CN112521393A - 一种脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于制药领域，涉及一种脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法。该制备方法包括以含叶绿素a的物质为起始物料，经过有机溶剂提取得到叶绿素a，叶绿素a再经过脱镁和甲酯化得到脱镁叶绿酸a甲酯产品，以及任选地，该产品经过进一步纯化最终得到高纯的脱镁叶绿酸a甲酯精制品。本发明方法与现有文献方法相比具有工艺收率高、产品纯度高的明显优点，还减少废酸的处理工序，降低环境污染，节约生产成本。

Description

一种脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法

技术领域

本发明属于制药领域，具体而言，涉及一种脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法。

背景技术

光动力疗法是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗新技术。其治疗基础为用一定波长的光辐照富集光敏剂的肿瘤组织，由光敏剂诱发光动力学等效应，导致肿瘤组织坏死而显示治疗作用。研究表明，二氢卟吩e6对小鼠实体肉瘤-180移植瘤具有可靠的光动力学疗效，与目前国内外临床使用的光敏剂相比，它具有化学结构明确、红光治疗区吸收系数较卟啉类制剂高一个数量级、光敏作用强，且在体内清除速度快、毒性小等特点。

脱镁叶绿酸a甲酯是制备二氢卟吩e6的关键中间体。目前文献报道的脱镁叶绿酸a甲酯以螺旋藻粉为起始物料在甲醇和浓硫酸的混合溶液中直接制备。该方法得到的产品含有较多的杂质，部分杂质通过柱层析也较难去除。本发明通过实验对比表明，螺旋藻粉直接制备脱镁叶绿酸a甲酯的收率较低，质量总收率为0.05％～0.10％。因此，该方法制备脱镁叶绿酸a甲酯的产品纯度较差，成本较高。

发明概述

本发明旨在提供一种由含叶绿素a的物质经过提取叶绿素a，然后制备脱镁叶绿酸a甲酯的方法。本发明还提供一种有效精制脱镁叶绿酸a甲酯的方法。

为实现上述目的，本发明技术方案是：将含叶绿素a的物质通过有机溶剂提取得到叶绿素a，叶绿素a经过脱镁和甲酯化反应制备得到脱镁叶绿酸a甲酯产品。根据需要，该技术方案还任选包括将上述脱镁叶绿酸a甲酯产品进一步纯化，经由打浆和重结晶，得到高纯的脱镁叶绿酸a甲酯精制品(纯度99％以上)。

本发明的改进之处在于，制备工艺包括先从含叶绿素a的物质中提取叶绿素a，去除较多的杂质，再将叶绿素a通过脱镁和甲酯化反应制备得到脱镁叶绿酸a甲酯产品。该脱镁叶绿酸a甲酯产品的纯度较高，难去除的杂质较少。

本发明方法以含叶绿素a的物质为起始物料，依次经过提取、脱镁和甲酯化得到脱镁叶绿酸a甲酯产品，工艺路线例如如下所示：

制备工艺的具体操作步骤如下：

(1)提取

将含叶绿素a的物质(例如螺旋藻粉)加入提取溶剂中，在加热回流条件下，避光搅拌2h。反应体系降温，过滤，滤液避光保存。滤饼继续按照上述方法提取2次。将3次提取的滤液减压蒸干，得到叶绿素a。

(2)脱镁、甲酯化

将步骤(1)中的叶绿素a加入无水甲醇中，滴加浓硫酸。滴毕，在室温下避光搅拌至HPLC监控脱镁叶绿酸a甲酯不再增加。向反应液中加入纯化水，用10％NaOH溶液调节pH＝5-6。减压除去反应体系中的甲醇后，剩余溶液通过硅藻土垫滤。滤干后，分别用纯化水、正庚烷和丙酮与二氯甲烷的混合溶剂洗脱硅藻土。收集丙酮和二氯甲烷的溶液，减压蒸干。向反应瓶中加入少量无水甲醇，搅拌均匀后，过滤，滤饼干燥后得到脱镁叶绿酸a甲酯产品。

本发明的另一改进之处在于，精制工艺是任选的，包括将上述脱镁叶绿酸a甲酯产品进一步纯化，经由打浆和重结晶，从而得到纯度 99％以上(例如，99.0％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％甚至99.5％以上)的脱镁叶绿酸a甲酯精制品。

