl-N,N-bis[2-(hepta-O-acetyl-β-maltosyloxy)ethyl]amin (57 mg) zu erhalten. Ausgewählte strukturspezifische 13C-NMR-Daten (500 MHz, CDCl3): 20,41 (CH3CO); 46,92, 47,24, 48,00 und 48,02 (OCH2CH2N und OCH2 CH2N); 61,30, 61,50, 61,98, und 62,52 (C-6 der Glucoseeinheiten); 67,18 (NCOOCH2C6H5); 67,81, 68,33, 69,14, 69,84, 72,02, 72,55, 75,10 (C-2 – C-5 der Glucoseeinheiten); 95,38 (C-1 der α-Glucoseeinheiten); 100,18 und 101,10 (C-1 der β-Glucoseeinheiten); 127,73, 128,01 und 128,40 (OCH2 C 6H5); 164,00 (NCOO); 169,24, 169,42, 169,76, 169,98, 170,35 (CH3 CO). [α]D 38,9° (c1, Ethylacetat). Das erhaltene Produkt wurde in 0,1 M Natriummethylat in absolutem Methanol gelöst und 2 Stunden gerührt, dann wurde es mit einem Ionenaustauscher-Harz KU-2(H+) neutralisiert und filtriert. Das Filtrat wurde über Nacht einer Hydrierung mit Pd/C unterworfen, filtriert und gefriergetrocknet, um 23 mg von Verbindung (11) zu erhalten, [α]D 71° (c1, Wasser). Ausgewählte strukturspezifische 13C-NMR-Daten (500 MHz, D O): 48,74 (OCH2 CH2N), 50,85 (OCH2CH2N); 61,72 (C-6 der α-Glucoseeinheiten), 61,92 (C-6 der β-Glucoseeinheiten), 77,28 (C-4 der β-Glucoseeinheiten); 100,83 (C-1 der α-Glucoseeinheiten); 103,40 (C-1 der β-Glucoseeinheiten).
  • Beispiel 13: Herstellung des wasserlöslichen Salzes von Chlorin e6 (7) mit Bis[2-(β-maltosyloxy)ethyl]amin (11).
  • Die Reaktion von 5 mg Chlorin e6 (7) mit 18,6 mg des Amins (11), wie in Beispiel 9(C) beschrieben, ergab quantitativ nahezu 23 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes.
  • Beispiel 14: Gewinnung von Methylmesophäophorbid a (37)
  • Methylphäophorbid a (5) (130 mg, 0,2 mmol) wurde in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und bei ~ 1 atm H2 über 30 mg 10% Pd(OH)2 auf Kohlenstoff für 1 Stunde bei Raumtemperatur hydriert. Der Katalysator wurde abflitriert und die Lösung wurde aufkonzentriert, um reines Methylmesophäophorbid a (37) zu erhalten (125 mg, quantitativ).
  • Beispiel 15: Gewinnung von Mesochlorin e6 (20)
  • Alkalische Hydrolyse von Methylmesophäophorbid a (37) (20 mg, 0,033 mmol), wie in Beispiel 9(B) beschrieben, ergab Mesochlorin e6 (17 mg, 86%). MS(–)(Elektrospray): 597,3 (M-H).
  • Beispiel 16: Herstellung des wasserlöslichen Salzes von Mesochlorin e6 (20) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Die Reaktion von 15 mg Mesochlorin e6 (20) mit 12 mg N-Methyl-D-glucamin (10), wie in Beispiel 9(C) beschrieben, ergab quantitativ 27 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes.
  • Figure 00260001
  • Beispiel 17: Herstellung des wasserlöslichen Salzes von Phäophorbid a (4) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Methylphäophorbid a (5) (30 mg, 0,049 mmol) wurde in 2 ml 50%iger Schwefelsäure gelöst, und das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde mit eiskaltem Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Die gesammelten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und aufkonzentriert, um rohes Phäophorbid a (4) zu erhalten. Letzteres wurde in 3 ml einer wässerigen N-Methyl-D-glucamin (10) (11,6 mg, 1,2 Äquiv.) Lösung gelöst. Die erhaltene Lösung wurde durch einen 45 μm Filter filtriert und gefriergetrocknet, um 29 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes zu erhalten. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 4): 591,2 (M-H).
  • Beispiel 18: Herstellung des wasserlöslichen Salzes von Dimethylchlorin-e6-dimethylester (21) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Saure Hydrolyse der drei Methylestergruppen von Chlorin e6 Trimethylester (38) [hergestellt nach S. Lötjönen, P.H. Hynninen, Synthesis, 1980, 541 – 543] (25 mg, 0,039 mmol) mit 50%iger Schwefelsäure und Reaktion mit 9 mg N-Methyl-D-glucamin (10) wie in Beispiel 17 beschrieben, ergab 32 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 21): 623,5 (M-H).
  • Beispiel 19: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Mesopyrophäophorbid-a-Derivates (25) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Methylphäophorbid a (5) (1,3 g, 2,09 mmol) wurde in 100 ml Pyridin gelöst und 8 Stunden unter Rückfluss im Dunkeln unter Stickstoff gerührt. Das Pyridin wurde im Vakuum abdestilliert, und der verbleibende Rückstand wurde aus Dichlormethan/Methanol umkristallisiert, um 1,08 g (92%) Methylpyrophäophorbid a (39) zu erhalten. UV/vis λmax (ε) (CH2Cl2): 410 (112500), 509 (11400), 537 (9800), 611 (8500), 669 (47000) nm.
