BR122021002358B1 - Sistema fluídico - Google Patents

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Jason Harris
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Abstract

Trata-se de um aparelho de detecção tendo um cabeçote de leitura que inclui uma pluralidade de microfluorômetros posicionados para adquirir simultaneamente uma pluralidade de imagens de campo amplo em um plano comum; e (b) um estágio de translação configurado para mover o cabeçote de leitura ao longo de um substrato que esteja no plano comum. O substrato pode ser uma célula de fluxo que esteja incluída em um cartucho, sendo que o cartucho também inclui uma carcaça para (i) um reservatório de amostra; (ii) uma linha fluídica entre o reservatório de amostra e a célula de fluxo; (iii) vários reservatórios de reagente em comunicação fluídica com a célula de fluxo, (iv) pelo menos uma válvula configurada para mediar a comunicação fluídica entre os reservatórios e a célula de fluxo; e (v) pelo menos uma fonte de pressão configurada para mover líquidos a partir dos reservatórios até a célula de fluxo. O aparelho de detecção e o cartucho podem ser usados juntos ou de forma independente.

Description

[001]O presente pedido se baseia e reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 61/619.784, depositado em 3 de abril de 2012, estando aqui incorporado a título de referência.
FUNDAMENTOS
[002]As modalidades da presente revelação referem-se, em geral, a aparelhos e métodos destinados à manipulação fluídica e detecção óptica de amostras, por exemplo, em procedimentos de sequenciamento de ácidos nucléicos.
[003]Nosso genoma proporciona uma planta-mestre para prever muitas de nossas predisposições, tais como preferências, talentos, suscetibilidade a doenças e reação a fármacos terapêuticos. O genoma de um ser humano individual contém uma sequência com mais de 3 bilhões de nucleotídeos. Diferenças em apenas uma fração desses nucleotídeos transmitem muitas de nossas características exclusivas. A comunidade pesquisadora vem fazendo avanços significativos em deslindar os recursos que constituem a planta-mestre e, com isso, uma compreensão mais abrangente de como as informações em cada planta-mestre se relaciona à saúde humana. No entanto, nossa compreensão está longe de uma conclusão e impede o movimento das informações a partir dos laboratórios de pesquisa às clínicas onde a esperança é que um dia cada um de nós terá uma cópia de seu próprio genoma pessoal de modo que possamos nos reunir com nossos médicos para determinar as escolhas apropriadas para que tenhamos um estilo de vida saudável ou um curso apropriado de tratamento.
[004]O obstáculo atual é uma questão de rendimento e escala. Um componente fundamental de deslindar a planta-mestre para qualquer indivíduo consiste em determinar a sequência exata dos 3 bilhões de nucleotídeos em seu genoma. As técnicas estão disponíveis para realização disso, mas essas técnicas tipicamente consomem muitos dias e milhares de dólares para que sejam concebidas. Adicionalmente, a relevância clínica da sequência genômica de qualquer indivíduo é uma questão de comparar os recursos exclusivos de sua sequência genômica (isto é, seu genótipo) aos genomas de referência que são correlacionados a características conhecidas (isto é, fenótipos). A questão de escala e rendimento se torna evidente quando for considerado que os genomas de referência são criados com base nas correlações do genótipo ao fenótipo que surgem a partir de estudos de pesquisa que tipicamente usam milhares de indivíduos para que sejam estatisticamente válidos. Logo, bilhões de nucleotídeos podem eventualmente ser sequenciados para milhares de indivíduos para identificar qualquer correlação clinicamente relevante entre o genótipo e o fenótipo. Multiplicando-se ainda pelo número de doenças, respostas a fármacos, e outras características clinicamente relevantes, a necessidade por tecnologias de sequenciamento rápidas e pouco dispendiosas se torna ainda mais aparente.
[005]Necessita-se de uma redução nos custos com sequenciamento que resulte em grandes estudos de correlação genética realizados por cientistas pesquisadores e que torne o sequenciamento acessível no ambiente clínico para o tratamento de pacientes individuais tomando decisões com consequência por toda a vida. As modalidades da invenção apresentadas no presente documento satisfazem essa necessidade e também proporcionam outras vantagens.
BREVE SUMÁRIO
[006]A presente revelação proporciona um aparelho de detecção que inclui (a) um carro incluindo uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros tem uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo, em que a pluralidade de microfluorômetros é posicionada para adquirir simultaneamente uma pluralidade de imagens de campo amplo em um plano comum, e em que cada uma das imagens de campo amplo é proveniente de uma área diferente do plano comum; (b) um estágio de translação configurado para mover o carro em ao menos uma direção paralela ao plano comum; e (c) um estágio amostral configurado para manter um substrato no plano comum.
[007]A presente revelação proporciona, ainda, um método para formar imagens de um substrato, incluindo as etapas de (a) proporcionar um substrato incluindo recursos fluorescentes sobre uma superfície; (b) adquirir uma pluralidade de imagens de campo amplo de uma primeira porção da superfície usando uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros adquire uma imagem de campo amplo a partir de um local diferente da superfície, em que a pluralidade de microfluorômetros é fixada a um carro; e (c) transladar o carro em uma direção paralela à superfície e repetir (b) para uma segunda porção da superfície. O método pode usar qualquer aparelho apresentado em qualquer parte do presente documento, mas não precisa ser limitado em todas as modalidades.
[008]Proporciona-se, também, um cartucho fluídico que inclui (a) uma célula de fluxo dotada de uma superfície opticamente transparente, uma entrada e uma saída; e (b) uma carcaça feita a partir de um material que seja opticamente opaco e impermeável a líquidos aquosos, em que a carcaça mantém: (i) um reservatório de amostra; (ii) uma linha fluídica entre o reservatório de amostra e a entrada da célula de fluxo; (iii) uma pluralidade de reservatórios de reagente em comunicação fluídica com a célula de fluxo através da entrada da célula de fluxo, (iv) pelo menos uma válvula configurada para mediar a comunicação fluídica entre os reservatórios e a entrada da célula de fluxo; e (v) pelo menos uma fonte de pressão configurada para mover líquidos a partir do reservatório de amostra ou dos reservatórios de reagente até a célula de fluxo através da entrada da célula de fluxo, em que uma janela opticamente transparente interrompe a carcaça e uma porta de entrada interrompe a carcaça, em que a porta de entrada se encontra em comunicação fluídica com o reservatório de amostra, e em que a superfície opticamente transparente fica posicionada na janela.
[009]A presente revelação proporciona, ainda, um método de sequenciamento que inclui as etapas de (a) proporcionar um cartucho fluídico tendo (i) uma célula de fluxo dotada de uma superfície opticamente transparente, (ii) uma amostra de ácido nucléico, (iii) uma pluralidade de reagentes para uma reação de sequenciamento, e (iv) um sistema fluídico para distribuir os reagentes à célula de fluxo; (b) proporcionar um aparelho de detecção tendo (i) uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros compreende uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo em um plano de imagem nas dimensões x e y, e (ii) um estágio amostral; (c) distribuir o cartucho fluídico ao estágio amostral, em que a superfície opticamente transparente é colocada no plano de imagem; e (d) realizar operações fluídicas de um procedimento de sequenciamento de ácido nucléico no cartucho fluídico e operações de detecção do procedimento de sequenciamento de ácido nucléico no aparelho de detecção, em que (i) os reagentes são distribuídos à célula de fluxo pelo sistema fluídico, e (ii) os recursos de ácido nucléico são detectados pela pluralidade de microfluorômetros.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[010]A Figura 1 mostra um dispositivo de detecção optoeletrônica (à esquerda) e um cartucho fluídico (à direita) útil para sequenciamento de ácido nucléico.
[011]A Figura 2 mostra um esboço óptico para um microfluorômetro individual tendo trajetórias de feixe de excitação e emissão ortogonais.
[012]A Figura 3 mostra um esboço óptico para um microfluorômetro.
[013]A Figura 4 mostra uma disposição de quatro microfluorômetros em relação a uma célula de fluxo tendo dois canais.
[014]A Figura 5 mostra um aparelho de autofocalização que pode ser usado em um microfluorômetro.
[015]A Figura 6 mostra no Painel A: vistas de topo de uma disposição de quatro canais em uma célula de fluxo (à esquerda) e uma disposição linear de objetivas em uma única fileira (à direita), e no Painel B: uma célula de fluxo tendo oito canais (à esquerda) e uma disposição de oito objetivas em duas fileiras lineares de quatro.
[016]A Figura 7 mostra vistas de topo de uma disposição de seis canais em uma célula de fluxo (à esquerda) e uma disposição de acondicionamento hexagonal de objetivas em duas fileiras (à direita).
[017]A Figura 8 mostra uma vista em perspectiva de uma disposição de oito microfluorômetros para um aparelho de detecção.
[018]A Figura 9 mostra uma vista em planta de fundo de uma disposição de oito microfluorômetros para um aparelho de detecção.
[019]A Figura 10 mostra um esboço óptico para um microfluorômetro individual tendo trajetórias de feixe de excitação e emissão paralelas.
[020]A Figura 11 mostra uma vista em perspectiva de tipo de um estágio a Y para um aparelho de detecção.
[021]A Figura 12 mostra uma vista em perspectiva de fundo de um estágio Y para um aparelho de detecção.
[022]A Figura 13 mostra uma vista em perspectiva de topo de um estágio Y que mantém uma disposição de oito microfluorômetros.
[023]A Figura 14 mostra um diagrama de blocos elétrico para um aparelho de detecção.
[024]A Figura 15 mostra uma vista explodida de um cartucho fluídico com uma célula de fluxo.
[025]A Figura 16 mostra um mapa fluídico para um cartucho fluídico.
[026]A Figura 17 mostra uma válvula giratória de injeção de quatro amostras.
[027]A Figura 18 mostra um mapa fluídico para um sistema de reutilização de reagente que usa um fluxo unidirecional e duas válvulas.
[028]A Figura 19 mostra um mapa fluídico para um sistema de reutilização de reagente que usa um fluxo alternado e uma válvula única.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[029]A presente revelação proporciona métodos e aparelhos para detecção de alta resolução de áreas planas como aquelas apresentes em superfícies do substrato. Uma aplicação particularmente útil se baseia opticamente em forma imagem de uma amostra biológica que esteja presente em uma superfície. Por exemplo, os métodos e aparelhos apresentados no presente documento podem ser usados para obter imagens de recursos de ácido nucléico que estejam presentes em arranjos de ácido nucléico, tais como aqueles usados em aplicações de sequenciamento de ácido nucléico. Pode-se usar uma variedade de técnicas de sequenciamento de ácido nucléico que utilizam amostras opticamente detectáveis e/ou reagentes. Essas técnicas são particularmente bem adequadas aos métodos e aparelhos da presente revelação e, portanto, destacam muitas vantagens para modalidades particulares da invenção. Algumas das vantagens são apresentadas por propósitos de ilustração e, embora as aplicações de sequenciamento de ácido nucléico sejam exemplificadas, as vantagens também podem ser estendidas a outras aplicações.
[030]Em relação a alguns dos exemplos aqui apresentados, as características notáveis de muitas técnicas de sequenciamento de ácido nucléico são: (1) o uso de detecção multicolor (por exemplo, geralmente quatro fluoróforos diferentes são usados, um para cada um dos diferentes tipos de nucleotídeo A, C, G e T (ou U) presentes em ácidos nucléicos), (2) distribuição de grandes números de diferentes fragmentos a partir de uma amostra de ácido nucléico (por exemplo, fragmentos de uma amostra de genoma, amostra de RNA, ou derivado desses) sobre a superfície de um arranjo e (3) ciclos repetidos de processamento fluídico e formação de imagem dos arranjos. As modalidades dos métodos e aparelhos aqui revelados são particularmente úteis para o sequenciamento de ácido nucléico pelo fato de poderem proporcionar a capacidade de formação de imagem em alta resolução de superfícies de arranjo em múltiplas cores e em múltiplas repetições. Por exemplo, as modalidades aqui apresentadas permitem que uma imagem de uma superfície seja obtida em uma resolução que esteja na faixa micrônica de centenas, dezenas ou até mesmo um único dígito. Desse modo, podem-se decidir os recursos de ácido nucléico tendo um espaçamento médio centro-a-centro de vizinho mais próximo que seja menor que 100 mícrons, 50 mícrons, 10 mícrons, 5 mícrons ou inferior. Em modalidades particulares, as imagens de campo amplo de superfícies podem ser adquiridas, incluindo, por exemplo, imagens que cubram uma área de 1 mm2 ou maior de um arranjo. As imagens podem ser adquiridas em múltiplas cores simultânea ou sequencialmente, por exemplo, para identificar marcadores fluorescentes exclusivamente associados a diferentes tipos de nucleotídeo. Ademais, as imagens podem ser adquiridas sequencialmente para múltiplos ciclos de uma técnica de sequenciamento. As imagens de uma determinada área do arranjo podem ser confiavelmente comparadas a partir de cada ciclo para determinar a sequência de alterações de cor detectadas para cada recurso de ácido nucléico no arranjo. A sequência de alterações de cor pode, sucessivamente, ser usada para inferir as sequências dos fragmentos de ácido nucléico em cada recurso.
[031]Em modalidades particulares, um aparelho da presente revelação inclui um ou mais microfluorômetros. Cada um dos microfluorômetros pode incluir uma fonte de radiação de excitação, um detector e uma objetiva para formar uma subunidade integrada de um cabeçote de leitura. Outros componentes ópticos podem estar presentes em cada microfluorômetro. Por exemplo, um divisor de feixe pode estar presente para proporcionar uma configuração de detecção epifluorescente compacta, por meio da qual o divisor de feixe fica posicionado para direcionar a radiação de excitação a partir da fonte de radiação de excitação à objetiva e direcionar a radiação de emissão a partir da objetiva ao detector.
[032]Uma vantagem de usar um design de microfluorômetro integrado é que o microfluorômetro pode ser convenientemente movido, por exemplo, em uma operação de varredura, para permitir a formação de imagem de um substrato que seja maior que o campo de visão do microfluorômetro. Em modalidades particulares, vários microfluorômetros podem ser combinados para formar um cabeçote de leitura. Várias configurações para a combinação de cabeçotes de leitura serão apresentadas abaixo e podem ser selecionadas para adequar um formato particular para um substrato que deva ter sua imagem formada, enquanto mantém o tamanho relativamente compacto para o cabeçote de leitura como um todo. O tamanho relativamente pequeno e a baixa massa do cabeçote de leitura em várias modalidades da presente revelação resultam em uma inércia relativamente baixa de modo que o cabeçote de leitura entre em modo de descanso rapidamente após ser movido, favorecendo, assim, uma rápida varredura de um arranjo de ácido nucléico ou de outro substrato. Em alguns casos, os microfluorômetros podem ser fixados a um carro de modo que não sejam móveis independentemente em pelo menos algumas dimensões durante o curso de uma aplicação analítica, tal como um ciclo de sequenciamento de ácido nucléico. Por exemplo, múltiplos microfluorômetros podem ser fixados permanentemente de modo que não sejam móveis independentemente uns em relação aos outros nas dimensões x e y (onde pelo menos um entre x e y é a direção de varredura). Os microfluorômetros podem, entretanto, ser independentemente atuados na dimensão z para proporcionar um controle de foco independente. Reduzir os graus de liberdade entre vários microfluorômetros diferentes de um aparelho da presente revelação proporciona uma proteção contra a perda de alinhamento durante o transporte, manuseio e uso do aparelho.
[033]Em algumas modalidades, múltiplos microfluorômetros que estiverem presentes em um cabeçote de leitura ou carro podem ter um módulo de autofocalização dedicado. De modo correspondente, cada microfluorômetro pode ser focalizado independentemente. Em algumas modalidades, um módulo de autofocalização particular em um cabeçote de leitura, embora dedicado à atuação de um microfluorômetro particular, pode, todavia, receber informações a partir de pelo menos outro módulo de autofocalização no cabeçote de leitura e as informações provenientes desse módulo de autofocalização particular e de pelo menos outro módulo de autofocalização podem ser usadas para determinar uma atuação apropriada para obter o foco desejado para o microfluorômetro particular. Dessa forma, o foco para qualquer dado microfluorômetro pode ser determinado pelo consenso entre dois ou mais microfluorômetros presentes no mesmo cabeçote de leitura ou carro.
[034]Em modalidades particulares, uma amostra a ser detectada em um método ou aparelho apresentados no presente documento pode ser proporcionada em um formato de cartucho. Por exemplo, o cartucho pode incluir um substrato a ser detectado junto a outros componentes fluídicos usados para processar o substrato para detecção. Adotando-se o exemplo mais específico de uma aplicação de sequenciamento de ácido nucléico, o cartucho pode incluir uma célula de fluxo capaz de apresentar um arranjo de recursos de ácido nucléico a um dispositivo de detecção, e, opcionalmente, um ou mais dos reservatórios para manter os reagentes de sequenciamento, reservatórios para manter os reagentes de preparação de amostras, reservatórios para manter os produtos residuais gerados durante o sequenciamento, e/ou bombas, válvulas e outros componentes capazes de mover fluidos através da célula de fluxo. Um cartucho fluídico desse tipo pode proporcionar as vantagens de um formato conveniente e compacto para armazenamento e processamento de uma amostra e reagentes para sequenciamento de ácido nucléico.
[035]Em modalidades particulares, um cartucho fluídico pode ser configurado para permitir a reutilização de um ou mais reagentes. Por exemplo, o cartucho fluídico pode ser configurado para distribuir um reagente a uma célula de fluxo, então, remover o reagente da célula de fluxo, e, em seguida, reintroduzi-lo à célula de fluxo. Uma vantagem de reutilizar reagentes consiste em reduzir refugos e reduzir os custos dos processos que utilizam reagentes dispendiosos e/ou reagentes que sejam distribuídos em altas concentrações (ou em altas quantidades).
[036]Os cartuchos fluídicos da presente revelação podem proporcionar uma vantagem de modularidade por meio da qual diferentes amostras podem ser fluidicamente processadas em um primeiro módulo (isto é, o cartucho fluídico) que esteja em comunicação óptica com um segundo módulo (por exemplo, um microfluorômetro, um cabeçote de leitura ou um aparelho de detecção). Um cartucho fluídico pode conter amostra(s), reagentes e hardware fluídico suficientes para um procedimento de processamento fluídico completo (por exemplo, um procedimento de sequenciamento de ácido nucléico) e o cartucho fluídico pode ser distribuído a um aparelho de detecção. Uma vez que os procedimentos fluídicos e de detecção estiverem completos, o cartucho fluídico pode ser removido de modo que o aparelho de detecção esteja pronto para outro procedimento. Devido ao fato de os módulos fluídicos e de detecção serem separáveis, o presente sistema permite que múltiplas amostras sejam avaliadas enquanto se evita o risco de contaminação cruzada entre as amostras. Isso proporciona vantagens às modalidades onde os componentes de detecção são relativamente dispendiosos e tecnicamente difíceis de montar, evitando-se uma manutenção, descontaminação ou descarte desnecessários de componentes ópticos que podem ser necessários quando os componentes fluídicos e os componentes ópticos não forem modulares.