精制工艺的具体操作步骤如下：

将上述步骤(2)中得到的脱镁叶绿酸a甲酯产品加入打浆溶剂中，室温搅拌打浆1h，过滤，滤饼真空干燥。将干燥后的脱镁叶绿酸a甲酯加入重结晶溶剂中，加热至回流，全部溶解后，关闭加热缓慢降温析晶。降至室温后，搅拌析晶2h。过滤，滤饼用重结晶溶剂淋洗，干燥得到高纯的脱镁叶绿酸a甲酯精制品。

具体而言，本发明提供一种脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法，包括下列步骤：

1)以含叶绿素a的物质为起始物料，经过有机溶剂提取得到叶绿素a，以及

2)叶绿素a再经过脱镁和甲酯化得到脱镁叶绿酸a甲酯。

优选的，本发明制备方法还包括下列精制步骤：

3)经过进一步纯化得到高纯的脱镁叶绿酸a甲酯精制品。

根据本发明，上述提取步骤1)在避光和惰性气体保护下进行，所述惰性气体优选氩气和氮气。

根据本发明，含叶绿素a的物质包括但不仅限于螺旋藻粉(例如钝顶螺旋藻粉，或极大螺旋藻(Spirulina maxima)粉)、蚕沙、小球藻粉、干荨麻叶粉、冻干菠菜叶等。

根据本发明，提取叶绿素a的有机溶剂不受限制，只要溶解叶绿素a就行，包括烷烃类，如正己烷、正庚烷、甲苯、环己烷，醚类，如四氢呋喃、二氧六环、乙醚，腈类，如乙腈、丙腈，醇类，如甲醇、乙醇、异丙醇，酮类，如丙酮、丁酮，酯类，如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯，或上述溶剂的混合物，优选丙酮、丁酮、甲醇、乙醇或其混合物。有机溶剂的用量为起始物料的2-8倍(体积/质量)，优选4-6倍(体积/质量)。

根据本发明，叶绿素a在甲醇和浓硫酸的混合溶液中发生脱镁和甲酯化。甲醇的用量为叶绿酸a的1-15倍(体积/质量)，优选5-8倍 (体积/质量)；浓硫酸的用量为叶绿酸a的0.1-1.0倍(体积/质量)，优选0.3-0.5倍(体积/质量)。

根据本发明，脱镁叶绿酸a甲酯的精制步骤包括先以打浆溶剂对脱镁叶绿酸a甲酯打浆进行初步精制，打浆样品干燥后，再用有机溶剂进行重结晶精制，从而得到脱镁叶绿酸a甲酯精制品。其中，打浆溶剂包括醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇)；烷烃类(例如正己烷、正庚烷、环己烷)；酮类(例如丙酮、丁酮)；酯类(例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯)；卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿)；醚类 (例如四氢呋喃、二氧六环、乙醚)；水，或上述溶剂中两种或多种的混合物，优选甲醇、正己烷、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯或其混合物。重结晶溶剂包括酮类(例如丙酮、丁酮、戊酮)；酯类(例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯)；卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿)；醚类(例如四氢呋喃、二氧六环、乙醚)，或其混合物，优选丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或其混合物。

根据本发明，打浆溶剂的用量为脱镁叶绿酸a甲酯的5-20倍(体积/质量)，优选10-12倍(体积/质量)，而重结晶溶剂的用量为脱镁叶绿酸a甲酯的10-70倍(体积/质量)，优选30-50倍(体积/质量)。

针对现有技术或其他制备方法得到的低纯度脱镁叶绿酸a甲酯粗品，本发明还提供一种通过纯化脱镁叶绿酸a甲酯粗品制备脱镁叶绿酸a甲酯精制品的方法，包括下列步骤：先以打浆溶剂对脱镁叶绿酸a 甲酯粗品打浆进行初步精制，打浆样品干燥后，再用有机溶剂进行重结晶，从而得到脱镁叶绿酸a甲酯精制品。其中，打浆溶剂和重结晶溶剂及其用量与精制本发明脱镁叶绿酸a甲酯产品的相同。

本发明针对现有脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法，得到的产品纯度差、收率低、需要柱层析纯化的缺点进行了改进。将含叶绿素a的物质先提取处理得到叶绿素a，去除较多可能在后续脱镁和甲酯化中发生副反应的杂质，制备得到的脱镁叶绿酸a甲酯纯度较高，难去除杂质含量较少。发明人经过大量实验数据摸索，惊奇地发现本发明的重结晶溶剂对脱镁叶绿酸a甲酯中的杂质有较好的去除效果，在较高收率情况下，仍制备得到纯度99％以上的脱镁叶绿酸a甲酯。

