MXPA05005262A

MXPA05005262A - Derivados anionicos de bacterioclorofila solubles en agua y sus usos.

Info

Publication number: MXPA05005262A
Application number: MXPA05005262A
Authority: MX
Inventors: Ohad Mazor
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 2002-11-17
Filing date: 2003-11-17
Publication date: 2005-07-25
Also published as: EP1567147B1; CN1741801B; FR18C0002I1; US7947672B2; DK1567147T3; US20110117029A1; AU2003282354A1; US20170143988A1; BRPI0316319B8; CA2506296A1; HK1081858A1; BE2018C018I2; CN1741801A; US20200094069A1; US20130345417A1; IL168480A; US8461142B2; RU2353624C2; JP2011162551A; PL216661B1

Abstract

La invencion proporciona derivados anionicos de bacterioclorofila tetraciclicos y pentaciclicos solubles en agua (Bchls) que contienen al menos uno, preferiblemente dos o tres, grupos negativamente cargados y/o grupos acidos que se convierten a grupos negativamente cargados al pH fisiologico, preferiblemente Bchls que tienen un grupo COO-, COS-, SO3-, PO32-, COOH, COSH, SO3H, y/o PO3H2 enlazado a traves de un enlace ester o amida a una o mas de las posiciones 173, 133, y 32 de la molecula Bchl tetraciclica o pentaciclica, para terapia fotodinamica y diagnostico.

Description

DERIVADOS AMONICOS DE BACTERIOCLOROFILA SOLUBLES EN AGUA Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a derivados aniónicos novedosos solubles en agua de bacterioclorofila, a su preparación y su uso en métodos de terapia fotodinámica in vivo y diagnóstico de tumores y diferentes enfermedades vasculares tales como la degeneración macular relacionada con la edad, así como métodos de exterminación in vivo y ex vivo de virus y microorganismos.

DEFINICIONES Y ABREVIATURAS AMD: Degeneración macular relacionada con la edad; Bchl: bacterioclorofila a -7,8,17, 8-tetrahidroporfirina pentacíclica con un 5t0 anillo isocíclico, un átomo central de Mg, un grupo fitilo o geranilgeranilo en la posición 173, un grupo COOCH3 en la posición 132, un átomo H en la posición 132, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 12, 18, un grupo acetilo en la posición 3 y un grupo etilo en la posición 8; Bphe: bacteriofeofitina a (Bchl en la cual el Mg central se reemplaza por dos átomos H); Bpheid: bacteríofeoforburo a (el derivado de ácido carboxílico libre de C-172 a partir de BPhe); Pd-Bpheid: bacteríofeoforburo a Pd; PDT: terapia fotodinámica Rodobacterioclorina: 7,8,17,18-tetrahidroporfirina tetracíclica que tiene un grupo CH2CH2COOH en la posición 7, un -COOH en la posición 3, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 12, 8 y grupos etilo en las posiciones 3 y 8. La numeración IUPAC de los derivados de bacterioclorofila se usa a lo largo de la especificación. Con el uso de esta nomenclatura, las bacterioclorofilas naturales llevan dos ásteres de ácido carboxílico en las posiciones 132 y 172, sin embargo esterifican en las posiciones 133 y 173.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La terapia fotodinámica (PDT) es un tratamiento no quirúrgico de tumores en el cual se combinan fármacos no tóxicos y radiación fotosensible no riesgosa para generar especies de oxígeno reactivas citotóxicas in situ. Esta técnica es más selectiva que la quimioterapia y radioterapia de tumores comúnmente usada. A la fecha, se han empleado las porfirinas como los agentes primarios fotosensibilizantes en clínicas. Sin embargo, los sensibilizadores actuales padecen de diversas deficiencias que limitan su aplicación, incluyendo principalmente: (1) absorción relativamente débil en el intervalo espectral visible que limita el tratamiento de tumores poco profundos; (2) acumulación y retención prolongada del sensibilizador en la piel del paciente, lo que conduce a una fototoxicidad prolongada de la piel (días hasta meses); y (3) diferenciación pequeña o aún ninguna diferenciación entre el efecto PDT en el tumor iluminado y tejidos sin tumor. Los inconvenientes de los fármacos actuales inspiraron una búsqueda detallada de sensibilizadores de segunda generación que absorben longitudes de ondas largas que muestran una mejor diferenciación entre su retención en células de tumor y la piel o en tejidos normales. Con objeto de optimizar el desempeño de los fármacos de porfirina en terapéuticos y diagnósticos, se han propuesto diversos derivados de la porfirina en los cuales, por ejemplo, existe un átomo de metal central (diferentes al Mg) que forma complejos con los cuatro anillo de pirrol, y/o los substituyentes periféricos de los anillos de pirrol se modifican y/o se deshidrogena el macrociclo a los derivados de clorofila, (clorinas) o los derivados tetrahidrogenados a las bacterioclorofilas (bacterioclorinas). Debido a su absorción intensa en regiones espectrales favorables (650-850 nm) y su fácil degradación después del tratamiento, los derivados de clorofila y bacterioclorofila se han identificado como sensibilizadores excelentes para PDT de tumores y tienen propiedades superiores en comparación con las porfirinas, pero están menos fácilmente disponibles y son más difíciles de manejar.

Las bacterioclorofilas son de ventaja potencial en comparación con las clorofilas debido a que muestran bandas intensas cercanas al infrarrojo, esto es a longitudes de onda considerablemente mayores que los derivados de clorofila. Los espectros, fotofísica, y fotoquímica de las bacterioclorofilas nativas (Bchls) las ha hecho moléculas óptimas de cosecha de luz con ventajas claras sobre otros sensibilizadores actualmente usados en PDT. En particular, estas moléculas tiene un coeficiente muy elevado de extinción a longitudes de onda prolongadas ( max=760-780 nm, e=(4-10)?104 M" cm"1), en donde la luz penetra profundamente en los tejidos. También generan especies de oxígeno reactivas (ROS) en un alto rendimiento de quantum (dependiendo del metal central). Bajo condiciones normales de entrega, esto es, en presencia de oxígeno a temperatura ambiente y bajo condiciones de luz normales, las porciones BChl son inestables y tienen de alguna manera rendimientos inferiores de quantum para la formación del estado triplete, cuando se comparan con, por ejemplo, el derivado de hematoporfirina (HPD). Sin embargo, su posible iniciación de reacciones biológicas de óxido reducción, características espectrales favorables y su fácil degradación in vivo resultan en una superioridad potencial de las bacterioclorofilas sobre otros compuestos, por ejemplo, las porfirinas y las clorofilas, para terapia y diagnóstico PDT, y para exterminio de células, virus y bacterias en muestras y tejido vivo. La modificación química de las bacterioclorofilas se espera que mejore además sus propiedades, pero esto ha estado muy limitado debido a una carencia de métodos adecuados para la preparación de tales bacterioclorofilas modificadas. La absorción biológica y la eficacia PDT de derivados libres de metal de Bchl se ha estudiado con el objetivo de manipular la afinidad de los sensibilizadores al compartimiento celular de tumores. De manera cardinal a este método está el uso de fármacos altamente lipofílicos que pueden incrementar la acumulación del fármaco en las células de tumor, pero también hace difícil su suministro. Además, la biodistribución reportada muestran niveles de fármaco fototóxicos en tejidos que no son de tumor durante promedios prolongados (al menos días) después de administrar el fármaco. En la patente de Israel previa del solicitante No. 102645 y las correspondientes EP 0584552, US 5,726,169, US5,726,169, US 5,955,585 y US 6,147,195, se tomó un método diferente por los inventores. Se estudiaron los sensibilizadores altamente eficientes antivasculares que no extravasan de la circulación después de la administración y tienen .un tiempo de vida corto en la sangre. Se espera que la diferencia inherente entre los vasos de tejidos normales y anormales tales como tumores u otros tejidos que se soportan en los neovasos, permitiría una destrucción relativamente selectiva del tejido anormal. Así, se ayuda a sintetizar los derivados de Bchl que son más polares y, así, tiene una mejor posibilidad de permanecer en el comportamiento vascular, en donde transportan el efecto fotodinámico principal. Hasta este punto, el residuo de geranilgeranilo en la posición C-17 de Bchl (compuesto 1, detallado en el Esquema 1 en la presente) se ha reemplazado por diversos residuos tales como aminoácidos, péptidos o proteínas que mejoran la capacidad hidrofílica del sensibilizador. Un derivado particular, Bchl-Ser (Esquema 1 , Compuesto 1 , en donde R es serilo), se encontró que era soluble en agua y altamente fototóxico en cultivo celulares. Después de una inyección intraperitoneal, el Bchl-Ser se depuró de la sangre de ratón y los tejidos bioexponencialmente en un tiempo relativamente corto ( ¡2 ~ y 16 h, respectivamente). La depuración de la circulación fue aún más rápida después de una inyección intravenosa. Bajo el protocolo del tratamiento seleccionado (aplicación de luz dentro de minutos después de la inyección de fármaco), se otorgó predominantemente la fototoxicidad a la vasculatura del tumor (Rosenbach-Belkin et al., 1996; Zilberstein et al., 2001 y 1997). Sin embargo, desafortunadamente, como el Bchl nativo, el derivado de Bchl-Ser se somete a una rápida foto-oxidación, formando el correspondiente éster de 2-desvinil-2-acetil-clorofiluro y otros productos. Para incrementar la estabilidad de los derivados de Bchl, el átomo central de Mg se reemplazó por Pd en la última publicación PCT del solicitante WO 00/33833 y US 6,569,846. Este átomo pesado se demostró previamente que incrementa notablemente el potencial de oxidación del macrociclo Bchl y al mismo tiempo mejora ampliamente la velocidad de cruce entre sistemas (1SC) de la molécula en su estado de triplete. Se efectuó un reemplazo de metal por la incorporación directa del ión Pd2+ dentro de una molécula Bpheid, como se describe en WO 00/33833. Con base en la biodistribución del pigmento y la farmacocinéticos, se supone que el derivado Pd-Bpheid permaneció en circulación por un tiempo muy corto sin prácticamente extravasación a otros tejidos, y por lo tanto es un buen candidato para el PDT de direccionamiento vascular que evita la fototoxicidad de la piel. El efecto de tratamiento en los vasos sanguíneos se demostró por una microscopía intravital de vasos sanguíneos tratados y tinción con azul Evans. Al usar un protocolo de tratamiento con un intervalo mínimo de fármaco a luz, Pd-Bpheíd (también designado como Tookad) se encontró que era efectivo en la erradicación de diferentes tumores en ratones, ratas y otros modelos animales y está actualmente entrando a los ensayos clínicos de fase l/ll en pacientes con cáncer de próstata que fallaron en la terapia de radiación (Chen et al., 2002; Schreiber et al., 2002; Koudinova et al., 2003). Debido a su baja solubilidad en soluciones acuosas, el uso clínico de Pd-Bpheid requiere del uso de agentes de solubilización tales como Cremophor que pueden provocar efectos colaterales a dosis elevadas. Sería altamente deseable hacer al Pd-Bpheid soluble en agua mientras se conservan sus propiedades físico-químicas. Alternativamente, sería deseable preparar derivados de Bchl que sean citofototóxicos y, al mismo tiempo, más solubles en agua que el Pd-Bpheid mismo. Tal solubilidad en agua se espera que mejore además la retención del fármaco en la circulación y, con ello, la selectividad antes mencionada. Además, al no tener necesidad de utilizar portadores tales como detergentes o liposomas, se pueden evitar efectos colaterales.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un derivado de bacterioclorofila que contiene al menos uno, preferiblemente dos o tres, grupos cargados relativamente y/o grupos ácidos que se convierten en grupos cargados negativamente a un pH fisiológico, excluyendo los derivados pentacíclicos de bacterioclorofila que tienen un grupo CH2CH2COOH libre o CH2CH2COO en la posición 17, y derivados tetracíclicos de bacterioclorofila desprovistos de un átomo de metal central y que tienen un grupo -CH2CH2COOH en la posición 17, un grupo CH2COOH o -COOH en la posición 15, un grupo -COOH en la posición 13, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 2, 18 y grupos etilo en las posiciones 3 y 8. Los grupos cargados negativamente de conformidad con la invención incluyen, pero no se limitan a, carboxilato (COO), tiocarboxilato (COS), sulfonato (S03) y fosfonato (P032"), y los grupos ácidos a partir de los cuales los grupos cargados se originan a un pH fisiológico son los grupos de ácidos carboxílico (COOH), tiocarboxilico (COSH), sulfónico (S03H) y fosfónico (P03H2), respectivamente. En una modalidad, el derivado de bacterioclorofila tiene la fórmula I o II: en donde M representa 2H o un átomo de metal seleccionado del grupo que consiste de Pd, Pt, Co, Sn, Ni, Cu, Zn y Mn bivalente, y Fe, Mn y Cr trivalente; R-i, R2 y R cada uno independientemente es Y- R5; Y es O, S o NR5R6; R3 es seleccionado del grupo que consiste de -CH=CH2, -C(=0)-CH3, -C(=0)-H, CH=NR7, -C(CH3)=NR7, -CH2-SR7, -CH2-NR7R 7, -CH(CH3)-R7, -CH(CH3)-SR7, -CH(CH3)-NR7R'7, -CH(CH3)Hal, -CH2-R7, -CH=CR7R'7, -C(CH3)=CR7R'7, -CH=CR7Hal, -C(CH3)=CR7Hal, y -C=CR7; R5, 6, R7 y R cada uno independientemente es H o se selecciona del grupo que consiste de: (a) hidrocarbilo de C1-C25 que opcionalmente contiene uno o más heteroátomos, porciones carbocíclicas o heterocíclicas, y/u opcionalmente substituido por uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de halógeno, oxo, OH, SH, CHO, NH2, CONH2, un grupo cargado negativamente, y un grupo ácido que se convierte a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico; (b) un residuo de un aminoácido, un péptido o de una proteína; y (c) cuando Y es O, o S, R5 puede además ser R8+; m es 0 ó 1 ; y Re+ es H+ o un catión; con la condición de que: (i) al menos uno, preferiblemente dos, de R5, R6, R7 y RV es una cadena de hidrocarburo como se define en (a) arriba substituido por un grupo cargado negativamente o por un grupo ácido que se convierte a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico; o (ii) al menos uno, preferiblemente dos, de R-i, R2 y R4 es OH, SH, O'R8+ o S'R8+; (¡ii) al menos uno de Ri, R2 y R4 es OH, SH, O"Rs+ O S"R8+ y al menos uno de R5, R6, R7 y R es una cadena de hidrocarburo substituido por un grupo cargado negativamente o por un grupo ácido que se convierte a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico; o (iv) al menos uno de R^ R2 y R4 es OH, SH, O"R8+ O S"RS+ y al menos uno de R5, R6, R7 y RV es un residuo de una aminoácido, un péptido o de una proteína; o (v) al menos uno de R5, R6, R7 y RV es una cadena de hidrocarburo substituido por un grupo cargado negativamente o por un grupo ácido que se convierte a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico y al menos uno de R5, [¾, R7 y RV es un residuo de un aminoácido, un péptido o de una proteína; pero excluyendo los compuestos de la fórmula I en donde M es como se define, R3 es -C(=0)CH3, 1 es OH u OR8+ y R2 ES -OCH3, y el compuesto de la Fórmula II en donde es 2H, R3 es -C(=0)CH3, R-i, R2 y R4 son OH, y m es 0 ó 1. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de bacterioclorofila como se define arriba para una terapia fotodinámica (PCT) particularmente para el direccionamiento vascular PDT, por ejemplo para PDT de tumores de una degeneración macular relacionada con la edad (AMD), o para exterminar células o agentes infecciosos que comprenden bacterias y virus in vivo o in vitro, así como para propósitos de diagnóstico. La invención proporciona un método para una terapia fotodinámica usando un fotosensibiiizador, en donde la mejora consiste en que el fotosensibiiizador es un derivado de bacterioclorofila de la invención. De acuerdo con este aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento por PDT que comprende administrar a un individuo que necesita una cantidad efectiva de un derivado de bacterioclorofila de la invención seguido por irradiación local. La invención proporciona además un método para el diagnóstico de tumores usando un fotosensibiiizador en donde la mejora consiste en que el fotosensibiiizador es un derivado de bacterioclorofila de la invención. De acuerdo con este aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de tumores que comprende administrar a un individuo que se sospecha que tiene un tumor, una cantidad efectiva de un derivado de bacterioclorofila de la invención, seguido por irradiación local y medición de la fluorescencia del área sospechosa, en donde una fluorescencia superior indica sitios de tumor. La invención todavía proporciona además un método para exterminar células o agentes infecciosos que comprende bacterias y virus, usando un fotosensibilizador, la mejora en donde el fotosensibilizador es un derivado de bacterioclorofila de la invención. De acuerdo con este aspecto, la invención se refiere a un método para la esterilización de productos biológicos, por ejemplo sangre, que comprende agregar al producto biológico, por ejemplo sangre, una cantidad efectiva de un derivado de bacterioclorifla de la invención, seguido por irradiación.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Los diferentes compuestos de la invención están representados en la siguiente descripción de los dibujos por números en negritas y subrayados. Su identificación completa se encuentra en la lista de compuestos al comienzo de la Sección Química de aquí en adelante. Las figuras A- 1B son gráficas que muestran ia fototoxicidad del compuesto sulfonado 8 en células endoteliales de ratón H5V (Fig. 1A) y células de melanoma de ratón M2R (Fig. 1B). Se incubaron las células con concentraciones crecientes de 8 por 4 horas, se lavaron e iluminaron (formas abiertas) o se mantienen en la oscuridad (control oscuro, formas cerradas). Los puntos son promedio de triplicados ± STD. Las figuras 2A-2B son gráficas que muestran la fototoxicidad del compuesto sulfonado 4 en células endoteliales de ratón H5V (Fig. 2A) y células de melanoma de ratón M2R (Fig. 2B). Se incubaron las células con concentraciones crecientes del compuesto 4 durante 4 horas, se lavaron e iluminaron (formas abiertas) o se mantienen en la oscuridad (control oscuro, formas cerradas). Los puntos son promedio de los triplicados ± STD. La figura 3 es una gráfica que muestra la fototoxicidad del compuesto sulfonado 5 en células de melanoma de ratón M2R (Fig. 2B). Se incubaron las células con concentraciones crecientes del compuesto 5 durante 4 horas, se lavaron e iluminaron (círculos) o se mantienen en la oscuridad (control oscuro, diamantes). Los puntos son promedio de los triplicados. La figura 4 es una gráfica que muestra la fototoxicidad del compuesto sulfonado 11 en células de melanoma de ratón M2R (Fig. 2B). Se incubaron las células con concentraciones crecientes del compuesto 1 por 4 horas, se lavaron e iluminaron (círculos) o se mantienen en la oscuridad (control oscuro, diamantes). Los puntos son promedio de los triplicados. La figura 5 es una gráfica que muestra la farmacocinética del compuesto 4 en sangre de ratones descubiertos CD1. Después de la inyección del compuesto 4 (6 mg/kg), se recolectaron muestras de sangre del mismo ratón y se determinó el Pd. Cada punto de tiempo representa un promedio de 3 ratones ± STD. La figura 6 muestra la biodistribución del compuesto 4 en ratones descubiertos con CD1. Se sacrificaron los ratones en tiempos diferentes siguiendo la inyección del compuesto 4 (6 mg/kg), y se determinó el contenido de Pd para los órganos indicados. Cada punto de tiempo representa un promedio de tres ratones ± STD. La figura 7 muestra el PDT de xenoinjertos de melanoma con el compuesto 4. Los ratones que soportan xenoinjertos de melanoma M2R se inyectaron de forma intravenosa con el compuesto 4 (6 mg/kg"1) y se iluminaron por 5 minutos con intensidad de luz de 30J/cm2 (n=14, cuadrados llenos), 39J/cm2 (n=8, diamantes llenos), ó 45J/cm2 (n=10, triángulos llenos).