[037]A Figura 1 mostra um dispositivo de varredura óptica exemplificador 1 que explora as vantagens de optoeletrônicos integrados e fluídicos à base de cartucho que são proporcionados pelas várias modalidades aqui apresentadas. O dispositivo exemplificador 1 inclui uma carcaça 2 que contém vários componentes fixos incluindo, por exemplo, componentes ópticos, componentes computacionais, fontes de energia, ventoinhas, e similares. Uma tela 3 presente, por exemplo, na face frontal da carcaça 2 funciona como uma interface gráfica de usuário que pode proporcionar vários tipos de informações, tais como status operacional, status de um procedimento analítico (por exemplo, um ciclo de sequenciamento) sendo realizado, status de transferência de dados para ou a partir do dispositivo 1, instruções para uso, alertas, ou similares. Um receptáculo de cartucho 4 também está presente na face frontal da carcaça 2. Conforme mostrado, o receptáculo de cartucho 4 pode ser configurado como um slot tendo uma porta protetora 5. Um indicador de status 6, sob a forma de uma luz indicadora na estrutura do receptáculo de cartucho neste exemplo, está presente e pode ser configurado para indicar a presença ou ausência de um cartucho no dispositivo 1. Por exemplo a luz indicadora 6 pode alternar entre ligada e desligada ou mudar de cor para indicar a presença ou ausência de um cartucho. Um botão de controle de energia 7 está presente na face frontal da carcaça 2 neste exemplo à medida que estiver identificando inscrições 8, tal como o nome do fabricando ou instrumento.
[038]Na Figura 1, mostra-se, também, um cartucho fluídico exemplificador 10 que pode ser usado para proporcionar uma amostra e reagentes ao dispositivo 1. O cartucho fluídico 10 inclui uma carcaça 11 que protege vários componentes fluídicos, tais como reservatórios, conexões fluídicas, bombas, válvulas, e similares. Uma célula de fluxo 12 é integrada ao cartucho fluídico em uma posição onde se encontra em comunicação fluídica com os reagentes dentro da carcaça. A carcaça 11 tem uma abertura 13 através da qual uma face da célula de fluxo 12 fica exposta de modo que possa interagir opticamente com o dispositivo de varredura óptica 1 quando o cartucho fluídico 10 for colocado no receptáculo de cartucho 4. A carcaça do cartucho 11 também inclui uma porta de amostra 14 para introdução de uma amostra de ácido nucléico alvo. Um código de barras 15 ou outras inscrições legíveis por máquina pode estar opcionalmente presente na carcaça do cartucho 11, por exemplo, para proporcionar rastreamento e gerenciamento de amostras. Outras inscrições 16 também podem estar presentes na carcaça para identificação conveniente por um usuário humano, por exemplo, para identificar o fabricante, análise analítica suportada pelo cartucho fluídico, número de lote, data de vencimento, avisos de segurança, e similares.
[039]O aparelho mostrado na Figura 1 é exemplificador. Outras modalidades exemplificadoras dos métodos e aparelhos da presente revelação que podem ser usadas alternativa ou adicionalmente ao exemplo da Figura 1 são apresentadas em maiores detalhes abaixo.
[040]Proporciona-se no presente documento um aparelho de detecção, tendo (a) um carro incluindo uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros inclui uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo, em que a pluralidade de microfluorômetros é posicionada para adquirir simultaneamente uma pluralidade de imagens de campo amplo em um plano comum, e em que cada uma das imagens de campo amplo é proveniente de uma área diferente do plano comum; (b) um estágio de translação configurado para mover o carro em pelo menos uma direção paralela ao plano comum; e (c) um estágio amostral configurado para manter um substrato no plano comum.
[041 ]Um aparelho de detecção (ou um microfluorômetro individual) da presente revelação pode ser usado para obter uma ou mais imagens em uma resolução suficiente para distinguir recursos em uma escala de mícrons. Por exemplo, um microfluorômetro que seja usado em um aparelho de detecção pode ter uma resolução que seja suficiente para distinguir recursos que sejam separados por no máximo 500 μm, 100 μm, 50 μm, 10 μm, 5 μm, 4 μm, 3 μm, 2 μm ou 1 μm. Uma resolução inferior também é possível, por exemplo, uma resolução que distinga recursos que sejam separados por mais de 500 μm.
[042]Um aparelho de detecção (ou um microfluorômetro individual) da presente revelação é bem adequado para detecção de alta resolução de superfícies. De modo correspondente, arranjos tendo recursos com um espaçamento médio na faixa de mícrons são substratos especialmente úteis. Em modalidades particulares, um aparelho de detecção ou microfluorômetro pode ser usado para obter uma ou mais imagens de um arranjo tendo recursos com um espaçamento centro-a-centro para os vizinhos mais próximos que, em média, sejam iguais ou menores que 500 μm, 100 μm, 50 μm, 10 μm, 5 μm, 4 μm, 3 μm, 2 μm ou 1 μm. Em muitas modalidades, os recursos de um arranjo não são contíguos sendo separados, por exemplo, por menos de 100 μm, 50 μm, 10 μm, 5 μm, 1 μm, ou 0,5 μm. No entanto, os recursos não precisam ser separados. De preferência, alguns ou todos os recursos de um arranjo podem ser contíguos entre si.
[043]Pode-se usar qualquer entre uma variedade de arranjos (também referidos como “microarranjos”) conhecidos na técnica. Um arranjo típico contém recursos, cada um tendo uma sonda individual ou uma população de sondas. No último caso, a população de sondas em cada sítio é tipicamente homogênea tendo uma única espécie de sonda. Por exemplo, no caso de um arranjo de ácido nucléico, cada recurso pode ter múltiplas espécies de ácido nucléico cada uma tendo uma sequência comum. No entanto, em algumas modalidades, as populações em cada recurso de um arranjo podem ser homogêneas. De modo similar, os arranjos de proteína podem ter recursos com uma única proteína ou uma população de proteínas tipicamente, mas nem sempre, tendo a mesma sequência de aminoácido. As sondas podem ser fixadas à superfície de um arranjo, por exemplo, através de uma ligação covalente das sondas à superfície ou através de interação(ões) não- covalentes das sondas com a superfície. Em algumas modalidades, sondas, tais como moléculas de ácido nucléico, podem ser fixadas a uma superfície através de uma camada de gel conforme descrito, por exemplo, no documento US 2011/0059865 Al, que se encontra aqui incorporado a título de referência.
[044]Arranjos exemplificadores incluem, sem limitações, um BeadChip Array disponível junto a Illumina®, Inc. (San Diego, Califórnia, EUA) ou outros, tais como aqueles onde as sondas são fixadas a microesferas que estejam presentes em uma superfície (por exemplo, microesferas em poços sobre uma superfície) tais como aquelas descritas nas Patentes U.S. Nos. 6.266.459; 6.355.431; 6.770.441; 6.859.570; ou 7.622.294; ou Publicação PCT No. WO 00/63437, estando cada uma dessas aqui incorporada a título de referência. Outros exemplos de microarranjos comercialmente disponíveis que podem ser usados incluem, por exemplo, um microarranjo Affymetrix® GeneChip® ou outro microarranjo sintetizado de acordo com as técnicas algumas vezes referidas como tecnologias VLSIPSTM (Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis). Um microarranjo identificado também pode ser usado em um aparelho ou sistema de acordo com algumas modalidades da invenção. Um microarranjo identificado exemplificador consiste em um Arranjo CodeLinkTM disponível junto a Amersham Biosciences. Outro microarranjo útil é aquele fabricado usando métodos de impressão a jato de tinta, tal como a Tecnologia SurePrintTM disponível junto a Agilent Technologies.
[045]Outros arranjos uteis incluem aqueles usados em aplicações de sequenciamento de ácido nucléico. Por exemplo, arranjos tendo amplicons de fragmentos genômicos (geralmente referidos como agrupamentos) são particularmente uteis, tais como aqueles descritos em Bentley et al, Nature 456:5359 (2008), WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, ou US 2008/0108082, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência. Outro tipo de arranjo útil para o sequenciamento de ácido nucléico consiste em um arranjo de partículas produzidas a partir de uma técnica PCR por emulsão. Descrevem-se exemplos em Dressman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), WO 05/010145, US 2005/0130173 ou US 2005/0064460, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Muito embora os arranjos anteriores tenham sido descritos no contexto de aplicações de sequenciamento, compreender-se-á que os arranjos podem ser usados em outras modalidades incluindo, por exemplo, aqueles que não incluem uma técnica de sequenciamento.
[046]Sejam configurados para detecção de um arranjo ou de outra amostra, um ou mais microfluorômetros que estejam presentes em um aparelho de detecção podem ser configurados para detecção de campo amplo. O diâmetro de campo para um microfluorômetro individual pode, por exemplo, ser igual a pelo menos 0,5 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm ou maior. Mediante a escolha de componentes ópticos apropriados, o diâmetro de campo pode ser limitado a uma área máxima e, como tal, o diâmetro de campo não pode ser, por exemplo, maior que 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm ou 1 mm. De modo correspondente, em algumas modalidades, uma imagem obtida por um microfluorômetro individual pode ter uma área que esteja em uma faixa de 0,25 mm2 a 25 mm2.
[047]Além de ser configurado para detecção de campo amplo, um microfluorômetro pode ser configurado para ter uma abertura numérica (NA) que seja maior que 0,2. Por exemplo, a NA de uma objetiva usada em um microfluorômetro da presente revelação pode ser pelo menos igual a 0,2, 0,3, 0,4, ou 0,5. Alternativa ou adicionalmente, pode ser desejável restringir a NA da objetiva para que não seja maior que 0,8, 0,7, 0,6 ou 0,5. Os métodos e aparelhos aqui apresentados são particularmente úteis quando a detecção ocorrer através de uma objetiva tendo uma NA entre 0,2 e 0,5.
[048]Em modalidades de detecção de arranjo, um aparelho de detecção (ou microfluorômetro individual) pode ser configurado para obter uma imagem digital do arranjo. Tipicamente, cada pixel do aparelho de detecção digital (ou microfluorômetro individual) coletará sinal a partir de não mais que um único recurso em qualquer dada aquisição de imagem. Essa configuração minimiza a 'diafonia' indesejada entre os recursos na imagem. O número de pixels que detecta sinal a partir de cada recurso pode ser ajustado com base no tamanho e formato dos recursos que tiveram imagem formada e com base na configuração do aparelho de detecção digital (ou microfluorômetro individual). Por exemplo, cada recurso pode ser detectado em uma dada imagem por não mais que cerca de 16 pixels, 9 pixels, 4 pixels, ou 1 pixel. Em modalidades particulares, cada imagem pode utilizar, em média, 6,5 pixels por recurso, 4,7 pixels por recurso ou 1 pixel por recurso. O número de pixels usados por recurso pode ser reduzido, por exemplo, reduzindo-se a variabilidade na posição dos recursos no padrão do arranjo e estreitamento da tolerância para alinhamento do aparelho de detecção ao arranjo. Adotando-se como exemplo um detector digital que seja configurado para usar menos de 4 pixels por recurso, a qualidade de imagem pode ser aperfeiçoada utilizando-se um arranjo de recursos de ácido nucléico ordenados no lugar de um arranjo de agrupamentos de ácido nucléico aleatoriamente distribuídos.
[049]Compreender-se-á que um aparelho de detecção tendo múltiplos microfluorômetros pode detectar uma área de um plano comum que seja aproximadamente equivalente ao número de microfluorômetros multiplicado pela área de campo amplo detectada por cada microfluorômetro. As áreas não precisam ser contíguas. Por exemplo, 2 ou mais microfluorômetros podem ser posicionados para detectar regiões discretas de um plano comum que sejam separadas por uma área não-detectada. No entanto, caso seja desejado, múltiplos microfluorômetros podem ser posicionados para detectar áreas que sejam contíguas, mas não sobrepostas. Em modalidades alternativas, um aparelho de detecção tendo múltiplos microfluorômetros pode detectar uma área de um plano comum que seja substancialmente menor que o número de microfluorômetros multiplicado pela área de campo amplo detectada por cada microfluorômetro. Isso pode resultar, por exemplo, quando múltiplos microfluorômetros forem posicionados para detectar áreas que tenham pelo menos uma sobreposição parcial. Conforme apresentado em maiores detalhes em qualquer parte do presente documento, múltiplas imagens não precisam ser adquiridas em um formato que seja usado para reconstrução, ou que ainda suporte a mesma, de uma imagem completa de um arranjo ou outro plano comum que tenha sido detectado.
[050]Um esboço óptico exemplificador para um microfluorômetro 100 é mostrado na Figura 2. O microfluorômetro 100 é direcionado a uma célula de fluxo 170 tendo uma camada superior 171 e uma camada inferior 173 que são separadas por um canal carregado com fluido 175. Na configuração mostrada, a camada superior 171 é opticamente transparente e o microfluorômetro 100 é focalizado em uma área 176 na superfície interna 172 da camada superior 171. Em uma configuração alternativa, o microfluorômetro 100 pode ser focalizado na superfície interna 174 da camada inferior 173. Uma ou ambas as superfícies podem incluir recursos de arranjo a serem detectados pelo microfluorômetro 100.
[051]O microfluorômetro 100 inclui uma objetiva 101 que seja configurada para direcionar radiação de excitação a partir de uma fonte de radiação 102 à célula de fluxo 170 e direcionar emissão a partir da célula de fluxo 170 a um detector 108. No esboço exemplificador, a radiação de excitação proveniente da fonte de radiação 102 passa através de uma lente 105, então, através de um divisor de feixe 106 e, em seguida, através da objetiva em seu percurso até a célula de fluxo 170. Na modalidade mostrada, a fonte de radiação inclui dois diodos emissores de luz (LEDs) 103 e 104, que produzem radiação em comprimentos de onda diferentes entre si. A radiação de emissão proveniente da célula de fluxo 170 é capturada pela objetiva 101 e refletida pelo divisor de feixe através da óptica de condicionamento 107 e ao detector 108 (por exemplo, um sensor CMOS). O divisor de feixe 106 funciona para direcionar a radiação de emissão em uma direção que seja ortogonal à trajetória da radiação de excitação. A posição da objetiva pode ser movida na dimensão z para alterar o foco do microfluorômetro. O microfluorômetro 100 pode ser movido para trás e para frente na direção y para capturar imagens de várias áreas da superfície interna 172 da camada superior 171 da célula de fluxo 170.
[052]A Figura 3 mostra uma vista explodida de um microfluorômetro exemplificador para propósitos de demonstrar a disposição funcional de vários componentes ópticos. Duas fontes de excitação são mostradas, incluindo um LED verde (LEDG) e um LED vermelho (LEDR). A luz de excitação passa através de uma lente coletora de LED verde (L6) e de uma lente coletora de LED vermelho (L7), respectivamente. Um espelho retrátil de LED (Ml) reflete a radiação de excitação verde a um dicróico combinador (F5) que reflete a radiação de excitação verde através de um filtro de excitação (F2), em seguida, através de um divisor de feixe de diodo a laser (F3), então, através de um batente de campo de excitação (FS), então, através de um grupo de lentes de projeção de excitação L2 a um dicróico de excitação/emissão (F4) que reflete a radiação de excitação verde através de um grupo de lentes objetivas estacionárias (L3) e de um grupo de lentes objetivas de translação (L4) à superfície de uma célula de fluxo (FC). A radiação de excitação vermelha passa a partir da lente coletora de LED vermelho (L7) ao dicróico combinador (F5), sendo que após isso a radiação de excitação vermelha segue a mesma trajetória que a radiação de excitação verde à superfície da célula de fluxo (FC). Conforme mostrado na figura, a focalização é atuada movendo-se o grupo de lentes objetivas de translação (L4) para cima e para baixo (isto é, ao longo da dimensão z). A emissão a partir da superfície da célula de fluxo (FC) passa novamente através do grupo de lentes objetivas de translação (L4), e, então, através do grupo de lentes objetivas estacionárias (L3) ao dicróico de excitação/emissão (F4) que passa a radiação de emissão ao grupo de lentes de projeção de emissão (LI) através do filtro de emissão e, então, ao sensor de imagem CMOS (SI). Um diodo a laser (LD) também é direcionado através de um grupo de lentes de acoplamento de diodo a laser (L5) ao divisor de feixe de diodo a laser (F3) que reflete a radiação de diodo a laser através do batente de campo de excitação (FS), do grupo de lentes de projeção de excitação (L2), do dicróico de excitação/emissão (F4), do grupo de lentes objetivas estacionárias (L3) e do grupo de lentes objetivas de translação (L4) à célula de fluxo (FC).
[053]Conforme demonstrado pelas modalidades exemplificadoras da Figura 2 e da Figura 3, cada um dos microfluorômetros pode incluir um divisor de feixe e um detector, em que o divisor de feixe é posicionado para direcionar a radiação de excitação a partir de uma fonte de radiação de excitação à objetiva e direcionar a radiação de emissão a partir da objetiva ao detector. Conforme mostrado nas figuras, cada microfluorômetro pode incluir, opcionalmente, uma fonte de radiação de excitação, tal como um LED. Neste caso, cada microfluorômetro pode incluir uma fonte de radiação dedicada, de modo que o cabeçote de leitura inclua várias fontes de radiação, cada uma separada em microfluorômetros individuais. Em algumas modalidades, dois ou mais microfluorômetros podem receber radiação de excitação a partir de uma fonte de radiação comum. Desse modo, dois ou mais microfluorômetros podem compartilhar uma fonte de radiação. Em uma configuração exemplificadora, uma única fonte de radiação pode direcionar radiação a um divisor de feixe que seja posicionado para separar a radiação de excitação em dois ou mais feixes e direcionar os feixes a dois ou mais respectivos microfluorômetros. Adicional ou alternativamente, a radiação de excitação pode ser direcionada a partir de uma fonte de radiação a um, dois ou mais microfluorômetros através de uma ou mais fibras ópticas.