  • Methylpyrophäophorbid a (39) (1,0 g, 1,78 mmol) wurde 100 ml Aceton gelöst und für 2 Stunden bei Raumtemperatur bei ~ 8 –10 atm H2 über 300 mg 10% Pd auf Kohlenstoff hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, und die Lösung wurde aufkonzentriert, um reines Methylmesopyrophäophorbid a (40) zu erhalten (1,0 g, quant.). UV/vis λmax (ε) (CH2Cl2): 408 (136000), 501 (12400), 534 (11800), 603 (10500), 656 (54600) nm; 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): 9,40 (s, 1H, β-meso H), 9,16 (s, 1H, α-meso H), 8,46 (s, 1H, δ-meso H), 5,26 und 5,08 (AB, J = 19,7 Hz, 10-CH2), 4,46 (dq, 1H, J7,8 = 2,0 Hz, 8-H), 4,27 (dt, 1H, 7-H), 3,80 und 3,64 (jeweils q, 4H, J = 7,5 Hz, 2a- und 4a-CH2), 3,63, 3,52, 3,28 und 3,21 (jeweils s, 12H, 1-, 3-, 5-Me und COOMe), 2,80 – 2,20 (m, 4H, 7a,b-CH2CH2), 1,80 (d, 3H, J = 7,3 Hz, 8-Me), 1,71 und 1,63 (jeweils t, 6H, J = 7,5 Hz, 2b- und 4b-Me), 0,60 und –1,60 (jeweils breites s, 2H, NH).
  • Methylmesopyrophäophorbid a (40) (250 mg, 0,443 mmol) wurde in 5 ml 50%iger Schwefelsäure gelöst, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde mit eiskaltem Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Diese Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und aufkonzentriert, um rohes Mesopyrophäophorbid a (36) zu erhalten. Letzteres wurde in 20 ml Dichlormethan gelöst, dann wurden 0,3 ml (2,22 mmol, ~ 5 eq.) Triethylamin hinzugegeben gefolgt von 0,1 ml (0,576 mmol, 1,3 eq.) Pentafluorphenyltrifluoracetat. Das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur gerührt (um Verbindung 41 zu erhalten), 0,5 ml Wasser wurden hinzugegeben gefolgt von der Zugabe der Verbindung 42 (200 mg, Produkt der G1ycoSense AG, Jena, Germany) in 5 ml Dichlormethan. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, mit Dichlormethan verdünnt, dann mit Wasser und 5%iger Schwefelsäure gewaschen, getrocknet und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie auf Kieselgel gereinigt. Eluierung mit Aceton-Dichlormethan (20:80) ergab 290 mg (88%) des Amids 42. UV/vis λmax (ε) (CH2Cl2): 408 (136500), 501 (12300), 534 (11800), 603 (10000), 656 (54500) nm; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 9,41 (s, 1H, β-meso H), 9,20 (s, 1H, α-meso H), 8,47 (s, 1H, δ-meso H), 6,08 (br s, 1H, CONH), 5,26 und 5,08 (AB, J = 19,7 Hz, 10-CH2), 4,51 (br q, 1H, 8-H), 4,32 (br d, 1H, 7-H), 3,82 und 3,66 (jeweils q, 4H, J = 7,5 Hz, 2a- und 4a-CH2), 3,78 (s, 2H, OCH 2COOMe), 3,63, 3,32 und 3,21 (jeweils s, 9H, 1-, 3- und 5-Me), 3,52 (s, 3H, COOMe), 3,28 (br s, 12H, NHCH 2CH 2OCH2CH 2OCH 2CH 2O), 2,80 – 1,90 (m, 4H, 7a,b-CH2CH2), 1,80 (d, 3H, J = 7.3 Hz, 8-Me), 1,72 und 1,68 (jeweils t, 6H, J = 7.5 Hz, 2b- und 4b-Me), 0,70 und –1,60 (jeweils br s, 2H, NH). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 196,3, 172,4, 172,3, 160,2, 155,2, 150,3, 149,0, 145,0, 142,3, 141,6, 137,3, 136,9, 135,6, 131,3, 130,1, 127,8, 105,9, 104,1, 95,8, 92,5, 70,5, 70,2, 69,9, 69,6, 68,2, 51,6, 50,1, 48,0, 39,1, 39,0, 32,6, 30,2, 23,1, 19,5, 19,4, 17,5, 17,0, 12,0, 11,3, 11,0.
  • Das Amid 42 (195 mg, 0.263 mmol) wurde in 4 ml 50%iger Schwefelsäure gelöst und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gelöst, anschließend wurde mit eiskaltem Wasser verdünnt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt (3 min bei 5000 U/min), mit Wasser bis pH 7gewaschen (2 × 50 ml) (Bildung von 25) und in einem Gemisch aus Aceton (50 ml), Methanol (15 ml) und Wasser gelöst (6 ml). N-Methyl-D-glucamin (10) (56 mg, 0,29 mmol, 1.1 Äquiv.) wurde zu dieser Lösung hinzugegeben. Die entstandene Lösung wurde bei 40°C im Vakuum aufkonzentriert (~ 20 mmHg), um die organischen Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand des Aufkonzentrierens wurde in 40 ml Wasser gelöst, durch einen 45 μm-Filter filtriert und gefriergetrocknet, um 239 mg des wasserlöslichen Salzes zu erhalten. UV/vis λmax (ε) (H2O): 375 (46550), 514 (5750), 548 (5750), 608 (6320), 660 (21260) nm. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 25): 724,7 (M-H).
