CN1741801B - 水溶性阴离子型细菌叶绿素衍生物及其用途 - Google Patents

水溶性阴离子型细菌叶绿素衍生物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于光动力治疗和诊断的阴离子型水溶性四环和五环的细菌叶绿素衍生物(Bch1)，其包含至少一个，优选两个或三个带负电荷的基团和/或在生理pH条件下转化为带负电荷的基团的酸性基团，优选具有通过酯或酰胺键结合于四环或五环Bch1分子的173、133、和32中的一个或多个位置上的COO-、COS-、SO3 -、PO3 2-、COOH、COSH、SO3H和/或PO3H2基团的Bch1。

Description

水溶性阴离子型细菌叶绿素衍生物及其用途
技术领域
本发明涉及新的水溶性阴离子型细菌叶绿素衍生物，其制备方法，及其在体内光动力治疗以及诊断肿瘤和不同血管疾病如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration)、以及体内和体外杀死病毒和微生物的方法中的用途。
定义和缩写
AMD：年龄相关性黄斑变性；
Bchl：细菌叶绿素a，即五环7，8，17，18-四氢卟啉，其具有第五同素环(5th isoayclic ring)，中心Mg原子，在173位的叶绿基或者香叶基香叶基，在132位的COOCH3基团，在132位的H原子，在2、7、12、18位的甲基，在3位的乙酰基，和在8位的乙基；
Bphe：细菌脱镁叶绿素a(其中中心Mg被两个H原子替代的Bchl)；
Bpheid：细菌脱镁叶绿甲酯酸a(衍生自BPhe的C-172-游离羧酸)；
Pd-Bpheid：Pd-细菌脱镁叶绿甲酯酸a；
PDT：光动力治疗；
玫红细菌卟吩(Rhodobacteriochlorin)：四环7，8，17，18-四氢卟啉，其在17位具有-CH2CH2COOH基团，在13位具有-COOH，在2、7、12、8位具有甲基，在3和8位具有乙基。
在说明书全文中使用了细菌叶绿素衍生物的IUPAC编号规则。使用这一命名法，天然细菌叶绿素在132和172位带有两个羧酸酯，然而他们在133和173位被酯化。
背景技术
光动力治疗(PDT)是肿瘤的非手术治疗方法，其中将无毒药物与无危险的光敏照射组合使用，原位产生细胞毒活性氧物质。这一技术比通常所用的肿瘤化疗和放疗技术的选择性更高。迄今为止，在临床中已经使用卟啉作为主要的光敏剂。然而当前敏化剂的几个缺点限制了他们的应用，所述缺点主要包括：(1)在可见光谱区内相对弱的吸收使治疗局限于较浅的肿瘤；(2)敏化剂在患者皮肤的蓄积和长期滞留，导致长期(数天到数月)的皮肤光毒性；和(3)PDT对被照射肿瘤和非肿瘤组织的作用的差别很小或没有差别。当前药物的缺点引发了对寻找长波长吸收第二代敏化剂的广泛研究，第二代敏化剂在肿瘤细胞的滞留和其在皮肤或其它正常组织的滞留之间具有更好的差异。
为了实现卟啉药物在治疗学和诊断学中性能的最优化，已经提出了几种卟啉衍生物，例如其中具有与四吡咯环络合的中心金属原子(不同于Mg)，和/或吡咯环的周围取代基经过修饰和/或大环被二氢化成为叶绿素衍生物(二氢卟酚)或被四氢化成为细菌叶绿素衍生物(菌绿素)。
由于它们在有利光谱区(650-850nm)的强吸收及其在处理后的易于降解，已经确定叶绿素和细菌叶绿素衍生物是肿瘤PDT的优异敏化剂，并具有与卟啉相媲美的出众性质，但是他们不易获得并且较难处理。
细菌叶绿素与叶绿素相比具有潜在的优点，因为他们比叶绿素衍生物表现强的近红外波段，即处在相当长的波长处的波段。
天然的细菌叶绿素(Bchl)的光谱学、光物理学、和光化学使得他们成为最佳的光捕获分子，与PDT目前所用的其它敏化剂相比明显的有优点。特别是，这些分子在长波长处具有非常高的消光系数(λmax＝760-780nm，ε＝(4-10)×104M-1cm-1)，这些波长的光透过深入到组织内。他们在高量子场(依靠中心金属)产生活性氧物质(ROS)。
在正常的递送条件下，即，在室温和正常的光条件和氧的存在下，BChl部分与例如血卟啉衍生物(HPD)相比是不稳定的并多少具较低的三线态形成所需的量子场。然而，由于他们可能引发生物氧化还原反应、光谱特性有利及其在体内易降解，使得细菌叶绿素具有优于例如卟啉和叶绿素化合物的潜在的优越性，用于PDT治疗和诊断，杀死样品和活组织内的细胞、病毒和细菌。预计细菌叶绿素的化学修饰可进一步改善它们的性质，但是这受到了缺乏制备这种改良细菌叶绿素的适当方法的约束。
已经研究了不含金属的Bchl衍生物的生物摄取和PDT效力，目的是控制敏化剂与肿瘤细胞区室的亲合力。这一方法主要是利用高亲脂性药物，其可增加药物在肿瘤细胞的积聚，但这也使递送困难。另外，所报道的生物分布显示了在给药后在非肿瘤组织内的长期(至少数天)显著的光毒性药物水平。
在本申请人在先的以色列专利102645和相应的EP 0584552、US5,726,169、US 5,726,169、US 5,955,585和US 6,147,195中，发明人使用了不同的方法。研究了在给药后未从循环中外渗并且在血液中具有较短持续时间的高效抗血管敏化剂。人们期望在正常组织和异常组织如肿瘤或其它依靠新生血管的组织之间的固有差异将能够相对选择性地破坏异常组织。因此，目的是合成极性更大的Bchl衍生物，从而更好地停留在血管腔室内，在那里他们发挥了主要的光动力作用。为此目的，Bchla(本文示意图1中的化合物1)的C-17位的香叶基香叶基残基被各种残基如氨基酸、肽或蛋白质替代，他们提高了敏化剂的亲水性。发现一个具体衍生物，Bchl-Ser(示意图1，化合物1，其中R是丝氨酰基)是水溶性的并在细胞培养物中具有高的光毒性。在腹膜内注射后，Bchl-Ser以相对短的时间(t1/2分别为～2h和16h)从小鼠血液和组织内以双指数方式清除。在静脉内注射后从循环的清除更快一些。在所选治疗方案中(在药物注射后几分钟内施用光)，光毒性主要地施加于肿瘤血管系统(Rosenbach-Belkin等人，1996；Zilberstein等人，2001和1997)。然而，令人遗憾的是，像天然Bchl那样，Bchl-Ser衍生物经历迅速的光氧化，形成相应的2-desvinyl-2-乙酰基-脱植基叶绿素酯及其它产物。
为增加Bchl衍生物的稳定性，在后一申请人的PCT公开WO 00/33833和US 6,569,846中，中心Mg原子被Pd替代。这一重原子先前显示出显著增加Bchl大环的氧化电位，并同时大大提高分子向其三线态的系统间跨越(intersystem-crossing，ISC)速率。金属置换通过直接将Pd2+离子引入到Bpheid分子中进行，如WO 00/33833所述。基于颜料生物分布和药代动力学，推测衍生物Pd-Bpheid在循环中停留很短时间，并且实际上不向其它组织外渗，因此是血管靶向PDT的良好候选药物，其避免了皮肤光毒性。对血管的治疗效果通过被治疗血管的活体镜检法并用依文氏蓝(Evans-Blue)染色证明。使用治疗方案，用最小的药物-光照间隔，发现Pd-Bpheid(也称作Tookad)在小鼠、大鼠及其他动物模型的不同肿瘤的根除中是有效的，衍生物Pd-Bpheid目前进入了患有前列腺癌患者的I/1I期临床试验阶段，所述患有前列腺癌的患者经过放疗后治疗失败(Chen等人，2002；Schreiber等人，2002；Koudinova等人，2003)。
由于Pd-Bpheid在水溶液中的低溶解性，Pd-Bpheid临床应用要求使用增溶剂如Cremophor，高剂量使用Cremophor时可引起副作用。非常希望使Pd-Bpheid具有水溶性并同时保持其理化性质。或者，希望制备具有细胞光毒性并同时具有水溶性较Pd-bpheid自身水溶性更高的Bchl衍生物。预计这种水溶性进一步提高药物在循环中的滞留，从而提高上述选择性。另外，无需使用载体如洗涤剂或lyposomes，可防止副作用。
发明概述
本发明涉及含有至少一个、优选两个或三个带负电荷的基团和/或在生理pH条件下转化为带负电荷的基团的酸性基团的细菌叶绿素衍生物，不包括在17位具有游离CH2CH2COOH或CH2CH2COO-基团的五环细菌叶绿素衍生物和无中心金属原子，在17位具有-CH2CH2COOH基团，在15位具有-CH2COOH或-COOH基团，在13位具有-COOH基团，在2、7、12、18位具有甲基，和在3和8位具有乙基的四环细菌叶绿素衍生物。
本发明的带负电荷的基团包括但是不限于羧酸根(COO-)，硫代羧酸根(COS-)，磺酸根(SO3 -)，和磷酸根(PO3 2-)，在生理pH条件下生成所述带电荷基团的酸性基团是羧酸(COOH)，硫代羧酸(COSH)，磺酸(SO3H)和膦酸(PO3H2)基团。
在一个实施方案中，细菌叶绿素衍生物具有下式I或II的结构：
Figure G038A8906519960403D000051
其中
M表示2H或选自二价Pd、Pt、Co、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn，三价Fe、Mn和Cr的金属原子，
R1、R2和R4各自独立地是Y-R5；
Y是O、S或NR5R6；
R3选自-CH＝CH2、-C(＝O)-CH3、-C(＝O)-H、-CH＝NR7、-C(CH3)＝NR7、-CH2-OR7、-CH2-SR7、-CH2-NR7R′7、-CH(CH3)-OR7、-CH(CH3)-SR7、-CH(CH3)-NR7R′7、-CH(CH3)Hal、-CH2-Hal、-CH2-R7、-CH＝CR7R′7、-C(CH3)＝CR7R′7、-CH＝CR7Hal、-C(CH3)＝CR7Hal和-C≡CR7；
R5，R6，R7和R′7各自独立地是H或选自：
(a)C1-C25烃基，其任选含有一个或多个杂原子，碳环或杂环部分，和/或任选被一个或多个选自卤素、氧代、OH、SH、CHO、NH2、CONH2、带负电荷的基团、和在生理pH条件下变成带负电荷的基团的酸性基团的官能团取代；
(b)氨基酸、肽或蛋白质的残基；和
(c)当Y是O或S时，R5可进一步是R8 +；
m是0或1；和
R8 +是H+或阳离子；
条件是：
(1)R5，R6，R7和R′7中的至少一个、优选两个是被带负电荷的基团或被在生理pH条件下变成带负电荷的基团的酸性基团取代的上述(a)中的烃链；或
(ii)R1、R2和R4中的至少一个、优选两个是OH、SH、O-R8 +或S-R8 +；
(iii)R1、R2和R4中的至少一个是OH、SH、O-R8 +或S-R8 +并且R5，R6，R7和R′7中的至少一个是被带负电荷的基团或被在生理pH条件下变成带负电荷的基团的酸性基团取代的烃链；或
(iv)R1、R2和R4中的至少一个是OH、SH、O-R8 +或S-R8 +并且R5，R6，R7和R′7中的至少一个是氨基酸、肽或蛋白质的残基；或