[054]Compreender-se-á que os componentes particulares mostrados nas figuras são exemplificadores e podem ser substituídos por componentes de função similar. Por exemplo, pode-se usar qualquer entre uma variedade de fontes de radiação ao invés de um LED. As fontes de radiação particularmente úteis são lâmpadas de arco, lasers, fontes de luz semicondutoras (SLSs), ou diodos a laser. Os LEDs podem ser adquiridos, por exemplo, junto a Luminus (Billerica, Massachusetts, EUA). De modo similar, uma variedade de detectores é útil incluindo, mas sem limitar-se a, um sensor de dispositivo acoplado à carga (CCD); tubos fotomultiplicadores (PMT's); ou sensor de óxido metálico semicondutor complementar (CMOS). Um detector particularmente útil é um sensor CMOS de 5 megapixels (MT9P031) disponível junto a Aptina Imaging (San Jose, Califórnia, EUA).
[055]A Figura 2 e a Figura 3 proporcionam modalidades exemplificadoras de um microfluorômetro que inclui duas fontes de excitação. Essa configuração é útil para detectar pelo menos dois fluoróforos que sejam excitados em diferentes comprimentos de onda, respectivamente. Caso seja desejado, um microfluorômetro pode ser configurado para incluir mais de duas fontes de excitação. Por exemplo, um microfluorômetro pode incluir pelo menos 2, 3, 4 ou mais fontes de excitação diferentes (isto é, fontes que produzem diferentes comprimentos de onda entre si). Alternativa ou adicionalmente, podem-se usar divisores de feixe e filtros ópticos para expandir a faixa de comprimentos de onda de excitação disponíveis a partir de uma fonte de radiação individual. De modo similar, podem-se usar múltiplas fontes de radiação e/ou filtragem óptica de feixes de excitação divididos para modalidades onde vários microfluorômetros compartilham a excitação proveniente de uma ou mais fontes de radiação. Conforme apresentado em maiores detalhes em qualquer parte do presente documento, a disponibilidade de múltiplos comprimentos de onda de excitação é particularmente útil para aplicações de sequenciamento que utilizam vários marcadores de fluoróforo diferentes.
[056]A Figura 4 mostra uma disposição exemplificadora de quatro microfluorômetros em um único cabeçote de leitura 150. Os quatro microfluorômetros são dispostos em um esboço decalado em relação aos canais 161 e 162 de uma célula de fluxo 160. Na disposição mostrada, dois dos microfluorômetros (correspondentes aos detectores 108a e 108c) são configurados para formar imagem de regiões separadas de um primeiro canal 161 e os outros dois microfluorômetros (correspondentes aos detectores 108b e 108d) são configurados para formar imagem de regiões separadas de um segundo canal 162. Conforme mostrado, os microfluorômetros (correspondentes aos detectores 108a e 108c) são decalados em relação aos microfluorômetros (correspondentes aos detectores 108b e 108d) na dimensão x de modo que os dois pares de microfluorômetros possam detectar os canais adjacentes 161 e 162 respectivamente. Os microfluorômetros têm uma trajetória ortogonal de emissão e excitação (conforme mostrado na Figura 2) com as fontes de radiação 102 posicionadas no mesmo lado do cabeçote de leitura, oposto à célula de fluxo 160. Dois dos detectores 108a e 108c são posicionados em um primeiro lado do cabeçote de leitura e os outros detectores 108b e 108d são posicionados no lado oposto, sendo que ambos os lados são ortogonais ao lado onde as fontes de excitação são posicionadas. Na modalidade exemplificadora mostrada na Figura 4, as quatro fontes de radiação se encontram em contato térmico com um único dissipador de calor grande 120. Um único dissipador de calor grande proporcionar um grau maior de dissipação de calor do que muitas configurações que usam um dissipador de calor individual para cada fonte de radiação. No entanto, caso seja desejado, fontes de radiação individuais podem ser termicamente acopladas a dissipadores de calor individuais (vide, por exemplo, a Figura 8 e a descrição relacionada abaixo). Uma vantagem da disposição de microfluorômetros mostrados na Figura 4 é a provisão de um cabeçote de leitura compacto. Vantagens similares podem ser derivadas para modalidades onde as posições relativas da fonte de excitação e do detector em cada microfluorômetro são trocadas (vide, por exemplo, a Figura 8 e a descrição relacionada abaixo).
[057]O cabeçote de leitura 150 mostrado na Figura 4 é posicionado para varredura na dimensão y. A dimensão y é paralela ao comprimento da célula de fluxo 160 de modo que o movimento do cabeçote de leitura 150 em uma operação de varredura resulte na formação de imagens de áreas ao longo do comprimento da célula de fluxo 160. Os detectores 108a, 108b, 108c e 108d são posicionados em lados opostos do cabeçote de leitura 150, e em lados opostos da célula de fluxo 160, sendo que os lados da célula de fluxo se estendem ao longo da direção de varredura. A orientação do cabeçote de varredura 150 em relação à célula de fluxo 160 e à direção de varredura é exemplificadora. Outras orientações também são úteis, incluindo, por exemplo, a orientação mostrada na Figura 13 em que os detectores são posicionados em lados opostos do cabeçote de leitura, mas em uma posição para frente e para trás em relação à direção de varredura.
[058]Um microfluorômetro, ou cabeçote de leitura tendo vários microfluorômetros, pode ser posicionado acima de uma célula de fluxo (em relação à seta da ação da gravidade) conforme exemplificado para várias modalidades aqui apresentadas. No entanto, também é possível posicionar um microfluorômetro, ou um cabeçote de leitura, abaixo de uma célula de fluxo. De modo correspondente, uma célula de fluxo pode ser transparente no lado superior, lado inferior ou em ambos os lados em relação aos comprimentos de onda de emissão de excitação e radiação usada. De fato, em algumas modalidades, pode ser desejável posicionar microfluorômetros em ambos os lados de uma célula de fluxo ou posicionar cabeçotes de leitura em ambos os lados de uma célula de fluxo. Outras orientações em relação à gravidade também são possíveis, incluindo, por exemplo, uma orientação lado a lado entre uma célula de fluxo e um microfluorômetro (ou cabeçote de leitura).
[059]Um microfluorômetro ou cabeçote de leitura pode ser configurado para detectar as duas superfícies internas opostas de uma célula de fluxo a partir de um único lado da célula de fluxo. Por exemplo, o microfluorômetro ou cabeçote de leitura pode empregar um compensador óptico que seja inserido e removido para detectar superfícies alternativas da célula de fluxo. Descrevem-se métodos e aparelhos exemplificadores para detectar superfícies internas opostas de uma célula de fluxo, tal como o uso de compensadores ópticos em US 8.039.817, que se encontra aqui incorporado em sua totalidade a título de referência. Um compensador é opcional, por exemplo, dependendo da NA e/ou da resolução óptica do aparelho.
[060]Um microfluorômetro usado em um aparelho ou método apresentado no presente documento pode incluir um módulo de autofocalização. De modo correspondente, múltiplos microfluorômetros que estão presentes em um cabeçote de leitura podem ter um módulo de autofocalização dedicado. Um módulo de autofocalização exemplificador 1600 é mostrado na Figura 5. O módulo inclui um receptáculo 1602 para uma objetiva de um microfluorômetro (por exemplo, a lente objetiva de translação mostrada na Figura 3). O receptáculo 1602 é fixado a um suporte deslizante 1603 tendo um braço de alavanca 1604. O braço de alavanca 1604 interage funcionalmente com um motor 1610 que é configurado para mover o braço de alavanca para cima e para baixo (ao longo da direção z). Desse modo, o motor 1610 atua o movimento da objetiva na direção z para alterar o foco. O motor 1610 é um atuador linear que usa uma rosca de avanço. A rotação de uma rosca de avanço interna sob a força rotacional do motor faz com que a porca de avanço 1613, através da qual a rosca de avanço é rosqueada, se mova para cima e para baixo. A porca de avanço 1613 é posicionada entre dois mancais 1611a e 1611b. O movimento da porca de avanço é orientado contra a mola 1608. A porca de avanço 1613 se encontra em contato físico com o braço de alavanca 1604 de modo que o movimento para cima e para baixo da porca de avanço atue o movimento para cima e para baixo do suporte deslizante 1603 e, consequentemente, a objetiva. Um sensor 1609 fica localizado no lado inferior do módulo de autofocalização separado do atuador por um espaçador 1612.
[061]O módulo de autofocalização 1600 mostrado na Figura 5 inclui, ainda, um suporte estrutural tendo um corpo lateral 1607 conectado a um plano posterior 1614 e conectado a uma flexão superior 1606 e uma flexão inferior 1605. Pode-se proporcionar rigidez pela estrutura de armação de caixa do corpo lateral 1607. Ademais, proporciona-se rigidez por dois suportes triangulares 1615a e 1615b entre o corpo lateral 1607 e o plano posterior 1614. As flexões 1606 e 1605 podem ser co- moldadas com o suporte deslizante para proporcionar uma grande tolerância entre o suporte deslizante 1603 e o corpo lateral 1607.
[062]Conforme mostrado pela modalidade exemplificadora da Figura 5, um módulo de autofocalização que é usado em um microfluorômetro pode incluir um detector e um atuador, em que o atuador é configurado para alterar o foco do microfluorômetro em relação ao plano comum, e em que o detector é configurado para direcionar o movimento do atuador. Desse modo, um módulo de autofocalização pode incluir um detector dedicado que direciona o movimento do atuador. O detector dedicado pode operar em um laço fechado com o atuador sem a necessidade de comunicar dados para fora do microfluorômetro ou para fora do cabeçote de detecção a fim de alcançar uma focalização automática. Alternativa ou adicionalmente, um detector fora do módulo de autofocalização, tal como o detector de formação de imagem que é usado para a formação de imagem de campo amplo, pode direcionar o movimento do atuador. Logo, o mesmo detector que é usado para formação de imagem de campo amplo e emitir dados de imagem a uma unidade de processamento para fora do microfluorômetro ou cabeçote de leitura também pode ser usado para alcançar uma focalização automática.
[063]Em modalidades particulares, os módulos de autofocalização para dois ou mais microfluorômetros em um cabeçote de leitura podem ser configurados para se comunicarem entre si. Por exemplo, um módulo de autofocalização para um primeiro microfluorômetro de um cabeçote de leitura pode ser configurado para integrar dados a partir de um módulo de autofocalização para um segundo microfluorômetro do aparelho. Dessa forma, o módulo de autofocalização para o primeiro microfluorômetro pode alterar o foco do primeiro microfluorômetro com base na posição focal percebida do primeiro microfluorômetro e na posição focal percebida do segundo microfluorômetro. Logo, um detector para um módulo de autofocalização pode ser configurado de modo que seja dedicado a focalizar geneticamente ao longo de um cabeçote de leitura enquanto não seja configurado para aquisição de imagem analítica. As informações de dois módulos de autofocalização diferentes podem ser úteis para determinar a inclinação de ponta do cabeçote de leitura. Uma inclinação de ponta indesejável pode ser corrigida pela atuação compensatória de um ou mais microfluorômetros com base nas informações de inclinação de ponta.
[064]Embora a focalização automática tenha sido exemplificada em relação a um motor de rosca de avanço, compreender-se-á que os módulos de autofocalização que usam outras modalidades de atuação podem ser usados incluindo, por exemplo, aqueles que usam um piezomotor ou motor de bobina de voz no lugar do motor de rosca de avanço exemplificado acima.
[065]Um cabeçote de leitura pode incluir dois ou mais microfluorômetros, por exemplo, fixados a um carro. Para modalidades que utilizam uma célula de fluxo de múltiplos canais, o cabeçote de leitura pode incluir uma série de microfluorômetros que correspondem ao número de canais na célula de fluxo. Conforme demonstrado anteriormente pelo exemplo da Figura 4, mais de um microfluorômetro por canal de célula de fluxo pode estar presente. Em modalidades particulares, um cabeçote de leitura pode proporcionar um único microfluorômetro por canal de fluxo. Na disposição exemplificadora mostrada na Figura 6, a célula de fluxo tem quatro canais e o cabeçote de leitura tem quatro microfluorômetros. A figura mostra uma vista de planta de topo da célula de fluxo e objetivas dos microfluorômetros. Para facilidade de demonstração, os componentes dos microfluorômetros além das objetivas não são mostrados; no entanto, aqueles componentes podem ser posicionados para alcançar um design compacto, por exemplo, ao longo das linhas exemplificadas em qualquer parte do presente documento. Conforme mostrado no painel A da Figura 6, as quatro objetivas podem ser dispostas em uma relação linear de modo que as objetivas sejam estritamente acondicionadas e uma linha reta imaginária passe através do ponto central de cada objetiva. A linha imaginária pode ser deslocada em um ângulo em relação à dimensão y, sendo que a dimensão y corresponde à dimensão mais longa da célula de fluxo (ou direção de varredura). O ângulo pode ser entre 0° e 90° no quadrante x-y e pode ser selecionado para acomodar o espaçamento dos canais na célula de fluxo (e o espaçamento das objetivas no cabeçote de leitura). A Figura 6A mostra um ângulo de deslocamento relativamente pequeno para uma linha que passa através das objetivas estritamente acondicionadas que acomodam os canais acondicionados de modo relativamente estrito. Um ângulo de deslocamento maior pode ser usado para acomodar canais que sejam separados por distâncias maiores entre si ou objetivas que sejam acondicionadas mais estritamente.
[066]O painel B da Figura 6 mostra uma disposição de múltiplas objetivas em duas linhas. No presente documento, a célula de fluxo inclui oito canais e o cabeçote de leitura tem oito microfluorômetros. O acondicionamento geral das objetivas nas duas linhas é aproximadamente retilíneo. A disposição acomoda objetivas estritamente acondicionadas e dois conjuntos de canais estritamente acondicionados (isto é, um primeiro conjunto de quatro canais estritamente acondicionados e um segundo conjunto de quatro canais estritamente acondicionados). Neste exemplo, os dois conjuntos de canais estritamente acondicionados são separados por um espaçamento maior que o espaçamento que separa os canais individuais em cada conjunto de quatro. Compreender-se-á que o acondicionamento geral das objetivas nas duas linhas pode ser deslocado a partir do acondicionamento retilíneo para acomodar diferentes disposições de canal. Adicionalmente, conforme apresentado em relação a uma única linha de objetivas, o ângulo de deslocamento da linha imaginária que se estende através dos centros de ambas as linhas de objetivas pode ser alterado e/ou a distância entre as objetivas pode ser alterada para acomodar diferentes disposições de canal.
[067]A Figura 7 demonstra uma disposição de múltiplas objetivas nas quais uma linha imaginária que se estende através dos centros das objetivas se encontra em um ângulo de 90° em relação à dimensão mais longa da célula de fluxo (ou direção de varredura). A linha imaginária se estende ao longo do eixo geométrico x. Neste exemplo, as objetivas se encontram em duas fileiras e são hexagonalmente acondicionadas. O acondicionamento hexagonal proporciona a vantagem de compactação máxima no plano x-y. O cabeçote de leitura é mostrado com seis objetivas e a célula de fluxo tem seis canais. Compreender-se-á que disposições similares podem ser usadas para um cabeçote de leitura tendo somente quatro objetivas ou para cabeçotes de leitura tendo mais de seis objetivas (por exemplo, oito objetivas conforme mostrado na Figura 8, na Figura 9, e na Figura 13). Conforme fica evidente por comparação visual, os canais de célula de fluxo são espaçados ainda mais na disposição da Figura 7 do que na disposição da Figura 6. No entanto, o espaçamento dos canais em ambos os casos se encontra dentro de uma faixa útil e conveniente, por exemplo, para aplicações de sequenciamento de ácido nucléico.
[068]Conforme demonstrado pelos exemplos das Figuras 6 e 7, cada objetiva em um cabeçote de leitura pode ser posicionada para formar imagem de pelo menos uma porção de um canal de fluxo individual. Cada objetiva pode ser posicionada para formar imagem de um e somente um canal de uma célula de fluxo tendo vários canais. Uma objetiva individual pode ser posicionada para formar imagem de uma porção de um e somente um canal, por exemplo, quando localizado em uma posição de estágio y particular. A varredura na dimensão y pode permitir que todo ou parte do canal tenha sua imagem formada através da objetiva. Em alguns casos, por exemplo, quando o diâmetro de campo da objetiva (ou outros componentes ópticos limitantes de um microfluorômetro) for menor que a largura do canal, a objetiva também pode ser varrida na dimensão x para formar imagem de todo ou de parte do canal. Múltiplas objetivas e seus respectivos microfluorômetros podem ser posicionados de modo que muitas das objetivas sejam posicionadas para obter imagens para ao menos uma porção de um e somente um canal. Naturalmente, o movimento de um cabeçote de leitura contendo as múltiplas objetivas e seus respectivos microfluorômetros pode ocorrer na direção y e/ou x para formar imagem de todo ou de parte de cada canal respectivo. Essas configurações particulares são úteis para células de fluxo de múltiplos canais conforme exemplificado acima. No entanto, compreender-se-á que as configurações e princípios fundamentais apresentados acima podem ser aplicadas a uma disposição apropriada de várias células de fluxo individuais, sendo que cada uma tem somente um único canal. Adicionalmente, conforme é o caso genérico para os métodos e aparelhos apresentados no presente documento, as disposições podem ser aplicadas a substratos além das células de fluxo.