  • Figure 00290001
  • Beispiel 20: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Bakteriophäophorbidderivates (29) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • 0,5 ml Pyridin wurden zu einer gerührten Lösung von Methylmesopyrophäophorbid a (40) (650 mg, 1,152 mmol) in 130 ml Dichlormethan hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von 600 mg (2,361 mmol, 2,05 Äquiv.) Osmiumtetroxid. Das Reaktionsgemisch wurde 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde für 5 min H2S durch die Lösung geleitet, um das Osmat in das freie Diol zu überführen (44). Das Gemisch wurde auf Kieselgel getrennt. Eluierung mit Aceton-Chloroform (5:95) ergab das Startmaterial 40 (190 mg, 29%). Eluierung mit Aceton-Chloroform (15:85) ergab das Diol (44) (350 mg, 51%). Letzteres wurde bei Raumtemperatur für 30 min mit 20 ml konzentrierter H2SO4 behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit eiskaltem Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden mit wässerigem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel gereinigt. Eluierung mit Aceton-Chloroform (1:99) ergab das Keton (45) (180 mg, 27% bezogen auf (40)) [vgl. R.K. Pandey et al., J. Org. Chem., 1997, 62, 1463 – 1472]. Das letztere wurde in 5 ml 50%iger Schwefelsäure gelöst, das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit eiskaltem Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und aufkonzentriert, um das Rohprodukt 46 zu erhalten. Dieses wurde in 20 ml Dichlormethan gelöst, 0,2 ml (1,58 mmol, ~ 5 Äquiv.) Triethylamin wurden hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von 70 μL (0,411 mmol, 1,3 Äquiv.) Pentafluorphenyltrifluoracetat. Das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur gerührt (um 47 zu erhalten), und dann wurden 0,5 ml Wasser hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe einer Lösung der Verbindung 42 (150 mg, Produkt der G1ycoSense AG, Jena, Germany) in 5 ml Dichlormethan. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, mit Dichlormethan verdünnt, mit Wasser und 5%iger Schwefelsäure gewaschen, getrocknet und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie auf Kieselgel gereinigt. Eluierung mit Aceton-Dichlormethan (20:80) ergab 205 mg (85%) des Amids (48). UV/vis λmax (ε) (CH2Cl2): 394 (42300), 412 (44100), 506 (7650), 539 (9100), 597 (4500), 652 (15750), 712 (30600) nm; 1H-NMR (250 MHz, CDCl3): 9,18, 8,72, 8,50 (jeweils s, 3H, meso H), 6,10 (br s, 1H, CONH), 5,20 (m, 2H, 10-CH2), 4,50 und 4,30 (beide m, 2H, 8-H und 7-H), 3,88 (s, 2H, OCH 2COOMe), 3,58, 3,41 und 3,21 (jeweils s, 9H, 1-, 3- und 5-Me), 3,51 (s, 3H, COOMe), 3,30 (br s, 12H, NHCH 2CH 2OCH 2CH 2OCH 2CH 2O), 2,80 – 1,90 (m, 4H, 7a,b-CH2CH2), 1,90 – 1,65 (m, 6H, 2 × CH2CH 3), 0,5 (m, 3H, CH2CH 3), –0,10 und –1,70 (jeweils br s, 2H, NH). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 201,4, 199,2, 172,3, 171,7, 153,3, 141,0, 137/2, 98,2, 95,0, 91,3, 89,7, 87,1, 79,4, 70,7, 70,4, 70,1, 69,8, 68,4, 53,4, 51,8, 49,9, 48,0, 39,3, 36,2, 32,9, 32,1, 30,5, 28,5, 25,9, 23,2, 19,3, 16,9, 11,9, 11,0, 9,0, 8,1.
  • Das Amidderivat (47) (205 mg, 0,270 mmol) wurde in 4 ml 50%iger Schwefelsäure gelöst und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann mit eiskaltem Wasser verdünnt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt (3 min bei 5000 U/min), mit Wasser bis pH 7 gewaschen (2 × 50 ml) (um 29 zu erhalten) und in einem Gemisch aus Aceton (50 ml), Methanol (15 ml) und Wasser (6 ml) gelöst. N-Methyl-D-glucamin (10) (56 mg, 0,29 mmol, 1,1 Äquiv.) wurde zu dieser Lösung hinzugegeben. Die entstandene Lösung wurde bei 40°C im Vakuum (~ 20 mmHg) aufkonzentriert, um die organischen Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde in 40 ml Wasser gelöst, durch einen 45 μm-Filter filtriert und die Lösung wurde bei 40°C im Vakuum (~ 20 mmHg) aufkonzentriert (~ 1 mmHg), um 240 mg des wasserlöslichen Salzes zu erhalten. UV/vis λmax (ε) (H2O): 420 (40400), 515 (5380), 561 (6150), 668 (9610), 776 (51200) nm. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 29): 740,7 (M-H).