(v)R5，R6，R7和R′7中的至少一个是被带负电荷的基团或被在生理pH条件下变成带负电荷的基团的酸性基团取代的烃链并且R5，R6，R7和R′7中的至少一个是氨基酸、肽或蛋白质的残基；
但是排除了以下结构的式I化合物：其中M如定义所述，R3是-C(＝O)CH3，R1是OH或O-R8 +，R2是-OCH3，并且排除了以下结构的式II化合物：其中M是2H，R3是C(＝O)CH3，R1、R2和R4是OH，m是0或1。
本发明进一步涉及包括以上定义的细菌叶绿素衍生物的药物组合物，用于光动力治疗(PDT)。特别是用于血管靶向PDT，如肿瘤或年龄相关性黄斑变性(AMD)的PDT，或用于体内或体外杀死包括细菌和病毒的细胞或传染物，以及用于诊断目的。
本发明提供了使用光敏剂的光动力治疗，其中改进之处在于所述光敏剂是本发明的细菌叶绿素衍生物。根据这一方面，本发明涉及通过PDT进行治疗的方法，其包括对需要的个体给予有效量的本发明的细菌叶绿素衍生物，然后局部照射。
本发明进一步提供了使用光敏剂诊断肿瘤的方法，其中改进之处在于所述光敏剂是本发明的细菌叶绿素衍生物。根据这一方面，本发明涉及诊断肿瘤的方法，其包括对怀疑患有肿瘤的个体给予有效量的本发明的细菌叶绿素衍生物，然后局部照射并检查怀疑区域的荧光，其中较强的荧光表明了肿瘤位置。
本发明还进一步提供了使用光敏剂杀死包括细菌和病毒的细胞或传染物的方法，改进之处在于其中所述光敏剂是本发明的细菌叶绿素衍生物。按照这一方面，本发明涉及生物制品例如血液灭菌的方法，其包括向所述生物制品如血液中加入有效量的本发明的细菌叶绿素衍生物，然后照射。
附图详述
本发明的不同化合物在以下附图说明中用粗体和加下划线的数字代表，它们的完全表征见于下文化学部分开头的化合物列表。
图1A-1B表示磺化化合物8对H5V小鼠内皮细胞(图1A)和M2R小鼠黑色素瘤细胞(图1B)的光毒性曲线图。细胞在8浓度增加的条件下培养4小时，洗涤并照射(空心形状)或保持在黑暗中(黑暗对照，实心形状)，各点是三个值的平均数±STD。
图2A-2B表示磺化化合物4对H5V小鼠内皮细胞(图2A)和M2R小鼠黑色素瘤细胞(图2B)的光毒性曲线。细胞在化合物4浓度增加的条件下培养4小时，洗涤并被照射(空心形状)或保持在黑暗中(黑暗对照，实心形状)。各点是三个值的平均数±STD。
图3是磺化化合物5对M2R小鼠黑色素瘤细胞的光毒性曲线。细胞在化合物5浓度增加的条件下培养4小时，洗涤和照射(圈)或保持在黑暗中(黑暗对照，菱形)。各点是三个值的平均数。
图4是磺化化合物11对M2R小鼠黑色素瘤细胞的光毒性曲线。细胞在化合物11浓度增加的条件下培养4小时，洗涤和被照射(圈)或保持在黑暗中(黑暗对照，菱形)。各点是三个值的平均数。
图5是化合物4在CD1裸鼠血液中的药代动力学曲线。注射化合物4(6mg/kg)后，在标示时间从相同小鼠收集血样并测量Pd。每一时间点表示三只小鼠的平均数±STD。
图6表示化合物4在CD1裸鼠中的生物分布。在注射化合物4(6mg/kg)后在不同时间处死小鼠，测量标示器官的Pd含量。每一时间点表示三只小鼠的平均数±STD。
图7表示使用化合物4的黑色素瘤异种移植的PDT。M2R黑色素瘤异种移植的小鼠被静脉内注射化合物4(6mg/kg)并用光强为30J/cm2(n＝14，实心正方形)、39J/cm2(n＝8，实心菱形)、或45J/cm2(n＝10，实心三角形)照射5分钟。注射了9mg/kg的化合物4的小鼠用光强为30J/cm2(n＝10，实心圈)照射5分钟。对照组：未经治疗(n＝4，空心正方形)，接受6mg/kg的化合物4的黑暗对照(n＝4，空心圈)或接受9mg/kg化合物4的黑暗对照(n＝5，空心三角形)，和光对照(n＝6，空心菱形，45J/cm2)。
图8a-8h是表示在异种移植大鼠C6胶质瘤并用化合物4治疗的小鼠中PDT的选择性效果的照片。(a-d)用PDT治疗的动物；(e-h)未经治疗的动物。(a)治疗前；(b)PDT和注射伊文氏蓝(EB)后3小时；(c)PDT后24小时经过治疗的区域的皮瓣；(d)PDT后24小时经过治疗的肿瘤的轴向切片；(e)注射EB之前；(f)注射EB后3小时；(g)注射EB后24小时的皮瓣；(h)注射EB后24小时的未经治疗的肿瘤的轴向切片。T-肿瘤；S-皮肤；M-肌肉；E-水肿。
图9A-9D表示在兔眼模型中使用化合物4(光强为50J/cm2，剂量为5mg/Kg，DLI 1分钟)进行阻塞PDT2小时，病灶中心的半薄切片和TEM。观察到了具有保存相对很好的RPB细胞和视网膜的脉络膜血管的停滞和扩张(9A和9B)。TEM表示在脉络膜毛细管腔(9D的白色箭头)和破裂的单核细胞(白色箭头形)中血细胞的溶血。透明层(Bm)保持完整，容纳有容易识别的视网膜色素上皮细胞细胞(RPE)。一些脉络膜毛细管内皮细胞显著改变，显示了凝聚染色质(9C上的白色星形)。缩写：ONL：外核层，ROS：杆状外部片段，CC：脉络膜毛细管，e：脉络膜毛细管内皮细胞。
发明详述
本发明在较宽的方面提供了含有至少一个、优选两个或三个带负电荷的基团和/或生理pH条件下转化为带负电荷基团的酸性基团的细菌叶绿素衍生物，不包括在17位具有游离-CH2CH2COOH或-CH2CH2COO-基团的五环细菌叶绿素衍生物和具有以下结构的四环细菌叶绿素衍生物：无中心金属原子，在17位具有-CH2CH2COOH基团，在15位具有-CH2COOH或-COOH基团，在13位具有-COOH基团，在2、7、12、18位具有甲基，和在3和8位具有乙基。
细菌叶绿素衍生物可衍生自天然或合成的细菌叶绿素衍生物，包括其中无中心Mg原子或中心Mg原子被其它金属原子替代的化合物，所述其它金属原子如二价Pd、Pt、Co、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn，三价Fe、Mn和Cr。在优选方案中，无金属原子或金属原子是Pd、Cu、Zn或Mn。在最优选方案中，中心金属原子是Pd。
在一个优选方案中，本发明提供了如上文定义的式I或II的细菌叶绿素衍生物。
根据本发明，R5，R6，R7和R′7定义中的“烃基”是指任何直链或支链、饱和或不饱和、非环状或环状、包括芳烃的烃基，其具有1-25个碳原子、优选1-20个碳原子、更优选1-6个碳原子、最优选2-3个碳原子。烃基可以是优选具有1-4个碳原子的烷基如甲基、乙基、丙基、丁基，或链烯基，炔基，环烷基，芳基如苯基，或芳烷基如苄基，或在17位具有衍生自天然Chl和Bchl化合物的基团，如香叶基香叶基(2，6-二甲基-2，6-辛二烯基)或植基(2，6，10，14-四甲基-十六-14-烯-16-基)。
R5，R6，R7和/或R′7的烃链可任选含有一个或多个杂原子如O、S、和/或NH，以及一个或多个碳环部分如苯基，或杂环部分如吡啶基。在一个实施方案中，烃链含有一个或多个O原子和OH端基，由含4-10个碳原子的低聚乙二醇残基、优选五氧乙二醇(pentaoxyethyleneglycol)代表。
R5，R6，R7和/或R′7也可是被一个或多个以下官能团取代的烃基：如Cl、CHO、OH、SH、NH2、CONH2、COOH、COSH、SO3H、PO3H2、或带负电荷的基团如COO-、COS-、SO3 -、或PO3 2-。在一个优选方案中，官能团COOH、COSH、SO3H、PO3H2、COO-、COS-、SO3 -、或PO3 2-是末端官能团。在最优选方案中，烃基具有2或3个碳原子和选自COO-、或PO3 2-，或最优选SO3 -的端基。
在另一个实施方案中，R5，R6，R7或R′7也可被一个以上的OH和任选的NH2基团取代，并且可以是单糖(monoaccharide)如葡糖胺的残基。
在另一个实施方案中，R5，R6，R7或R′7也可以是氨基酸、肽或蛋白质的残基。在一个优选方案中，在任意位上，但优选在173位上的R5是氨基酸、肽或蛋白质的残基。如果氨基酸、肽或蛋白质含有游离的末端羧基和/或含非末端游离羧酸基团的氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸的残基，则该氨基酸、肽或蛋白质可以是带负电荷的基团的来源。
在一个实施方案中，R5，R6，R7或R′7是含有羟基的氨基酸或肽(寡肽或多肽)的残基，所述含有羟基的氨基酸或肽如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，或含有它们的肽，或选自以下的所述氨基酸或肽的衍生物：酯如烷基酯优选甲酯，其中N-保护基是例如叔丁氧基、苄氧羰基或三苯甲基的N-保护衍生物，并且所述羟基化氨基酸或肽或其衍生物通过其羟基与Bchl衍生物的COO-基团连接。这种氨基酸衍生物的例子是丝氨酸甲酯、N-叔丁基氧羰基丝氨酸、N-三苯甲基丝氨酸甲酯、酪氨酸甲酯、和N-叔丁基氧酪氨酸甲酯，这种肽的例子是N-苄氧羰基-丝氨酰基丝氨酸甲酯，其制备都在上述EP 0584552中描述。
在另一个实施方案中，R5，R6，R7和/或R′7是通过酰胺键(Y是NH)与-CO基团连接的氨基酸或肽(寡肽或多肽)。
在另一个实施方案中，R5，R6，R7或R′7是选自肽和蛋白质的细胞特异性或组织特异性配体，其例证为，但不限于，激素肽，例如促黑素细胞激素如α-MSH，和抗体，如免疫球蛋白，和肿瘤特异性抗体。肽或蛋白可能通过酯键、硫代酯键或酰胺键直接与-CO基团连接，或者可通过酯键或酰胺键与C1-C25烃基的选自OH、COOH和NH2的末端官能团连接。
如以上EP 0584552中所述，通过使Bchl结合不同的氨基酸，和进一步使Bchl氨基酸结合物结合激素、生长因子或其衍生物、或肿瘤特异性抗体、或任何其它细胞特异性配体，获得了适当的定位的光敏剂。
在一个实施方案中，本发明的带负电荷的基团COO-、COS-、SO3 -、或PO3 2-分别来自R5，R6，R7和/或R′7的取代烃链的官能团COOH、COSH、SO3H、或PO3H2。在另一个实施方案中，COOH、COSH、COO-、和/或COS-基团来自分别为OH、或SH、O-R8 +或S-R8 +的R1、R2和R4，即，当在131、151(m是0)、152(m是1)、和/或173位存在羧酸或硫代羧酸基团、或羧酸根或硫代羧酸根阴离子时。
阳离子R8 +可为来自碱金属或碱土金属的单价或二价阳离子如K+、Na+、Li+、NH4 +、Ca+，更优选为K+，或者R8 +为衍生自胺的阳离子。
在一个优选实施方案中，本发明的细菌叶绿素衍生物为式I，其中：
M表示二价的Pd；
R1为-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、-NH-(CH2)n-COO-R8 +、-NH(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2；