附图说明

图1是按照对比例方法由螺旋藻粉直接制备的脱镁叶绿酸a甲酯粗品的纯度检测结果；

图2是按照对比例方法，从脱镁叶绿酸a甲酯粗品制备得到的脱镁叶绿酸a甲酯精制品的纯度检测结果；

图3是按照本发明实施例方法制备得到的脱镁叶绿酸a甲酯产品的纯度检测结果；以及

图4是按照本发明实施例方法，从脱镁叶绿酸a甲酯产品制备得到的高纯脱镁叶绿酸a甲酯精制品的纯度检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在无需作出创造性劳动的前提下所获得的所有变体，都属于本发明要求保护的范围。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1：提取叶绿素a

在10L反应瓶中加入5L丙酮，在机械搅拌条件下加入1Kg螺旋藻粉。不断向体系内通入氩气，在避光回流条件下，提取叶绿素a。2h 后，停止加热，冷却后抽滤，滤液减压去除溶剂。滤饼返回反应瓶中，继续加入5L丙酮回流提取。连续提取三次，将滤液合并蒸干，得到50g 叶绿素a，质量收率5.00％。

实施例2：脱镁叶绿酸a甲酯产品的制备

将300mL无水甲醇加入实施例1的50g叶绿素a中，搅拌均匀后，转移至在1L的反应瓶中，在冰水浴下避光搅拌。向反应瓶中滴加15mL 浓硫酸，滴加过程中控制温度不超过30℃。滴毕，反应瓶避光、室温搅拌至反应液中脱镁叶绿酸a甲酯的含量不再增加为止。

反应完毕后，将反应液过滤，滤饼用50mL无水甲醇洗涤。滤液用10％NaOH溶液调节pH至6。减压除去反应液中的甲醇后，将反应液通过硅藻土过滤，然后用纯化水洗涤硅藻土至滤液为浅黄色或茶色。将滤饼继续抽干后，加入正己烷50ml浸泡硅藻土20min后抽干，再重复洗涤1次。然后用100mL丙酮浸泡硅藻土20min后，抽干；用100mL 丙酮和二氯甲烷的混合液(1:1)浸泡硅藻土20min后抽干。滤液和上一步的丙酮溶液合并后，减压去除溶剂。向反应瓶中加入25mL无水甲醇，室温搅拌20min，过滤，干燥得到6.10g脱镁叶绿酸a甲酯产品，收率 12.20％，纯度95.35％。

实施例3：脱镁叶绿酸a甲酯产品的精制

将实施例2的6.00g脱镁叶绿酸a甲酯产品加入60mL无水甲醇中，室温打浆1h，过滤，滤饼加入240mL丙酮中，避光搅拌条件下回流0.5h。关闭加热自然降温析晶。降至室温后，搅拌析晶2h，过滤，滤饼用10ml 丙酮淋洗，干燥，得到2.40g高纯的脱镁叶绿酸a甲酯精制品，收率 40％，纯度99.24％。

实施例4(对比例)

根据一般制备脱镁叶绿酸a甲酯的文献方法(CN1512994A)，由螺旋藻粉直接制备脱镁叶绿酸a甲酯粗品。

在反应瓶中加入5L无水甲醇，在搅拌条件下加入1Kg螺旋藻粉。搅拌均匀后，滴加500mL浓硫酸，加毕，室温搅拌3h。用冷水稀释，加硅藻土过滤，然后分别用水、乙醇和己烷洗涤后，用丙酮将脱镁叶绿酸a甲酯移出。丙酮溶液浓缩，重结晶得到2.50g脱镁叶绿酸a甲酯粗品，质量收率0.25％，纯度82.22％。

按照实施例3的方法，将上述粗品一次精制后，得到0.88g脱镁叶绿酸a甲酯精制品，纯度为94.35％，收率35.20％。

上述实施例1-3是本发明脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法，实施例4 是一般文献公开的脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法。为了更好的对本发明进行对比说明，将两种制备方法得到的产品的纯度和收率进行对比，如下表1和图1-4所示：

表1两种方法收率与纯度汇总表

本发明方法制备得到的脱镁叶绿酸a甲酯在纯度和收率上都明显高于一般文献方法制备得到的产品。分析原因是本发明制备得到的脱镁叶绿酸a甲酯在现有HPLC条件下保留时间在4.80min左右的杂质较少，该杂质是脱镁叶绿酸a甲酯中较难去除的杂质，影响产品质量。样品HPLC检测结果如下表2所示：