  • Beispiel 21: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Phäophorbid-a-derivates (22) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Phäophorbid a (4) (17 mg, 0,028 mmol) wurde mit Pentafluorphenyltrifluoracetat (15 μl) aktiviert, gefolgt von der Reaktion mit Verbindung 42 (25 mg, Produkt der GlycoSense AG, Jena, Germany) in Gegenwart eines Überschusses von Triethylamin. Anschließende saure Hydrolyse mit 50%iger Schwefelsäure und Reaktion mit 6,5 mg N-Methyl-D-glucamin (10), wie in Beispiel 19 beschrieben, ergab 23 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 22): 780,1 (M-H).
  • Beispiel 22: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Pyrophäophorbid-a-Derivates (23) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Saure Hydrolyse von Methylpyrophäophorbid a (39) (15 mg) mit 50%iger Schwefelsäure, Aktivierung des Produktes mit Pentafluorphenyltrifluoracetat (15 μl) und Reaktion mit Verbindung 42 (25 mg, Produkt der GlycoSense AG, Jena, Germany) in Gegenwart eines Überschusses von Triethylamin, gefolgt von saurer Hydrolyse mit 50%iger Schwefelsäure und Reaktion mit 6 mg N-Methyl-D-glucamin (10), wie in Beispiel 19 beschrieben, ergab 19 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 23): 722,1 (M-H).
  • Beispiel 23: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Mesophäophorbid-a-Derivates (24) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Saure Hydrolyse von Methylmesophäophorbid a (37) (16 mg) mit 50%iger Schwefelsäure, Aktivierung des Produktes mit Pentafluorphenyltrifluoracetat (15 μl) und Reaktion mit Verbindung 42 (25 mg, Produkt der GlycoSense AG, Jena, Germany) in Gegenwart eines Überschusses von Triethylamin, gefolgt von saurer Hydrolyse mit 50%iger Schwefelsäure und Reaktion mit 6 mg N-Methyl-D-glucamin (10), wie in Beispiel 19 beschrieben, ergab 18 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 24): 782,2 (M-H).
  • Beispiel 24: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Mesopyrophäophorbid-a-Derivates (26) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Aktivierung von Mesopyrophäophorbid a (36) (20 mg, 0,034 mmol) mit Pentafluorphenyltrifluoracetat (20 μl), gefolgt von der Reaktion mit Verbindung 49 (40 mg, Produkt der G1ycoSense AG, Jena, Germany) in Gegenwart eines Überschusses von Triethylamin und Reaktion mit 7 mg N-Methyl-D-glucamin (10), wie in Beispiel 19 beschrieben, ergab 32 mg gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 26): 856,7 (M-H).
  • Beispiel 25: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Mesopyrophäophorbid-a-Derivates (27) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Aktivierung von Mesopyrophäophorbid a (36) (15 mg, 0,026 mmol) mit Pentafluorphenyltrifluoracetat (15 μl) gefolgt von der Reaktion mit 20 mg Glycinmethylester in Gegenwart eines Überschusses von Triethylamin, gefolgt von Hydrolyse mit 50%iger Schwefelsäure und Reaktion mit 5 mg N-Methyl-D-glucamin (10), wie in Beispiel 19 beschrieben, ergab 19 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 27): 592,6 (M-H).
  • Beispiel 26: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Mesopyrophäophorbid-a-Derivates (28) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Aktivierung von Mesopyrophäophorbid a (36) (14 mg, 0,024 mmol) mit Pentafluorphenyltrifluoracetat (15 μl), anschließende Reaktion mit 25 mg ε-Aminocapronsäuremethylester in Gegenwart eines Überschusses von Trietylamin, gefolgt von saurer Hydrolyse mit 50%iger Schwefelsäure und Reaktion mit 5 mg N-Methyl-D-glucamin (10), wie in Beispiel 19 beschrieben, ergab 20 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 28): 648,5 (M-H).
  • Beispiel 27: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Chlorin-e6-Derivates (30) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Ein Gemisch von Methylphäophorbid a (5) (38 mg, 0,063 mmol) und N,N-Dimethyl-1,3-diaminopropan (100 μl) in 1,4-Dioxan (3 ml) wurde 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (um Verbindung 50 zu erhalten). Zu dieser Lösung wurde eine 6M wässerige NaOH-Lösung (0,1 ml) gegeben, und das entstandene Gemisch wurde 10 min am Rückfluss erhitzt. Es wurden 5 ml Wasser hinzugegeben, und das Gemisch wurde weitere 10 min am Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde abgekühlt, mit 30 ml Wasser verdünnt und mit Essigsäure auf pH 4,5 angesäuert. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt (3 min bei 5000 U/min) und mit Wasser gewaschen, um das Disäurederivat (30) zu erhalten. Letzteres wurde in 7 ml einer wässerigen N-Methyl-D-glucamin-Lösung (10) (30 mg, 1,2 Äquiv.) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde durch einen 45 μm-Filter filtriert und gefriergetrocknet, um 62 mg des wasserlöslichen Salzes zu erhalten. MS(+)(Elektrospray) (Säurekomponente 30): 681,3 (M+H).