[069]Uma vista em perspectiva de um cabeçote de leitura 1000 tendo uma disposição de oito microfluorômetros é mostrada na Figura 8. Cada microfluorômetro tem um design compacto similar àquele mostrado na Figura 3. Para facilidade de demonstração, os componentes de somente um dos microfluorômetros são marcados na Figura 8 e serão descritos no presente documento. No entanto, conforme visível na Figura 8, cada um dos microfluorômetros tem componentes e configurações similares. Duas fontes de excitação estão presentes em cada microfluorômetro, incluindo um LED verde 1040 e um LED vermelho 1030. A luz de excitação proveniente dos LEDs passa através de uma lente coletora de LED verde 1075 e de uma lente coletora de LED vermelho 1076, respectivamente. Um espelho retrátil de LED 1074 reflete a radiação de excitação verde a um dicróico combinador 1073 que reflete a radiação de excitação verde através de um divisor de feixe de diodo a laser 1072, então, através de uma lente de projeção de excitação 1071 a um dicróico de excitação/emissão 1060 que reflete a radiação de excitação verde através de uma objetiva 1010. A radiação de excitação vermelha passa a partir da lente coletora de LED vermelho 1076 ao dicroico combinador 1073 após o qual a radiação de excitação vermelha segue a mesma trajetória que a radiação de excitação verde. A objetiva 1010 é posicionada para coletar radiação de emissão e direcioná-la através do dicróico de excitação/emissão 1060 que passa a radiação de emissão ao sensor de imagem CMOS 1080. Um diodo a laser 1301 é posicionado para direcionar radiação através de um grupo de lentes de acoplamento de diodo a laser 1401 ao divisor de feixe de diodo a laser 1072 que reflete a radiação de diodo a laser através da lente de projeção de excitação 1071, do dicróico de excitação/emissão 1060, e da objetiva 1010. Um módulo de autofocalização 1600 é acoplado a pelo menos parte da objetiva 1010 e configurado para transladar a objetiva 1010 para cima e para baixo (isto é, ao longo da dimensão z). O módulo de autofocalização pode, mas não precisa, incluir componentes do aparelho de autofocalização exemplificado na Figura 5. Compreender-se-á que componentes ópticos adicionais podem estar presentes no cabeçote de leitura 1000 incluindo, mas sem limitar-se àqueles exemplificados para a Figura B. Adicionalmente, determinados componentes ópticos podem estar ausentes do cabeçote de leitura 1000 ou modificados no cabeçote de leitura 1000 para adequar aplicações particulares. Placas de circuito impresso 1701 e 1702 podem ser configuradas para se comunicarem com os detectores, módulos de autofocalização e/ou fontes de excitação.
[070]A Figura 9 mostra uma vista de planta inferior do cabeçote de leitura 1000. Novamente, para facilidade de demonstração, os componentes de somente um dos microfluorômetros são marcados na Figura 9 e descritos no presente documento. O LED vermelho 1030 é mostrado em comunicação térmica com o dissipador de calor 1201 e em alinhamento óptico com a lente coletora de LED vermelho 1076. O LED verde é escurecido pelo LED vermelho 1030 e a maioria da trajetória de excitação é escurecida pelo módulo de autofocalização 1600 nessa vista. A objetiva 1010 é visível conforme em uma porção do sensor de imagem CMOS 1080; no entanto, a maioria da trajetória de emissão é escurecida nessa vista. Conforme fica evidente a partir das figuras, as objetivas são dispostas em duas fileiras e acondicionadas hexagonalmente.
[071]As configurações descritas anteriormente exemplificam um cabeçote de leitura em que cada um dos microfluorômetros inclui pelo menos uma fonte de radiação, um divisor de feixe e um detector, em que o divisor de feixe é posicionado para direcionar a radiação de excitação a partir da fonte de radiação de excitação à objetiva e direcionar a radiação de emissão a partir da objetiva ao detector, em que a radiação de excitação e a radiação de emissão são direcionadas em direções mutuamente ortogonais. Nas modalidades exemplificadas nas Figuras 8 e 9, os detectores para vários microfluorômetros são dispostos em um primeiro lado do cabeçote de leitura que seja oposto ao plano comum ao qual as objetivas são focalizadas, um subconjunto das fontes de radiação é disposto em um segundo lado do cabeçote de leitura (o segundo lado sendo ortogonal ao primeiro lado e ortogonal ao plano comum) e um segundo subconjunto das fontes de radiação é disposto em um terceiro lado do cabeçote de leitura (o terceiro lado sendo oposto ao segundo lado, ortogonal ao primeiro lado e ortogonal ao plano comum). Alternativamente, e conforme exemplificado na Figura 4, as fontes de radiação para vários microfluorômetros são dispostas em um primeiro lado do cabeçote de leitura que seja oposto ao plano comum ao qual as objetivas são focalizadas, um primeiro subconjunto dos detectores é disposto em um segundo lado do cabeçote de leitura (o segundo lado sendo ortogonal ao primeiro lado e ortogonal ao plano comum) e o segundo subconjunto dos detectores é disposto em um terceiro lado do carro (o terceiro lado sendo oposto ao segundo lado, ortogonal ao primeiro lado e ortogonal ao plano comum).
[072]Além das modalidades anteriores em que as trajetórias de excitação e emissão são ortogonais, as configurações onde as trajetórias de emissão e excitação são paralelas também podem ser uteis. Neste caso, a(s) fonte(s) de radiação de excitação e o detector podem estar presentes no mesmo lado do cabeçote de leitura. Um esboço exemplificador para um microfluorômetro 800 é mostrado na Figura 10, onde a radiação de excitação proveniente da fonte de excitação 805 passa através da óptica de excitação 806 à superfície de prisma 807 que reflete a radiação de excitação à superfície de prisma 802 que reflete a radiação de excitação através da objetiva 801. A emissão passa através da objetiva 801, então, através do divisor de feixe 802 à lente de projeção 803 e, então, ao detector 804. A trajetória de emissão é paralela à maioria da trajetória de excitação. O detector e a fonte de radiação de excitação ficam localizados no mesmo lado do microfluorômetro, oposto e paralelo ao plano de detecção. Um guia 810 é configurado para fazer interface com uma célula de fluxo ou substrato para alinhar a objetiva. Um guia similar pode ser usado em outros microfluorômetros apresentados no presente documento. O esboço para o microfluorômetro 800 é exemplificador para propósitos de demonstrar uma disposição paralela de trajetórias de excitação e emissão. Outros componentes podem ser incluídos, tais como aqueles mostrados em outras figuras incluindo, mas sem limitar-se a, um módulo de autofocalização. Por exemplo, uma fonte de excitação 809 para um módulo de autofocalização é mostrada e produz excitação que passa através da superfície de prisma 807 e é refletida pela superfície de prisma 802 para passar através da objetiva 801. Vários microfluorômetros 800 podem ser dispostos para que tenham objetivas em uma ou mais linhas, conforme exemplificado nas Figuras 6 e 7.
[073]Conforme demonstrado pelas modalidades exemplificadoras acima, um cabeçote de leitura pode incluir uma pluralidade de objetivas, sendo que cada objetiva é dedicada a um único microfluorômetro. Logo, um microfluorômetro da presente revelação pode incluir uma variedade de componentes ópticos, tais como um ou mais detectores, fontes de radiação de excitação, lentes de divisores de feixe, espelhos, ou similares, que formem um trem óptico que direciona radiação de excitação através de uma única objetiva e/ou que recebe radiação de emissão através de uma única objetiva. Nessas modalidades, a objetiva pode ser configurada como uma macrolente tendo um campo de visão amplo. Em modalidades alternativas, um microfluorômetro da presente revelação pode incluir uma variedade de componentes ópticos que direcionam a radiação de excitação através de várias objetivas e/ou que recebem radiação de emissão através de várias objetivas. Logo, um microfluorômetro individual pode incluir vários trens ópticos que incluem várias objetivas. Em modalidades que incluem várias objetivas por microfluorômetro, as objetivas podem ser opcionalmente configuradas como um arranjo de microlentes. Cada objetiva dentre várias em um microfluorômetro particular (por exemplo, cada microlente em um arranjo de microlentes) pode ser opcionalmente configurada para focalização independente, desse modo, cada objetiva pode ser movida na dimensão z independente de outras objetivas no mesmo microfluorômetro. Alternativa ou adicionalmente, as várias objetivas podem ser configuradas para foco global de modo que possam ser todas movidas juntas na dimensão z.
[074]Compreender-se-á que os vários componentes de um cabeçote de leitura que são apresentados no presente documento podem ser misturados e correspondidos de várias formas com o intuito de alcançar uma função similar àquelas exemplificadas no presente documento. Por exemplo, conforme apresentado no parágrafo anterior, um cabeçote de leitura pode incluir várias objetivas e cada uma dessas objetivas pode ser dedicada a um único microfluorômetro ou, alternativamente, várias dessas objetivas podem ser compartilhadas por um único microfluorômetro. De modo similar, e conforme apresentado previamente no presente documento, cada microfluorômetro pode incluir pelo menos uma fonte de excitação dedicada ou, alternativamente, dois ou mais microfluorômetros podem receber radiação de excitação a partir de uma fonte de radiação compartilhada. Logo, não há necessidade de haver uma correspondência um-para-um entre o número de microfluorômetros em um cabeçote de leitura particular e o número de componentes exemplificado no presente documento para qualquer modalidade de microfluorômetro. De preferência, um ou mais dos componentes aqui exemplificados como sendo uteis em um microfluorômetro podem ser compartilhados por vários microfluorômetros em um cabeçote de leitura particular.
[075]Um cabeçote de leitura da presente revelação é particularmente útil para métodos e aparelhos de varredura, por exemplo, devido a seu tamanho relativamente compacto e massa pequena que proporciona baixa inércia. Inércia reduzida permite que o cabeçote de leitura entre em repouso mais rapidamente seguindo movimento, permitindo, assim, que imagens de alta resolução sejam obtidas mais rapidamente do que seriam no caso de um cabeçote de leitura de inércia maior ao qual o movimento residual do cabeçote de leitura causaria embaçamento e perda de resolução. As configurações para alcançar o movimento do cabeçote de leitura serão apresentadas em maiores detalhes abaixo. No entanto, primeiramente deve-se notar que não se pretende que a vantagem de baixa inércia seja uma limitação ou requerimento para um aparelho ou método apresentado no presente documento. De preferência, um cabeçote de leitura da presente revelação pode ser mantido em uma posição estática para todo ou parte de um protocolo de detecção. Por exemplo, um método de sequenciamento, tal como aquele que usa as etapas fluídicas e de formação de imagem aqui apresentadas, pode ser realizado usando um cabeçote de leitura que seja estático durante pelo menos um e, talvez, durante todos os ciclos do método de sequenciamento.
[076]Como um primeiro exemplo de uma modalidade de cabeçote de leitura estático, um cabeçote de leitura pode incluir um número suficiente de microfluorômetros para detectar ou formar imagem de uma porção desejada de uma superfície ou outro objeto. Logo, o cabeçote de leitura não precisa se mover nas dimensões x ou y. Por exemplo, vários microfluorômetros podem ser linearmente dispostos para capturar quadros de imagem ao longo do comprimento total (ou pelo menos ao longo do comprimento efetivo alvo) de um canal de célula de fluxo. De modo similar, usando uma disposição de acondicionamento apropriada de várias fileiras de microfluorômetros, tal como aquela apresentada no presente documento, vários canais de célula de fluxo (presentes em uma ou mais células de fluxo) podem ter suas imagens formadas ao longo de seu comprimento total (ou pelo menos ao longo do comprimento efetivo alvo). Conforme apresentado anteriormente, os quadros de imagem obtidos para um canal individual podem, mas não precisam, ser contíguos.
[077]Como um segundo exemplo de uma modalidade de cabeçote de leitura estático, um cabeçote de leitura pode permanecer em uma posição fixa em relação às dimensões xey enquanto um substrato que estiver sendo detectado pelo cabeçote de leitura é transladado na dimensão x e/ou y. Por exemplo, pode-se proporcionar um aparelho tendo um estágio de translação que seja configurado para apresentar um substrato ao cabeçote de leitura. O estágio de translação pode se mover em um movimento tipo “step-and-shoot” ou contíguo para permitir a varredura do substrato pelo cabeçote de leitura estático. Em modalidades particulares, o substrato é uma célula de fluxo que pode ser fixada ao estágio de translação. A célula de fluxo pode ser transladada como parte de um cartucho fluídico, tal como aquele exemplificado abaixo, ou a célula de fluxo pode ser transladada independentemente de qualquer cartucho fluídico. Logo, o estágio de translação pode ser configurado para fixar um cartucho fluídico ao qual uma célula de fluxo é fixada e mover o cartucho fluídico ao longo do qual a célula de fluxo ou o estágio de translação pode ser configurada para mover somente a célula de fluxo enquanto o cartucho fluídico permanece em uma posição estática ou fixa.
[078]De acordo com os exemplos anteriores, o movimento relativo entre um cabeçote de varredura (ou microfluorômetro) e um substrato pode ser alcançado pelo movimento físico do cabeçote de varredura (ou microfluorômetro), pelo movimento físico do substrato, ou pelo movimento físico de ambos. Compreender- se-á que os cabeçotes de leitura estáticos referidos na primeira e segunda modalidades exemplificadoras acima não precisam ser estáticos em relação ao movimento na dimensão z. De preferência, os cabeçotes de leitura estáticos podem incluir um ou mais microfluorômetros tendo módulos de autofocalização. Alternativa ou adicionalmente, os cabeçotes de leitura podem ser movidos como um todo na dimensão z, por exemplo, para alcançar um foco global pelo menos a uma aproximação.
[079]Voltando-se agora às modalidades em que um cabeçote de leitura é transladado, as Figuras 11 e 12 mostram vistas de superiores e inferiores, respectivamente, de um estágio de translação y exemplificador 200 para um cabeçote de leitura. Nessa modalidade exemplificadora, o estágio y é configurado para translação na dimensão y, mas não na dimensão x. Logo, um cabeçote de leitura transportado pelo estágio de translação y 200 será capaz de realizar um movimento na dimensão y e o cabeçote de leitura ou microfluorômetros individuais no mesmo podem ser capazes de realizarem um movimento na dimensão z (por exemplo, através de autofocalização), mas o cabeçote de leitura não será capaz de realizar um movimento na dimensão x. Um cabeçote de leitura pode ser fixado ao carro 201 tendo uma área de base 241 posicionada para suportar o lado inferior do cabeçote de leitura e uma armação 240 configurada para restringir o movimento lateral do cabeçote de leitura. O carro 201 inclui, ainda, um guia de flange 243 e um guia de colar 242. Uma abertura 244 na área de base 241 proporciona uma janela entre um cabeçote de leitura e um substrato a ser detectado pelo cabeçote de leitura. Os componentes supramencionados do carro 201 podem formar uma estrutura monolítica.
[080]O carro é configurado para se mover ao longo de uma armação em estágio y 207 através de um primeiro eixo 203, ao longo do qual o guia de colar 242 se estende e um segundo eixo 204 ao longo do qual o guia de flange 243 se estende. Os eixos são orientados ao longo do eixo geométrico y de modo que o carro 201 seja direcionado para deslizar para trás e para frente ao longo da dimensão y através dos guias. O primeiro eixo 203 é mantido à armação em estágio y 207 pela inserção no plano de referência 215 em uma primeira parede lateral 250 e no plano de referência 218 em uma segunda parede lateral 251. O primeiro eixo 203 é fixado ao plano de referência 215 pelo membro de suporte 252 e fixado ao plano de referência 218 pelo membro de suporte 253. O segundo eixo 204 é mantido à armação em estágio y 207 pela inserção no plano de referência 214 em uma primeira parede lateral 250 e no plano de referência 217 em uma segunda parede lateral 251. O primeiro eixo 204 é fixado ao plano de referência 214 pela braçadeira de haste 206 e fixado ao plano de referência 217 pela braçadeira de haste 205.
[081]O movimento do carro 201 é acionado pela rotação da rosca de avanço 202 que é rosqueada através de uma porca de avanço 260 e que é fixada à armação em estágio y 207 pela inserção em um plano de referência na primeira parede lateral 250 e em um plano de referência 219 na segunda parede lateral 251. A rosca de avanço 202 é fixada em posição pelos mesmos membros de suporte 252 e 253 que fixam o primeiro eixo 203. A rotação da rosca de avanço 202 é acionada pelo motor 212 que é montado ao membro de suporte 252. Um codificador 208 é configurado para interagir com o motor 212 através de uma correia 210 que interage com o rotor 209 no codificador e rotor 211 no motor 212. Um tensionador de correia 220 interage com a correia 210.
[082]Uma abertura 230 passa através do assoalho 216 da armação em estágio y 207. A abertura 230 é posicionada para acomodar a trajetória de abertura 244 na área de base 241 do carro 201 à medida que atravessa a armação em estágio y. Um cabeçote de leitura é posicionado no carro de modo que as objetivas sejam direcionadas através da abertura 244 e através da abertura 230 ao longo de uma trajetória atravessada pelo carro. De modo correspondente, a abertura 230 acomoda a formação de imagem de uma área alongada ao longo do eixo geométrico y através do movimento de um cabeçote de leitura fixado ao carro.
[083]A relação estrutural e funcional entre o estágio de translação y 200 e o cabeçote de leitura 1000 é mostrada na Figura 13. A orientação das objetivas 1010 em relação à direção de varredura do estágio de translação y 200 é similar àquela exemplificada na Figura 7 (exceto pelo fato de que o cabeçote de leitura 1000 tem duas objetivas adicionais). Uma célula de fluxo pode ser orientada em relação ao estágio de translação y 200 conforme mostrado na Figura 7.
[084]Conforme exemplificado anteriormente, um carro pode ser configurado para mover um cabeçote de leitura, por exemplo, em uma operação de varredura. Alternativa ou adicionalmente, um carro pode ser configurado para evitar o movimento relativo entre os microfluorômetros individuais de um a cabeçote de leitura nas dimensões x e y. Um carro não precisa proporcionar essa função, por exemplo, se o cabeçote de leitura incluir outros elementos estruturais que evitem o movimento relativo entre os microfluorômetros individuais, Por exemplo, um cabeçote de leitura pode ser formado a partir de uma montagem co-moldada. A montagem co-moldada pode, sucessivamente, ser fixada a um carro. Todavia, em algumas modalidades, o carro pode representar pelo menos um papel auxiliar em evitar um movimento transversal relativo entre os microfluorômetros individuais de um cabeçote de leitura. Adicionalmente, compreender-se-á que um cabeçote de leitura que é formado a partir de uma montagem co-moldada pode ser usado para modalidades que não empreguem um carro.
[085]Um estágio y que é usado em um método ou aparelho apresentado na presente invenção pode ser configurado para varrer através de um movimento descontínuo ou contínuo. A varredura descontinua, geralmente referida como varredura tipo step-and-shoot, geralmente envolve um movimento incremental de um microfluorômetro ou cabeçote de varredura na direção y (ou x) e a detecção (por exemplo, aquisição de imagem) entre os movimentos, enquanto o microfluorômetro ou cabeçote de varredura estiver em um estado temporariamente estático. A varredura contínua, por outro lado, geralmente envolve detecção ou aquisição de imagem enquanto o microfluorômetro ou cabeçote de varredura estiver em movimento. Em uma modalidade particular, pode-se realizar uma varredura contínua em um modo de integração de retardo de tempo (TDI). De modo correspondente, o sinal obtido por elementos de pixel ao longo da dimensão de varredura pode ser coletado em um binário comum e lido como um valor único. O modo TDI pode proporcionar vantagens de uma taxa de processamento de sinal aumentada e precisão aumentada. As disposições ópticas exemplificadoras que podem estar incluídas em um microfluorômetro ou cabeçote de leitura para acomodar a detecção em modo TDI são descritas, por exemplo, em US 7.329.860, que se encontra aqui incorporada a título de referência.