Los ratones que se inyectaron con 9 mg kg' del compuesto 4 se iluminaron por 5 minutos con 30J/cm2 (n=10, círculos llenos): Grupos de control: sin tratar (n=4, cuadrados abiertos), control oscuro recibieron 6 mg kg"1 (n=4, círculos abiertos) ó 9 mg kg"1 (n=5, triángulos abiertos) del compuesto 4 control de luz (n=6, diamantes abiertos, 45J/cm2). Las figuras 8a-8h son fotografías que muestran el efecto selectivo de PDT en ratones que transporta xenoinjertos del glioma C6 de rata y se trataron con el compuesto 4. (figs. 8a-8d) animal tratado con PDT; (figs.8e-8h) animal sin tratar, (fig. 8a) antes de tratamiento, (fig. 8b) 3 horas después de PDT e inyección de azul Evans (EB) inyección; (fig. 8c) colgajo de piel del área tratada, 24 horas después de PDT; (fig. 8d) porción axial del tumor tratado 24 horas después de PDT; (fig. 8e) antes de la inyección EB; (fig. 8f) 3 horas después de la inyección EB; (fig. 8g) colgajo de piel 24 horas después de inyección EB; (fig. 8h) porción axial del tumor sin tratar, 24 horas después de la inyección EB. T - tumor; S - piel; M - músculo; E - edema. Las figuras 9A-9D muestran secciones semidelgadas del centro de lesión y TEM 2 horas después de PDT oclusivo en el modelo de ojo de conejo con el compuesto 4 (fluencia 50 J/cm2, dosis de 5 mg/Kg, y un DLI de 1 minuto). La estasis y dilatación de los vasos coroidales con células RPE relativamente bien conservadas y retina, se observan (figs. 9A y 9B). TEM muestra la hemolisis de células de glóbulos rojos dentro del lumen coriocapilar (flechas blancas de la fig. 9D) y monocitos rotos (puntas de flecha blancas). La membrana Bruch (Bm) es un portador de células de epitelio de pigmento retinal bien identificadas intacto (RPE). Algunas de las células coriocapilares endoteliales se alteran marcadamente lo que demuestra cromatina condensada (estrella blanca en la fig. 9C). Abreviaturas: ONL: capa nuclear externa, ROS: segmento externos en rodillo, CC: coriocapilares, e: células endoteliales coriocapilares.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona, en un aspecto amplio, derivados de bacterioclorofila que contienen al menos uno, preferiblemente dos o tres grupos cargados negativamente y/o grupos ácidos que se convierten a grupos cargados negativamente al pH fisiológico, excluyendo los derivados de bacterioclorofila pentacíclicos que tienen un grupo -CH2CH2COOH ó -CH2CH2COO" libre en la posición 17, y derivados de bacterioclorofila tetracíclicos desprovistos de un átomo de metal central y tienen un grupo CH2CH2COOH en la posición 17, un grupo -CH2COOH ó -COOH en la posición 15, un grupo -COOH en la posición 13, un grupo metilo en cada una de las posiciones 2, 7, 12 y 18, y un grupo etilo en cada una de las posiciones 3 y 8. Los derivados de bacterioclorofila pueden derivarse de un derivado natural o sintético de bacterioclorofila, incluyendo los compuestos en los cuales el átomo Mg central puede ser eliminado o reemplazado por otros átomos de metal tales como Pd, Pt, Co, Sn, Ni, Cu, Zn y Mn divalente, y Fe, Mn y Cr trivalente. En modalidades preferidas, el átomo de metal está ausente o es Pd, Cu, Zn o Mn. En la modalidad más preferida, el átomo de metal central es Pd. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un derivado de bacterioclorofila de la fórmula I o II como se define anteriormente en la presente. De conformidad a la invención, el "hidrocarbilo" como se define para R5, ?¾, 7 y RV, significa cualesquiera de los radicales de hidrocarbilo recto o ramificado, saturado o insaturado, acíclico o cíclico, incluyendo aromático, de 1-25 átomos de carbono, preferiblemente de 1 hasta 20, más preferiblemente de 1 hasta 6, más preferiblemente de 2-3 átomos de carbono.

