BRPI0110371B1 - inibidores de fosfatidilinositol 3-cinase delta humana - Google Patents

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Abstract

"inibidores de delta 3-cinase de fosfatidil-inositol humana". são mostrados métodos de inibição de atividade da isoforma de delta 3-cinase de fosfatidilinositol (pi3k<sym>) e métodos de tratamento de doenças, tais como distúrbios de imunidade e inflamação , nos quais a pi3k<sym> tem um papel na função de leucócitos. preferencialmente, os métodos empregam agentes ativos que seletivamente inibem a pi3k<sym>, embora não inibam significativamente a atividade de outras isoformas de pi3k<sym>. são providos compostos que inibem a atividade da pi3k<sym>, incluindo compostos que seletivamente inibem a atividade da pi3k<sym>. também são providos métodos de uso de compostos inibidores de pi3k<sym> para a inibição do crescimento ou da proliferação de células de câncer. assim sendo, a invenção provê métodos de uso de compostos inibidores de pi3k<sym>, para a inibição de processos mediados por pi3k<sym> in vitro e in vivo.

Description

INIBIDORES DE FOSFATIDILINOSITOL 3-CINASE DELTA HUMANA
Referência Cruzada a Pedidos Relacionados Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. 60/199.655, depositado em 25 de abril de 2000 e do pedido provisório U.S. 60/238.057, depositado em 25 de outubro de 2000.
Campo da Invenção A presente invenção se refere, geralmente, a enzimas de 3-cinase de fosfatidilinositol (PI3K) e, mais particularmente, a inibidores de atividade de PI3K e a métodos de uso desses materiais.
Antecedentes da Invenção Uma sinalização de célula através de fosfoinositídeos 3'-fosforilatados foi implicado em uma variedade de processos celulares, por exemplo, transformação maligna, sinalização de fator de crescimento, inflamação e imunidade (veja Rameh e cols., J. Biol Chem, 274: 8347-8350 (1999) para uma revisão). A enzima responsável pela geração desses produtos de sinalização fosforilatados, 3-cinase de fosfatidilinositol (PI 3-cinase; PI3K), originalmente, foi identificada como uma atividade associada a oncoproteínas virais e cinases de tirosina de receptor de fator de crescimento, que fosforilata fosfatidilinositol (PI) e seus derivados fosforilatados no 3'-hidroxila do anel inositol (Panayoutou e cols., Trends Cell Biol 2: 358-60 (1992)).
Os níveis de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3), o produto primário da ativação de PI 3-cinase, aumentam mediante um tratamento de células com uma variedade de agonistas. Acredita-se que a ativação de PI 3-cinase, portanto, esteja envolvida em uma faixa de respostas celulares, incluindo crescimento de células, diferenciação e apoptose (Parker e cols., Current biology, 5: 577-99 (1995); Yao e cols., Science, 267: 2003-05 (1995)). Embora os alvos a jusante de lipídios fosforilatados, gerados seguindo-se à ativação de PI 3-cinase não tenham sido bem caracterizados, uma evidência emergente sugere que as proteínas de domínio de homologia de "pleckstrina" e contendo domínio de "FYVE-FINGER" sejam ativadas, quando de uma ligação a vários lipídios de fosfatidilinositol (Sternmark e cols., J Cell Sei, 112: 4175-83 (1999); Lemmon e cols., Trends Cell Biol, 7: 237-42 (1997)). In vitro, algumas isoformas de cinase C de proteína (PKC) são diretamente ativadas por PIP3, e a cinase de proteína relacionada a PKC, PKB, foi mostrada ser ativada por PI 3-cinase (Burgering e cols., Nature, 376:599-602 (1995)).
Presentemente, a família da enzima de PI 3-cinase foi dividida em três classes, com base em suas especificidades de substrato. As PI3Ks de Classe I podem fosforilatar fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol-4-fosfato, e fosfatidilinositol-4,5-difosfato (PIP2) , fosfatidilinositol-3,4-difosfato, e fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato, respectivamente. As PI3Ks de Classe II fosforilatam PI e fosfatidilinositol-4-fosfato, ao passo que as PI3Ks de Classe III podem fosforilatar apenas PI. A purificação inicial e a clonagem molecular de PI 3-cinase revelaram que ela era um heterodímero consistindo em subunidades p85 a pllO (Otsu e cols., Cell, 65: 91-104 (1991); Hiles e cols., Cell, 70: 419-29 (1992)). Desde então, quatro PI3Ks de Classe I distintas foram identificadas, designadas PI3K α, β, δ e γ, cada um consistindo em uma subunidade catalítica de 110 kDa distinta e uma subunidade reguladora. Mais especificamente, três das subunidades catalíticas, isto é, ρΙΙΟα, ρΙΙΟβ e ρΙΙΟδ, cada uma interagindo com a mesma unidade reguladora, p85; ao passo que pllOy interage com uma subunidade regulamentar distinta, plOl. Como descrito abaixo, os padrões de expressão de cada uma dessas PI3Ks em células e tecidos humanos também são distintos. Embora um baú de informações tenha sido acumulado no passo recente sobre as funções celulares de PI 3-cinases em geral, os papéis tidos pelas isoformas individuais são largamente desconhecidos. A clonagem de pllOa bovina foi descrita. Esta proteína foi identificada como relacionada a proteína Saccharomyces cerevisiae: Vps34p, uma proteína envolvida no processamento de proteína vacuolar. 0 produto pllOa recombinado também foi mostrado associado a p85a, para produzir uma atividade de PI3K em células COS-1 transfectadas. Veja Hiles e cols., Cell, 70, 419-29 (1992). A clonagem de uma segunda isoforma humana pllO, designada ρΙΙΟβ, é descrita em Hu e cols., Mol Cell Biol, 13: 7677-88 (1993). Esta isoforma é dita associada a p85 em células, e como sendo expressa de forma ubiqüista, como ρΙΙΟβ mRNA, foi encontrada em numerosos tecidos humanos e de ratos, bem como em células endoteliais de veia umbilical humana, células T leucêmicas humanas de Jurkat, células de rim embrionais humanas 293, fibroblastos 3T3 de rato, campos elétricos HeLa, e células de carcinoma de bexiga de rato NBT2. Essa expressão ampla sugere que esta isoforma é amplamente importante na sinalização de percursos. A identificação da isoforma ρΙΙΟδ de PI 3-cinase é descrita em Chantry e cols., J Biol Chem, 272: 19236-41 (1997). Foi observado que a isoforma humana ρΙΙΟδ é expressa em uma forma restrita a tecido. Ela é expressa em altos níveis em linfócitos e tecidos linfóides, sugerindo que a proteína podería ter um papel na sinalização mediada por PI 3-cinase no sistema imune. Os detalhes referentes à isoforma ρ220δ também podem ser encontrados nas Patentes U.S. 5.858.753; 5.822.910; e 5.985.589. Veja, também, Vanhaesebroeck e cols., Proc Natl Acad Sei USA, 94: 4330-5 (1997), e publicação internacional WO 97/46688.
Em cada um dos subtipos ΡΙ3Κα, β e δ, a subunidade p85 atua para a localização de PI 3-cinase para a membrana de plasma, pela interação de seu domínio SH2 com resíduos de tirosina fosforilatada (presentes em um contexto de seqüência apropriada) em proteínas alvo (Rameh e cols., Cell, 83: 821-30 (1995)). Duas isoformas de p85 foram identificadas, p85ct, a qual é expressa de forma ubiqüista, e ρ85β, a qual é primariamente encontrada nos tecidos do cérebro e linfóide (Volinia e cols., Oncogene, 7; ' 789-93 (1992)). Uma associação da subunidade p85 com as subunidades catalíticas de PI 3-cinase ρΙΙΟα, β, ou δ parece ser requerida para a atividade catalítica e a estabilidade dessas enzimas. Além disso, a ligação de proteínas Ras também regula para cima a atividade de PI 3-cinase. A clonagem de ρΙΙΟγ revelou ainda uma complexidade adicional na família de PI3K de enzimas (Stoyanov e cols., Science, 269: 660-93 (1995)). A isoforma ρΙΙΟγ está proximamente relacionada a pllOa e ρΙΙΟβ (45 a 48% de identidade no domínio catalítico), mas, como notado, não faz uso de p85 como uma subunidade de alvo. Ao invés disso, a ρΙΙΟγ contém um domínio adicional, denominado um "domínio de homologia de pleckstrina" próximo de sua terminação amino. Este domínio permite uma interação de ρΙΙΟγ com as subunidades βγ de proteínas G heterotrimêricas e esta interação parece regular sua atividade. A subunidade reguladora plOl para PI3Kgama foi clonada, originalmente, em suínos, e o "ortólogo" humano identificado subsequentemente (Krugmann e cols., J Biol Chem, 274·. 172152-8 (1999)). Uma interação entre a região de W-terminal de plOl com a região de N-terminal de pllOy parece ser crítica para a ativação de Ρϊ3Κγ através de GBy mencionada acima.
Um polipeptídio de PI3K ativo de forma constitutiva é descrito na publicação internacional WO 96/25488. Esta publicação mostra a preparação de uma proteína de fusão quimérica, na qual um fragmento de resíduo 102 de p85 conhecido como região inter-SH2 (iSH2) é fundido através de uma região de ligante ao término N de murino pllO. 0 domínio iSH2 de p85, aparentemente, é capaz de ativar a atividade de PI3K de uma maneira comparável à p85 intacta (Klippel e cols., Mol Cell Biol, 14: 2675-85 (1994)).
Assim, as PI 3-cinases podem ser definidas por sua identidade de aminoácido ou por sua atividade. Membros adicionais desta família de gene de crescimento incluem cinases de lipídio e proteína, incluindo Vps34 TOR1 e TOR2 de Saccharomyces cerevisiae (e seus homólogos mamíferos, tais como FRAP e mTOR), o produto de gene de telangiectasia ataxia (ATR) e a subunidade catalítica de cinase de proteína dependente de DNA (DNA-PK). Veja, geralmente, Hunter, Cell, 83:1-4 (1995). A PI 3-cinase parece estar envolvida em vários dos aspectos de ativação de leucócito. Uma atividade de PI 3-cinase associada a p85 foi mostrada se associar fisicamente ao domínio citoplásmico de CD28, a qual é uma molécula co-estimuladora importante para a ativação de células T, em resposta a um antígeno (Pages e cols., Nature, 369: 327-29 (1994); Rudd, Immunity, 4: 527-34 (1996)). A ativação de células T através de CD28 diminui o limite para a ativação por antígeno, e aumenta a magnitude e a duração de resposta proliferativa. Esses efeitos são ligados a aumentos na transcrição de vários genes, incluindo interleucina-2 (IL2), um fator de crescimento de célula T importante (Fraser e cols., Science, 251: 313-16 (1991)). Uma mutação de Cd28, de modo que ela não possa mais interagir com a PI 3-cinase leva a uma falha para iniciar a produção de IL2, sugerindo um papel crítico para a PI 3-cinase na ativação de célula T.
Inibidores específicos contra membros individuais de uma família de enzimas proveem ferramentas inestimáveis para a decif ração de funções de cada enzima. Dois compostos, LY294002 e "wortmannin", foram amplamente usados como inibidores de PI 3-cinase. Esses compostos, entretanto, são inibidores de PI3K não específicos, uma vez que eles não distinguem dentre os quatro membros de PI 3-cinases de Classe I. Por exemplo, os valores de IC50 de wortmannin contra cada uma das várias classes de PI 3-cinase de Classe I estão na faixa de 1 a 10 nM. De modo similar, os valores de IC50 para LY294002 contra cada uma dessas PI 3-cinases é de cerca de 1 μΜ (Fruman e cols., Ann Rev Biochem, 67·. 481:507 (1998)). Assim, a utilidade desses compostos no estudo dos papéis de PI 3-cinases de Classe I individuais é limitado.
Com base nos estudos usando wortmannin, há uma evidência que a função de PI 3-cinase também é requerida para alguns aspectos de sinalização de leucócito através de receptores acoplados de proteína G (Thelen e cols., Proc Natl Acad Sei USA, 91:4960-64 (1994)). Mais ainda, foi mostrado que o wortmannin e o LY294002 bloqueiam a migração de neutrófilo e a liberação de superóxido. Entretanto, à medida que esses compostos não distinguem dentre as várias isoformas de PI3K, permanece obscuro qual isoforma de PI3K em particular ou isoformas está (estão) envolvida(s) nesses fenômenos.
Tendo em vista as considerações acima, é claro que um conhecimento existente está faltando em relação a aspectos estruturais e funcionais das enzimas de PI 3-cinase, incluindo localização subcelular, estados de ativação, afinidades de substrato, e similares. Mais ainda, as funções que essas enzimas executam em ambos os tecidos normais e doentes permanecem por serem elucidadas. Em particular, a função de ΡΙ3Κδ em leucócitos não foi previamente caracterizada, e um conhecimento concernente a sua função na fisiologia humana permanece limitado. A co-expressão nesses tecidos de outras isoformas de PI3K, portanto, até agora, frustrou os esforços de se segregarem as atividades de cada enzima. Mais ainda, uma separação das atividades das várias isozimas de PI3K não pode ser possível sem uma identificação de inibidores que demonstram características de inibição seletiva. De fato, os Requerentes, presentemente, não estão cientes de que tais inibidores seletivos, ou melhor, específicos de isozimas de PI3K tenham sido demonstrados.
Assim, existe uma necessidade na técnica de uma caracterização estrutural adicional do polipeptídio ΡΙ3Κδ. Também existe uma necessidade de uma caracterização funcional de PI3KS. Mais ainda, nossa compreensão de ΡΙ3Κδ requer ainda uma elaboração das interações estruturais de ρΙΙΟδ, ambas com sua subunidade reguladora e com outras proteínas na célula. Também permanece uma necessidade de inibidores seletivos ou específicos de isozimas de PI3K, de modo que as funções de cada isozima possam ser mais bem caracterizadas. Em particular, inibidores seletivos ou específicos de ΡΙ3Κδ são desejáveis, para a exploração do papel desta isozima e para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos para a modulação da atividade da isozima.
Um aspecto da presente invenção é fornecer compostos que possam inibir a atividade biológica de PI3KÔ humana. Um outro aspecto da invenção é fornecer compostos que possam inibir a PI 3-cinase seletivamente, enquanto se tem uma potência inibidora relativamente baixa contra as outras isoformas de PI3K. Um outro aspecto da invenção é fornecer métodos de caracterização da função humana de PI3KÔ. Um outro aspecto da invenção é fornecer métodos de modulação seletiva da atividade de ΡΙ3Κδ humana e, desse modo, promover um tratamento médico de doenças mediadas por uma disfunção de PI3KÔ. Outros aspectos e vantagens da invenção serão prontamente evidentes para o técnico tendo um conhecimento comum na técnica.
Sumário da Invenção Agora, foi descoberto que estes e outros aspectos podem ser obtidos pela presente invenção, a qual, em um aspecto, é um método para interrupção da função de leucócito, compreendendo contatar os leucócitos com um composto que seletivamente iniba a atividade de δ 3-cinase l de fosfatidilinositol (ΡΙ3Κδ) nos leucócitos. De acordo com o método, os leucócitos podem compreender células selecionadas a partir do grupo que consiste em neutrófilos, linfócitos B, linfócitos T e basófilos.
Por exemplo, nos casos em que os leucócitos compreendem neutrófilos, o método pode compreender a disrupção de pelo menos uma função de neutrófilo selecionada a partir do grupo que consiste em liberação de superóxido estimulada, exocitose estimulada e migração quimiotãtica. Preferencialmente, o método não interrompe substancialmente a fagocitose bacteriana ou a morte bacteriana pelos neutrófilos. Nos casos em que os leucócitos compreendem linfócitos B, o método pode compreender a disrupção da proliferação dos linfócitos B ou a produção de anticorpo pelos linfócitos B. Nos casos em que os leucócitos compreendem linfócitos T, o método pode compreender a disrupção da proliferação dos linfócitos T. Nos casos em que os leucócitos compreendem basófilos, o método pode compreender a disrupção da liberação de histamina pelos basófilos.
Nos métodos da invenção em que um inibidor de PI3KÔ seletivo é empregado, é preferido que o composto seja pelo menos cerca de 10 vezes seletivo para a inibição de PI3K6 em relação a outros tipos de isoformas de PI3K de Tipo I em um ensaio baseado em célula. Mais preferencialmente, o composto é pelo menos cerca de 20 vezes seletivo para a inibição de ΡΙ3Κδ em relação a outros tipos de isoformas de PI3K de Tipo I em um ensaio baseado em célula. Ainda mais preferencialmente, o composto é pelo menos cerca de 50 vezes seletivo para a inibição de ΡΙ3Κδ em relação a outros tipos de isoformas de PI3K de Tipo I em um ensaio bioquímico.
Os compostos seletivos preferidos úteis de acordo com os métodos incluem compostos tendo a estrutura (I): onde A é um sistema de anel monocíclico ou bicíclico opcionalmente substituído, contendo pelo menos dois átomos de nitrogênio, e pelo menos um anel do sistema é aromático; X é selecionado a partir do grupo que consiste em CHRb, CH2CHRb, e CH=C(Rb); Y é selecionado a partir do grupo que consiste em nulo, S, SO, S02, NH, 0, C(=0), 0C(=0), C(=0)0, e NHC(=0)CH2S ; R1 e R2, independentemente, são selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, Ci-6 alquila, arila, heteroarila, halogênio, NHC (=0) Ci-3alquilenoN(Ra) 2, N02, 0Ra, 0CF3, N (Ra) 2, CN, 0C (=0) Ra, C(=0)Ra, C(=0)0Ra, arÍ10Rb, Het, NRaC (=0) Ci-3alquilenoC (=0) 0Ra, arilOCi-3alquileno-N(Ra) 2, Ci-4alquilenoC (=0) 0Ra, OC^alquilenoC (=0) 0Ra, Ci-4alquilenoCi-4alquilenoC (=0) 0Ra, C (=0) -NRaS02Ra, C^alquilenoN (Ra) 2, C2. 6alquilenoN(Ra)2, C (=0) NRaCi_4alquilenoORa, C(=0)NRaCi_ 4alquilenoHet, OC2.4alquilenoN (Ra) 2, OCi- 4alquilenoCH (0Rb) CH2N (Ra) 2, OCi-4alquilenoHet, 0C2_ 4alquilenoORa, (XV4alquileno-NRaC (=0) 0Ra, NRaC2- 4alquÍlenoN(Ra)2, NRaC(=0)Ra, NRaC (=0) N (Ra) 2, N(S02Ci-4alquila)2, NRa (S02Ci_4alquila) , S02N(Ra)2, 0S02CF3, Ci- 3alquilenoarila, Ci_4alquilenoHet, Ci-6alquilenoORb, Ci_ 3alquilenoN(Ra) 2, C(=0)N(Ra)2, NHC (=0) Ci-3alquilenoarila, C3. acicloalquila, C3_aheterocicloalquila, arilOCi_3alquilenoC3-3heterocicloalquila, arilOC (=0) Rb, NHC (=0) C!_3alquilenoC3-aheterocicloalquila, NHC (=0) Ci_3alquilenoHet, 0Ci_ 4alquilenoOCi-4alquilenoC (=0) 0Rb, C (=0) Ci-4alquilenoHet e NHC (=0) haloCi_6alquila;
Ou R1 e R2 são tomados em conjunto para formarem um componente de cadeia de alquileno ou alquenileno de 3 ou 4 elementos de um anel de 5 ou 6 elementos, opcionalmente contendo pelo menos um heteroátomo; 0 R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio opcionalmente substituído, Ci-Salquila, C3_ acicloalquila, C3-8heterocicloalquila, Ci- 4alquilenocicloalquila, C2_6alquenila, C2-3alquilenoarila, arilCi-3alquila, C(=0)Ra, arila, heteroarila, C(=0)0Ra, C (=0) N (Ra) 2, C (=S) N (Ra) 2, S02Ra, S02N(Ra)2, S(=0)Ra, S (=0) N (Ra) 2, C (=0)NRaC1_4alquilenoORa/ C(=0)NRaCi_ 4alquilenoHet, C (=0) Ci-4alquilenoarila, C(=0)Ci- 4alquilenoheteroarila, Ci-4alquilenoarila substituído com um ou mais dentre S02N(Ra)2, N(Ra)2, C(=0)ORa, NRaS02CF3, CN, N02, C (=0) Ra, 0Ra, Ci-4alquilenoN (Ra) 2, e 0Ci.4alquilenoN (Ra) 2, C1-4alquilenoheteroarila, Ci-4alquilenoHet, Ci- 4alquilenoC (=0) Ci_4alquilenoarila, Ci_4alquilenoC (=0) C4_ 4alquilenoheteroarila, Ci-4alquilenoC (=0) Het, Ci- 4alquilenoC (=0) N (Ra) 2, Cx^alquilenoOR3, Ci_ 4alquilenoNRaC (=0) Ra, Ci-4alquilenoOCi-4alquilenoORa, Ci-4alquilenoN(Ra) 2, Ci-4alquilenoC (=0) 0Ra, e Ci-4alquilenoOCi-4alquilenoC(=0)0Ra; 0 Ra é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, Ci-galquila, C3.8cicloalquila, C3_ eheterocicloalquila, Ci-3alquilenoN (Ra) 2( arila, arilCi-3alquila, Ci_3alquilenoarila, heteroarila, heteroarilCi-3alquila, e Ci_3alquilenoheteroarila;
Ou dois grupos Ra são tomados em conjunto para a formação de um anel de 5 ou 6 elementos, opcionalmente contendo pelo menos um heteroátomo; 0 Rb é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, Ci-6alquila, arila, heteroarila, arilCi-3alquila, heteroarilCi_3alquila, C1_3alquilenoarila e Ci_ 3alquilenoheteroarila;
Het é um anel heterocí clico de 5 ou 6 elementos, saturado ou parcial ou completamente insaturado, contendo pelo menos um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em oxigênio, nitrogênio e enxofre, e opcionalmente substituído com Ci-4alquila ou C(=0)0Ra; E sais aceitáveis em termos farmacêuticos e solvatos (por exemplo, hidratos) dos mesmos, Onde o composto tem pelo menos cerca de 10 vezes a inibição seletiva para ΡΙ3Κδ em relação a outras isoformas de PI3K Tipo I em um ensaio baseado em célula.
Em uma outra montagem, a invenção é um método para o tratamento de uma condição médica mediada por neutrófilos, compreendendo a administração a um mamífero com necessidade da mesma de uma quantidade efetiva de um composto que inibe, seletivamente, a atividade de delta 3-cinase de fosfatidilinositol (PI3KÔ) nos neutrófilos. As condições médias de exemplo, que podem ser tratadas de acordo com o método incluem aquelas condições caracterizadas por uma função de neutrófilo indesejável selecionada a partir do grupo que consiste em liberação de superóxido estimulada, exocitose estimulada e migração quimiotática. Preferencialmente, de acordo com o método, a atividade fagocítica ou a morte bacteriana pelos neutrófilos é substancialmente não inibida.
Em uma outra montagem, a invenção é um método para a disrupção de uma função de osteoclastos, compreendendo contatar os osteoclastos com um composto que inibe, seletivamente, a atividade de delta 3-cinase de fosfatidilinositol (ΡΙ3Κδ) nos osteoclastos. De acordo com o método, o composto pode compreender uma porção que, preferencialmente, se ligue ao osso.
Em uma outra montagem, a invenção é um método de melhoria de um distúrbio de ressorção do osso em um animal com necessidade da mesma, compreendendo a administração ao animal de uma quantidade efetiva de um composto que iniba a atividade de delta 3-cinase de fosfatidilinositol (ΡΙ3Κδ) em osteoclastos do animal. Um distúrbio de ressorção de osso passível de tratamento de acordo com o método é osteoporose.
Em uma outra montagem, a invenção é um método para inibição do crescimento ou da proliferação de células cancerosas de origem hematopoiética, compreendendo contatar as células cancerosas com um composto que iniba seletivamente a atividade de delta 3-cinase de fosfatidilinositol (PI3KÔ) nas células cancerosas. 0 método pode ser vantajoso na inibição do crescimento ou da proliferação de cânceres selecionados a partir do grupo que consiste em linfornas, mielomas múltiplos e leucemias.
Em uma outra montagem, a invenção é um método de inibição da atividade de cinase de um polipeptídio de delta 3-cinase de fosfatidilinositol (PI3KÔ) , compreendendo contatar o polipeptídio de ΡΙ3Κδ com um composto que tem a estrutura genérica (I).
Os compostos preferidos úteis de acordo com o método incluem compostos selecionados a partir do grupo que consiste em: onde Y é selecionado a partir do grupo que consiste em nulo, S e NH; 0 R4 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, N02, OH, OCH3, CH3 e CF3; 0 R5 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OCH3 e halogênio;
Ou R4 e R5 juntamente com C-S e C-7 do sistema de anel de quinazolina definem um anel aromático de 5 ou 6 elementos, opcionalmente contendo um ou mais átomos de 0, N ou S; 0 R6 é selecionado a partir do grupo que consiste em Ci-C6alquila, fenila, halofenila, alcoxifenila, alquilfenila, bifenila, benzila, piridinila, 4-metilpiperazinila, C(=0)-0C2H5 e morfolinila; 0 Rd, independentemente, é selecionado a partir do grupo que consiste em NH2, halogênio, Ci-3alquila, S (Ci_ 3alquila) , OH, NH (Ci-3alquila) , N(Ci-3alquila) 2, NH (Ci. 3alquilenofenila) e q é 1 ou 2, Desde que pelo menos um dentre R4 e R5 seja diferente de H, quando R6 for fenila ou 2-clorofenila.
Mais preferencialmente, o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em: onde Y é selecionado a partir do grupo que consiste em nulo, S e NH; 0 R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, OH, OCH3, CH3 e CF3; 0 R8 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OCH3 e halogênio;
Ou R7 e R8 juntamente com C-6 e C-7 do sistema de anel de quinazolina definem um anel aromático de 5 ou 6 elementos, opcionalmente contendo um ou mais átomos de 0, N ou S; 0 R9 é selecionado a partir do grupo que consiste em Ci-C6 alquila, fenila, halofenila, alquilfenila, bifenila, benzila, piridinila, 4-metilpiperazinila, C(=0)-0C2H5 e morfolinila; 0 Rd, independentemente, é selecionado a partir do grupo que consiste em NH2, halogênio, Ci_3 alquila, S (Ci_3 alquila), OH, NH(Ci-3 alquila), N(Ci-3 alquila) 2, NH(Ci_3 alquilenofenila); q é 1 ou 2, Desde que pelo menos um dentre R7 e R8 seja diferente de grupos β-halo ou 6,7-dimetóxi, e que R9 seja diferente de 4-clorofenila.
Em uma outra montagem, a invenção é um método para a disrupção da função de leucócito, compreendendo contatar os leucócitos com um composto tendo uma estrutura geral (I).
Em uma outra montagem, a invenção é uma classe de compostos que foram observados inibindo a atividade de ΡΙ3Κδ em ensaios bioquímicos e baseados em célula, e espera-se que exibam um benefício terapêutico em condições médicas nas quais a atividade de ΡΙ3Κδ é excessiva ou indesejada. Assim, a invenção fornece uma classe de compostos tendo a estrutura (II).
Preferencialmente, os compostos têm uma estrutura geral (IV): onde Y é selecionado a partir do grupo que consiste em nulo, S e NH; 0 R10 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, OH, OCH3, CH3 e CF3; 0 R1* é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OCH3 e halogênio;
Ou R10 e R11 em conjunto com C-β e C-7 do sistema de anel de quinazolina definem um anel aromático de 5 ou 6 membros contendo um ou mais átomos de 0, N ou S; 0 R12 é selecionado a partir do grupo que consiste em Ci-Salquila, fenila, halofenila, alquilfenila, bifenila, benzila, piridinila, 4-metilpiperazinila, C(=0)C2H5 e morfolinila; 0 Rd, independentemente, é selecionado a partir do grupo que consiste em NH2, halogênio Ci_3alquila, S (Ci-3alquila) , OH, NH(Ci-3alquila) , N(Ci-3alquila) , NH(Ci. 3alquilenofenila), e q é 1 ou 2, Desde que: (a) pelo menos um dentre R10 e R11 seja diferente de grupos 6-halo ou 6,7-dimetóxi; (b) o R12 seja diferente de 4-clorofenila; e (c) pelo menos um dentre R10 e R11 seja diferente de H, quando R12 for fenila ou 2-clorofenila e X for S.
Esses e outros aspectos e vantagens da presente invenção serão apreciados a partir da descrição detalhada e dos exemplos que são estabelecidos aqui. A descrição detalhada e os exemplos são fornecidos para melhorarem a compreensão da invenção, mas não são pretendidos para limitarem o escopo da invenção.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra o efeito de um inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ da invenção na atividade de três isoformas de PI3K. A Figura 2 mostra o efeito de um inibidor seletivo de PI3KÔ sobre a geração de superóxido por neutrófilos humanos na presença de TNF ou IgG. A Figura 3 mostra o efeito de um inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ sobre a geração de superóxido por neutrófilos humanos na presença de TNF ou fMLP. A Figura 4 mostra o efeito de um inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ sobre a exocitose de elastase na presença de fMLP por neutrófilos humanos. A Figura 5 mostra o efeito de um inibidor seletivo de PI3KÔ sobre a quimiotaxia induzida por fMLP por neutrófilos humanos. A Figura 6 mostra que um inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ não afeta a fagocitose e a morte de S. aureaus por neutrófilos. A Figura 7 mostra o efeito de um inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ sobre a proliferação e a produção de anticorpos por linfócitos B humanos. A Figura 8 mostra o efeito de um inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ sobre a proliferação de linfócito B esplênico de rato estimulado por anti-IgM. A Figura 9 mostra o efeito de um inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ sobre a exocitose de elastase em um modelo de animal. Descrição Detalhada das Montagens Preferidas A invenção fornece compostos que seletivamente inibem a atividade de ΡΙ3Κδ. A invenção ainda fornece métodos de inibição da atividade de ΡΙ3Κδ, incluindo métodos de modulação seletiva da atividade da isozima de ΡΙ3Κδ em células, especialmente em leucócitos, osteoclastos e células de câncer. Os métodos incluem aplicações in vitro, in vivo e ex vivo. São de benefício em particular os métodos de modulação seletiva da atividade de ΡΙ3Κδ na regulagem clínica, de modo a diminuir a doença ou distúrbios mediados pela atividade de ΡΙ3Κδ. Assim, o tratamento de doenças ou de distúrbios caracterizados por uma atividade de ΡΙ3Κδ excessiva ou imprópria pode ser feito através do uso de moduladores seletivos de ΡΙ3Κδ, de acordo com a invenção.
Outros métodos da invenção incluem permitir a caracterização adicional do papel fisiológico da isozima. Mais ainda, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo inibidores seletivos de ΡΙ3Κδ. Também são fornecidos artigos de fabricação compreendendo um composto de inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ (ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto) e instruções para uso do composto. Os detalhes dessas e outras montagens úteis da invenção são descritos, agora.
Os métodos descritos aqui se beneficiam do uso de compostos que inibem, seletivamente, e, de forma preferencial e específica, inibem, a atividade de PI3KÔ em células, incluindo células in vitro, in vivo ou ex vivo. As células úteis nos métodos incluem aquelas que expressam ΡΙ3Κδ endógena, onde endógenc indica que as células expressam uma introdução recombinante ausente de ΡΙ3Κδ nas células de um ou mais polinucleotídeos codificando um polipeptídio de PI3KS ou um fragmento biologicamente ativo. Os métodos também envolvem o uso de células que expressam ΡΙ3Κδ exógeno, onde um ou mais polinucleotídeos codificando ΡΙ3Κδ ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo foram introduzidos na célula, usando-se procedimentos recombinantes.
De vantagem em particular, as células podem ser in vivo, isto é, em um indivíduo vivo, por exemplo, um animal ou um ser humano, onde um inibidor de ΡΙ3Κδ pode ser usado como um terapêutico para inibir a atividade de PI3KÔ no indivíduo. Alternativamente, as células podem ser isoladas como células discretas ou em um tecido, para métodos ex vivo ou in vitro. Os métodos in vitro também envolvidos pela invenção podem compreender a etapa de contatar uma enzima de ΡΙ3Κδ ou um fragmento biologicamente ativo da mesma com um composto inibidor da invenção. A enzima de ΡΙ3Κδ pode incluir uma enzima purificada e isolada, onde a enzima é isolada a partir de uma fonte natural (por exemplo, células ou tecidos que normalmente expressam uma modificação ausente de polipeptídio de ΡΙ3Κδ por tecnologia recombinante) ou isolada a partir de células modificadas por técnicas recombinantes, para expressão de uma enzima exógena. 0 termo "inibidor seletivo de PI3KÔ" como usado aqui se refere a um composto que inibe a isozima de ΡΙ3Κδ mais efetivamente do que outras isozimas da família de PI3K. Um composto "inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ" é compreendido como sendo mais seletivo para ΡΙ3Κδ do que compostos designados, de forma convencional ou genética, inibidores de PI3K, por exemplo, wortmannin ou LY294002. Concomitantemente, wortmannin e LY294002 são julgados "inibidores de PI3K não seletivos". Compostos de qualquer tipo que seletivamente regulem de forma negativa a expressão ou a atividade de PI3KÔ podem ser usados como inibidores seletivos de ΡΙ3Κδ nos métodos da invenção. Mais ainda, compostos de qualquer tipo que seletivamente regulem de forma negativa a expressão ou a atividade e que possuam propriedades farmacológicas aceitáveis podem ser usados como inibidores seletivos de ΡΙ3Κδ nos métodos terapêuticos da invenção.
As eficácias relativas de compostos como inibidores de uma atividade de enzima (ou uma outra atividade biológica) podem ser estabelecidos determinando-se as concentrações nas quais cada composto inibe a atividade até uma extensão pré-definida e, então, comparando-se os resultados. Tipicamente, a determinação preferida é a concentração que inibe 50% da atividade em um ensaio bioquímico, isto é, a concentração de 50% de inibição ou "IC5o". Determinações de IC50 podem ser realizadas usando-se técnicas convencionais conhecidas na arte. Em geral, uma IC50 pode ser determinada pela medição da atividade de uma dada enzima na presença de uma faixa de concentrações do inibidor sob estudo. Os valores obtidos experimentalmente de atividade de enzima, então, são plotados contra as concentrações de inibidor usadas. A concentração do inibidor que mostra 50% de atividade de enzima (se comparada com a atividade na ausência de qualquer inibidor) é tomada como o valor de IC50. De forma análoga, outras concentrações inibidoras podem ser definidas, através de determinações apropriadas de atividade. Por exemplo, em algumas regulagens, pode ser desejável estabelecer uma concentração 90% inibidora, isto é, IC90, etc.
Assim sendo, um "inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ", alternativamente, pode ser compreendido como se referindo a um composto que apresenta uma concentração 50% inibidora (IC50) em relação a PI3KÔ, que é pelo menos 10 vezes, preferencialmente pelo menos 20 vezes e, mais preferencialmente, pelo menos 30 vezes mais baixa do que o valor de IC50 em relação a todos ou qualquer um dos outros membros da família de PI3K de Classe I. O termo "inibidor de ΡΙ3Κδ específico" pode ser compreendido como se referindo a um composto inibidor seletivo de PI3KÔ que apresenta uma IC50 em relação a ΡΙ3Κδ que é pelo menos 50 vezes, preferencialmente pelo menos 100 vezes, mais preferencialmente pelo menos 200 vezes e, ainda mais preferencialmente pelo menos 500 vezes menor do que a IC50 em relação a todos ou qualquer um dos outros membros da família de PI3K de Classe I. / Dentre outras coisas, a invenção fornece métodos de inibição de função de leucõcito. Mais particularmente, a invenção fornece métodos de inibição ou de supressão de funções de neutrófilos e linfócitos T e B. Em relação aos neutrófilos, inesperadamente, foi descoberto que a inibição de atividade de ΡΙ3Κδ inibe as funções de neutrófilos. Por exemplo, foi observado que os compostos da invenção eliciam a inibição de funções clássicas de neutrófilo, tais como ligação estimulada de superóxido, exocitose estimulada e migração quimiotática. Entretanto, foi observado, ainda, que o método da invenção permite a supressão de certas funções de neutrófilos, enquanto não afeta substancialmente outras funções dessas células. Por exemplo, foi observado que a fagocitose de bactérias por neutrófilos não é substancialmente inibida pelos compostos de inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ da invenção.
Assim, a invenção inclui métodos para inibição de funções de neutrófilo, sem substancialmente inibir a fagocitose de bactérias. As funções de neutrófilo adequadas para inibição de acordo com o método incluem qualquer função que seja mediada por atividade expressão de ΡΙ3Κδ. Essas funções incluem, sem limitação, liberação estimulada de superóxido, exocitose estimulada ou desgranulação, migração quimiotática, adesão a endotélio vascular (por exemplo, acorrentamento / rolamento de neutrófilos, disparo de atividade de neutrófilo e/ou engate de neutrófilos ao endotélio), diapedese transmural ou emigração através do endotélio até tecidos periféricos. Em geral, essas funções podem ser coletivamente denominadas "funções inflamatórias", uma vez que elas, tipicamente, estão relacionadas â resposta de neutrófilos a uma inflamação. As funções inflamatórias de neutrófilos podem ser distinguidas das funções de matança bacteriana exibidas por essas células, por exemplo, fagocitose e morte de bactérias. Assim sendo, a invenção ainda inclui métodos de tratamento de estados de doença, nos quais uma ou mais das funções inflamatórias dos neutrófilos estão anormais ou são indesejáveis.
Ainda, foi estabelecido, através da invenção, que a ΡΙ3Κδ tem um papel na proliferação estimulada de linfócitos, incluindo células B e células T. Mais ainda, a ΡΙ3Κδ parece ter um papel na secreção estimulada de anticorpos por células B. Os compostos de inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ da invenção foram empregados para se estabelecer que estes fenômenos podem ser ab-rogados pela inibição de ΡΙ3Κδ. Assim, a invenção inclui métodos de inibição de proliferação de linfócitos, e métodos de inibição de produção de anticorpos por linfócitos B. Outros métodos permitidos pela invenção incluem métodos de tratamento de estados de doença, nos quais uma ou mais dessas funções de linfócitos são anormais ou indesejáveis.