表2两种方法制备样品主要杂质汇总表

因此，本发明脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法，与现有文献方法相比具有工艺收率高、产品纯度高的明显优点。同时本发明的方法所用溶剂均可以回收套用，制备脱镁叶绿酸a甲酯的过程中浓硫酸用量明显减少，减少了废酸的处理工序，降低环境污染，节约生产成本。

Claims (11)

1.一种脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法，包括下列步骤：

1)以含叶绿素a的物质为起始物料，经过有机溶剂提取得到叶绿素a，以及

2)叶绿素a再经过脱镁和甲酯化制备得到脱镁叶绿酸a甲酯。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括下列精制步骤：

3)脱镁叶绿酸a甲酯经过进一步纯化得到高纯的脱镁叶绿酸a甲酯精制品(纯度优选99％以上)。

3.权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，含叶绿素a的物质选自螺旋藻粉(例如，钝顶螺旋藻粉或极大螺旋藻粉)、蚕沙、小球藻粉、干荨麻叶粉和冻干菠菜叶。

4.权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，提取叶绿素a的有机溶剂选自烷烃类(例如正己烷、正庚烷、甲苯、环己烷)，醚类(例如四氢呋喃、二氧六环、乙醚)，腈类(例如乙腈、丙腈)，醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇)，酮类(例如丙酮、丁酮)，酯类(例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯)，或上述溶剂的混合物，优选丙酮、丁酮、甲醇、乙醇或其混合物。

5.权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，有机溶剂的用量为起始物料的2-8倍(体积/质量)，优选4-6倍(体积/质量)。

6.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，叶绿素a在甲醇和浓硫酸的混合溶液中发生脱镁和甲酯化。

7.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，甲醇的用量为叶绿素a的1-15倍(体积/质量)，优选5-8倍(体积/质量)，而浓硫酸的用量为叶绿素a的0.1-1.0倍(体积/质量)，优选0.3-0.5倍(体积/质量)。

8.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，精制步骤包括先以打浆溶剂对脱镁叶绿酸a甲酯打浆进行初步精制，打浆样品干燥后，再用有机溶剂进行重结晶精制，

其中打浆溶剂选自醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇)；烷烃类(例如正己烷、正庚烷、环己烷)；酮类(例如丙酮、丁酮)；酯类(例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯)；卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿)；醚类(例如四氢呋喃、二氧六环、乙醚)；水，或上述溶剂中两种或多种的混合物，优选甲醇、正己烷、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯或其混合物，

重结晶溶剂选自酮类(例如丙酮、丁酮、戊酮)；酯类(例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯)；卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿)；醚类(例如四氢呋喃、二氧六环、乙醚)，或其混合物，优选丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或其混合物。

9.权利要求8所述的制备方法，其特征在于，打浆溶剂的用量为脱镁叶绿酸a甲酯的5-20倍(体积/质量)，优选10-12倍(体积/质量)，而重结晶溶剂的用量为脱镁叶绿酸a甲酯的10-70倍(体积/质量)，优选30-50倍(体积/质量)。

10.一种通过纯化脱镁叶绿酸a甲酯粗品制备脱镁叶绿酸a甲酯精制品的方法，包括下列精制步骤：

先以打浆溶剂对脱镁叶绿酸a甲酯粗品打浆进行初步精制，以及，

打浆样品干燥后，再用有机溶剂进行重结晶，从而得到脱镁叶绿酸a甲酯精制品，

其中，打浆溶剂选自醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇)；烷烃类(例如正己烷、正庚烷、环己烷)；酮类(例如丙酮、丁酮)；酯类(例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯)；卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿)；醚类(例如四氢呋喃、二氧六环、乙醚)；水，或上述溶剂中两种或多种的混合物，优选甲醇、正己烷、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯或其混合物，

重结晶溶剂选自酮类(例如丙酮、丁酮、戊酮)；酯类(例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯)；卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿)；醚类(例如四氢呋喃、二氧六环、乙醚)，或其混合物，优选丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或其混合物。

11.权利要求10所述的制备方法，其特征在于，打浆溶剂的用量为脱镁叶绿酸a甲酯粗品的5-20倍(体积/质量)，优选10-12倍(体积/质量)，而重结晶溶剂的用量为脱镁叶绿酸a甲酯粗品的10-70倍(体积/质量)，优选30-50倍(体积/质量)。

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