  • Beispiel 28: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Chlorin-e6-derivates (32) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Eine Lösung von Phäophorbid a (4) (20 mg, 0,033 mmol) und ε-Aminocapronsäuremethylester (50 mg, ~ 10 Äquiv.) in 1,4-Dioxan (3 ml) wurde 120 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan verdünnt, mit 0,5 N wässeriger HCl-Lösung und Wasser gewaschen, getrocknet, aufkonzentriert und durch Flash-Chromatographie auf Kieselgel gereinigt. Eluierung mit 3% MeOH-Dichlormethan ergab 22 mg (88%) des Amidderivates (51). Saure Hydrolyse des Letzteren mit 50%iger Schwefelsäure und anschließende Umsetzung mit 13,5 mg N-Methyl-D-glucamin (10), wie in Beispiel 17 beschrieben, ergab 33 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 32): 722,3 (M-H).
  • Beispiel 29: Herstellung des wasserlöslichen Salzes des Chlorin-e6-Derivates (33) mit N-Methyl-D-glucamin (10)
  • Eine Lösung von Phäophorbid a (4) (20 mg, 0,034 mmol) und 2-Aminoethanol (50 μl) in 1,4-Dioxan (3 ml) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan verdünnt, mit 0,5 N wässeriger HCl-Lösung und Wasser gewaschen, getrocknet, aufkonzentriert, und durch Flash-Chromatographie auf Kieselgel gereinigt. Eluierung mit 3% MeOH-Dichlormethan ergab 20 mg (91%) des Amidderivates 33. Umsetzung mit 8 mg N-Methyl-D-glucamin (10), wie in Beispiel 17 beschrieben, ergab 28 mg des gefriergetrockneten wasserlöslichen Salzes. MS(–)(Elektrospray) (Säurekomponente 33): 652,2 (M-H).
  • Beispiel 30: Bestimmung der Dunkeltoxizität (Cytotoxizität) des wasserlöslichen Chlorin-e6-Salzes (7) mit N-Methyl-D-glucamin (10) (in OV2774-Zellen), hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit dem nach Ponomarev et al. ( RU 2144538 ) hergestellten Salz
  • Um die Cytotoxizität (Dunkeltoxizität) des wasserlöslichen Chlorin-e6-Salzes (7) mit N-Methyl-D-glucamin (10), hergestellt gemäß Beispiel 9(B) der vorliegenden Erfindung (Substanz A) und gemäß dem russischen Patent Nr. 2144538 von Ponomarev (Substanz B), zu bestimmen, wurden OV2774-Zellen (Besiedlungsdichte: 50 – 75 Zellen/mm2 in RPMI-1640 w. P. (mit Phenolrot), 5% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamax I, 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin) mit zunehmenden Konzentrationen von bis zu 50 μM für 24 Stunden inkubiert. Der Zell-Survival wurde nach weiteren 24 Stunden in Sensitizer-freiem Medium unter Verwendung des Neutralrot-Assays bestimmt. Die Werte sind als Prozentsatz bezogen auf die nicht-inkubierten Kontrollproben angegeben. Für jede inkubierte Konzentration wurden drei voneinander unabhängige Experimente mit vier Proben durchgeführt. Die Daten der Experimente sind in 1 wiedergegeben. Substanz A zeigte im Vergleich zu Substanz B eine geringere Cytotoxizität gegenüber OV2774-Zellen. Der Zell-Survival wurde durch Konzentrationen von bis zu 25 μM (Substanz B: 10 μM) nicht wesentlich verringert. Auf der Basis dieser Daten konnte der IC50-Wert (Die Inkubationskonzentration, die das Zellwachstum, verglichen mit den Kontrollen, auf 50% herabsetzt) noch nicht bestimmt werden. Bei der höchsten getesteten Inkubationskonzentration ergab sich ein Zell-Survival größer 80%.
  • Beispiel 31: Bestimmung der Phototoxizität des wasserlöslichen Chlorin-e6-Salzes (7) mit N-Methyl-D-glucamin (10) (in OV2774-Zellen, unter Bestrahlung bei 670 nm), hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit dem nach Ponomarev et al. ( RU 2144538 ) hergestellten Salz
  • Um die Phototoxizität des wasserlöslichen Chlorin-e6-Salzes (7) mit N-Methyl-D-glucamin (10), hergestellt gemäß Beispiel 9 der vorliegenden Erfindung (Substanz A) und gemäß dem russischen Patent Nr. 2144538 von Ponomarev (Substanz B), zu bestimmen, wurden OV2774-Zellen (Besiedlungsdichte: 50 – 75 Zellen/mm2 in RPMI-1640 w/o P. (mit Phenolrot), 5% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamax I, 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin) mit derselben Konzentration wie in den vorhergehenden Experimenten für Substanz B inku biert (10 μM, 24 h). Die Bestrahlung erfolgte bei 670 nm (10 – 25 mW/cm2, 0,1 – 2,5 J/cm2) nach einer zweiten Inkubationsperiode im Medium ohne Photosensibilisator und ohne Phenolrot. Der Zell-Survival wurde unter Verwendung des Neutralrot-Assays bestimmt. Die Werte sind als Prozentsätze bezogen auf die inkubierten, aber nicht bestrahlten Kontrollproben angegeben. Es wurden fünf voneinander unabhängige Experimente mit vier Proben durchgeführt. Die ID50-Werte [Der Energiefluss (die Energiedichte), die das Zellwachstum, verglichen mit den Kontrollen, auf 50% reduziert] der Proben dienten als quantitatives Maß für die Phototoxizität. Die Daten der Experimente sind in 2 wiedergegeben. Die Ergebnisse zeigten eine etwas höhere Phototoxizität von Substanz A verglichen mit Substanz B. Der ID50-Wert war etwa halb so groß wie der von Substanz B (0,1 J/cm2 im Vergleich zu 0,2 J/cm2).