Foi determinado que a atividade de ΡΙ3Κδ pode ser inibida de forma seletiva ou específica, para facilitar o tratamento de uma doença mediada por ΡΙ3Κδ, enquanto se reduzem ou eliminam as complicações que, tipicamente, estão associadas a uma inibição concomitante da atividade de outras PI 3-cinases de Classe I. Para ilustrar esta montagem, os métodos da invenção podem ser praticados usando-se membros de uma classe de compostos que foram descobertos apresentando uma inibição seletiva de ΡΙ3Κδ em relação a outras isoformas de PI3K.
Os métodos desta invenção podem ser praticados usando-se compostos que têm a estrutura geral (III). Os métodos preferidos empregam compostos que foram determinados empiricamente como apresentando uma inibição seletiva de PI3KÔ de pelo menos 10 vezes em relação a outras isoformas de PI3K. Por exemplo, os métodos podem ser praticados usando-se os seguintes compostos: 3- (2-isopropilfenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-3-(2-fluorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-fluorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-metoxifenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2,6-diclorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-6-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(3-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-7-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-morfolin-4-il-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato; 8-cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilTnetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-6,7-difluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-metoxifenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 6-cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(3-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-piridin-4-il-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-trifluorometil-3H-quinazolin-4-ona; 3-benzil-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(4-metilpiperazin-l-il)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato; 3-(2-clorofenil)-6-hidróxi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilrnetil)-3H-quinazolin-4-ona; éster de etila de ácido [5-fluoro-4-oxo-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-quinazolin-3-il]acético; 3-(2,4-dimetoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-bifenil-2-il-5-cloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-isopropilfenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4 -ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-bifenil-2-il-5-cloro-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-3-(2-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ílmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-fluorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2- (6-aminopurin-9-ilmet.il) -8-cloro-3- (2-clorofenil) -3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4 -ona; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-5-fluoro-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-quinazolin- 4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-butil-3H-quinazolin-4-ona; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-3-morfolin-4-il-3H-quinazolin-4-ona; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil) -3-(2-clorofenil) -7-fluoro-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-fenil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-isopropilfenil)-3H-quinazolin-4-ona; e 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-o-tolil-3H-quinazolin- 4-ona.
Ainda, foi determinado que os métodos da invenção podem ser vantajosamente praticados usando-se membros de uma classe de compostos que apresentam atividade inibidora de ΡΙ3Κδ, desse modo facilitando inibições de atividade de ΡΙ3Κδ em doenças mediadas dessa forma. Por exemplo, nesta montagem, os métodos da invenção podem ser praticados usando-se compostos tendo a estrutura geral (I). onde A é um sistema de anel monocíclico ou bicíclico opcionalmente substituído, contendo pelo menos dois átomos de nitrogênio, e pelo menos um anel do sistema é aromático; X é selecionado a partir do grupo que consiste em CHRb, CH2CHRb, e CH=C(Rb); Y é selecionado a partir do grupo que consiste em nulo, S, SO, S02, NH, 0, C(=0), 0C(=0), C(=0)0, e NHC(=0)CH2S; R1 e R2, independentemente, são selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, Ci-6 alquila, arila, heteroarila, halogênio, NHC (=0) Ci-3alquilenoN(Ra) 2, N02, 0Ra, OCF3, N(Ra) 2, CN, OC (=0) Ra, C{=O)0Ra, arilORb, Het, NRaC (=0) Cx-salquilenoC (=0) 0Ra, arilOCi-3alquileno-N(Ra) 2, C3- 4alquilenoC (=0) 0Ra, 0Ci-4alquilenoC (=0) 0Ra, Ci-4alquilenoCi-4alquilenoC (=0)0Ra, C (=0)-NRaS02Ra, Ci_4alquilenoN (Ra) 2, C2- 6alquilenoN (Ra) 2, C (=0) NRaCi_4alquilenoORa, C(=0)NRaCi_ 4alquilenoHet, 0C2-4alquilenoN(Ra)2, OCi- 4alquilenoCH (0Rb) CH2N (Ra) 2, OCi-4alquilenoHet, 0C2- 4alquilenoORa, OC2.4alquileno-NRaC (=0) 0Ra, NRaC2. 4alquilenoN (Ra) 2, NRaC(=0)Ra, NRaC (=0) N (Ra) 2, N(S02Ci_ 4alquila) 2, NRa(S02Ci-4alquila) , S02N{Ra)2, 0S02CF3, Cx- 3alquilenoarila, Ci_4alquilenoHet, Cx-6alquilenoORb, Cx. 3alquilenoN(Ra) 2, C(=0)N(Ra)2, NHC (=0) Cx-3alquilenoarila, C3_ scicloalquila, C3-8heterocÍcloalquila( arilOCx-3alquilenoC3_ 8heterocicloalquila, arilOC (=0) Rb, NHC (=0) Cx-3alquilenoC3-8heterocicloalquila, NHC (=0) Cx-3alquilenoHet, OCx- 4alquilenoOCx-4alquilenoC (=0) 0Rb, C (=0) Cx-4alquilenoHet e NHC (=0) haloCx_6alquila;
Ou R1 e R2 são tomados em conjunto para formarem um componente de cadeia de alquileno ou alquenileno de 3 ou 4 elementos de um anel de 5 ou 6 elementos, opcionalmente contendo pelo menos um heteroátomo; 0 R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio opcionalmente substituído, Cx-6alquila, C3. ecicloalquila, C3.aheterocicloalquila, Cx- 4alquilenocicloalquila, C2-£alquenila, C2-3alquilenoarila, arilCx-3alquila, C(=0)Ra, arila, heteroarila, C(=0)0Ra, C (=0) N (Ra) 2, C (=S)N (Ra) 2, S02Ra, S02N(Ra)2, S(=0)Ra, S (=0) N (Ra) 2, C(=0)NRaCx-4alquileno0Ra, C(=0)NRaCi- 4alquilenoHet, C (=0) Cx-4alquilenoarila, C(=0)Cx_ 4alquilenoheteroarila, Ci_4alquilenoarila substituído com um ou mais dentre S02N(Ra)2í N(Ra)2, C(=0)0Ra, NRaS02CF3, CN, N02, C(=0)Ra, 0Ra, Ci-4alquilenoN (Ra) 2, e OCx-4alquilenoN (Ra) 2, Cx-4alquilenoheteroarila, Cx-4alquilenoHet, Cj.. 4alquilenoC (=0) Cx-4alquilenoarila, Ci_4alquilenoC (=0) Cx- 4alquilenoheteroarila, Cx-4alquilenoC (=0) Het, Cx_ 4alquilenoC (=0)N(Ra) 2, Cx_4alquilenoORa, Cx. 4alquilenoNRaC (=0) Ra, Ci-4alquilenoOCa_4alquilenoORa, Ci-4alquilenoN (Ra) 2, Ci-4alquilenoC (=0) 0Ra, e Ci_4alquilenoOCi-4alquilenoC(=0)0Ra; 0 Ra é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, Ci-6alquila, C3_scicloalquila, C3. sheterocicloalquila, Ci-3alquilenoN (Ra) 2, arila, arilCi-3alquila, Ci-3alquilenoarila, heteroarila, heteroarilCi-3alquila, e Ci-3alquilenoheteroarila;
Ou dois grupos Ra são tomados em conjunto para a formação de um anel de 5 ou 6 elementos, opcionalmente contendo pelo menos um heteroátomo; 0 Rb é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, Ci-6alquila, arila, heteroarila, arilCi_3alquila, heteroarilCi-3alquila, Ci-3alquilenoarila e Ci- 3alquilenoheteroarila;
Het é um anel heterocíclico de 5 ou 6 elementos, saturado ou parcial ou completamente insaturado, contendo pelo menos um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em oxigênio, nitrogênio e enxofre, e opcionalmente substituído com Ci-4alquila ou C(=0)0Ra; E sais aceitáveis em termos farmacêuticos e solvatos (por exemplo, hidratos) dos mesmos.
Por exemplo, os métodos da invenção podem empregar compostos que possuam uma atividade inibidora de ΡΙ3Κδ, como se segue: 3-(2-isopropilfenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-3-(2-fluorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3- 3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-fluorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-metoxifenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2,6-diclorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-6-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-7-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-morfolin-4-il-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato; 8-cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-6,7-difluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(3-metoxifenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 6-cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(3-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-piridin-4-il-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-8-trifluorometil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-benzil-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(4-metilpiperazin-l-il)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato; 3-(2-clorofenil)-6-hidróxi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; éster de etila de ácido [5-fluoro-4-oxo-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-quinazolin-3-il]acético; 3- bifenil-2-il-5-cloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-3-(2-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-isopropanilfenil)5-metil-3H-quinazolin-4-ona 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin- 4- ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-bifenil-2-il-5-cloro-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-fluorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-8-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-5-fluoro-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-quinazolin- 4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilraetil)-3-butil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-morfolin-4-il-3H-quinazolin-4-ona; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-7-fluoro-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-fenil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (4-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-6,7-dimetóxi-2-(9H-purin-6-i1sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-7-nitro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-6-bromo-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-6,7-dimetóxi-3H-quinazolin-4-ona; 6-bromo-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-benzo [g]quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-o-tolil-3H-quinazolin-4 -ona; e 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-metoxifenil)-3H-quinazolin-4-ona. A invenção ainda fornece compostos que são inibidores seletivos de atividade de ΡΙ3Κδ. Os compostos apresentam inibição de ΡΙ3Κδ em ensaios bioquímicos e seletivamente interrompem a função de células de expressão de ΡΙ3Κδ em ensaios baseados em célula. Como descrito em outro lugar aqui, os compostos da invenção demonstraram inibir certas funções em neutrófilos e outros leucócitos, bem como funções de osteoclastos.
Em geral, os compostos fornecidos pela invenção têm a estrutura geral (I) , um sal aceitável em termos farmacêuticos dos mesmos, ou um pró-medicamento do mesmo: onde A é um sistema de anel monocíclico ou bicíclico opcionalmente substituído, contendo pelo menos dois átomos de nitrogênio, e pelo menos um anel do sistema é aromático; X é selecionado a partir do grupo que consiste em CHRb, CH2CHRb, e CH=C(Rb); Y é selecionado a partir do grupo que consiste em nulo, S, SO, S02, NH, 0, C(=0), 0C<=0), C(=0)0, e NHC(=0)CH2S; 0 R1 e R2, independentemente, são selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, Ci-6 alquila, arila, heteroarila, halogênio, NHC (=0) Ci-3alquilenoN(Ra) 2, N02, 0Ra, OCF3, N (Ra) 2, CN, OC (=0) Ra, C(=0)0Ra, arilORb, Het, NRaC (=0) Ci-3alquilenoC (=0) 0Ra, arilOCi-3alquileno-N (Ra) 2, Ci-4alquilenoC (=0) 0Ra, 0Ci-4alquilenoC (=0) 0Ra, Ci-4alquilenoCi-4alqu.i.lenoC (=0) 0Ra, C (=0) -NRaS02Ra, Ci..4alquilenoN (Ra) 2, C2- 6alquÍlenoN(Ra)2, C (=0) NRaCi.4alquilenoORa, C(=0)NRaCi_ 4alquilenoHet, OC2-4alquilenoN (Ra) 2, OCi- 4alquilenoCH(ORb)CH2N(Ra)2, OCi-4alquilenoHet, 0C2- 4alquilenoORa, OC2.4alquileno-NRaC (=0) 0Ra, NRaC2- 4alquilenoN(Ra)2, NRaC(=0)Ra, NRaC (=0) N (Ra) 2, N(S02Ci-4alquila)2, NRa(S02Ci-4alquila) , S02N(Ra)2, 0S02CF3, Cx. 3alquilenoarila, Ci-4alquilenoHet, Ci.6alquilenoORb, Ci. 3alquilenoN(Ra) 2, C(=0)N(Ra)2, NHC (=0) Ci-3alquilenoarila, C3. 8cicloalquila, C3-8heterocicloalquila, arilOCi.3alquilenoC3. sheterocicloalquila, arilOC (=0) Rb, NHC (=0) Ci_3alquilenoC3. aheterocicloalquila, NHC (=0) Ci-3alquilenoHet, OCi^ 4alquilenoOCi-4alquilenoC (=0) 0Rb, C (=0) Ci-4alquilenoHet e NHC (=0) haloCi-6alquila;
Ou R1 e R2 são tomados em conjunto para formarem um componente de cadeia de alquileno ou alquenileno de 3 ou 4 elementos de um anel de 5 ou 6 elementos, opcionalmente contendo pelo menos um heteroátomo; 0 R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio opcionalmente substituído, Ci_6alquila, C3. 8cicloalquila, C3-8heterocicloalquila, Ci- 4alquilenocicloalquila, C2-6alquenila, C2-3alquilenoarila, arilCi-3alquila, C(=0)Ra, arila, heteroarila, C(=0)0Ra, C (=0) N (Ra) 2, C ( = S) N (Râ) 2 , S02R\ S02N(Ra)2, S(=0)Ra, S (=0)N(Ra) 2, C(=0)NRaC1.4alquileno0Ra, C(=0)NRaC!_ 4alquilenoHet, C (=0) Ci-4alquilenoarila, C(=0)Ci- 4alquilenoheteroarila, Ci-4alquilenoarila opcionalraente substituído com um ou mais dentre halogênio, S02N(Ra)2, N (Ra) 2, C (=0) 0Ra, NRaS02CF3, CN, N02, C(=0)Ra, 0Ra, Ci, 4alquilenoN (Ra) 2, e 0Ci-4alquilenoN (Ra) 2, Ci- 4alquilenoheteroarila, C1_4alquilenoHet/ Ci-4alquilenoC (=0) Ci-4alquilenoarila, Ci-4alquilenoC (=0) Ci_4alquilenoheteroarila, C1-4alquilenoC(=0)Het, Ci-4alquilenoC (=0) -N(Ra) 2, Ci- 4alquilenoORa, CV4alquilenoNRaC (=0) Ra, Ci_4alquilenoOCi-4alquileno0Ra, Ci_4alquilenoN (Ra) 2/ Ci_4alquilenoC (=0) 0Ra, e C1_4alquilenoOCi.4alquilenoC (=0) 0Ra; 0 Ra é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, Ci-6alquila, C3-8cicloalquila, C3- 8heterocicloalquila, Ci_3alquilenoN (Ra) 2, arila, arilCi-3alquila, Ci_3alquilenoarila, heteroarila, heteroarilCi-3alquila, e Ci-3alquilenoheteroarila;
Ou dois grupos Ra são tomados em conjunto para a formação de um anel de 5 ou 6 elementos, opcionalmente contendo pelo menos um heteroátomo; 0 Rb é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, Ci-6alquila, arila, heteroarila, arilCi-3alquila, heteroarilC3-3alquila, C:.-3alquilenoarila e Ci- 3alquilenoheteroarila;
Het é um anel heterocíclico de 5 ou 6 elementos, saturado ou parcial ou completamente insaturado, contendo pelo menos um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em oxigênio, nitrogênio e enxofre, e opcionalmente substituído com Ci_4alquila ou C(=0)0Ra; E sais aceitáveis era termos farmacêuticos e solvatos (por exemplo, hidratos) dos mesmos.
Como usado aqui, o termo "alquila" inclui grupos de hidrocarbonetos de cadeia reta e ramificada, contendo o número indicado de átomos de carbono, tipicamente, metila, etila e grupos propila e butila de cadeia reta e ramificada. 0 grupo de hidrocarboneto pode conter até 16 átomos de carbono, preferencialmente de um a oito átomos de carbono. 0 termo "alquila" inclui "alquila em ponte", isto é, um grupo de hidrocarboneto de C5-Ci6 bicíclico ou policíclico, por exemplo, norbornila, adamantila, biciclo [2.2.2]octila, biciclo[2.2.1]heptila, biciclo [3.2.1]octila, ou decaidronaftila. 0 termo "cicloalquila" é definido como um grupo de hidrocarboneto C3-C8 cíclico, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, cicloexila e ciclopentila. 0 termo "alquenila" é definido de forma idêntica a "alquila", exceto por conter uma ligação dupla de carbono-carbono. "Cicloalquenila" é definido de forma similar a cicloalquila, exceto por uma ligação dupla de carbono-carbono estar presente no anel. 0 termo "alquileno" se refere a um grupo alquila tendo um substituinte. Por exemplo, o termo "Ci-3alquilenoarila" se refere a um grupo alquila contendo de um a três átomos de carbono e substituído com um grupo arila. 0 termo "halo" ou "halogênio" é definido aqui como incluindo flúor, bromo, cloro e iodo. 0 termo "haloalquila" é definido aqui como um grupo alquila substituído com um ou mais substituintes halo, fluoro, cloro, bromo, iodo ou combinações dos mesmos. De modo similar, "halocicloalquila" é definido como um grupo cicloalquila tendo um ou mais substituintes halo. 0 termo "arila", sozinho ou em combinação, é definido aqui como um grupo aromático monocíclico ou policíclico, preferencialmente um grupo aromático monocíclico ou bicíclico, por exemplo, fenila ou naftila. A menos que indicado de outra forma, um grupo "arila" pode ser não substituído ou substituído, por exemplo, com um ou mais e, em particular, de um a três halo, alquila, fenila, hidroxialquila, alcóxi, alcoxialquila, haloalquila, nitro, amino, alquilamino, acilamino, alquiltio, alquilsulfinila e alquilsulfonila. Os grupos arila de exemplo incluem fenila, nfatila, bifenila, tetra-hidronaftila, clorofenila, fluorofenila, aminofenila, metilfenila, metoxifenila, trifluorometilfenila, nitrofenila, carboxifenila e similares. Os termos "arilCi-3alquila" e "heteroarilCi. 3alquila" são definidos como um grupo arila ou heteroarila tendo um substituintes Ci-3alquila. 0 termo "heteroarila" é definido aqui como um sistema de anel monocíclico ou bicíclico contendo um ou dois anéis aromáticos e contendo pelo menos um átomo de nitrogênio, oxigênio ou enxofre em um anel aromático, e o qual pode ser não substituído ou substituído, por exemplo, com um ou mais e, em particular, de um a três substituintes, como halo, alquila, fenila, hidroxialquila, alcóxi, alcoxialquila, haloalquila, nitro, amino, alquilamino, acilamino, alquiltio, alquilsulfinila e alquilsulfonila. Os exemplos de grupos heteroarila incluem tienila, furila, piridila, oxazolila, quinolila, isoquinolila, indolila, triazolila, isotiazolila, isoxazolila, imidizolila, benzotiazolila, pirazinila, pirimidila, tiazolila e tiadiazolila. 0 termo "Het" é definido como grupos monocíclicos, bicíclicos e tricíclicos contendo um ou mais heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em oxigênio, nitrogênio e enxofre. Um grupo "Het" também contém um grupo oxo (=0) anexado ao anel. Os exemplos não limitativos de grupos Het incluem 1,3-dioxolano, 2-pirazolina, pirazolidina, pirrolidina, piperazina, uma pirrolina, 2H-piran, 4H-piran, morfolina, tiofolina, piperidina, 1,4-ditiano e 1,4-dioxano. 0 termo "hidróxi" é definido como -OH. 0 termo "alcóxi" é definido como -OR, onde R é alquila. 0 termo "alcoxialquila" é definido como um grupo alquila onde um hidrogênio foi substituído por um grupo alcóxi. 0 termo "(alquiltio)alquila" é definido de forma similar ao alcoxialquila, exceto por um átomo de enxofre, ao invés de um átomo de oxigênio, estar presente. 0 termo "hidroxialquila" é definido como um grupo hidróxi em apenso a um grupo alquila. 0 termo "amino" é definido como -NH2, e o termo "alquilamino" é definido como -NR2, onde pelo menos um R é alquila e o segundo R é alquila ou hidrogênio. 0 termo "acilamino" é definido como RC(=0)N, onde R é alquila ou arila. 0 termo "alquiltio" é definido como -SR, onde R é alquila. 0 termo "alquilsulfinila" é definido como R-S02, onde R é alquila. 0 termo "alquilsulfonila" é definido como R-S03, onde R é alquila. 0 termo "nitro" é definido como -N02. 0 termo "trifluorometila" é definido como -CF3. 0 termo "trifluorometóxi" é definido como -OCF3. 0 termo "ciano" é definido como -CN.
Em montagens preferidas, X é selecionado a partir do grupo que consiste em CH2; CH2CH2, CH=CH, CH(CH3), CH2 CH(CH3) e C(CH3) 2 · Em outras montagens preferidas, X é selecionado a partir do grupo que consiste em nulo, S e UH, 0 anel A pode ser monocíclico ou bicíclico. Os sistemas de anel A monocíclico são aromáticos. Os sistemas de anel A bicíclico contêm pelo menos um anel aromático, mas ambos os anéis podem ser aromáticos. Os exemplos de sistemas de anel A incluem, mas nãc estão limitados a imidazolila, pirazolila, 1,2,3-triazolila, piridizinila, pirimidinila, pirazinila, 1,3,5-triazinila, purinila, cinolinila, ftalazinila, quinazolinila, quinoxalinila, 1,8-naftiridinila, pteridinla, lH-indazolila e benzimidazolila.
Em um grupo preferido de compostos de fórmula (I), A é representado por um sistema de anel opcionalmente substituído, selecionado a partir do grupo que consiste em: 0 sistema de anel A ser substituído por de um a três,e preferencialmente um a dois, substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em N(Ra)2, halogênio, Ci-3alquila, S (Ci-3alquila) , 0Ra, e Os substituintes específicos incluem, mas não estão limitados a NH2, NH(CH3), N(CH3)2, NHCH2C6HS, NH(C2H5), Cl, F, CH3, SCH3í OH e Em um outro grupo preferido de compostos de fórmula (I), R1 e R2, independentemente, são representados por hidrogênio, 0Ra, halogênio, Cx-galquila, CF3, N02, N(Ra)2, NRaCi_3alquilenoN(Ra) 2, e OCi-3alquilenoORa. Os substituintes específicos incluem, mas não estão limitados a H, OCH3í Cl, Br, F, CH3, CF3, N02, OH, N(CH3)2, e 0 (CH2) 20CH2C6H5. R1 e R2 também podem ser tomados em conjunto, para a formação de um anel, por exemplo, um anel fenila.
Em uma montagem preferida, o R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em Ci-6alquila opcionalmente substituída, arila, heteroarila, C3-Bcicloalquila, C3_ sheterocicloalquila, C(=0)0Ra, Ci-4alquilenoHet, Ci_ 4alquilenocicloalquila, Ci-4alquilenoarila, Ci- 4alquilenoC (=0) Ci-4alquilenoarila, Ci-4alquilenoC (=0) 0Ra, Ci_ 4alquilenoC (=0) N{Ra) 2, Ci_4alquilenoC (=0) Het, Ci_ 4alquilenoN (Ra) 2, e Ci-4alquilenoNRaC (=0) Ra. Os grupos R3 específicos incluem, mas não estão limitados a: 0 grupo R3 pode ser substituído com de um a três substituintes, por exemplo, 0Ra, Ci-6alquila, arila, heteroarila, N02, N(Ra)2, NRaS02CF3, NRaC(=0)Ra, C(=0)Ra, S02N (Ra) 2, CN, C (=0) Ra, C1-4alquilenoN (Ra) 2, OCi-4alquilenoN (Ra) 2 e N (Ra) Ci_4alquilenoN (Ra) 2. Os substituintes específicos para o grupo R3 incluem, mas não estão limitados a Cl, F, CH3, CH(CH3)2, 0CH3, CsESl N02, NH2, NHC(=0)CH3í C02H, e N (CH3) CH2CH2N (CH3) 2 - Como usado aqui, a estrutura de anel de quinazolina e a numeração da estrutura de anel são: A estrutura de anel de purina e a numeração da estrutura de anel são: Os compostos fornecidos pela invenção são exemplificados como se segue: 3- (2-isopropilfenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-3-(2-fluorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-fluorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-metoxifenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2,6-diclorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-6-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-3- (2-clorofenil) -2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil) -3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-7-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-morfolin-4-il-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato; 8-cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil) -6,7-d.ifluoro-2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(3-metoxifenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 6-cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(3-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-piridin-4-il-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-8-trifluorometil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-benzil-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(4-metilpiperazin-l-il)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato; 3-(2-clorofenil)-6-hidróxi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; éster de etila de ácido [5-fluoro-4-oxo-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-quinazolin-3-il]acético; 3-(2-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H- quinazolin-4-ona; 3- bifenil-2-il-5-cloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5-cloro-3-(2-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-{2-isopropilfenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin- 4- ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-bifenil-2-il-5-cloro-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-fluorofenil)-3H-quinazolin-4 -ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-8-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4 -ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-5-fluoro-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-quinazolin- 4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil) -3-butil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-raorfolin-4-il-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil) -7-fluoro-3H-quinazolin-4-ona; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-6-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (4-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-6,7-dimetóxi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-7-nitro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-6-bromo-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-6,7-dimetóxi-3H-quinazolin-4-ona; 6-bromo-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-benzo [g] quinazolin-4-ona,· 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-o-tolil-3H-quinazolin- 4- ona; e 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-metoxifenil)-3H-quinazolin-4-ona Os compostos preferidos fornecidos pela invenção têm a estrutura (IV), exemplificados como se segue: 3- (2-isopropilfenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5- cloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona ; 5-cloro-3-(2-fluorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-fluorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2,β-diclorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-6-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 5- cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4 -ona; 3-(2-clorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilraetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-7-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-morfolin-4-il-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato; 8-cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(2-clorofenil)-6,7-diflnoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3- (3-metoxifenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 6- cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(3-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-piridin-4-il-3H-quinazolin-4-ona; 3- (2-clorofenil)-8-trifluorometil-2-(9H-purin-6- ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-benzil-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 3-(4-metilpiperazin-l-il)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato; 3-(2-clorofenil)-6-hidróxi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilTnetil)-3H-quinazolin-4-ona; éster de etila de ácido [5-fluoro-4-oxo-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-quinazolin-3-il]acético; 3- bifenil-2-il-5-cloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-isopropanilfenil)5-metil-3H-quinazolin-4-ona 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-O-tolil-3H-quinazolin- 4- ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil}-3-bifenil-2-il-5-cloro-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil) -5-cloro-3-(2-fluorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-8-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-5-fluoro-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-quinazolin- 4 -ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-butil-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-morfolin-4-il-3H-quinazolin-4-ona; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-7-fluoro-3H-quinazolin-4-ona; e 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-o-tolil-3H-quinazolin- 4-ona. 0 termo pró-medicamento, como usado aqui, se refere a compostos que são rapidamente transformados in vivo em um composto tendo a fórmula estrutural (I) aqui acima, por exemplo, por hidrólise. 0 projeto de pró-medicamento é discutido, geralmente, em Hardma e cols. (Eds.), Goodman and Gilma's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th ed., pp. 11-16 (1996). Uma discussão completa é fornecida em Higuchi e cols., Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, ASCD Symposium Series, e em Roche (ed.), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987). Brevemente, a administração de uma droga é seguida pela eliminação do corpo ou alguma biotransformação, por meio do que a atividade biológica da droga é reduzida ou eliminada. Alternativamente, um processo de biotransformação pode levar a um subproduto metabólico, o qual em si é muito mais ativo ou igualmente ativo, se comparado com a droga inicialmente administrada. Uma compreensão aumentada desses processos de biotransformação permite o projeto dos assim denominados "pró-medicamentos", os quais, seguindo-se à biotransformação, se tornam fisiologicamente mais ativos em seu estado alterado. Os pró-medicamentos, portanto, envolvem compostos inativos em termos farmacológicos, que são convertidos em metabólitos biologicamente ativos.
Para ilustrar, os pró-medicamentos podem ser convertidos em uma forma ativa em termos farmacológicos através da hidrólise, por exemplo, de uma ligação de éster ou de amida, desse modo introduzindo-se ou expondo-se um grupo funcional do produto resultante. Os pró-medicamentos podem ser projetados para reagirem com um composto endógeno, para a formação de um conjugado solúvel em água, que adicionalmente melhora as propriedades farmacológicas do composto, por exemplo, uma meia-vida circulatória aumentada. Alternativamente, os pró-medicamentos podem ser projetados para sofrerem uma modificação covalente em um grupo funcional, por exemplo, com ácido glicorônico, sulfato, glutationa, aminoácidos ou acetato. 0 conjugado resultante pode ser inativado e excretado na urina, ou tornado mais potente do que o composto de origem. Conjugados de peso molecular alto também podem ser excretados na bile, sujeitos a divagem enzimática e liberados de volta na circulação, desse modo efetivamente aumentando-se a meia-vida biológica do composto originalmente administrado. Métodos de Identificação de Reguladores Negativos de Atividade de ΡΙ3Κδ A proteína de ΡΙ3Κδ, bem como fragmentos da mesma possuindo atividade biológica podem ser usados para a triagem de compostos reguladores negativos putativos em qualquer uma de uma variedade de técnicas de triagem de droga. Um regulador negativo de ΡΙ3Κδ é um composto que diminui ou abole a capacidade de ΡΙ3Κδ de realizar qualquer uma de suas funções biológicas. Um exemplo desses compostos é um agente que diminui a capacidade de um polipeptídio de ΡΙ3Κδ de fosforilatar fosfatidilinositol ou para almejar estruturas apropriadas em uma célula. A seletividade de um composto que regula negativamente a atividade de ΡΙ3Κδ pode ser avaliada pela comparação de sua atividade na ΡΙ3Κδ com sua atividade em outras proteínas. Os reguladores negativos seletivos incluem, por exemplo, anticorpos e outras proteínas ou peptídios que especificamente se ligam a um polipeptídio de ΡΙ3Κδ, oligonucleotídeos que especificamente se ligam a polipeptídios de ΡΙ3Κδ, e outros compostos não-peptídios (por exemplo, moléculas orgânicas isoladas ou sintéticas), que interagem especificamente com os polipeptídios de ΡΙ3Κδ. Os reguladores negativos também incluem compostos como descrito acima, mas os quais interagem com um parceiro de ligação específica de polipeptídios de ΡΙ3Κδ.
Os alvos presentemente preferidos para o desenvolvimento de reguladores negativos seletivos de ΡΙ3Κδ incluem, por exemplo: (1) regiões citoplásmicas de polipeptídios de PI3KÔ que contatam outras proteínas e/ou localizam PI3KÔ em uma célula; (2) regiões de polipeptídios de ΡΙ3Κδ que se ligam a parceiros de ligação específicos; (3) regiões de polipeptídios de ΡΙ3Κδ que se ligam a um substrato; (4) locais reguladores alostéricos de polipeptídios de PI3KÔ, que podem ou não interagir diretamente no local ativo, mediante um sinal regulador. (5) regiões dos polipeptídios que mediam uma multimerização.
Por exemplo, um alvo para o desenvolvimento de moduladores é a interação reguladora de p85 com ρΙΙΟδ, a qual pode estar envolvida na ativação e/ou na localização subcelular da porção de ρΙΙΟδ. Ainda outros moduladores seletivos incluem aqueles que reconhecem sequências reguladoras específicas ou de nucleotídeo de codificação de ΡΙ3Κδ. Os moduladores de atividade de ΡΙ3Κδ podem ser úteis, em termos terapêuticos, no tratamento de uma ampla faixa de doenças e de condições fisiológicas nas quais uma atividade de ΡΙ3Κδ aberrante esteja envolvida.
Assim sendo, a invenção fornece métodos de caracterização da potência de um composto de teste como um inibidor de polipeptídio de PI3KÔ, o referido método compreendendo as etapas de (a) medição da atividade de um polipeptídio de ΡΙ3Κδ na presença de um composto de teste; (b) comparação da atividade do polipeptídio de ΡΙ3Κδ na presença do composto de teste com a atividade do polipeptídio de ΡΙ3Κδ na presença de uma quantidade equivalente de um composto de referência (por exemplo, um composto inibidor de ΡΙ3Κδ da invenção, como descrito aqui), onde uma atividade do polipeptídio de ΡΙ3Κδ na presença do composto de teste menor do que na presença do composto de referência indica que o composto de teste é um inibidor mais potente do que o composto de referência, e uma atividade do polipeptídio de ΡΙ3Κδ na presença do composto de teste mais alta do que na presença do composto de referência indica que o composto de teste é um inibidor menos potente do que o composto de referência. A invenção ainda fornece métodos de caracterização da potência de um composto de teste como um inibidor de polipeptídio de PI3KÔ, compreendendo as etapas de (a) determinação de uma quantidade de um composto de controle (por exemplo, um composto inibidor de ΡΙ3Κδ da invenção, como descrito aqui), que inibe a atividade de um polipeptídio de PI3KÔ por uma percentagem de referência de inibição, desse modo definindo uma quantidade inibitória de referência para o composto de controle; (b) determinação de uma quantidade de um composto de teste que inibe uma atividade de um polipeptídio de ΡΙ3Κδ por uma percentagem de inibição de referência, desse modo definindo uma quantidade inibidora de referência para o composto de teste; (c) comparação da quantidade inibitória de referência para o composto de teste com a quantidade inibitória de referência para o composto de controle, onde uma quantidade inibitória de referência para o composto de teste menor do que para o composto de controle indica que o composto de teste é um inibidor mais potente do que o composto de controle, e uma quantidade inibitória de referência par ao composto de teste mais alta do que para o composto de controle indica que o composto de teste é um inibidor menos potente do que o composto de controle. Em um aspecto, o método usa uma quantidade inibitória de referência, a qual é a quantidade do composto que inibe a atividade do polipeptídio de ΡΙ3Κδ em 50%, 60%, 70% ou 80%. Em um outro aspecto, o método emprega uma quantidade inibitória de referência que é a quantidade de composto que inibe a atividade do polipeptídio de ΡΙ3Κδ em 90%, 95% ou 99%. Esses métodos compreendem determinar a quantidade inibitória de referência dos compostos em um ensaio bioquímico in vitro, em um ensaio baseado em célula in vitro ou em um ensaio in vivo. A invenção ainda fornece métodos de identificação de um regulador negativo de atividade de PI3KÔ, compreendendo as etapas de (i) medir a atividade de um polipeptídio de PI3KÔ na presença e na ausência de um composto de teste, e (ii) identificação como um regulador negativo de um composto de teste que diminua a atividade de PI3KÔ e que compita com um composto da invenção para ligação a ΡΙ3Κδ. Mais ainda, a invenção fornece métodos para a identificação de compostos que inibem a atividade de ΡΙ3Κδ, compreendendo as etapas de (i) contatar um polipeptídio de ΡΙ3Κδ com um composto da invenção na presença e na ausência de um composto de teste, e (ii) identificar um composto de teste como um regulador negativo de atividade de PI3KÔ, onde o composto compete com um composto da invenção para ligação a ΡΙ3Κδ. A invenção, portanto, fornece um método para a triagem de reguladores negativos candidatos de atividade de PI3KÔ e/ou para confirmar o modo de ação desses reguladores negativos candidatos. Esses métodos podem ser empregados contra outras isoformas de PI3K em paralelo, para o estabelecimento de uma atividade comparativa para o composto de teste através das isoformas e/ou em relação a um composto da invenção.
Nesses métodos, o polipeptídio de ΡΙ3Κδ pode ser um fragmento de pllOÔ, que exibe atividade de cinase, isto é, um fragmento compreendendo o local catalítico de ρΙΙΟδ. Alternativamente, o polipeptídio de ΡΙ3Κδ pode ser um fragmento do domínio de ligação de ρΙΙΟδ de p85, e fornece um método para a identificação de moduladores alostéricos de ΡΙ3Κδ. Os métodos podem ser empregados em células expressando ΡΙ3Κδ ou em suas subunidades, de forma endógena ou exógena. Assim sendo, o polipeptídio empregado nesses métodos pode ser livre em solução, afixado a um suporte sólido, modificado para ser exibido em uma superfície de célula, ou localizado de modo intracelular. A modulação de atividade ou a formação de complexos de ligação entre o polipeptídio de PI3K5 e o agente sendo testado, então, pode ser medida.
Os polipeptídios de ΡΙ3Κδ Humano são receptíveis a ensaios de triagem de alta produção (HTS) bioquímicos ou baseados em célula, de acordo com métodos conhecidos e praticados na técnica, incluindo sistemas de ensaio melanòforos para a investigação de interações de receptor-ligante, sistemas de ensaio baseados em levedura, e sistemas de expressão de célula de mamífero. Para uma revisão, veja Jayawickreme e Kost, Curr Opin Biotechnol, 8: 629-34 (1997). Ensaios de HTS automatizados e miniaturizados também são compreendidos como descritos, por exemplo, em Huston e Banks, Curr Opin Biotechnol, 8: 734-40 (1997) .
Esses ensaios de HTs são usados para a triagem de bibliotecas de compostos, para a identificação de compostos particulares que apresentem uma propriedade desejada. Qualquer biblioteca de compostos pode ser usada, incluindo bibliotecas químicas, bibliotecas de produtos naturais e bibliotecas combinatórias, compreendendo oligopeptídios aleatórios ou designados, oligonucleotídeo e outros compostos orgânicos.
As bibliotecas químicas podem conter compostos conhecidos, análogos estruturais proprietários de compostos conhecidos ou compostos que são identificados a partir de uma triagem de produto natural.
As bibliotecas de produto natural são coleções de materiais isolados a partir de fontes naturais, tipicamente, microorganismos, animais, plantas ou organismos marinhos. Os produtos naturais são isolados de suas fontes por fermentação de microorganismos, seguida por isolamento e extração dos brotos de fermentação, ou por uma extração direta dos microorganismos ou tecidos (plantas ou animais) em si. As bibliotecas de produto natural incluem policetídeos, peptídios não-ribossômico, e variantes (incluindo variantes de ocorrência não natural) dos mesmos. Para uma revisão, veja Cane e cols., Science, 282: 63-68 (1998).
As bibliotecas combinatórias são compostas por grandes números de compostos relacionados, tais como peptídios, oligonucleotídeos, e outros compostos orgânicos, como uma mistura. Esses compostos são relativamente diretos de se projetar e preparar por protocolos de síntese automatizada tradicionais, PCR, clonagem ou métodos sintéticos proprietários. São de interesse em particular as bibliotecas combinatórias de peptídio e oligonucleotídeo.
Ainda outras bibliotecas de interesse incluem bibliotecas de peptídio, proteína, peptidiomimético, coleção sintética multiparalela, recombinatória e de polipeptídio. Para uma -revisão de química combinatória e bibliotecas criadas dessa forma, veja Myers, Curr Opin Biotechnol, 8: 701-7 (1997).