El hidrocarbilo puede ser un radical alquilo, preferiblemente de 1-4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, o alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo tal como fenilo o un grupo aralquilo tal como bencilo, o en la posición 17 este es un radical derivado de compuestos Chl y Bchl naturales, por ejemplo, geranilgeranilo (2,6-dimetil-2,6-octadienil) o fitil(2,6,10,14-tetrametil-hexadec-14-en-16-ilo). La cadena de hidrocarburo de R5, ?¾, R7 y/o R'7 puede opcionalmente contener uno o más heteroátomos tales como O, S y/o NH, y/o uno o más anillos carbocíclicos, por ejemplo, fenilo, o anillo heterocíclico, por ejemplo, piridilo, porciones. En una modalidad, la cadena de hidrocarbilo contiene uno o más átomos O y tiene un grupo terminal OH como se representa por un residuo de oligooxietilenglicol de 4 hasta 10 átomos, preferiblemente pentaoxietilenglicol. 5, Re, R7 y/o R'7 pueden también ser hidrocarbilos substituidos por uno o más grupos funcionales, tales como Cl, CHO, OH, SH, NH2, CONH2, COOH, COSH, SO3H, PO3H2 o por un grupo cargado negativamente tal como COO", COS", S03" ó P032'. En una modalidad preferida, el grupo funcional COOH, COSH, S03H, P03H2, COO", COS", S03", o P032" es un grupo funcional terminal. En modalidades más preferidas, el hidrocarbilo tiene 2 ó 3 átomos de carbono y un grupo terminal seleccionado de COO", P032", o, más preferiblemente, S03". Todavía en una modalidad preferida, R5, R6, R7 ó R'7 pueden ser substituidos por más de un OH y opcionalmente grupos NH2 y puede ser el residuo de un monosacárido, por ejemplo, glucosamina. En otra modalidad, R5, Re, 7 ó R'7 pueden ser el residuo de un aminoácido, un péptido o una proteína. En una modalidad preferida, R5 en cualquiera de las posiciones, pero preferiblemente en su posición 173, es el residuo de un aminoácido, un péptido o una proteína. El aminoácido, péptido o proteína puede ser la fuente del grupo cargado negativamente si estos contienen un grupo y/o un residuo carboxilo de terminal libre de un aminoácido que contiene un grupo carboxíiico de terminal no libre, por ejemplo, ácido aspártico o glutámico. En una modalidad, R5, R6, R7 ó R'7 son el residuo de un aminoácido o péptido (oligopéptido o polipéptido) que contiene un grupo hidroxilo, tal como serina, treonina, y tirosina, o péptidos que los contienen, o un derivado del aminoácido o péptido seleccionado de ésteres tales como alquilo, preferiblemente metilo, ésteres, y derivados protegidos de N, en donde el grupo protegido en N es por ejemplo tert-butiloxi, carbobenzoxi o tritilo y el aminoácido hidroxilado o péptido o derivado del mismo se enlaza al grupo COO" del derivado BChl a través de su grupo hidroxi. Los ejemplos de tales derivados de aminoácido son éster de metilo serina, N-tert-butilcarbonil-serina, éster de metilo N-tritil-serina, éster de metilo tirosina, y éster de metilo N-tert-butoxi-tirosina y un ejemplo de péptido es éster de metil N-carbobenzoxi-seril serina, todos estos se preparan como se describe en la EP 0584552 antes mencionada. En otra modalidad, R5, R6, R7 y/o R'7 es el residuo de un aminoácido o péptido (oiigo o polipéptido) enlazado al grupo -CO a través de un enlace de amida (Y es NH). En una modalidad adicional, R5, Re, R7 ó RV es el residuo de un ligando de célula específica o tejido específico seleccionado de péptidos y proteínas, los cuales se ejemplifican por, pero no se limitan a, péptidos de hormona, por ejemplo, hormonas estimulantes de melanocito, por ejemplo, -MSH, y anticuerpos, por ejemplo, inmunoglobulinas y anticuerpos de tumor específico. El péptido o proteína pueden enlazarse directamente al grupo -CO por medio de un éster, tioéster o un enlace amida, o puede enlazarse por medio de un enlace de éster o amida a un grupo funcional final del radical de hidrocarbilo de C1-C25 seleccionado de OH, COOH y NH2. Como se describe en la EP 0584552 antes mencionada, por la conjugación de Bchl con diferentes aminoácidos, y la conjugación adicional del aminoácido Bchl conjugado con hormonas, factores de crecimiento o derivados de los mismos, o anticuerpos de tumor específico, o cualesquiera de otros ligandos de célula específica, se obtienen los fotosensibilizadores apropiados dirigidos al sitio. En una modalidad, el grupo cargado negativamente COO", COS", SO3", ó PO32' de conformidad a la invención se origina del grupo funcional COOH, COSH, SO3H, ó PO3H2, respectivamente, de las cadenas de hidrocarbilo substituidas de R5, R6, R7 y/o R'7. En otra modalidad, el grupo COOH, COSH, COO", y/o COS" se deriva de R-i, R2 y R4 es OH ó SH, O"R8+ ó S"Rs+, respectivamente, esto es, cuando un grupo carboxílico o tiocarboxílico o un anión de carboxiiato o tiocarboxilato se presenta en la posición 13 , 151 (m es 0), 152(m es 1), y/o 173. El catión R8+ puede ser un catión monovalente o divalente derivado de un metal alcalino o alcalinotérreo tal como K+, Na÷, Lf , ??4+, Ca+, más preferiblemente K+; ó R8+ es un catión derivado de una amina. En una modalidad preferida, el derivado de bacterioclorofila de la invención tiene la fórmula I en donde: M representa Pd divalente; Ri es -NH-(CH2)n-S03'R8+, -NH-(CH2)n-COO-R8+; -NH-(CH2)n- P032-(R8+)2; R2 es metoxi; y R3 es -C(=0)-CH3; R8÷ es un catión monovalente tal como K+, Na+, Li+, NH4+; y n es un entero de 1 hasta 10, preferiblemente 2 ó 3. De conformidad con esta modalidad, en el compuesto de la fórmula I, Ri es preferiblemente un grupo -NH-(CH2)n-S03"R8+, en donde n es 3 y R8+ es K+. En otra modalidad preferida, el derivado de bacterioclorofila de la invención tienen la fórmula I I en donde: M representa 2H, Pd, Cu, o Zn divalente o Mn trivalente; Ri es -0-R8+, -NH(CH2)n-S03"R8+, -NH-(CH2)n-COO-R8+, -NH-(CH2)n-P032-(R8+)2; o Y-R5 en donde Y es O, S ó NH y R5 es el residuo de un aminoácido, un péptido o una proteína; R2 es alcoxi de CrCe tal como metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, más preferiblemente metoxi; R3 es -C(=0)-CH3, -CH=N-(CH2)n-S03"R8+; -CH=N-(CH2)n-COO' R8+; -CH2-NH-(CH2)n-S03-R8+; -NH-(CH2)n-COO" R8+; ó -NH-(CH2)n-P032-(R8+)2; R4 es -NH-(CH2)n-S03"R8+; -NH-(CH2)n-COO-R8+; -NH-(CH2)n- P032-(R8+)2; R8+ es un catión monovalente tal como K+, Na+, Li+, NH4+, más preferiblemente K+; m es , y n es un entero desde 1 hasta 10, preferiblemente 2 ó 3. En una modalidad más preferida de la invención, el derivado de bacterioclorofila tiene la fórmula II y M es Pd. En otra modalidad más preferida, la invención se refiere a un derivado de bacterioclorofila de la fórmula II en donde: M es Pd; R-i es -0"RS+, -NH-(CH2)n-S03"R8+, o Y-R5 en donde Y es O, S o -NH y R5 es el residuo de una proteína, preferiblemente ¡nmunoglobulina; R2 es alcoxi de C1-C6 tal como metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, más preferiblemente metoxi; R3 es -C(=0)-CH3, -CH=N-(CH2)n-S03-R8+; ó -CH2NH-(CH2)n- S03-R8+; R4 es -NH-(CH2)n-S03-R8+; NH-(CH2)n-COO-R8+; NH-(CH2)n- P032-(R8+)2; Rs+ es un catión monovalente tal como K+, Na+, Li+, NH4+, más preferiblemente K+; y m es l y n es 2 ó 3 más preferiblemente 2. Un ejemplo de un derivado de bacterioclorofila de la invención que tiene un solo grupo cargado negativamente (S03") en la posición 17 se representa por el compuesto de la fórmula I identificado en la Lista de Compuestos de aquí en adelante como el compuesto 7. Los ejemplos de derivados de bacterioclorofila de la invención que tienen dos grupos cargados negativamente en las posiciones 13 y 17 incluyen los compuestos de la fórmula II identificados en la Lista de Compuestos de aquí en adelante como los compuestos 4, 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 5. En una modalidad más preferida, el compuesto de la invención es el compuesto 4. Los ejemplos de derivados de bacterioclorofila de la invención que tienen tres grupos cargados negativamente en las posiciones 3, 13 y 17 incluyen los compuestos de la fórmula II identificados en la Lista de Compuestos de aquí en adelante como los compuestos 9 y 16. El compuesto 13 tiene un grupo cargado negativamente en la posición 13 y un grupo -COOH como parte de la molécula de proteína en la posición 173, y el compuesto 15 tiene un grupo divalente cargado negativamente en la posición 13 y un grupo -COO" en la posición 173. Los compuestos de la invención pueden prepararse, por ejemplo, por los métodos detallados en el Esquema 1 en la presente. Para la preparación de los compuestos en donde F¾ es el residuo de un aminoácido, péptido o proteína, los métodos descritos en la EP 0584552 antes mencionada, particularmente el método de condensación catalítica, puede usarse como se muestra en el Esquema 1 para la reacción con taurina y homotaurina de ácidos aminosulfónicos. Así, un método para la preparación de los compuestos de la fórmula II en donde Ri es -0"R8+; R2 es -OCH3; R3 es acetilo; R4 es un grupo -NH-(CH2)n-S03"R8+; Ra* es un catión monovalente, m es 1 y n es 1 hasta 10, comprende: (i) hacer reaccionar la M-bacteriofeoforburo correspondiente de la fórmula I en donde Ri es OH con un ácido aminosulfónico de la fórmula H2N-(CH2)n-S03H en una solución amortiguadora Ra+; y (ii) aislar el compuesto deseado de la fórmula II. Para la preparación del compuesto 4, el método comprende hacer reaccionar el Pd-bacteriofeoforburo 3 con taurina de la fórmula H2N-(CH2)2-S03H en una solución amortiguadora K+, y aislar el compuesto deseado. Para la preparación del compuesto 5, el método comprende hacer reaccionar el bacteriofeoforburo 2 con taurina de la fórmula H2N-(CH2)2-SO3H en una solución amortiguadora K+, y aislar el compuesto deseado. Para la preparación de los compuestos Cu y Zn 10, 1 , el método comprende la inserción directa del átomo Cu o Zn de metal central al reaccionar el compuesto 5 con acetato de cobre o acetato de zinc, respectivamente, mientras que para la preparación del compuesto n 12, la inserción del átomo de metal central de n se efectúa por la transmetalación al hacer reaccionar primero el compuesto 5 con acetato de cadmio y luego con cloruro de manganeso. Un método para la preparación de los compuestos de fórmula II en donde R-i es -0"R8÷; R2 es -OCH3; R3 es acetilo; R4 es un grupo -NH-(CH2)n-COO-R8+; es un catión monovalente; m es 1 y n es 1 hasta 10, comprende: (i) hacer reaccionar el correspondiente M-bacteriofeoforburo de fórmula I en donde R1 es OH con un ácido aminocarboxíiico de la fórmula H2N-(CH2)n-COOH en una solución amortiguadora R8+; y (ii) aislar el compuesto deseado de la fórmula II. Así, para la preparación del compuesto 14, el método comprende hacer reaccionar el Pd-bacteriofeoforburo a 3 con ß-alanina de la fórmula H2N-(CH2)2-COOH en una solución amortiguadora K+ y aislar el compuesto deseado. Un método para la preparación de los compuestos de fórmula II en donde R-i es -0"R8+; R2 es -OCH3; R3 es acetilo; R4 es un grupo -NH-(CH2)n-P032"(Rs+)2; R8+ es un catión monovalente; m es 1 y n es 1 hasta 10, comprende: (i) hacer reaccionar el correspondiente M-bacteriofeoforburo de fórmula I en donde R1 es OH con un ácido aminofosfórico de la fórmula H2N-(CH2)n-P03H2 en una solución amortiguadora R8; y (ii) aislar el compuesto deseado de la fórmula II. Así, para la preparación del compuesto 15, el método comprende hacer reaccionar el Pd-bacteriofeoforburo a 3 con ácido 3-amino-1- propanofosfónico de la fórmula H2N-(CH2)3-P03H2 en una solución amortiguadora K+ y aislar el compuesto deseado. Para la preparación de los compuestos que tienen los mismos grupos cargados negativamente en las posiciones 13 y 17, el M-bacteriofeoforburo correspondiente puede reaccionar con un exceso del reactivo tal como ácido aminosulfónico, aminocarboxílico o aminofosfórico como se describe arriba, y aislamiento del derivado deseado 13,17-disubstituido de fórmula II, o una vía diferente se puede seguir como se detalla en el Esquema 1 en la presente y descrito a continuación. Así, un método para la preparación de los compuestos de fórmula II en donde Ri y R4 son cada uno un grupo -NH-(CH2)n-S03"R8+; R2 es -OCH3; R3 es acetilo; R8+ es catión monovalente; m es 1 y n es 1 hasta 0, comprende: (i) acoplar el correspondiente M-bacteriofeoforburo de fórmula I en donde R1 es OH con N-hidroxi-sulfosuccinamida (sulfo NHS) en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC); (ii) hacer reaccionar el éster de -bacteriofeoforburo-173-N-hidroxisulfosuccinimida resultante con un exceso del ácido aminosulfónico de la fórmula H2N-(CH2)n-S03H en una solución amortiguadora R8+, obteniendo así un compuesto de fórmula I que tiene un solo grupo negativamente cargado en la posición 17; (iii) hacer reaccionar este producto con un exceso de H2N-(CH2)n-S03H en una solución amortiguadora Rs+ y aislar el compuesto deseado de la fórmula II. Para la preparación del compuesto 8, la reacción se efectúa con un exceso de homotaurina de la fórmula H2N-(CH2)3-S03H.

Cuando el ácido aminosulfónico se reemplaza por el ácido aminocarboxílico o aminofosfónico, los derivados correspondientes de carboxilato y fosfonato se obtienen. Los compuestos de la invención, también referidos en la presente algunas veces por el término "pigmentos", presentan una polaridad suficiente alta para ser solubles en agua e inyectarse en soluciones acuosas sin tensoactivos agregados. En una modalidad, para el compuesto preferido sulfonado de Pd-Bchl 4, también la biodistribución y farmacocinéticas se muestran y, con base en ello, se asume que estos y otros derivados de la invención permanecen en circulación y por un tiempo muy corto. Por lo tanto son buenos sensibilizadores para el PDT de direccionamiento vascular. El tratamiento de melanoma melanótico 2R y los xenoinjertos de carcinoma de colón humano HT29 en ratones que se muestran en la presente, demuestran el efecto selectivo del pigmento en la vasculatura del tumor. El protocolo sugerido con el Pd-Bchl 4 sulfonado considera un tiempo corto de depuración del fármaco. Sobre la base de su efecto selectivo en la vasculatura del tumor, estos compuestos se pueden usar para el tumor así como para degeneración macular relacionada con la edad y otras anormalidades de tejidos que dependen de la neovascularización. Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un derivado de bacterioclorofila de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende un derivado de bacterioclorofila de la fórmula I o II en la presente, más preferiblemente un derivado sulfonado de fórmula II, más preferiblemente el compuesto 4. Los derivados aniónicos de bacterioclorofila de la presente invención se formulan en composiciones farmacéuticas finales para administración al paciente o se aplican a un objetivo in vitro usando técnicas bien conocidas en el arte, por ejemplo, como se resume en el Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Penna, última edición. Las composiciones se pueden administrar sistémicamente, en particular por inyección o se pueden usar tópicamente. Los compuestos aniónicos BchI de la invención tienen una absorción óptica similar y características fotofísicas que los respectivos BchI aniónicos y, por lo tanto, una vez que residen dentro del tejido tratado, se espera que sean agentes fotodinámicos eficientes. Pueden así ser útiles como fotosensibilizadores como agentes terapéuticos y de diagnóstico, por ejemplo para el tratamiento de diversos tipos de cáncer tales como, pero no limitados a, melanoma, cánceres de próstata, cerebro, colón, ovarios, mama, piel, pulmón, esófago, y vejiga y otros tumores sensibles a las hormonas, así como para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad, y para exterminar células, virus, hongos y bacterias en muestras y tejidos vivos como se conocen bien en el arte de PDT y otras aplicaciones de fotosensibilizadores.