[086]O movimento de um microfluorômetro ou cabeçote de varredura em uma dimensão x ou y, por exemplo, para acomodar modalidades de varredura contínuas ou descontínuas, pode ser controlado por um codificador ou outro dispositivo. No exemplo do estágio y 200, o movimento pode ser controlado pelo codificador 208. Conforme apresentado anteriormente no presente documento, a varredura (seja por técnicas contínuas ou descontínuas) pode resultar na aquisição de quadros contíguos ou não-contíguos a partir de um substrato ou outro objeto sob detecção. Logo, a soma total de porções que têm imagens formadas por varredura pode ser contígua (mas não sobreposta), não-contígua, ou sobreposta. O sistema não precisa ser configurado para obter imagens de todo o substrato ou objeto (por exemplo, superfície de arranjo) e não precisa fazê-lo de modo a permitir que uma imagem compósita seja produzida.
[087]Um diagrama de bloco elétrico para um aparelho de detecção é mostrado na Figura 14. Uma placa de circuito impresso de leitura (PCB) está presente em um cabeçote de leitura (vide, por exemplo, PCB 1701 e 1702 na Figura 8) e é conectada a uma PCB principal que está tipicamente contida no aparelho de detecção carcaça. Em modalidades alternativas, a PCB principal pode estar localizada externamente ao instrumento. Os dados podem ser comunicados entre a PCB de leitura e a PCB principal através da linha LVDS. Por exemplo, pode-se usar um cabo flexível plano (FFC) 36-cond e 0,5 mm de inclinação para a linha LVDS. A linha LVDS pode ser configurada para comunicar dados de imagem a partir da PCB de leitura à PCB principal, e instruções para o controle de câmera a partir da PCB principal à PCB de leitura. As duas PCBs também são conectadas por uma linha de força, tal como um FFC SO-cond revestido com cobre de 1 mm de inclinação que transmite energia a partir de uma fonte de alimentação de 24 volts através da PCB principal. As conexões FFC são configuradas para que tenham comprimento e flexibilidade suficientes para permitir que a PCB de leitura se mova com o cabeçote de leitura enquanto a PCB principal permanece estacionária.
[088]No exemplo da Figura 14, a PCB principal também é conectada a um computador pessoal de análise primária externo (PC) através dos conectores SS LF USB 3.0. Em algumas modalidades, o computador de análise primária pode estar localizado dentro da carcaça do aparelho de detecção. No entanto, deixar o computador de análise primária sem instrumentos permite um uso intercambiável de uma variedade de computadores a serem usados para diferentes aplicações, manutenção conveniente do computador de análise primária por substituição sem precisar interromper a atividade do aparelho de detecção e área ocupada pequena para o aparelho de detecção. Pode-se usar qualquer entre uma variedade de computadores incluindo, por exemplo, um computador desktop, um computador laptop, ou um servidor contendo um processador em comunicação operacional com memória acessível e instruções para implementação dos métodos implementados por computador descritos no presente documento. A PCB principal também é conectada a uma tela de cristal líquido (LCD) para comunicação com um usuário humano. Outras interfaces também podem ser usadas.
[089]Em algumas modalidades, uma interface de usuário pode incluir uma tela (por exemplo, um LCD) para exibir ou solicitar informações a partir de um usuário e um dispositivo de entrada de usuário (por exemplo, um teclado) para receber entradas de usuário. Em algumas modalidades, a tela e o dispositivo de entrada de usuário são o mesmo dispositivo. Por exemplo, a interface de usuário pode incluir uma tela sensível ao toque configurada para detectar a presença de um toque individual e também identificar um local do toque na tela. No entanto, outros dispositivos de entrada de usuário podem ser usados, tal como um mouse, touchpad, teclado, bloco teclado numérico, scanner de mão, sistema de reconhecimento de voz, sistema de reconhecimento de movimento, e similares.
[090]A PCB de leitura inclui oito transmissores DS90CR217 para transferir dados a partir de sensores individuais (isto é, detectores) à linha LVDS, regulador de comutação de 3,3 volts, um regulador de comutação de 5 volts, e drives buck de LED para as fontes de radiação de excitação de LED.
[091]A PCB principal inclui um FPGA + processador configurados para aceitar dados de imagem a partir do LVDS. Um buffer de quadro DDR3 DIMM é eletronicamente conectado ao FPGA + processador. A PCB principal também inclui um regulador de controle térmico e um conjunto de circuitos de controle para vários motores de acionamento, tais como um motor de eixo geométrico y, um motor de cartucho, um motor de válvula, e um motor de bomba.
[092]A presente revelação proporciona, ainda, um método para formação de imagens de um substrato, incluindo as etapas de (a) proporcionar um substrato incluindo recursos fluorescentes em uma superfície; (b) adquirir uma pluralidade de imagens de campo amplo de uma primeira porção da superfície usando uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros adquire uma imagem de campo amplo a partir de um local diferente da superfície, em que a pluralidade de microfluorômetros é fixada a um carro; e (c) transladar o carro em uma direção paralela à superfície e repetir (b) para uma segunda porção da superfície. O método pode usar qualquer aparelho apresentado em qualquer parte do presente documento, mas não precisa ser limitado em todas as modalidades.
[093]As modalidades dos presentes métodos são usadas particularmente para técnicas de sequenciamento de ácido nucléico. Por exemplo, protocolos de sequenciamento por síntese (SBS) são particularmente aplicáveis. Em SBS, a extensão de um iniciador de ácido nucléico ao longo de um modelo de ácido nucléico é monitorada para determinar a sequência de nucleotídeos no modelo. O processo químico básico pode ser a polimerização (por exemplo, conforme catalisado por uma enzima polimerase) ou ligação (por exemplo, catalisado por uma enzima ligase). Em uma modalidade SBS baseada em polimerase particular, os nucleotídeos fluorescentemente marcados são adicionados a um iniciador (estendendo, assim, o iniciador) em uma maneira dependente do modelo de modo que a detecção da ordem e do tipo de nucleotídeos adicionados ao iniciador possa ser usada para determinar a sequência do modelo. Pode-se submeter uma pluralidade de modelos diferentes a uma técnica SBS em uma superfície sob condições onde eventos que ocorrem para diferentes modelos podem ser distinguidos. Por exemplo, os modelos podem estar presentes sobre a superfície de um arranjo de modo que os diferentes modelos sejam espacialmente distinguíveis entre si. Tipicamente, os modelos ocorrem em recursos tendo múltiplas cópias do mesmo modelo (algumas vezes denominados como “agrupamentos” ou “colônias”). No entanto, também é possível realizar SBS em arranjos onde cada recurso tem uma única molécula modelo presente, de modo que as únicas moléculas modelo sejam solucionáveis entre si (algumas vezes denominadas como “únicos arranjos de molécula”).
[094]As células de fluxo proporcionam um substrato conveniente para alojar um arranjo de ácidos nucléicos. As células de fluxo são convenientes para técnicas de sequenciamento porque as técnicas tipicamente envolvem a distribuição repetida de reagentes em ciclos. Por exemplo, para iniciar um primeiro ciclo de SBS, um ou mais nucleotídeos marcados, DNA polimerase, etc., podem ser fluidos através de uma célula de fluxo que aloja um arranjo de modelos de ácido nucléico. Os recursos onde a extensão de iniciador que faz com que um nucleotídeo marcado seja incorporado podem ser detectados, por exemplo, usando métodos ou aparelhos apresentados no presente documento. Opcionalmente, os nucleotídeos podem incluir, ainda, uma propriedade de terminação reversível que termina a extensão de iniciador uma vez que um nucleotídeo tiver sido adicionado a um iniciador. Por exemplo, um análogo de nucleotídeo tendo uma porção terminadora reversível pode ser adicionado a um iniciador de modo que uma extensão subsequente não possa ocorrer até que um agente de desbloqueio seja distribuído para remover a porção. Logo, para modalidades que usam uma terminação reversível, um agente de desbloqueio pode ser distribuído à célula de fluxo (antes ou após a detecção ocorrer). Podem-se realizar lavagens entre as várias etapas de distribuição. O ciclo pode, então, ser repetido n vezes para estender o iniciador por n nucleotídeos, detectando, assim, uma sequência de comprimento n. Descrevem-se técnicas de sequenciamento exemplificadoras, por exemplo, em Bentley et al, Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, e US 2008/0108082, estando cada uma dessas aqui incorporada a título de referência.
[095]Para a etapa de distribuição de nucleotídeo de um ciclo de SBS, um único tipo de nucleotídeo pode ser distribuído de uma vez, ou múltiplos tipos de nucleotídeo diferentes (por exemplo, A, C, T e G juntos) podem ser distribuídos. Para uma configuração de distribuição de nucleotídeo onde somente um único tipo de nucleotídeo está presente de uma vez, os diferentes nucleotídeos não precisam ter marcadores distintos visto que podem ser distinguidos com base em separação temporal inerente na distribuição individualizada. De modo correspondente, um método ou aparelho de sequenciamento pode usar detecção de cor única. Por exemplo, o microfluorômetro ou o cabeçote de leitura precisam somente proporcionar excitação em um único comprimento de onda ou em uma única faixa de comprimentos de onda. Logo, um microfluorômetro ou cabeçote de leitura ter precisam somente uma única fonte de excitação e uma filtração em múltiplas bandas de excitação não é necessária. Para uma configuração de distribuição de nucleotídeo onde a distribuição resulta em múltiplos nucleotídeos diferentes estando presentes na célula de fluxo de uma vez, os recursos que incorporam diferentes tipos de nucleotídeo podem ser distinguidos com base em diferentes marcadores fluorescentes que são fixados aos respectivos tipos de nucleotídeo na mistura. Por exemplo, quatro nucleotídeos diferentes podem ser usados, cada um tendo um dos quatro fluoróforos diferentes. Em uma modalidade, os quatro fluoróforos diferentes podem ser distinguidos usando excitação em quatro regiões diferentes do espectro. Por exemplo, um microfluorômetro ou cabeçote de leitura pode incluir quatro fontes de radiação de excitação diferentes. Alternativamente, um cabeçote de leitura pode incluir menos de quatro fontes de radiação de excitação diferentes, mas pode utilizar a filtração óptica da radiação de excitação a partir de uma única fonte para produzir diferentes faixas de radiação de excitação na célula de fluxo.
[096]Em algumas modalidades, quatro nucleotídeos diferentes podem ser detectados em uma amostra (por exemplo, arranjo de recursos de ácido nucléico) utilizando menos de quatro cores diferentes. Como um primeiro exemplo, um par de tipos de nucleotídeo pode ser detectado no mesmo comprimento de onda, porém distinguidos com base em uma diferença em intensidade de um membro do par comparado com o outro, ou com base em uma alteração de um membro do par (por exemplo, através de modificação química, modificação fotoquímica ou modificação física) que faz com que um sinal evidente apareça ou desapareça comparado com o sinal detectado pelo outro membro do par. Como um segundo exemplo, três entre quatro tipos de nucleotídeo diferentes podem ser detectáveis sob condições particulares enquanto um quarto tipo de nucleotídeos é desprovido de um marcador que é detectável sob essas condições. Em uma modalidade de SBS do segundo exemplo, a incorporação dos três primeiros tipos de nucleotídeo em um ácido nucléico pode ser determinada com base na presença de seus respectivos sinais, e a incorporação do quarto tipo de nucleotídeo no ácido nucléico pode ser determinada com base na ausência de qualquer sinal. Como um terceiro exemplo, um tipo de nucleotídeo pode ser detectado em duas imagens diferentes ou em dois canais diferentes (por exemplo, uma mistura de duas espécies que possuem a mesma base, porém marcadores diferentes podem ser usados, ou uma única espécie que possui dois marcadores pode ser usada ou uma única espécie que possui um marcador que é detectado em ambos os canais pode ser usada), enquanto outros tipos de nucleotídeo são detectados em mais de uma das imagens ou canais. Nesse terceiro exemplo, a comparação das duas imagens ou dois canais serve para distinguir os diferentes tipos de nucleotídeo.
[097]As três configurações exemplificadoras no parágrafo acima não são mutuamente exclusivas e podem ser usadas em várias combinações. Uma modalidade exemplificadora é um método SBS que usa nucleotídeos reversivelmente bloqueados (rbNTPs) que possuem marcadores fluorescentes. Nesse formato, quatro tipos de nucleotídeo diferentes podem ser distribuídos a um arranjo de recursos de ácido nucléico e serão sequenciados e devido aos grupos de bloqueio reversível um e apenas um evento de incorporação irá ocorrer em cada recurso. Os nucleotídeos distribuídos ao arranjo nesse exemplo podem incluir um primeiro tipo de nucleotídeo que é detectado em um primeiro canal (por exemplo, rbATP que possui um marcador que é detectado no primeiro canal quando excitado por um primeiro comprimento de onda de excitação), um segundo tipo de nucleotídeo que é detectado em um segundo canal (por exemplo, rbCTP que possui um marcador que é detectado no segundo canal quando excitado por um segundo comprimento de onda de excitação), um terceiro tipo de nucleotídeo que é detectado no primeiro e no segundo canal (por exemplo, rbTTP que possui pelo menos um marcador que é detectado em ambos os canais quando excitado pelo primeiro e/ou segundo comprimento de onda de excitação) e um quarto tipo de nucleotídeo que é desprovido de um marcador que é detectado em cada canal (por exemplo, rbGTP que não possui marcador extrínseco).
[098]Uma vez que os quatro tipos de nucleotídeo foram contatados com o arranjo no exemplo acima, um procedimento de detecção pode ser realizado, por exemplo, para capturar duas imagens do arranjo. As imagens podem ser obtidas em canais separados e podem ser obtidas de maneira simultânea ou sequencial. Uma primeira imagem obtida utilizando o primeiro comprimento de onda de excitação e a emissão no primeiro canal irá mostrar recursos que incorporam o primeiro e/ou terceiro tipo de nucleotídeo (por exemplo, A e/ou T). Uma segunda imagem obtida utilizando o segundo comprimento de onda de excitação e emissão no segundo canal irá mostrar recursos que incorporam o segundo e/ou terceiro tipo de nucleotídeo (por exemplo, C e/ou T). A identificação não ambígua do tipo de nucleotídeo incorporado em cada recurso pode ser determinada ao comparar as duas imagens para chegar ao seguinte: recursos que aparecem no primeiro canal incorporam o primeiro tipo de nucleotídeo (por exemplo A), recursos que aparecem apenas no segundo canal incorporam o segundo tipo de nucleotídeo (por exemplo C), recursos que aparecem no canal incorporam o terceiro tipo de nucleotídeo (por exemplo T) e recursos que não aparecem em cada canal incorporam o quarto tipo de nucleotídeo (por exemplo G). Nota-se que a localização dos recursos que incorporam G nesse exemplo pode ser determinada a partir de outros ciclos (onde pelo menos um dos outros três tipos de nucleotídeo é incorporado). Um aparelho e métodos exemplificadores para distinguir quatro nucleotídeos diferentes utilizando a detecção de menos de quatro cores são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente US No. Ser. 61/538.294, que está aqui incorporado a título de referência.
[099]Em um método de sequenciamento, um microfluorômetro pode adquirir pelo menos duas imagens de campo amplo da mesma área de uma superfície durante cada ciclo, em que cada uma entre pelo menos duas imagens de campo amplo é adquirida utilizando comprimentos de onda de excitação ou emissão diferentes. Por exemplo, durante cada ciclo um microfluorômetro pode adquirir duas, três ou quatro imagens de campo amplo da mesma área de uma superfície durante cada ciclo, em que cada uma das duas imagens de campo amplo detecta fluorescência em diferentes regiões do espectro. De forma alternativa ou adicional, um microfluorômetro pode adquirir imagens de campo amplo que detectam fluorescência em não mais de duas, três ou quatro regiões diferentes do espectro para uma determinada área de uma superfície durante um determinado ciclo de sequenciamento. Por exemplo, um microfluorômetro pode excitar uma área de uma superfície de célula de fluxo com radiação em não mais de duas, três ou quatro regiões diferentes do espectro durante um determinado ciclo e/ou um microfluorômetro pode adquirir imagens de campo amplo de uma determinada área de uma superfície em não m ais de duas, três ou quatro regiões diferentes do espectro durante um determinado ciclo. Imagens de campo amplo diferentes podem ser obtidas em momentos diferentes (por exemplo, sequencialmente) ou em algumas modalidades duas ou mais imagens de campo amplo podem ser obtidas simultaneamente.
[0100]No contexto da presente revelação “diferentes imagens de campo amplo de uma área” se referem a duas ou mais imagens de campo amplo da mesma área que são adquiridas sob condições de excitação e/ou emissão diferentes. Alternativamente, duas ou mais imagens de campo amplo separadas da mesma área podem ser adquiridas sob as mesmas condições de excitação e emissão ou pelo menos similares. Por exemplo, múltiplos quadros podem ser obtidos de uma área de um determinado objeto sob uma determinada condição de detecção de fluorescência e os quadros podem ser coadicionados. A coadição pode proporcionar a vantagem de aumentar o sinal para ruído como comparado com a obtenção de um único quadro sob as mesmas condições. Um exemplo adicional é que a coadição pode ser realizada em conjunto com a excitação pulsada para reduzir danos por exposição solar à amostra como comparado com a excitação contínua da amostra durante um período de tempo prolongado (que pode ou não obter intensidade de sinal ou razão sinal para ruído similar).
[0101]Em algumas modalidades, os ácidos nucléicos podem ser fixados a uma superfície e amplificados antes ou durante o sequenciamento. Por exemplo, a amplificação pode ser realizada utilizando amplificação em ponte para formar agrupamentos de ácido nucléico sobre uma superfície. Métodos de amplificação em ponte úteis são descritos, por exemplo, em US 5.641.658; US 2002/0055100; US 7.115.400; US 2004/0096853; US 2004/0002090; US 2007/0128624; ou US 2008/0009420, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência. Outro método útil para amplificar ácidos nucléicos sobre uma superfície é amplificação por círculo rolante (RCA), por exemplo, como descrito em Lizardi et al, Nat. Genet. 19:225-232 (1998) e US 2007/0099208 Al, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência. PCR em emulsão em microesferas também pode ser usada, por exemplo, como descrito em Dressman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), WO 05/010145, US 2005/0130173 ou US 2005/0064460, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência.