Uma vez tenham sido identificados os compostos que mostram atividade como reguladores negativos de função de ΡΙ3Κδ, um programa de otimização pode ser realizado, em um esforço para se melhorar a potência e/ou a seletividade Esta análise de relações de estrutura-atividade (SAR), tipicamente, envolve uma série interativa de modificações seletivas de estruturas de compostos e sua correlação com atividade bioquímica ou biológica. Famílias de compostos relacionados podem ser projetadas, tal que todos exibam a atividade desejada, com certos membros da família, especificamente, aqueles possuindo perfis farmacológicos adequados, potencialmente se qualificando como candidatos terapêuticos.
Usos Terapêuticos de Inibidores de Atividade de PI3K5 A invenção fornece um método para se inibir, de forma seletiva ou específica, a presente invenção, de modo terapêutico ou profilático. 0 método compreende a administração de um inibidor seletivo ou específico de atividade de ΡΙ3Κδ em uma quantidade efetiva para isso. Este método pode ser empregado no tratamento de seres humanos ou de animais que estejam ou possam ser submetidos a qualquer condição cujos sintomas ou cuja patologia sejam mediados por expressão ou atividade de ΡΙ3Κδ. "Tratamento", como usado aqui, se refere a evitar que um distúrbio ocorra em um animal que possa ser predisposto à desordem, mas que ainda não tenha sido diagnosticado como a tendo; inibição do distúrbio, isto é, parar seu desenvolvimento; aliviar o distúrbio, isto é, causar sua regressão; ou moderação do distúrbio, isto é, redução da severidade dos sintomas associados ao distúrbio. Pretende- se que "distúrbio" inclua distúrbios médicos, doenças, condições, síndromes e similares, sem limitação.
Os métodos da invenção envolvem vários outros modos de tratamento de um indivíduo animal, preferencialmente, um mamífero, mais preferencialmente um primata e, ainda mais preferencialmente, um ser humano. Dentre os animais mamíferos que podem ser tratados estão, por exemplo, animais de estimação (bichinhos), incluindo cães e gatos; animais de fazenda, incluindo gado, cavalos, ovelhas, porcos e cabras; animais de laboratório, incluindo ratos, camundongos, coelhos, porquinhos da índia, e primatas não humanos e espécimes de zoológico. Os animais não mamíferos incluem, por exemplo, pássaros, peixes, répteis e anfíbios.
Em um aspecto, o método da invenção pode ser empregado para o tratamento de indivíduos de forma terapêutica ou profilática que tenham ou possam estar sujeitos a um distúrbio inflamatório. Um aspecto da presente invenção deriva do envolvimento de ΡΙ3Κδ na mediação de aspectos do processo inflamatório. Sem pretender ser limitado por qualquer teoria, é teorizado que, devido ao fato de a inflamação envolver processos tipicamente mediados por ativação e transmigração quimiotática de leucócito (por exemplo, neutrófilo, linfócito, etc.), e devido ao fato de ΡΙ3Κδ poder mediar esses fenômenos, antagonistas de ΡΙ3Κδ podem ser usados para supressão de danos associados a uma inflamação. "Distúrbio inflamatório" como usado aqui pode se referir a qualquer doença, distúrbio ou síndrome, no (a) qual uma resposta inflamatória excessiva ou desregulada leva a sintomas inflamatórios excessivos, danos ao tecido hospedeiro ou perda de função do tecido. "Distúrbio inflamatório" também se refere a um estado patológico mediado por influxo de leucócitos e/ou quimiotaxia de neutrófilo. "Inflamação" como usado aqui se refere a uma resposta de proteção localizada eliciada por danos ou destruição de tecidos, a qual serve para destruir, diluir ou desemparedar (seqüestrar) ambos o agente danoso e o tecido danificado. A inflamação, notadamente, está associada ao influxo de quimiotaxia de leucócitos e/ou de neutrófilos. A inflamação pode resultar de uma infecção com organismos patogênicos e vírus e a partir de meios não infecciosos, tais como trauma ou reperfusão seguindo-se a um infarto do miocárdio ou um acidente vascular cerebral, resposta imune a um antígeno estranho e respostas autoimunes. Assim sendo, distúrbios inflamatórios receptivos â invenção envolvem distúrbios associados a reações do sistema de defesa específico, bem como a reações do sistema de defesa não específico.
Como usado aqui, o termo "sistema de defesa específico" se refere ao componente do sistema imune que reage à presença de antígenos específicos. Os exemplos de inflamação resultante de uma resposta do sistema de defesa específico incluem a resposta clássica a antígenos estranhos, doenças autoimunes e resposta de hipersensibilidade de tipo atrasado mediada por células T. doenças inflamatórias crônicas, a rejeição de tecido e órgãos transplantados sólidos, por exemplo, transplantes de rim e medula óssea, e doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD) são outros exemplos de reações inflamatórias do sistema de defesa específico. 0 termo "sistema de defesa não específico", como usado aqui, se refere a distúrbios inflamatórios que são mediados por leucócitos, que são incapazes de memória imunológica (por exemplo, granulócitos e macrófagos). Os exemplos de inflamação que resultam, pelo menos em parte, de uma reação do sistema de defesa não específico incluem uma inflamação associada a condições tais como síndrome de sofrimento respiratório em adultos (aguda) ou síndromes de danos a múltiplos órgãos; danos por reperfusão; glomerunefrite aguda; artrite reativa; dermatoses com componentes inflamatórios agudos; meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, tais como acidente vascular cerebral; danos térmicos; doença de inflamatória do intestino; . síndromes associadas à transfusão de granulócito; e toxicidade induzida por citocina. "Doença autoimune" como usado aqui se refere a qualquer grupo de distúrbios nos quais um dano de tecido esteja associado a respostas humorais ou mediadas por célula para os próprios constituintes do corpo. "Doença alérgica" como usado aqui se refere a quaisquer sintomas, danos ao tecido ou perda de função do tecido resultante de uma alergia. "Doença artrítica" como usado aqui se refere a qualquer doença que seja caracterizada por lesões inflamatórias das juntas, atribuíveis a uma variedade de etiologias. "Dermatite" como usado aqui se refere a qualquer uma de uma ampla família de doenças da pele, que são caracterizadas por inflamação da pele atribuível a uma variedade de etiologias. "Rejeição de transplante", como usado aqui, se refere a qualquer reação imune dirigida contra um tecido enxertado, tais como órgãos ou células (por exemplo, medula óssea), caracterizada por uma perda de função dos tecidos enxertados e circundantes, dor, inchaço, leucocitose e trombocitopenia.
Os métodos terapêuticos da presente invenção incluem métodos para o tratamento de distúrbios associados à ativação de célula inflamatória. "Ativação de célula inflamatória" se refere à indução por um estímulo (incluindo, mas não limitando citocinas, antígenos ou auto-anticorpos) de uma resposta celular proliferativa, a produção de mediadores solúveis (incluindo, mas não limitando citocinas, radicais de oxigênio, enzimas, prostanóides ou aminas vasoativas), ou expressão de superfície de célula de números novos ou aumentados de mediadores (incluindo, mas não limitando antígenos de histocompatibilidade principal ou moléculas de adesão de célula) em células inflamatórias (incluindo, mas não limitando monócitos, macrófagos, linfócitos T, linfócitos B, granulócitos (isto é, leucócitos polimorfonuclear, tais como neutrófilos, basófilos e eosinófilos), mastócitos, células dendríticas, células de Langerhans e células endoteliais). .Será apreciado por pessoas versadas na técnica que a ativação de um ou de uma combinação desses fenótipos nessas células pode contribuir para a iniciação, a perpetuação ou a exacerbação de um distúrbio inflamatório.
Os compostos da invenção mostraram inibir a liberação de superóxido por neutrófilos. 0 superóxido é liberado por neutrófilos, em resposta a qualquer um de uma variedade de estímulos, incluindo sinais de infecção, como um mecanismo de matança de célula. Por exemplo, a liberação de superóxido é conhecida por ser induzida por fator alfa de necrose de tumor (TNFa), o qual é liberado por macrófagos, mastócitos e linfócitos, mediante um contato com componentes de parede de célula bacteriana, tal como lipopolissacarídeo (LPS). 0 TNFa é um ativador extracomumente potente e promíscuo de processos inflamatórios, estando envolvido na ativação de neutrófilos e vários outros tipos de célula, na indução de adesão de leucócito / célula endotelial, pirexia, produção de classe I de MHC melhorada e estimulação de angiogênese. Alternativamente, a liberação de superóxido pode ser estimulada por formil-Met-Leu-Phe (fMLP) ou outros peptídios bloqueados na terminação N por metionina formilatada. Esses peptídios não são encontrados, normalmente, em eucariotes, mas são fundamentalmente característicos de bactérias e sinalizam a presença de bactérias para o sistema imune. Os leucócitos que expressam o receptor de fMLP, por exemplo, neutrófilos e macrófagos, são estimulados a migrarem gradientes desses peptídios (isto é, quimiotaxia) em direção a locais de infecção. Como demonstrado aqui, os compostos da invenção inibem uma liberação estimulada de superóxido por neutrófilos, em resposta a TNFa ou fMLP. Outras funções de neutrófilos, incluindo exocitose estimulada e migração quimiotática dirigida, também mostraram ser inibidas pelos inibidores de ΡΙ3Κδ da invenção. Assim sendo, espera-se que os compostos da invenção seja úteis no tratamento de distúrbios, tais como distúrbios inflamatórios, que são mediados por qualquer uma ou potência todas essas funções de neutrófilo. A presente invenção permite métodos de tratamento de doenças, tais como doenças artríticas, tais como artrite reumatóide, artrite gotosa, espondilite; doença de Behcet; sépsis, choque séptico, choque endotóxico, sépsis gram-negativa, sépsis gram-positiva, e síndrome de choque tóxico; síndrome de danos a múltiplos órgãos secundária a septicemia, trauma ou hemorragia; distúrbios oftãlmicos, tais como conjuntivite alérgica, conjuntivite vernal, uveíte e oftalmopatia associada à tireóide; granuloma eosinofílico; distúrbios pulmonares ou respiratórios, tais como asma, bronquite crônica, rinite alérgica, ARDS, doença inflamatória pulmonar crônica (por exemplo, doença pulmonar obstrutora crônica), silicose, sarcoidose pulmonar, pleurisia, alveolite, vasculite, enfisema, pneumonia, bronquiectase, e toxicidade de oxigênio pulmonar; dano de reperfusão do miocárdio, cérebro ou extremidades; fibrose, tal como fibrose cística; formação de quelóide ou formação de tecido de cicatriz; aterosclerose; doenças autoimunes, tais como lúpus eritematoso sistêmico (SLE), tireoidite autoimune, esclerose múltipla, algumas formas de diabetes e síndrome de Reynaud; e distúrbios de rejeição a transplante, tais como GVHD e rejeição de aloenxerto; glomerulonefrite crônica; doenças inflamatórias do intestino, tais como doença inflamatória do intestino crônica (CIBD), doença de Crohn, colite ulcerativa e enterocolite necrosante; dermatoses inflamatórias, tais como dermatite de contato, dermatite atópica, psoríase ou urticária; febre e mialgias devido a uma infecção,-distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central ou periférico, tais como meningite, encefalite e danos ao cérebro ou a coluna cervical devido a um trauma menor; síndrome de Sjôgren; doenças envolvendo diapedese de leucócito; hepatite alcoólica; pneumonia bacteriana; doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo; choque hipovolêmico; diabetes melito Tipo I; hipersensibilidade aguda e atrasada; estados de doença devido a discrasia de leucócito e metástase; danos térmicos; síndromes associadas à transfusão de granulócito; e toxicidade induzida por citocina. 0 método pode ter utilidade no tratamento de indivíduos que estejam ou possam estar sujeitos a um dano de reperfusão, isto é, um dano resultante de situações nas quais um tecido ou um órgão experimenta um período de isquemia, seguido por reperfusão. 0 termo "isquemia" se refere a uma anemia localizada no tecido, devido a uma obstrução do influxo de sangue arterial. A isquemia transiente seguida por reperfusão, caracteristicamente, resulta da ativação de neutrófilo e da transmigração através do endotélio dos vasos sanguíneos na área afetada. A acumulação de neutrófilos ativados, por sua vez, resulta na geração de metabõlitos de oxigênio reativo, os quais danificam componentes do tecido ou do órgão envolvido. Este fenômeno de "dano de reperfusão", comumente, está associado a condições tais como acidente vascular (incluindo isquemia global e focal), choque hemorrágico, isquemia ou infarto do miocárdio, transplante de órgãos e vasoespasmo cerebral. Para ilustrar, um dano de reperfusão ocorre no término de procedimentos de desvio cardíaco ou durante uma parada cardíaca, quando o coração, uma vez impedido de receber sangue, começa a reperfundir. É esperado que uma inibição da atividade de PI3KÔ resulte em quantidades reduzidas de dano de reperfusão nessas situações.
Em relação ao sistema nervoso, uma isquemia global ocorre quando o fluxo de sangue para todo o cérebro cessa por um período. A isquemia global pode resultar de uma parada cardíaca. A isquemia focal ocorre quando uma porção do cérebro é privada de seu suprimento normal de sangue. A isquemia focal pode resultar de oclusão tromboembolítica de um vaso cerebral, de danos traumáticos à cabeça, edema ou tumor cerebral. Mesmo se transiente, tanto a isquemia global quanto a focal podem causar um dano neuronial espalhado. Embora um dano ao tecido nervoso ocorra por horas ou mesmo dias apôs o início da isquemia, algum dano permanente ao tecido nervoso pode se desenvolver nos minutos iniciais seguindo-se à cessação de fluxo de sangue para o cérebro. A isquemia também pode ocorrer no coração em um infarto do miocárdio ou em outros distúrbios cardiovasculares, nos quais as artérias coronarianas foram obstruídas como resultado de aterosclerose, trombo ou espasmo. Assim sendo, acredita-se que a invenção seja útil no tratamento de danos ao tecido cardíaco, particularmente danos resultantes de isquemia cardíaca ou causados por danos de reperfusão em mamíferos.
Em um outro aspecto, os inibidores seletivos de atividade de PI3K6, tais como os compostos da invenção, podem ser empregados em métodos de tratamento de doenças do osso, especialmente doenças nas quais a função do osteoclasto é anormal ou indesejada. Como mostrado no Exemplo 6 abaixo, os compostos da invenção inibem a função do osteoclasto in vitro. Assim sendo, o uso desses compostos e de outros inibidores seletivos de ΡΙ3Κδ pode ser de valor no tratamento de osteoporose, doença de Paget e distúrbios relacionados à ressorção de osso.
Em um outro aspecto, a invenção inclui métodos de uso de compostos inibidores de ΡΙ3Κδ para a inibição do crescimento ou da proliferação de células de câncer de origem hematopoiética, preferencialmente, células de câncer de origem linfóide e, mais preferencialmente, células de câncer relacionadas ou derivadas de linfócitos B ou progenitores de linfócitos B. Os cânceres receptivos a um tratamento usando-se o método da invenção incluem, sem limitação, linfomas, por exemplo, neoplasmas malignos de tecidos linfóides e reticuloendoteliais, tais como linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkins, linfomas não Hodgkins, linfomas linfocíticos e similares; múltiplos mielomas; bem como leucemias tais como leucemias linfocíticas, leucemias mielóides crônicas (mielogenosa) e similares. Em uma montagem preferida, os compostos inibidores de ΡΙ3Κδ podem ser usados para a inibição ou para o controle do crescimento ou da proliferação de células de leucemia mielóide (mielogenosa) crônica.
Em um outro aspecto, a invenção inclui um método de supressão de uma função de basófilos e/ou mastócitos, desse modo permitindo um tratamento de doenças ou distúrbios caracterizados por uma atividade de basófilo e/ou mastócito excessiva ou indesejável. De acordo com o método, um composto da invenção pode ser usado, o qual seletivamente inibe a expressão ou a atividade de delta 3-cinase de fosfatidilinositol (ΡΙ3Κδ) nos basófilos e/ou mastócitos.
Preferencialmente, o método emprega um inibidor de ΡΙ3Κδ em uma quantidade suficiente para inibir uma liberação estimulada de histamina pelos basófilos e/ou mastócitos. Assim sendo, o uso desses compostos e de outros inibidores seletivos de ΡΙ3Κδ pode ser de valor no tratamento de doenças caracterizadas por liberação de histamina, isto é, distúrbios alérgicos, incluindo distúrbios tais como doença pulmonar obstrutora crônica (COPD), asma, ARDS, enfisema e distúrbios relacionados.
Composições Farmacêuticas de Inibidores de Atividade de ΡΙ3Κδ Um composto da presente invenção pode ser administrado como o produto químico puro, mas tipicamente, é preferível administrar o composto na forma de uma composição farmacêutica ou de uma formulação. Assim sendo, a presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem um composto químico ou biológico ("agente"), que é ativo como um modulador de atividade de ΡΙ3Κδ e um portador farmacêutico biocompatível, um adjuvante ou um veículo. A composição pode incluir o agente como a única porção ativa ou em combinação com outros agentes, tais como oligo ou polinucleotídeos, oligo ou polipeptídios, drogas ou hormônios misturados com excipiente(s) ou outros portadores aceitáveis em termos farmacêuticos. Os portadores e outros ingredientes podem ser julgados aceitáveis em termos farmacêuticos, uma vez que sejam compatíveis com outros ingredientes da formulação e não deletérios para o destinatário dos mesmos.
As técnicas para a formulação e a administração de composições farmacêuticas podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas usando-se qualquer método convencional, por exemplo, mistura, dissolução, granulação, feitura de drágea, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento, fiação com fusão, aspersão a seco ou processos de liofilização. Entretanto, a formulação farmacêutica ótima será determinada, por uma pessoa versada na técnica, dependendo da rota de administração e da dosagem desejada. Essas formulações podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração in vivo do agente administrado. Dependendo da condição sendo tratada, essas composições farmacêuticas podem ser formuladas e administradas de forma sistêmica ou localmente.
As composições farmacêuticas são formuladas para conterem portadores aceitáveis em termos farmacêuticos adequados e, opcionalmente, podem compreender excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas em termos farmacêuticos. Por exemplo, formulações para administração parenteral podem compreender soluções aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água. Os portadores adequados para administração parenteral podem ser selecionados a partir de salina, salina com tampão, dextrose, água e outras soluções compatíveis em termos fisiológicos. Os portadores preferidos para administração parenteral são tampões compatíveis em termos fisiológicos, tais como solução de Hank, solução de Ringer ou salina fisiologicamente com tampão. Para administração por tecido ou celular, penetrantes apropriados para a barreira em particular a ser permeada são usados na formulação. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na técnica. Para preparações contendo proteínas, a formulação pode incluir materiais de estabilização, tais como polióis (por exemplo, sacarose) e/ou tensoativos (por exemplo, tensoativos não iônicos) e similares.
Alternativamente, as formulações para uso parenteral podem compreender dispersões ou suspensões dos compostos ativos preparados como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Os solventes lipolíticos adequados ou veículos incluem óleos graxos, tal como óleo de gergelim, ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. As suspensões aquosas de injeção podem conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrana. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentem a solubilidade dos compostos, para permitirem a preparação de soluções altamente concentradas. Os polímeros aquosos que proveem uma solubilização sensível a pH e/ou uma liberação sustentada do agente ativo também podem ser usados como revestimentos ou estruturas de matriz, por exemplo, polímeros metacrílicos, tais como a série ® EUDRAGIT , disponível a partir da Rohm America Inc. (Piscataway, NJ). Emulsões, por exemplo, dispersões de óleo em água e água em óleo, também podem ser usadas, opcionalmente estabilizadas por um agente de emulsificação ou um dispersante (materiais de superfície ativa; tensoativos). As suspensões podem conter agentes de suspensão, tais como álcoois de isoestearila etoxilatado, sorbitol de polioxietileno e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metaidróxido de alumínio, bentonita, agar-agar, goma tragacanto e misturas dos mesmos.
Os lipossomas contendo o agente ativo também podem ser empregados para administração parenteral. Os lipossomas, geralmente, são derivados de fosfolipídios ou outras substâncias de lipídio. As composições em forma de lipossoma também podem conter outros ingredientes, tais como estabilizantes, preservativos, excipientes e similares. Os lipídios preferidos incluem fosfolipídios e colinas de fosfatidila (lecitinas), naturais e sintéticos. Os métodos de formação de lipossomas são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Prescott (Ed.), Methods in Cell Biology, Vol. XIV, p. 33, Academic Press, Nova York (1976).
As composições farmacêuticas compreendendo o agente em dosagens adequadas para administração oral podem ser formuladas usando-se portadores aceitáveis em termos farmacêuticos bem conhecidos na técnica. As preparações formuladas para administração oral podem ser na forma de tabletes, pílulas, cápsulas, cápsulas de selo, drágeas, trociscos, líquidos, géis, xaropes, suspensões finas, elixires, suspensões ou pós. Para ilustrar, as preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas pela combinação dos compostos ativos com um excipiente sólido, opcionalmente moendo-se a mistura resultante, e processando-se a mistura de grânulos, após a adição de auxiliares necessários, se desejado, para a obtenção de tabletes ou núcleos de drágeas. As formulações orais podem empregar portadores líquidos similares no tipo àqueles descritos para uso parenteral, por exemplo, soluções aquosas com tampão, suspensões e similares.
As formulações orais preferidas incluem tabletes, drágeas e cápsulas de gelatina. Essas preparações podem conter um ou mais excipientes, os quais incluem, sem limitação: a) diluentes, tais como açúcares, incluindo lactose, dextrose, sacarose, manitol ou sorbitol; b) aglutinantes, tais como silicato de alumínio e magnésio, amido de milho, trigo, arroz, batata, etc.; c) materiais de celulose, tais como metilcelulose, celulose de hidroxipropilmetila e carboximetilcelulose de sódio, polivinilpirrolidona, gomas, tais como goma arábica e goma tragacanto, e proteínas, tais como gelatina e colágeno; d) agentes de desintegração ou solubilização, tais como pirrolidona de polivinila de ligação cruzada, amidos, agar, ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginato de sódio, ou composições efervescentes; e) lubrificantes, tais como sílica, talco, ácido esteárico ou seu sal de magnésio ou cálcio, e polietileno glicol; f) flavorizantes e adoçantes; g) corantes ou pigmentos, por exemplo, para a identificação do produto ou para caracterizarem a quantidade (dosagem) de composto ativo; e h) outros ingredientes, tais como preservativos, estabilizantes, agentes de inchamento, agentes de emulsificação, promotores de solução, sais para regulagem de pressão osmótica, e tampões.
As cápsulas de gelatina incluem cápsulas de adaptação por encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas macias seladas feitas de gelatina e um revestimento tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de adaptação por encaixe podem conter o(s) ingrediente(s) ativo(s) misturado(s) com enchimento, aglutinantes, lubrificantes e/ou estabilizantes, etc. Em cápsulas macias, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou postos em suspensão em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polietileno glicol líquido com ou sem estabilizantes.
Os núcleos de drágea podem ser fornecidos com revestimentos adequados, tais como soluções de açúcar concentrado, as quais também podem conter goma arábica, talco, pirrolidona de polivinila, gel de carbopol, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de verniz e solventes orgânicos adequados ou misturas de · solventes. A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal de um agente ativo. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros protônicos do que nas formas correspondentes de ácido ou base livre. Os sais aceitáveis em termos farmacêuticos são bem conhecidos na técnica. Compostos que contenham porções acídicas podem formar sais aceitáveis em termos farmacêuticos com cátions adequados.
Os cátions aceitáveis em termos farmacêuticos adequados incluem, por exemplo, cátions de metal alcalino (por exemplo, sódio ou potássio) e de alcalino-terroso (por exemplo, cálcio ou magnésio).
Os compostos de fórmula estrutural (I) , que contêm porções básicas, podem formar sais de adição de ácido aceitáveis em termos farmacêuticos com ácidos adequados. Por exemplo, Berge e cols. descreve sais aceitáveis em termos farmacêuticos em detalhes em J Pharm Sei, 66: 1 (1977) . Os sais podem ser preparados in situ, durante o isolamento final e a purificação dos compostos da invenção, ou separadamente pela reação de uma função de base livre com um ácido adequado.
Os sais de adição de ácido representativos incluem, mas não estão limitados a acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, canforato, canforolsulfonato, digliconato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, hidrocloreto, hidrobrometo, hidroiodeto, 2-hidroxietano-sulfanoato (isotionato), lactato, maleato, metanossulfonato ou sulfato, nicotinato, 2-naftaleno-sulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartarato, tiocianato, fosfato ou fosfato de hidrogênio, glutamato, bicarbonato, p-toluenossulfato e undecanoato. Os exemplos de ácidos que podem ser empregador para a formação de sais de adição de ácido aceitáveis em termos farmacêuticos incluem, sem limitação, ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico, e ácidos orgânicos tais como ácido oxálico, ácido maléico, ácido succínico e ácido cítrico. À luz do precedente, pretende-se que qualquer referência a compostos da presente invenção aparecendo aqui inclua compostos de fórmula estrutural (I)-(IV), bem como sais aceitáveis em termos farmacêuticos e solvatos, bem como pró-medicamentos dos mesmos.
Os sais de adição básicos podem ser preparados in si tu, durante o isolamento final e a purificação dos compostos da invenção, ou separadamente pela reação de uma porção contendo ácido carboxílico com uma base adequada, tal como hidróxido, carbonato ou bicarbonato de um cátion de metal aceitável em termos farmacêuticos, ou com amônia ou amina orgânica primária, secundária ou terciária. Os sais de adição básicos aceitáveis em termos farmacêuticos incluem, mas não estão limitados a cátions baseados em metais alcalinos ou metais alcalino-terrosos, tais como lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e sais de alumínio e similares, e cátions de amônio quaternário e amina não tóxicos, incluindo amônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, metilamônio, dimetilamônio, trimetilamônio, etilamônio, dietilamônio, trietilamônio e similares. Outras aminas orgânicas representativas úteis para a formação de sais de adição de base incluem etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina, piperazina e similares.
Os grupos contendo nitrogênio básicos podem ser quaternizados com agentes tais como haletos de alquila inferior, tais como cloretos, brometos e iodetos de metila, etila, propila e butila; sulfatos de dialquila como sulfatos de dimetila, dietila, dibutila e diamila,- haletos de alquila de cadeia longa, tais como cloretos, brometos e iodetos de decila, laurila, miristila e estearila; haletos de arilalquila, tais como brometos de benzila e fenetila; e outros. Produtos tendo solubilidade ou dispersividade modificada, desse modo, são obtidos.
As composições compreendendo um composto da invenção, formulado em um portador aceitável em termos farmacêuticos, podem ser preparadas, colocadas em um recipiente adequado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada. Assim sendo, também é contemplado um artigo de fabricação, tal como um recipiente compreendendo uma forma de dosagem de um composto da invenção e um rótulo contendo instruções para uso do composto. Também são contemplados kits segundo a invenção. Por exemplo, o kit pode compreender uma forma de dosagem de uma correspondência e uma inserção de embalagem contendo instruções para uso da composição no tratamento de uma condição médica. Em qualquer caso, as condições indicadas no rótulo podem incluir o tratamento de distúrbios inflamatórios, câncer, etc. Métodos de Administração de Inibidores de Atividade de ΡΙ3Κδ As composições farmacêuticas compreendendo um inibidor de atividade de ΡΙ3Κδ podem ser administradas a um indivíduo por qualquer método convencional, incluindo técnicas parenterais e entéricas. As montagens de administração parenteral incluem aquelas nas quais a composição é administrada por uma outra rota que não através do trato gastrintestinal, por exemplo, injeções intravenosas, intraarteriais, intraperitoniais, intramedulares, intramusculares, intraarticulares, intratecais e intraventriculares. As montagens de administração entérica incluem, por exemplo, administração oral (incluindo bucal e sublingual) e retal. As montagens de administração transepitelial incluem, por exemplo, uma administração transmucosa e uma administração transdérmica. A administração transmucosa incluir, por exemplo, administrações entéricas, bem como uma administração nasal, por inalação e respiração profunda; administração vaginal; e administração retal. A administração transdérmica inclui as modalidades transdérmicas ou transcutâneas passivas ou ativas, incluindo, por exemplo, adesivos e dispositivos de iontoforese, bem como a aplicação tópica de pastas, pomadas ou ungüentos. A administração parenteral também pode ser realizada usando-se uma técnica de alta pressão, por exemplo, POWDERJECT®.
As técnicas cirúrgicas incluem a implantação de composições de depósito (reservatório) , bombas osmóticas e similares. Uma rota preferida de administração para tratamento de inflamação pode ser um envio local ou tópico para distúrbios localizados, tal como artrite, ou um envio sistêmico para distúrbios distribuídos, por exemplo, um envio intravenoso para dano de reperfusão ou para condições sistêmicas, tais como septicemia. Para outros distúrbios, incluindo aqueles envolvendo o trato respiratório, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma e enfisema, a administração pode ser realizada por inalação ou administração por respiração profunda de aspersões, aerossóis, pós e similares.
Para o tratamento de doenças neoplásicas, especialmente de leucemias e outros cânceres distribuídos, a administração parenteral, tipicamente, é preferida. As formulações dos compostos para otimização deles para biodistribuição, seguindo-se à administração parenteral. seriam desejáveis. Os compostos inibidores de ΡΙ3Κδ podem ser administrados, antes, durante ou após a administração de quimioterapia, radioterapia e/ou cirurgia.
Mais ainda, o índice terapêutico dos compostos de inibidor de ΡΙ3Κδ pode ser melhorado pela modificação ou derivação dos compostos para um envio direcionado a células de câncer expressando um marcador, que identifica as células dessa forma. Por exemplo, os compostos podem ser ligados a um anticorpo, que reconhece um marcador, que é seletivo ou específico para células de câncer, de modo que os compostos sejam levados para a vizinhança das células, para exercerem seus efeitos localmente, como descrito previamente (veja, por exemplo, Pietersz e cols., Irmunol Rev, 129: 57 (1992); Trail e cols., Science, 261: 212 (1993); e Rowlinson-Busza e cols., Curr Opin Oncol, 4: 1142 (1992)). 0 envio direcionado a tumor desses compostos melhora o benefício terapêutico, inter alia, pela minimização das toxicidades não específicas, que podem resultar do tratamento com radiação ou da quimioterapia. Em um outro aspecto, os compostos inibidores de ΡΙ3Κδ e radioisótopos ou agentes quimioterápicos podem ser conjugados para o mesmo anticorpo antitumor.
Para o tratamento de distúrbios de ressorção de osso ou distúrbios mediados por osteoclasto, os inibidores de ΡΙ3Κδ podem ser enviados por qualquer método adequado. Uma administração focal pode ser desejável, tal como por uma injeção intra-articular. Em alguns casos, pode ser desejável acoplar os compostos a uma porção que possa direcionar os compostos para o osso. Por exemplo, um inibidor de ΡΙ3Κδ pode ser acoplado a compostos com alta afinidade por hidroxiapatita, o qual é um constituinte principal do osso. Isso pode ser realizado, por exemplo, pela adaptação de um método de acoplamento de tetraciclina, desenvolvido para o envio direcionado de estrogênio ao osso (Orme e cols., Bioorg Med Chem Lett, 4(11): 1375-80 (1994) ) .
Para serem efetivos terapeuticamente na modulação de alvos do sistema nervoso central, os agentes usados nos métodos da invenção devem penetrar prontamente na barreira de sangue do cérebro, quando administrados de forma periférica. Os compostos que não podem penetrar na barreira de sangue do cérebro, contudo, ainda podem ser administrados efetivamente por uma rota intravenosa.
Como notado acima, as características do agente em si e a formulação do agente podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração in vivo do agente administrado. Essa informação farmacocinética e farmacológica pode ser colecionada através de estudos pré-clínicos in vitro e in vivo, confirmados mais tarde em seres humanos, no decorrer de ensaios clínicos. Assim, para qualquer composto usado no método da invenção, uma dose efetiva em termos terapêuticos pode ser estimada, inicialmente, a partir de ensaios bioquímicos e/ou baseados em célula. Então, a dosagem pode ser formulada em modelos de animais, para a obtenção de uma faixa de concentração de circulação adequada, que module a expressão ou a atividade de ΡΙ3Κδ. Conforme os estudos em seres humanos forem conduzidos, uma informação adicional emergirá referente aos níveis de dosagem apropriados e à duração do tratamento para várias doenças e condições. A toxicidade e a eficácia terapêutica desses compostos pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padronizados em culturas de célula ou em animais experimentais, por exemplo, para a determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose efetiva terapeuticamente em 50% da população). A relação de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é expressa como a relação LD50/ED50. Os compostos que apresentam grandes índices terapêuticos, isto é, a dose tóxica é substancialmente maior do que a dose efetiva, são preferidos. Os dados obtidos a partir desses ensaios de cultura de célula e de estudos adicionais em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso humano. A dosagem desses compostos, preferencialmente, fica em uma faixa de concentrações de circulação que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade.
Para os métodos da invenção, qualquer regime de administração efetiva regulando o sincronismo e a seqüência de doses pode ser usado. As doses de agente incluem, preferencialmente, unidades de dosagem farmacêutica compreendendo uma quantidade efetiva do agente. Como usado aqui, "quantidade efetiva" se refere a uma quantidade suficiente para a modulação da expressão ou da atividade de ΡΙ3Κδ e/ou para se derivar uma mudança mensurável em um parâmetro fisiológico do indivíduo, através da administração de uma ou mais das unidades de dosagem farmacêutica.
Os níveis de dosagem de exemplo para um indivíduo humano são da ordem de cerca de 0,001 miligrama de agente ativo por quilograma de peso corporal (mg/kg) até cerca de 100 mg/kg. Tipicamente, as unidades de dosagem do agente ativo compreendem de cerca de 0,01 mg a cerca de 10.000 mg, preferencialmente de cerca de 0,1 mg a cerca de 1.000 mg, dependendo da indicação, da rota de administração, etc. Dependendo da rota de administração, uma dose adequada pode ser calculada de acordo com o peso corporal, a área superficial do corpo ou com o tamanho do órgão. O regime de dosagem final será determinado pelo médico atendente, tendo em vista a boa prática médica, considerando-se vários fatores que modificam a ação de drogas, por exemplo, a atividade específica do agente, a identidade e a severidade do estado de doença, a capacidade de resposta do paciente, a idade, condição, peso corpóreo, sexo e dieta do paciente, e da severidade de qualquer infecção. Fatores adicionais que podem ser levados em consideração incluem tempo e freqüência de administração, combinações de drogas, sensibilidades de reação e tolerância / resposta â terapia. Um refinamento adicional da dosagem apropriada para um tratamento envolvendo qualquer uma das formulações mencionadas aqui é feito rotineiramente pelo praticante versado, sem uma experimentação indevida, especialmente â luz da informação de dosagem e dos ensaios mostrados, bem como dos dados farmacocinéticos observados em ensaios clínicos humanos. As dosagens apropriadas podem ser avaliadas através do uso de ensaios estabelecidos para a determinação da concentração do agente em um fluido corpóreo ou uma outra amostra, juntamente com os dados de resposta de dose.
A freqüência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos do agente e da rota de administração. A dosagem e a administração são ajustadas para o fornecimento de níveis suficientes da porção ativa, e para manutenção do efeito desejado. Assim sendo, as composições farmacêuticas podem ser administradas em uma dose única, múltiplas doses discretas, infusão contínua, depósitos de liberação sustentada ou combinações dos mesmos, como requerido para a manutenção do nível mínimo desejado do agente. Composições farmacêuticas de atuação curta (isto é, de meia-vida curta) podem ser administradas uma vez ao dia ou mais de uma vez ao dia (por exemplo, duas, três, quatro vezes ao dia). As composições farmacêuticas de longa atuação poderíam ser administradas a cada 3 ou 4 dias, a cada semana ou uma vez a cada duas semanas. Bombas, tais como bombas subcutâneas, intraperitoniais ou subdurais podem ser preferidas para uma infusão contínua.
Os Exemplos a seguir são fornecidos para adicionalmente ajudarem na compreensão da invenção, e pressupõem uma compreensão de métodos convencionais bem conhecidos por aquelas pessoas tendo um conhecimento comum na técnica à qual os exemplos se referem, por exemplo, a construção de vetores e plasmídeos, a inserção de polipeptídios de codificação de genes nesses vetores e plasmídeos, ou a introdução de vetores e plasmídeos em células hospedeiras. Esses métodos são descritos em detalhes em numerosas publicações, incluindo, por exemplo, Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Ansubel e cols. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1999). Os materiais e as condições em particular descritas aqui abaixo devem ser pretendidos para exemplificarem aspectos particulares da invenção, e não devem ser construídos para limitarem o escopo razoável da mesma.