Los nuevos derivados Bchl solubles en agua de la invención son útiles, por ejemplo, para sensibilizar células neoplásticas u otro tejido anormal para destrucción por irradiación ya sea in vivo o ex vivo usando luz de una longitud de onda adecuada. Se cree que la energía de fotoactivación se transfiere al oxígeno endógeno para convertirlo en oxígeno singlete y/u otras especies de oxígeno reactivas (ROS) tales como radicales hidroxilo y superóxido, que se considera que son responsables del efecto citotóxico. Además, las formas fotoactivadas del Bchls fluorescen, cuya fluorescencia puede ayudar a localizar tumores u otros sitios a los cuales se administra el derivado Bchl. Los ejemplos de las indicaciones, conocidas en el arte, que se pueden tratar con los derivados de bacterioclorofila de la presente invención, incluyen destrucción de tejido de tumor en tumores sólidos y la disolución de placas en vasos sanguíneos (ver, por ejemplo, Patente de EUA No. 4,512,762). Particularmente, estos derivados son adecuados para el PDT dirigido vascular debido a su retención mínima en la circulación y debido a que se toman sólo de manera mínima por tejidos no circulantes tales como piel y músculo. Así, estos compuestos permiten la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) limitadas a los vasos interiores con excitación y, con ello, provocan una respuesta selectiva de los vasos anormales tales como aquellos presentes en tumores y degeneración macular relacionada con la edad. Además, ios derivados de bacterioclorofila son útiles para la destrucción selectiva en el tratamiento de condiciones locales tales como el acné, pie de atleta, verrugas, papiloma, psoriasis, para el tratamiento de hipertrofia benigna de la próstata y para la esterilización de productos biológicos tales como sangre para transfusión, por destrucción de los agentes infecciosos. Las composiciones farmacéuticas de la invención se administrarán al paciente por procedimientos estándar usados en PDT. La cantidad del derivado aniónico Bchl de la invención a administrarse a un individuo que necesita y la vía de administración se establecerán de acuerdo con la experiencia acumulada con otras porfirinas usadas en PDT, y variarán dependiendo de la variación del derivado usado como ingrediente activo, la condición, por ejemplo, el tipo de tumor a tratarse, la etapa de la enfermedad, condiciones de edad y de salud del paciente, y el juicio del medico pero serán mucho mayores que las dosis actualmente usadas de Fotofrina II de alrededor de 20-40 mg HPD/kg de peso corporal. Las vías de administración preferidas son intravenosas o inyección directa en el tumor sólido de la solución acuosa del compuesto activo que comprende portadores convencionales farmacéuticamente aceptables y aditivos, y el tratamiento tópico de tumores de la piel con composiciones tópica adecuadas. La longitud de onda de luz irradiante se escoge preferiblemente para coincidir con la absorbancia máxima del fotosensibilizador de bacterioclorofila. La longitud de onda adecuada para cualquiera de los compuestos se puede determinar fácilmente a partir de su espectro de absorción.

Además del uso in vivo, los derivados aniónicos BchI de la invención se pueden usar en el tratamiento de materiales in vitro para exterminar virus perjudiciales o agentes infecciosos, tales como bacterias dañinas. Por ejemplo, la sangre y el plasma de sangre a usarse para una transfusión futura se pueden tratar con un BchI de la invención e irradiar para efectuar la esterilización. La conjugación de proteínas, por ejemplo, hormonas, factores de crecimiento o sus derivados, anticuerpos, péptidos que se enlazan específicamente a los receptores de las células objetivos, y de los nutrientes de las células, por ejemplo, tirosina, a la porción de BchI significa que incrementa su retención en el tumor y los sitios tratados. Al incrementar el giro rojo permite una mayor profundidad de penetración, mientras se mantiene la ubicuidad del sistema natural. El reemplazo del Mg por otros metales significa optimizar la estabilidad intrínseca y metabólica de la porción BchI y su intersistema que cruza el estado de triplete excitado, y también abre la posibilidad para nuevos procedimientos de diagnóstico. Los anticuerpos y péptidos específicos de tumor que tienen una alta afinidad para las células neoendoteliales, se dirigirán preferiblemente a las porciones BchI al tumor o al sitio tratado, mientras que las hormonas y los nutrientes de las células también se pueden tomar por las contrapartes normales no transformadas. Sin embargo, las células seleccionadas como objetivo para las hormonas y los nutrientes de las células, tales como los melanocitos y células endoteliales, están dispersas entre otras células bajo condiciones normales y cuando se transforman en células malignas se agrupan en los tumores sólidos. Como resultado, la concentración del fotosensibilizador en los compartimientos vascular y/o celular del tejido maligno se espera que incremente dramáticamente con relación a su concentración en el tejido normal, en donde las células están más dispersas, asegurando la amplificación del efecto PDT en el sitio del tumor. Esto permite un uso efectivo de dosis ligeras, menores que el umbral perjudicial del tejido normal, reduciendo así la necesidad de una radiación especialmente bien definida. Además, al tener una fluorescencia más fuerte, el Bchl dirigido al sitio se puede usar para un etiquetado por fluorescencia de los sitios del tumor u otros objetivos. En una modalidad más preferida de la presente invención, el objetivo para el tratamiento con los sensibilizadores de la invención son los vasos sanguíneos anormales, particularmente vasos sanguíneos de tumores sólidos y degeneración macular relacionada con la edad, debido a la diferencia inherente de la sensibilidad de los vasos sanguíneos normales y anormales con los protocolos PDT sugeridos aquí descritos. La invención se refiere además a un método de terapia fotodinámica, que comprende administrar a un individuo que necesita de una cantidad efectiva de un derivado Bchl de la invención, seguido por irradiación local. En una modalidad, el método PDT de la invención se usa para tratamiento del cáncer y comprende administrar a un paciente que padece de un cáncer con tumor sólido, una cantidad terapéuticamente efectiva de un derivado Bchl de conformidad con la invención, y luego irradiar el sitio del tumor con fuentes de luz fuerte a 670-780 nm. Los derivados Bchl de la invención también son útiles para fotodestrucción de células animales normales o malignas así como de microorganismos en cultivo, permitiendo una fotodestrucción selectiva de ciertos tipos de células en cultivo o agentes infecciosos; para dirigir la porción de porfirina a células seleccionadas por la colocación a polipéptidos específicos tales como hormonas u otro ligandos del receptor, a anticuerpos específicos de tejidos de células o a otros ligandos, por ejemplo, lectinas, para el etiquetado/identificación fluorescente de moléculas para propósitos analíticos en laboratorio, aplicaciones de diagnóstico e industriales, y para el etiquetado fluorescente de células o microorganismos animales o partículas para aplicaciones de laboratorio, de diagnóstico o industriales. Pueden reemplazar a varias de las etiquetas de fluorescencia actualmente usadas tales como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina debido a sus coeficientes de extinción superiores y rendimiento mayor de fluorescencia. Para los propósitos de diagnóstico, los derivados Bchl de la invención se pueden usar solos o se pueden etiquetar con un radioisótopo u otro medio de detección como se conoce en el arte. Por ejemplo, el derivado Bchl se puede etiquetar radioactivamente por procedimientos estándares, por ejemplo, con 67Ga, 111ln, 20 T1 , "mTc, y el agente de diagnóstico radioactivo se administra al paciente, preferiblemente por inyección intravenosa. Después de algunas horas, el lugar del cáncer se puede forman con imágenes por procedimientos estándar. La invención proporciona además el uso de derivados Bchl de la invención para un exterminio ex vivo o in vitro de células o agente infecciosos tales como bacterias, virus, parásitos y hongos en un producto biológico, por ejemplo, con sangre que comprende tratar la muestra infectada con el compuesto de la invención seguido por iluminación de la muestra. La invención será ilustrada ahora por los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Para conveniencia y mejor entendimiento, la sección de los ejemplos se divide en dos subsecciones: (I) la sección química, que describe la síntesis de los derivados solubles en agua e intermediarios 4-16, y (II) la sección biológica, que describe la actividad biológica de los nuevos derivados Bchl.

I Sección química En los ejemplos en la presente, los derivados de la invención (4- 5, 7-9 y 10-16) y los intermediarios (1-3, y 6) se presentaran por sus números arábigos respectivos en negritas y subrayados de acuerdo con la siguiente lista de compuestos. Las fórmulas correspondientes aparecen en el Esquema al final de la especificación, justo antes de las reivindicaciones.

Lista de Compuestos 1. Bacterioclorofila a (Bchl a) 2. Bacteriofeoforburo a (Bpheid a) 3. Pd-Bacteriofeoforburo a (Pd-Bpheid a) 4. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 -(2-sulfo-etil)amida sal de dipotasio [Ejemplo 1] 5. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida sal de dipotasio [Ejemplo 2] 6. Paladio bacteriofeoforburo a 173-(3-sulfo-1-oxisuccinimida) sal de éster de sodio [Ejemplo 6] 7. Paladio Bacteriofeoforburo a 173-(3-sulfopropil)amida sal de potasio [Ejemplo 7] 8. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 31, 173-di(3-sulfopropil)amida sal de dipotasio [Ejemplo 8] 9. Paladio 31-(3-sulfopropilimino)- 5-metoxicarbonilmetil-Rodobacterio-clorina 131,173-di(3-sulfopropil)amida sal de tnpotasio [Ejemplo 9] 10. Cobre (II) 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacter¡oclorina 13 -(2-sulfoetil)amida sal de dipotasio [Ejemplo 3] 11. Zinc 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida sal de dipotasio [Ejemplo 4] 12. Manganeso (III) 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida sal de dipotasio [Ejemplo 5] 13. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetiI-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida, 173-(N-immunoglobulina G) amida sal de potasio] [Ejemplo 10] 14. Paladio 3 -oxo-15-metox¡carbonil-Rodobacterioclorina 131-(2-carboxietil)amida sal de dipotasio [Ejemplo 11] 15. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-fosfopropil)amida sal de tripotasio [Ejemplo 12] 16. Paladio 31-(3-sulfopropilamino)-15-metoxicarbonilmet¡l-Rodobacterio-clorina 131, 173-di(3-sulfoprop¡I)amida sal de tripotasio [Ejemplo 13] Materiales y métodos (i) Bchl a (1) se extrae y purifica a partir de células liofilizadas de Rhodovolum Sulfidophilum como se describe previamente (WO 00/33833). (ii) El bacteriofeoforburo de paladio (Pd-Bpheid, 2) se prepara ya sea como se describe previamente (WO 00/33833) o se obtiene de Steba Biotech Ltd. a través de Negma-Lerads, Francia. (iii) El ácido 3-amino-1-propano sulfónico (homotaurina) y el ácido 3-am¡no-1-propano fosfónico se adquirieron de Aldrich (USA), y el ácido 2-aminoetano sulfónico (taurina) y el ácido 3-aminopropiónico (ß-alanina) se adquirieron de Pierce (USA), 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) se adquirió de Fluka (Suiza). (iv) Los productos químicos y los solventes de grado analítico se usaron generalmente excepto cuando se efectúa CLAR, en donde se aplicaron solventes grado CLAR. (v) CCD; placas de sílice (Kieselgel-60, Merck, Alemania); cloroformo-metanol (4:1 , v/v). (vi) Espectros de resonancia magnética nuclear 1H (RMN) se registraron en un instrumento Avance DPX 250 (Bruker, Francia) y se reportan en un campo inferior en ppm (d) a partir de tetrametilsilano con picos residuales de solventes como los estándares internos. (vii) Los coeficientes de extinción de los derivados de Pd se determinaron al correlacionar la concentración de Pd (usando fotometría de flama con PdCb como un estándar) con la densidad óptica de la solución examinada en la longitud de onda en particular. (viii) Espectros de masa de ionización de electrorocío (ESI-EM) se registraron en un espectrómetro de plataforma LCZ (Micromass, Inglaterra). (ix) Espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente (ICP-EM) se efectuó para la determinación de concentraciones de Pd usando un instrumento ELAN-6000 (Perkin Elmer, CT). (x) absorción óptica de los diferentes complejos se registro con espectrofotómetros Genesis-2 (Milton Roy, Inglaterra) y V-570 (JASCO, Japón). (xi) se efectuó la CLAR usando un instrumento LC-900 (JASCO, Japón) equipado con un detector de configuración de diodos UV-915.