[0102]Conforme apresentado acima, as modalidades de sequenciamento são um exemplo de um processo repetitivo. Os métodos da presente revelação são bem adequados para processos repetitivos. Algumas modalidades são apresentadas abaixo.
[0103]Essa revelação proporciona um método de formação de imagens de um substrato, que inclui as etapas de (a) fornecer um substrato que inclui recursos fluorescentes sobre uma superfície; (b) adquirir uma pluralidade de imagens de campo amplo de uma primeira porção da superfície utilizando uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros adquire uma imagem de campo amplo de um local diferente da superfície, em que a pluralidade de microfluorômetros é fixada a um carro; (c) mudar o carro em uma direção paralela à superfície e repetir (b) para uma segunda porção da superfície; e (d) retornar o carro para uma posição de modo a adquirir uma segunda pluralidade de imagens de campo amplo da primeira porção da superfície. Opcionalmente, o método pode incluir ainda uma etapa de modificar os recursos fluorescentes sobre a superfície após (c) e antes de (d), em que a segunda pluralidade de imagens de campo amplo é diferente da primeira pluralidade de imagens de campo amplo.
[0104]Em modalidades particulares, as etapas (a) a (c) do método acima correspondem à(s) etapa(s) de detecção de uma técnica de sequenciamento. Em uma modalidade relacionada, a etapa (d) por meio da qual o carro é retornado corresponde a um segundo ciclo de uma técnica de sequenciamento. Nesse exemplo, a modificação dos recursos fluorescentes sobre a superfície pode incluir uma ou mais etapas bioquímicas de uma técnica de sequenciamento. As técnicas de sequenciamento exemplificadoras que podem ser usadas no método são apresentadas acima ou de outro modo conhecidas.
[0105]Também proporciona-se um cartucho fluídico que inclui (a) uma célula de fluxo que possui uma superfície opticamente transparente, uma entrada e uma saída; e (b) uma carcaça feita de um material que é opticamente opaco e impermeável a líquidos aquosos, em que a carcaça contém: (i) um reservatório de amostra; (ii) uma linha fluídica entre o reservatório de amostra e a entrada da célula de fluxo; (iii) uma pluralidade de reservatórios de reagente em comunicação fluídica com a célula de fluxo através da entrada da célula de fluxo, (iv) pelo menos uma válvula configurada para mediar a comunicação fluídica entre os reservatórios e a entrada da célula de fluxo; e (v) pelo menos uma fonte de pressão configurada para mover os líquidos do reservatório de amostra ou os reservatórios de reagente à célula de fluxo através da entrada da célula de fluxo, em que uma janela opticamente transparente corta a carcaça e uma porta de entrada corta a carcaça, em que a porta de entrada está em comunicação fluídica com o reservatório de amostra, e em que a superfície opticamente transparente fica posicionada na janela.
[0106]A vista externa de um cartucho fluídico exemplificador 10 é mostrada na Figura 1 e é descrita acima. A Figura 15 mostra uma vista explodida de um cartucho fluídico 2000. A carcaça do cartucho fluídico é formada por um invólucro 2001 que é compatível com uma base 2002. O invólucro está no lado superior do cartucho fluídico como mostrado e inclui uma área de recepção 2009 de uma célula de fluxo 2020. A célula de fluxo é exposta à parte externa da carcaça através de uma janela 2010. Uma ou mais portas 2013 no invólucro permitem que amostra ou outros reagentes sejam distribuídos aos reservatórios na parte interna do cartucho fluídico 2000. A base 2002 inclui uma abertura 2012 que é configurada para aceitar uma bandeja de reagente 2003. A bandeja de reagente 2003 pode ser acoplada ao cartucho fluídico por inserção na abertura 2012 de maneira que os reservatórios de reagente individuais na bandeja estejam em comunicação fluídica com linhas fluídicas individuais para a distribuição de reagentes à célula de fluxo. A carcaça também contém válvulas 2005 e 2006 que fazem interface com bombas para mover os reagentes através das linhas fluídicas. Também contido dentro da carcaça está um saco de refugo 2004 que possui uma entrada 2011 que faz interface com as linhas fluídicas da célula de fluxo 2020.
[0107]A carcaça de um cartucho fluídico (por exemplo, o invólucro 2001 e/ou base 2002 de cartucho fluídico 2000) pode ser feita de um material que é opaco à radiação em uma parte particular do espectro. Por exemplo, a carcaça pode ser opaca à radiação UV, VIS e/ou IR para proteger os reagentes contra danos por exposição solar devido à radiação nesses comprimentos de onda. Por exemplo, um material que é opaco à radiação UV é benéfico para evitar danos por exposição solar a ácidos nucléicos entre outros reagentes usados em reações de sequenciamento. Como outro exemplo, pode ser desejado usar um material que é opaco à radiação na faixa de comprimento de onda absorvida por fluoróforos usados como marcadores em uma reação de sequenciamento.
[0108]A carcaça de um cartucho fluídico será tipicamente impermeável aos líquidos alojados nesse. Assim, a carcaça pode fornecer uma barreira secundária além dos reservatórios contidos nessa. Materiais exemplificadores incluem plástico como policarbonato ou poliestireno, ou metais como alumínio ou ácido inoxidável. Os materiais que são quimicamente inertes aos reagentes alojados no cartucho fluídico são geralmente desejados. Reservatórios individuais ou outros componentes fluídicos em um cartucho fluídico terão propriedades similares de impermeabilidade a fluido e também podem ser opcionalmente opacos. Os materiais podem ser rígidos ou flexíveis. Por exemplo, qualquer um entre uma variedade de reservatórios de reagente apresentados aqui ou de outro modo usados em um cartucho fluídico pode ser uma bolsa flexível como exemplificado para o reservatório de refugo 2004.
[0109]Como exemplificado pela Figura 1 e Figura 15, um cartucho fluídico pode ser configurado para conter uma variedade de componentes dentro de uma carcaça. Por exemplo, em várias modalidades um ou mais componentes fluídicos apresentados aqui podem ficar totalmente contidos dentro da carcaça. De fato, em modalidades particulares, todos os componentes fluídicos de uma modalidade particular podem ficar totalmente contidos no cartucho fluídico. Por exemplo, uma carcaça do cartucho pode conter um ou mais reservatórios de amostra, um ou mais reservatórios de reagente, um ou mais reservatórios de refugo, um ou mais reservatórios de mistura, uma ou mais válvulas configuradas para mediar a comunicação fluídica entre um reservatório e uma célula de fluxo, uma ou mais fontes de pressão configuradas para mover líquidos de um reservatório para uma célula de fluxo, ou uma ou mais linhas fluídicas entre um reservatório e uma célula de fluxo. Entretanto, compreender-se-á que em algumas modalidades pelo menos parte de alguns componentes fluídicos pode estar presente fora da carcaça. Por exemplo, uma superfície de uma célula de fluxo através da qual ocorrerá a detecção pode estar fora de uma carcaça do cartucho.
[0110]Em modalidades particulares, um cartucho fluídico pode incluir uma área de recepção que é dimensionada para reter firmemente uma célula de fluxo, por exemplo, por um ajuste de compressão. Entretanto, em outras modalidades, a área de recepção pode ser maior que a área ocupada de uma célula de fluxo que está ou estará presente no cartucho fluídico. Assim, a célula de fluxo pode ocupar um espaço de recepção na carcaça que é dimensionado e conformado para permitir que a célula de fluxo flutue em relação à carcaça. Uma configuração que acomoda a flutuação de uma célula de fluxo pode ser vantajosa para o alinhamento da célula de fluxo com o componente óptico de um aparelho de detecção após o cartucho fluídico ser colocado no instrumento. O alinhamento pode ser realizado através da inserção de um ou mais pinos de alinhamento na área de recepção pelo aparelho de detecção, por exemplo, em casos onde os pinos são pré-alinhados em um microfluorômetro de um cabeçote de leitura do aparelho de detecção. De modo correspondente, a área de recepção pode incluir um ajuste de pelo menos um pino de alinhamento ou outro membro de alinhamento. As configurações exemplificadoras para alinhar uma célula de fluxo flutuante que podem ser adaptadas a um cartucho fluídico da presente revelação são descritas em US Ser. No. 13/273,666 (publicado como US 2012/0270305 Al), que está aqui incorporado a título de referência. Em modalidades que utilizam a flutuação de célula de fluxo, a conexão fluídica da célula de fluxo a outros componentes fluídicos do cartucho será geralmente flexível. Por exemplo, a tubagem flexível pode conectar uma célula de fluxo a componentes fluídicos fixos de um cartucho.
[0111]Um cartucho fluídico da presente revelação não precisa incluir um dispositivo de detecção ou outros componentes de detecção descritos aqui. Por exemplo, um cartucho fluídico pode ser configurado para excluir um detector, microfluorômetro ou cabeçote de leitura como aqueles descritos aqui ou aqueles úteis em um método apresentado aqui. Em modalidades de sequenciamento de ácido nucléico, um detector, microfluorômetro ou cabeçote de leitura que é usado para detectar ácidos nucléicos em uma célula de fluxo (ou outro substrato) de um cartucho fluídico pode ficar localizado fora da carcaça do cartucho fluídico. Similarmente em outras modalidades, um detector, microfluorômetro ou cabeçote de leitura que é usado para detectar uma característica particular de um substrato pode ser excluído da parte interna de uma carcaça de um cartucho fluídico, que fica localizado fora da carcaça. Compreender-se-á que em pelo menos algumas configurações um tipo de detector pode ser excluído de um cartucho fluídico enquanto outro tipo de detector pode estar presente. Por exemplo, um cartucho fluídico pode excluir um dispositivo de detecção usado para detectar ácidos nucléicos em uma célula de fluxo, porém pode incluir um detector usado para avaliar uma característica de um fluido no cartucho ou avaliar um componente do cartucho. Mais especificamente, um cartucho pode incluir um detector de temperatura, pressão, taxa de fluxo ou outras características dos fluidos usados no cartucho. Outros exemplos de componentes que podem ser excluídos de um cartucho fluídico incluem, mas não se limitam a, filtros ópticos, lentes, objetivas, câmeras (por exemplo, câmeras CCD ou câmeras CMOS), fontes de radiação de excitação (por exemplo, LEDs) ou similares.
[0112]Um mapa fluídico de um cartucho fluídico exemplificador é mostrado na Figura 16. A célula de fluxo 2020 possui oito linhas fluidicamente conectadas a uma das oito linhas fluídicas individuais (coletivamente marcadas 2047) que são individualmente atuadas pela válvula de entrada 2044. A válvula de entrada 2044 controla o fluxo de fluido de quatro reservatórios de amostra 2030 através 2033. A válvula de entrada 2044 também controla o fluxo de fluido de vários reservatórios de reagente SBS 2035 e de vários reservatórios de reagente de amplificação 2036. A distribuição e fluxo de fluidos dos reservatórios de reagente SBS 2035 são controlados pela válvula de seleção de reagentes 2043. A distribuição e fluxo de fluidos dos reservatórios de reagente de amplificação 2036 são controlados pela válvula de seleção de reagentes 2042 que fica localizada a montante da válvula de seleção de reagentes 2043. De modo correspondente, a válvula de seleção de reagentes 2043 fica posicionada para controlar a distribuição e fluxo de reagentes tanto dos reservatórios de reagente SBS 2035 como dos reservatórios de reagente de amplificação 2036.
[0113]O fluxo de fluidos através do sistema da Figura 16 é conduzido por oito bombas de seringa separadas 2051 a 2058. As bombas de seringa são posicionadas para puxar fluidos através do sistema fluídico e cada bomba pode ser individualmente atuada pela válvula 2045. Logo, o fluxo através de cada canal da célula de fluxo pode ser individualmente controlado por uma fonte de pressão dedicada. A válvula 2045 também é configurada para controlar o fluxo de fluidos ao reservatório de refugo 2060.
[0114]A Figura 16 exemplifica um sistema fluídico no qual os fluidos são puxados pela ação de bombas de seringa a jusante. Compreender-se-á que um sistema fluídico útil pode usar outros tipos de dispositivos ao invés de bobas de seringa para conduzir fluidos incluindo, por exemplo, pressão positiva ou negativa, bomba peristáltica, bomba de diafragma, bomba de pistão, bomba de engrenagem ou parafuso de Arquimedes. Adicionalmente, esses e outros dispositivos podem ser configurados para puxar fluidos a partir de uma posição a jusante em relação a uma célula de fluxo ou empurrar fluidos a partir de uma posição a montante.
[0115]A Figura 16 também exemplifica o uso de oito bombas de seringa para oito canais de uma célula de fluxo. Logo, o sistema fluídico inclui uma série de bombas que seja equivalente ao número de canais em uso. Compreender-se-á que um sistema fluídico que seja útil em um cartucho fluídico da presente revelação pode ter menos bombas (ou outras fontes de pressão) do que o número de canais em uso. Por exemplo, vários canais podem ser fluidicamente conectados a uma bomba compartilhada e uma válvula pode ser usada para atuar a vazão de fluidos através de um canal individual.
[0116]Uma válvula giratória exemplificadora 400 é mostrada na Figura 17. A estrutura e função da válvula giratória 400 pode ser compreendida no contexto de um procedimento de sequenciamento conforme apresentado abaixo. Naturalmente, compreender-se-á que a válvula pode ser usada de formas similares para outras aplicações. Em um protocolo de sequenciamento onde quatro amostras diferentes devem ser fluidicamente processadas, a válvula giratóriaválvula giratória 400 pode funcionar como uma válvula giratória de injeção de quatro amostras usando uma inclinação de 45 graus e também pode funcionar como uma tubulação quatro a um para reagentes de sequenciamento. Na vista de topo da Figura 17, a válvula giratória 400a é posicionada para permitir o fluxo a partir do reservatório de reagente comum 401 a quatro linhas de uma célula de fluxo. De modo mais específico, nesta posição, os fluidos podem fluir a partir dos reagentes comuns 401 através da porta 402 à Linha 1 (através da porta 411), à Linha 2 (através da porta 412), à Linha 3 (através da porta 413), e à Linha 4 (através da porta 414). No entanto, nesta posição os fluidos não fluem a partir dos reservatórios de amostra S1, S2, S3 ou S4 porque as portas 421,422, 423 e 424 são fechadas ao fluxo a partir da porta 402. Uma volta de 45 graus colocada válvula giratória 400b na posição mostrada na vista inferior da Figura 17, permitindo, assim, que as amostras S1, S2, S3 e S4 sejam injetadas pelo fato de as portas 411, 412, 413 e 414 estarem abertas ao fluxo a partir das portas 421, 422, 423 e 424, respectivamente. No entanto, nesta posição, o fluxo a partir da porta 402 é fechado, evitando, assim, o fluxo de reagentes comuns às linhas da célula de fluxo.
[0117]Em modalidades particulares, um cartucho fluídico pode ser configurado para permitir a reutilização de um ou mais reagentes. Por exemplo, o cartucho fluídico pode ser configurado para distribuir um reagente a uma célula de fluxo, então, remover o reagente da célula de fluxo, e, em seguida, reintroduzir o reagente à célula de fluxo. Em uma configuração, conforme exemplificado na Figura 18, os fluídicos de cartucho podem ser configurados de modo que um reservatório de reagente esteja em comunicação fluídica com a porta de entrada de uma célula de fluxo e a porta de saída da célula de fluxo também se encontra em comunicação fluídica com o reservatório de reagente. Um ou mais dos reagentes podem ser reutilizados em uma rede de tubulação de laços de reagente similares conforme mostrado na Figura 18. Por exemplo, a válvula 522 controla o fluxo a partir do reservatório de lavagem 524, do reservatório de IMX 525, do reservatório de SMX 526, do reservatório de CLM 527 e do reservatório de clivagem 528 à célula de fluxo 520. A bomba 521 se encontra a jusante da célula de fluxo 520 e a montante da válvula 523. A válvula 523 controla o fluxo a partir da célula de fluxo 520 ao reservatório de refugo 535, ao reservatório de IMX 525, ao reservatório de SMX 526, ao reservatório de CLM 527 e ao reservatório de clivagem 528.
[0118]As linhas fluídicas que conectam os componentes anteriores da Figura 18 serão descritas no contexto de um ciclo de sequenciamento onde os reagentes são distribuídos a partir dos reservatórios à célula de fluxo e os reagentes usados são distribuídos a partir da célula de fluxo aos respectivos reservatórios. Em todas as etapas do ciclo exemplificado abaixo, os fluidos são movidos sob a força da pressão produzida pela bomba 521. Em uma primeira etapa do ciclo, a célula de fluxo é lavada abrindo-se uma válvula 522 à linha 501 e abrindo-se a válvula 523 à linha 505 de modo que o fluido flua a partir do reservatório de lavagem 524 ao reservatório de refugo 535 através de uma trajetória entre a válvula 522 e a válvula 523 que cruza através da célula de fluxo 520. Para todas as etapas descritas para a Figura 18, a trajetória entre a válvula 522 e a válvula 523 leva a partir da válvula 522 à linha 502, até a entrada 530 da célula de fluxo 520, através do canal 531 da célula de fluxo 520, através da saída 532 da célula de fluxo 520, através da linha 503, à bomba 521 e, então, através da linha 504 à válvula 523. Em uma segunda etapa do ciclo, IMX é introduzido à célula de fluxo abrindo-se a válvula 522 à linha 506 e abrindo-se a válvula 523 à linha 505 de modo que o fluido flua a partir do reservatório de IMX 525 ao o reservatório de refugo 535 através da trajetória entre a válvula 522 e a válvula 523 que cruza através da célula de fluxo 520. Em uma terceira etapa do ciclo, IMX usado é movido a partir da célula de fluxo 520 ao reservatório de IMX 525 abrindo-se a válvula 522 à linha 501 e abrindo-se a válvula 523 à linha 510 de modo que o fluido de lavagem desloque o IMX a partir da trajetória entre a válvula 522 e a válvula 523 que cruza através da célula de fluxo 520. Em uma quarta etapa do ciclo, SMX é introduzido à célula de fluxo abrindo-se a válvula 522 à linha 507 e abrindo-se a válvula 523 à linha 505 de modo que o fluido flua a partir do reservatório de SMX 526 ao reservatório de refugo 535 através da trajetória entre a válvula 522 e a válvula 523 que cruza através da célula de fluxo 520. Em uma quinta etapa do ciclo, SMX usado é movido a partir da célula de fluxo 520 ao reservatório de SMX 526 abrindo-se a válvula 522 à linha 501 e abrindo-se a válvula 523 à linha 511 de modo que o fluido de lavagem desloque o SMX a partir da trajetória entre a válvula 522 e a válvula 523 que cruza através da célula de fluxo 520. Pares similares de etapas podem ser repetidos para (1) introduzir o reagente CLM à célula de fluxo e retornar o reagente CLM usado ao reservatório de CLM, e (2) introduzir o reagente de clivagem à célula de fluxo e retornar o reagente de clivagem usado ao reservatório de clivagem.