Exemplo 1 Preparação e Purificação de ΡΙ3Κδ, β e δ Recombinante Os complexos heterodiméricos de PI3K recombinante, consistindo em uma subunidade catalítica pllO e uma subunidade reguladora p85 foram superexpressos usando-se o sistema de expressão de bacilovírus BAC-TO-BAC® HT (GIBCO/BRL) e, então, purificados para uso em ensaios bioquímicos. As quatro PI 3-cinases de Classe I foram clonadas em vetores de bacilovírus como se segue: 0 ρΙΙΟδ: uma versão rotulada FLAG° de ρΙΙΟδ humana (ID de SEQ N°: 1) (Veja Chantry e cols., J. Biol Chem, 212: 19236-41 (1997)) foi subclonada usando-se técnicas de DNA recombinante padrão no local BairiHl-Xbal do vetor de expressão de célula de inseto pFastbac HTb (Life Technologies, Gaithersburg, MD), de modo que o clone estivesse em quadro com o rótulo His do vetor. 0 sistema FLAG° é descrito nas Patentes U.S. 4.703.004; 4.782.137; 4.851.341 e 5.011.912, e os reagentes estão disponíveis a partir da Eastman Kodak Co. O pllOa: similar ao método usado para a ρΙΙΟδ, descrito acima, uma versão rotulada FLAG* de pllOa (veja Volinia e cols., Genomics, 24(3): 427-477 (1994)) foi subclonada em locais BamHl-HindIII do pFastbac HTb (Life Technologies, Gaithersburg, MD), de modo que o clone estivesse em quadro com o rótulo His do vetor. Ο ρΙΙΟβ: um clone ρΙΙΟβ (veja Hu e cols., Mol Cell Biol, 13: 7677-88 (1993)) foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA de baço humano MARATHON® Ready (Clontech, Paio Alto, CA) , de acordo com o protocolo do fabricante, usando-se os iniciadores a seguir: Iniciador 5' 5' - GATCGAATTCGGCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGTGCTTCAGTTTCA TAATGCCTCC-3' (ID DE SEQ N°: 3) Iniciador 3' 5'-GATCGCGGCCGCTTAAGATCTGTAGTCTTTCCGAACTGTGTG-3' (ID DE SEQ N°: 4) 0 iniciador 5' foi construído para conter um rótulo FLAG em quadro com a sequência ρΙΙΟβ. Após uma φ amplificação, a seqüência FLAG -ρΙΙΟβ foi subclonada, usando-se técnicas recombinantes padronizadas nos locais EcoRl-Notl de pFastbacHTa (Life Technologies), de modo que o clone estivesse em quadro com o rótulo His do vetor. 0 PllOy: o cDNA de ρΙΙΟγ (veja Stoyanov e cols., Science, 269: 690-93 (1995)) foi amplificado a partir de uma biblioteca de cDNA de baço humano Marathon Ready (Clontech, Paio Alto, CA) , de acordo com o protocolo do fabricante, usando-se os iniciadores a seguir: Iniciador 5' 5' - AGAATGCGGCCGCATGGAGCTGGAGAACTATAAACAGCCC-3' (ID DE SEQ N° : 5) Iniciador 3' 5'-CGCGGATCCTTAGGCTGAATGTTTCTCTCCTTGTTTG-3' (ID DE SEQ N° : 6) Um rótulo FLAG° foi subsequentemente afixado à extremidade 5' da seqüência pllOy e foi clonado nos locais BamHl-Spel do pFastbac HTb (Life Technologies), usando-se técnicas de DNA recombinante padronizadas, com a seqüência O FLAG -110γ em quadro com o rótulo His do vetor. 0 p85a: um fragmento BamHl-BcoRl de cDNA de p85 rotulado com FLAG® (veja Skolnik e cols., Cell, 65: 83-89 (1991)) foi subclonado nos locais BamHl-EcoRl do vetor pFastbac duplo Life Technologies).
Os bacilovírus recombinantes contendo os clones acima foram gerados usando-se um protocolo recomendado do fabricante (Life Technologies). Os bacilovírus expressando a subunidade catalítica ρΙΙΟα, ρΙΙΟβ ou ρΙΙΟδ rotulada His e a subunidade p85 foram co-infectadas em células de inseto Sf21. Para enriquecer o complexo de enzima heterodimérico, uma quantidade em excesso de bacilovírus expressando a subunidade p85 foi infectada, e a subunidade catalítica pllO rotulada com His complexada com p85 foi purificada na coluna de afinidade de níquel. Uma vez que a pllOy não se associa à p85, as células Sf21 foram infectadas com bacilovírus recombinantes expressando pllOy rotulada com His apenas. Em uma abordagem alternativa, a plOl pode ser clonada no bacilovírus, para permitir uma co-expressão com sua parceira de ligação preferida pllOy.
As células Sf21 infectadas após 72 horas (3 litros) foram colhidas e homogeneizadas em um tampão hipotônico (20 mM de HEPES-KOH, pH 7,8, 5 mM de KCl), coquetel inibidor de protease completa (Roche Biochemicals, Indianapolis, IN) , usando um homogeneizador Dounce. Os homogenatos foram centrifugados a 1.000 x g por 15 min. Os supernadantes foram ainda centrifugados a 10.000 x g por 20 min., seguida por uma ultracentrifugação a 1000.000 x g por 60 min. A fração solúvel foi imediatamente carregada em 10 mL de uma coluna de afinidade de níquel HITRAP® (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada com 50 mL de Tampão A (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,8, 0,5 M de NaCl, 10 mM de imidazol) . A coluna foi lavada extensamente com o Tampão A e eluída com um gradiente linear de 10-500 mM de imidazol. A subunidade p85 livre foi removida da coluna, durante a etapa de lavagem, e apenas o complexo de enzima heterodimérico eluído a 250 mM de imidazol. As alíquotas de frações de níquel foram analisadas por uma eletroforese de gel de SDS-poliacrilamida a 10% (SDS-PAGE), manchada com Vermelho SYPRO41 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) , e quantificada com STORM® Phosfolmager (Molecular Dynamics, Synnyvale, CA) . As frações ativas foram agrupadas e diretamente carregadas em uma coluna de heparina de armadilha de Hi de 5 mL pré-equilibrada com o Tampão B, contendo 50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM de NaCl, 2 mM de ditiotreitol (DTT) . A coluna foi lavada com 50 mL de Tampão B e eluída com um gradiente linear de 0,05-2 M de NaCl. Um pico único contendo complexo de enzima de PI3K eluído a 0,8 M de NaCl. A análise em gel de SDS-poliacrilamida mostrou que as frações de enzima de PI3KÔ continham um complexo estequiométrico de 1:1 de subunidades pllO e p85. O perfil de proteína do complexo de enzima, durante a cromatografia de heparina correspondeu àquele de atividade de cinase de lipídio. As frações ativas foram agrupadas e congeladas sob nitrogênio líquido.
Exemplo 2 Triagem de Alta Produção de ΡΙ3Κδ (HTS) e Ensaio de Seletividade Uma triagem de alta produção de uma biblioteca química proprietária foi realizada, para a identificação de inibidores candidatos de atividade de ΡΙ3Κδ. A ΡΙ3Κδ catalisa uma fosfotransferência de lipossomas γ- [32P]ATP para PIP2/PS na posição D3' do anel de inositol de lipídio PIP2. Esta reação é dependente de MgCl2 e é resfriada em um tampão de fosfato de potássio de alta molaridade com pH 8,0 contendo 30 mM de EDTA. Na triagem, esta reação é realizada na presença ou na ausência de compostos de biblioteca. Os produtos de reação (e todos os produtos não rotulados) são transferidos para uma placa de filtro de PVDF pré-umedecida de 96 poços, filtrados e lavados em fosfato de potássio de alta molaridade. Cintilante é adicionado aos poços secos e a radioatividade incorporada é quantificada. A maioria das operações de ensaio foi realizada usando-se estações de trabalho robóticas BIOMEK* 1000 (Beckman) e todas as placas foram lidas usando-se protocolos de contador de placa de cintilação de líquido de Wallac.
Os estoques de ensaio 3X de substrato e enzima foram feitos e armazenados em uma cuba (para ensaios robóticos) ou uma placa de 96 poços, de fundo em V, de polipropileno (para ensaios manuais). Os reagentes eram estáveis por pelo menos 3 horas à temperatura ambiente. 0 substrato 3X para o HTS continha 0,6 mM de Na2ATP, 0,10 mCi/mL de γ-[32P]ATP (NEN, Pittsburgh, PA), 6 μΜ de lipossomas PIP2/PS (Avanti Polar Lipids, Inc., Atlanta, GA), em 20 mM de HEPES, pH 7,4.
As amostras de biblioteca de triagem de alta produção (HTS) química (cada uma contendo um grupo de 22 compostos) em sulfõxido de dimetila (DMSO) foram diluídas para 18,75 μΜ ou 37,8 μΜ em água duplamente destilada, e 20 μ]1 de diluições foram colocados nos poços de uma placa de polipropileno de 96 poços para ensaio. O controle de inibidor negativo (ou controle de enzima positivo) foi DMSO diluído em água, e os controles de inibidor positivo empregaram concentrações de LY294002 suficientes para a provisão de 50% e 100% de inibição.
Aos 20 μΏ de diluições de biblioteca de produto químico agrupado, 2 0 μΙ> de substrato 3X foram adicionados. A reação foi iniciada com 20 μΐ, de enzima 3X, incubada à temperatura ambiente, por 10 minutos. Esta diluição estabeleceu uma concentração final de 200 μΜ ATP no volume de reação. A, reação foi parada com 150 μΏ de tampão de resfriamento (1,0 M de fosfato de potássio, pH 8,0, 30 mM de EDTA). Uma porção da solução resfriada (180 μΐΟ , então, foi transferida para uma placa de filtro de PVDF (Millipore #MAIP NOB pré-umedecido com lavagens sequenciais de 2 00 μί de metanol a 100%, água e, finalmente, tampão de lavagem de 1,0 M de fosfato de potássio, pH 8,0). A placa de filtro de PVDF foi aspirada sob vácuo moderado (266,6 a 666,6 Pa), lavada com 5 x 200 μΐι de tampão de água e, então, seca por aspiração. 0 filtro foi subseqüentemente manchado, deixado secar ao ar completamente, e inserido em um cassete de contagem de Wallac com 50 μΙ> de coquetel de cintilação Ecoscient adicionados por poço. A radioatividade incorporada foi quantificada e os dados foram analisados, após normalização para o controle positivo de enzima (regulado a 100%), para a identificação da interseção de curva no valor de inibição de 50%, para se estimarem valores de IC50 para os inibidores.
Um total de 57 poços mestres agrupados foi selecionado para desconvolução, com base nos critérios combinados de <42% de atividade residual na concentração testada, e uma taxa de acerto aceita total de não mais do que 0,2%. Em 22 compostos por poço, 1254 compostos no total foram identificados através desta convolução e individualmente ensaiados na concentração IX de 27,7 μΜ, para a identificação de quais compostos apresentavam a atividade desejada. A partir desses ensaios, 73 compostos foram selecionados e ensaiados adicionalmente, para o desenvolvimento das curvas de IC50. A partir dos resultados da curva de IC50, 34 compostos foram selecionados para ensaios de seletividade contra PI3Ka e ΡΙ3Κβ (veja o protocolo de ensaio no Exemplo 11). A partir dos ensaios de seletividade, um composto, 3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (Composto D-000), foi selecionado como sendo um composto relativamente potente e seletivo. Pesquisas em catálogo e ensaios de seletividade de muitos compostos análogos dos acertos potentes e/ou seletivos levaram apenas a um composto que era um análogo ativo e seletivo de D-000. Este composto foi comprado da Contract Services Corporation (N° de Catálogo 7232154) e diferia do D-000 na substituição de um grupo fenila pelo grupo 2-clorofenila de D-000.
Como descrito acima, o inibidor de PI 3-cinase LY294002 (Calbiochem, La Jolla, CA) não tem seletividade significativa dentre as diferentes isoformas de PI 3-cinase testadas. Sob nossas condições de ensaio, o LY294002 inibiu todas as três isoformas de PI 3-cinases com uma IC50 de 0,3 a 1 μΜ. Entretanto, quando o composto D-000 foi testado contra as mesmas isoformas de PI 3-cinase, uma seletividade distinta foi observada. Especificamente, como mostrado na Figura 1, D-000 inibiu a atividade da isoforma δ de PI3K com uma IC50 de aproximadamente 0,3 μΜ, ao passo que, sob condições similares, ele não inibiu as atividades das isoformas α e β a um limite de 100 μΜ de composto. Esses resultados mostram que D-000 seletivamente inibe a atividade de PI3KÔ.
Exemplos 3 A 7 Uma vez que ΡΙ3Κδ é expressa em níveis significativos apenas em leucócitos, é importante estudar os efeitos do inibidor seletivo de ΡΙ3Κδ funções de leucócitos. Assim sendo, os efeitos de inibidor de ΡΙ3Κδ em vários tipos de leucócitos foram examinados. Os neutrófilos foram examinados, para se determinarem os efeitos que a inibição seletiva de Ρΐ3Κδ podería eliciar (Exemplo 3, abaixo). Surpreendentemente, descobriu-se que a inibição seletiva de atividade de PI3KÔ parece estar significativamente associada à inibição de algumas, mas não todas as funções características de neutrófilos ativados. Além disso, os efeitos de inibição de ΡΙ3Κδ sobre a função de célula B e de célula T também foram testados (Exemplos 4 a 5, abaixo). Mais ainda, como PI3KÔ também é expressa em osteoclastos, o efeito de inibição de PI3KÔ sobre a função dessas células especializadas foi estudado (Exemplo 6, abaixo).
Exemplo 3 Caracterização do Papel de PI3K5 na Função de Neutrófilos Os efeitos de um inibidor de ΡΙ3Κδ da invenção, isto é, D-000, sobre funções de neutrófilos, tais como a geração de superóxido, a exocitose de elastase, quimiotaxia e matança bacteriana, foram testados. A. Preparação de Neutrófilos a partir de Sangue Humano Alíquotas (8 mL) de sangue heparinizado de voluntários saudáveis foram depositados em camadas em 3 mL em almofadas de 7,3% de FICOLL° (Sigma, St. Louis, MO) e 15,4% de HYPAQUE® (Sigma) e centrifugadas a 900 rpm, por 30 min., à temperatura ambiente, em uma centrífuga de topo de mesa (Beckman). A banda rica em neutrófilo imediatamente acima da almofada de FICOLL®-HYPAQE® foi coletada e lavada com uma solução de sal balanceada de Hank (HBSS) contendo 0,1% de gelatina. Os eritrócitos residuais foram removidos por lise hipotônica com NaCl a 0,2%. A preparação de neutrófilo foi lavada duas vezes com HBSS contendo 0,1% de gelatina e usada imediatamente. B. Medição de Produção de Superóxido a partir de Neutrófilos A geração de superóxido é uma das marcas de qualidade de ativação de neutrófilo. Uma variedade de ativadores potencializa a geração de superóxido por neutrófilo. O efeito do inibidor de PI3KÔ D-000 sobre a geração de superóxido por três agonistas diferentes: TNFla, IgG e fMLP, cada um representando classes separadas de ativador, foi medida. O superóxido gerado por neutrófilos foi medido pela monitoração da mudança na absorbância mediante uma redução do citocromo C pela modificação do método descrito por Green e cols. (pp. 14.5.1-14.5.11 em Supp. 12, Curr Protocols Immunol (Eds. Colligan e cols.) (1994)), como se segue. Poços individuais de uma placa de 96 poços foram revestidos, durante a noite, a 4 °C, com 50 ixh de e mg/mL de solução de fibrinogênio humano ou IgG. Os poços foram lavados com PBS e os reagentes a seguir foram adicionados a cada poço: 50 μΐι de HBSS ou dismutase de superóxido (1 mg/mL) , 50 μL de HBSS ou TNFla (50 ng/mL) , 50 μΏ de citocromo C (2,7 mg/mL) e 100 μΙ* de suspensão de neutrófilo humano purificado (2 x 106 células/mL). A placa foi centrifugada por 2 min a 200 rpm e a absorbância a 550 nm foi monitorada por 2 h. Para a medição das quantidades relativas de superóxido gerado, os valores obtidos a partir dos poços contendo dismutase de superóxido foram subtraídos de todos, e normalizados para os valores obtidos a partir dos poços sem qualquer inibidor.
Como mostrado na Figura 2, o inibidor de PI3KÔ D-000 inibe a geração de superóxido induzida por TNF por neutrófilos de uma maneira dependente de concentração. A geração de superóxido induzida por TNF foi reduzida para a metade do seu valor máximo em cerca de 3 μΜ de D-000. A Figura 2 também revela que a geração de superóxido induzida por IgG não foi significativamente inibida por D-000. De fato, mesmo a 10 μΜ, este inibidor de PI3KÔ não teve qualquer efeito sobre a geração de superóxido induzida por IgG.
Em seguida, o efeito de D-000 na geração de superóxido induzida por um outro indutor potente, o peptídio bacteriano, Met-Leu-Phe formilatado (fMLP) foi estudado.
Como a geração de superóxido induzida por TNF, a geração de superóxido induzida por fMLP também foi inibida por D-000 (Figura 3) . Esses resultados mostram que o inibidor de PI3KÔ D-000 pode impedir uma indução específica de estímulo de geração de superóxido por neutrófilos, indicando que a PI3KÔ está envolvida neste processo. C. Medição de Exocitose de Elastase a partir de Neutrófilos Além da geração de superóxido, os neutrófilos ativados também respondem pela liberação de várias proteases, que são responsáveis pela destruição de tecidos e cartilagem, durante uma inflamação. Como uma indicação de liberação de protease, o efeito de D-000 sobre a exocitose de elastase foi medido. A exocitose de elastase foi quantificada pela modificação do procedimento descrito por Ossanna e cols. (J Clin Invest, 77: 1939-1951 (1986)), como se segue.
Neutrófilos humanos purificados (0,2 x 106) (tratados com DMSO ou uma diluição serial de D-000 em DMSO) foram estimulados com fMLP em PBS, contendo 0,01 mg/mL de L-metionina e 1 μΜ de fMLP, por 90 min a 37 °C, em uma placa de 96 poços. No final do período de incubação, a placa foi centrifugada por 5 min a 100 rpm, e 90 ^L do supernadante foram transferidos para 10 ftL de 1 mM de solução de um peptídio de substrato de elastase, MeO-suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA, onde Meo-suc = metóxi-succinil; pNA = p-nitroanilida (Calbiochem, San Diego, CA) . A absorbância a 410 nm foi monitorada por 2 h em uma leitora de placa de 96 poços. Para a medição das quantidades relativas de exocitose de elastase, todos os valores de absorbância foram normalizados para os valores em qualquer inibidor. Como mostrado na Figura 4, o inibidor de ΡΙ3Κδ D-000 inibe a exocitose de elastase induzida por fMLP significativamente, e o faz de uma forma dependente de dose. A inibição foi metade da máxima a uma concentração de cerca de 2 a 3 μΜ D- 000.
D. Medição de Migração de Neutrófilo Humano Induzida por fMLP
Os neutrófilos têm uma capacidade intrínseca de migrarem através de tecidos, e são um dos primeiros tipos de célula a chegarem nos locais de inflamação ou de dano a tecido. 0 efeito de D-000 sobre a migração de neutrófilo em direção a um gradiente de concentração de fMLP foi medido. No dia anterior aos ensaios de migração serem realizados, placas de 6 poços foram revestidas com proteína de fusão recombinante ICAM-l/Fc (Van der Vieren e cols., Iimunity, 3: 683-690 (1995)) (25 μg/mL em tampão de bicarbonato, pH 9,3) e deixadas durante a noite a 4 °C. Após a lavagem, uma solução de agarose a 1% em RPMI-1640 com albumina de soro bovino (BSA) a 0,5%, foi adicionada aos poços com ou sem um inibidor, e as placas foram colocadas em um refrigerador, antes do puncionamento de orifícios na agarose geleificada, para a criação de placas (1 orifício central circundado por 6 periféricos por poço).
Os neutrófilos humanos foram obtidos como descrito acima, e recolocados em suspensão em um meio de RPMI suplementado com BSA a 0,5% em 5 x 106 células/mL. Após a combinação de volumes iguais de suspensão de neutrófilo e meio (com DMSO ou uma diluição serial do composto de teste em DMSO), os neutrófilos foram distribuídos nos orifícios periféricos, enquanto o orifício central recebeu fMLP (5 μΜ). As placas foram incubadas a 37 “C na presença de 5% de C02 por 4 h, seguido pela terminação de migração pela adição de uma solução de glutaraldeído a 1% em D-PBS. Após a remoção da camada de agarose, os poços foram lavados com água destilada e secos.
Uma análise de migração de neutrófilo foi conduzida em uma estação de trabalho de vídeo de microscópio invertido Nikon DIAPHOT0 (objetiva de lx) . Usando-se os programas Microsoft Excel e Table Curve 4 (SSPS, Inc., Chicago, IL), um índice de migração foi obtido para cada uma das condições estudadas. 0 índice de migração foi definido como a área sob uma curva representando um número de neutrófilos migrados versus a distância líquida de migração por célula.
Como mostrado na Figura 5, o inibidor de ΡΙ3Κδ D-000 teve um efeito profundo sobre a migração de neutrófilo. A EC50 deste composto para inibição de migração de neutrófilo neste ensaio é de cerca de 1 μΜ. Com base em uma inspeção visual dos percursos registrados das células neste ensaio. Parece que o comprimento de percurso total para os neutrófilos não foi significativamente afetado pelo composto de teste. Ao invés disso, o composto afetou a orientação ou o sentido de direção do neutrófilo, de modo que ao invés de migrar ao longo do eixo do gradiente quimio-atrativo, as células migraram de uma maneira não direcionada ou menos direcionada. E. Medição de Capacidade Bacteriana de Neutrófilos Dado que o inibidor de ΡΙ3Κδ D-000 afeta certas funções de neutrófilo detalhadas acima, foi de interesse ver se o composto afeta a matança de bactérias mediada por neutrófilos. 0 efeito de D-000 sobre a matança de Staphylococcus aureus mediada por neutrófilo foi estudado, de acordo com o método descrito por Clark e Nauseef (pp. 7.23.4-7.23.6 em Vol. 2, Supp. 6, Curr Protocols Inununol (Eds., Colligan e cols.) (1994)). Os neutrófilos humanos purificados (5 x 106 células/ mL) (tratados com DMSO ou uma diluição serial de D-000 em DMSO) foram misturados com soro autólogo. Crescidas durante a noite, as células de S. aureus foram lavadas, recolocadas em suspensão em HBSS e adicionadas aos neutrófilos opsonizados em soro a uma relação de 10:1. Os neutrófilos foram deixados internalizar as bactérias por fagocitose por incubação a 37 °C, por 20 min. As bactérias não internalizadas foram mortas por 10 unidades/mL de lisostafina a 37 °C, por 5 min, e a mistura total foi girada a 37 °C. As amostras foram retiradas em vários momentos, por até 90 min, e os neutrófilos foram lisados por diluição em água. As bactérias viáveis foram contadas pela colocação de diluições apropriadas em uma placa de tripticase-soja-agar e contando-se as colônias de S. aureus, após o crescimento durante a noite.
Como mostrado na Figura 6, a matança mediada por neutrófilo de S. aureus foi similar em amostras tratadas com DMSO (controle) e com D-000. Esses resultados indicam que o inibidor de Ρΐ3Κδ não afeta significativamente a capacidade dos neutrófilos de matarem S. aureus, sugerindo que a ΡΙ3Κδ não está envolvida neste percurso de função de neutrófilo.
Exemplo 4 Caracterização do Papel de ΡΙ3Κδ na Função de Linfócito B
Os efeitos do inibidor de PI 3-cinase sobre as funções de célula B, incluindo índices clássicos, tais como produção de anticorpos e proliferação induzida por estímulo específico, também foram estudados. A. Preparação e Estimulação de Células E a partir de Sangue Humano Periférico.
Sangue heparinizado (200 mL) de voluntários saudáveis foi misturado com igual volume de D-PBS, depositado em camadas em 10 x 10 mL de FICOLL-PAQUE* (Pharmacia), e centrifugado a 1600 rpm, por 30 min, à temperatura ambiente. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram coletadas a partir da interface de FICOLL® / soro, sobrepostas em 10 mL de soro bovino fetal (FBS) e centrifugadas a 800 rpm por 10 min, para a remoção de plaquetas. Após a lavagem, as células foram incubadas com Mistura de Anticorpo DYNAL® (kit de célula B) (Dynal Corp., Lake Success, NY) por 20 min a 4-8 °C. Seguindo-se à remoção de anticorpo não ligado, PBL foram misturados com contas magnéticas revestidas com igG anticamundongo (Dynal) por 20 min a 4-8 °C com uma agitação suave, seguido pela eliminação de células não B rotuladas no separador de conta magnética. Este procedimento foi repetido mais uma vez. As células B foram recolocadas em suspensão em RPMI-1640 com FBS a 10%, e mantidas em gelo até um uso posterior. B. Medição de produção de anticorpo por células B humanas Para estar a produção de anticorpos, as células B foram distribuídas a 50-75 x 103 células/poço em uma placa de 96 poços com ou sem inibidor, à qual IL-2 (100 U/mL) e células de Staphylococcus aureus (1:90.000) PANSORBIN® (Calbiochem) foram adicionados. Parte do meio foi removido após 24 a 36 horas, e um meio novo (com ou sem inibidor) e IL-2 foram adicionados. As culturas foram incubadas a 37 °C, na presença de um incubador de C02, por 7 dias adicionais. As amostras de cada condição (em triplicata) foram removidas e analisadas quanto a IgG e IgM, como medido por ELISA. Brevemente, 4 placas de 96 poços de IMMULON® foram revestidas (50 μΐι/ροςο) com 150 ng/mL de IgG anti-humano de macaco (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove PA) , ou 2 μg/mL de IgG+IgM anti-humano de macaco (H+L) (Jackson ImmunoResearch) em tampão de bicarbonato, e deixadas durante a noite a 4 °C. Após uma lavagem 3x com salina com tampão de fosfato contendo 0,1% de TWEEN®-80 (PBST) (350 ^L/poço) e bloqueando com soro de cabra a 3% em PBST (100 μΐι/poço) por 1 hora à temperatura ambiente, as amostras (100 μΐι/ροςο) de meio gasto de célula B diluído em PBST foram adicionadas. Para placas de IgG, a faixa de diluição foi de 1:500 a 1:10000, e para IgM 1:50 a 1:1000. Após 1 h, as placas foram expostas a IgG anti-humano conjugado com biotina (100 ng/mL) ou IgM anti-humano (Jackson ImmunoResearch) por 30 min, seguido por estreptavidina-HRP (1:20000) por 30 min e, finalmente, uma solução de TMB (1:100) com H202 (1 : 10000) por 5 min, com uma lavagem com PBST 3 x entre as etapas. 0 desenvolvimento de cor foi parado por uma solução de H2S04, e as placas foram lidas em uma leitora de placa de ELISA.
Como mostrado na Figura 7, o D-000 significativamente inibiu a produção de anticorpos. A produção de IgM foi mais afetada do que a produção de IgG: uma inibição metade da máxima de IgM foi observada a cerca de 1 μΜ, versus cerca de 7 μΜ para uma inibição comparável de produção de IgG. C. Medição de Proliferação de Célula B em resposta a um estímulo de IgM de superfície de célula No experimento acima, as células B foram estimuladas usando-se PANSORBIN®. O efeito de D-000 sobre a resposta de proliferação de célula B, quando elas foram estimuladas através de seu IgM de superfície de célula usando-se um anticorpo anti-IgM, também foi medido. Esplenócitos de murino (Balb/c) foram depositados nas placas de microtítulo de 96 poços a 2 x 105 células por poço em FBS/RMPI a 10%. Diluições apropriadas do inibidor de teste foram incubadas por de 3 0 a 6 minutos, antes da adição do estímulo. Seguindo-se à pré-incubação com o inibidor de teste, uma preparação de F(ab')2 de anticorpo de cabra específico para μ-cadeia de IgM de camundongo foi adicionado aos poços em uma concentração final de 25 μg/mL. As placas foram incubadas a 37 °C, por 3 dias, e 1 μ(3ί de [3H]-timidina foi adicionado a cada poço, pelas quatro horas finais de cultura. As placas foram coletadas em filtros de fibra, lavadas, e a incorporação de rãdio-rótulo foi determinada usando-se um contador beta (Matrix 96, Packard Instrument Co., Downers Grove, IL) e expressas como contagens por minuto (CPM). A Figura 8 mostra o efeito de D-000 sobre a proliferação estimulada por anti-IgM de células B. 0 composto inibiu a proliferação de células B estimulada por anti-IgM de uma maneira dependente de dose. A cerca de 1 μΜ, a proliferação foi reduzida para seu valor metade do máximo.
Devido ao fato de o composto D-000 inibir a proliferação de célula B, é divisado que este composto e outros inibidores de ΡΙ3Κδ possam ser usados para a supressão de uma proliferação indesejável de células B em procedimentos clínicos. Por exemplo, na malignidade de células B, células B de vários estágios de diferenciação mostram uma proliferação não regulada. Com base nos resultados mostrados acima, pode-se inferir que os inibidores seletivos de ΡΙ3Κδ poderíam ser usados para controlar, limitar ou inibir o crescimento dessas células. EXEMPLO 5 Caracterização do Papel de ΡΙ3Κδ na Função de Linfócito T A proliferação de célula T em resposta a um co-estímulo de CD3+CD28 foi medida. As células T foram purificadas a partir de um sangue humano saudável por uma seleção negativa, usando contas magnéticas revestidas com anticorpo, de acordo com o protocolo do fabricante (Dynal) e recolocadas em suspensão em RPMI. As células foram tratadas com DMSO ou uma diluição serial de D-000 em DMSO e depositadas a 1 x 105 células/poço em uma placa de 96 poços pré-revestida com IgG anticamundongo de cabra. Os anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 monoclonais de camundongo, então, foram adicionados a cada poço a 0,2 ng/mL e 0,2jug/mL, respectivamente. A placa foi incubada a 37 °C, por 24 horas, e [3H]-timidina (1 μ(3ι / poço) adicionada.
Após outras 18 horas de incubação, as células foram coletadas com um coletor de célula automático, lavadas, e a radioatividade incorporada foi quantificada.
Embora o inibidor de ΡΙ3Κδ D-000 inibisse a proliferação induzida por anti-CD3 e anti-CD28 de células T, seu efeito não é tão forte quanto seu efeito sobre as células B ou em algumas das funções de neutrófilos. A inibição metade da máxima de incorporação de timidina não foi obtida na concentração testada mais alta, isto é, 10 μΜ de D-000. EXEMPLO 6 Caracterização do Papel de ΡΙ3Κδ na Função de Osteoclasto Para análise do efeito do inibidor de ΡΙ3Κδ D-000 sobre osteoclastos, células de medula óssea de camundongo foram isoladas e diferenciadas para osteoclastos, pelo tratamento das células com um Fator de Estimulação de Colônia de Macrófago'1 (mCSF"1) e Ligante de Osteoprotegerina (OPGL) em um meio contendo soro (aMEM com 10% de FBS inativado por calor; Sigma) por 3 dias. No quarto dia, quando os osteoclastos tinham se desenvolvido, o meio foi removido e as células foram coletadas. Os osteoclastos foram depositados em fatias de dentina a 105 células/poço em meio de crescimento, isto é, aMEM contendo soro a 1% e BSA a 2% com 55 μg/mL de OPGL e 10 ng/mL de mCSF-1. Após 3 h, o meio foi mudado para soro a 1% e BSA a 1%, com ou sem osteopontina (25 ^g/mL) e os inibidores de ΡΙ3Κδ (100 nM) . O meio foi mudado a cada 24 horas com ostepontina nova e os inibidores. Em 72 h, o meio foi removido, e as superfícies de dentina foram lavadas com água, para remoção de resíduo de célula e manchadas com hematoxilina ácida. A mancha em excesso foi lavada e as profundidades de furo foram quantificadas, usando-se microscopia confocal.
Como mostrado na Tabela 1, em dois experimentos, os inibidores de PI 3-cinase tiveram um efeito inibidor sobre a função de osteoclasto. Ambos os inibidores não específicos LY294002 e wortmannin inibiram a atividade de osteoclasto. Entretanto, o inibidor de ΡΙ3Κδ D-000 teve o efeito mais profundo, uma vez que a 100 nM este composto inibiu, de forma praticamente completa, a atividade de osteoclasto. EXEMPLO 7 Caracterização do Papel de ΡΙ3Κδ na Função de Basófilo A avaliação do efeito de um composto da invenção sobre a função de basófilo foi testada usando-se um ensaio de liberação de histamina convencional, geralmente de acordo com o método descrito em Miura e cols., J Iimunol, 162: 4198-206 (1999). Brevemente, basõfilos enriquecidos foram pré-incubados com compostos de teste a várias concentrações, de 0,1 nM até 1.000 nM, por 10 min a 37 °C. Então, IgE anti-humano de cabra policlonal (0,1 /xg/mL) ou fMLP foi adicionado, e deixado incubar por 30 min adicionais. A histamina liberada no supernadante foi medida, usando-se uma técnica fluorométrica automática. Dois compostos foram testados, mostrados abaixo.
Uma diminuição dependente de dose na liberação de histamina foi observada para 3-(2-clorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-026), quando os basófilos foram estimulados com anti-IgE. Esta supressão de liberação de histamina foi essencialmente de 100% a 1.000 nM, com uma EC50 de cerca de 25 nM. Um outro composto, 3-(2-clorofenil)-2-(lH-pirazolo[3,4-d]pirimidin- 4-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-099), no qual a estrutura do anel de purina é rearranjada, foi menos eficaz na inibição da liberação de histamina. Nenhum composto eliciou qualquer efeito quando os basófilos foram estimulados com fMLP. Para comparação, o inibidor de ΡΙ3Κδ não seletivo LY294002 foi testado a 0,1 nM e 10.000 nM, mostrando próximo de 100% de inibição de liberação de histamina na concentração mais alta.
Esses dados indicam que inibidores de atividade de delta PI 3-cinase podem ser usados para supressão de liberação de histamina, a qual é um dos mediadores de alergia. Uma vez que a atividade de várias PI 3-cinases é requerida para o tráfego de proteína, secreção e exocitose em muitos tipos de célula, os dados acima sugerem que a liberação de histamina por outras células, tais como mastócitos, também pode ser interrompida pelos inibidores seletivos de delta PI 3-cinase.
EXEMPLOS DE SÍNTESE QUÍMICA
Os exemplos específicos não limitativos de compostos da invenção são providos abaixo. É compreendido na técnica que grupos de proteção podem ser empregados quando necessário, de acordo com os princípios gerais de química sintética. Esses grupos de proteção são removidos nas etapas finais da síntese, sob condições básicas, acídicas ou hidrogenolíticas, prontamente evidentes para aquelas pessoas versadas na técnica. Pelo emprego de uma manipulação apropriada e de proteção de quaisquer funcionalidades químicas, a síntese de compostos de fórmula estrutural (I) não especificamente estabelecida aqui pode ser realizada por métodos análogos aos esquemas estabelecidos abaixo. A menos que estabelecido de outra forma, todos os materiais de partida foram obtidos a partir de fornecedores comerciais e usados sem uma purificação adicional. Todas as reações e as frações de cromatografia foram analisadas por cromatografia de camada fina (TLC) em placas de 250 mm de sílica gel, visualizadas com luz ultravioleta (UV) ou mancha de iodo (I2) . Os produtos e os intermediários foram purificados por cromatografia rápida ou cromatografia de líquido de alta performance de fase reversa.
As abreviações a seguir foram usadas nos exemplos sintéticos: aq (aquosa), H20 (água), CHC13 (clorofórmio), HCl (ácido clorídrico), MeOH (metanol), NaOH (hidróxido de sódio), NaOMe (metóxido de sódio), TFA (ácido trifluoroacético) , K3C03 (carbonato de potássio), S0C12 (cloreto de tionila), CH2C12 (cloreto de metileno), EtOAC (acetato de etila), DMF (dimetilformamida), EtOH (etanol), DMSO (sulfóxido de dimetila), NaHC03 (bicarbonato de sódio), TLC (cromatografia de camada fina), HPLC
(cromatografia de líquido de alta performance), HOBT (hidroxibenzotriazol), EDC
(etildietilaminopropilcarbodiimida), DIEA (diisopropiletilamina) e HOAc (ácido acético).
I. Procedimentos Gerais Procedimento A
Cloreto de tionila foi adicionado a uma solução de agitação rápida de ácido antranílico ou ácido benzóico em benzeno, e a mistura foi agitada em refluxo por de 5 a 18 horas. A reação foi concentrada in vacuo, e extraída duas vezes com benzeno. 0 óleo resultante foi dissolvido em CHC13 e àquela solução foi adicionada a anilina apropriada. A mistura de reação foi aquecida para refluxo e agitada até se completar, como determinado por TLC, ponto esse em que a mistura de reação foi resfriada para a temperatura ambiente. 0 precipitado foi removido por filtração, e o filtrado concentrado in vacuo. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia e/ou recristalização a partir de MeOH, para prover amidas la-lr.
Procedimento B A uma suspensão de agitação rápida de uma amida em ácido acético glacial foi adicionado cloreto de cloro acetila. A mistura de reação foi aquecida até 120 °C, e deixada agitar naquela temperatura, até se completar, como determinado por TLC. Após um breve resfriamento, a mistura de reação foi concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado por extração, cromatografia e/ou recristalização, para prover cloretos 2a-2r.