EJEMPLOS QUIMICOS EJEMPLO 1 Sal de di potasio Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilrnetiN Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida (Compuesto 4) Novecientos treinta y cinco (935) mg de Pd-Bpheid (3) se disolvieron en un matraz de fondo redondo de 1 L con 120 mi de DMSO mientras se agitaba bajo argón (burbujeado en la solución). Se disolvió taurina (1288 mg) en 40 mi de una solución amortiguadora K2HPO4 1 M, y el pH de la solución se ajustó hasta 8.2 (con HCI). Esta solución acuosa se agregó en la solución de DMSO mientras se agitaba y se burbujeó el argón en una solución durante otros 20 minutos. Luego se evaporó la mezcla de reacción a 30°C por 3.5 horas bajo ~2 mbar y luego por otras 2 horas a 37°C hasta una sequedad completa. Los sólidos secos se disolvieron en 300 mi de MeOH y la solución coloreada se filtró a través de la lana de algodón para deshacerse de las sales amortiguadoras y el exceso de taurina. El avance de la reacción se determinó por CCD (del Rf sin reaccionar Pd-Bphe¡d que es 0.8-0.85 y del producto de reacción (aminolisis) que es 0.08-0.1 ) y al seguir el espectro de absorción óptico de la mezcla de reacción después de liofilización y resolubilización de MeOH. El espectro de absorción se caracteriza por un giro de transición Qy desde756 nm ( para Pd-Bpheid) hasta 747 nm (para el producto 4) y por un giro Qx desde 534 nm de Pd-Bpheid hasta 519 nm (del producto 4). El MeOH se evaporó y se purificó el producto 4 por CLAR con una columna ODS-A 250x20 S10P µ?p (YMC, Japón). Solvente A: 95% 0.005 M de solución amortiguadora de fosfato, pH 8.0 y MeOH al 5%. El solvente B: MeOH al 100%. El sólido seco se disolvió en 42 mi de agua destilada y se inyectó en porciones de 1.5 mi cada uno. Se describe el perfil de elución en el cuadro 1. El producto 4 (Esquema 1 , ver a continuación) se eluyó y se recolectó a -9-11 minutos. Las impurezas principales recolectadas después a 4-7 min. (ca 5-10%), correspondieron a los subproductos con la estructura propuesta 7. Picos a 22-25 min. (ca 2-5%) que correspondieron posiblemente a la isoforma del producto principal 4 y los residuos sin tratar Pd-Bpheid.

CUADRO 1 Perfil de gradiente de purificación del compuesto 4 El solvente (metanol acuoso) se evaporó bajo presión reducida.

Luego, el producto purificado 4] se volvió a disolver a -150 mi MeOH y se filtró a través de lana de algodón. El solvente se evaporó nuevamente y se almacenó el pigmento sólido 4 bajo Ar en la oscuridad a -20°C. El rendimiento de reacción: ~90% (en peso, con relación a 3). La estructura del producto 4 se confirmó por espectroscopia de masas de electrorocío. (ESl-EM, modo negativo, Figs. 2A-2B), (picos a 875 (M--K-H), 859 (M--2K-H+Na), 837 (M"-2K), 805 (M2K-H-OMe), 719) y el espectro H-RMN (Fig. 4 en MeOH-d4). El Cuadro 4 proporciona los giros (en unidades de ppm) de los picos RMN principales. Absorción óptica (UN-VIS) espectro (MeOH): ?, 747 (1.00), 5 6 (0.13), 384 (0.41 ), 330 (0.50); e747 (MeOH) es 1.2 x 105 mol-1 crn 1. RMN (MeOH-d4): 9.38 (5-H, s), 8.78 (10-H, s), 8.59 (20-H, s), 531 y 4.95 (151- CH2, dd), 4.2-4.4 (7,8, 7,18-H, m), 3.88 (153-Me, s), 3.52 (21-Me, s), 3.19 (121- Me, s), 3,09 (32-Me, s), 1.92-2.41 , 1.60-1.75 (171, 172-CH2l m), 2.19 (81-CH2, m), 1.93 (71-Me, d), 1.61 (181-Me,d), 1.09 (82-Me, t), 3.62,3.05 (CH2'S de taurina). Relación de partición de agua/octanol es 40:60.

EJEMPLO 2 Preparación de la sal de potasio de 3 -oxo-15-metoxicarbonilmetil- Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida (Compuesto 5) Ciento sesenta (160) mg de taurina se disolvieron en 5 mi de solución amortiguadora K2HPO4 1M, y el pH de la solución se ajustó a 8.2. Esta solución se agregó a 120 mg del compuesto 2 disuelto en 15 mi de DMSO, y la reacción y la siguiente purificación fueron análogas a aquellas descritas en el Ejemplo previo. Espectro de absorción (MeOH): ?, 750(1.00), 519(0.30), 354 (1.18)nm. ESI-EM(-): 734 (M"-2K). RMN (MeOH-d4): 9.31 (5-H, s), 8.88 (10-H, s), 8.69 (20-H, s), 5.45 y 5.25 (151-CH2, dd), 4.35 (7,18-H, m), 4.06 (8,17-H, m), 4.20 y 3.61 (2-CH2, m de taurina), 3.83 (I53-Me, s), 3.63 (21-Me, s), 3.52 (3-CH2, m de taurina), 3.33 (121-Me, s), 3.23 (32-Me, s), 2.47 y 2.16 (171-CH2, m), 2.32 y 2.16 (81-CH2, m), 2.12 y 1.65 (172-CH2, m), 1.91 (71-Me, d), 1.66 (181-Me, d), 1.07 (82-Me, t). Relación de partición octanol/agua es 60:40.

EJEMPLO 3 Preparación de sal dipotasio de cobredO 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil- Rodobacteriocolorina 131-(2-sulfoetill)amida (Compuesto 10) Cincuenta (50) mg del compuesto 5 del Ejemplo 2 y 35 mg de acetato de cobre (II) se disolvieron en 40 mi de metanol, y se burbujeó argón en la solución por 10 minutos. Luego se agregaron 500 mg de ascorbato de palmitoilo, y la solución se agitó durante 30 min. El espectro de absorción se caracteriza por un giro en la transición de Qy desde 750 mn (para 5) hasta 768 nm (para el producto 10) y por un giro Qx desde 519 nm de 5 hasta 537 mn (del producto 10). Luego se evaporó, la mezcla de reacción, se volvió a disolver en acetona y se filtró a través de lana de algodón para deshacerse del exceso de sal de acetato. Se evaporó la acetona y el producto se purificó adicionalmente por CLAR a las combinaciones antes mencionadas con el perfil de elución, descrito en el cuadro 2. El solvente (metanol acuoso) se evaporó bajo presión reducida. Luego, se volvió a disolver el pigmento purificado 10 en metanol y se filtró a través de lana de algodón. El solvente se evaporó nuevamente y el pigmento sólido 10 se almacenó bajo Ar en la oscuridad a -20°C. Rendimiento de reacción: -90%.

CUADRO 2 Perfil de gradiente de purificación del compuesto 10 Espectro de absorción (MeOH): ? 768 (1.00), 537 (0.22), 387 (0.71) y 342 (0.79) nm. ESI-MS (-): 795 (IVT-2K). Relación de partición de agua/octanol es 40:60.

EJEMPLO 4 Preparación de la sal de dipotasio de zinc 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil- Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetinamida (Compuesto 11) La inserción de Zn en el compuesto 5 se llevó a cabo en acetato de Zn en ácido acético como se describe previamente (Patente E.U.A No. 5,726,169). Se llevó a cabo la purificación final por CLAR en las mismas condiciones que para el compuesto 5 en el Ejemplo 2 anterior. Espectro absorción (MeOH): ?, 762 (1.00), 558 (0.26), 390 (0.62) y 355 (0.84) nm.

Relación de partición de agua/octanol es 50:50.

EJEMPLO 5 Preparación de sal dipotasio de manganeso(lll) sal 3 -oxo-15- metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida (Compuesto 12) La inserción de Mn en el compuesto 5 se llevó a cabo con acetato de Zn en ácido acético como se describe previamente (WO 97/19081 ; U.S. 6,333,319) con algunas modificaciones. Asi, cincuenta (50) mg del compuesto 5 en 10 mi de DMF se agitaron con 220 mg de acetato de cadmio y se calentaron bajo atmósfera de argón a 110°C alrededor de 15 min (formación de complejo de Cd se observa por un giro en la banda de absorción por transición Qx desde 519 a 585 nm en acetona). Luego se enfrió y evaporó la mezcla de reacción. Se volvió a disolver el residuo seco en 15 mi de acetona y se agitó con cloruro de manganeso (II) para formar el producto 12 de Mn(lll). La formación del producto se observa por el giro en la banda de transición Qx desde 585 a 600 nm y la banda de transición Qy desde 768 a 828 nm en acetona. Se evaporó la acetona y el producto 12 se purificó adicionalmente por CLAR en las condiciones mencionadas en el Ejemplo 2 anterior con el perfil de elución descrito en el Cuadro 3 a continuación en donde el sistema solvente consiste de A: - 5% metanol acuoso, B - metanol.

CUADRO 3 Gradiente de purificación del compuesto 12 El solvente (metanol acuoso) se evaporó bajo presión reducida y el pigmento sólido 12 se almacenó bajo Ar en la oscuridad a -20°C. Espectro de absorción (MeOH): ? 828 (1.00),.588 (0.32) y 372 (0.80) nm. Relación de partición de agua/octanol es 5:95.

EJEMPLO 6 Preparación de la sal de sodio del éster de paladio bacteriofeoforburo 173-(3-sulfo-1 -oxi-sucinimida) (Compuesto 6) Cincuenta (50) mg de Pd-Bpheid (compuesto 2), 80 mg de N-hidroxi-sulfosucinimida (sulfoNHS) y 65 mg de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) se mezclaron en 7 mi de DMSO secó durante la noche a temperatura ambiente. Luego se evacuó el solvente bajo presión reducida. El residuo seco se volvió a disolver en cloroformo (ca. 50 mi), se filtró del material insoluble y se evaporó, la conversión fue ab. 95% (CCD). El producto 6 se usó posteriormente sin purificación cromatográfica adicional ESI-EM (-): 890 (M"-Na). RMN (CDCI3): 9.19 (5-H, s), 8.49 (10-H, s), 8.46 (20-H, s), 5.82 (132-H, s), 4.04-4.38 (7,8,17,18-H, m), 3.85 (134.Me, s), 3.47 (21-Me, s), 3.37 (121-Me, g), 3.09 (32 Me, s), 1.77 (7 -Me, d), 1.70 (18 .Me, d), 1.10 (82-Me, t), 4.05 (CH2 de sNHS), 3.45 (CH de s NHS).

EJEMPLO 7 Preparación de la sal del potasio de paladio bacteriofeoforburo a 173 -(3- sulfopropil) amida (Compuesto 7) Diez (10) mg del compuesto 6 en 1 mi de DMSO se mezclaron con 20 mg de homotaurina (ácido 3-amino-1-propano-sulfón¡co) en 1 mi de una solución amortiguadora de K-fosfato 0.1 M, pH 8.0 durante la noche. Luego se dividió la mezcla de reacción de cloroformo/agua. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporó. El residuo seco se volvió a disolver en cloroformo metanol (19:1 ) y se aplicó a una columna cromatográfica con sílice. El producto 7 se obtuvo con una elución de cloroformo-metanol (4:1 ) el rendimiento fue alrededor de 80-90%.

ESI-EM (-): 834 (M-K) m/z. RMN (MeOH-d4). 9.16 (5-H, s), 8.71 (IO-H, s), 8.60 (20-H, g), 6.05 (132-H, s), 4.51 , 4.39,4.1 ,3.98 (7,8,17,18-H, todo m), 3.92 (134-Me, g), 3.48 (21-Me, s), 3.36 (121-Me, s), 3.09 (32-Me, s), 2.02-2.42 (171 y 172 -CH2, m), 2.15 (81-CH2, q), 1.81 (7 -Me, d), 1.72 (181.Me, d), 1.05 (82-Me, t), 3.04, 2.68, y 2.32 (CH2's de homotaurina, m).