R2为甲氧基；和
R3为-C(＝O)-CH3；
R8 +为单价阳离子，如K+、Na+、Li+、NH4 +；和
n为1到10的整数，优选为2或3。
根据这一实施方案，在式I的化合物中，R1优选为基团-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +，其中n为3，R8 +为K+。
在另一个优选实施方案中，本发明的细菌叶绿素衍生物为式II，其中：
M表示2H，二价的Pd、Cu、或Zn，或三价的Mn；
R1为-O-R8 +、-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、-NH-(CH2)n-COO-R8 +、-NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2；或Y-R5，其中Y为O、S或NH，R5为氨基酸、肽或蛋白质的残基；
R2为C1-C6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基，更优选为甲氧基；
R3为-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)n-SO3 -R8 +、-CH＝N-(CH2)n-COO-R8 +、-CH＝N-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2、-CH2-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、-NH-(CH2)n-COO-R8 +、或-NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2；
R4为-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、-NH-(CH2)n-COO-R8 +、-NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2；
R8 +为单价阳离子，如K+、Na+、Li+、NH4 +、更优选为K+；
m为1，n为1到10的整数，优选为2或3。
在本发明更优选的实施方案中，细菌叶绿素衍生物为式II并且M为Pd。
在另一个更优选的实施方案中，本发明涉及式II的细菌叶绿素衍生物，其中：
M为Pd；
R1为-O-R8 +、-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、或Y-R5，其中Y为O、S或-NH，R5为蛋白质的残基，优选为免疫球蛋白的残基；
R2为C1-C6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基，更优选为甲氧基；
R3为-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)nSO3 -R8 +、或-CH2-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +；
R4为-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、NH-(CH2)n-COO-R8 +、NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2；
R8 +为单价阳离子，如K+，Na+，Li+，NH4 +，更优选为K+；
和m为1，n为2或3，更优选为2。
在17位具有唯一带负电荷的基团(SO3 -)的本发明的细菌叶绿素衍生物的例子由在下文中的化合物目录中标识为化合物7的式I的化合物表示。
在13和17位具有两个带负电荷的基团的本发明的细菌叶绿素衍生物的例子包括在下文中的化合物目录中标识为化合物4、5、8、10、11、12、13、14、15的式II的化合物。在最优选的实施方案中，本发明的化合物为化合物4。
在3、13和17位具有三个带负电荷的基团的本发明的细菌叶绿素衍生物的例子包括在下文中的化合物目录中标识为化合物9和16的式II的化合物。化合物13在13位具有一个带负电荷的基团并在173位具有作为蛋白质分子的一部分的-COOH基团，化合物15在13位具有一个二价的带负电荷的基团并在173位具有-COO-基团。
可以通过例如本文图解1所述的方法制备本发明的化合物。对于其中R5为氨基酸、肽或蛋白质的残基的化合物的制备方法，可如图解1所示用于与氨基磺酸(牛磺酸和高牛磺酸)的反应使用上述提及的EP0584552中所述的方法，特别是催化缩合法。
因此，制备其中R1为-O-R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R4为基团-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的式II的化合物的方法包括：(i)使相应的其中R1为OH的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8 +-缓冲液中反应；和(ii)分离所需的式II的化合物。
对于制备化合物4，该方法包括使Pd-细菌脱镁叶绿甲酯酸a3与式H2N-(CH2)2-SO3H的牛磺酸在K+-缓冲液中反应并分离所需的化合物。
对于制备化合物5，该方法包括使细菌脱镁叶绿甲酯酸a2与式H2N-(CH2)2-SO3H的牛磺酸在K+-缓冲液中反应并分离所需的化合物。
对于Cu和Zn化合物10、11的制备，该方法包括通过使化合物5分别与醋酸铜或乙酸锌反应，直接嵌入中心金属Cu或Zn原子，而对于Mn化合物12的制备，中心金属Mn原子的嵌入通过首先使化合物5与乙酸镉反应然后与氯化锰反应的金属转移作用进行。
对于其中R1为-O-R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R4为基团-NH-(CH2)n-COO-R8 +、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的式II的化合物的制备，该方法包括：(i)使相应的其中R1为OH的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与式H2N-(CH2)n-COOH的氨基羧酸在R8 +-缓冲液中反应、和(ii)分离所需的式II的化合物。
因此，对于化合物14的制备，该方法包括使Pd-细菌脱镁叶绿甲酯酸a3与式H2N-(CH2)2-COOH的β-丙氨酸在K+-缓冲液中反应并分离所需的化合物。
对于其中R1为-O-R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R4为基团-NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的式II的化合物的制备，该方法包括：(i)使相应的其中R1为OH的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与式H2N-(CH2)n-PO3H2的氨基膦酸在R8 +-缓冲液中反应、和(ii)分离所需的式II的化合物。
因此，对于化合物15的制备，该方法包括使Pd-细菌脱镁叶绿甲酯酸a3与式H2N-(CH2)3-PO3H2的3-氨基-1-丙烷膦酸在K+-缓冲液中反应，并分离所需的化合物。
对于在13和17位具有相同的带负电荷的基团的化合物的制备，可如上所述使相应的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与过量的试剂如氨基磺酸、氨基羧酸或氨基膦酸反应，并分离所需的式II的13，17-二取代衍生物，或者遵循图解1中所述和如下所述的不同反应路线。
因此，对于其中R1和R4各自为基团-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的式II化合物的制备，该方法包括：(i)使相应的其中R1为OH的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)的存在下偶联；(ii)使得到的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸-173-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯与过量的式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8 +-缓冲液中反应，从而得到在17位具有唯一带负电荷的基团的式I的化合物；(iii)将这一产物与过量的H2N-(CH2)n-SO3H在R8 +-缓冲液中反应；并分离所需的式II的化合物。
对于化合物8的制备，与过量的式H2N-(CH2)3-SO3H高牛磺酸进行反应。
当氨基磺酸被氨基羧酸和氨基膦酸代替时，得到相应的羧酸酯和膦酸酯衍生物。
本发明的化合物，在本文中往往也称为“颜料”，具有充分高的极性，为水溶性的，可以以水溶液形式注射而不需要加入表面活性剂。在一个实施方案中，对于优选的磺化-Pd-Bchl化合物4，还显示了其生物分布和药代动力学，并以此为基础，推测本发明的这一衍生物和其它衍生物保留在循环中，并且保留很短的时间。因此，它们是用于血管靶向PDT的良好光敏剂。本文所示的对小鼠中的M2R黑素瘤和HT-29人结肠癌异种移植物的治疗证明颜料对肿瘤血管系统的选择性效果。使用磺化-Pd-Bchl 4的推荐方案者虑了药物的短的消除时间。由于它们对肿瘤血管系统的选择性作用，这些化合物可用于肿瘤以及年龄相关性黄斑变性和其它基于新血管形成的组织异常。
因此，另一个方面，本发明提供包括本发明的细菌叶绿素衍生物和可药用载体的药物组合物。
在优选实施方案中，该药物组合物包括本文中式I或II的细菌叶绿素衍生物，更优选为式II的磺化衍生物，最优选为化合物4。
使用本领域公知的技术，如在Remington的PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，Easton，Penna.，最新版中所概括的，将本发明的阴离子型细菌叶绿素衍生物配制成最终的用于对患者给药或应用于体外靶的药物组合物。该组合物可全身给药，特别是注射给药，或者可局部给药。