Procedimento C
Uma mistura de cloreto, um nitrogênio ou um nucleófilo de nitrogênio ou enxofre, por exemplo, monoidrato de mercaptopurina ou adenina, e K2C03 em DMF, foi agitada à temperatura ambiente, por de 15 a 72 horas. A suspensão resultante foi vazada em água e mantida a 4 °C, por várias horas. 0 sólido bruto foi filtrado, lavado com água e purificado por cromatografia ou recristalização, para prover os produtos finais. EXEMPLO 8 Preparação de Compostos Intermediários: Amidas 2-amino-N-(2-clorofenil)-4,5-dimetoxibenzamida (la) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 4,5-dimetoxiantranílico (5,0 g, 25,4 mmol) e S0C12 (5,5 mL, 76,1 mmol) em benzeno (100 mL) , seguido por 2-cloroanilina (6,7 mL, 63,5 mmol) e CHC13 (75 mL). 0 produto foi lavado com NaHC03 aquoso (2 x 25 mL) e HCl (0,5 M, 75 mL) e purificado por cromatografia em CH2C12, para prover 4,3 g de uma espuma marrom (55%). XH NMR (CDC13) δ: 8,42 (dd, J = 1,5, 8.3 Hz, 1H) ; 8,32 (br s, 1H) ; 7,40 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H); 7,31 (dt, J = 1,4, 7,9 Hz, 1H); 7,05 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 7,03 (s, 1H) ; 6,24 (s, 1H) ; 3,88 (s, 3H); 3,87 (s, 3H), MS (ES): m/z 307, 0 (M+) . 2-Amino-5-bromo-N-(2-clorofenil)benzamida (lb) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-5-bromobenzênico (5,0 g, 23,1 mmol) e SOCl2 (7,0 mL, 95,9 mmol) em benzeno (50 mL) , seguido por 2-cloroanilina (7,3 mL, 69,3 mmol) e CHC13 (50 mL). O produto foi purificado por duas cromatograf ias em CH2C12, para prover 1,48 g de um sólido laranja (20%) . ΧΗ NMR (CDC13) δ: 8,36 (dd, J = 1,2, 8,2 Hz, 1H) ; 8,20 (br s, 1H) ; 7,62 (d, J = 2,1 Hz, 1H) ; 7,42 (dd, J = 1,3, 8,0 Hz, 1H) ; 7,34 (dd, J = 2,2, 8,8 Hz, 1H); 7,28-7,33 (m, 1H) ; 7.09 (dt, J = 1,4, 7,7 Hz, 1H); 6,62 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 5,57 (br s, 2H). 2-Amino-N-(2-clorofenil)-4-fluorobenzamida (lc) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-4-fluorobenzóico (1,15 g, 7,41 mmol) e SOCl2 (1,4 mL, 18,5 mmol) em benzeno (25 mL) , seguido por 2- cloroanilina (1,6 mL, 14,8 mmol) e CHC13 (25 mL). 0 produto foi cromatografado em CH2C12, então, triturado a partir de hexanos, para prover 1,02 g de um sólido inteiramente branco (52%). ^ NMR (CDC13) δ: 12,91 (br s, 1H); 8,72 (dd, J = 2,7, 12 Hz, 1H); 8,34 (dd, J = 6,4, 9,2 Hz, 1H) ; 8,29 (dd, J = 5,9, 8,8 Hz, 1H); 7,81 (dd, J = 6,2, 8,8 Hz, 1H); 7,28 (dt, J = 2,4, 8,4 Hz, 1H); 7,21 (dd, J = 2,4, 9,0 Hz, 1H) ; 6,92 (ddd, J = 2,4, 7.3, 9,1 Hz, 1H) ; 6,54 (ddd, J = 2,4, 7,8, 8,8 Hz, 1H); 6,45 (dd, J = 2,4, 11Hz, 1H); 5,93 (br s, 2H), MS (ES): m/z 265,0 (M+) . 2-Amino-5-cloro-N-(2-clorofenil)benzamida (ld) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-5-clorobenzóico (2,0 g, 11,7 mmol) e S0C12 (2,2 mL, 2 9,2 mmol) em benzeno (50 mL) , seguido por 2- cloroanilina (2,5 mL, 23,3 mmol) e CHC13 (50 mL) . O produto foi purificado por recristalização a partir de MeOH para prover 1,72 g de um sólido amarelo escuro (52%). 1H NMR (CDCI3) δ: 8,37 (dd, J = 1,5, 8,3 Hz, 1H) ; 8,22 (br s, 1H); 7,48 (d, J = 2,3 Hz, 1H) ; 7,42 (dd, J = 1,5, 8,1 Hz, 1H) ; 7,31 (dt, J = 1,4, 7,8 Hz, 1H); 7,22 (dd, J = 2,4, 8,8 Hz, 1Η); 7,09 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 6,67 (d, J = 8,8 Hz, 1H); 5,56 (br S, 2H). 2-Amino-N-(2-clorofenil)-6-fluorobenzamida (le) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-6-fluorobenzóico (2,0 g, 12,9 mmol) e SOCl2 (2,3 mL, 32,2 mmol) em benzeno (50 mL) , seguido por 2- cloroanilina (2,7 mL, 25,8 mmol) e CHC13 (50 mL) . O produto foi purificado por cromatografia em EtOAc/hexanos, prover 2,06 g de um sólido laranja pálido (60%). 1H NMR (CDCI3) Ô: 9,00 (d, J = 17 Hz, 1H); 8,47 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 7,41 (d, J = 8,0 Hz, 1H) ; 7,30 (t, J = 7,9 Hz, 1H) ; 7,10-7,20 (m, 1H) ; 7,07 (t, J = 7,7 Hz, 1H) ; 6,49 (d, J = 8,3 Hz, 1H) ; 6,03 (br s, 2H). MS (ES): m/z 265,0 (M+). 2-Amino-6-cloro-N-(2-clorofenil)benzamida (lf) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-6-clorobenzóico (2,5 g, 14,6 mmol) e SOCl2 (2,7 mL, 36,4 mmol) em benzeno (75 mL) , seguido por 2- cloroanilina (3,1 mL, 29,1 mmol) e CHC13 (75 mL). O produto foi cromatografado em CH2C12, para prover 1,05 g de um sólido amarelo alaranjado (26%). 1H NMR (CDC13) δ: 8,54 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 8,30 (br s, 1H) ; 7,41 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz, 1H) ; 7,33 (t, J = 7,8 Hz, 1H) ; 7,10 (t, J = 8,1 Hz, 1H); 7,09 (dt, J = 1,6, 7,8 Hz, 1H); 6,78 (dd, J = 0,4, 7,9 Hz, 1H) ; 6,63 (dd, J = 0,9, 8,2 Hz, 1H) ; 4,69 (br s, 2H) . Ms (ES): m/Z 303,0 (M + 22), 281,0 (M+). 2-Amino-N-(2-clorofenil)-6-metilbenzamida (lg) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-6-metilbenzóico (2,5 g, 16,5 mmol) e S0C12 (3,0 mL, 41,3 mmol) em benzeno (75 mL) , seguido por 2-cloroanilina (3,5 mL, 33,0 mmol) e CHC13 (75 mL) . O produto foi cromatografado em CH2C12, para prover 2,19 g de um óleo marrom (51%). XH NMR (CDC13) δ: 8,58 (d, J - 8,1 Hz, 1H) ; 7,99 (br s, 1H); 7,40 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H); 7,34 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,11 (t, J = 7,8 Hz, 1H) ; 7,09 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 6,64 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 6,59 (d, J = 8,1 Hz, 1H) ; 4,29 (br s, 2H) ; 2,45 (s, 3H) . MS (ES): m/z 283,0 (M+22). 2-Amino-3-cloro-N-(2-clorofenil)benzamida (lh) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-3-clorobenzõico (1,0 g, 5,82 mmol) e S0C12 (1,1 mL, 14,6 mmol) em benzeno (25 mL) , seguido por 2- cloroanilina (1,2 mL, 11,7 mmol) e CHC13 (25 mL) . O produto foi recristalizado a partir de MeOH, para prover 1,29 g de um sólido amarelo (78%). ΧΗ NMR (CDC13) δ: 8,43 (dd, J = 1,4, 8,3 Hz, 1H) ; 8,30 (br s, 1H) ; 7,47 (dd, J = 1,1, 8,0 Hz, 1H) ; 7,42 (d, J = 8,0 Hz, 2H) ; 7,33 (dt, J = 1,4, 7,9 Hz, 1H) ; 7,09 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 6,68 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 6,13 (br s, 2H). MS (ES): m/z 281,0 (M+). 2-Amino-N-bifenil-2-il-6-clorobenzamida (li) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-6-clorobenzóico (2,0 g, 11,7 mmol) e S0C12 (2,1 mL, 29,3 mmol) em benzeno (60 mL) , seguido por 2- aminobifenilamina (4,15 mL, 24,5 mmol) e CHC13 (60 mL) . 0 produto foi cromatografado em CH2C12, para prover 2,16 g de um resíduo âmbar escuro espumoso (57%). 1H NMR (CDC13) δ: 8,48 (d, J = 8,2 Hz, 1H) ; 7,79 (br s, 1H) ; 7,34 - 7,46 (m, 6H) ; 7,20 - 7,30 (m, 2H) ; 7,00 (t, J = 8,1 Hz, 1H) ; 6,63 (dd, J = 0,6, 7,9 Hz, 1H) ; 6,54 (d, J = 8,3 Hz, 1H) ; 4,58 (br s, 2H). MS (ES): m/z 323,1 (M+). 2-Amino-6-cl·oro-N-o-tolilbenzamida (lj) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-6-clorobenzóico (1,0 g, 5,83 mmol) e S0C12 (1,1 mL, 14,6 mmol) em benzeno (30 mL) , seguido por o-toluidina (1,4 mL, 12,8 mmol) e CHC13 (30 mL) . O produto foi cromatografado em CH2C12, para prover 840 mg de um sólido amarelo oleoso (55%). 1H NMR (CDC.l3) δ: 7,96 (d, J = 7.9 Hz, 1H) ; 7,60 (br S, 1H, J = 7,5 Hz, 1H) ; 7,11 (t, J = 8,3 Hz, 1H); 6,78 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 6,64 (d, J = 8,2 Hz, 1H) ; 4,73 (br s, 2H) ; 2,35 (s, 3H) . MS (ES): m/z 261.0 (M+) . 2-Amino-6-cloro-N-(2-fluorofenil)benzamida (lk) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-6-clorobenzóico (2,0 g, 11,7 mmol) e S0C12 (2,1 mL, 29,1 mmol) em benzeno (60 mL) , seguido por 2- fluoroanilina (2,3 mL, 23,4 mmol) e CHC13 (60 mL) . 0 produto foi cromatografado em CH2C12/ para prover 1,05 g de um sólido amarelo (34%). XH NMR (CDC13) δ: 8,45 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 8,01 (br s, 1H); 7,02 - 7,22 (m, 4H); 6,78 (dd, J = 0,5, 7,9 Hz, 1H) ; 6,64 (dd, J = 0,8, 8,2 Hz, 1H) ; 4,73 (br s, 2H). MS (ES): m/z 265,0 (M+). 2-amino-6-cloro-N-(2-metoxifenil)benzamida (11) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-6-clorobenzóico (2,0 g, 11,7 mmol) e S0C12 (2,1 mL, 29,1 mmol) em benzeno (60 mL) , seguido por o- anisidina (2,6 mL, 23,4 mmol) e CHC13 (60 mL) . O produto foi cromatografado em CH2C12, para prover 2,61 g de um óleo amarelo escuro (34%). ΧΗ NMR (CDC13) δ: 8,53 (dd, J = 1,7, 7.9 Hz, 1H) ; 8,39 (br s, 1H) ; 7,11 (dt, J = 1,6, 7,8 Hz, 1H) ; 7,09 (t, J = 8,1 Hz, 1H); 7,02 (dt, J = 1,4, 7,8 Hz, 1H); 6,92 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H); 6,62 (dd, J = 0,9, 8,2 Ηζ, 1Η); 4,66 (br s, 2H); 3,87 (s, 3H). MS (ES): m/z 277.0 (M+) . 2-Amino-N-(2-clorofenil)-3-trifluorometilbenzamida (lm) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 3-trifluorometilantranílico (2,0 g, 9,75 mmol) e SOCl2 (1,8 mL, 24,4 mmol) em benzeno (50 mL) , seguido por 2-cloroanilina (2,1 mL, 19,5 mmol) e CHC13 (50 mL) . O produto foi purificado por recristalização a partir de MeOH, para prover 2,38 g de cristais amarelos (78%). *H NMR (CDCI3) δ: 8,40 (dd, J = 1,4, 8,3 Ηζ, 1H); 8,25 (br S, 1H); 7,71 (d, J = 7,8 Ηζ, 1H) ; 7,60 (d, J = 7,8 Ηζ, 1H) ; 7,43 (dd, J = 1,4, 8,0 Ηζ, 1H); 7,34 (dt, J = 1,3, 7,9 Ηζ, 1H); 7,11 (dt, J = 1,5, 7,7 Ηζ, 1H) ; 6,77 (t, J = 7,8 Ηζ, 1H) ; 6,24 (br s, 2H). MS (ES): m/z 315.0 (M+). (2-Clorofenil)amida de ácido 3-Aminonaftaleno-2-carboxílico (ln) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 3-amino-2-naftóico (2,0 g, 10,7 mmol) e S0C12 (1,9 mL, 26,7 mmol) em benzeno (50 mL), seguido por 2- cloroanilina (2,3 mL, 21,4 mmol) e CHC13 (50 mL) . O produto foi cromatografado em CH2C12, foi recristalizado a partir de MeOH, para prover 1,71 g de um sólido marrom (54%). XH NMR (CDCI3) δ: 10,88 (br s, 1H) ; 9,21 (s, 1H) ; 8,91 (s, 1H); 8,70 (dd, J = 1,0, 8,3 Ηζ, 1H); 7,95 - 8,01 (m, 1H) ; 7,87 - 7,94 (m, 1H) ; 7,60 - 7,68 (m, 2H) ; 7,41 (dd, J = 1,3, 8,0 Ηζ, 1H); 7,34 (dt, J = 1,2, 7,8 Ηζ, 1H); 7,07 (dt, J = 1,4, 7,7 Ηζ, 1H). MS (ES): m/z 297.1 (M-f) . 2-Amino-N-(2-clorofenil)-4-nitrobenzamida (lo) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 4-nitroantranílico (5,0 g, 27,5 mmol) e SOCl2 (5,0 mL, 68,6 mmol) em benzeno (150 mL), seguido por 2- cloroanilina (5,8 mL, 55,0 mmol) e CHC13 (150 mL) . O produto foi purificado por cromatografia em CH2C12, seguido por uma recristalização a partir de MeOH, para prover 2,20 g de um sólido marrom alaranjado (31%) . 1H NMR (CDC13) δ: 8,41 (dd, J = 1,3, 8,3 Hz, 1H); 8,31 (br s, 1H); 7,67 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 7,52 (dd, J = 2,2, 8,5 Hz, 1H) ; 7,44 (dd, J = 1,3, 8,1 Hz, 1H) ; 7,35 (dt, J = 1,3, 7,9 Hz, 1H); 7,13 (dt, J = 1,4, 7,8 Hz, 1H); 5,88 (br s, 2H) . MS (ES): m/z 292,0 (M+) . 2-Amino-N-(2-clorofenil)-5-hidroxibenzamida (Ip) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico (5,0 g, 32,7 mmol) e S0C12 (6,0 mL, 81,6 mmol) em benzeno (150 mL) , seguido por 2-cloroanilina (6,9 mL, 65,4 mmol) e CHC13 (150 mL) . O produto foi purificado por duas cromatografias em MeOH/CH2C12, para prover 990 mg de um sólido marrom (12%). XH NMR (MeOH-d4) δ: 7,92 (dd, J = 1,6, 8,1 Hz, 1H) ; 7,48 (dd, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 7,34 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 7,2 0 (dt, J = 1,7, 7,7 Hz, 1H); 7,16 (d, J = 2,7 Hz, 1H) ; 6,83 (dd, J = 2,7, 8,7 Hz, 1H); 6,76 (d, J = 8,7 Hz, 1H);
[6,24 (br s, 2H)]. MS (ES): m/z 263,0 (M+). 2-Amino-N-(2-clorofenil)-4,5-difluorobenzamida (lq) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 4,5-difluoroantrílico (2,0 g, 11,6 mmol) e SOCl2 (2,1 mL, 28,9 mmol) em benzeno (60 mL), seguido por 2-cloroanilina (2,4 mL, 23,2 mmol) e CHC13 (60 mL) . O produto foi purificado por duas cromatografias em CH2C12 e EtOAc/hexanos para prover 769 mg de um sólido marrom (23%). XH NMR (CDC13) δ: 8,69 - 8,82 (m, 1H) ; 8,00 (dd, J = 8,4, 9,0 Ηζ, 1Η) ; 7,90 (dd, J = 8,9, 12 Hz, 1H) ; 7,39 (dd, J = 6,8, 10 Hz, 1H) ; 6,53 (dd, J = 6,6, 12 Hz, 1H) ; 6,41 (br s, 2H); 5,79 (br s, 1H). MS (ES): m/z 283,1 (M+). 2-Artiino-N- (2-clorofenil) -5-fluorobenzamida (lr) Preparada de acordo com o Procedimento A, usando-se ácido 2-amino-5-fluorobenzóico (1,0 g, 6,45 mmol) e SOCl2 (1,2 mL, 16,1 mmol) em benzeno (30 mL) , seguido por 2-cloroanilina (1,4 mL, 12,9 mmol) e CHC13 (30 mL). O produto foi triturado a partir de CH2CI2, para prover 985 mg de um sólido amarelo mostarda (58%). NMR (CDC13) δ: 7,66 (dd, J = 2,9, 8,7 Hz, 1H) ; 7,52 - 7,55 (m, 1H) ; 7,32 - 7,37 (m, 3H); 7,09 (dt, J = 3,0, 8,5 Hz, 1H); 6,71 (dd, J = 4,3, 8,7 Hz, 1H). MS (ES): m/z 305,0 (M+40). EXEMPLO 9 Preparação de Compostos Intermediários: Cloretos 2-clorometil-3-(2-clorofenil)-6,7-dimetóxi-3H-quinazolin-4-ona (2a) Preparada de acordo com o Procedimento B com la (2,95 g, 9,63 mmol) e cloreto de cloroacetila (2,3 mL, 28,9 mmol) em ácido acético (30 mL) . Purificada a partir da extração de K2C03 aq. e recristalização a partir de isopropanol, para levar a 1,61 g de um sólido cristalino marrom (46%). *H NMR (CDCI3) δ: 7,59 - 7,66 (m, 2H) ; 7,45 - 7,56 (m, 3H) ; 7,20 (S, 1H); 4,37 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,08 (d, J = 12 Hz, 1H) ; 4,04 (s, 3H); 4,00 (s, 3H) . MS (ES): m/z 365,0 (M+) . 6-Bromo-2-clorometil-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona (2b) Preparada de acordo com o Procedimento B com lb (500 mg, 1,54 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,37 mL, 4,61 mmol) em ácido acético (10 mL). Purificada por recristalização a partir de isopropanol, para levar a 490 mg de um sólido inteiramente branco (83%) . ΧΗ NMR (CDC13) δ: 8,43 (d, J = 2,3 Hz, 1H) ; 7,91 (dd, J = 2,3, 8,7 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,60 - 7,65 (m, 1H); 7,47 -7,56 (m, 2H) ; 7,52 (t, J = 5,3 Hz, 1H) ; 7,47 - 7,56 (m, 1H) ; 4,37 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,06 (d, J = 12 Hz, 1H) . MS (ES): m/z 385,0 (M+). 2-Clorometil-3-(2-clorofenil)-7-fluoro-3H-quinazolin-4-ona (2c) Preparada de acordo com o Procedimento B com lc (500 mg, 1,89 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,45 mL, 5,67 mmol) em ácido acético (10 mL) . Purificada por extração a partir de K2C03 aquoso, seguido por uma recristalização a partir de isopropanol, para levar a 501 mg de um sólido cristalino amarelo (82%). 1H NMR (CDC13) δ: 8,32 (dd, J = 6,0, 8,9 Hz, 1H); 7,59 - 7,66 (m, 1H); 7,50 - 7,55 (m, 3H); 7,44 (dd, J = 2,4, 9,4 Hz, 1H); 7,27 (dt, J = 2,5, 8,5 Hz, 1H) ; 4,37 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,07 (d, J = 12 Hz, 1H) . MS (ES): m/z 323,0 (M+). 6-Cloro-2-clorometil-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona (2d) Preparada de acordo com o Procedimento B com ld (500 mg, 1,78 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,42 mL, 5,33 mmol) em ácido acético (10 mL) . Purificada por recristalização a partir de isopropanol, para levar a 555 mg de um sólido amarelo (92%). 1H NMR (CDC13) δ: 8,27 (d, J = 1,9 Hz, 1H) ; 7,74 - 7,78 (m, 2H) ; 7,60 - 7,66 (m, 1H) ; 7,48 - 7,57 (m, 3H); 4,37 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,07 (d, J = 12 Hz, 1H) . MS (ES): m/z 339,0 (M+) . 2-Clorometil-3-(2-clorofenil)-5-fluoro-3H-quinazolin-4-ona (2e) Preparada de acordo com o Procedimento B com le (500 mg, 1,89 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,45 mL, 5,67 mmol) em ácido acético (10 mL) . Purificada por extração a partir de K2C03 aq. e recristalização a partir de isopropanol, para levar a 430 mg de um sólido cristalino inteiramente branco (70%). 1H NMR (CDC13) δ: 7,76 (dt, J = 5,3, 8,2 Hz, 1H); 7,56 - 7,65 (m, 2H); 7,47 - 7,56 (m, 3H); 7,16 - 7,25 (m, 1H); 4,35 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,07 (d, J = 12 Hz, 1H). MS (ES): m/z 323,0 (M+). 5-Cloro-2-clorometil-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolina-4-ona (2f) Preparada de acordo com o Procedimento B com lf (1,0 g, 3,56 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,85 mL, 10,7 mmol) em ácido acético (15 mL) . Purificada por recristalização a partir de isopropanol, para levar a 791 mg de um sólido cristalino inteiramente branco (65%). XH NMR (CDC13) δ: 7,70 (s, 1H); 7,68 (d, J = 3,8 Hz, 1H); 7,61 - 7,65 (m, 1H); 7,55 (dd, J = 2,7, 6,4 Hz, 1H); 7,51 (d, J = 3,1 Hz, 1H); 7,50 (s, 2H); 4,35 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,05 (d, J = 12 Hz, 1H) . MS (ES): m/z 339,0 (M+) . 2-Clorometil-3-(2-clorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (2g) Preparada de acordo com o Procedimento B com lg (2,18 g, 8,36 mmol) e cloreto de cloroacetila (2,0 mL, 25,1 mmol) em ácido acético (40 mL). Purificada por duas cromatografias em CH2C12 e EtOAc/hexanos, seguido por uma recristalização a partir de isopropanol, para levar a 638 mg de um sólido cristalino inteiramente branco (65%) . ΧΗ NMR (CDC13) δ: 7,73 - 7,80 (m, 3H) ; 7,58 - 7,64 (m, 3H) ; 7,41 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 4,40 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,26 (d, J = 12 Hz, 1H); 2,74 (s, 3H). MS (ES): m/z 319.0 (M+). 8-Cloro-2-clorometil-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona (2h) Preparada de acordo com o Procedimento B com lh (500 mg, 1,78 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,49 mL, 6,13 mmol) em ácido acético (10 mL) . Purificada por extração a partir de K2C03 aquoso, seguido por uma recristalização a partir de isopropanol, para levar a 448 mg de um sólido amarelo (74%). ΧΗ NMR (CDC13) δ: 8,23 (ss, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H); 7,90 (dd, J = 1,4, 7,8 Hz, 1H); 7,61 - 7,66 (m, 1H); 7,51 - 7,55 (m, 3H); 7,47 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 4,48 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,12 (d, J = 12 Hz, 1H) . MS (ES): m/z 339,0 (M+) . 3-Bifenil-2-il-5-cloro-2-clorometil-3H-quinazolin-4-ona (2i) Preparada de acordo com o Procedimento B com li (2,0 g, 6,20 mmol) e cloreto de cloroacetila (1,5 mL, 18,6 mmol) em ácido acético (30 mL) . Purificada por cromatografia em CH2C12, seguido por uma recristalização a partir de isopropanol, para levar a 1,44 g de um sólido inteiramente branco (61%). 1H NMR (CDC13) δ: 7,61 - 7,64 (m, 1H) ; 7,58 -7,59 (m, 1H) ; 7,54 - 7,57 (m, 2H) ; 7,52 - 7,53 (m, 1H) ; 7,45 - 7,52 (m, 2H); 7,24 (s, 5H); 3,92 - 4,03 (m, 2H). MS (ES): m/z 381,0 (M+). 5-Cloro-2-clorometil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (2~j) Preparada de acordo com o Procedimento B com lj (75 0 mg, 2,88 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,69 mL, 8,63 mmol) em ácido acético (15 mL) . Purificada por cromatografia em CH2C12, seguido por uma recristalização a partir de isopropanol, para levar a 340 mg de um sólido branco (37%). ΧΗ NMR (CDC13) δ: 7,69 (d, J = 2,1 Hz, 1H) ; 7,68 (q, J = 7,4 Hz, 1H) ; 7,54 (dd, J = 2,2, 7,0 Hz, 1H) ; 7,35 - 7,47 (m, 3H); 7,21 - 7,25 (m, 1H) ; 4,27 (d, J = 12 Hz, 1H) ; 4,11 (d, J = 12 Hz, 1H) ; 2,18 (s, 3H) . MS (ES): m/z 319,0 (M+). 5-Cloro-2-clorometil-3-(2-fluorofenil)-3H-quinazolin-4-ona (2k) Preparada de acordo com o Procedimento B com lk (1,0 g, 3,78 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,90 mL, 11,3 mmol) em ácido acético (20 mL) . Purificada por cromatografia em CH2C12, seguido por uma recristalização a partir de isopropanol, para levar a 484 mg de um sólido branco (37%). XH NMR (CDC13) δ: 7,69 (s, 1H); 7,68 (d, J = 3,2 Hz, 1H); 7,56 (d, J = 3,0 Hz, 1H); 7,54 (d, J = 3,0 Hz, 1H); 7,40 - 7,47 (m, 1H); 7,35 - 7,38 (m, 1H); 7,27 - 7,32 (m, 1H); 4,35 (d, J = 12 Hz, 1H); 4,18 (d, J = 12 Hz, 1H). MS (ES): m/z 323,0 (M +). 5-Cloro-2-clorometil-3-(2-metoxifenil)-3H-quinazolin-4-ona (21) Preparada de acordo com o Procedimento B com 11 (2,6 g, 9,41 mmol) e cloreto de cloroacetila (2,2 mL, 28,2 mmol) em ácido acético (4 0 mL) . Purificada por cromatografia em CH2C12, seguido por uma recristalização a partir de isopropanol, para levar a 874 mg de um sólido amarelo pálido (28%). ΧΗ NMR (CDC13) δ: 7,55 - 7,74 (τη, 2H) ; 7,47 - 7,54 (m, 2H); 7,34 (dd, J = 1,7, 7,8 Hz, 1H); 7,13 (dt, J = 1,2, 7,7 Hz, 1H); 7,08 (dd, J = 1,0, 8,4 Hz, 1H); 4,29 (d, J = 12 Hz, 1H); 4,11 (d, J = 12 Hz, 1H); 3,80 (s, 3H). MS (ES): m/z 335,0 (M+). 2-clorometil-3-(2-clorofenil)-8-trifluorometil-3H-quinazolin-4-ona (2m) Preparada de acordo com o Procedimento B com lm (500 mg, 1,59 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,38 mL, 4,77 mmol) em ácido acético (10 mL) . Purificada por recristalização a partir de isopropanol, para levar a 359 mg de um sólido cristalino branco (61%) . ‘‘‘H NMR (CDCl3) δ: 8.51 (dd, J = 1,0, 8,0 Hz, 1H); 8,14 (d, J = 7,3 Hz, 1H) ; 7,65 (dd, J = 2,5, 5,6 Hz, 1H); 7,62 (d, J = 3,9 Hz, 1H); 7,48 - 7,60 (m, 3H); 4,44 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,12 (d, J = 12 Hz, 1H). MS (ES): m/z 373,0 (M+). 2-Clorometil-3-(2-clorofenil)-3H-benzo[g]quinazolin-4-ona (2n) Preparada de acordo com o Procedimento B com ln (500 mg, 1,68 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,40 mL, 5,05 mmol) em ácido acético (10 mL). Purificada por cromatografia em CH2C12, seguido por uma recristalização a partir de isopropanol, para levar a 232 mg de um sólido marrom claro (39%). XH NMR (CDC13) δ: 8,92 (s, 1H) ; 8,29 (S, 1H) ; 8,81 (d, J = 8,3, 1H) ; 8,32 (d, J = 8,3 Hz, 1H) ; 7.51 - 7,69 (m, 4H); 7,55 (d, J = 5,2 Hz, 1H); 7,53 (d, J = 3,8 Hz, 1H) ; 4,43 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,12 (d, J = 12 Hz, 1H). MS (ES): m/z 355,0 (M+). 2-Clorometil-3-(2-Clorofenil)-7-nitro-3H-quinazolin-4-ona (2o) Preparada de acordo com o Procedimento B com lo (500 mg, 1,71 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,41 mL, 5,14 mmol) em ácido acético (10 mL) . Purificada por extração a partir de K2C03 aquoso, seguido por duas cromatografias em CH2C12, para levar a 338 mg de um óleo amarelo (56%). 1H NMR (CDC13) δ: 8,64 (d, J = 2,2 Hz, 1H) ; 8,48 (d, J = 8,8 Hz, 1H); 8,32 (dd, J = 2,2, 8,7 Hz, 1H); 7,66 (dd, J = 2,5, 6,0 Hz, 1H); 7,52 - 7,59 (m, 3H); 4,41 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,10 (d, J = 12 Hz, 1H) . MS (ES): m/z 350,0 (M+) .
Ester de 2-clorometil-3-(2-clorofenil)-4-oxo-3,4-diidro-quinazolin-6-ila de Ácido acético (2p) Preparada de acordo com o Procedimento B com lp (67 0 mg, 2,55 mrnol) e cloreto de cloroacetila (0,61 mL, 7,65 mmol) em ácido acético (10 mL) . Purificada por cromatografia em 0 a 3% de MeOH/CH2Cl2, seguido por recristalização a partir de isopropanol, para levar a 523 mg do acetato como cristais pêssego claro (57%) . XH NMR (CDCla) δ: 8,00 (d, J = 2,7 Hz, 1H) ; 7,82 (d, J = 8,8 Hz, 1H) ; 7,60 - 7,66 (m, 1H) ; 7,56 (dd, J = 2,7, 8,8 Hz, 1H) ; 7,51 (t, J = 4,7 Hz, 2H); 7,50 (s, 1H); 4,38 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,08 (d, J = 12 Hz, 1H) ; 2,36 (s, 3H) . MS (ES): m/z 363,0 (M+). 2-Clorometil-3-(2-clorofenil)-6,7-difluoro-3H-quinazolin-4-ona (2q) Preparada de acordo com o Procedimento B com lq (700 mg, 2,48 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,60 mL, 7,43 mmol) em ácido acético (12 mL). Purificada por cromatografia em CH2C12, seguido por recristalização a partir de isopropanol, para levar a 219 mg de um sólido cristalino amarelo (26%). ΧΗ NMR (CDC13) δ: 8,07 (dd, J = 8,5, 9,7 Hz, 1H); 7,64 (dd, J = 2,5, 5,6 Hz, 1H); 7,60 (dd, J = 3,5, 11 Hz, 1H); 7,55 (q, J = 2,9 Hz, 3H); 7,52 (d, J = 1,9 Hz, 1H) ; 7,49 - 7,51 (m, 1H) ; 4,36 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,06 (d, J = 12 HZ, 1H). MS (ES): m/z 341,0 (M+). 2-Clorometil-3-(2-clorofenil) -6-fluoro-3H-quinazolin-4-ona (2 r) Preparada de acordo com o Procedimento B com lr (850 mg, 3,21 mmol) e cloreto de cloroacetila (0,77 mL, 9,63 mmol) em ácido acético (15 mL) . Purificada por extração a partir de K2C03 aguoso, seguido por cromatografia EtCAc/hexanos. Uma segunda cromatografia em acetona/hexanos levou a 125 mg de um sólido branco (12%) . 1H NMR (CDC13) δ: 7,95 (dd, J = 2,9, 8,2 Hz, 1H); 7,81 (dd, J = 4,8, 9,0 Hz, 1H) ; 7,61 - 7,66 (m, 1H) ; 7,57 (dd, J = 2,7, 8,6 Hz, 1H) ; 7,57 (dd, J = 2,7, 8,6 Hz, 1H) ; 7,52 (dd, J = 3,2, 6,9 Hz, 1H); 7,52 (br S, 2H); 4,38 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,08 (d, J = 12 Hz, 1H). MS (ES): m/z 323.0 (M+). EXEMPLO 10 Preparação de Compostos de Inibidor de ΡΙ3Κδ Composto D-001 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-6,7-dimetóxi-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2a (200 mg, 0,546 mmol), adenina (81 mg, 0,602 mmol), K2C03 (83 mg, 0,601 mmol), e DMF (4 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de etanol (EtOH), para prover 164 mg de um sólido bege (65%), pf 281,5-282,7 °C (decompõe-se). 1H NMR (DMSO-d6) δ: 8,06 (s, 1H) ; 8,04 (s, 1H); 7,76 - 7,81 (m, 1H); 7,70 - 7,76 (m, 1H) ; 7,60 -7,67 (m, 2H) ; 7,45 (s, 1H) ; 7,22 (s, 2H) ; 6,90 (s, 1H) ; 5,08 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,91 (d, J = 17 Hz, 1H); 3,87 (s, 3H) ; 3,87 (s, 3H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 159,9; 156,2; 155,4; 152,9; 150,0; 149,7; 149,4; 143,0; 141,9; 133,7; 132,1; 131,9; 131,2; 130,8; 129,3; 118,4; 113,6; 108,4; 105,8; 56,5; 56,1; 44,7. MS (ES): m/z 464,1 (M+). Análise calculada para (C22H18) ClN7O3*0,1 (C2-H60*0,05KC1: C, 56,47; H, 3,97; Cl, 7,88; N, 20,76. Encontrado: C, 56,54; H, 4,05; Cl, 7,77; N, 20,55.
Composto D-002 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-6-bromo-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2b (100 mg, 0,260 mmol), adenina (39 mg, 0,286 mmol), K2C03 (40 mg, 0,286 mmol), e DMF (2 mL) . 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 52 mg de um sólido inteiramente branco (41%), pf 284,2-284,7 °C (decompõe-se) . XH NMR (DMSO-ds) δ: 8,24 (d, J = 2,0 Hz, 1H) ; 8,05 (s, 1H); 8,03 (s, 1H) ; 7,98 (dd, J = 1,9, 8,6 Hz, 1H) ; 7,74 - 7,83 (m, 2H); 7,59 - 7,68 (m, 2H); 7,46 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,22 (s, 2H) ; 5,12 (d, J = 17 Hz, 1H) ; 4,94 (d, J = 17 Hz, 1H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 159,5; 156,2; 152,9; 152,0; 150,1; 145,8; 141,8; 138,4; 133,1; 132,2; 131,9; 131,1; 130,9; 130,1; 129,4; 128,9; 122,4; 120,4; 118,4; 45,0. MS (ES): m/z 482,0 (M+). Análise calculada para (C22H13)ClBrN7O0,lKCl: C, 49,01; H, 2,67; Cl, 7,96; N, 20,00. Encontrado: C, 48,82; H, 2,82; Cl, 8,00; N, 19,79.
Composto D-003 2-(6-aminopurin-9-ilmetil) - 3-(2-clorofenil)-7-fluoro-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2c (100 mg, 0,310 mmol), adenina (46 mg, 0,340 mmol), K2C03 (47 mg, 0,340 mmol), e DMF (1 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 57 mg de um sólido bege (44%), pf 216,8-287,2 °C. NMR (DMSO-ds) δ: 8,22 (dd, J = 6,3, 8,7 Hz, 1H) ; 8,05 (s, 1H) ; 8,03 (s, 1Η); 7,78 - 7,80 (m, 2H); 7,61 - 7,64 (m, 2H); (dt, J = 2,1, 8.6 Hz, 1H) ; 7,32 (d, J = 9,8 Hz, 1H) ; 7,22 (s, 2H) ; 5,13 (d, J = 17 Hz, 1H) ; 4,95 (d, J = 17 Hz, 1H) . 13C NMR (DMSO- de) ppm: 166,1 (d, J = 253 Hz); 159,6; 155,8; 152,5; 149,7; 148.6 (d, J = 14 Hz) ; 141,4; 132,8; 131,8; 131,6; 130,8; 130,5; 129,8 (d, J = 11 Hz); 129,0; 118,1; 117,4; 116,2 (d, J = 24 Hz); 112,7 (d, J = 22 Hz); 44,6, MS (ES): m/z 422,0 (M+) . Análise calculada para (C22Hi3) ClFN7O0,1H20 (0,15KC1: C, 55,25; H, 3,06; Cl, 9,38; N, 22,55. Encontrado: C, 55,13; H, 2,92; Cl, 9,12; N, 22,30.
Composto D-004 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-6-cloro-3-(2-cloro£enil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2d (100 mg, 0,294 ramol), adenina (44 mg, 0,323 mmol) , K2C03 (45 mg, 0,323 mmol) , e DMF (1 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 50 mg de um sólido amarelo (39%), pf 294,5-294,8 °C (decompõe-se). 3H NMR (DMSO-d6) 6: 8,10 (d, J = 2,2 Hz, 1H) ; 8,05 (s, 1H) ; 8,03 (s, 1H) ; 7,86 (dd, J = 2,4, 8,8 Hz, 1H) ; 7,75 - 7,82 (m, 2H) ; 7,59 - 7,67 (m, 2H); 7,53 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,22 (br, s, 2H) ; 5,13 (d, J = 17 Hz, 1H) ; 4,95 (d, J = 17 Hz, 1H). 13C NMR (DMSO-de) ppm: 159,7; 156,2; 152,9; 151,9; 150,1; 145,5; 141,8; 135,7; 133,1; 132,3; 132,2; 131,9; 131,1; 130,9; 130,0; 125,9; 122,0; 118,4; 44,9. MS (ES): m/z 438,0 (M+) . Análise calculada para C2oH13Cl2N70: C, 54,81; H, 2,99; N, 22,37. Encontrado: C, 54,72; H, 2,87; N, 22,18. Composto D-005 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil) -3-(2-clorofenil) -5-fluoro-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2e (200 mg, 0,619 mmol), adenina (92 mg, 0,681 mmol), K2C03 (94 mg, 0,680 mmol), e DMF (4 mL) . O produto bruto foi cromatografado em MeOH/CH2Cl2, para prover 168 mg de um sólido inteiramente branco (64%), pf 159-172 °C (decompõe-se gradualmente). 3H NMR (DMSO-de) δ: 8,10 (s, 1H) ; 8,08 (s, 1H); 7,73 - 7,89 (m, 3H); 7,57 - 7,71 (m, 2H); 7,37 - 7,48 (m, 2H); 7,34 (d, J = 11 Hz, 1H) ; 7,30 (d, J = 8,3 Hz, 1H) ; 5,14 (d, J = 17 Hz, 1H) ; 4,94 (d, J = 17 Hz, 1H) . 13C NMR (DMSO-dg) ppm: 160,8 (d, J = 264 Hz) ; 157,5 (d, J = 4,2 Hz); 155,8; 152,4; 152,4; 150,0; 148,7; 142,1; 136,4 (d, J = 11Hz); 133,0; 132,2; 132,1; 131,2; 130,9; 129,4; 123,8 (d, J = 3,6 Hz); 118,4; 114,5 (d, J = 20 Hz); 110,2 (d, J = 6,0 Hz); 44,9. MS (ES): m/z 422,0 (M+). Análise calculada para C20H13ClFN7O : C, 56,95; H, 3,11; Cl, 8,40; N, 23,24.
Encontrado: C, 54,62; H, 3,32; Cl, 9,40; N, 21,29.