[0119]Outro exemplo de uma configuração fluídica que proporciona reutilização de reagente é mostrado na Figura 19. Neste exemplo, os fluídicos para um cartucho são configurados de modo eu cada reservatório de reagente esteja em comunicação fluídica com uma única porta da célula de fluxo 620. O fluxo alternado permite que cada reagente flua a partir de um reservatório à célula de fluxo 620 e a partir da célula de fluxo 620 de volta ao reservatório, em que o ingresso de reagentes à célula de fluxo 620 e o egresso dos reagentes a partir da célula de fluxo 620 ocorrem através da mesma porta da célula de fluxo 620. A reutilização para quatro reagentes é exemplificada na Figura 19, no entanto, um sistema fluídico pode ser configurado para mais ou menos reagentes a serem reutilizados em um formato alternado similar. Conforme mostrado na Figura 19, a válvula 622 controla o fluxo de fluidos entre a célula de fluxo 620 e cada um entre: o reservatório de lavagem 624, o reservatório de IMX 625, o reservatório de SMX 626, o reservatório de CLM 627 e o reservatório de clivagem 628. Em uma primeira direção de fluxo, a bomba 621 é configurada para puxar fluidos a partir da célula de fluxo 620 através da linha 603 e empurrar fluidos ao reservatório de refugo 635 através da linha 605.
[0120]As linhas fluídicas que conectam os componentes anteriores da Figura 19 serão descritas no contexto de um ciclo de sequenciamento onde os reagentes são distribuídos a partir dos reservatórios até a célula de fluxo e os reagentes usados são distribuídos a partir da célula de fluxo aos respectivos reservatórios. Em uma primeira etapa do ciclo, a célula de fluxo é lavada abrindo-se a válvula 622 à linha 601 de modo que o fluido flua a partir do reservatório de lavagem 624 ao reservatório de refugo 635. A trajetória entre a válvula 622 e o reservatório de refugo 635 se estende a partir da válvula 622 à linha 602 até a porta 630 da célula de fluxo 620, através do canal 631 da célula de fluxo 620, através da porta 632 da célula de fluxo 620, através da linha 603 à bomba 621 e, então, através da linha 605 ao reservatório de refugo 635. Em uma segunda etapa do ciclo, IMX é introduzido à célula de fluxo abrindo-se a válvula 622 à linha 606 de modo que o fluido flua a partir do reservatório de IMX 625 através da válvula 622 à linha 602, até a porta 630 da célula de fluxo 620, através do canal 631 da célula de fluxo 620, através da porta 632 da célula de fluxo 620, e parcialmente através da linha 603 (deixando, assim, uma solução de lavagem residual em uma porção a jusante da linha 603 através da bomba 621). Em uma terceira etapa do ciclo, o reagente de IMX usado é retornado a partir da célula de fluxo 620 ao reservatório de IMX 625 abrindo-se a válvula 622 à linha 606 e invertendo-se a direção da bomba 621 de modo que o reagente IMX usado seja retornado a partir da célula de fluxo 620 ao reservatório de IMX 625 através da porta 630 da célula de fluxo 620, até a linha fluídica 602, através da válvula 622, então, através da linha fluídica 606 ao reservatório de IMX 625. Durante a etapa três, o fluxo a partir da bomba 621 até o reservatório de IMX 625 ocorre por tempo suficiente para que uma porção do reagente IMX retorne ao reservatório de IMX 625, mas não longo o suficiente para fazer com que uma quantidade substancial da solução de lavagem residual a partir da linha 603 entre no reservatório de IMX 625. Em uma quarta etapa do ciclo, a célula de fluxo é lavada conforme descrito para a primeira etapa. Em uma quinta etapa do ciclo, SMX é introduzido à célula de fluxo abrindo-se a válvula 622 à linha 607 de modo que o fluido flua a partir do reservatório de SMX 626 através da válvula 622 à linha 602, até a porta 630 da célula de fluxo 620, através do canal 631 da célula de fluxo 620, através da porta 632 da célula de fluxo 620, e parcialmente através da linha 603 (deixando, assim, uma solução de lavagem residual em uma porção a jusante da linha 603 através da bomba 621). Em uma sexta etapa do ciclo, o reagente SMX usado é retornado a partir da célula de fluxo 620 ao reservatório de SMX 626 abrindo-se a válvula 622 à linha 607 e invertendo-se a direção da bomba 621 de modo que o reagente SMX usado seja retornado a partir da célula de fluxo 620 ao reservatório de SMX 626 através da porta 630 da célula de fluxo 620, até a linha fluídica 602, através da válvula 622, então, através da linha fluídica 607 ao reservatório de SMX 626. Conforme na etapa três, o fluxo a partir da bomba 621 durante a etapa seis faz com que uma porção do reagente SMX retorne ao reservatório de SMX 626, mas pouca ou nenhuma solução de lavagem residual a partir da linha 603 entre no reservatório de SMX 626. Podem-se repetir os tripletos similares das etapas para (1) introduzir um reagente de CLM à célula de fluxo 620, retornar o reagente de CLM usado ao reservatório de CLM 627 e lavar a célula de fluxo 620, e (2) introduzir o reagente de clivagem à célula de fluxo 620, retornar o reagente de clivagem usado ao reservatório de clivagem 628 e lavar a célula de fluxo 620.
[0121]Os exemplos da Figura 18 e da Figura 19 mostram um único reservatório para cada reagente. De modo correspondente, a mistura dos reagentes usados com reagentes não-usados do mesmo tipo pode ocorrer ao longo do processo fluídico. Nesta modalidade, a fração de reagente reutilizado no reservatório aumentará com cada ciclo fluídico. De modo correspondente, um volume suficientemente grande de reagente inicial pode ser proporcionado para acomodar qualquer diluição ou contaminação que possa ocorrer enquanto se mantém um nível desejado de qualidade de reação geral.
[0122]Como uma alternativa ao uso de um único reservatório para cada reagente, o sistema fluídico pode incluir vários reservatórios para cada tipo de reagente. Cada um dos reservatórios pode ser configurado para reutilização. No entanto, cada reservatório pode ser submetido a uma série de eventos de mistura que seja menor que o número de ciclos para a célula de fluxo. De modo correspondente, um número apropriado de reservatórios para cada tipo de reagente pode ser proporcionado para acomodar tanto um número desejado de ciclos para uma célula de fluxo como o número limitado de ciclos de reutilização aceitável para cada reagente. Por exemplo, dez reservatórios podem ser proporcionados para um reagente particular a fim de acomodar um processo fluídico tendo cem ciclos e um reagente que deve ser usado somente dez vezes (isto é, reutilizado 9 vezes). Neste exemplo, uma vez que um dos dez reservatórios tiver sido retirado das dez vezes, o sistema pode comutar para um segundo dos dez reservatórios. Múltiplos reservatórios de reagente podem ser configurados para reutilização no sistema exemplificador mostrado na Figura 18, por exemplo, fazendo-se interface dos reservatórios com a válvula 522 e a válvula 523 ou fazendo-se interface de cada subconjunto dos reservatórios com uma válvula dedicada a montante da válvula 522 e a jusante da válvula 523. Adotando-se o exemplo da Figura 19, múltiplos reagentes podem ser configurados para reutilização fazendo-se interface dos reservatórios adicionais com a válvula 622 ou fazendo-se interface do subconjunto de reservatórios com uma válvula dedicada a montante da válvula 622 (na direção de entrada da célula de fluxo que se encontra a jusante da válvula 622 na direção de saída de célula de fluxo).
[0123]Outra configuração útil para reutilização de um dado reagente consiste em utilizar um reservatório suplementar que seja separado de um reservatório de reagente. Adotando-se como um exemplo a configuração da Figura 18, as linhas 510, 511, 512 e 513 podem fluir aos respectivos reservatórios suplementados de modo que os reagentes não sejam direcionados de volta aos reservatórios de reagente 525, 526, 527 e 528 após serem colocados em contato com a célula de fluxo. O reagente usado pode, então, ser distribuído a partir dos respectivos reservatórios suplementares à célula de fluxo através de diferentes portas na válvula 522 ou através de uma válvula separada. Voltando-se ao exemplo do sistema fluídico da Figura 19, podem-se adicionar reservatórios suplementares ao sistema e portas podem ser adicionadas à válvula 622 para direcionar os reagentes usados aos reservatórios suplementares. De modo correspondente, a atuação da válvula 622 pode ser usada para direcionar os reagentes usados aos reservatórios suplementares ao invés de aos reservatórios de reagente 625, 626, 627 e 628 após os reagentes terem sido colocados em contato com a célula de fluxo. Para modalidades que incluem um reservatório suplementar incluindo, mas sem limitar-se àqueles exemplificados nas Figuras 18 e 19, os reagentes usados (de um tipo particular) de vários ciclos podem ser misturados nesses reservatórios suplementares antes da reutilização. Alternativamente, os reagentes usados podem ser reutilizados sequencialmente sem mistura nos reservatórios suplementares. Sejam os reagentes usados misturados ou não, uma vez eu os reagentes tiverem sido reutilizados um número predeterminado de vezes ou, de outro modo, um número desejável de vezes, os reagentes usados podem ser enviados a um reservatório de refugo e o reservatório suplementar novamente usado para ciclos subsequentes com alíquota(s) subsequente(s) de reagente usado.
[0124]As configurações mostradas nas Figuras 18 e 19 são exemplificadoras. Outras configurações também são possíveis para alcançar uma reutilização de um ou mais dos reagentes usados em um processo particular. Compreender-se-á que em algumas configurações de reutilização de reagente, as configurações fluídicas para reutilização de reagentes serão usadas somente para um subconjunto de reagentes usados em um processo particular. Por exemplo, um primeiro subconjunto dos reagentes pode ser robusto o suficiente para que seja reutilizado, enquanto um segundo subconjunto pode ser propenso à contaminação, degradação ou outros efeitos indesejados após um único uso. De modo correspondente, o sistema fluídico pode ser configurado para reutilização do primeiro subconjunto de reagentes, enquanto os fluídicos para o segundo conjunto de reagentes serão configurados para uso único.
[0125]Um reagente particular pode ser reutilizado qualquer número de vezes desejadas para adequar um processo particular. Por exemplo, um ou mais dos reagentes aqui exemplificados, descritos em uma referência citada, ou, de outro modo, conhecidos pelo uso em um processo aqui apresentado podem ser reutilizados pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50 ou mais vezes. De fato, qualquer um entre uma variedade de reagentes desejados pode ser reutilizado por ao menos tantas vezes.
[0126]As configurações fluídicas e métodos para reutilização de reagente, embora exemplificadas para um processo de sequenciamento de ácido nucléico, podem ser aplicadas a outros processos, em particular, processos que envolvam ciclos repetidos de distribuição de reagente. Processos exemplificadores incluem o sequenciamento de polímeros, tais como polipeptídeos, polissacarídeos ou polímeros sintéticos e também incluem a síntese desses polímeros.
[0127]As Figuras 18 e 19 e outros exemplos aqui proporcionados em relação aos métodos e aparelhos para reutilização de reagente foram descritos no contexto de um único canal para uma célula de fluxo. Compreender-se-á que métodos e aparelhos similares podem ser aplicados a uma célula de fluxo tendo múltiplos canais. De modo correspondente um cartucho fluídico da presente revelação pode incluir uma célula de fluxo tendo múltiplos canais e pode incluir, ainda, um sistema fluídico configurado para proporcionar a reutilização de reagente para todos ou para um subconjunto de canais. Por exemplo, os canais individuais podem ser conectados a um sistema fluídico configurado conforme mostrado na Figura 18 ou na Figura 19 ou conforme descrito em qualquer parte do presente documento.
[0128]Um cartucho fluídico da presente revelação pode incluir uma conexão de entrada e saída (I/O) para permitir a comunicação entre o cartucho fluídico e um aparelho de detecção que recebe o cartucho fluídico. A conexão I/O pode ser usada para coordenar as operações fluídicas que ocorrem no cartucho fluídico com as operações de detecção que ocorrem no aparelho de detecção. Por exemplo, em um procedimento de sequenciamento de ácido nucléico, a distribuição fluídica de reagentes de sequenciamento a uma célula de fluxo pode ser coordenada com a detecção da célula de fluxo pelo aparelho de detecção em um ou mais ciclos do procedimento de sequenciamento. Na modalidade da Figura 14, o conector I/O pode permitir a comunicação entre o cartucho fluídico e o PCB principal.
[0129]Conforme ficará evidente a partir das modalidades exemplificadoras de sequenciamento de ácido nucléico aqui apresentadas, os reservatórios em um cartucho fluídico da presente revelação podem conter reagentes úteis para um procedimento de sequenciamento de ácido nucléico. Por exemplo, os reagentes úteis para uma técnica de sequenciamento por síntese podem estar presentes incluindo, por exemplo, uma polimerase, um nucleotídeo fluorescentemente marcado, ou uma solução de lavagem. Vários nucleotídeos fluorescentemente marcados diferentes podem estar presentes, seja como uma mistura em um único reservatório ou cada um sozinho em um reservatório separado. Os nucleotídeos marcados podem ter porções de terminação reversíveis para uso em um sequenciamento terminador reversível, sendo que neste caso um reservatório contendo um agente de desbloqueio também pode estar presente. Outros reagentes de sequenciamento de ácido nucléico que podem ser incluídos em um cartucho fluídico incluem aqueles apresentados previamente que incluem, mas não se limitam àqueles descritos em Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, ou US 2008/0108082, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência. Em particular, os reagentes de sequenciamento de ácido nucléico disponíveis junto a Illumina, tais como aqueles proporcionados em kits SBS TruSeq® podem ser incluídos em um cartucho fluídico.
[0130]Os reservatórios de um cartucho fluídico também podem incluir uma amostra de ácido nucléico que deva ser sequenciada. Várias amostras podem estar presentes em seu próprio reservatório. Em algumas modalidades, várias amostras podem ser misturadas em um único reservatório, por exemplo, em casos onde as amostras foram previamente marcadas com sequências de tag de ácido nucléico conhecidas e, então, misturadas.
[0131]Um cartucho fluídico também pode incluir reservatórios que contenham reagentes usados para amplificação de ácidos nucléicos. Por exemplo, os reagentes usados para uma amplificação em ponte (também denominada como amplificação de agrupamento) podem ser incluídos, tais como aqueles descritos em US 5.641.658; US 2002/0055100; US 7.115.400; US 2004/0096853; US 2004/0002090; US 2007/0128624; ou US 2008/0009420, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência. Em particular, os reagentes de amplificação em ponte disponíveis junto a Illumina, tais como aqueles proporcionados em kits de amplificação de RNA ou DNA TruSeq® podem ser incluídos em um cartucho fluídico. Os reagentes úteis para amplificação por círculo rolante (RCA) também podem estar presentes em um cartucho fluídico incluindo, por exemplo, aqueles descritos em Lizardi et al, Nat. Genet. 19:225-232 (1998) ou US 2007/0099208 Al, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência. Reagentes PCR de emulsão também podem ser usados, por exemplo, aqueles descritos em Dressman et al, Proc. Natl. Acad. Set USA 100:8817-8822 (2003), WO 05/010145, ou US 2005/0130173 ou US 2005/0064460, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência.
[0132]Um cartucho fluídico da presente revelação pode incluir duas ou mais partes de subcomponente que contém diferentes reagentes. As partes de subcomponente podem ser configuradas para uma combinação conveniente em um cartucho fluídico, por exemplo, manualmente e sem o uso de ferramentas. Por exemplo, as partes de subcomponente podem ser combinadas em um cartucho fluídico usando encaixe por pressão, juntando-se encaixes macho e fêmea complementares, inserção em portas de recepção apropriadamente dimensionadas, fixação ou similares. Caso seja desejado, podem-se usar conexões que exijam o uso de ferramentas, por exemplo, o uso de uma chave de fenda para conectar-se aos parafusos, ou uso de uma chave para girar uma cavilha e/ou uma porca.
[0133]As partes de subcomponente que constituem um cartucho fluídico podem conter reagentes que foram previamente transportados e/ou armazenados sob condições diferentes. Por exemplo, um primeiro subcomponente pode incluir reagentes que sejam armazenados em temperaturas congelantes (por exemplo, abaixo de 0°C, -20°C ou -70°C) enquanto um segundo subcomponente pode incluir reagentes que sejam armazenados em uma temperatura maior (por exemplo, temperatura ambiente ou acima de 20°C, 0°C, -20°C ou -70°C). De modo correspondente, pelo menos alguns dos reagentes nos reservatórios de um subcomponente podem estar em fase sólida congelada, enquanto todos os reagentes nos reservatórios de outro subcomponente se encontram em forma líquida. Duas ou mais partes de subcomponente que foram armazenadas em temperaturas diferentes podem ser combinadas em um cartucho fluídico antes ou após as temperaturas se equilibrarem com a temperatura ambiente (ou outra temperatura comum).
[0134]Os reagentes úteis para processos fluídicos além de processos de sequenciamento de ácido nucléico podem ser proporcionados nos reservatórios de um cartucho fluídico. Por exemplo, um cartucho fluídico pode conter reagentes úteis para sequenciamento de outros polímeros, tais como polipeptídeos, polissacarídeos ou polímeros sintéticos. Alternativa ou adicionalmente, reagentes úteis para a síntese desses polímeros também podem estar presentes.
[0135]No entanto, voltando-se às modalidades referentes ao sequenciamento de ácido nucléico, a presente revelação proporciona, ainda, um método de sequenciamento que inclui as etapas de (a) proporcionar um cartucho fluídico tendo (i) uma célula de fluxo tendo uma superfície opticamente transparente, (ii) uma amostra de ácido nucléico, (iii) uma pluralidade de reagentes para uma reação de sequenciamento, e (iv) um sistema fluídico para distribuir os reagentes à célula de fluxo; (b) proporcionar um aparelho de detecção tendo (i) uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros compreende uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo em um plano de imagem em dimensões x e y, e (ii) um estágio amostral; (c) distribuir o cartucho fluídico ao estágio amostral, em que a superfície opticamente transparente é colocada no plano de imagem; e (d) realizar operações fluídicas de um procedimento de sequenciamento de ácido nucléico no cartucho fluídico e operações de detecção do procedimento de sequenciamento de ácido nucléico no aparelho de detecção, em que (i) os reagentes são distribuídos à célula de fluxo pelo sistema fluídico, e (ii) os recursos de ácido nucléico são detectados pela pluralidade de microfluorômetros.