本发明的阴离子型Bchl化合物具有与各自的非阴离子型Bchl类似的光学吸收特征和光物理学特征，因此，当存在于被处理的组织内时，预计它们为有效的光动力学治疗剂。因此，它们可用作光敏剂，作为治疗剂和诊断剂，例如对若干类型的癌症的治疗，例如但不限于黑素瘤、前列腺癌、脑癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、食管癌、和膀胱癌，和其它激素敏感的肿瘤，以及用于治疗年龄相关性黄斑变性，和用于如PDT领域中公知的杀死样品和活组织中的细胞、病毒、真菌和细菌和用于其它光敏剂应用。
本发明的新型水溶性Bchl衍生物可用于例如使赘生性细胞或其它异常组织敏化，使用适当波长的光通过体内或体外辐射将其破坏。相信光活化能量被转移到内源性氧，将其转化为被认为具有细胞毒性作用的单线态氧和/或其它活性氧(ROS)如超氧化物和羟基基团。另外，Bchls的光活化形式发出荧光，该荧光有助于定位给予Bchl衍生物的肿瘤或其它部位。
本领域中已知的可使用本发明的细菌叶绿素衍生物治疗的适应症的例子包括破坏实体瘤中的肿瘤组织、和溶解血管中的斑块(参见例如美国专利4,512,762)。特别是，由于这些衍生物极少保留在循环中和由于它们只最低限度地被非循环组织如皮肤和肌肉吸收，这些衍生物适合于血管靶向PDT。因此，这些化合物使得在刺激时活性氧(ROS)的生产局限在血管内，从而产生异常血管如存在于肿瘤和年龄相关性黄斑变性中的那些血管的选择性响应。另外，细菌叶绿素衍生物可用于在局部病症如粉刺、脚癣、疣、乳头瘤和牛皮癣的治疗中选择性破坏；用于治疗良性前列腺肥大和用于通过破坏传染物用于生物制品如输血用血液的灭菌。
可通过PDT中使用的标准程序将本发明的药物组合物给予患者。可根据PDT中使用其它卟啉积累的经验建立给予有需要的个体以本发明阴离子型Bchl衍生物的量和给药途径，并且将取决于用作活性成分的衍生物的选择、病症如待治疗肿瘤的种类、疾病的阶段、患者年龄和健康状况、和医生的判断而改变，但是其应比现在使用的PhotofrinII的约20-40HPD/kg体重的用量低得多。优选的给药途径为将包括常规的可药用载体和添加剂的活性化合物水溶液静脉内注射或直接注射到实体瘤中和使用适当的局部组合物的皮肤肿瘤的局部治疗。
优选选择辐照光的波长与细菌叶绿素光敏剂的最大吸光度匹配。任何化合物的适合波长可从其吸收光谱容易地测定。
除了体内应用之外，本发明的阴离子型Bchl衍生物可用于体外处理材料以杀死有害病毒或传染物如有害细菌。例如，可使用本发明的Bchl处理并照射将来用于输血的血液和血浆以灭菌。
特异性结合于靶细胞受体的蛋白质如激素、生长因子或其衍生物、抗体、肽对Bchl部分的结合和细胞营养素如酪氨酸对Bchl部分的结合意味着增加在肿瘤和被处理位点的保留。红移的增加使得能够进行更深入地渗透，同时保持天然系统的普遍性。由其它金属代替Mg优化了Bchl部分的固有的稳定性和代谢稳定性及其向受激三线态的系统间过渡，以及开启了新的诊断方法的可能性。
对新生内皮细胞具有高亲合力的肿瘤特异性抗体和肽优先将Bchl部分导向肿瘤或处理位置，同时激素和细胞营养素也可由正常的非转化对应物吸收。然而，选择作为激素和细胞营养素的靶的细胞如黑素细胞和新生内皮细胞在正常情况下分散于其它细胞中和当转化为恶性细胞时群集为实体瘤。结果是，预计恶性组织的血管和/或细胞区室中的光敏剂浓度相对于其在细胞更为分散的正常组织中显著增加，保证了PDT效果在肿瘤位置中的放大。这使得能够有效使用比正常组织损坏阈值更低的光剂量，从而减少了对空间界限清晰的辐射的需要。另外，由于具有非常强烈的荧光，定位的Bchl可用于肿瘤位置或其它靶点的荧光标记。
在本发明的一个最优选的实施方案中，由于正常和异常的血管固有的对本文所述的PDT方案的敏感性的不同，使用本发明的光敏剂治疗的靶为异常的血管，特别是实体瘤和年龄相关性黄斑变性的血管。
本发明另外涉及光动力学治疗方法，其包括对有需要的个体给予有效量的本发明的Bchl衍生物，随后局部照射。
在一个实施方案中，本发明的PDT方法用于治疗癌症，其包括对患有实体瘤癌症的患者给予治疗有效量的本发明的Bchl衍生物，然后使用670-780nm的强光源照射肿瘤位置。
本发明的Bchl衍生物还可用于正常或恶性动物细胞以及培养物中微生物的光破坏，其能够选择性地光破坏培养物中的某些类型的细胞或传染物；用于通过将卟啉部分结合于特定的多肽如激素或其它受体配体、结合于细胞或组织特异性抗体、或结合于其它配体如外源凝集素而使卟啉部分针对所选细胞；用于在实验室、诊断和工业应用中的分析目的的荧光标记分子；和用于荧光标记动物细胞或微生物或颗粒，用于实验室、诊断或工业应用。由于它们优异的吸光系数和较高的荧光收率，它们可以代替几种现在使用的荧光标记物如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白。
对于诊断目的，可单独使用本发明的Bchl衍生物，或可用本领域中已知的放射性同位素或其它检测手段标记。例如，可通过标准程序由例如用67Ga、111In、201Tl、99mTc放射性标记Bchl衍生物，并将放射性诊断剂给予患者，优选通过静脉注射给药。在数小时后，可以通过标准程序造影癌症部位。
本发明另外提供本发明的Bchl衍生物用于体内或体外杀死生物制品如血液中的细胞或传染物如细菌、病毒、寄生虫和真菌的用途，其包括用本发明的化合物处理被感染的样品，随后照射样品。
下文通过非限制性实施例说明本发明。
实施例
为了方便和更好地理解，实施例部分分为两个小部分：(I)化学部分，描述水溶性衍生物和中间体4-16的合成，和(II)生物学部分，描述新型Bchl衍生物的生物活性。
I化学部分
在本文的实施例中，根据以下化合物目录，本发明的衍生物(4-5、7-9、和10-16)和中间体(1-3、和6)由它们各自为粗体并加下划线的阿拉伯数字表示。相应的分子式出现在说明书结尾、权利要求之前的图解中。
化合物目录
1.细菌叶绿素a(Bchl a)
2.细菌脱镁叶绿甲酯酸a(Bpheid a)
3.Pd-细菌脱镁叶绿甲酯酸a(Pd-Bpheid a)
4.钯31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐[实施例1]
5. 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐[实施例2]
6.钯 细菌脱镁叶绿甲酯酸a 173-(3-磺基-1-氧琥珀酰亚胺)酯钠盐[实施例6]
7.钯 细菌脱镁叶绿甲酯酸a 173-(3-磺基丙基)酰胺钾盐[实施例7]
8.钯 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩 131，173-二(3-磺基丙基)酰胺二钾盐[实施例8]
9.钯 31-(3-磺基丙基亚胺基)-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三钾盐[实施例9]
10.铜(II)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐[实施例3]
11.锌 31-氧代-15-甲氧基羰基甲基-玫红细菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐[实施例4]
12.锰(III)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐[实施例5]
13.钯 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-致红细菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺，173-(N-免疫球蛋白G)酰胺钾盐][实施例10]
14.钯 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩 131-(2-羧乙基)酰胺二钾盐[实施例11]
15.钯 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩 131-(3-膦丙基)酰胺三钾盐[实施例12]
16.钯 31-(3-磺基丙基氨基)-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三钾盐[实施例13]
材料和方法
(i)Bchl a(1)为从前述(WO 00/33833)的RhodovolumSulfidophilum冻干细胞提取并纯化得到。
(ii)钯细菌脱镁叶绿甲酯酸(Pd-Bpheid，2)为如前所述(WO00/33833)制备或通过Negma-Lerads，France得自Steba BiotechLtd.。
(iii)3-氨基-1-丙烷磺酸(高牛磺酸)和3-氨基-1-丙烷膦酸购自Aldrich(USA)，2-氨基乙烷磺酸(牛磺酸)和3-氨基丙酸(β-丙氨酸)购自Sigma(USA)，N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)购自Pierce(USA)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)购自Fluka(瑞士)。
(iv)除了作HPLC时使用HPLC级溶剂之外，使用分析级的化学品和溶剂。
(v)TLC：硅胶板(Kieselgel-60，Merck，德国)；氯仿-甲醇(4∶1，v/v)。
(vi)在Avance DPX 250仪器(Bruker，法国)上记录1H核磁共振(NMR)光谱，并以剩余溶剂峰作为内标的四甲基硅烷低场的ppm(δ)表示。
(vii)通过使Pd浓度(使用PdCl2作为标准的火焰光度法)与在特定波长的受检溶液的光学密度相关测定Pd-衍生物的吸光系数。
(viii)在平台LCZ光谱仪(Micromass，英国)上记录电喷雾离子化质谱(ESI-MS)。
(ix)使用ELAN-6000仪器(Perkin Elmer，CT)进行电感耦合等离子质谱(ICP-MS)，用于测定Pd浓度。
(x)使用Genesis-2(Milton Roy，英国)和V-570(JASCO，日本)分光光度计记录各种络合物的光学吸收。
(xi)使用装备有UV-915二极管阵列检测器的LC-900仪器(JASCO，日本)进行HPLC。
化学实施例
实施例1.钯31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐(化合物4)
在含有120ml的DMSO并在氩气(在溶液中鼓泡)下搅拌的1L圆底烧瓶中溶解935mg的Pd-Bpheid(3)。将牛磺酸(1288mg)溶解于40ml的1M K2HPO4缓冲液中，并(使用HCl)将溶液pH调节为8.2。在搅拌下将该水溶液加入到DMSO溶液中，并继续向溶液中鼓入氩气20分钟。然后在30℃在2毫巴下蒸发反应混合物3.5小时，然后在37℃再蒸发2小时以彻底干燥。将干燥的固体溶解于300ml的MeOH中，并通过脱脂棉过滤有色溶液，以除去过量的缓冲盐和牛磺酸。