Composto D-006 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4 -ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2f (300 mg, 0,883 mmol), adenina (131 mg, 0,972 mmol), K2C03 (134 mg, 0,972 mmol), e DMF (4 mL) . O produto bruto foi cromatografado em MeOH/CH2Cl2 e recristalizado a partir de EtOH, para prover 188 mg de um sólido cristalino laranja (49%), pf 245,7-246,0 °C (começa a condensar a 220 °C) . XH NMR (DMS0-d6) 6: 8,06 (s, 1H) ; 8,04 (s, 1H) ; 7,76 - 7,81 (m, 2H) ; 7,72 (d, J = 8,0 Hz, 1H) ; 7,59 - 7,66 (m, 3H) ; 7,41 (d, J = 8,1 Hz, 1H) ; 7,26 (br s, 2H) ; 5,11 (d, J = 17 Hz, 1H) ; 4,93 (d, J = 17 Hz, 1H) . 13C NMR (DMSO-d5) ppm: 158,5; 156,2; 152,9; 152,2; 150,1; 149,2; 141,8; 135,4; 133,3; 133,2; 132,1; 132,0; 131,2; 130,9; 130,4; 129,4; 127,3; 118,4; 117,7; 44,9. MS (ES): m/z 438,0 (M+) . Análise calculada para C2oHi3C12N70*0,1C2H60*0,05H2O: C, 54,67; H, 3,00; Cl, 15,82; N, 23,24. Encontrado: C, 54,62; H, 3,32; Cl, 9,40; N, 22,31.
Composto D-007 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-clorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2g (250 mg, 0,783 mmol), adenina (116 mg, O, 862 mmol), K2C03 (119 mg, 0,862 mmol), e DMF (4 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 93 mg de um sólido amarelo pálido (28%), pf 190,7- 190,9 °C. ΧΗ NMR (DMSO-d6) δ: 8,05 (s, 1H) ; 8,03 (s, 1H) ; 7,76 - 7,79 (m, 1H); 7,71 - 7,74 (m, 1H); 7,59 - 7,67 (m, 1H) ; 7,34 (d, J = 7,4 Hz, 1H) ; 7,28 (d, J = 8,2 Hz, 1H) ; 7,24 (br s, 2H) ; 5,07 (d, J = 17 Hz, 1H) ; 4,92 (d, J = 17 Hz, 1H) ; 2,73 (s, 3H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 161,1; 156,2; 152,8; 150,9; 150,1; 148,3; 141,9; 141,0; 134,6; 133,6; 132,2; 131,9; 131,3; 130,8; 130,3; 129,3; 125,9; 119,1; 118,4; 44,8; 22,8. MS (ES): m/z 418,1 (M+). Análise calculada para C2iHi6ClN70*H20: C, 57,87; H, 4,16; Cl, 8,13; N, 22,49. Encontrado: C, 57,78; H, 3,99; Cl, 8,38; N, 22,32 .
Composto D-008 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-8-cloro-3-(2-clorofenil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2h (100 mg, 0,294 mmol) , adenina (44 mg, 0,324 mmol), K2C03 (45 mg, 0,324 mmol), e DMF (1 mL) . 0 produto bruto foi cromatografado em MeOH/CH2Cl2, para prover 50 mg de um sólido amarelo pálido (39%), pf 273,3-273,5 °C (descolore). λΕ NMR (DMSO-ds) δ: 8,11 (dd, J = 1.3, 8,0 Hz, 1H) ; 8,08 (s, 1H) ; 8,05 (s, 1H); 8,00 (dd, J = 1.3, 8,0 Hz, 1H);7,79 - 7,83 (m, 2H); 7,63 - 7,66 (m, 2H) ; 7,56 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,21 (br s, 2H); 5,17 (d, J = 17 Hz, 1H) ; 4,97 (d, J = 17 Hz, 1H) . 13C NMR (DMS0-d6) ppm: 160,2; 156,1; 152,8; 152,2; 150,2; 143,3; 142,0; 135,6; 133,1; 132,3; 131,9; 131,1; 131,0; 130,9; 129,4; 128,4; 126,0; 122,5; 118,4; 45,0. MS (ES): m/z 438,0 (M+).
Análise calculada para C20Hi3C12N7O«0,1CH400,06H2O (0,15 KC1: C, 52,09; Η, 3,18; N, 21,15. Encontrado: C, 51,85; H, 2,93; N, 21,01.
Composto D-009 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil) -3-bifenil)-2-il-5-cloro-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2i (400 mg, 1,05 mmol), adenina (155 mg, 1,15 mmol), K2C03 (159 mg, 1,15 mmol), e DMF (5 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 344 mg de um sólido branco (68%), pf 299,9-300,1 °C (descolore). 3H NMR (DMSO-ds) δ: 8,08 (s, 1H) ; 7,89 (s, 1H) ; 7,58 - 7,73 (m, 5H) ; 7,51 (d, J = 7,9 Hz, 1H) ; 7,46 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,27 - 7,41 (m, 3H); 7,14 - 7,27 (m, 3Η); 5,14 (d, J = Hz, 1H); 4,82 (d, J = 17 Hz, 1H); 13C NMR (DMSO-ds) ppm: 159,6; 156,2; 152,8; 152,5; 150,0; 149,0; 141,7; 140,2; 137,7 135,0; 133,3; 133,2; 131,8; 130,7; 130,1; 129,8; 129,5; 128,8; 128,6; 128,4; 127,1; 118,4; 117,6; 45,3. MS (ES): m/z 480,1 (M+). Análise calculada para C26H18C1N70: C, 65,07; H, 3,78; Cl, 7,39; N, 20,43. Encontrado: C, 64,77; H, 3,75; Cl, 7,43; N, 20,35. Composto D-010 5-Cloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2j (200 mg, 0,626 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (93 mg, 0,546 mmol), K2C03 (95 mg, 0,689 mmol) , e DMF (4 mL) . 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 125 mg de um sólido inteiramente branco (46%), pf 213,9 °C. 1H NMR (DMSO-d6) 6: 13,53 (br s, 1H); 8,49 (s, 1H) ; 8,44 (s, 1H); 7,78 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,63 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 7,59 (d, J = 7,7 Hz, 1H) ; 7,49 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 7,24 - 7,41 (m, 3H) ; 4,32 - 4,45 (m, 2H) ; 2,14 (s, 3H) ; 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,9; 157,2; 154,2; 151,5; 149,7; 149,6; 143,5; 136,1; 135,9; 135,1; 133,2; 131,3; 130,3; 130,0; 129,9; 129,1; 127,6; 127,1; 117,8; 32,4; 17,5. MS (ES): m/z 438,0 (M+) . Análise calculada para C2iH15ClN6OS: C, 58,00; H, 3,48; Cl, 8,15; N, 19,32; S, 7,37. Encontrado: C, 58,05,- H, 3,38; Cl, 8,89; N, 18,38; S, 7,00.
Composto D-011 5-Cloro-3- (2-fluorofenil) -2-^9H-purin-6-il-sulfanilmetil) -3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2k (210 mg, 0,650 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (122 mg, 0,715 mmol), K2C03 (99 mg, 0,715 mmol) , e DMF (4 mL) . 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 240 mg de um sólido inteiramente branco (84%), pf 244,0 °C. 1H NMR (DMSO-de) δ: 13,56 (br s, 1H); 8,50 (s, 1H); 8,45 (s, 1H); 7,81 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 7,74 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,62 (d, J = 7,7 Hz, 1H); 7,46 - 7,55 (m, 1H); 7,29 -7,42 (m, 2H) ; 4,47 - 4,54 (m, 2H) ; 13C NMR (DMSO-ds) ppm: 158,4; 157,3 (d, J = 249 Hz); 156,4; 153,8; 151,0; 149,1; 143,2; 135,0; 132,9; 131,8 (d, J = 8,0 Hz); 130,8; 129,9; 126,7; 125,3 (d, J = 3,5 Hz); 123,6 (d, J = 13 Hz); 117,0; 116,2 (d, J = 19 Hz) ; 31,7. MS (ES): m/z 439,0 (M+) .
Análise calculada para C2oHx2ClFN6OS: C, 54,74; H, 2,76;
Cl, 8,08; N, 19,15; S, 7,31. Encontrado: C, 54,42; H, 2,88; Cl, 8,08; N, 18,87; S, 7,08.
Composto D-012 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-5-Cloro-3-(2-fluorofenil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2k (210 mg, 0,650 mmol), adenina (97 mg, 0,715 mmol), K2C03 (99 mg, 0,715 mmol), e DMF (4 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 137 mg de um sólido castanho (50%), pf 295,6-295,8 °C (decompõe - se) . 1H NMR (DMSO-ds) δ: 8,05 (s, 1H) ; 8,04 (s, 1H) ; 7,75 (t, J = 7,6 Hz, 1H) ; 7,74 (t, J = 7,9 Hz, 1H) ; 7,62 - 7,69 (m, 1H) ; 7,61 (d, J = 7,6 Hz, 1H) ; 7,47 - 7,55 (m, 1H) ; 7,48 (d, J = 7,8 Hz, 1H) ; 7,41 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,24 (br s, 2H); 5,19 (d, J = 17 Hz, 1H); 5,03 (d, J = 17 Hz, 1H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,7; 157,6 (d, J = 250 Hz); 156,2; 152,8; 152,4; 150,0; 149,2; 141,8; 135,4; 133,3; 132,5(d, J = 8,0 Hz) ; 131,0 130,4; 127,3; 126,2(d, J = 3,5 Hz); 123,1 (d, J = 3,5 Hz); 123,1 (d, J = 14 Hz); 118,4; 117,6; 117,2 (d, J = 19 Hz) ; 45,1. MS (ES): m/z 422,0 (M+) . Análise calculada para C20H13CIFN7OO, 05 C2-H60: C, 56,92; H, 3,16; Cl, 8,36; N, 23,12. Encontrado: C, 56,79; H, 3,20; Cl, 8,46; N, 22,79.
Composto D-013 3-Bifenil-2-il-5-cloro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2i (400 mg, 1,05 mmol) , monoidrato de 6-mercaptopurina (196 mg, 1,15 mmol), K2C03 (159 mg, 1,15 mmol), e DMF (5 mL). O produto bruto foi cromatografado em MeOH/CH2Cl2 e, subsequentemente, recristalizado a partir de EtOH, para prover 439 mg de um sólido cristalino amarelo pálido (84%), pf 222,0-222,5 °C (decompõe - se) . 3Η NMR (DMSO-d5) Ô: 13,56 (br s, 1H) ; 8,55 (s, 1H) ; 8,45 (s, 1H) ; 7,73 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 7,64 (d, J = 7,7 Hz, 1H); 7,50 - 7,59 (m, 4H) ; 7,41 - 7,48 (m, 1H) ; 7,25 - 7,38 (m, 5H) ;
4,41 (d, J = 16 Hz, 1H) ; 4,16 (d, J = 16 Hz, 1H) . 13C NMR (DMSO-dg) ppm: 160,2; 157,0; 153,7; 151,5; 149,7; 149,3; 143,5; 139,9; 137,8; 135,1; 134,1; 133,3; 131,5; 130,5; 130,3; 130,1; 129,1; 128,9; 128,4; 126,9; 117,5; 32,3. MS (ES): m/z 497,0 (M+). Análise calculada para C26Hi7C1NsOS : C, 62,84; H, 3,45; Cl, 7,13; N, 16,91; S, 6,45. Encontrado: C, 62,60; H, 3,47; Cl, 7,15; N, 16,65; S, 6,41.
Composto D-014 5-Cloro-3-(2-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)- 3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 21 (250 mg, 0,746 mmol), monoidrato de 6- mercaptopurina (140 mg, 0,821 mmol), K2C03 (113 mg, 0,821 mmol), e DMF (4 mL) . 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 254 mg de um sólido inteiramente branco (76%), pf 237,0 °C (decompõe-se; descolore a 154,6 °C) . 3Η NMR (DMS0-ds) δ: 13,53 (br s, 1H); 8,52 (s, 1H); 8,45 (s, 1H) ; 7,78 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,64 (t, J = 8,0 Hz, 1H) ; 7,59 (d, J = 7,7 Hz, 1H) ; 7,48 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 7,42 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,15 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 7,03 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 4,45 (s, 2H); 3,76 (s, 3H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,9; 157,1; 154,8; 154,7; 151,5; 149,6; 143,6; 135,1; 133,2; 131,3; 130,4; 130,0; 127,0; 124,8; 121,2; 117,8; 112,7; 56,1; 32,0. MS (ES): m/z 451,0 (M+) . Análise calculada para C2iHi5C1NsO2S*0,15 C2H60*0,05 KC1: C, 55,43; H, 3,47; Cl, 8,07; N, 18,21; S, 6,95. Encontrado: C, 55,49; H, 3,68; Cl, 7,95; N, 17,82; S, 6,82.
Componente D-015 3- (2-Clorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2e (200 mg, 0,619 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (116 mg, 0,681 mmol), K2C03 (94 mg, 0,681 mmol), e DMF (5 mL) . 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 152 mg de um sólido branco (56%), pf 222,7-223,8 °C (descolore). XH NMR (DMSO-d6) δ: 13,56 (br s, 1H); 8,48 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 7,89 (dt, J = 5,6, 8,1 Hz, 1H); 7,76 (dd, J = 1,6, 7,3 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 7,56 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,47 (t, J = 7,1 Hz, 1H) ; 7,41 - 7,53 <m, 2H) ; 7,37 (dd, J = 8,7, 11 Hz, 1H) ; 4,38 - 4,52 (m, 2H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,9 (d, J = 264 Hz) ; 157,6; 154,1; 154,1; 151,5; 149,6; 149,0; 143,6; 136,4 (d, J = 11 Hz) ; 133,9; 132,2; 131,7; 131,6; 130,5; 130,2; 128,8; 123,6; 114,4 (d, J = 20 Hz) ; 110,2; 32,0. MS (ES): m/z 439,0 (M+). Análise calculada para C2oHi2ClFN6OS«0,5C2H60: C, 54,61; H, 3,27; Cl, 7,68; N, 18,19; S, 6,94. Encontrado: C, 54,37; H, 3,26; Cl, 7,89; N, 18,26; S, 6,55.
Componente D-016 3- (2-Clorofenil)-6,7-dimetóxi-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2a (200 mg, 0,546 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (102 mg, 0,601 mmol), K2C03 (83 mg, 0,601 mmol) , e DMF (5 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 172 mg de um sólido inteiramente branco (65%) , pf 160-180 °C (decompõe-se gradualmente). ΧΗ NMR (DMSO-de) δ: 13,55 (br s, 1H) ; 8,49 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 7,72 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 7,66 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 7,38 - 7,54 (m, 3H); 7,22 (s, 1H); 4,36 - 4,52 (m, 2H) ; 3,94 (s, 3H) ; 3,89 (s, 3H) . 13C NMR (DMSO-dg) ppm: 160,1; 155,4; 151,5; 151,1; 149,4; 143,2; 134,6; 132,3; 131,6; 131,5; 130,4; 128,7; 113,6; 108,4; 105,8; 56,5; 56,1; 32,0. MS (ES): m/z 481,1 (M+). Análise calculada para C22Hi7ClN6O3S*0,5C2H6O*0,05KC1: C, 54,41; H, 3,97; Cl, 7,33; N, 16,55; S, 6,32. Encontrado: C, 54,43; H, 3,94; Cl, 7,69; N, 16,69; S, 6,52.
Composto D-017 6-Bromo-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2b (200 mg, 0,519 mmol), monoidrato de 6- mercaptopurina (97 mg, 0,570 mmol), K2C03 (79 mg, 0,572 mmol), e DMF (5 mL). 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 123 mg de um sólido inteiramente branco (47%), pf 160-180 °C (decompõe-se gradualmente). XH NMR (DMSO-d6) δ: 13,07 (br s, 1H) ; 8,48 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 8,24 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 8,06 (dd, J = 2,3, 8,7 Hz, 1H); 7,76 (dd, J = 1,9, 7,4 Hz, 1H); 7,70 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,66 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,51 (dd, J = 2,1, 7,9 HZ, 1H); 7,46 (dd, J = 1,9, 7,9 Hz, 1H) ; 4,47 (S, 2H) . 13C NMR (DMSO-dç) ppm: 159,7; 156,8; 153,6; 151,5; 146,1; 143,6; 138,5; 134,0; 132,1; 131,8; 131,5; 130,5; 130,2; 129,9; 128,9; 128,8; 122,2; 120,3; 32,0. MS (ES): m/z 499,0 (M+). Análise calculada para C2oHi2ClBrNsOS*0,2C2HG00,05KCl: C, 47,79; H, 2,59; N, 16,39; S, 6,25. Encontrado: C, 47,56; H, 2,54; N, 16,25; S, 6,58. Composto D-018 3-(2-clorofenil)-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-8-trifluorometil-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2m (200 mg, 0,536 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (100 mg, 0,588 mmol), K2C03 (82 mg, 0,593 mmol) , e DMF (4 mL). O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 14 8 mg de um sólido branco (56%), pf 218,5-219,4 °C. 1H NMR (DMSO-d6) δ: 13,52 (br s, 1H); 8,48 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 8,43 (d, J = 6,0 Hz, 1H) ; 8,26 (d, J = 7,5 Hz, 1H) / 7.84 (dd, J = 2,5, 6,7 Hz, 1H) ; 7,70 - 7,75 (m, 2H); 7,51 - 7,59 (m, 2H); 4,40 - 4,55 (m, 2H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,0; 157,2; 154,2; 151,4; 149,6; 144,4; 143,4; 133,8; 133,0 (q, J = 6,0 Hz, 1H) ; 132,0; 131,9; 131,6; 131,4; 130,6; 129,0; 127,3; 125,2 (q, J = 30 Hz); 123,6 (g, J = 273 Hz); 121,8; 32,6. MS (ES): m/z 489,0 (M+) . Análise calculada para C2iHi2C1F3N6OS: C, 51,59; Η, 2,47; Cl, 7,25; N, 17,19; S, 6,56. Encontrado: C, 51,51; H, 2,55; Cl, 7,37; N, 17,05; S, 6,38.
Composto D-019 3-(2-Clorofenil)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-benzo[g]quinazolin-4-ona Preparado de acordo.com o Procedimento C, usando-se o ' * $ ■- ...
Intermediário 2n (200 mg, 0,563 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (105 mg, 0,619 mmol), K2C03 (86 mg, 0,619 mmol), e DMF (4 mL) . 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 128 mg de um sólido amarelo escuro (48%), pf 247,8-254,4 °C (decompõe-se). NMR (DMSO-d6) δ: 13,56 (br S, 1H) ; 8,90 (s, 1H) ; 8,50 (s, 1H) ; 8,46 (S, 1H); 8,34 (s, 1H) ; 8,27 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 8,16 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 7,81 (dd, J = 1,6, 7,3 Hz, 1H) ; 7,70 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,61 - 7,74 (m, 2H); 7,49 (t, J = 7,5 Hz, 1H) ; 7,44 - 7,53 (m, 1H) ; 4,44 - 4,56 (m, 2H) . 13C NMR (DMSO-dg) ppm: 161,3; 151,6; 151,5; 143,9; 142,2; 136,7; 134,4; 132,5; 131,8; 131,6; 130,5; 129,7; 129,3; 128,8; 128,6; 128,3; 127,1; 125,2; 119,5; 32,4. MS (ES): m/z 471,0 (M+) . Análise calculada para C24Hi5C1N6OS*0,2C2H60*0,05KC1: C, 60,57; H, 3,37; Cl, 7,69; N, 17,37; S, 6,63. Encontrado: C, 60,24; H, 3,46; Cl, 7,50; N, 17,34; S, 6,69.
Composto D-020 6-Cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2d {200 mg, 0,587 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (110 mg, 0,646 mmol), K2C03 (90 mg, 0,651 mmol), e DMF (5 mL) . 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 113 mg de um sólido cristalino amarelo (42%), pf 237,1-238,2 °C (decompõe-se). *Η NMR (DMSO-de) Ô: 13,55 (br s, 1H) ; 8,48 (s, 1H) ; 8,44 (s, 1H) ; 8,11 (s, 1H) ; 7,94 (d, J = 8,3 Hz, 1H) ; 7,78 (d, J = 8,1 Hz, 2H) ; 7,66 (dd, J = 6,7 Hz, 1H) ; 7,48 - 7,56 (m, 2H) / 4,48 (s, 2H) . 13C NMR (DMSO-ds) ppm: 159,8; 156,8; 153,5;
151,5; 149,6; 145,8; 143,6; 135,7; 134,0; 132,2; 131,7; 131,5; 130,5; 130,2; 129,8; 128,8; 125,8; 121,9; 32,0. MS (ES): m/z 455,0 (M+). Análise calculada para C2cH12C12N6OS*0,1C2H60*0,6H20(0,1KC1: C, 50,34; H, 2,89; Cl, 15,82; N, 17,44; S, 6,65. Encontrado: C, 50,02; H, 2,63; Cl, 15,51; N, 17,39; S, 6,81.
Composto D-021 8-Cloro-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2h (200 mg, 0,589 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (124 mg, 0,726 mmol), K2C03 (100 mg, 0,726 mmol) , e DMF (4 mL). 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 202 mg de um sólido branco (75%), pf 211,9-212,7 °C (decompõe-se). 3Η NMR (DMSO-d6) δ: 13,54 (br s, 1H); 8,47 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 8,12 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 8,07 (d, J = 7,6 Hz, 1H); 7,78 (t, J = 7,5 Hz, 1Η) ; 7,67 (d, J = 7,1 Hz, 1H) ; 7,58 (t, J = 7,9 Hz , 1H) ; 7,42 - 7,54 (m, 2H) ; 4,52 (s, 2H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,3; 156,9; 153,9; 151,5; 149,7; 143,5; 135,7; 134,0; 132,1; 131,8; 131,4; 131,1; 130,5; 130,3; 128,9; 128,3; 126,1; 122,4; 32,5. MS (ES): m/z 455,0 (M+). Análise calculada para C20Hi2C12N6OS : C, 52,76; H, 2,66; Cl, 15,57; N, 18,46; S, 7,04. Encontrado: C, 52,65; H, 2,79; Cl, 15,32; N, 18,47; S, 7,18.
Composto D-022 3-(2-Clorofenil)-7-fluoro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2c (200 mg, 0,619 mmol), monoidrato de 6- mercaptopurina (116 mg, 0,681 mmol), K2C03 (95 mg, 0,687 mmol) , e DMF (4 mL). 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 143 mg de um sólido cristalino branco (53%), pf 151,4-154,2 °C (descolore). 3H NMR (DMSO-d6) δ: 13,55 (br s, 1H) ; 8,48 (s, 1H) ; 8,44 (s, 1H) ; 8,23 (dd, -.J = 6,3, 8,7 Hz, 1H) ; 7,7 (dd, J = 1,7, 7,4 Hz, 1H) ; 7,64 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 7,57 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 7,45 - 7,52 (m, 3H) ; 4,48 (s, 2H) . 13C NMR (DMSO-ds) ppm: 169,0 (d, J = 253 Hz); 162,6; 159,3; 157,0; 154,0; 152,2; 151,7 (d, J = 13 Hz); 146,1; 136,5; 134,7; 134,2; 134,0; 133,0; 132,6 (d, J = 11 Hz); 131,3; 120,2; 188,9 (d, J = 24 Hz) ; 115,3 (d, J = 22 Hz);34,6. MS (ES): m/z 439,0 (M+) . Análise calculada para C20H12C1FN5OS*0,4-C2H60*0,4H20(0,15KC1: C, 52,52; H, 3,22; Cl, 8,57; N, 17,67. Encontrado: C, 52,25; H, 3,11; Cl, 8,20; N, 17,69.
Composto D-023 3-(2-Clorofenil)-7-nitro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)- 3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2o (216 mg, 0,617 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (116 mg, 0,681 mmol), K2C03 (94 mg, 0,680 mmol), e DMF (4 mL) . 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 212 mg de um sólido cristalino amarelo (74%), pf 218,0-218,3 °C (decompõe-se). 1H NMR (DMSO-dg) δ: 13,56 (br s, 1H) ; 8,49 (s, 1H) ; 8,42 (s, 1H) ; 8,38 - 8,45 (m, 2H); 8,31 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 7,81 (d, J = 6,5 Hz, 1H); 7,68 (d, J = 6,7 Hz, 1H); 7,43 - 7,58 (m, 2H); 4,53 (s, 2H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 157,7; 154,4; 153,3; 149,8; 149,3; 147,6; 145,2; 141,4; 131,5; 129,8; 129,7; 129,2; 128,4; 127,1; 126,7; 122,7; 120,3; 119,4; 29,9. MS (ES): m/z 466,0 (M+). Análise calculada para C20Hi2ClN7O3S*0,4C2H6O*0,05KC1: C, 51,19; H, 2,97; Cl, 7,63; N, 20,09; S, 6,57. Encontrado: C, 51,27; H, 2,88; Cl, 7,40; N, 20,04; S, 6,52.
Composto D-024 3-(2-Clorofenil)-6-hidróxi-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2p (200 mg, 0,552. mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (117 mg, 0,685 mmol), K2C03 (95 mg, 0,687 mmol), e DMF (4 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 182 mg de um sólido branco, uma mistura do produto desejado e um derivado de acetila. Uma porção deste material (120 mg) foi colocada em suspensão em uma mistura de MeOH (2 mL) e NaHC03 aquoso (saturado, 1 mL) e agitada rapidamente, por 4 horas. A mistura foi concentrada in vacuo, colocada em suspensão em H20 (10 mL) e armazenada a 4 °C, durante a noite. 0 sólido branco foi coletado e seco até 103 mg (66%) , pf 186-214 °C (decompõe-se gradualmente). 1H NMR(DMS0-dÊ) δ: 8,48 (s,lH); 8,45 (s, 1H); 7,71 (d, J = 6,8 Hz, 1H); 7,62 - 7,64 (m, 2H); 7,43 -7,51 (m, 2H) ; 7,40 - 7,43 (m, 1H) ; 7,35 (d, J = 8,8 Hz, 1H) ; 4,39 - 4,52 (m, 2H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,6; 157,1; 156,2; 151,4; 150,8; 149,3; 144,1; 140,2; 134,5; 132,2; 131,6; 131,4; 130,4; 129,3; 128,7; 124,8; 121,7; 109,8; 32,0. MS (ES): m/z 437,0 (M+). Análise calculada para: (2 C20Hi3ClN6O2S*0,1 C2H60*6H20: C, 49,68; H, 3,88; Cl, 7,26; N, 17,21; S, 6,57. Encontrado: C, 49,43; H, 3,62; Cl, 7,32; N, 17,07; S, 6,58.
Composto D-025 5-Cloro-3-(2-clorofenil)-6-hidróxi-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2f (300 mg, 0,883 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (165 mg, 0,972 mmol), K2C03 (134 mg, 0,972 mmol), e DMF (4 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 341 mg de um sólido cristalino laranja pálido (85%), pf 233,7-234,4 °C (decompõe-se). *Η NMR(DMS0-d6) δ: 13,58 (br s, 1H) ; 8,50 (s,lH); 8,47 (s, 1H) ; 7,77 - 7,85 (m, 2H) ; 7,68 (d, J = 8,1 Hz, 2H) ; 7,65 (d, J = 7,7 Hz, 1H); 7,41 - 7,56 (m, 2H); 4,45 (d, J = 1,2 Hz, 2H) . 13C NMR (DMS0-de) ppm: 158,7; 156,8; 153,8; 151,5; 149,6; 149,5; 143,5; 135,4; 134,1; 133,3; 132,2; 131,6; 131,6; 130,5; 130,2; 128,8; 127,1; 117,6; 32,0. MS (ES): m/z 455,0 (M+) . Análise calculada para: C20Hi2C12N6OS· C2H6O*0,3H2: C, 52,14; H, 3,70; Cl, 13,99; N, 16,58; S, 6,33. Encontrado: C, 52,07; H, 3,37; Cl, 13,40; N, 16,65; S, 6,42.
Composto D-026 3-(2-Clorofenil)-5-metil-2-QH-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2g (300 mg, 0,940 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (176 mg, 1,03 mmol), K2CO3 (142 mg, 1,03 mmol), e DMF (5 mL) . 0 produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 324 mg de um sólido cristalino branco (79%), pf 227,8-230,1 °C (decompõe-se). XH NMR(DMSO-d6) δ: 13,57 (br s, 1H) ; 8,49 (s,lH); 8,47 (s, 1H) ; 7,69 -7,78 (m, 2H) ; 7,66 (d, J = 7,3 Hz, 1H) ; 7,55 (d, J = 7,9 Hz, 1H) ; 7,39 - 7,52 (m, 2H) ; 7,36 (d, J = 6,9 Hz, 1H) ; 4,38 - 4,50 (m, 2H) ; 2,74 (s, 3H) . 13C NMR (DMSO-ds) ppm: 161,2; 156,3; 152,4; 151,5; 148,6; 143,9; 141,0; 1346; 134,5; 132,3; 131,7; 131,4; 130,4; 128,7; 125,7; 119,0; 32,0; 22,8. MS (ES): m/z 435,0 (M+) . Análise calculada para: C2iH15C1N5OS*0,65C2H6O*0,1H20: C, 57,40; H, 4,13; Cl, 7,60; N, 18,01; S, 6,87. Encontrado: C, 57,11; H, 3,96; Cl, 7,45; N, 17,79; S, 6,90.
Composto D-027 3-(2-Clorofenil)-6,7-difluoro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2q (200 mg, 0,586 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (110 mg, 0,645 mmol), K2C03 (89 mg, 0,645 mmol) , e DMF (4 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 143 mg de um sólido cristalino amarelo pálido (53%), pf 207,8 °C (descolore,- condensa a 136 °C) . XH NMR(DMSO-ds) δ: 13,57 (br s, 1H) ; 8,49 (s, 1Η); 8,46 (s, 1H); 8,11 (t, J = 9,4 Hz, 1H); 7,88 (dd, J'= 7,3, 11 Hz, 1H); 7,77 (dd, J = 1,7, 7,3 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 7,4 Hz, 1H) ; 7,42 - 7,55 (m, 2H) ; 4,48 (s, 2H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 159,5 (d, J = 2,5 Hz) ; 154,6 (dd, J = 14, 255 Hz); 154,0 (d, J = 1,5 Hz); 151,5; 149,3 (dd, J = 14, 250 Hz); 145,1 (d, J = 12 Hz); 143,9; 133,9; 132,1; 131,8; 131,4; 130,5; 128,9; 118,0 (d, J = 4,9 Hz); 115,8 (d, J = 18 Hz) ; 114,6 (d, J = 20 Hz) ; 32,0. MS (ES): tíl/z 457,0 (M+) . Análise calculada para: C20HiiClF2NsOS: C, 52,58; H, 2,43; Cl, 7,76; N, 18,40; S, 7,02. Encontrado: C, 51,81; H, 2,37; Cl, 7,49; N, 18,04; S, 7,55.
Composto D-028 3-(2-Clorofenil)-6-fluoro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2r (118 mg, 0,365 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (68 mg, 0,402 mmol), K2C03 (56 mg, 0,402 mmol) , e DMF (2 mL) . O produto bruto foi recristalizado a partir de EtOH, para prover 103 mg de um sólido cristalino inteiramente branco (64%), pf 232,8-233,0 °C (descolore). XH NMR (DMSO-dg) δ: 13,56 (br s, 1H) ; 8,48 (s, 1H) ; 8,44 (s, 1H) ; 7,81 - 7,86 (m, 3H) ; 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 1H) ; 7,67 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,40 - 7,54 (m, 2H); 4,48 (br S, 2H) . 13C NMR (DMSO-dç) ppm: 160,8 (d, J = 247 Hz) ; 160,2 (d, J = 3,3 Hz) ; 156,9; 152,3 (d, J = 1,9 Hz) ; 151,5; 149,7 Hz) ; 144,0; 143,6; 134,1; 132,1; 131,7; 131,5; 130,5; 130,4; 130,2; 128,8; 124,0 (d, J = 24 Hz); 122,0 (d, J = 8,7 Hz) ; 111,7 (d, J = 24 Hz) ; 32,0. MS (ES): m/z 439,0 (M+) . Análise calculada para: C20Hi2ClFN6OS*0,2C2H6O*0,1H20 : C, 54,46; H, 3,00; Cl, 7,88; N, 18,68. Encontrado: C, 54,09; Η, 2,73; Cl, 7,80; Ν, 18,77.
Composto D-029 2- (6-Aminopurin-9-ilmetil) -3- (2-isopropilfen.il) -5-metil-3H-quinazolin-4-ona Cloreto de tionila (2,2 mL, 30 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de ácido 2-amino-6-metilbenzóico (1,51 g, 10 mmol) em benzeno (50 mL), e a mistura foi aquecida em refluxo por 18 h. Uma vez resfriada, o solvente foi removido in vacuo e extraído duas vezes com benzeno (25 mL) . 0 resíduo foi dissolvido em CHC13 (50 mL) e tratado com 2-isopropilanilina (2,83 mL, 20 mmol). A suspensão foi tratada em refluxo por 3 h. Naquele momento, a TLC (50% de EtOAc/hexano) indicou que a reação estava completa. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a mistura de reação foi vazada pelo topo de um plugue de 4 cm de sílica gel e descarregada com 20% de EtOAc/hexano. 0 produto contendo frações foi combinado e concentrado in vacuo. 0 resíduo foi dissolvido em HOAc (50 mL) e tratado com cloreto de cloroactila (1,6 mL, 20 mmol), e a mistura foi aquecida em refluxo por 18 h. A reação foi resfriada e concentrada in vacuo. O HOAc remanescente foi removido por removido por azeotropismo com tolueno (25 mL) três vezes. 0 resíduo foi dissolvido em tolueno (10 mL) e vazado através de um plugue de 4 cm de sílica gel, descarregando com 2 0% de EtOAc/hexano. 0 produto contendo frações foi identificado por LCMS (MS (ES) : m/z 327 (M+) ) , e concentrado in vacuo, para levar a 975 mg (30%) como uma espuma branca. 0 cloreto de espuma branca (450 mg, 1,36 mmol) foi dissolvido em DMF (10 mL) e tratado com adenina (275 mg, 2,04 mmol) e K2C03 (281 mg, 2,04 mmol), e a mistura foi agitada, durante a noite, à temperatura ambiente. A suspensão, então, foi vazada em 200 mL de água, agitada à temperatura ambiente, por 30 min, então, resfriada no refrigerador por 30 min. O sólido resultante foi coletado por filtração a vácuo e recristalizado a partir de EtOH, para levar a 285 mg (49%) de um sólido inteiramente branco. Pf 258,0-258,2 °C. XH NMR(DMSO-ds) δ: 8,19 (s, 1H) ; 8,09 (s, 1H) ; 7,50 (m, 3H) ; 7,45 (m, 2H) ; 7,23 (m, 3H); 5,11 (d, J = 17,5 Hz, 1H) ; 4,71 (d, J = 17,5 HZ, 1H); 2,68 (S, 3H); 2,73 (q, J = 6,9 Hz, 1H); 1,34 (d, J = 6,8 Hz, 3H) ; 1,13 (d, J = 6,8 Hz, 3H) . 13C NMR (DMS0-ds) ppm: 161,9; 156,2; 152,8; 151,6; 150,1; 148,4; 146,1; 142,2; 140,8; 134,3; 133,7; 130,6; 130,0; 129,0; 127,7; 127,6; 125,8; 119,2; 118,4; 44,8; 28,3; 24,4; 23,3; 22,9. MS (ES): m/z 426,4 (M+) . Análise calculada para: C24H23N7O: C, 67,75; H, 5,45; N, 23,04. Encontrado: C, 67,60; H, 5,45; N, 22,82.
Composto D-030 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-(2-toluil)-3H-quinazolin-4-ona Cloreto de tionila (2,2 mL, 30 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de ácido 2-amino-6-metilbenzóico (1,51 g, 10 mmol) em benzeno (50 mL) , e a mistura foi aquecida em refluxo por 18 h. Uma vez resfriada, o solvente foi removido in vacuo e extraído duas vezes com benzeno (25 mL) . O resíduo foi dissolvido em CHCI3 (50 mL) e tratado com 2-toluidina (2,13 mL, 20 mmol). A suspensão foi aquecida, então, em refluxo por 3 h. Naquele momento, a TLC (50% de EtOAc/hexano) indicou que a reação estava completa. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a mistura de reação foi vazada pelo topo de um plugue de 4 cm de sílica gel e descarregada com 2 0% de EtOAc/hexano. O produto contendo frações foi combinado e concentrado in vacuo. O resíduo foi dissolvido em HOAc (50 mL) e tratado com cloreto de cloroactila (1,6 mL, 20 mmol) , e a mistura foi aquecida em refluxo por 18 h. A reação foi resfriada e concentrada in vacuo. 0 HOAc remanescente foi removido por removido por azeotropismo com tolueno (25 mL) três vezes. O resíduo foi dissolvido em tolueno (10 mL) e vazado através de um plugue de 4 cm de sílica gel, descarregando com 20% de EtOAc/hexano. O produto contendo frações foi identificado por LCMS (MS (ES): m/z 299 (M+)) , e concentrado in vacuo, para levar a 476 mg (16%) como uma espuma branca. O cloreto de espuma branca (470 mg, 1,57 mmol) foi dissolvido em DMF (10 mL) e tratado com adenina (423 mg, 3,14 mmol) e K2C03 (433 mg, 3,14 mmol), e a mistura foi agitada, durante a noite, â temperatura ambiente. A suspensão, então, foi vazada em 200 mL de H20, agitada à temperatura ambiente, por 30 min, então, .resfriada no refrigerador por 30 min. O sólido resultante foi coletado por filtração a vácuo e recristalizado a partir de EtOH, para levar a 123 mg (20%) de um sólido inteiramente branco. Pf 281,5-282,7 °C (decompõe-se). 3Η NMR(DMS0-d6) δ: 8,07 (s, 1H) ; 8,05 (s, 1H) ; 7,61 (t, J = 7,8 Hz, 1H) ; 7,48 (m, 4H) ; 7,25 (m, 3H) ; 5,09 (d, J = 17,4 Hz, 1H); 4,76 (d, J = 17,4 Hz, 1H); 2,73 (s, 3H); 2,18 (s, 3H) . 13C NMR (DMSO-ds) ppm: 161,3; 156,2; 152,8; 151,4; 150,0; 148,5; 142,2; 140,9; 136,1; 135,4; 134,3; 131,7; 130,1; 130,0; 129,0; 128,0; 125,8; 119,2; 118,5; 44,8; 22,9; 17,4. MS (ES): m/z 398,2 (M+). Análise calculada para: C22Hi9N70: C, 66,49; H, 4,82; N, 24,67. Encontrado: C, 66,29; H, 4,78; N, 24,72.