EJEMPLO 8 Preparación de la sal de dipotasio de paladio 31-oxo-15- metoxicarbonilmetil-Rodo-bacterioclorin 131. 173-di(3-sulfopropil)amida (CompuestoD Diez (10) mg del compuesto 6 o 7 se disolvieron en 3 mi de DMSO se mezclaron con 100 mg de homotaurina en solución amortiguadora de fosfato K 1 mi de 0.5 M pH 8.2, y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Luego se evacuó el solvente bajo presión reducida como se describe arriba y el producto 8 se purificó en CLAR. Rendimiento 83%. Espectro de absorción (MeOH): 747 (1.00), 516 (0.13), 384 (0.41),330 (0.50), S747 =1.3x105 morW. ESI-EM(-):1011 (M"-K), 994 (M"-2K+Na), 972 (M"-2K), 775 (M-2K-CO2Me-homotaurina NHCH2CH2CH2SO3), 486 ([ -2KJ/2) RMN (MeOH-d4): 9.35 (5-H, s), 8.75 (10-H, s), 8.60 (20-H, s), 5.28 and 4.98 (151-CH2) dd), 4.38, 4.32, 4.22, 4.15 (7,8,17,18-H, todo m), 3.85 (15~3 -Me, s), 3.51 (2~1 -Me, s), 3.18 (12 -Me, g), 3.10 (32-Me, s 2.12-2.41 (17 .CH2, m), 2.15-2.34 (81-CH2, m), 1.76-2.02 (172-CH2, m), 1.89 (71-Me, d), 1.61 (181-Me, d), 1.07 (82-Me, t). 3.82, 3.70, 3.20, 3.10, 2.78, 2.32, 1.90 (CH2's de homotaurina a C-131 y C-173) EJEMPLO 9 Sal de tri potasio de Paladio 31-(3-sulfopropilimino)-15- metoxlcarbonimetil-Rodo-bacterioclorina 131:173 -di(3-sulfopropil)amida (Compuesto 9) El compuesto 9 se obtuvo: a partir de CLAR como un producto menor durante la síntesis de 8. Espectro de absorción (MeOH): 729 (1.00), 502 (0.10), 380 (0.69), 328 (0.57). ESI-EM (30.4.2000): 1171 (M-K+H), 1153 (M -2K-H+Na), 1131 (M-2K), 566 ([M-K]/2), 364 ([M-3K]/3). RMN (MeOH-d4): 8.71 (1 H), 8.63 (1.5H), 8.23 (0.5H) (5-, 10- y 20-H, todo -m), 5.30 y 4.88 (151-CH2, dd), 4.43 y 4.25 (7,8,17,18-H, m), 3.85 (15"3-Me, s), 3.31 (21-Me, s), 3.22 (12 -Me, g), 3.17 (32-Me, 111), 1.89-2.44 (171 y 172-CH2, m), 2.25 (81-CH2, m), 1.91 (71-Me, g), 1.64 (181-Me, g), 1 .08 (82-Me, t), 4.12, 3.56, 3.22, 3.16, 2.80 y 2.68 (CH2's de homotaurina).

EJEMPLO 10 Sal de potasio de Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil- Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetiDamida, 173-(N-¡nmunoglobulina G)amida (Compuesto 13) Diez (10) mg del compuesto 4 se hicieron reacción con 20 mg de sulfo-NHS y 15 mg de EDC en 1 mi de DMSO secó durante 1 hora a temperatura ambiente, luego el IgG de conejo (0.6 mg) se agregó en PBS (2.5 mi) y la mezcla se incubó además durante noche a temperatura ambiente. La mezcla se evaporó hasta sequedad y luego se volvió a disolver en 1 mi de PBS y se cargó en una columna Sephadex G-25 equilibrada con PBS. Se eluyó una banda coloreada con 4-5 mi de PBS. la relación de pigmento/proteína en el conjugado obtenido 13 se determino por densidad óptica a 753 y 280 nm, respectivamente, y varió entre 0.5/1 a 1/1 del pigmento 13/proteína.

EJEMPLO 11 Preparación de la sai de dipotasio paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil- Rodobacterioclorina 131-(2-carboxietil)amída (Compuesto 14) La preparación y purificación del compuesto del título 14 se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 2 por la reacción del compuesto 2 con el ácido 3-aminopropiónico (p-alanina)(150 mg) en lugar de taurina. Rendimiento: 85%.

EJEMPLO 12 Preparación de la sai de tripotasio de paladio 31-oxo-15- metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-fosfopropil)amida (Compuesto 15) La preparación y purificación del compuesto del título 15 se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 2 por la reacción del compuesto 2 con el ácido 3-amino-1-propanfosfónico (180 mg) en lugar de taurina. Rendimiento 68%.

EJEMPLO 13 Preparación de la sal de tripotasio paladio 3 -(3-sulfopropilamino)-15- metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorin 131, 173-di(3-sulfoprop¡l)amida (Compuesto 16) Para la reducción del grupo imina en 31-(3-sulfopropil¡mino) a el correspondiente grupo 31-(3-sulfopropilamino), el compuesto 9 (8 mg) se hizo reaccionar por agitación con cianoborohidruro de sodio (15 mg) en 5 mi de metanol durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se trató con 0.05 M HCI (5 mi), se neutralizó con 0.01 M KOH, y se evaporó. El producto del título 16 se purificó usando las condiciones CLAR como se describen en el Ejemplo 2. Rendimiento 80-90%.

II Sección biológica Materiales v Métodos Estudios In vitro (i) Cultivo de células. Células M2R de melanoma de ratón, H5V endotelial de ratón y C6 de glioma de rata se cultivaron como monocapas en un medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 que contiene HEPES 25 mM, pH 7.4, 10% de suero de bovino fetal (FBS), glutamina (2 mM) penicilina (0.06 mg/ml) y estreptomicina (0.1 mg/ml) (de aquí en adelante referido como medio de cultivo). Se hicieron crecer las células a 37°C en una atmósfera humidificada con C02 al 8%. (¡i) Ensayo de Fototoxicidad. Para determinar la eficacia fotodinámica, se preincubaron las células con concentraciones crecientes de los pigmentos en la oscuridad para los tiempos y condiciones como se indican para los experimentos individuales. Se retiró el sensibilizador sin enlazar al lavar las células una vez con el medio de cultivo y las placas se iluminaron a temperatura ambiente desde el fondo (?>650 nm, 12 J/cm2). La fuente de luz fue una lámpara de halógeno de 100W (Osram, Alemania) equipada con filtro de agua de 4-cm. Se colocaron los cultivos en el incubador del cultivo y se determinó la superviviencia de las células 24 horas después de la iluminación, por ensayo de viabilidad de rojo neutral. Se usan 3 tipos de controles: (i) control de luz: células iluminadas en ausencia de pigmentos; (ii) control de oscuridad: células tratadas con pigmentos pero mantenidas en la oscuridad; y (iii) células no tratadas que se mantienen en la oscuridad.

Estudios In Vivo (iii) Implante de tumor. Se implantan células M2R o C6 (2 x 106) subcutáneamente en el lomo de ratones; se desarrollan los tumores para el tamaño de tratamiento (6-8 mm) dentro de 2-3 semanas. (iv) Preparación del sensibilizador. Se preparan soluciones de reserva de los compuestos de la invención antes de usarse al disolver el pigmento seco directamente en PBS hasta la concentración deseada para la inyección. (v) Bbdistribución y farmacocinéticos. El pigmento 4 de la invención (6 mg/kg cuerpo) se inyecta a ratones desnudos CD1 por medio de la vena de la cola. Se sacrifican los ratones en los tiempos indicados, y las muestras de los órganos o tejidos indicados se colocan y se pesan en viales previamente pesados y se congelan inmediatamente en hielo seco. Para el examen, cada muestra se descongela y se homogeniza (1 :10 p/v) en agua de doble destilado. Se liofilizan alícuotas del homogenado (0.5 mi) en tubos de prueba Eppendorff. Luego se agrega 0.2 mi de HN03 (70%, TraceSelect, Fluka) a cada muestra seca, se incuba durante 1 hora a 90°C y se diluye en agua de doble destilado hasta 10 mi. Se determinan las concentraciones de paladio por ICP-MS. Se determina el respaldo para cada órgano/tejido en muestras idénticas tomadas de ratones no tratados, y los valores se substraen en consecuencia. (vi) Protocolo PDT. Se anestesian ratones que portan el tumor M2R y se inyecta el pigmento intravenosamente (i.v.) por medio de la vena de la cola. Los tumores se iluminan inmediatamente transcutáneamente durante 5 minutos por láser de diodo 755 nm (CeramOptec, Alemania) con dosis de luz de ya sea 30J/cm2 (100mW/cm2), 39J/cm2 (130mW/cm2) ó 45J/cm2 (150mW/cm2). Después del tratamiento, los ratones se regresan a la jaula. En el grupo de control de oscuridad, los ratones se inyectaron i.v. con el sensibilizador y se colocaron en la jaula oscura durante 24 horas. En el grupo de control de luz, los ratones se iluminaron con 45J/cm2. (vii) Detención y permeabilidad vascular. Se tratan ratones que portan los xenoinjertos de tumor de glioma C6 con el pigmento 4 (9 mg/kg) y luz (100 mW/cm2 durante 5 minutos). Inmediatamente después del tratamiento, se inyecta azul Evans (EB; 1 % en PBS) (0.5 mi, i.p.). Los ratones se fotografiaron a 3 y 24 horas después del tratamiento. Los ratones se sacrifican 24 horas después del tratamiento y se hace un colgajo de piel para cada ratón y se fotografía. Después, se remueve el tumor con la piel arriba de este, se congela durante 1 hora a -20°C, y luego se hace un corte axial y el corte se fotografía. Los ratones de control se inyectan con azul Evans al mismo tiempo como los ratones tratados, y el protocolo continua como se describe arriba para todos los ratones en conjunto.

EJEMPLO 14 Citofotoxicidad de los derivados de bacterioclorofila sulfonados contra cultivos de célula de tumor La fototoxicidad de los compuestos 4 y 8 se determina como se describe en (ii) arriba en melanoma de ratón M2R y células endoteliales de ratón H5V. Se preincuban las células con concentraciones incrementadas del compuesto durante 4 horas, se lava y se ilumina o se mantiene en la oscuridad.

Los resultados se muestran en las figuras 1A-1 B para el compuesto bisulfonado 8 en células H5V y MR2, respectivamente, y las figuras 2A-2B para el compuesto monosulfonado 4 (comparación) en células H5V y MR2, respectivamente. Como puede apreciarse, la fototoxicidad de ambos pigmentos 4 y 8 es dependiente de la concentración y la luz, sin ninguna toxicidad en la oscuridad en el rango probado. El LD50 de ambos pigmentos es el mismo (-2 µ?), y es similar en ambas líneas de células. La fototoxicidad de los pigmentos sulfonados 5 y 11 se determina en células de melanoma M2R. Como puede apreciarse en las figuras 3 y 4, la fototoxicidad de los pigmentos 5 y 11 es dependiente de la concentración y la luz, y el LD50 de ambos pigmentos es el mismo (~5 µ?). No hay toxicidad en la oscuridad dentro del rango probado.

EJEMPLO 15 Farmacocinéticos v biodistribución del compuesto 4 La primera etapa antes de probar la fototoxicidad de 4 hacia PDT de los xenoinjertos de melanoma sólido es determinar los farmacocinéticos y biodistribución del pigmento in vivo como se describe en la sección (vi) arriba. Como puede apreciarse en la figura 5, alrededor del 90% del pigmento 4 se libera dentro de los primeros 10 minutos de la inyección i.v. con un patrón cinético monofásico con un t0.5 de 1.65 minuto (Cuadro 4). La liberación rápida de 4 de la sangre puede implicar que sólo una fracción pequeña (si en todo) se enlaza a los componentes del plasma, de otra manera la liberación puede ser más lenta.

CUADRO 4 Parámetros farmacocinéticos de 4 en sangre de ratones Kei - relación de eliminación; Vd- volumen de distribución; CL-liberación. La biodistribución del compuesto 4 muestra que, en la mayoría de los órganos examinados del ratón, los niveles de pigmento son altos inmediatamente después de la inyección y caen hasta casi niveles de respaldo dentro de 20-30min, similares a sus velocidades de liberación de la sangre (Fig. 6). Estos resultados representan probablemente el nivel del pigmento en la sangre atrapada en la vasculatura del órgano como se aprecia en el bazo, pulmón y corazón. Adicionalmente, los resultados también sugieren que la difusión del pigmento en los órganos es insignificante. El pigmento 4 se aclara rápidamente del cuerpo del ratón, y dentro de 30 minutos después de la inyección en niveles de respaldo en todos los tejidos. La velocidad de liberación de 4 del cuerpo del ratón es mucho más rápida que Pd-Bpheid (3), que alcanza niveles de respaldo solo 48 horas después de la inyección (no mostrado).

EJEMPLO 16 Tratamiento fotodinámico de xenoinjertos de melanoma M2R en ratones desnudos CD1 con el pigmento sulfonado 4 Con base en los resultados farmacocinéticos del Ejemplo 15 anterior, el protocolo de tratamiento para el compuesto 4 se establece para una iluminación de 5 minutos inmediatamente después de la inyección del pigmento. En estos experimentos, (ver sección (vii) arriba), se usa un láser médico dedicado alineado al pico de absorción de 4 (CeramOptec, Alemania, 755 nm). Con objeto de determinar el protocolo fármaco/luz óptimo se tratan los ratones con dosis de fármaco de 6 mg/kg y se incrementa la intensidad de la luz (Figura 7). Como puede apreciarse en la curva quirúrgica KaplanMeier, al incrementar la intensidad de la luz se mejora la velocidad de cura de los ratones desde 43% hasta 60% con 30 y 45J/cm2, respectivamente. Cuando la dosis de fármaco se eleva hasta 9 mg/kg con intensidad de luz 30 J/cm2, hay un incremento importante en la sobrevivencia de ratones del 70% (figura 7). No se aprecia toxicidad en la oscuridad en los animales tratados con 6 o 9 mg/kg y mantenidos en la oscuridad.