通过TLC(未反应的Pd-Bpheid的Rf为0.8-0.85，反应(氨解)产物的Rf为0.08-0.1)和通过跟踪在冻干和在MeOH中重溶之后反应混合物的光学吸收谱测定反应的进行。吸收光谱的特征为从756nm(Pd-Bpheid)到747nm(产物4)的Qy跃迁位移和Pd-Bpheid从534nm到519nm(产物4)的Qx位移。蒸发MeOH并通过使用ODS-A 250×20 S10Pμm柱(YMC，日本)的HPLC纯化产物4。溶剂A：95％的0.005M磷酸盐缓冲液，pH 8.0的5％的甲醇。溶剂B：100％甲醇。将干燥的固体溶解于42ml蒸馏水中并各自以1.5ml小份注入。
洗脱方案在表1中说明。将产物4(见下文图解1)洗脱并在～9-11分钟收集。在4-7分钟收集的主要的杂质(约5-10％)相当于具有所述结构7的副产物。在22-25分钟(约2-5％)的峰可能相当于主要产物4的异构体(iso-form)和未处理的Pd-Bpheid残留。
表1.化合物4梯度纯化方案
时间(分钟) 流速(ml/min) A％ B％
0 12 55 45
14 12 30 70
14.1 6 30 70
16 6 0 100
18 6 0 100
24 6 55 45
29 6 55 45
30 0.5 55 45
减压蒸发溶剂(含水的甲醇)。然后，将纯化的产物4再溶解在～150ml MeOH中并通过脱脂棉过滤。再次蒸发溶剂并将固体颜料4在黑暗中在Ar下在-20℃贮存。反应收率：～90％(以重量计，相对于3)。
通过电喷雾离子质谱确认产物4的结构(ESI-MS，负电模式，图2)(在875(M--K-H)，859(M--2K-H+Na)，837(M--2K)，805(M2K-H-OMe)，719有峰)，1H-NMR光谱(图4，在MeOH-d4中)。
表4提供了主要的NMR峰的位移(以ppm为单位)。
光学吸收(UV-VIS)光谱(MeOH)：λ747(1.00)，516(0.13)，384(0.41)，330(0.50)；ε747(MEOH)为1.2×105mol-1cm-1。
NMR(MeOH-d4)：9.38(5-H，s)，8.78(10-H，s)，8.59(20-H，s)，5.31和4.95(151-CH2，dd)，4.2-4.4(7，8，17，18-H，m)，3.88(153-Me，s)，3.52(21-Me，s)，3.19(121-Me，s)，3.09(32-Me，s)，1.92-2.41、1.60-1.75(171、172-CH2，m)，2.19(81-CH2，m)，1.93(71-Me，d)，1.61(181-Me，d)，1.09(82-Me，t)，3.62，3.05(牛磺酸的CH2)。
辛醇/水的分配比为40∶60。
实施例2. 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐(化合物5)的制备
将160mg的牛磺酸溶解于5ml的1M K2HPO4缓冲液中，并调节溶液的pH为8.2。向该溶液中加入溶解于15ml DMSO中的120mg化合物2，反应和随后的纯化与前述实施例中所述的类似。
吸收光谱(MeOH)：λ750(1.00)，519(0.30)，354(1.18)nm。
ESI-MS(-)：734(M--2K)。
NMR(MeOH-d4)：9.31(5-H，s)，8.88(10-H，s)，8.69(20-H，s)，5.45和5.25(151-CH2，dd)，4.35(7，18-H，m)，4.06(8，17-H，m)，4.20和3.61(牛磺酸的2-CH2，m)，3.83(153-Me，s)，3.63(21-Me，s)，3.52(牛磺酸的3-CH2，m)，3.33(121-Me，s)，3.23(32-Me，s)，2.47和2.16(171-CH2，m)，2.32和2.16(81-CH2，m)，2.12和1.65(172-CH2，m)，1.91(71-Me，d)，1.66(181-Me，d)，1.07(82-Me，t)。
辛醇/水的分配比为60∶40。
实施例3.铜(II)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐(化合物10)的制备
将50mg的实施例2化合物5和35mg的醋酸铜(II)溶解于40ml甲醇中，并向溶液中鼓入氩气10分钟。然后加入500mg的棕榈酰抗坏血酸酯，并搅拌溶液30分钟。吸收光谱的特征为在750nm(5)到768nm(产物10)的Qy跃迁位移和从5的519nm到537nm(产物10)的Qx位移。然后蒸发反应混合物，再溶解于丙酮中并通过脱脂棉过滤除去过量的醋酸盐。蒸发丙酮并另外通过HPLC在表2中所述洗脱方案的条件下纯化产物。
减压下蒸发溶剂(含水的甲醇)。然后将纯化的颜料10再溶解于甲醇中并通过脱脂棉过滤。再次蒸发溶剂并在Ar在黑暗中在-20℃贮存固体颜料10。反应收率：90％。
表2.化合物10梯度纯化方案
时间(分钟) 流速(ml/min) A％ B％
0 12 58 42
14 12 45 55
14.1 6 45 55
16 6 0 100
18 6 0 100
24 6 58 42
29 6 58 42
30 0.5 58 42
吸收光谱(MeOH)：λ768(1.00)，537(0.22)，387(0.71)和342(0.79)nm。
ESI-MS(-)：795(M--2K)。
辛醇/水的分配比为40∶60。
实施例4.锌31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐(化合物11)的制备
如前所述(美国专利5,726,169)使用醋酸中的醋酸锌将Zn嵌入到化合物5中。以与实施例2中化合物5同样的条件通过HPLC进行最终的纯化。
吸收光谱(MeOH)：λ762(1.00)，558(0.26)，390(0.62)和355(0.84)nm。
辛醇/水的分配比为50∶50。
实施例5.锰(III)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐(化合物12)的制备
使用对如前所述(WO 97/19081、US 6,333,319)的方法略加改变的方法使用醋酸中的醋酸锌将锰嵌入到化合物5中。因此，将在10ml的DMF中的50mg的化合物5与220mg乙酸镉搅拌并在氩保护气氛下在110℃下加热约15分钟(通过在丙酮中的从519到585nm的Qx跃迁吸收谱带移动监测Cd-络合物的形成)。然后将反应混合物冷却并蒸发。将干燥的残余物再溶解于15ml的丙酮中并与氯化锰(II)搅拌以形成Mn(III)-产物12。通过在丙酮中的从585到600nm的Qx跃迁吸收谱带移动和从768到828nm的Qx跃迁吸收谱带移动监测产物的形成。蒸发丙酮并另外通过HPLC在上述实施例2中提及的条件下以以下表3中所述的洗脱方案纯化产物12，其中溶剂系统包括：A-5％含水甲醇，B-甲醇。
表3.化合物12梯度纯化方案
时间(分钟) 流速(ml/min) A％ B％
0 8 95 5
14 8 55 45
14.1 8 55 45
16 8 0 100
18 8 0 100
24 8 95 5
29 8 95 5
30 0.5 95 5
减压下蒸发溶剂(含水的甲醇)并在-20℃下在黑暗中在Ar下贮存固体颜料111012。
吸收光谱(MeOH)：λ828(1.00)，588(0.32)和372(0.80)nm。
辛醇/水的分配比为5∶95。
实施例6.钯 细菌脱镁叶绿甲酯酸a 173-(3-磺基-1-氧基-琥珀酰亚胺)酯钠盐(化合物6)的制备
在室温下将50mg的Pd-Bpheid(化合物2)，80mg的N-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和65mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)在7ml的无水DMSO中混合过夜。然后减压下排出溶剂。将干燥的残余物再溶解于氯仿(约50ml)中，滤掉不溶性物质并蒸发。转化率为约95％(TLC)。产物6随后不经进一步的色谱纯化而使用。ESI-MS(-)：890(M-Na)。
NMR(CDCl3)：9.19(5-H，s)，8.49(10-H，s)，8.46(20-H，s)，5.82(132-H，s)，4.04-4.38(7，8，17，18-H，m)，3.85(134-Me，s)，3.47(21-Me，s)，3.37(121-Me，s)，3.09(32-Me，s)，1.77(71-Me，d)，1.70(181-Me，d)，1.10(82-Me，t)，4.05(NHS的CH2，s)，3.45(NHS的CH，s)。
实施例7.钯 细菌脱镁叶绿甲酯酸a 173-(3-磺基丙基)酰胺钾盐(化合物7)的制备
将1ml DMSO中的10mg化合物6与1ml的0.1M K-磷酸盐缓冲液(pH8.0)中的20mg高牛磺酸(3-氨基-1-丙烷磺酸)混合过夜。然后将反应混合物在氯仿/水中分配。无水硫酸钠干燥有机层并蒸发。将干燥的残余物再溶解于氯仿-甲醇(19∶1)中并用于硅胶色谱柱纯化。使用氯仿-甲醇(4∶1)洗脱得到产物7。收率为约80-90％。
ESI-MS(-)：834(M-K)m/z。
NMR(MeOH-d4)：9.16(5-H，s)，8.71(10-H，s)，8.60(20-H，s)，6.05(132-H，s)，4.51，4.39，4.11，3.98(7，8，17，18-H，都是m)，3.92(134-Me，s)，3.48(21-Me，s)，3.36(121-Me，s)，3.09(32-Me，s)，2.02-2.42(171和172-CH2，m)，2.15(81-CH2，q)，1.81(71-Me，d)，1.72(181-Me，d)，1.05(82-Me，t)，3.04、2.68和2.32(高牛磺酸的CH2，m)。
实施例8.钯 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺二钾盐(化合物8)的制备
将10mg的化合物6或7溶解于3ml的DMSO中，将其与1ml的pH为8.2的0.5M K-磷酸盐缓冲液中的100mg高牛磺酸混合，并在室温下保温过夜。然后如上所述减压排出溶剂，在HPLC上纯化产物8。收率：83％。
吸收光谱(MeOH)：747(1.00)，516(0.13)，384(0.41)，330(0.50)，ε747＝1.3×105mol-1cm-1。
ESI-MS(-)：1011(M--K)，994(M--2K+Na)，972(M--2K)，775(M--2K-CO2Me-高牛磺酸NHCH2CH2CH2SO3)，486([M-2K]/2)