Composto D-031 3- (2-Fluorofenil)-5-metil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Cloreto de tionila (2,2 mL, 30 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de ácido 2-amino-6-metilbenzóico (1,51 g, 10 mmol) em benzeno (50 mL), e a mistura foi aquecida em refluxo por 18 h. Uma vez resfriada, o solvente foi removido in vacuo e extraído duas vezes com benzeno (25 mL) . O resíduo foi dissolvido em CHC13 (50 mL) e tratado com 2-fluoroanilina (1,93 mL, 20 mmol). A suspensão foi tratada em refluxo por 3 h. Naquele momento, a TLC (50% de EtOAc/hexano) indicou que a reação estava completa. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a mistura de reação foi vazada pelo topo de um plugue de 4 cm de sílica gel e descarregada com 2 0% de EtOAc/hexano. O produto contendo frações foi combinado e concentrado in vacuo. O resíduo foi dissolvido em HOAc (50 mL) e tratado com cloreto de cloroacVila (1,6 mL, 20 mmol), e a mistura foi aquecida em refluxo por 18 h. A reação foi resfriada e concentrada in vacuo. O HOAc remanescente foi removido por removido por azeotropismo com tolueno (25 mL) três vezes. O resíduo foi dissolvido em tolueno (10 mL) e vazado através de um plugue de 4 cm de sílica gel, descarregando com 20% de EtOAc/hexano. 0 produto contendo frações foi identificado por LCMS (MS (ES) : m/z 303 (M+) ) , e concentrado in vacuo, para levar a 1,12 g (37%) como uma espuma branca. O cloreto de espuma branca (455 mg, 1,50 mmol) foi dissolvido em DMF (10 mL) e tratado com monoidrato de mercaptopurina (510 mg, 3,0 mmol) e K2C03 (414 mg, 3,0 mmol), e a mistura foi agitada, durante a noite, à temperatura ambiente. A suspensão, então, foi vazada em 200 mL de água, agitada à temperatura ambiente, por 30 min, então, resfriada no refrigerador por 30 min. 0 sólido resultante foi coletado por filtração a vácuo e recristalizado a partir de EtOH, para levar a 487 mg (77%) de um sólido inteiramente branco. Pf 151,9-152,2 °C. 1HNMR (DMSO-dg) δ: 8,48 (s, 1H) ; 8,44 (s, 1H) ; 7,70 (m, 2H); 7,48 (m, 2H); 7,33 (m, 3H); 4,55 (d, J = 15,1 Hz, 1H) ; 4,48 (d, J = 15,1 Hz, 1H) ; 2,73 (s, 3H) . 13C NMR (DMSO-ds) ppm: 161,3; 157,8 (d, J = 249,1 Hz) ; 156,9; 152,8; 151,5; 149,6; 148,6; 143,6; 140,9; 134,7; 131,9 (d, J = 8,0 Hz) ; 131,4; 130,2; 125,6 (d, J = 3,6 Hz); 125,5; 124,4 (d, J = 13,5 Hz) ; 118,8; 116,6 (d, J = 19,6 Hz) ; 56,4; 22,9. MS (ES): m/z 419,5 (M+). Análise calculada para: C21Hi5FN6OS*0,15C2H6O: C, 60,14; H, 3,77; F, 4,47; N, 19,76; S, 7,54. Encontrado: C, 59,89; H, 3,88; F, 4,42; N, 19,42; S, 7,23.
Composto D-032 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-o-tolil-3H-quinazolin- 4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 2j (200 mg, 0,626 mmol), adenina (93 mg, 0,689 mmol), K2C03 (95 mg, 0,689 mmol), e DMF (3 mL) . O produto bruto foi cromatografado em MeOH/CH2Cl2, para prover 101 mg de um sólido inteiramente branco (39%), pf 262,0-266,5 °C. ^ NMR (DMS0-d6) δ: 8,08 (s, 1H) ; 8,07 (s, 1H) ; 7,70 (t, J = 8,0 Hz, 1H) ; 7,58 (dd, J = 0,6, 7,9 Hz, 1H) ; 7,43 - 7,57 (m, 4H); 7,36 (dd, J = 0,7, 8,0 Hz, 1H); 7,26 (br s, 2H); 5,12 (d, J = 18 Hz, 1H); 4,78 (d, J = 18 Hz, 1H) ; 2,20 (s, 3H) . 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,7; 156,2; 152,9; 152,7; 150,0; 149,4; 142,1; 136,1; 135,1; 135,0; 133,2; 131,8; 130,3; 130,1; 128,9; 128,1; 127,2; 118,5; 117,9; 44,9; 17,4. MS (ES): m/z 418,1 (M+). Análise calculada para: C21H1SCIN7OO, 1Η2Ο·0,05KC1: C, 59,57; H, 3,86; Cl, 8,79; N, 23,16. Encontrado: C, 59,65; H, 3,80; Cl, 8,7 0;N, 22,80.
Composto D-033 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-5-cloro-3-(2-metoxifenil)-3H-quinazolin-4-ona Preparado de acordo com o Procedimento C, usando-se o Intermediário 21 (250 mg, 0,746 mmol), adenina (111 mg, 0,821 mmol), K2C03 (113 mg, 0,821 mmol), e DMF (4 mL) . O produto bruto foi cromatografado em MeOH/CH2Cl2 e recristalizado a partir de EtOH, para prover 124 mg de um Sólido marrom (38%), pf 257,0-257,1 °C. ΧΗ NMR(DMSO-d6) δ: 8,06 (s, 1H) ; 8,01 (s, 1H) ; 7,71 (t, J = 8,0 Hz, 1H) ; 7,57 (dd, J = 0,9, 7,9 Hz, 1H); 7,52 - 7,59 (m, 1H); 7,50 (dd, J = 1,6, 7,8 Hz, 1H); 7,38 (dd, J = 1,1, 8,2 Hz, 1H); 7,27 (dd, J = 0,6, 8,3 Hz, 1H) ; 7,24 (br S, 2H) ; 7,17 (dt, J = 0,9, 7,6 Hz, 1H); 5,07 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,97 (d, J = 17 Hz, 1H) ; 3,79 (s, 3H) . 13C NMR (DMSO-dg) ppm: 158,8; 156,2; 154,7; 153,2; 152,8; 150,1; 149,3; 142,0; 135,1; 133,2; 131,8; 130,1; 130,1; 127,2; 123,8; 121,6; 118,4; 117,9; 113,1; 56,2; 44,8. MS (ES): m/z 434,0 (M+) . Análise calculada para: C21Hi6ClN7O2*0,5Η20·0,04KC1: C, 56,57; H, 3,84; Cl, 8,27; N, 21,99. Encontrado: C, 56,29; H, 3,75; Cl, 8,21;N, 21,61.
Os compostos a seguir foram feitos, geralmente, de acordo com os métodos descritos acima, e servem para ilustração, adicionalmente, das montagens específicas dos compostos da invenção: 3-(2,6-diclorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-034)^' 3-(2-isopropilfenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-035)^ 3-(2-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-036) 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-037) 3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-038) 3-morfolin-4-il-2-(9H-purin-5-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato (D-039) 3-(3-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-040) ^ 3-(3-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-041) ^ 2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-piridin-4-il-3H-quinazolin-4-ona (D-042) 3- benzil-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-043)i^ 3-(4-metilpiperazin-l-il) -2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato (D-044) ^ [5-fluoro-4-oxo-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)^4H-quinazolin-3-il] éster etila de ácido acético (D-045)>^ 3-(2-metoxifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-046) 3-(2-metoxifenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)- 3H-quina.zolin-4-ona (D-047) 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (D-048) 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-quinazolin- 4-ona (D-049) 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-butil-3H-quinazolin-4-ona (D-050) 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-3-morfolin-4-il-3H-quinazolin-4-ona, sal de acetato (D-051) 3- (4-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-052) Os compostos adicionais da presente invenção foram preparados pelos procedimentos sintéticos a seguir.
Os intermediários a seguir foram preparados pelo Procedimento A descrito acima. 3a R = ciclopropila 3b R = ciclopropilmetila 3c R = fenetila 3d R = ciclopentila 3e R = 3-(2-cloro)piridila 3f R = ácido 4-(2-metila) benzóico 3g R = 4-nitrobenzila 3h R = cicloexila 3i R = E-(2-fenil)ciclopropila Os compostos adicionais da presente invenção (D-053 a D-070) tendo a estrutura de núcleo a seguir, são discutidos na Seção Experimental a seguir. Todos foram preparados de acordo com o Procedimento C.
Estrutura de núcleo: 2-(2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-3-ciclopropil-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (D-053) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3a {100 mg, 0,4 mmol) , 2-amino-6-mercaptopurina (80 mg, 0,48 mmol) e K2C03 {77 mg, 0,56 mmol). O produto foi purificado por trituração a partir de H20. XH NMR(DMSO-d6) δ: 7,89 (d, J = 0,9 Hz, 1H) ; 7,54 (t, J = 7,4 Hz, 1H) ; 7,34 (dd, J = 8,1 Hz, 1H); 7,19 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 6,28 (s, 2H); 4,94 (s, 2H) ; 2,70 (s, 3H) ; 1,24 (d, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,94 (s, 2Η); 2,70 (s, 3H); 1,24 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 0,91 (s, 2H). MS (ES): m/z 380 (M+H), 190. 3-Ciclopropilmetil-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-054) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3b (300 mg, 1,14 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (214 mg, 1,26 mmol) e K2C03 (189 mg, 1,37 mmol). 0 produto foi purificado por trituração a partir de H20, seguido por uma recristalização a partir de MeOH. XH NMR (DMSO-d6) δ: 13,60 (br s, 1H) ; 8,72 (s, 1H) ; 8,48 (s, 1H) ; 7,63 (t, J = 7,8 Hz, 1H) ; 7,42 (d, J = 8,0 Hz, 1H) ; 7,28 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 5,01 (s, 2H); 4,11 (d, J = 6,8 Hz, 2H); 2,78 (s, 3H); 1,35 (quint, J = 6,2 Hz, 1H); 0,44 - 0,59 (m, 4H). MS (ES): m/z 379 (M+H), 325. 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)3-ciclopropilmetil-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (D-055) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3b (3 0 0 mg, 1,14 mmol), adenina (170 mg, 1,2 6 mmol) e K2C03 (189 mg, 1,37 mmol). 0 produto foi purificado por trituração a partir de H20, seguido por uma recristalização a partir de MeOH. ΧΗ NMR(DMSO-d6) δ: 8,21 (s, 1H) ; 8,10 (s, 1H) ; 7,52 (t, J = 7,7 Hz, 1H) ; 7,18 - 7,31 (m, 3H) ; 7,06 (d, J = 8,1 Hz, 1H) ; 5,68 (s, 2H) ; 4,14 (d, J = 6,8 Hz, 2H); 2,77 (s, 3H); 1,34 (quint, J = 6,4 Hz, 1H); 0,45 -0,60 (m, 4H). MS (ES): m/z 362 (M+H), 308. 2-(2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-ciclopropilmetil- 5-metil-3H-quinazolin-4-ona (D-056) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3b (280 mg, 1,1 mmol), 2-amino-6-mercaptopurina (200 mg, 1,2 mmol) e K2C03 (180 mg, 1,3 mmol) . O produto foi purificado por trituração a partir de MeOH. 1H NMR(DMSO-d6) δ: 12,70 (br s, 1H) ; 7,95 (s, 1H) ; 7,64 (t, J = 7,8 Hz, 1H) ; 7,44 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 7,28 (d, J = 7,4 Hz, 1H) ; 6,41 (s, 2H); 6,41 (s, 2H); 4,91 (s, 2H); 4,05 (d, J = 6,8 Hz/ 2H) ; 2,78 (s, 3H); 1,26 - 1,43 (m, 1H); 0,36 - 0,56 (m, 4H). MS (ES): m/z 394 (M+H), 340. 5-Metil-3-fenetil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-057) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3c (750 mg, 2,4 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (442 mg, 2.6 mmol) e K2C03 (398 mg, 2,9 mmol). O produto foi purificado por trituração a partir de H20. 1H NMR(DMSO-de) δ: 13,61 (s, 1H); 8,71 (s, 1H); 8,48 (s, 1H); 7,65 (t, J = 7.7 Hz, 1H); 7,44 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 7,16-7,35 (m, 6H); 4,89 (s, 2H); 4,29 (br t, J = 7,9 Hz, 2H); 3,08 (br t, J = 7.8 Hz; 2H); 2,81 (s, 3H). MS (ES): m/z 429 (M+H), 105. 2- (2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-fenetil-3H-quinazolin-4-ona (D-058) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3c (750 mg, 2,4 mmol), 2-amino-6-mercaptopurina (435 mg, 2,6 mmol) e K2C03 (398 mg, 2,9 mmol). 0 produto foi purificado por trituração a partir de H20. 1H NMR(DMSO-d6) δ: 12,61 (S, 1H); 7,95 (s, 1H); 7,65 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,45 (d, J = 7,9 Hz, 1H) ; 7,14 - 7,32 (τη, 6H) ; 6,44 (s, 2H) ; 4,81 (s, 2H); 4,24 (br t, J = 7,9 Hz, 2H); 3,04 (br t, J = 7,8 Hz, 2H); 2,81 (s, 3H). MS (ES): m/z 444 (M+H), 340. 3- Ciclopentil-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-059) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3d (100 mg, 0,36 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (73 mg, 0,43 mmol) e K2C03 (100 mg, 0,72 mmol) . O produto foi purificado por recristalização a partir de MeOH. 1H NMR (DMSO-dg) δ: 13,62 (br s, 1H) ; 8,77 (s, 1H) ; 8,48 (s, 1H) ; 7,62 (t, J = 7,7 Hz, 1H) ; 7,42 (d, J = 7,8 Hz, 2H) ; 7,26 (d, J = 7,4 Hz, 1H) ; 5,03 (s, 2H) ; 4,80 (quint, J = 8,0 Hz, 1H); 2,76 (s, 3H); 2,12 - 2,31 (m, 2H); 1,79 - 2,04 (m, 4H) ; 1,44 - 1,58 (τη, 2H) . MS (ES): m/z 393 (M+H) , 325. 2- (6-Aminopurin-9-ilmetil) -3-ciclopentil-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (D-060) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3d (100 mg, 0,36 mmol), adenina (58 mg, 0,43 mmol) e K2C03 (100 mg, 0,72 mmol). 0 produto foi purificado por recristalização a partir de MeOH. 1H NMR(DMSO-d6) δ: 8,15 (s, 1H) ; 8,11 (s, 1H) ; 7,52 (t, J = 7,7 Hz, 1H) ; 7,16 - 7,31 (m, 3H); 7,10 (d, J = 8,0 Hz, 2H); 5,68 (s, 2H); 4,78 (quint, J = 8,3 Hz, 1H); 2,74 (s, 3H); 2,09 - 2,32 (m, 2H) ; 1,86- 2,04 (m, 2H) ; 1,68 - 1,86 (m, 2H) ; 1,43 - 1,67 (m, 2H). MS (ES): m/z 376 (M+H), 308, 154. 3- (2-Cloro-piridin-3-il)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-061) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3e (500 mg, 1,6 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (289 mg, 1,7 mmol) e K2C03 (262 mg, 1,9 mmol). O produto foi purificado por trituração a partir de H20. MS (ES): m/z 436 (M+H), 200. 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-cloro-piridin-3-il)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (D-062) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3e (500 mg, 1,6 mmol), adenina (230 mg, 1,7 mmol) e K2C03 (262 mg, 1,9 mmol). O produto foi purificado por trituração a partir de H20. 1H NMR(DMSO-d5) δ: 8,59 {dd, J = 1,7, 4,8 Hz, 1H) ; 8,22 (dd, J = 1,7, 7,8 Hz, 1H) ; 8,025 (s, 1H) ; 8,017 (s, 1H) ; 7,60 - 7,72 (m, 2H) ; 7,35 (t, J = 8,2 Hz, 2H); 7,22 (s, 2H); 5,12 (d, J = 17,0 Hz, 1H); 5,02 (d, J = 17,0 Hz, 1H); 2,72 (s, 3H). MS (ES): m/z 419 (M+H). Ácido_____3-metil-4-[5-metil-4-oxo-2-(9H-purin-6-ilsulfanil metil)-4H-quinazolin-3-il]-benzóico (D-063) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3f (400 mg, 1,17 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (219 mg, 1,29 mmol) e K2C03 (226 mg, 1,64 mmol). O produto foi purificado por recristalização a partir de MeOH. 1H NMR(DMS0-d6) δ: 13,54 (br s, 1H) ; 8,44 (s, 1H) ; 8,42 (s, 1H); 7,80 (s, 2H); 7,71 (t, J = 7,7, 4,8 Hz, 1H); 7,59 (d, J = 8,6 Hz, 1H) ; 7,52 (d, J = 7,9 Hz, 1H) ; 7,34 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 4,46 (d, J = 15,4 Hz, 1H); 4,34 (d, J = 15,7 Hz, 1H); 3,17 (d, J = 4,4 Hz, 1H); 2,73 (s, 3H); 2,17 (s, 3H). MS (ES): m/z 459 (M+H). 3-Ciclopropil-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-064) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3a (100 mg, 0,40 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (90 mg, 0,53 mmol) e K2C03 (97 mg, 0,7 mmol) . O produto foi purificado por trituração a partir de H20. XH NMR(DMS0-d5) δ: 8,69 (d, J = 0,8 Hz, 1H); 8,47 (s, 1H); 7,57 (d, J = 7,9 Hz, 1H) ; 7,37 (d, J = 8,1 Hz, 1H) ; 7,23 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 5,08 (s, 2H); 3,06 - 3,18 (m, 1H); 2,74 (s, 3H); 1,14 - 1,36 (m, 2H) ; 0,92 - 1,06 (m, 2H) . MS (ES): m/z 419 (M+H). 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil) -3-ciclopropil-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (D-065) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3a (100 mg, 0,40 mmol), adenina (94 mg, 0,7 rranol) e K2C03 (121 mg, 0,88 mmol). 0 produto foi purificado por trituração a partir de H20. 1H NMR (DMSO-ds) δ: 8,19 (d, J = 0,9 Hz, 1H) ; 8.09 (d, J = 1,0 Hz, 1H); 7,48 (7, J = 7,8 Hz, 1H); 7,13 -7,29 (m, 3H); 7,04 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 5,74 (s, 2H); 3,00 - 3,13 (m, 1H); 2,73 (s, 3H); 1,18 - 1,38 (m, 2H) ; 0,94 - 1.09 (m, 2H). 5-Metil-3-(4-nitro-benzil)-(2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-066) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3g (200 mg, 0,58 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (148 mg, 0,87 mmol) e K2C03 (160 mg, 1,16 mmol). O produto foi purificado por trituração a partir de MeOH. XH NMR(DMSO-ds) δ: 13,44 (br s, 1H) ; 8,50 (s, 1H) ; 8,31 (s, 1H) ; 8,03 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 7,58 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,37 (d, J = 8,3 Hz, 3H) ; 7,22 (d, J = 7,5 Hz, 1H) ; 5,44 (s, 2H) ; 4,70 (s, 2H); 2,66 (s, 3H). MS (ES): m/z 460 (M+H). 3-Cicloexil-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-067) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3h (150 mg, 0,52 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (97 mg, 0,57 mmol) e K2C03 (86 mg, 0,62 mmol). 0 produto foi purificado por trituração a partir de MeOH. *H NMR(DMSO-d6) δ: 13,66 (br s, 1H); 8,82 (s, 1H); 8,50 (s, 1H); 7,62 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,42 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,26 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 5,01 (s, 2H); 4,11 (br s, 1H); 2,75 (s, 3H); 2,38 - 2,65 (m, 2H); 1,58 - 1,90 (m, 4H) ; 1,37 - 1,57 (m, 1H) ; 0,71 - 1,26 (m, 3H). MS (ES): m/z 407 (M+H), 325. 2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-3-cicloexil-5-metil-3H- quinazolin-4-ona (D-068) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3h (150 mg, 0,52 mmol), adenina (77 mg, 0,57 mmol) e K2C03 (86 mg, 0,62 mmol). 0 produto foi purificado por trituração a partir de MeOH. *H NMR(DMSO-d6) δ: 8,15 (s, 2H) ; 7,54 (t, J = 7,9 (m, 3H); 7,06 - 7,35 (m, 4H); 5,65 (s, 2H); 4,09 (br s, 1H); 2,73 (s, 3H); 1,41 - 1,90 (m, 6H); 0,99 - 1,34 (m, 4H). MS (ES): m/z 390 (M+H), 308. 2-(2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-cicloexil-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (D-069) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3h (150 mg, 0,52 mmol), 2-amino-6-mercaptopurina (95 mg, 0,57 mmol) e K2C03 (86 mg, 0,62 mmol). O produto foi purificado por HPLC de fase reversa (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4.7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector a 220) . MS (ES) : m/z 422 (Μ + H), 340, 170. 5-Metil-3-(Ε-2-fenil-ciclopropil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-070) Preparado de acordo com o procedimento C, usando-se 3i e monoidrato de 6-mercaptopurina. O produto foi purificado por HPLC de fase reversa (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4.7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector a 220) . MS (ES) : m/z 441.
Os compostos adicionais da invenção se seguem, juntamente com a rota sintética para os compostos D-071 a D-118 .
Procedimento D: Uma mistura de amida 4a ou 4b, FMOC-glicil-cloreto e ácido acético glacial foi aquecida até 120 °C, por de 1 a 4 horas. A mistura resultante foi concentrada in vacuo e purificada por cromatografia rápida, para prover a amina ciclizada. Este material foi combinado com 10 equivalentes de octanotiol e uma quantidade catalítica de DBU em THF e agitado à temperatura ambiente, até que o consumo do material de partida fosse indicado por LCMS. A reação foi vazada diretamente em uma coluna rápida (equilibrada em CH2C12) e eluída com 0 a 5% de MeOH/CH2Cl2, para prover a amina livre, 5a ou 5b. O composto 5c foi preparado de uma maneira análoga, usando-se (+) FMOC-alanil-cloreto no lugar de FMOC-glicil-cloreto.
Procedimento E: Quantidades equimolares de 5a ou 5b, a 6-cloropurina apropriada e DIEA foram combinadas com EtOH em um pequeno frasco e aquecidas até 80 °C. A reação foi monitorada regularmente por LCMS e purificada, como estabelecido.
Procedimento F: Uma mistura de amida 4b, cloreto de acetoacetila e ácido acético glacial foi aquecida até 120 °C e agitada por 2 horas. A reação resfriada foi filtrada e os sólidos lavados com CH2C12, para prover o acetato ciclizado como um sólido branco. Este material foi combinado com K2C03 em metanol aquoso e agitado por uma hora, então, concentrado in vacuo. Os sólidos resultantes foram triturados a partir de H20, para provisão de 6a como um sólido branco. 3-(2-Clorofenil)-5-fluoro-2-[(9H-purin-6-ilamino)-metil]-3H-quinazolin-4-ona (D-072) Preparado de acordo com o procedimento E, usando-se 5b (50 mg, 0,165 mmol) e 6-cloropurina (26 mg, 0,165 mmol) em 1 mL de Et OH. Após 5 dias, a reação é purificada por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ). *H NMR(DMSO-d6) δ: 12,99 (br s, 1H); 8,14 (br S, 1H); 8,12 (s, 1H); 7,85 (dt, J = 5,7, 8,1 Hz, 1H) ; 7,68 - 7,79 (m, 3H) ; 7,57 (t, J = 6,2 Hz, 1H) ; 7,57 (d, J = 7,7 Hz, 1H) ; 7,50 (d, J = 8,1 Hz, 1H) ; 7,35 (dd, J = 8,4, 10,7 Hz, 1H) ; 4,15 - 4,55 (m, 2H) . MS (ES): m/z 422 (M+H), 211. 2-[(2-Amino-9H-purin-6-ilamino)metil]-3-(2-clorofenil)-5-fluoro-3H-quinazolin-4-ona (D-074) Preparado de acordo com o procedimento E, usando-se 5b (50 mg, 0,165 mmol) e 2-amino-6-cloropurina (28 mg, 0,165 mmol) em 1 mL de EtOH. Após 5 dias, a reação é purificada por HPLC (coluna Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ). 1H NMR(DMSO-d6) δ: 12,13 (br s, 1H) ; 7,86 (dt, J = 5,6, 8,2 Hz, 1H) ; 7,76 - 7,83 (m, 1H); 7,68 (br s, 1H); 7,61 (t, J = 5,7 Hz, 1H); 7,61 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 7,53 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 7,35 (dd, J = 8,2 Hz, 1H); 5,66 (br s, 2H); 4,16 - 4,50 (m, 1H); 4,09 (q, J = 5,3 Ηζ, 2Η). MS (ES): m/z 437 (M+H), 219. 5-Metil-2-[(9H-purin-6-ilamino)metil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-071) Preparado de acordo com o procedimento E, usando-se 6-cloropurina (11 mg, 0,072 mmol) e 5a (20 mg, 0,072 mmol) . Após 5 dias, a reação foi resfriada com água e a suspensão resultante filtrada. Os sólidos foram purificados por HPLC (coluna Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ). 1H NMR(DMSO-d6) δ: 12,98 (br s, 1H) ; 8,14 (br s, 1H) ; 8,10 (s, 1H) ; 7,58 - 7,79 (m, 2H) ; 7,37, 7,48 (m, 4H) ; 7,26 - 7,36 (m, 2H) ; 3,93 - 4,39 (m, 2H) ; 2,75 (s, 3H) ; 2,18 (s, 3H) . MS (ES): m/z 398 (M+H), 199. 2-[(2-Amino-(9H-purin-6-ilamino)metil]-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-073) Preparado de acordo com o procedimento E, usando-se 5a (189 mg, 0,677 mmol) e 2-amino-6-cloropurina (115 mg, 0,677 mmol) em 3 mL de EtOH. Após 3 dias, a reação foi filtrada para remoção do excesso de purina e o filtrado purificado por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) , para prover 7 mg do produto como o sal de TFA. 1H NMR(DMS0-d6) δ: 8,88 (br s, 1H) ; 8,21 (s, 1H) ; 7,71 (t, J = 7,7 Hz, 1H) ; 7,45 - 7,56 (m, 2H) ; 7,38 - 7,44 (m, 3H) ; 7,35 (d, J = 7,5 Hz, 1H) ; 7,30 (br s, 1H); 4,40 (dd, J = 4,5, 17,5 Hz, 1H); 4,27 (dd, J = 5,3, 17,4 Hz, 1H); 2,75 (s, 3H) ; 2,09 (s, 3H) . MS (ES): m/z 413 (M+H), 207, 163. 2-[(2-Fluoro-(9H-purin-6-ilamino)metil]-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-076) Preparado de acordo com o procedimento E, usando-se 5a (20 mg, 0,072 mmol) e 2-fluoro-6-cloropurina (16 mg, 0,094 mmol) em 1 mL de EtOH. Após 18 horas, a reação foi purificada por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) e, subsequentemente, recristalizada a partir de EtOH, para prover 14 mg do produto como um sólido amarelo. 2Η NMR(DMSO-d6) δ: 13,12 (br s, 1H) ; 8,40 (br s, 1H) ; 8,15 (s, 1H) ; 7,66 (t, J = 7,7 Hz, 1H) ; 7,35 - 7,49 (m, 4H) ; 7,31 (d, J = 7,2 Hz, 1H) ; 4,00 - 4,22 (m, 2H) ; 3,17 (s, 1H) ; 2,74 (s, 3H) ; 2,18 (s, 3H) . MS (ES): m/z 416 (M+H), 208. (2-Clorofenil)-dimetilamino-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-075) D-015 (100 mg, 0,228 mmol) foi combinado com hidróxido de amônio (28 a 30%, 1 mL) em DMF (2 mL) e aquecido até 80 °C. Após 2 dias, a reação foi purificada por HPLC (coluna Cl 8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 22 0 λ) , para prover o produto como um sólido amarelo, ~ 2 mg. XH NMR(DMS0-d6) δ: 13,52 (br s, 1H); 8,46 (s, 1H); 8,42 (s, 1H); 7,69 (dd, J = 2,1, 7,3 Hz, 1H); 7,62 (dd, J = 1,6, 7,6 Hz, 1H); 7,61 (t, J = 8,0 Hz, 1H) ; 7,37 - 7,48 (m, 2H) ; 7,05 (d, J = 7,9 Hz, 1H) ; 6,96 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 4,32 - 4,45 (m, 2H) ; 2,80 (m, 6H) . MS (ES): m/z 464 (M+H), 232. 5-(2-Benziloxietóxi)-3-(2-clorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-078) ^ A uma solução de 2-benziloxietanol (0,3 mL) em DMF (1,0 mL) foi adicionado NaH (50 mg, 2,08 mmol). Após agitação por 5 minutos, 0,5 mL foi adicionado a uma solução de IC-87185 (50 mg, 0,114 mmol) em DMF anidro (0,75 mL) . A reação foi aquecida até 50 °C e agitada por 3 dias. A purificação por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) prove o produto como um sólido heterogêneo, 150 μπι. MS (ES) : m/z 571 (M+H) , 481.
Ester_____de____3- (2-Clorofenil) -5-f luoro-4-oxo-3,4-diidro- quinazolin-2-ilmetila de ácido 6-aminopurin-9-carboxílico (D-079) A uma solução de 3b (20 mg, 0,066 mmol) em CH2C12 (500 μΐι) a 0 °C foi adicionado fosgênio (2M/tolueno, 36 μΐ,, 0,072 mmol), seguido por adenina (10 mg, 0,072 mmol) e DIEA (25 μΙ>, 0,145 mmol). A reação foi deixada atingir a temperatura ambiente e agitada por 8 dias. A purificação por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 22 0 λ) prove o produto como uma mistura. 1H NMR(DMS0-d5) δ: 11,04 (br s, 1H) ; 8,61 (s, 1H); 8,40 (s, 1H); 7,85 - 7,95 (m, 1H); 7,76 (dd, J = 5,4, 9,6 Hz, 1H); 7,70 - 7,78 (m, 1H); 7,52 - 7,63 (m, 3H); 7,38 (d, J = 8,3, 10,6 Hz, 1H) ; 4,76 - 4,89 (m, 2H) . MS (ES): m/z 466 (M+H), 331, 305. Ν- [3-(2-Clorofenil)-5-fluoro-4-oxo-3,4-diidro-quinazolin-2-ilmetil]-2-(9H-purin-6-ilsulfanil)-acetamida (D-077) (9H-Purin-6-ilsulfanil)ácido acético (63 mg, 0,296 mmol) , 5b (108 mg, 0,355 mmol) , EDC (68 mg, 0,355 mmol), HOBT (48 mg, 0,355 mmol), DIEA (62 μι, 0,355 mmol) e DMF (1 mL) foram combinados em um frasco e agitados à temperatura ambiente por uma hora. A reação foi diluída com EtOAc (20 mL) e lavada com salmoura diluída (2 x 13 mL) . A fase orgânica foi concentrada in vacuo e cromatografada em 5% de MeOH/CH2Cl2, para prover os 91 mg do produto como uma espuma pêssego viscosa. 1H NMR(DMSO-d6) δ: 12,88 (br s, 1H) ; 8,72 (s, 1H); 8,62 (t, J= 5,0 Hz, 1H); 8,49 (s, 1H) ; 7,88 (dt, J = 5,6, 8,2 Hz, 1H); 7,73 - 7,78 (m, 1H); 7,67 -7,72 (m, 1H) ; 7,57 - 7,65 (m, 2H) ; 7,38 (d, J = 8,1 Hz, 1H) ; 7,36 (dd, J = 8,3 - 11,1 Hz, 1H) ,· 4,11 - 4,24 (m, 2H) ; 3,96 (dd, J = 5,0, 17,4 Hz, 1H) ; 3,78 (dd, J = 5,2, 17,4 Hz, 1H). MS (ES): m/z 496 (M+H), 248. 2-[1-(2-Fluoro-(9H-purin-6-ilamino)etil]-5-metil-3-o-tolil- 3H-quinazolin-4-ona (D-080) Preparado de acordo com o procedimento E, usando-se 5c (50 mg, 0,17 mmol) e 2-fluoro-6-cloropurina (35 mg, 0,204 mmol) em 1,2 mL de EtOH. A purificação por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) proveu dois atropisômeros como sólidos brancos. XH NMR(DMSO-dg) δ: 8,48 (br d, J = 6,4 Hz, 1H) ; 8,17 (s, 1H) ; 7,69 (t, J = 7,8 Hz, 1H) ; 7,53 (d, J = 7,8 Hz, 1H) ; 7,44 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 7,33 (d, J = 7,2 Hz, 2H); 7,07 (br t, J = 7,2 Hz, 1H) ; 4,80 (br t, J = 6,8 Hz, 1H) ; 2,74 (s, 3H) ; 2,09 (s, 3H) , 1,38 (d, J = 6,7 Hz, 3H) . MS (ES): m/z 430 (M+H), 215. 5-Metll-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)etil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-081) Preparado de acordo com o procedimento E, usando-se 5c (50 mg, 0,17 mmol) e 6-cloropurina (32 mg, 0,204 mmol) em 1,2 mL de EtOH. A purificação por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) proveu dois atropisômeros como sólidos amarelos. Dados para um desses como se segue: XH NMR(DMSO-d6) δ: 8,39 (br s, 1H) ; 8,34 (s, 1H) ; 8,18 (s, 1H) ; 7,71 (t, J = 7,7 Hz, 1H) ; 7,56 (d, J = 7,9 Hz, 1H) ; 7,49 (d, J = 6,9 Hz, 1H) ; 7,28 - 7,43 (m, 3H); 7,20 (br s, 1H) ; 5,06 (br s, 1H); 2,73 (s, 3H) ; 2,04 (s, 3H) ; 1,51 (d, J = 6,6 Hz, 3H) . MS (ES): m/z 412 (M+H), 206.