EJEMPLO 17 Efecto selectivo del tratamiento fotodinámlco con el compuesto 4 Este experimento se llevó a cabo como se describe en la sección (vii) arriba. Las figuras 8a-8h ilustran el efecto del tratamiento fotodinámico en la perfusión sanguínea en xenoinjertos C6 implantados en ratones (fig. 8a, 8e). El animal tratado que se administró con el azul Evans inmediatamente después de PDT muestra un edema y una pérdida de vasculatura aumentada de EB en el ¡nteresticio como se demuestra por el color azul (debido a la pérdida de azul Evans-albúmina) en el área iluminada cuando se compara con el área no iluminada en el mismo animal a un animal no tratado (figs. 8b, 8f). Veinticuatro horas después, puede apreciarse que en el ratón tratado, el tumor circundante está altamente coloreado en azul (edema; fig. 8c), mientras que los restos de tumor blanco (sin color EB) debido a la detención vascular que se presenta inmediatamente después de PDT (fig. 8d). El tejido muscular bajo el tumor así como la piel arriba y alrededor del tumor (pero dentro del área tratada) es azul, lo que indica que no ha tomado lugar una detención vascular (figs. 8c, 8d). En el animal tratado, el tumor se colorea de azul igual que otros tejidos (figs. 8g, 8h). El cerrado selectivo de nuevos vasos en el tumor indica que los compuestos de la invención pueden usarse para el tratamiento selectivo de una vasculatura anormal como en la degeneración macular relacionada con la edad (AMD).

EJEMPLO 18 Tratamiento PPT con el compuesto 4-animal de AMD Se ha desarrollado la terapia fotodinámica (PDT) apuntando a inducir una oclusión vascular localizada de las membranas vasculares recientemente formadas emanadas del coroide (neovascularización coroidial -CNV). En la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), el PDT que usa verteporfina reduce el riesgo de una pérdida visual secundaria a CNV. El mecanismo de acción de PDT se piensa que involucra la liberación de especies de oxígeno reactivo que dañan las células endoteliales y activan la cascada del coagulo subendotelial. Estos eventos llevan a la formación de trombos dentro del lumen del vaso. Para el tratamiento de neovascularización coroidal, se han desarrollado parámetros selectivos (densidad o fluencia de polvo de láser, dosis fotosensibilizadora y distancia para la iluminación de luz (DLI)) que permiten el enfoque y direccionamiento preciso de los vasos patológicos y efectos dañinos secundarios mínimos a la retina saludable y tejidos coroides. Sin embargo, usando el único fotosensibilizador (verteporfina) actualmente disponible para uso clínico, generalmente se requieren tratamientos repetidos para alcanzar los efectos oclusivos CNV deseados. De esta manera, el peligro de un daño de tejido colateral aumenta y puede volverse un efecto colateral importante del tratamiento.

En este experimento, se ha evaluado potencial de tratamiento fotodinámico (PDT) del fotosensibilizador hidrosoluble designado aquí WST11 o el compuesto 4, y comparar sus características para aquellos de verteporfina. El compuesto 4 es un derivado de bacterioclorofila puro y estable aislado como un polvo cristalino morado oscuro. Tiene un peso molecular de 916 y es soluble en una solución acuosa. Se caracteriza por las siguientes propiedades: (a) 4 picos principales de absorción (750, 530, 385 y 330 nm). La absorbancia más fuerte de luz es casi la infrarroja (-750 nm) donde la transmisión de tejido es la más alta; (b) una citotoxicidad muy baja en la oscuridad. De esta manera, el tejido dañado puede controlarse por la dosis de luz y la longitud de exposición; (c) se libera rápidamente del cuerpo después de la administración. Por lo tanto, el daño a la fotosensibilización de la piel potencial en la exposición a la luz ambiental o la luz del sol es mínima; (d) la generación de especies de oxígeno reactivo (ROS) es alta debido al cruce intersistema eficiente (ISC). El polvo WST11 se diluye en agua estéril sin endotoxina a una concentración de 10 mg/kg, y se agita hasta que se completa la disolución. Esta formulación se mantiene estable durante 24 horas a 4°C protegida de la luz. Para calcular el volumen a inyectarse, se hace un ajuste de acuerdo al peso del conejo. La solución de volumen apropiados se inyecta intravenosamente como un bolo por medio de la vena de la oreja marginal.

El potencial del compuesto 4 para PDT de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) se compara con la verteporfina (Visudyne®, Novartis, Suiza) usando un modelo de ojo de conejo. Los conejos pigmentados (136 conejos "Fauve de Bourgogne", 10-12 semanas de edad, 2.5-3 kg; Elevage des Pins, Epeigne-sur-Déme, Francia) se usaron. Los efectos PDT de larga duración y agudos en el ojo del conejo se investigan por los siguientes parámetros: 1) fluencia de láser 753 nm (35 y 50J/cm2), dosis de compuesto 4 (también designada WST11 ) (2.5 y 5 mg/kg) y distancia para iluminación de luz (DLI) de 1 , 5, 10 y 15 minutos. 2) fluencia de láser (10, 50, 100 J/cm2), dosis de verteporfina (3, 6 y 12 mg/m2) y un DLI constante de 5 minutos. Estos parámetros PDT abarcan una configuración de efectos en el coroide y la retina traslapada se entregan durante 83 segundos para inducir eventos oclusivos, oclusivos de subumbral y vasculares no oclusivos. Los ojos de conejos tratados se examinaron y se siguen por oftalmoscopia directa, angiografía de fluoresceína (FA) e histología a varios intervalos después de PDT. WST11 de PDT usa una fluencia de 50J/cm2, dosis de fármaco de 5 mg/kg y DLI de 1 minuto que induce la oclusión coroidal total asociada con lesiones estructurales del RPE traslapado y la retina en el 100% de los ojos tratados (figuras 9A-9D). Los parámetros PDT no oclusivos, más débiles (25 J/cm2, dosis de fármaco 5 mg/kg y DLI de 10 minutos) no inducen la oclusión coriocapilar ni las lesiones retínales. La verteporfina PDT usa una dosis de fármaco de 12 mg/m2 a una fluencia de 100 J/cm2 y DLI de 5 minutos que induce eventos oclusivos (observados por FA) en el 89% de los ojos y daño histológico de la retina traslapada y capa RPE en todos los ojos. Los parámetros PDT de verteporfina no oclusivos más débiles que usan una dosis de fármaco 3 mg/kg, fluencia 10J/cm2 y DLI de 5 minutos, no inducen ninguna oclusión coriocapilar en FA. Sin embargo, en estos ojos, el daño estructural definitivo de la retina y tejidos coroides se observa en histología. De manera similar a la verteporfina, WST1 1 de PDT induce la oclusión transitoria de los coriocapilares observada 1 semana después del tratamiento. Al contrario de la verteporfina, los parámetros WST11 de PDT no incluyen la oclusión del vaso que no causa RPE o daño estructural en la retina. De esta manera, a pesar de su capacidad para inducir la obstrucción de vasos, WST1 1 de PDT no causa daño a RPE y la retina traslapada cuando no toma lugar la oclusión de los coriocapilares. Las ventajas de estas características indican que WST11 es un candidato apropiado para el tratamiento PDT de CNV en la degeneración macular relacionada con la edad. Para la histología, se disectaron ojos enucleados bajo un microscopio binocular. Se usó una punción de biopsia de 4 mm para cortar el grosor completo de las zonas tratadas. Estos tejidos se fijaron en glutaraldehído, se procesaron en solución amortiguadora de cacodilato y se colocaron en plástico. Las secciones semidelgadas se obtienen usando un microtomo y un contador de teñido como hematoxilina-eosina. Estas secciones se analizan usando microscopio de contraste de fase. Los sitios específicos de interés se procesaron además para TEM. Las secciones ultradelgadas se obtienen usando un ultramicrotomo y un contador de teñido con acetato de uranilo.

Referencias Chen Q, Huang, Z, Luck D, Beckers J, Brun PH, Wilson BC, Scherz A, Salomón Y, Hetzel FW. (2002) Preclinicla studies in normal canine prostate of a novel palladium-bacteriopheophorbide (WST09) photosensitiser for photodynamic therapy of prostate cancers. Photochem Photobil. 76(4):438-45. Koudinova NV, Pinthus JH, Brandis A, Brenner O, Bendel P, Ramón J, Eshhar Z, Scherz A, Salomón Y. (2003) Photodynamic therapy with Pd-Bacteriopheophorbide (TOOKAD): successful in vivo treatment of human prostatic small cell carcinoma xenografts. Int J Cáncer 104(6): 782-9. Rosenbach-Belkin, V., Chen, L, Fiedor, L, Tregub, I., Pavlotski, F., Brumfeld, V., Salomón, Y., Scherz, A. (1996) Serine conjugates of chlorophyll and bacteriochlorophyll: Photocytotoxicity in vivo and tissue distribution in mice bearing melanoma tumors. Photochem. Photobiol. 64:174-181. Schreiber S, Gross S, Brandis A, Harmelin A, Rosenbach-Belkin V, Scherz A, Salomón Y. (2002) Local photodynamic therapy (PDT) of rat C6 glioma xenografts with Pd-bacteriopheophorbide leads to decreased metastases and increase of animal cure compared with surgery. Int J Cáncer. 99(2):279-85. Zilberstein, J., Schreiber, S., Bloemers, MCWM, Bendel, P., Neeman, M., Schechtman, E., Kohen, F., Scherz, A. Salomón Y. (2001) Antivascular treatment of solid melanoma tumors with bacteriochlorophyll-serine-based photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 73:257-266. Züberstein, J., Bromberg, A., Franz, A., RosenbachBelkin, V., Kritzmann, A., Pfefermann, R., Salomón Y., Scherz, A. (1997) Light-dependent oxygen consumption in bacteriochlorophyll-serine-treated melanoma tumors: On-line determination using a tissue-inserted oxygen microsensor. Photochem. Photobiol. 65:1012-1019.

ESQUEMA 1 9 7

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un derivado de bacterioclorofila que contiene al menos uno, preferiblemente dos o tres, grupos cargados negativamente y/o grupos ácidos que se convierten en grupos cargados negativamente a un pH fisiológico, excluyendo los derivados pentacíclicos de bacterioclorofila que tienen un grupo CH2CH2COOH libre o CH2CH2COO en la posición 17, y derivados tetracíclicos de bacterioclorofila desprovistos de un átomo de metal central y que tienen un grupo -CH2CH2COOH en la posición 17, un grupo CH2COOH o -COOH en la posición 15, un grupo -COOH en la posición 13, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 12, 18 y grupos etilo en las posiciones 3 y 8.

2. - El derivado de bacterioclorofila de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque contiene dos grupos cargados negativamente.

3. - El derivado de bacterioclorofila de conformidad con la reivindicación , caracterizado además porque contiene tres grupos cargados negativamente.

4.- El derivado de bacterioclorofila de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque los grupos cargados negativamente se seleccionan del grupo que consiste de COO", COS", S03", y/o P032".

5.- El derivado de bacterioclorofila de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos grupos ácidos que se convierten a grupos cargados negativamente al pH fisiológico se seleccionan del grupo que consiste de COOH, COSH, S03H, y/o P03H2.

6.- El derivado de bacterioclorofila de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, derivado de un derivado natural o sintético de bacterioclorofila, caracterizado además porque incluye compuestos en los cuales el átomo Mg central puede ser eliminado o reemplazado por otros átomos de metal.

7.- El derivado de bacterioclorofila de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es de la fórmula I o II: en donde, M representa 2H o un átomo de metal seleccionado de Pd, Pt, Co, Sn, Ni, Cu, Zn y Mn divalente, y Fe, Mn y Cr trivalente; R-?, R2 y R4 cada uno independientemente es Y- R5; Y es O, S o R5R6; R3 es seleccionado de -CH=CH2, -C(=0)-CH3) -C(=0)-H, -CH=NR7, -C(CH3)=NR7) -CH2-OR7, -CH2-SR7, -CH2-NR7R'7) -CH(CH3)-OR7, -CH(CH3)-SR7, -CH(CH3)-NR7R'7l - CH(CH3)Hal, -CH2-Hal, -CH2-R7, -CH=CR7R'7l -C(CH3)=CR7R'7, -CH=CR7Hal, -C(CH3)=CR7Hal, y -C=CR7; R5, R6, R7 y R cada uno independientemente es H o se selecciona del grupo que consiste de: (a) hidrocarbilo de C1-C25 que opcionalmente contiene uno o más heteroátomos, porciones carbocíclicas o heterocíclicas, y/u opcionalmente substituido por uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de halógeno, oxo, OH, SH, CHO, NH2, CONH2, un grupo cargado negativamente, y un grupo ácido que se convierte a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico; (b) un residuo de un aminoácido, un péptido o de una proteína; y (c) cuando Y es O, o S, R5 puede además ser Rs+; m es 0 ó 1; y R3+ es H+ o un catión; con la condición de que: (i) al menos uno, preferiblemente dos, de R5, R6, R7 y R'7 es una cadena de hidrocarburo como se define en (a) arriba substituido por un grupo cargado negativamente o por un grupo ácido que se convierte a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico; o (ii) al menos uno, preferiblemente dos, de R1 , R2 y R4 es OH, SH, 0"R8+ o S"R8+; o (¡ii) al menos uno de R-i, R2, y R4 es OH, SH, 0"R8+ o S"R3+ y al menos uno de R5, Re, R7 y R'7 es una cadena de hidrocarburo substituido por un grupo cargado negativamente o por un grupo ácido que se convierte a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico; o (ív) al menos uno de R-i, R2, y R4 es OH, SH, 0"R3+ o S"Rs+ y al menos uno de R5, R6, R7 y R'7 es un residuo de un aminoácido, un péptido o de una proteína; o (v) al menos uno de R5, R6, R7 y R'7 es una cadena de hidrocarburo substituido por un grupo cargado negativamente o por un grupo ácido que se convierte a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico y al menos uno de R5, R6, R7 y RV es un residuo de un aminoácido, un péptido o de una proteína; pero excluyendo los compuestos de la fórmula I en donde M es como se define, R3 es -C(=O)CH3, R1 es OH u OR8+ y R2 es -OCH3, y el compuesto de la fórmula II en donde M es 2H, R3 es -C(=O)CH3, R1, 2 y son OH, y m es 0 ó 1.