  • Beispiel 32: Bestimmung der Dunkeltoxizität (Cytotoxizität) der wasserlöslichen Salze von Chlorin- (7) und Phäophorbidderivaten [(4), (22) und (25)] mit N-Methyl-D-glucamin (10) in HeLa-Zellen.
  • Um die Dunkeltoxizität der wasserlöslichen Salze von Chlorin e6 (7) und den Phäophorbid-a-Derivaten (4, 22, 25) mit N-Methyl-D-glucamin (10) (hergestellt gemäß den Beispielen 9, 17, 19 und 21) zu bestimmen, wurden HeLa- (Humane-Zervixkarzinom-) Zell-Monoschichtkulturen in 96-well-Platten (Besiedelungsdichte: 7,000 Zellen pro well in Dulbeco-modified essentional medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum) mit zunehmenden Konzentrationen der Photosensibilisatoren (von 2 bis 500 μg/ml) für 48 Stunden inkubiert.
  • Die Zellen wurden mit reinem DMEM gewaschen und 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 10% Formalin behandelt. Die Zellen wurden zweimal mit Wasser gewaschen, 15 Minuten mit einer 0,1%igen Kristallviolettlösung (50 μl/well) inkubiert, dann mit Wasser gewaschen und mit Ethanol behandelt (100 μl/well). Die optischen Dichten der erhaltenen ethanolischen Lösungen wurden mit einem Specord 100 (Analytik Jena AG, Germany) Spektrophotometer bei 594 nm gemessen, um den Zell-Survival zu verfolgen.
  • Die Werte sind als Prozentsätze bezogen auf die nicht-inkubierten Kontrollproben angegeben. Für jede Inkubationskonzentration wurden acht Experimente durchgeführt. Die Daten der Experimente sind in Tabelle 1 angegeben, welche die IC50- und IC80-Werte angibt (Die Inkubationskonzentrationen, die das Zellwachstum, verglichen mit den Kontrollen, auf 50% bzw. 20% herabsetzen).
  • Tabelle 1: Daten zur Dunkeltoxizität (Cytotoxizität) der wasserlöslichen Salze von Chlorin-(7) und Phäophorbidderivaten [(4), (22) und (25)] mit N-Methyl-D-glucamin (10) in HeLa-Zellen Beisiel 33)
    Figure 00360001
  • Beispiel 33: Bestimmung der Phototoxizität der wasserlöslichen Salze von Chlorin- (7) und Phäophorbidderivaten [(4), (22) und (25)] mit N-Methyl-D-glucamin (10) in HeLa-Zellen unter Bestrahlung bei 662 nm.
  • Um die Phototoxizität der wasserlöslichen Salze von Chlorin e6 (7) und den Phäophorbid-a-Derivaten (4, 22, 25) mit N-Methyl-D-glucamin (10) (hergestellt gemäß den Beispielen 9, 17, 19 und 21) zu bestimmen, wurden HeLa-(Humane-Zervixkarzinom-)Zell-Monoschichtkulturen in 96-well-Platten (Besiedelungsdichte: 30,000 Zellen pro well in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum) mit zunehmenden Photosensibilisator-Konzentrationen von 0,01 bis 40 μg/ml inkubiert. Die Bestrahlung wurde bei 662 nm [Ceralas PDT Laser, biolitec AG, Deutschland; 150 mW/cm2, 5 – 20 J/cm2) nach einer 30-minütigen Inkubationsperiode durchgeführt. Der Zell-Survival wurde unter Verwendung des MTT-Assays gemessen. Die Werte sind als Prozentsätze bezogen auf die bestrahlten, aber nicht-inkubierten Kontrollproben angegeben. Die Experimente wurden jeweils mit acht Proben durchgeführt. Die Daten der Experimente sind in Tabelle 2 angegeben; diese zeigt die beobachteten IC50- und IC90-Werte nach Bestrahlung mit 10 J/cm2.
  • Tabelle 2: Daten zur Phototoxizität der wasserlöslichen Salze von Chlorin- (7) und Phäophorbidderivaten [(4), (22) und (25)] mit N-Methyl-D-glucamin (10) in HeLa-Zellen (Beispiel 34)
    Figure 00370001
  • Beispiel 34: Bestimmung der Phototoxizität der wasserlöslichen Salze von Chlorin- (7) und Phäophorbidderivaten [(4), (22) und (25)] mit N-Methyl-D-glucamin (10) in Experimenten zur antimikrobiellen photodynamischen Therapie.
  • Die verwendeten Mikroorganismen waren historische und klinische Bakterienzelllinien von Staphylococcus aureus (ATCC25923), Enterococcus faecalis (ATCC29212) und Candida spp (klinisch).