NMR(MeOH-d4)：9.35(5-H，s)，8.75(10-H，s)，8.60(20-H，s)，5.28和4.98(15-1-CH2，dd)，4.38，4.32，4.22，4.15(7，8，17，18-H，都是m)，3.85(15-3-Me，s)，3.51(21-Me，s)，3.18(121-Me，s)，3.10(32-Me，s，2.12-2.41(171-CH2，m)，2.15-2.34(81-CH2，m)，1.76-2.02(172-CH2，m)，1.89(71-Me，d)，1.61(181-Me，d)，1.07(82-Me，t).3.82，3.70，3.20，3.10，2.78，2.32，1.90(C-高牛磺酸的131和C-173的CH2)。
实施例9.钯 31-(3-磺基丙基亚胺基)-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三钾盐(化合物9)
在合成8的过程中从HPLC得到化合物9作为副产物。
吸收光谱(MeOH)：729(1.00)，502(0.10)，380(0.69)，328(0.57)。
ESI-MS(30.4.2000)：1171(M-K+H)，1153(M--2K-H+Na)，1131(M-2K)，566([M-K]/2)，364([M-3K]/3)。
NMR(MeOH-d4)：8.71(1H)，8.63(1.5H)，8.23(0.5H)(5-，10-和20-H，都是m)，5.30和4.88(151-CH2，dd)，4.43和4.25(7，8，17，18-H，m)，3.85(15-3-Me，s)，3.31(21-Me，s)，3.22(121-Me，s)，3.17(32-Me，m)，1.89-2.44(171和172-CH2，m)，2.25(81-CH2，m)，1.91(71-Me，s)，1.64(181-Me，s)，1.08(82-Me，t)，4.12，3.56，3.22，3.16，2.80和2.68(高牛磺酸的CH2)。
实施例10.钯 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺，173-(N-免疫球蛋白G)酰胺钾盐(化合物13)
在室温下将10mg的化合物4与1毫升无水DMSO中的20mg磺基-NHS和15mg的EDC反应1小时，然后加入PBS(2.5ml)中的兔IgG(0.6mg)，并在室温下进一步保温混合物过夜。蒸干混合物，然后再溶解于1ml的PBS中并加载到由PBS平衡的Sephadex G-25柱上。使用4-5ml的PBS洗脱色带。分别通过753和280mn的光学密度测定得到的共轭物13中的颜料/蛋白质比，其颜料13/蛋白质为0.5/1到1/1。
实施例11.钯 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-羧乙基)酰胺二钾盐(化合物14)的制备
如实施例2中所述进行标题化合物14的制备和纯化，使化合物2与代替牛磺酸的3-氨基丙酸(β-丙氨酸)(150mg)反应。收率：85％。
实施例12.钯 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(3-膦酸丙基)酰胺三钾盐(化合物15)的制备
如实施例2中所述进行标题化合物15的制备和纯化，使化合物2与代替牛磺酸的3-氨基丙烷膦酸(180mg)反应。收率：68％。
实施例13.钯 31-(3-磺基丙基氨基)-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三钾盐(化合物16)
为了将31-(3-磺基丙基亚胺基)中的亚氨基还原为相应的31-(3-磺基丙基氨基)基团，使化合物9(8mg)在室温下通过搅拌与5ml甲醇中的氰基硼氢化钠(15mg)反应过夜。然后用0.05M HCl(5ml)处理反应混合物，用0.01 M KOH中和并蒸发。在实施例2中所述条件下用HPLC纯化标题产物16。收率：80-90％。
II 生物学部分
材料和方法
体外研究
(i)细胞培养
在包含25mM HEPES、pH 7.4、10％胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(0.06mg/ml)和链霉素(0.1mg/ml)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)/F12(以下简称为“培养液”)中将M2R小鼠黑素瘤、H5V小鼠内皮细胞和C6大鼠神经胶质瘤细胞培养成为单层。细胞在37℃下在8％CO2的湿润环境中生长。
(ii)光毒性分析
为了测定光动力学效力，在各个实验所示的时间和条件下在黑暗中在增加颜料浓度下预培养细胞。通过用培养液洗细胞除去未结合的光敏剂，并在室温下从底部照射板(λ＞650nm，12J/cm2)。光源为装备有4cm水过滤器的100W卤素灯(Osram，德国)。将培养物置于培养孵育器中并在照射24小时后通过中性红生活力分析法测定细胞存活。使用了三种类型的对照：(i)光照对照：在没有颜料的情况下照射细胞；(ii)黑暗对照：用颜料处理细胞但保持在黑暗中；和(iii)保持在黑暗中的未经处理的细胞。
体内研究
(iii)肿瘤植入
在小鼠背上皮下植入M2R或C6细胞(2×106)；在2-3周内肿瘤发展到治疗尺寸(6-8mm)。
(iv)光敏剂的制备
通过在使用之前将干燥的颜料直接溶解于PBS中到所需的注射浓度制备本发明的化合物的储备液。
(v)生物分布和药代动力学
将本发明的颜料4(6mg/kg体重)通过尾部静脉注射给CD1裸鼠。在标示时间将小鼠处死并将标示器官或组织的样品置于预先称重的小瓶中并称重，并立即在干冰上冷冻。检验时，将各个样品解冻并在双蒸水中(1∶10w/v)匀浆。将匀浆的等份试样(0.5ml)在Eppendorff试管中冻干。然后向各个干燥样品中加入0.2ml的HNO3(70％，TraceSelect，Fluka)，在90℃培养1小时并在双蒸水中稀释到10ml。通过ICP-MS测定钯浓度。使用取自未经处理的小鼠的相同的样品测定各个器官/组织的基底值，并相应地减去该数值。
(vi)PDT方案
将患有M2R肿瘤的小鼠麻醉并通过尾部静脉静脉内(i.v.)注射颜料。立即通过755nm二极管激光器(CeramOptec，Germany)以30J/cm2(100mW/cm2)、39J/cm2(130mW/cm2)或45J/cm2(150mW/cm2)的光剂量经皮照射肿瘤5分钟。在治疗之后，将小鼠放回笼中。在黑暗对照组中，为小鼠i.v.注射光敏剂并将其置于黑暗的笼中24小时。在光照对照组中，在45J/cm2下照射小鼠。
(vii)血管的关闭和渗透性
用颜料4(9mg/kg)和光(100mW/cm2，5分钟)处理患有C6神经胶质瘤异种移植的小鼠。在处理后立即注射(0.5ml，i.p.)伊文思蓝(EB，1％的PBS溶液)。在处理后的3和24小时为小鼠照相。在处理后24小时将小鼠处死并制备每只小鼠的皮瓣并照相。然后移取肿瘤，在其上面带有皮肤，在-20℃冷冻1小时，然后制备轴向切片并为切片照相。对照小鼠与被处理的小鼠同时注射伊文思蓝，并对所有小鼠一起进行如上所述的方案。
实施例14.磺化细菌叶绿素衍生物对肿瘤细胞培养物的细胞光毒性
如以上(ii)中所述测定化合物4和8在M2R小鼠黑素瘤和H5V小鼠内皮细胞中的光毒性。在增加化合物浓度下预培养细胞4小时，洗涤并照射或保持在黑暗中。
图1A-1B中所示为双磺化化合物8分别在H5V和MR2细胞中的结果，图2A-2B为单磺化化合物4(对照)分别在H5V和MR2细胞中的结果。可以看出，颜料4和8两者的光毒性为浓度依赖性和光依赖性的，在测试的范围内没有任何的黑暗毒性。两种颜料的LD50相同(～5μM)。并在两个细胞系中相似。
在M2R小鼠黑素瘤细胞上测定磺化颜料5和11的光毒性。在图3和4中可以看出，颜料5和11的光毒性为浓度依赖性和光依赖性的，两种颜料的LD50相同(～5μM)。在测试的范围内没有黑暗毒性。
实施例15.化合物4的药代动力学和生物分布
在测试4对实体黑素瘤异种移植的PDT的光毒性之前的第一步为如上述部分(vi)中所述测定颜料的体内药代动力学和生物分布。在图5可以看出，在i.v.注射后的第一个10分钟内约90％的颜料4以单相动力学模型清除，t0.5为1.65分钟(表4)。4从血液的快速清除可能意味着只有小部分(即使有的话)结合于血浆组分，否则清除会较慢。
表4. 4在小鼠血液中的药代动力学参数
参数
方程 y＝1.64+90.6e(-0.42t)
T<sub>0.5</sub>(分钟) 1.65
K<sub>e1</sub>(分钟<sup>-1</sup>) 0.42
Vd(ml) 2.12
CL(ml/min) 0.89
Ke1-消除速率；Vd-分布容积；CL-清除率。
化合物4的生物分布表明，在小鼠的大多数被测器官中，颜料水平在注射后立即很高，并在20-30分钟内降低到基底水平，它们的清除率与从血液的清除率类似(图6)。这些结果可能表示在脾、肺和心脏中看见的器官的血管系统中截留的血液中的颜料水平。此外，该结果还暗示了到器官中的颜料扩散可以忽略。颜料4迅速地从小鼠体内清除并在注射后30分钟内在所有组织中处于基底水平。4从小鼠体内的清除率比Pd-Bpheid(3)快得多，其只能在注射后48小时达到基底水平(未显示)。
实施例16.用磺化颜料4对CD1裸鼠中的M2R黑素瘤异种移植物的光动力学治疗
基于上述实施例15的结果，设置化合物4的治疗方案为在注射颜料后立即照射5分钟。在这些实验(参见上述部分(vii))中，使用与4的最大吸收相匹配的专用医用激光器(CeramOptec，Germany，755nm)。为了测定最佳的药物/光照方案，用6mg/kg剂量的药物处理小鼠并增加光强(图7)。从Kaplan-Meier存活曲线中可以看出，增加光强使小鼠的治愈率从30J/cm2的43％改善到45J/cm2的60％。当使用30J/cm2的光强将药物剂量升高到9mg/kg时，小鼠存活率有显著的增加，达到70％(图7)。在使用6或9mg/kg处理并保持在黑暗中的动物中没有看到黑暗毒性。
实施例17.化合物4的光动力学治疗的选择性效果
如上述部分(vii)中所述进行该实验。图8说明了光动力学治疗对植入小鼠的C6异种移植物中血液灌流的效果(a，e)。与同一动物的未照射区域和未经处理的动物相比，在PDT之后立即给予伊文思蓝的被处理的动物在照射区域表现出浮肿和增加的由蓝色显示的EB血管渗漏到间质组织(由于白蛋白-伊文思蓝渗漏)(b，f)。在二十四小时后，可以看出，在被处理的小鼠中，肿瘤周围为较深着色的蓝色(浮肿，c)，而由于在PDT之后立即发生血管关闭，肿瘤保持白色(没有EB着色)(d)。肿瘤下的肌肉组织以及肿瘤以上和周围的皮肤(除了被处理区域内)为蓝色，表明没有发生血管关闭(c，d)。在未经处理的动物中，肿瘤与其它组织一样被着色为蓝色(g，h)。本发明的化合物选择性地密封肿瘤中的新生血管，表明其可用于如年龄相关性黄斑变性(AMD)中的异常血管系统的选择性治疗。