8.- El derivado de bacterioclorofila de la fórmula I o II de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque los grupos cargados negativamente se seleccionan del grupo que consiste de COO", COS-, SO3", y/o PO32".

9.- El derivado de bacterioclorofila de la fórmula I o II de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque los grupos ácidos que se convierten a grupos cargados negativamente al pH fisiológico se seleccionan del grupo que consiste de COOH, COSH, SO3H, y/o PO3H2.

10. - El derivado de bacterioclorofila de la fórmula I o II de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque R1 es Y-R5; Y es O, S ó NH; y R5 es una cadena de hidrocarburo substituida por grupos funcionales seleccionados de OH, SH, SO3H, NH2, CONH2, COOH, COSH, PO3H2.

11. - Ei derivado de bacterioclorofila de la fórmula I o II de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque R5 es el residuo de un aminoácido, un péptido o una proteína.

12. - El derivado de bacterioclorofila de la fórmula I o II de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque contiene un átomo de metal Pd central. 13. - El derivado de bacterioclorofila de la fórmula I de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque: M es Pd;

R1 es -NH-(CH2)n-S03"R8+, -NH-(CH2)n-COO-R8+; -NH-(CH2)n-P032-(R8+)2; 2 es metoxi; R3 es -C(=0)-CH3; R8+ es un catión monovalente tal como K+, Na+, Li+, NH4+, y n es un entero desde 1 hasta 10, preferiblemente 2 ó 3.

14. - El derivado de bacterioclorofila de la fórmula II de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque: M representa 2H, Pd, Cu, o Zn divalente o Mn trivalente; R1 es -0"R8+, -NH(CH2)n-S03'R8+, -NH-(CH2)n-COO-R8+, -NH-(CH2)n-P032-(R8+)2; o Y-R5 en donde Y es O, S ó NH y R5 es el residuo de un aminoácido, un péptido o una proteína; R2 es alcoxi de C C6 tal como metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, más preferiblemente metoxi; R3 es -C(=0)-CH3, -CH=N-(CH2)n-S03"R8+; -CH=N-(CH2)n-COO'8+; -CH=N-(CH2)n-P032"(R8+)2; -CH2-NH-(CH2)n-S03"R8+; -NH-(CH2)n-COO-R8+; ó -NH-(CH2)n-P032"(R8+)2; R4 es -NH-(CH2)n-S03-R8+; -NH-(CH2)n-COO'R8+; -NH-(CH2)n-P032'(R8+)2; Re* es un catión monovalente tal como K+, Na+, Li+, NF , más preferiblemente K+; y m es 1, y n es un entero desde 1 hasta 10, preferiblemente 2 ó 3.

15. - El derivado de bacterioclorofila de la fórmula II de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque: M es Pd divalente; R1 es -0"R8+, -NH-(CH2)n-S03"R8+, o Y-R5 en donde Y es O, S o - NH y R5 es e! residuo de un aminoácido, un péptido o una proteína, R2 es alcoxi de C C6, preferiblemente metoxi; R3 es -C(=0)-CH3, -CH=N-(CH2)n-S03"R8+; ó -CH2NH-(CH2)n-S03"R8+; R4 es -NH-(CH2)n-S03"R8+; NH-(CH2)n-COO"R8+; NH-(CH2)n-P032"(R8+)2; R8+ es un catión monovalente, preferiblemente K+; m es 1 y n es 2 ó 3.

16.- El derivado de bacterioclorofila de la fórmula I de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque consiste del compuesto bacteriofeoforburo de paladio a 173-(3-sulfopropil)amida sal de potasio.

17.- El derivado de bacterioclorofila de la fórmula II de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque consiste de los compuestos: Paladio 31-oxo- 5-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 3 -(2-sulfo-etil)amida sal de dipotasio; 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 -(2-su!foetil)amida sal de dipotasio; Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13\173-di(3-sulfopropil)amida sal de dipotasio; Paladio 31-(3-sulfopropilimino)-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterio-clorina 131,173-di(3-sulfopropil)amida sal de tripotasio; Cobre (II) 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida sal de dipotasio; Zinc 31-oxo- 5-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 31-(2-sulfoetil)amida sal de dipotasio; Manganeso (III) 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida sal de dipotasio; Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 -(2-sulfoetil)amida, 173-(N-immunoglobulina G) amida sal de potasio; Paladio 3 -oxo-15-metoxicarbon¡l-Rodobacter¡oclorina 131-(2-carboxietil)amida sal de dipotasio; Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-fosfopropil)amida sal de tripotasio; y Paladio 31-(3-sulfopropilamino)-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 ,173-di(3-sulfopropil)amida sal de tripotasio.

18. - Paladio 31-oxo-15-metox¡carbonilmetil-Rodobacterio-clorina 131-(2-sulfoetil)amida sal de dipotasio.

19. - Una composición farmacéutica que comprende un derivado de bacterioclorofila como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, y un portador farmacéuticamente aceptable.

20. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque es para terapia fotodinámica.

21. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque es para terapia fotodinámica de direccionamiento vascular.

22. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20 ó 21 , caracterizada además porque es para terapia fotodinámica de tumores, incluyendo tumores metastáticos.

23. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque es para terapia fotodinámica de melanoma, cáncer de colon, mama, pulmón o próstata.

24. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizada además porque es para terapia fotodinámica de degeneración macular relacionada con la edad.

25. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizada además porque es para terapia fotodinámica de hipertrofia de próstata benigna.

26. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque es para diagnóstico de tumor.

27. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque es para eliminar células o agentes infecciosos que comprenden virus y bacterias,

28. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque es para eliminación in vitro de células o agentes infecciosos que comprenden bacterias y virus en un producto biológico durante la iluminación del producto.

29. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el producto biológico es sangre.

30. - El uso de un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para la manufactura de una composición farmacéutica para su uso en terapia fotodinámica.

31. - El uso que se reclama en la reivindicación 30 para terapia fotodinámica de tumores, incluyendo tumores metastáticos.

32. - El uso que se reclama en la reivindicación 31 para terapia fotodinámica de melanoma, cáncer de colon, mama, pulmón, o próstata.

33. - El uso que se reclama en la reivindicación 30 para terapia fotodinámica de degeneración macular relacionada con la edad.

34.- El uso de un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para la manufactura de una composición farmacéutica para diagnóstico de tumores.

35. - El uso de un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para la manufactura de una composición farmacéutica para eliminar células o agentes infecciosos que comprenden bacterias y virus.

36. - En un método in vitro para eliminar células o agentes infecciosos que comprenden bacterias y virus, utilizando un fotosensibilizador, la mejora en donde dicho fotosensibilizador es un derivado de bacterioclorofila como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

37. - El compuesto bacteriofeoforburo de paladio a 173-(3-sulfo-1-oxisuccinimida) éster sal de sodio, como un intermediario.

38. - Un método para la preparación de compuestos de la fórmula II definida en la reivindicación 7, en donde Ri es -0"R8+, R2 es -OCH3; R3 es acetilo; R4 es un grupo -NH-(CH2)n-S03"Rs+; s+ es un catión monovalente; m es 1 y n es 1 a 10; el método comprende: (i) hacer reaccionar el correspondiente M-bacteriofeoforburo de la fórmula I en donde R1 es OH con un ácido aminosulfónico de la fórmula H2N-(CH2)n-S03H en una solución amortiguadora Rs+; y (i¡) aislar el compuesto deseado de la fórmula II.

39. - El método de conformidad con la reivindicación 38, para la preparación de paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmet¡l-rodobacterioclorin 13 -(2-sulfoetil)amida sal de dipotasio, caracterizado además porque comprende: (i) hacer reaccionar el Pd-bacteriofeoforburo con taurina de la fórmula H2N-(CH2)2-S03H en una solución amortiguadora K+, y (ii) aislar el compuesto del título.

40. - Un método para la preparación de compuestos de la fórmula II definida en la reivindicación 7, en donde Ri es -O R8+, R2 es -OCH3; R3 es acetilo; R4 es un grupo -NH-(CH2)n-COO'R8+; Re+ es un catión monovalente; m es 1 y n es 1 hasta 10, el método comprende: (i) hacer reaccionar el correspondiente M-bacteriofeoforburo de la fórmula I en donde Ri es OH con un ácido aminocarboxílico de la fórmula H2N-(CH2)n-COOH en una solución amortiguadora Rs+; y (ii) aislar el compuesto deseado de la fórmula II.

41.- Un método para la preparación de compuestos de la fórmula II definida en la reivindicación 7, en donde R-i es -0"R8+, R2 es -OCH3; R3 es acetilo; R4 es un grupo -NH-(CH2)n-P032"(R8+)2; Rs+ es un catión monovalente; m es 1 y n es 1 hasta 10; el método comprende: (i) hacer reaccionar el correspondiente M-bacteriofeoforburo de la fórmula I en donde Ri es OH con un ácido aminofosfónico de la fórmula H2N-(CH2)n-P03H2 en una solución amortiguadora Rs+; y (ii) aislar el compuesto deseado de la fórmula II.

42.- Un método para la preparación de compuestos de la fórmula II definida en la reivindicación 7, en donde R-i y R contienen el mismo grupo negativamente cargado; el método comprende: (i) hacer reaccionar el correspondiente M-bacteriofeoforburo con un exceso de ácido aminosulfónico, aminocarboxílico o aminofosfórico en una solución amortiguadora Rs+; y (ii) aislar el derivado 13,17-disubstituido deseado de la fórmula II.

43.- Un método para la preparación de compuestos de la fórmula II definida en la reivindicación 7, en donde R-? y R4 son cada uno un grupo — NH-(CH2)n-S03"Rs+; a es -OCH3; R3 es acetilo; R8+ es un catión monovalente; m es 1 y n es 1 a 10, el método comprende (i) acoplar el correspondiente M-bacteriofeoforburo de la fórmula I en donde Ri es OH con N-hidroxi-sulfosuccinamida (sulfo NHS) en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodi¡mida (EDC); (ii) hacer reaccionar el éster de M-bacteriofeoforburo-173-N-hidroxisulfosuccinimida resultante con un exceso del ácido aminosulfónico de la fórmula H2N-(CH2)n-S03H en una solución amortiguadora Rs+, obteniendo así un compuesto de fórmula I que tiene un solo grupo negativamente cargado en la posición 17; (iii) hacer reaccionar este producto con un exceso de H2N-(CH2)n-S03H en una solución amortiguadora Rs+ y (iv) aislar el compuesto deseado de la fórmula II.

44.- Un método para la preparación de compuestos de la fórmula II definida la reivindicación 7, en donde Ri y R4 son cada uno un grupo -NH-(CH2)n-COO"Rs+; R2 es -OCH3; R3 es acetilo; Rs+ es un catión monovalente; m es 1 y n es 1 a 10, el método comprende (i) acoplar el correspondiente M-bacteriofeoforburo de la fórmula I en donde R1 es OH con N-hidroxi-sulfosuccinamida (sulfo NHS) en presencia de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)- carbodümida (EDC); (ii) hacer reaccionar el éster de M-bacteriofeoforburo- 73-N-hidroxisulfosuccinimida resultante con un exceso del ácido aminocarboxílico de la fórmula H2N-(CH2)n-COOH en una solución amortiguadora R8+, obteniendo así un compuesto de fórmula I que tiene un solo grupo negativamente cargado en la posición 17; (iii) hacer reaccionar este producto con un exceso de H2N-(CH2)n-COOH en una solución amortiguadora R8+ y (iv) aislar el compuesto deseado de la fórmula II.

45.- Un método para la preparación de compuestos de la fórmula II definida la reivindicación 7, en donde Ri y R4 son cada uno un grupo -NH-(CH2)n-P032"R8+; R2 es -OCH3; R3 es acetilo; Ra* es un catión monovalente; m es 1 y n es 1 a 10; el método comprende (i) acoplar el correspondiente M-bacteriofeoforburo de la fórmula I en donde R1 es OH con N-hidroxi-sulfosuccinamida (sulfo NHS) en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC); (ii) hacer reaccionar el éster de M-bacteriofeoforburo-173-N-hidroxisulfosuccinimida resultante con un exceso del ácido aminofosfónico de la fórmula ?2?-(??2)?-??3?2 en una solución amortiguadora Rs+, obteniendo así un compuesto de fórmula I que tiene un solo grupo negativamente cargado en la posición 17; (iii) hacer reaccionar este producto con un exceso de H2N-(CH2)n-P03H2 en una solución amortiguadora Ra+ y (iv) aislar el compuesto deseado de la fórmula II.