  • Die Bakterienkolonien wurden auf folgenden festen Medien kultiviert: Staphylococcus aureus auf Staphylococcus Agar 110, Enterococcus faecalis auf der Basis von Columbia Agar mit 5% Pferdeblut, Candida spp auf Saburo Dextrose Agar.
  • Die Ausgangsbakteriensuspension (IBS) wurde in isotonischer NaCl-Lösung gemäß dem McFarland-Standard mit einem Wert von 0,5 – 1,0 (1,5 – 5 × 108 Bakterienzellen in 1 ml) hergestellt, gefolgt von einer Verdünnung 1:100.
  • Zur Kontrolle des Bakterienzell-Counts wurde ein Teil der IBS 1:1000 mit isotonischer NaCl-Lösung verdünnt (auf 10–3 der Ausgangskonzentration), dann wurden drei Teilproben (jeweils 0,1 ml) entnommen und auf separate Petrischalen mit dem für die Mikroorganismen geeigneten Medium aufgebracht. Die Bakterienkolonien wurden 24 Stunden (48 Stunden für Staphylococcus aureus) bei 37°C inkubiert, dann wurden die Kolonien gezählt und ein Mittelwert von jeder der drei Petrischalen wurde als Kontrolle verwendet.
  • A) Kontrolle von Temperatur und Laser-Bestrahlung.
  • 2,0 ml der Ausgangsbakteriensuspension (IBS) wurden 30 min bei 37°C gelagert und dann 1:1000 mit isotonischer NaCl-Lösung verdünnt (auf 10–3 der Ausgangskonzentration), dann wurden drei Teilproben (jeweils 0,1 ml) entnommen und auf separate Petrischalen mit dem für die Mikroorganismen geeigneten Medium aufge bracht. Die Bakterienkolonien wurden 24 Stunden bei 37°C gelagert, dann gezählt und ein Mittelwert von jeder der drei Petrischalen wurde bestimmt und als Kontrolle verwendet.
  • Eine weitere Probe der IBS (2,0 ml) wurde 30 min bei 37°C gelagert und dann mit Laserlicht in 40 mm-Petrischalen (Dicke der Suspensionsschicht: 2 mm) mit einem „Ceralas PDT"-Laser für 210 Sekunden mit einer Ausgangsleistung von 3 W bestrahlt, so dass die Dosis der abgegebenen Lichtenergie etwa 50 J/cm2 betrug. Das Gemisch wurde 1:1000 mit isotonischer NaCl-Lösung verdünnt (auf 10–3 der Ausgangskonzentration), dann wurden drei Teilproben (jeweils 0.1 ml) entnommen und auf separate Petrischalen aufgebracht, kultiviert und dann wie oben beschrieben gezählt.
  • Die Daten in Tabelle 3 [Behandlungsregime B und C gezeigt für (7)] zeigen, dass die Lagerung der IBS für 30 min bei 37°C ohne Photosensibilisator und unter Laserbestrahlung mit einer Dosis von 50 J/cm2 die Bakterienviabilität praktisch nicht beeinflusst.
  • B) Bestimmung der Dunkeltoxizität.
  • 0,5 ml einer Vorratslösung des Photosensibilisators mit einer Konzentration von 500 μg/ml wurden zu 2,0 ml IBS hinzugegeben, um eine Konzentration des Photosensibilisators von 100 μg/ml zu erreichen. Die gebildete Suspension wurde 30 min bei 37°C gelagert, und dann 1:1000 mit isotonischer NaCl-Lösung verdünnt (auf 103 der Ausgangskonzentration). Drei Anteile von jeweils 0,1 ml wurden entnommen, auf drei Petrischalen aufgebracht und dann wie oben beschrieben gezählt.
  • Die Daten in Tabelle 3 zeigen, dass die Photosensibilisatoren der vorliegenden Erfindung unterhalb einer Konzentration von 100 μg/ml bei 30 Minuten Inkubation nahezu keinen dunkeltoxischen Effekt besitzen.
  • C) Bestimmung der Phototoxizität.
  • 0,125 oder 0.5 ml einer Vorratslösung des Photosensibilisators mit einer Konzentration von 500 μg/ml wurden zu 2,0 ml IBS hinzugegeben, um eine Konzentration des Photosensibilisators von 25 bzw. 100 μg/ml zu erreichen. Die gebildeten Suspensionen wurden 30 min bei 37°C gelagert und dann mit einer Dosis von 50 J/cm2 bestrahlt. Drei Teilproben von jeweils 0,1 ml wurden entnommen und auf drei Petrischalen aufgebracht. Anteile der verbliebenen Suspensionen wurden 1:100 oder 1:1000 mit isotonischer NaCl-Lösung verdünnt (auf 10–2 oder 10–3 der Ausgangskonzentration), dann wurden drei Anteile von jeweils 0,1 ml von jeder Verdünnung auf drei Petrischalen aufgebracht und wie oben beschrieben gezählt.