实施例18.化合物4的PDT治疗-AMD动物模型
已经针对从脉络膜长出的新形成血管膜诱导局限性血管阻塞(脉络膜新血管形成-CNV)研究了光动力学治疗(PDT)。在年龄相关性黄斑变性(AMD)中，使用维替泊芬的PDT降低了CNV继发的失明的危险。认为PDT的作用机制涉及释放活性氧物质，其破坏内皮细胞和激活下游的内皮凝血级联反应。这些事件导致在血管腔内形成血栓。
对于脉络膜血管增生的治疗已经开发了能够精确集中和靶向病态血管并使对健康视网膜和脉络膜组织的继发性损伤效果最小化的高选择性参数(激光功率密度或流量、光敏剂剂量和光照距离(DLI))。然而，使用目前临床使用的唯一的光敏剂(维替泊芬)，通常需要重复的治疗以实现所需的CNV阻塞效果。因此，侧副组织损伤的危险增加，并可能成为该治疗的显著副作用。
在这一实验中，我们评价了本文中命名为WST11或化合物4的水溶性光敏剂的光动力学治疗(PDT)效力，并将其特征与维替泊芬的那些特征进行了比较。
化合物4为纯的和稳定的细菌叶绿素衍生物，其分离后为黑紫色晶体粉末。其分子量为916，并可溶解于水溶液中。其具有以下特征：(a)有4个主要的吸收峰(750、530、385和330nm)。最强的吸光度接近其中组织透光度最高的红外区(约750nm)；(b)在黑暗中具有非常低的细胞毒性。因此，可通过光剂量和照射时间控制组织损伤；(c)其在给药之后迅速从体内清除。因此，使暴露于环境光照或太阳光照的潜在的皮肤光敏损伤最小化；(d)由于有效的系统间跨越(ISC)活性氧(ROS)的产生量很高。
将WST11粉末在不含内毒素的无菌水中稀释为10mg/ml的浓度，并振摇直到完全溶解。该制剂在4℃下避光保持稳定24小时。为了计算注射的量，根据兔的体重进行调节。通过耳静脉将适当量的溶液以小团(bolus)形式静脉内注射。
使用兔眼模型比较化合物4和维替泊芬(Visudyne，Novartis，Switzerland)对年龄相关性黄斑变性(AMD)的PDT效力。使用着色的兔(136“Fauve de Bourgogne”兔，10-12周龄，2.5-3kg，Elevagedes Pins，Epeigne-sur-Deme，France)。根据以下参数研究急性和长期PDT对兔眼的效果：1)753nm激光流(25和50J/cm2)、化合物4(也称为WST11)剂量(2.5和5mg/kg)和光照间距(DLI)为1、5、10和15分钟。2)689nm激光流(10、50、100J/cm2)，维替泊芬剂量(3、6和12mg/m2)，恒定的DLI为5分钟。递送这些对脉络膜及叠加的视网膜具有一系列作用的PDT参数83秒，以诱导阻塞、阈下阻塞和非阻塞的血管事件。检查了经过治疗的兔眼并随后在PDT后以不同的间隔进行间接眼底检查、荧光素血管造影(FA)和组织学检查。使用流量为50J/cm2、5mg/kg药物剂量和DLI为1分钟的WST11 PDT在100％的经过处理的眼中诱导了与叠加的RPE和视网膜结构损害有关的完全脉络膜阻塞(图9A-9D)。较弱的非阻塞PDT参数(25J/cm2，5mg/kg药物剂量和DLI为10分钟)没有诱导脉络膜毛细血管阻塞也没有诱导视网膜损害。使用药物剂量为12mg/m2、流量为100J/cm2的和DLI为5分钟的维替泊芬PDT在89％的眼睛中诱导了阻塞事件(通过FA观察)，并在所有的眼睛中诱导了叠加的视网膜和RPE层的组织学损伤。使用药物剂量为3mg/m2、流量为10J/cm2和DLI为5分钟的较弱的非阻塞的维替泊芬PDT参数在FA上没有诱导任何的脉络膜毛细血管阻塞。然而，在这些眼睛中，在组织学上观察到视网膜和脉络膜组织的有限的结构破坏。与维替泊芬类似，WST11 PDT在直到处理后一周诱导了脉络膜毛细血管的短暂阻塞。与维替泊芬不同，没有诱导血管阻塞的WST11 PDT参数也没有引起RPE或视网膜结构破坏。因此，尽管其具有诱导血管阻塞的能力，但当没有发生脉络膜毛细血管阻塞时，WST11 PDT不引起RPE和叠加的视网膜的损害。这些特征的优点表明WST11为用于年龄相关性黄斑变性中CNV的PDT治疗的适合候选物。
对于组织学，在双目显微镜下解剖摘出的眼睛。使用4mm的活检穿孔器(biopsy punch)切除处理区域的全部厚度。将这些组织在戊二醛中固定，在二甲胂酸盐缓冲液中处理并包在塑料中。使用切片机得到半薄切片并使用苏木素-曙红复染。使用相差显微镜分析这些切片。对感兴趣的特定部位进一步处理用于TEM。使用切片机得到超薄切片并使用乙酸双氧铀复染。
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Figure A20038010890600431
                            图解1

Claims (39)

1.式II的包含至少一个带负电荷的基团和/或在生理pH条件下转化为带负电荷的基团的酸性基团的细菌叶绿素衍生物：
其中
M表示2H或选自二价的Pd、Pt、Co、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn，和三价的Fe、Mn和Cr的金属原子；
R1、R2和R4各自独立地为Y-R5；
Y为O、S或-NR6；
R3选自-CH＝CH2、-C(＝O)-CH3、-C(＝O)-H、-CH＝NR7、-C(CH3)＝NR7、-CH2-OR7、-CH2-SR7、-CH2-NR7R′7、-CH(CH3)-OR7、-CH(CH3)-SR7、-CH(CH3)-NR7R′7、-CH(CH3)Hal、-CH2-Hal、-CH2-R7、-CH＝CR7R′7、-C(CH3)＝CR7R′7、-CH＝CR7Hal、-C(CH3)＝CR7Hal、和-C≡CR7；
R5、R6、R7和R′7各自独立地为H或选自：
(a)C1-C25烃基，其任选包含一个或多个杂原子、碳环或杂环部分，和/或任选被选自卤素、氧代、OH、SH、CHO、NH2、CONH2、带负电荷的基团、和在生理pH条件下转化为带负电荷的基团的酸性基团的一个或多个官能团取代；
(b)氨基酸、肽或蛋白质的残基；和
(c)当Y为O或S时，R5可进一步为R8 +；
m为0或1；和
R8 +为H+或阳离子；
条件是：
(i)R5、R6、R7和R′7中的至少一个为由带负电荷的基团或在生理pH条件下转化为带负电荷的基团的酸性基团取代的上述(a)中定义的烃链；或
(ii)R1、R2和R4中的至少一个为OH、SH、O-R8 +或S-R8 +；或
(iii)R1、R2和R4中的至少一个为OH、SH、O-R8 +或S-R8 +，和R5、R6、R7和R′7中的至少一个为由带负电荷的基团或由在生理pH条件下转化为带负电荷的基团的酸性基团取代的烃链；或
(iv)R1、R2和R4中的至少一个为OH、SH、O-R8 +或S-R8 +，和R5、R6、R7和R′7中的至少一个为氨基酸、肽或蛋白质的残基；或
(v)R5、R6、R7和R′7中的至少一个为由带负电荷的基团或由在生理pH条件下转化为带负电荷的基团的酸性基团取代的烃链，和R5、R6、R7和R′7中的至少一个为氨基酸、肽或蛋白质的残基；
但是排除其中M为2H、R3为-C(＝O)CH3、R1、R2和R4为OH、m为0或1的式II的化合物。
2.权利要求1的细菌叶绿素衍生物，其包含两个带负电荷的基团。
3.权利要求1的细菌叶绿素衍生物，其包含三个带负电荷的基团。
4.权利要求1到3中任一项的细菌叶绿素衍生物，其中所述带负电荷的基团选自COO-、COS-、SO3 -、和/或PO3 2-。
5.权利要求1的细菌叶绿素衍生物，其中所述在生理pH条件下转化为带负电荷的基团的酸性基团选自COOH、COSH、SO3H和/或PO3H2。
6.权利要求1的式II的细菌叶绿素衍生物，其中R1为Y-R5；Y为O、S或NH；R5为由选自OH、SH、SO3H、NH2、CONH2、COOH、COSH、PO3H2的官能团取代的烃链。
7.权利要求1的式II的细菌叶绿素衍生物，其中R5为氨基酸、肽或蛋白质的残基。
8.权利要求1的式II的细菌叶绿素衍生物，其包含中心Pd金属原子。
9.权利要求1的式II的细菌叶绿素衍生物，其中：
M表示2H，二价的Pd、Cu、或Zn，或三价的Mn；
R1为-O-R8 +、-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、-NH-(CH2)n-COO-R8 +、-NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2；或Y-R5，其中Y为O、S或NH，R5为氨基酸、肽或蛋白质的残基；
R2为C1-C6烷氧基，选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基；
R3为-C(＝O)-CH3、-C(CH3)＝N-(CH2)n-SO3 -R8 +、-C(CH3)＝N-(CH2)n-COO-R8 +、-C(CH3)＝N-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2、-CH2-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、-CH2-NH-(CH2)n-COO-R8 +或-CH2-NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2；
R4为-NH-(CH2)n-SO3 -R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8 +、-NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2；
R8 +为单价阳离子，选自K+、Na+、Li+、NH4 +；
m为1，n为1到10的整数。
10.权利要求9的细菌叶绿素衍生物，其中n为2或3。
11.权利要求1的式II的细菌叶绿素衍生物，其中：
M为二价的Pd；
R1为-O-R8 +、-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、或Y-R5，其中Y为O、S或-NH，R5为氨基酸、肽或蛋白质的残基；
R2为C1-C6烷氧基；