Os compostos a seguir da presente invenção (D-082 a D-109) foram preparados como destacado no procedimento C, usando 2-clorometil-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (10 mg) , o nucleófilo apropriado XH (20 mg, excesso) e carbonato de potássio (10 mg) em DMF (0,25 mL) . A mistura de reação foi agitada 16 h à temperatura ambiente, resfriada com água, e o produto sólido bruto foi coletado por filtração e seco ao ar. 0 material bruto foi dissolvido em 0,5 mL de DMSO e purificado por HPLC de fase reversa (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ). Assinante frações apropriadas foram concentradas in vacuo, para levar aos produtos finais. 2-(6-Dimetilaminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-082) Produção: 8,1 mg. XH NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 8,13 (s, 1H) , 8,11 (s, 1H) , 7.60 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,54 - 7,38 (m, 4H), 7,30 (d, J = 7.4 Hz, 1H) , 7,20 (d, J = 8,1 Hz, 1H) , 5,11 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 3,33 (s, 6H), 2,73 (s, 3H), 2,20 (s, 3H). LRMS (ES pos.): m/z 426 (M+l). 5-Metil-2-(2-metil-6-oxo-l,6-diidro-purin-7-ilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-083) Produção: 3,3 mg ΧΗ NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 12,06 (s, 1H) , 8,12 (s, 1H) , 7.60 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,55 - 7,38 (m, 4H), 7,30 (d, J = 7.4 Hz, 1H) , 7,15 (d, J = 7,9 Hz, 1H) , 5,26 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 2,73 (s, 3H) , 2,32 (s, 3H) , 2,24 (s, 3H) . Alquilação a .purina N7 atribuída de forma arbitrária, com base no deslocamento para baixo no campo de prótons de metileno, devido ao grupo carbonila. LRMS (ES pos.) m/z = 413 (M+l). 5-Metil-2-(2-metil-6-oxo-l,6-diidro-purin-9-ilmetil)-3-o-tol.il-3H-quinazolin-4-ona (D-084) Purificado a partir da mesma mistura de reação que d-03. Produção 3,6 mg. 1H NMR (300 MHz, d6-DMS0) 12,17 (s, 1H) , 7,96 (s, 1H) , 7,63 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,57 - 7,39 (m, 4H) , 7,32 (d, J = 7,4 Ηζ, 1Η) , 7,26 (d, J = 8,1 Hz, 1H) , 5,08 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 2,73 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,17 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 413 (M+l). 2-(Amino-dimetilaminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-085) Produção: 6,7 mg. ΧΗ NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: .7,66 (s, 1H) , 7,61 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,55 - 7,40 (m, 4H), 7,32 - 7,26 (m, 2H), 6,74 (s, 2H), 4,94 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 2,97 (s, 6H), 2,73 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 2,08 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z 441 (M+l). 2-(2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-086) Produção: 9,5 mg. lH NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 12,54 (s, 1H) , 7,89 (s, 1H) , 7,69 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,51 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 7,51 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 7,43 (t, J = 3,9 Hz, 1H) , 7,34 - 7,26 (m, 4H) , 6,16 (s, 2H) , 4,32 (quarteto AB, JAB = 14,8 Hz Δη = 23,7), 2,74 (s, 3H), 2,09 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z 430 (M+l). 2-(4-Amino-l,3,5-triazin-2-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-087) Produção: 5,8 mg. ΧΗ NMR {300 MHz, d6-DMS0) δ: 8,10 (s, 1H) , 7,70 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,58 (s, 1H) , 7,52 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 7,48 - 7,26 (m, 6H), 4,08 (s, 2H), 2,73 (s, 3H), 2,09 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z 391 (M+l). 5-Metil-2-(7-metil-7H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-088) Produção: 3,1 mg. *Η NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 8,52 (s, 1H) , 8,49 (s, 1H) , 7,70 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,50 (d, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,45 (d, J = 7,1 Hz, 1H) , 7,35 - 7,20 (m, 4H) , 4,41 (quarteto AB, Jab = 15,3 Hz Δν = 19,2 Hz) , 4,08 (s, 3H) , 2,73 (s, 3H), 2,12 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 406 (M+l). 5-Metil-2-(2-oxo-l,2-diidro-pirimidin-4-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-089) Produção: 2,4 mg. XH NMR (300 ΜΗζ, ds-DMSO) δ: 11,49 (s, 1Η) , 7,70 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,60 (brt, J = 6,0 Hz, 1H) , 7,53 - 7,48 (m, 2H) , 7,46 - 7,28 (m, 4H) , 6,31 (d, J = 6,7 Hz, 1H) , 4,05 (s, 2H), 2,73 (s, 3H), 2,12 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 391 (M+l). 5-Metil-2-purin-7-ilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-090) XH NMR (300 MHz, dg-DMSO) δ: 9,04 (s, 1H) , 8,97 (s, 1H) , 8,48 (s, 1H) , 7,65 - 7,54 (m, 2H) , 7,53 - 7,39 (m, 3H) , 7,31 (d, J = 7,4 Hz, 1H) , 7,13 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 5,31 (d, J = 17,6 Hz, 1H) , 5,16 (d, J = 17,6 Hz, 1H) , 2,73 (s, 3H) , 2,09 (s, 3H). A alquilação na purina N7 foi determinada por melhoria de NOE entre o próton de posição 6 de purina e os prótons de metileno no ligante entre os grupos purina e quinazolinona. LRMS (ES pos.) m/z = 383 (M+l). 5-Metil-2-purin-9-ilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-091) A partir da mesma reação que produziu D-090. 2H NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 9,17 (s, 1H) , 8,86 (s, 1H) , 8,55 (s, 1H) , 7,59 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,55 - 7,42 (m, 4H) , 7,30 (d, J = 7,4 Hz, 1H) , 7,13 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 5,26 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 2,73 (s, 3H) , 2,19 (s, 3H) . Alquilação na purina N9 sugerida pela falta de melhoria de NOE entre os prótons de posição 6 de purina e os prótons de metileno de ligante. LRMS (ES pos.) m/z = 383 (M+l). 5-Metil-2-(9-metil-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-092) ΧΗ NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 8,52 (s, 1H) , 8,42 (s, 1H) , 7,69 (t, J = 7,7 Hz, 1H) , 7,50 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 7,44 (d, J = 7,6 Hz, 1H) , 7,36 - 7,27 (m, 4H) , 4,38 (quarteto AB, Jab = 15,5 Hz Δν = 21,0 Hz) , 3,80 (s, 3H) , 2,73 (s, 3H), 2,12 (s, 3H) . LRMS (ES pos.) m/z = 429 (M+l). 2-(2,6-Diamino-pirimidin-4-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-093) ΧΗ NMR (300 MHz, d6-DMS0) Ô: 7,70 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,45 - 7,27 (m, 5H) , 6,22 (br s, 1H), 3,99 (quarteto AB, = 14,6 Hz, Δν = 26,9 Hz, 2H) , 2,73 (s, 3H), 2,08 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 405 (M+l). 5-Metí1-2-(5-metil-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirimidin-7-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-094) ΧΗ NMR (300 MHz, ds-DMSO) δ: 8,57 (s, 1Η) , 7,73 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,55 - 7,35 (m, 4H), 7,18 (s, 1H), 4,27 (s, 2H) , 2,74 (s, 3H), 2,55 (a, 3H), 2,08 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 429 (M+l). 5-Metil-2-(2-metilsulfanil)-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-095) NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,30 (s, 1H) , 8,29 (s, 1H) , 7,72 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,54 (d, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,47 (d, J = 6,3 Hz, 1H) , 7,38 - 7,26 (m, 4H) , 4,34 (quarteto AB, JAB = 16,1 Hz Δν = 23,6 Hz) , 2,74 (s, 3H) , 2,32 (s, 3H), 2,10 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 461 (M+l). 2-(2-Hidróxi-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-096) ΧΗ NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,08 (s, 1H) , 7,69 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,50 (brd, J = 7,8 Hz, 2H), 7,33 - 7,50 (m, 4H), 4,28 (quarteto AB, Jab = 15,5 Hz, Δν = 21,3 Hz, 2H) , 2,74 (s, 3H), 2,12 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 431 (M+l). 5-Metil-2-(l-metil-lH-imidazol-2-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-097) ΧΗ NMR (300 ΜΗζ, ds-DMSO) δ: 7,69 (t, J = 7,8 Ηζ, 1Η) , 7,46 - 7,37 (m, 5Η), 7,32 (d, J = 7,3 Ηζ, 1Η), 7,20 (d, J = 1,0 Ηζ, 1Η) , 6,48 (d, J = 1,0 Ηζ) , 3,83 (quarteto ΑΒ, JAB = 15,0 Ηζ Δν = 18,8 Ηζ, 1Η), 3,55 (s, 3Η), 2,73 (s, 3Η) , 2,09 (s, 3Η) . LRMS (ES pos.) m/z = 364 (M+l). 5-Metil-3-o-tolil-2-(1Η-[1,2,4]triazol-3-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-098) ΧΗ NMR (300 ΜΗζ, dg-DMSO) δ: 13,98 (s, 1H) , 8,47 (s, 1H) , 7,70 (t, J = 7,8 Ηζ, 1H), 7,49 (d, J = 7,9 Ηζ, 1H), 7,44 - 7,31 (m, 5H) , 4,04 (quarteto ΑΒ, = 15,5 Ηζ, Δν = 19,1 Ηζ, 1H), 2,74 (s, 3H), 2,10 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 364 (M+l). 2-(2-Amino-6-cloro-purin-9-ilmetil)5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-099) LRMS (ES pos.) 432 (M+l). 2-(6-Aminopurin-7-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin- 4-ona (D-100) 1H NMR (300 ΜΗζ, de-DMSO) δ: 8,19 (s, 3Η), 7,66 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,59 - 7,43 (m, 5H) , 7,34 (d, J = 7,4 Hz, 1H) , 7,23 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,90 (s, 2H), 5,21 (quarteto AB, JAB = 17,4 Hz, Δν = 22,1 Hz, 2H) , 2,72 (s, 3H) , 1,93 (s, 3H). A alquilação na purina N7 foi confirmada por melhorias de NOE entre os prótons a seguir: 1) prótons de amina exocíclica e de metileno, 2) prótons de amina exocíclica e de metil toluíla. LRMS (ES pos.) m/z = 398 (M+l). 2-(7-Amino-l,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-3-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-101) XH NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 8,43 (br s, 1H) , 8,19 (s, 1H) , 8,10 (br s, 1H), 7,62 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,49 - 7,28 (m, 5H) , 7,22 (d, J = 8,1 Hz, 1H) , 5,49 (d, J = 17,0 Hz, 1H) , 5,19 (d, J = 17,0 Hz, 1H) , 2,73 (s, 3H) , 2,11 (s, 3H) . A alquilação na purina N7 determinada por similaridade com espectro nmr de D-030. LRMS (ES pos.) m/z = 399 (M+l). 2-(7-Amino-l,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-l-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-102) Para a mesma mistura de reação que D-101. ΧΗ NMR (300 MHz, ds-DMS0) δ: 8,27 (s, 1H) , 8,20 (br s, 1H) , 8,05 (br s, 1H), 7,70 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,47 - 7,26 (m, 6H) , 5,61 (quarteto AB, JAb = 16,0 Hz, Δν = 2 0,7 Hz, 2H) , 2,75 (s, 3H) , 1,98 (s, 3H) . A alquilação para a purina N7 foi determinada por similaridade com o espectro de nmr de D-100. LRMS (ES pos.) m/z = 399 (M+l). 2-(6-Amino-9H-purin-2-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-103) ΧΗ NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 12,62 (s, 1H) , 7,93 (s, 1H) , 7,69 (t, J = 7,7 Hz, 1H) , 7,51 (d, J = 8,1 Hz, 1H) , 7,42 (dd, J = 7,6, 1,7 Hz, 1H) , 7,35 - 7,15 (m, 6H) , 4,12 (quarteto AB, = 14,5 Hz, Δν = 18,2 Hz, 2H) , 2,73 (s, 3H), 2,10 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 430 (M+l). 2-(2-Amino-6-etilamino-pirimidin-4-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-104) XH NMR (300 MHz, dg-DMSO) δ: 7,70 (T, J = 7,8 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,44 - 7,31 (m, 5H) , 6,69 (br s, 1H), 5,83 (br s, 1H) , 5,61 (s, 1H) , 4,03 (d, J = 14,6 Hz, 1H) , 3,95 (d, J = 14,6, 1H) , 2,73 (s, 3H) , 2,08 (s, 3H) , 1,06 (t, J = 7,1 Hz, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 433 (M+l). 2-(3-Amino-5-metilsulfanil-l,2,4-triazol-l-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-105) Produção: 5,0 mg. XH NMR (300 MHz, d4-MeOH) δ: 7,67 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,55 - 7,37 (m, 4H), 7,35 - 7,27 (m, 2H), 4,77 (d, J = 17,1 Hz, 1H) , 4,60 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 2,80 (s, 3H) , 2,43 (s, 3H) , 2,14 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 393 (M+l). 2-(5-Amino-3-metilsulfanil-l,2,4-triazol-l-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-106) Produção: 0,6 mg.
Purificado a partir da mesma mistura de reação que D- 105. 1H NMR (300 MHz, d4-MeOH) δ: 7,67 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,50 - 7,24 (m, 6H) , 4,83 (D, J = 16,5 Hz, 1H) , 4,70 (D, j = 16,5 Hz, 1H), 2,79 (s, 3H), 2,79 (s, 3H) 2,47 (s, 3H), 2,14 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 393 (M+l). 5-Metil-2-(6-metilaminopurin-9-ilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-107) Produção: 5,0 mg XH NMR (300 MHz, d4-MeOH) δ: 8,17 (s, 1H) , 8,03 (s, 1H) , 7,54 - 7,43 (m, 4H), 7,31 - 7,23 (m, 2H), 5,14 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,90 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 3,14 (br s, 3H), 2,79 (s, 3H), 2,22 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 412 (M+l). 2-(S-Benzilaminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-108) Produção: 6,7 mg XH NMR (300 MHz, d4-MeOH) δ: 8,13 (s, 1H) , 8,04 (s, 1H) , 7,58 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,51 - 7,21 (m, 11H), 5,15 (d, J = 17,5 Hz, 1H) , 4,91 (d, J = 17,5 Hz, 1H) , 4,83 (s, 2H, abaixo do pico de H20), 2,79 (s, 3H), 2,22 (s, 3H) . LRMS (ES pos.) m/z = 488 (M+l). 2-(2,6-Diaminopurin-9-ilmetil) -5-metil-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-109) Dobradas as quantidades de todos os reagentes. Produção: 14 mg XH NMR (300 ΜΗζ, ds-DMSO) δ: 8,53 (br s, 2H) , 8,01 (s, 1H) , 7,64 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,53 - 7,40 (m, 4H), 7,33 (d, J = 7,4 Hz, 1H) , 7,27 (d, J = 7,9 Hz, 1H) , 4,96 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,64 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 2,74 (s, 3H), 2,17 (s, 3H) . LRMS (ES pos.) m/z = 413 (M+l).
Os compostos D-110 a D-115 da estrutura geral a seguir foram preparados a partir dos Intermediários E-l a E-3 a seguir.
Intermediário E-l. S-Metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3,l-benzoxazin-4-ona Etapa 1. Uma suspensão de ácido 6-metilantranílico (2 g, 13,2 mmol) em cloreto de cloroacetila (12 mL, grande excesso) foi agitada a 115 °C em um frasco selado, por 30 min. A solução resultante foi resfriada até a temperatura ambiente e tratada com éter (~ 5 mL). Após o resfriamento a 4 °C durante a noite, o precipitado castanho resultante foi coletado por filtração, lavado com éter e seco in vacuo, para produzir o intermediário de cloro (1,39 g, 50%). λΕ NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7,67 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,46 (t, J = 7,9 Hz, 1H) , 7,35 (d, J = 7,6 Hz, 1H) , 4,39 (s, 2H), 2,81 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 210 (M+l).
Etapa 2. Uma mistura de intermediário de cloro (50 mg, 0,25 mmol), monoidrato de 6-mercaptopurina (43 mg, 0,25 mmol) e carbonato de potássio (25 mg, 0,25 mmol) em DMF seco (0,5 mL) foi agitada à temperatura ambiente, por 30 min. A mistura foi vazada em acetato de éter (20 mL) e todo o material insolúvel foi filtrado e descartado. 0 filtrado foi concentrado in vacuo, para a remoção de todo o acetato de etila, e o resíduo foi tratado com éter, resultando em um precipitado laranja claro. O precipitado foi coletado por filtração, lavado com éter e seco in vacuo, para levar ao Intermediário E-l (41 mg, 51%). ΧΗ NMR (300 MHz, ds-DMSO) δ: 8,64 (s, 1H) , 8,39 (s, 1H),7,73 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,44 - 7,37 (m, 2H), 4,69 (s, 2H), 2,69 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 326 (M+l).
Intermediário E-2 Uma solução de 2-nitroacetanilida (1,0 g, 5,6 mmol) em EtOH foi purgada com nitrogênio, tratada com Pd(OH)2 (20% em peso em C, 200 mg, cat.), e agitada por 2 h, sob H2 (138 kPa) . 0 catalisador foi removido por filtração através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um (Corning), e o filtrado foi concentrado in vacuo, para levar ao produto sólido cristalino branco (800 mg, 96%). XH NMR (300 MHz, ds-DMSO) δ: 9,12 (s, 1H) , 7,14 (dd, J = 7,8, 1,3 Hz, 1H), 6,88 (dt, J = 7,6, 1,5 Hz, 1H), 6,52 (dt, J = 7,5, 1,4 Hz, 1H), 4,85 (br s, 2H), 2,03 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 151 (M+l).
Intermediário E-3 Uma mistura de 2-fluoro-nitrobenzeno (1,41 g, 10 mmol) e NaHC03 (20 mL) foi tratada com (Ν,Ν,Ν'-trimetil)-1,2-diaminoetano (1,1 g, 11 mmol) e foi agitada 16 h a 80 °C. O solvente foi removido in vacuo, o resíduo foi tratado com 0,1 M de NaOH (120 mL) , e a mistura foi extraída com acetato de etila (2 x 50 mL) . As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com 2 0 mL de água (lx) e salmoura (2x), secas com sulfato de sódio, e concentradas in vacuo até um líquido laranja (2,2 g, 100%, ESMS: m/z 224, M+l).
Este intermediário foi dissolvido em EtOH, a solução foi purgada com nitrogênio, tratada com Pd(0H)2 (20% em peso em C, 180 mg, cat.), e agitada por 2 h, sob H2 (345 kPa) . 0 catalisador foi removido por filtração através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um (Corning), e o filtrado foi concentrado in vacuo, para levar ao produto líquido vermelho E-3 (1,8 g, 95%). ΧΗ NMR (300 ΜΗζ, CDC13) δ: 8,64 (s, 1Η) , 7,03 (dd, J = 8,3, 1,4 Hz, 1H) , 6,91 (ddd, J = 7,6, 7,2, 1,4 Hz, 1H) , 6,73 - 6,67 (m, 2H), 4,20 (br s, 2H), 2,95 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 2,68 (s, 3H), 2,41 (t, J = 6,7 Hz, 1H), 2,26 (s, 6H). LRMS (ES pos.) m/z = 194 (M+l).
Os compostos D-110 a D115 foram preparados como se segue: 5-Metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-quinazolin-4-ona (D-110) Uma mistura de intermediário E-l (40 mg) e o-toluidina (0,3 mL, grande excesso) foi aquecida a 100 °C em um frasco selado, por 16 h. A mistura de reação foi resfriada, tratada com IN HCl (2 mL) e éter (2 mL) , e o precipitado cinza .resultante foi coletado por filtração, lavado com éter e seco ao ar (19 mg bruto) . O sólido bruto foi dissolvido em 0,5 mL de DMSO e purificado por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) . As frações apropriadas foram concentradas in vacuo, para levar ao produto final como um sólido branco (4 mg) . ΧΗ NMR (300 MHz, d6-DMSO) 6: 13,52 (s, 1H) , 8,47 (s, 1H) , 8,43 (s, 1H) , 7,69 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,50 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,46 - 7,43 (m, 1H), 7,37 - 7,25 (m, 4H), 4,37 (quarteto AB, Jab = 15,4 Hz Δν = 22,4 Hz, 2H) , 2,74 (5, 3H), 2,12 (5, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 415 (M+l). 3-Isobutil-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-lll) Uma mistura de intermediário E-l (40 mg) e isobutilamina (0,4 mL, grande excesso) foi aquecida a 120 °C em um frasco selado, por 16 h. A isobutilamina em excesso foi deixada evaporar, o resíduo foi dissolvido em 1 mL de DMSO e purificado por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ). As frações apropriadas foram concentradas in vacuo, para levar ao produto final como um sólido branco (4 mg). 1H NMR (300 MHz, de-DMS0) δ: 13,75 (br s, 1H) , 8,73 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 7,63 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,00 (d, J = 7,5 Hz, 2H) , 2,77 (s, 3H) , 2,30 - 2,15 (m, 1H) , 0,98 (d, J = 6,7 Hz, 1H). LRMS (ES pos.) m/z = 381 (M+l). N-{2-[5-Metil-4-oxo-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-quinazolin-3-il]-fenil)-acetamida (D-112) Uma mistura de Intermediário E-l (80 mg, 0,25 mmol) e Intermediário E-2 (75 mg, 0,5 mmol, 2 eq) foi aquecida até ser fundida em um frasco selado, usando-se uma pistola de calor. A mistura de reação foi triturada com éter e os sólidos foram coletados por filtração. O material bruto foi dissolvido em 1 mL de DMSO e purificado em duas porções por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 22 0 λ) . As frações apropriadas foram concentradas in vacuo, para levar ao produto final como um sólido branco. lH NMR (300 MHz, dg-DMSO) δ: 13,52 (s, 1H) , 9,52 (s, 1H), 8,48 (s, 3H) , 8,42 (s, 3H) , 8,02 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,69 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,45 -7,37 (m, 2H) , 7,31 (d, J = 7,3 Hz, 1H) , 7,19 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 4,38 (s, 2H), 2,74 (s, 3H), 1,93 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 458 (M+l). 5-Metil-3-(Ε-2-metil-cicloexil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanil metil)-3H-quinazolin-4-ona (D-113) Uma mistura de Intermediário E-l (80 mg, 0,25 mmol) e trans-2-metil-1-aminocicloexano (0,25 mL, grande excesso) foi aquecida em um frasco selado a 100 °C, por 16 h. A mistura de reação foi triturada com éter e os sólidos foram coletados por filtração. 0 material bruto foi dissolvido em 0,5 mL de DMSO e purificado por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) . As frações apropriadas foram concentradas in vacuo, para levar ao produto final como um sólido branco (1,5 mg). XH NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 13,5 (br s, 1H) , 8,82 (s, 1H) , 8,51 (s, 1H) , 7,63 (t, J = 7,7 Hz, 1H) , 7,43 (d, J = 7,9 Hz, 1H) , 7,27 (d, J = 7,4 Hz, 1H) , 5,11 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 3,78 - 3,69 (m, 1H), 2,73 (s, 3H), 2,55 - 2,40 (m, 3H) , 1,88 - 1,46 (m, 4H), 1,31 - 1,11 (m, 1H), 0,90 - 0,65 (m, 1H), 0,74 (d, J = 6,7 Hz, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 421 (M+l). Ácido 2-[5-Metil-4-oxo-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-quinazolin-3-il]benzóico (D-114) Uma mistura de Intermediário E-l (80 mg, 0,25 mmol) e antranilato de metila (0,25 mL, grande excesso) foi aquecida em um frasco selado a 100 °C, por 16 h. A mistura de reação foi triturada com éter e os sólidos foram coletados por filtração. O material bruto foi dissolvido em 0,5 mL de DMSO e purificado por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) . As frações apropriadas foram concentradas in vacuo, para levar ao produto final como um sólido branco (8 mg) . "H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,51 (s, 1H) , 8,51 (s, - 1H) , 8,42 (s, 1H) , 8,11 (dd, J = 7,4, 1,1 Hz, 1H) , 7,88 (dt, J = 7,7, 1,4 Hz, 1H) , 7,70 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 7,57 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,49 - 7,35 (m, 3H), 4,58 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 4,35 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 2, 44 (s, 3H). LRMS (ES pos.) m/z = 445 (M+l). 3-(2-[(2-Dimetilamino-etil) -metil-amino]-fenil}-5-Metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-115) Uma mistura de Intermediário E-l (40 mg, 0,25 mmol) e Intermediário E-3 (0,2 mL, grande excesso) foi aquecida em um frasco selado a 100 °C, por 16 h. A mistura de reação foi triturada com éter e os sólidos foram coletados por filtração. O material bruto foi dissolvido em 1 mL de DMSO e purificado por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 0,05% de TFA em todos os solventes, detector em 220 λ) . As frações apropriadas foram concentradas in vácuo, para levar ao produto final como o sal de TFA (11 mg). XE NMR (300 MHz, ds-DMSO) δ: 13,4 (br s, 1H) , 9,27 (s, 1H) , 8,52 (s, 1H) , 8,44 (s, 1H) , 7,72 (t, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,53 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,40 - 7,33 (m, 4H), 7,10 - 7,04 (m, 1H) , 4,42 (s, 3H) , 3,5 (s, 3H) , 3,5 (m, 2H) , 3,23 - 3,03 (m, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,68 - 2,56 (m, 8H). LRMS (ES pos.) m/z = 501 (M+l).
Os compostos D-116 a D-118 foram preparados como se segue: 3-(2-Clorofenil)-5-metóxi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-116) (R = Me, X = 0) Uma mistura de Intermediário D-015 (25 mg) em 0,5 M
NaOMe (2 mL em MeOH; grande excesso) foi agitada a 50 °C, por 16 h, em um frasco selado. A mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente, tratada com água (5 mL), e o precipitado resultante foi coletado por filtração, lavado com água e seco ao ar. 0 material bruto foi dissolvido em 0,5 mL de DMSO e purificado por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) . As frações apropriadas foram concentradas in vacuo, para levar ao produto final como um sólido branco (5,3 mg). ΧΗ NMR (300 MHz, ds-DMS0) δ: 13,52 (s, 1H) , 8,48 (s, 1H) , 8,44(br s, 1H) , 7,77 (t, J = 8,2 Hz, 1H) , 7,71 - 7,60 (m, 2H) , 7,51 - 7,34 (m, 2H) , 7,23 (d, J = 8,2 Hz, 1H) , 7,10 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,39 (quarteto AB, Jab = 5,2 Hz, Δν = 23,2 Hz, 2H), 3,85 (s, 3H). LRMS (ES positivo) m/z = 451 (M+l). 3-(2-Clorofenil)-5-(2-morfolin-4-il-etilamino-2-(9H-purin- 6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-117) Uma mistura de Intermediário D-015 (25 mg) e 4-amioet-2-il)-morfolina (650 mg, grande excesso) foi agitada a 50 °C, por 16 h, em um frasco selado. A mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) . As frações apropriadas foram concentradas in vacuo, para levar ao produto final. *Η NMR (300 MHz, d6-acetona) δ: 8,57 (br s, 1H) , 8,47 (s, 1H), 8,37 (s, 1H), 7,72 (dd, J = 7,7, 1,6 Hz, 1H), 7,65 (dd, J = 8,0, 1,2 Hz, 1H) , 7,57 (t, J = 8,1 Hz, 1H) , 7,49 (dt, J = 7,7, 1,6 Hz, 1H), 7,40 (dt, J = 7,7, 1,5 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 7,4 Hz, 1H) , 6,82 (d, J = 8,3 Hz, 1H) , 4,55 (d, J = 15,0 Hz, 1H) , 4,42 (d, J = 15,1 Hz, 1H) , 4,05 - 3,90 (τη, 4H) , 3,90 (t, J = 6,9 Hz, 2H) , 3,75 - 3,4 (m, 4H) , 3,54 (t, J = 6,9 Hz, 2H). LRMS (ES positivo) m/z = 549 (M+l). 3-Benzil-5-metóxi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona (D-118) Uma mistura de Intermediário D-043 (25 mg) em 0,5 M
NaOMe (2 mL em MeOH; grande excesso) foi agitada a 50 °C, por 16 h, em um frasco selado. A mistura de reação foi tratada com 1 N HCl (1 mL) e alíquotas desta solução (0,5 mL cada) purificadas por HPLC (coluna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10 a 75% de acetonitrila / água por 15 min, 100% de acetonitrila a 18 min, detector em 220 λ) . As frações apropriadas foram concentradas in vacuo, para levar ao produto final como um sólido branco (6,6 mg). 1H NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 13,57 (s, 1H) , 8,60 (s, 1H) , 8,45 (s, 1H) , 7,72 (t, J = 8,1 Hz, 1H) , 7,42 - 7,30 (m, 2H) , 7,30 - 7,19 (m, 3H) , 7,15 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 7,06 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,43 (s, 2H), 4,80 (s, 2H), 3,87 (S, 3H). LRMS (ES positivo) m/z = 431 (M+l).
Composto D-999 (comparativo) 3-(2-clorofenil)-2-(ΙΗ-pirazolo[3,4-d]piramidin-4-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona Um composto análogo, 3 -(2-clorofenil)-2-(1H-pirazolo[3,4-d]piramidin-4-ilsulfanilmetil)-3H-quinazolin-4-ona, também foi sintetizado geralmente, de acordo com os métodos descritos, exceto pelo fato de um 4-mercapto-lH-pirazolo[3,4-d]piramidina ser substituído pela mercaptopurina na etapa final. EXEMPLO 11 Ensaios Bioquímicos de Potência de ΡΙ3Κδ e Seletividade A. Ensaio Bioquímico usando 20 μΜ ATP
Usando-se o método descrito no Exemplo 2, acima, os compostos da invenção foram testados quanto à atividade inibidora e à potência contra ΡΙ3Κδ, e quanto à seletividade para ΡΙ3Κδ versus outras isozimas de PI3K de Classe I. Na Tabela 2, os valores de ico50 (μΜ) são dados para PI3Ka ("Alfa"), ΡΙ3Κβ ("Beta"), ΡΙ3Κγ ("Gama") e ΡΙ3Κδ ("Delta"). Para ilustrar a seletividade dos compostos, as relações dos valores de IC50 dos compostos para PI3Ka, ΡΙ3Κβ e ΡΙ3Κγ em relação a PI3KÔ são dadas, respectivamente, como "Relação Alfa/Delta", "Relação Beta/Delta" e "Relação Gama/Delta".
Os ensaios iniciais de seletividade foram feitos de forma idêntica ao protocolo de ensaio de seletividade no Exemplo 2, exceto pelo uso de 100 μΙ> de Ecoscint para detecção de rádio-rótulo. Os ensaios subseqüentes de seletividade foram feitos de modo similar, usando-se os mesmos estoques de substrato 3X, exceto pelo fato de eles conterem 0,05 mCi/mL γ[32Ρ]ΑΤΡ e 3 mM de PIP2. Os ensaios subseqüentes de seletividade também usaram os mesmos estoques de enzima 3X, exceto pelo fato de eles conterem, agora, 3 nM de qualquer dada isoforma de PI3K.
Para todos os ensaios de seletividade, os compostos de teste foram pesados e dissolvidos em 10-50 mM de estoques em 100% de DMSO (dependendo das suas respectivas solubilidades) e armazenados a -20 °C. Os compostos foram descongelados (até a temperatura ambiente ou 37 °C), diluídos para 300 μΜ em água, a partir do que uma série de diluição de 3 vezes foi feita. A partir dessas diluições, 2 0 μΐί foram adicionados aos poços de ensaio juntamente com inativos de água usados para o controle de enzima (positivo) e para o controle de nenhuma enzima (fundo). O resto do ensaio foi essencialmente feito de acordo com o protocolo de seletividade no Exemplo 2.
Para aqueles casos nos quais a maior concentração usada no ensaio, isto é, 100 μΜ, não inibiu a atividade da enzima em pelo menos 50%, a tabela recita a atividade percentual remanescente naquela concentração (isto é, a 100 μΜ). Nesses casos, a(s) relação(ões) de atividade real para os compostos não pode(m) ser calculada(s) , uma vez que um dos valores requeridos de IC50 está faltando. Entretanto, para prover alguma visão sobre as características desses compostos, uma relação de atividade hipotética é calculada, usando-se 100 μΜ como substituto para o valor faltando. Nesses casos, a relação de seletividade deve, de fato, ser maior do que o valor hipotético, e isso é indicado pelo uso de um símbolo maior do que (>). 1) 0 composto D-121 é 3-fenil-2-(9H-purin~6-Ílsulfanilmetil)-3H-quina2olin-4-ona. Β. Ensaio Bioquímico usando 200 μΜ ΑΤΡ Na Parte A, acima, os compostos da invenção foram testados para o estabelecimento de sua IC50 para inibição das isoformas alfa, beta, delta e gama de PI3K, usando-se 20 μΜ ATP. Uma outra triagem foi executada, para o estabelecimento da sua IC50 para a inibição das quatro isoformas de PI3K em uma concentração final de 200 μΜ ATP, 10 vezes maior, e substancialmente mais próxima da concentração fisiológica normal de ATP em células. Este protocolo de seletividade é idêntico àquele descrito acima, exceto pelo fato de a concentração de ATP de estoque 3X ter sido de 600 μΜ. Os dados deste ensaio são resumidos na Tabela 3 abaixo. A sensibilidade observada para a concentração de ATP sugere que esses compostos inibidores de ΡΙ3Κδ atuam como competidores de ATP. EXEMPLO 12 Dados de Ensaio Baseado em Célula para Inibidores de Atividade de ΡΙ3Κδ Usando-se os métodos descritos nos Exemplos 3 a 5 acima, os compostos da invenção foram testados quanto à atividade inibidora e ã potência em ensaios de proliferação estimulada de célula B e T, migração de neutrófilo (PMN) e liberação de elastase de neutrófilo. Os dados para esses ensaios são estabelecidos na Tabela 4, abaixo. Na Tabela 4, os valores mostrados são concentrações efetivas do composto (EC50; μΜ) . Quando nenhum valor for dado, nenhum ensaio foi realizado. EXEMPLO 13 Ensaio de Inibidores de ΡΙ3Κδ Atividade em Células de Câncer 0 efeito dos compostos da invenção sobre a proliferação de célula de câncer foi avaliado testando-se ura dos compostos em relação a um painel de linhas de célula de Leucemia Mielóide Crônica (CML), incluindo KU812, RWLeu4, K562 e MEG-01. A atividade inibidora do composto (D-000, dissolvido em DMSO) foi determinada como se segue. 0 composto testado foi adicionado em uma série de concentrações (0,001 μΜ a 20 μΜ) a placas de microtitulação com 96 poços com células (1000 a 5000 células/poço). As placas foram incubadas por cinco dias a 37 °C, durante o que as culturas de controle sem composto de teste foram capazes de sofrer pelo menos dois ciclos de divisão. O crescimento de célula foi medido pela incorporação de [3H]-timidina, por dezoito horas, adicionada nos dias três, quatro e cinco. As células foram transferidas para um filtro, lavadas e a radioatividade contada, usando-se um contador beta Matrix 96 (Packard). A percentagem de crescimento de célula foi medida como se segue: (contagens médias de células incubadas com uma 0 valor de EC5o nesses experimentos foi determinado pela concentração do composto de teste que resultou em uma contagem de radioatividade 50% menor do que aquela obtida usando-se o controle sem o inibidor. O composto D-000 apresentou atividade inibidora com uma EC50 de aproximadamente 2 μΜ para as linhas KU812 e RWLeu4. O composto não mostrou exibir um efeito nas linhas K562 e MEG-01.
Os inibidores de ΡΙ3Κδ da invenção parecem inibir o crescimento de célula de CML e, portanto, seriam úteis no tratamento de tumores benignos ou malignos. A expressão de PI3KÔ foi demonstrada até gora, principalmente em células de origem hematopoiética. Entretanto, podería estar presente em uma variedade mais ampla de células de proliferação. Portanto, os compostos da invenção poderíam ser usados para a indução de regressão de tumor e para impedir a formação de metástase de tumor em tumores de leucemia ou sólidos ou na proliferação de origem não tumoral. Além disso, os compostos poderíam ser usados sozinhos e em combinação com outros compostos farmacologicamente ativos ou em combinação com radiação como um agente de sensibilização. EXEMPLO 14 Medição de exocitose de elastase em lavagem de bolsa de ar de camundongo 0 efeito de D-030 sobre o influxo de leucócito e a exocitose de elastase de neutrófilo em modelos de animais foi testado. 0 modelo de bolsa de ar de seis dias é um modelo de inflamação in vivo que, histologicamente, se assemelha a uma sinóvia de junta. Uma cobertura de células mononucleares organizadas e fibroblastos se desenvolve, a qual se assemelha proximamente a uma cavidade sinovial. O modelo representa um modelo "agudo" de uma doença crônica (por exemplo, artrite reumatóíde). Este modelo permite a avaliação in vivo de agentes para bloquearem o influxo celular na bolsa de ar, sob a influência de um estímulo inflamatório. 0 teste foi realizado como se segue: no dia zero, grupos de ratos foram raspados e 10 ml de ar foram injetados de forma subcutânea nas costas de cada um, formando uma bolsa. No dia três, 10 ml de ar foram reinjetados. Seis horas antes do desafio de TNF no dia seis, um grupo de ratos (n = 6) recebeu D-030 {100 mg/kg em veículo PEG 400) oralmente, e um outro grupo (n = 12) recebeu o veículo apenas oralmente. Seis horas seguindo-se a dosagem, as bolsas de ar de ambos os grupos receberam 2,5 ng de TNF. Doze horas seguindo-se â dosagem, as bolsas foram lavadas com salinha, e o fluido de lavagem resultante foi analisado quanto a contagens de leucócito e atividade de elastase de neutrófilo. Além disso, o sangue foi retirado, para se determinarem os níveis de D-030 na circulação. Os resultados foram como se segue: os ratos que receberam D-030 por doze horas tiveram uma média de 8,7 mM de composto na circulação e tiveram uma redução de 82% nos leucócitos totais no fluido de lavagem, se comparado com os controles de veículo. As reduções nas contagens de leucócito específicas foram como se segue: neutrófilos (90%), eosinófilos (66%) e linfócitos (70%) . A quantificação de elastase de neutrófilo mostrou que os ratos tratados com D-030 tiveram níveis de elastase que foram um pouco reduzidos (15%) versus os controles de veículo.
Em um outro teste, uma área das costas do rato foi raspada usando-se uma máquina de tosquia, e uma bolsa de ar foi criada pela injeção de 3 ml de ar de forma subcutânea. No dia três, a injeção de ar foi repetida. No dia seis, os animais receberam doses de D-030 (32 mg/kg em LABRAFIL®) ou LABRAFIL® apenas uma hora antes e duas horas depois do desafio com TNF-a (0,5 ng em 1 ml PBS) , ou PBS apenas. O PBS é salina com tampão de fosfato. Quatro horas após o desafio de TNF, os animais foram anestesiados e as bolsas foram lavadas com 2 mL de salinha a 0,9% com 2 mM de EDTA. As lavagens foram centrifugadas a 14.000 rpm em uma microcentrífuga. Cinqüenta microlitros do supernadante foram usados para a medição da exocitose de elastase, de acordo com o procedimento descrito acima.
Como mostrado na Figura 9, o desafio de TNF induziu um alto nível de exocitose de elastase, se comparado com os animais desafiados com PBS. Entretanto, quando os animais desafiados com TNF foram tratados com D-030, uma diminuição significativa na atividade de elastase nas lavagens de bolsa de ar foi observada.
Todas as publicações e os documentos de patente citados neste relatório descritivo são incorporados aqui como referência, quanto a tudo que eles mostrem.
Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência específica a certas montagens preferidas, para fins de clareza e compreensão, será evidente para o técnico versado que mudanças e modificações adicionais podem ser praticadas no escopo da invenção, como é definido nas resistência estabelecidas a seguir. Assim sendo, nenhuma limitação deve ser imposta à invenção, além daquelas especificamente recitadas nas reivindicações.
REIVTNDICAÇÕES

Claims (9)

1. Composto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula: onde Y é selecionado a partir do grupo que consiste em nulo e NH; R4 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, N02, OH, OCH3, CH3 e CF3; R5 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OCH3 e halogênio; ou R4 e R5 juntamente com C-6 e C-7 do sistema de anel de quinazolina definem um anel aromático de 5 ou 6 elementos, opcionalmente contendo um ou mais átomos de O, N ou S; R6 é selecionado a partir do grupo que consiste em Ci~ Cgalquila, fenila, halofenila, alcoxifenila, alquilfenila, bifenila, benzila, piridinila, 4-metilpiperazinila, C(=0)~ OC2H5 e morfolinila; Rd, independentemente, é selecionado a partir do grupo que consiste em NH2, halogênio, Ci-3alquila, S (Ci_3alquila) , OH, NH (Ci_3alquila) , N {Ci_3alquila) 2, NH (Ci_3alquilenof enila) e q é 1 ou 2; ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, desde que pelo menos um dentre R4 e R5 seja diferente de H, quando R6 for fenila ou 2-clorofenila.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo que consiste em: .pá ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de R4 ser selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, OH, OCH3, CH3 e CF3; Rb ser selecionado a partir do grupo que consiste em Ci-6alquila, fenila, halofenila, alquilfenila, bifenila, benzila, piridinila, 4-metilpiperazinila, C(=0)0C2H5 e morfolinila; ou um sal f armaceut icamente aceitável dos mesmos, onde (a) R4 e R5, independentemente, são diferentes dos grupos 6-halo ou 6,7-dimetóxi; e (b) Rb é diferente de 4-clorofenila.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo que consiste em: ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
5. Composto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula de estrutura geral: em que A é um sistema de anel purinila opcionalmente substituído com um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste em NH2, NH(CH3), N(CH3)2/ NHCH2C6H5, CH3, F, Cl, SCH3 e OH; X é selecionado a partir do grupo que consiste em CH2, CHCH2CH3 e CH (CH3) ; Y é selecionado a partir do grupo que consiste em nulo, NH, 0C(=0), C(=0)0, e NHC(=0)CH2S; R1 e R2, independentemente, são selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, N02, CH3, Cl, F, Br, OH, OCH3, 0 (CH2) 2OCH2Ph, N02, N(CH3)2 e NH (CH2) 2-~morfolin-4- ila, ou R1 e R2 são tomados em conjunto para formarem um componente de cadeia alquenileno de um anel de 6 elementos; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em cada um dos quais é opcionalmente substituído com um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste em Cl, F, CH3, CH(CH3)2, OCH3, C6H5, N02, NHC(=0)CH3, C02H, e N (CH3) CH2CH2N (CH3) 2; ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de Y ser selecionado a partir do grupo que consiste em nulo e .NH, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de o sistema de anel A ser substituído por de um a três subst ituintes selecionados a partir do grupo que consiste em NH2, NH(CH3), N(CH3)2, NHCH2C6H5, Cl, F, CH3, SCH3 e OH, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
8. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de R1 e R2 serem tomados em conjunto para formarem um anel de seis elementos, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de R3 ser substituído com um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste em Cl, F, CH3, CH(CH3)2, OCH3, C6H5, N02, NHC (=0) CH3, C02H, e N (CH3) CH2CH2N (CH3) 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
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