  • Die Daten in Tabelle 3 zeigen die mögliche Anwendbarkeit der wasserlöslichen Salze aus der vorliegenden Erfindung als Photosensibilisatoren für die antimikrobielle photodynamische Therapie. Tabelle 3: Anwendung der wasserlöslichen Salze von Chlorin- (7) und Phäophorbidderivaten [(4), (22) und (25)] mit N-Methyl-D-glucamin (10) in Experimenten zur antimikrobiellen photodynamischen Therapie (Beispiel 34)
    Figure 00400001
    • * Behandlungsregime:
    • A Kontrollbakterien-Count in der verwendeten Ausgangsbakteriensuspension (IBS);
    • B Bakterien-Count nach der Lagerung der IBS für 30 Minuten bei 37°C;
    • C Bakterien-Count nach Bestrahlung mit Laser mit einer Dosis von 50 J/cm2 („Ceralas PDT", 3 W, 210 Sekunden);
    • D Bakterien-Count nach 30-minütiger Inkubation mit Photosensibilisator (Konzentration of 100 μg/ml);
    • E Bakterien-Count nach photodynamischer Behandlung mit einer Konzentration des Photosensibilisators von 25 μg/ml;
    • F Bakterien-Count nach photodynamischer Behandlung mit einer Konzentration des Photosensibilisators von 100 μg/ml.
  • Nachdem bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die Beispiele beschrieben worden sind, versteht es sich von selbst, dass die Erfindung nicht auf diese speziellen Ausführungsformen beschränkt ist, und dass verschiedene Änderungen und Modifikationen von Fachleuten daran vorgenommen werden können, ohne vom Geltungsbereich der Erfindung, so wie er in den beigefügten Patentansprüchen definiert ist, abzuweichen.

Claims (5)

  1. Ein Verfahren, um hochreine wasserlösliche Porphyrinderivate der allgemeinen Formeln 1 oder 2 in pharmazeutischer Qualität herzustellen:
    Figure 00420001
    wobei B ein Ring ist mit der Struktur:
    Figure 00420002
    wobei: R1 = -CH=CH2, -CH(OAlk)CH3, -CHO, -C(O)CH3, -CH2CH3, -CH(Alk)CH(COAlk)2, -CH2CH(COAlk)2, -CH(Alk)CH2COAlk, -CH(Alk)CH2CH(OH)CH3, oder -CH2CH2CH(OH)CH3; R2 = -CH3, -CHO, -CH(OH)Alk, -CH=CHAlk, -CH2OH, oder -CH2OAlk; R3 = -OH, -OAlk, -NH-Alk, NH-X-COO–(HG)+, -NH-Y-NR8R9, oder -NH-Y-OH; R4 = -O–(HG)+, -OAlk, -NH-Alk, oder -NH-X-COO–(HG)+; R5 = -O–(HG)+, -OAlk, -NH-Alk, oder -NH-X-COO–(HG)+; R6 = -H oder -COOAlk; R7 = -O–(HG)+, -OAlk, -NH-Alk, oder -NH-X-COO–(HG)+; R8 = -H oder -Alk; R9 = -H oder -Alk mit: -NH-X-COO– = Reste organischer Aminosäuren; X = Alkylidene, Peptide, Oligopeptide oder -(CH2CH2O)nCH2CH2-, mit n = 1 – 30; Y = Alkylidene oder -(CH2CH2O)nCH2CH2-, mit n = 1 – 30; G = ein hydrophiles organisches Amin (z. B. N-Methyl-D-glucamin oder andere Aminogruppen-enthaltende Kohlenhydrat-Derivate, TRIS, Aminosäuren, Oligopeptide); und Alk = einem Alkyl-Substituenten; beinhaltend die Schritte: a. ein- oder zweistufige direkte saure Alkoholyse von biologischem Ausgangsmaterial, die kristalline Alkyl-Pheophorbide ergibt; b. Umwandlung der erhaltenen Alkyl-Pheophorbide in ein acidisches Porphyrin und c. Reaktion des acidischen Porphyrins mit einem hydrophilen organischen Amin in einem Medium, gewählt aus der Gruppe Wasser und wässrige organische Lösungen.
  2. Ein Verfahren, um hochreine wasserlösliche Porphyrinderivate in pharmazeutischer Qualität herzustellen, beinhaltend die Schritte: a. ein- oder zweistufige direkte saure Alkoholyse von biologischem Ausgangsmaterial, die kristalline Alkyl-Pheophorbide ergibt; b. Umwandlung der erhaltenen Alkyl-Pheophorbide in ein acidisches Porphyrin; c. Reaktion des acidischen Porphyrins mit einem hydrophilen organischen Amin in einem Medium, gewählt aus der Gruppe Wasser und wässrige organische Lösungen; und d. Reinigung eines wasserlöslichen Porphyrinderivates mittels Reversed-Phase-Chromatographie unter Benutzung flüchtiger Lösungsmittel.
  3. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei genanntes biologisches Ausgangsmaterial aus der Gruppe gewählt ist, die in der Natur vorkommende Pflanzen, Algen, Blutkomponenten, Insektenausscheidungen und Mikroorganismen umfasst.
  4. Eine Methode nach Anspruch 3, wobei in der Natur vorkommende Pflanzen und Algen Spirulina platensis, Spirulina maxima, Chlorella, Brennnessel und Spinat einschließen.
  5. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 – 4 wobei genannte ein- oder zweistufige Alkoholyse vorzugsweise aus der Gruppe der Methanolyse und Ethanolyse gewählt wird.
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