R3为-C(＝O)-CH3、-C(CH3)＝N-(CH2)n-SO3 -R8 +、或-CH2-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +；
R4为-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、NH-(CH2)n-COO-R8 +、NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2；
R8 +为单价阳离子；
m为1，和n为2或3。
12.权利要求11的式II的细菌叶绿素衍生物，其包括化合物：
钯31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐；
31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐；
钯31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺二钾盐；
钯31-(3-磺基丙基亚胺基)-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三钾盐；
铜(II)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐；
锌31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐；
锰(III)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐；
钯31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺，173-(N-免疫球蛋白G)酰胺钾盐；
钯31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-羧基乙基)酰胺二钾盐；
钯31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(3-膦酸基丙基)酰胺三钾盐；和
钯31-(3-磺基丙氨基)-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三钾盐。
13.权利要求12的细菌叶绿素衍生物，为钯31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐。
14.药物组合物，其包括权利要求1到13中任一项的式II细菌叶绿素衍生物和可药用载体。
15.用于光动力学治疗的权利要求14的药物组合物。
16.用于血管靶向光动力学治疗的权利要求15的药物组合物。
17.用于肿瘤包括转移性肿瘤的光动力学治疗的权利要求15或16的药物组合物。
18.用于黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、或前列腺癌的光动力学治疗的权利要求17的药物组合物。
19.用于年龄相关性黄斑变性的光动力学治疗的权利要求15或16的药物组合物。
20.用于良性前列腺肥大的光动力学治疗的权利要求15或16的药物组合物。
21.用于肿瘤诊断的权利要求14的药物组合物。
22.用于杀死细胞或包括细菌和病毒的传染物的权利要求14的药物组合物。
23.用于在照射生物制品时体外杀死所述制品中的细胞或包括细菌和病毒的传染物的权利要求22的药物组合物。
24.权利要求23的药物组合物，其中所述生物制品为血液。
25.权利要求1到13中任一项的式II化合物用于生产用于光动力学治疗的药物组合物的用途。
26.权利要求25的用途，用于肿瘤包括转移性的肿瘤的光动力学治疗。
27.权利要求26的用途，用于黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、或前列腺癌的光动力学治疗。
28.权利要求25的用途，用于年龄相关性黄斑变性的光动力学治疗。
29.权利要求1到13中任一项的化合物用于生产用于肿瘤诊断的药物组合物的用途。
30.权利要求1到13中任一项的化合物用于生产杀死细胞或包括细菌和病毒的传染物的药物组合物的用途。
31.化合物钯细菌脱镁叶绿甲酯酸a 173-(3-磺基-1-氧琥珀酰亚胺)酯钠盐，作为权利要求1中式II细菌叶绿素衍生物的中间体。
32.制备其中R1为-O-R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R4为基团-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的权利要求1的式II的化合物的方法，该方法包括：
(i)使相应的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8 +-缓冲液中反应；
Figure FSB00000113079900051
和
(ii)分离所需的式II的化合物。
33.用于制备钯31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫红细菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二钾盐的权利要求32的方法，其包括：(i)使Pd-细菌脱镁叶绿甲酯酸α与式H2N-(CH2)2-SO3H的牛磺酸在K+-缓冲液中反应；和(ii)分离标题化合物。
34.制备其中R1为-O-R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R4为基团-NH-(CH2)n-COO-R8 +、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的权利要求1的式II的化合物的方法，该方法包括：
(i)使相应的权利要求32的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与式H2N-(CH2)n-COOH的氨基羧酸在R8 +-缓冲液中反应；和
(ii)分离所需的式II的化合物。
35.制备其中R1为-O-R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R4为基团-NH-(CH2)n-PO3 2-(R8 +)2、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的权利要求1的式II的化合物的方法，该方法包括：
(i)使相应的权利要求32的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与式H2N-(CH2)n-PO3H2的氨基膦酸在R8-缓冲液中反应；和
(ii)分离所需的式II的化合物。
36.制备其中R1和R4包含同样的带负电荷的基团的权利要求1的式II的化合物的方法，该方法包括：
(i)使相应的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与过量的氨基磺酸、氨基羧酸或氨基膦酸在R8 +-缓冲液中反应；和
(ii)分离所需的式II的13，17-二取代衍生物。
37.制备其中R1和R4各自为基团-NH-(CH2)n-SO3 -R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的权利要求1的式II化合物的方法，该方法包括：
(i)使相应的权利要求32的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与N-羟基-磺基琥珀酰亚胺在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的存在下偶联；
(ii)使得到的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸-173-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯与过量的式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8 +-缓冲液中反应，从而得到在17位具有唯一带负电荷的基团的式I的化合物；
(iii)将步骤(ii)的产物与过量的H2N-(CH2)n-SO3H在R8 +-缓冲液中反应；和
(iv)分离所需的式II的化合物。
38.制备其中R1和R4各自为基团-NH-(CH2)n-COO-R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的权利要求1的式II化合物的方法，该方法包括：
(i)使相应的权利要求32的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与N-羟基-磺基琥珀酰亚胺在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的存在下偶联；
(ii)使得到的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸-173-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯与过量的式H2N-(CH2)n-COOH的氨基羧酸在R8 +-缓冲液中反应，从而得到在17位具有唯一带负电荷的基团的式I的化合物；
(iii)将步骤(ii)的产物与过量的H2N-(CH2)n-COOH在R8 +-缓冲液中反应；和
(iv)分离所需的式II的化合物。
39.制备其中R1和R4各自为基团-NH-(CH2)n-PO3 2-R8 +、R2为-OCH3、R3为乙酰基、R8 +为单价阳离子、m为1、n为1到10的权利要求1的式II的化合物的方法，其包括：
(i)使相应的权利要求32的式I的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸与N-羟基-磺基琥珀酰亚胺在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的存在下偶联；
(ii)将得到的M-细菌脱镁叶绿甲酯酸-173-N-羟基-磺基琥珀酰亚胺酯与过量的式H2N-(CH2)n-PO3H2的氨基膦酸在R8 +-缓冲液中反应，从而得到在17位具有唯一带负电荷的基团的式I的化合物；
(iii)将步骤(ii)的产物与过量的H2N-(CH2)n-PO3H2在R8 +-缓冲液中反应；和
(iv)分离所需的式II的化合物。
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