[0136]Pode-se usar qualquer entre uma variedade de aparelhos de detecção e/ou cartuchos fluídicos descritos no método anterior. Uma vantagem particular do aparelho aqui apresentado é a modularidade que permite um sequenciamento conveniente de diferentes amostras usando um único aparelho de detecção. Conforme apresentado previamente, a(s) amostra(s), reagentes e hardware fluídico suficientes para um procedimento de sequenciamento completo podem estar contidos em um cartucho fluídico que pode ser distribuído a um aparelho de detecção para um procedimento de sequenciamento. Uma vez que o procedimento de sequenciamento estiver completo, o cartucho fluídico pode ser removido de modo que o aparelho de detecção fique pronto para outro ciclo de sequenciamento. Separando-se o aparelho de detecção e o sistema fluídico em módulos separados, o presente sistema permite que várias amostras diferentes sejam sequenciadas evitando o risco de contaminação cruzada entre as amostras que ocorrem em sistemas existentes onde o aparelho de detecção e o sistema fluídico são permanentemente integrados. Adicionalmente, para modalidades onde os componentes de detecção são relativamente dispendiosos e tecnicamente difíceis de montar, a modularidade aqui apresentada proporciona economias de custos permitindo-se que o aparelho de detecção seja mantido para uso repetido enquanto os componentes fluídicos com preços tipicamente menores e de fácil montagem são substituídos ou descartados por uma ação que pode ser tão simples quanto pressionar um botão de ejeção.
[0137]De modo correspondente, um método de sequenciamento pode incluir as etapas de (a) proporcionar um cartucho fluídico tendo (i) uma célula de fluxo tendo uma superfície opticamente transparente, (ii) uma amostra de ácido nucléico, (iii) uma pluralidade de reagentes para uma reação de sequenciamento, e (iv) um sistema fluídico para distribuir os reagentes à célula de fluxo; (b) proporcionar um aparelho de detecção tendo (i) uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros compreende uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo em um plano de imagem em dimensões x e y, e (ii) um estágio amostral; (c) distribuir o cartucho fluídico ao estágio amostral, em que a superfície opticamente transparente é colocada no plano de imagem; (d) realizar as operações fluídicas de um procedimento de sequenciamento de ácido nucléico no cartucho fluídico e operações de detecção do procedimento de sequenciamento de ácido nucléico no aparelho de detecção, em que (i) os reagentes são distribuídos à célula de fluxo pelo sistema fluídico, e (ii) os recursos de ácido nucléico são detectados pela pluralidade de microfluorômetros; (e) remover o cartucho fluídico a partir do estágio amostral; (f) distribuir um segundo cartucho fluídico ao estágio amostral; e (g) realizar operações fluídicas de um procedimento de sequenciamento de ácido nucléico no segundo cartucho fluídico e operações de detecção do procedimento de sequenciamento de ácido nucléico no aparelho de detecção.
[0138]Em geral, um segundo cartucho fluídico incluirá uma segunda amostra de ácido nucléico que seja diferente da amostra de ácido nucléico no primeiro cartucho fluídico. No entanto, caso seja desejado, dois cartuchos fluídicos podem incluir amostras duplicadas, por exemplo, para proporcionar análise estatística ou outras comparações técnicas. Um sistema ou método de sequenciamento da presente revelação podem ser repetidamente usados para uma série de cartuchos fluídicos. Por exemplo, contempla-se que pelo menos 2, 5, 10, 50, 100, ou 1000 ou mais cartucho fluídicos podem ser usados.
[0139]Em modalidades particulares, uma célula de fluxo que contém uma pluralidade de canais pode ser fluidicamente manipulada e opticamente detectada em uma maneira escalonada. De modo mais específico, as manipulações fluídicas podem ser realizadas em um primeiro subconjunto de canais na célula de fluxo enquanto a detecção óptica ocorre para um segundo subconjunto de canais. Por exemplo, em uma configuração, pelo menos quatro canais lineares podem ser dispostos paralelos entre si na célula de fluxo (por exemplo, canais 1 a 4 podem ser ordenados em fileiras sequenciais). As manipulações fluídicas podem ser realizadas em canais alternados (por exemplo, canais 1 e 3) enquanto a detecção ocorre para os outros canais (por exemplo, canais 2 e 4). Essa configuração particular pode ser acomodada utilizando-se um cabeçote de leitura que fixa vários microfluorômetros em uma configuração espaçada de modo que as objetivas sejam direcionadas a canais alternados da célula de fluxo. Neste caso, o cabeçote de leitura pode ter uma série de microfluorômetros que seja metade do número de canais na célula de fluxo. Adicionalmente, válvulas podem ser atuadas para direcionar o fluxo de reagentes para um ciclo de sequenciamento a canais alternados enquanto os canais que estiverem sendo detectados são mantidos em um estado de detecção. Neste exemplo, um primeiro conjunto de canais alternados pode ser submetido a etapas fluídicas de um primeiro ciclo de sequenciamento e um segundo conjunto de canais alternados pode ser submetido a etapas de detecção de um segundo ciclo de sequenciamento. Uma vez que as etapas fluídicas do primeiro ciclo estiverem completas e as etapas de detecção do segundo ciclo estiverem completas, o cabeçote de leitura pode ser saltado (por exemplo, ao longo da dimensão x) ao primeiro conjunto de canais alternados e válvulas podem ser atuadas para distribuir reagentes de sequenciamento ao segundo conjunto de canais. Então, as etapas de detecção para o primeiro ciclo podem ser completas (no primeiro conjunto de canais) e as etapas fluídicas para um terceiro ciclo podem ocorrer (no segundo conjunto de canais). As etapas podem ser repetidas desta forma várias vezes até que um número desejado de ciclos tenha sido realizado ou até que o procedimento de sequenciamento esteja completo.
[0140]Uma vantagem das etapas fluídicas escalonadas e de detecção apresentadas acima consiste em proporcionar um ciclo de sequenciamento geral mais rápido. No exemplo anterior, um ciclo de sequenciamento mais rápido resultará a partir da configuração escalonada (comparada à manipulação fluídica de todos os canais em paralelo seguida pela detecção de todos os canais em paralelo) se o tempo requerido para manipulação fluídica for aproximadamente igual ao tempo necessário para detecção. Naturalmente, em modalidades onde a temporização para etapa de detecção não é igual à temporização para etapas fluídicas, a configuração escalonada pode ser alterada a canais alternados para um padrão mais apropriado de modo a acomodar a varredura paralela de um subconjunto de canais enquanto outro subconjunto de canais é submetido às etapas fluídicas.
[0141]De acordo com várias modalidades apresentadas acima, proporciona- se um aparelho de detecção tendo um fator de forma relativamente compacto. Em algumas modalidades, um aparelho de detecção pode ter uma área ocupada de cerca de 0,09 m2 (1 pé ao quadrado) e pode ocupar um volume de cerca de 0,03 m3 (1 pé cúbico). Áreas e/ou volumes menores são possíveis. Áreas ocupadas e/ou volumes ligeiramente maiores também são uteis. Conforme exemplificado no presente documento, um aparelho pode ter uma área ocupada relativamente pequena e ocupar um volume de espaço relativamente pequeno quando estiver em um estado completamente funcional, por exemplo, após aceitar um cartucho fluídico internamente. Exemplificaram-se vários aparelhos no contexto de seu uso como unidades autônomas capazes de realizar qualquer entre uma variedade de procedimentos desejados. No entanto, não se pretende que esses exemplos sejam limitantes e, de fato, o fator de forma compacta das modalidades apresentadas acima permite que vários aparelhos sejam dispostos em um pequeno espaço. Por exemplo, vários aparelhos podem ser empilhados e/ou colocados em um gabinete ou bastidor para colocação conveniente. O gabinete ou bastidor pode incluir uma ou mais prateleiras que definem um ou mais espaços de recepção, e cada espaço de recepção pode ser configurado para acomodar um ou mais aparelhos de detecção.
[0142]De modo correspondente, vários aparelhos de detecção da presente revelação podem ser usados juntos em um sistema maior, desse modo, cada aparelho de detecção funciona efetivamente como um módulo ou nó do sistema. Por exemplo, vários aparelhos de detecção podem ser fisicamente colocalizados em um bastidor e podem ser eletronicamente ligados em rede. A rede eletrônica, seja para os aparelhos que são colocalizados ou para aparelhos que estejam localizados em locais distribuídos, pode permitir uma análise de dados global e/ou controle global de função de instrumentos. Para modalidades de sequenciamento de ácido nucléico, vários aparelhos de detecção diferentes podem funcionar como um sistema de sequenciamento, por exemplo, para sequenciar a mesma amostra (ou subfrações da mesma amostra) em paralelo. Um sistema de sequenciamento de ácido nucléico pode incluir um computador de controle que proporcionar instruções a cada aparelho de detecção individual. Como tal, qualquer um dos aparelhos de detecção no sistema de sequenciamento de ácido nucléico pode adotar instruções a partir de um computador de controle que seja fisicamente externo àquele aparelho de detecção. Os dados de sequência de ácido nucléico a partir dos vários aparelhos de detecção podem ser analisados no computador de controle e/ou em um computador de análise separado. Logo, um computador central pode ser usado para análise global de dados de sequência de ácido nucléico a partir dos vários aparelhos de detecção diferentes em um sistema em rede.
[0143]Podem-se utilizar mecanismos de retroinformações no controle de vários aparelhos de detecção que formam módulos em um sistema maior. Por exemplo, podem-se usar laços de retroinformações de controle de qualidade para observar os parâmetros que sejam determinativos ou diagnósticos de qualidade de dados de sequência de ácido nucléico e ações responsivas apropriadas podem ser adotadas. Laços de retroinformações exemplificadores que podem ser prontamente adaptados para uso em um sistema de sequenciamento modular da presente revelação são descritos, por exemplo, em US 7.835.871, que se encontra aqui incorporado a título de referência. Um computador de controle pode ser programado para incluir laços de retroinformações com base em parâmetros e respostas para controlar a qualidade de saída (por exemplo, qualidade de dados de sequência) para uma rede de aparelho de detecção.
[0144]Os dados de sequência de ácido nucléico que são obtidos a partir de um ou mais aparelhos de detecção que funcionam como módulos ou nós em um sistema podem ser analisados em tempo real. Os dados de sequência podem ser avaliados em relação a um parâmetro, por exemplo, comparando-se a sequência de ácido nucléico adquirida em tempo real a uma sequência padrão. Com base nesses resultados da comparação, pode-se tomar uma decisão quanto a se procede ou não com um procedimento de sequenciamento em um ou mais dos aparelhos de detecção. Por exemplo, amostras ambientais ou amostras patológicas podem ser sequenciadas usando vários módulos em um sistema de sequenciamento e a saída de dados a partir dos módulos pode ser comparada a sequências conhecidas para contaminantes ou patógenos suspeitos. Uma vez que dados suficientes tiverem sido coletados para determinar a presença ou a ausência de um contaminante ou patógeno particular, o sequenciamento pode ser interrompido em um ou mais dos módulos. Protocolos exemplificadores para análises em tempo real que podem ser adaptados a um sistema em rede da presente revelação são descritos em US 2011/0246084 A1, que se encontra aqui incorporado a título de referência. Os procedimentos de análise e decisão de dados exemplificados anteriormente podem ser feitos de modo completamente automático sem intervenção humana. Por exemplo, os procedimentos podem ser realizados em um computador de controle ou outro computador que seja parte de um sistema em rede apresentado no presente documento.
[0145]Alternativa ou adicionalmente a ser eletronicamente ligados em rede, vários aparelhos de detecção que são fisicamente colocalizados em um bastidor podem ser ligados em rede considerando-se a distribuição de amostras e/ou reagentes. Por exemplo, os cartuchos podem ser distribuídos aos aparelhos de detecção apropriados usando um auto-carregador ou dispositivo robótico. De modo específico, os cartuchos fluídicos podem ser automaticamente removidos de um local de armazenamento a dispositivos de detecção apropriados. A distribuição automática pode estar sob instruções de um computador de controle ou de outro computador que esteja ligado em rede ao sistema de sequenciamento. Adicionalmente, em algumas modalidades, nem todos os reagentes usados em um processo de sequenciamento de ácido nucléico precisam estar contidos nos cartuchos fluídicos que são usados em um sistema de sequenciamento. De preferência, vários aparelhos de detecção podem estar em comunicação fluídica com um ou mais reservatórios contendo reagentes volumosos. Neste caso, os reagentes podem ser distribuídos a vários aparelhos de detecção a partir de um local de armazenamento fluídico central, por exemplo, usando um sistema de distribuição de fluidos central. A distribuição de reagentes pode ocorrer sob as instruções de um computador de controle ou de outro computador que esteja ligado em rede a um sistema de distribuição central ou que esteja ligado em rede a um aparelho de detecção individual no sistema de sequenciamento.
[0146]Várias modalidades da presente invenção foram apresentadas no presente documento no contexto de sequenciamento de ácido nucléico ou usando aplicações de sequenciamento de ácido nucléico como um exemplo. No entanto, os aparelhos e métodos aqui apresentados não se limitam a aplicações de sequenciamento de ácido nucléico. Outras aplicações são uteis incluindo, mas sem limitar-se a, outros tipos de análises de ácido nucléico, tais como aquelas que utilizam marcadores opticamente detectados. Dois exemplos são análises de expressão realizadas em arranjos de ácido nucléico e análises de genotipagem realizadas em arranjos de ácido nucléico. Em qualquer caso, um microfluorômetro, um cabeçote de leitura ou um aparelho de detecção aqui apresentados podem ser usados para detecção dos arranjos. Adicionalmente, os arranjos podem ser incluídos em um cartucho fluídico e fluidicamente manipulados por uma modificação apropriada do cartucho fluídico e métodos apresentados no presente documento. Métodos à base de arranjo exemplificadores que podem ser modificados para uso com os aparelhos e métodos da presente revelação incluem, por exemplo, aqueles descritos em US 2003/0108900, US 2003/0215821 ou US 2005/0181394, estando cada um desses aqui incorporado a título de referência.
[0147]Outros ensaios de fase sólida que são realizados em arranjos ou em substratos de múltiplos poços, tais como ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISAs), também podem ser usados nos métodos e aparelhos aqui apresentados. Os formatos que usam marcadores fluorescentes são particularmente uteis visto que os marcadores podem ser detectados usando microfluorômetros, cabeçote de leituras ou aparelhos de detecção apresentados acima. Adicionalmente, reagentes usados em ELISAs ou em outros ensaios de fase sólida podem ser processados em um cartucho fluídico similar àqueles apresentados no presente documento.
[0148]Os métodos e aparelhos aqui apresentados também podem ser uteis para monitorar a síntese de moléculas que sejam opticamente detectáveis ou moléculas que sejam preparadas usando reagentes opticamente detectáveis, intermediários ou subprodutos. As moléculas poliméricas que são submetidas a reações cíclicas são particularmente aplicáveis. Por exemplo, a síntese de ácidos nucléicos ou de polipeptídeos utilizam grupos de bloqueio opticamente detectáveis ou intermediários que possam ser detectados usando um microfluorômetro, cabeçotes de leitura ou aparelhos de detecção aqui apresentados. As etapas fluídicas envolvidas em protocolos sintéticos podem ser realizadas em um cartucho fluídico similar àqueles aqui apresentados.
[0149]Outra aplicação útil dos métodos e aparelhos aqui apresentados consiste na formação de imagens microscópicas de objetos, tais como amostras biológicas. As amostras particularmente bem adequadas são tecidos ou células. As amostras podem ser apresentadas em um substrato e detectadas conforme exemplificado no presente documento para arranjos de ácido nucléico. A formação de imagem de propriedades fluorescentes de objetos, tais como amostras biológicas, é particularmente aplicável aos métodos e aparelhos aqui apresentados. Os microfluorômetros podem ser usados para essas aplicações e manipulações opcionalmente fluídicas, por exemplo, para introduzir reagentes fluorescentemente marcados, tais como tags fluorescentes para moléculas alvo, podem ser realizadas.
[0150]Ao longo do presente pedido, referenciaram-se várias publicações, patentes e pedidos de patente. As revelações dessas publicações em suas totalidades se encontram incorporadas a título de referência neste pedido a fim de descrever mais completamente o estado da técnica cuja a presente invenção pertence.
[0151]No presente documento, pretende-se que o termo “que compreende” seja ilimitado, incluindo não somente os elementos citados, mas abrangendo ainda quaisquer elementos adicionais.
[0152]Conforme o uso em questão, o termo “cada,” quando usado em referência a uma coleção de itens, é destinado a identificar um item individual na coleção, mas não se refere necessariamente a cada item na coleção, exceto onde o contexto indicar claramente em contrário.
[0153]Muito embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos proporcionados acima, deve-se compreender que várias modificações podem ser feitas sem divergir da invenção. De modo correspondente, a invenção é limitada somente pelas reivindicações.

Claims (35)

1. Aparelho de detecção CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um carro que compreende uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros compreende uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo, em que a pluralidade de microfluorômetros é posicionada para adquirir simultaneamente uma pluralidade das imagens de campo amplo em um plano comum, e em que cada uma das imagens de campo amplo é proveniente de uma área diferente do plano comum; (b) um estágio de translação configurado para mover o carro em pelo menos uma direção paralela ao plano comum; e (c) um estágio amostral configurado para manter um substrato no plano comum; um microfluorômetro; e um cartucho que compreende: uma carcaça compreendendo um material que é opticamente opaco e impermeável a líquidos aquosos, a carcaça compreendendo ainda uma área de recepção para receber uma célula de fluxo, em que a carcaça retém: uma pluralidade de reservatórios de reagente, e um reservatório de resíduos, o reservatório de resíduos em comunicação fluídica seletiva com uma saída da célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça; e uma válvula giratória de seleção de reagente incluindo uma pluralidade de portas de entrada em respectiva comunicação fluídica com um reservatório de reagente correspondente da pluralidade de reservatórios de reagente, uma porta de saída do reservatório de reagente em comunicação fluídica seletiva com a célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça, a válvula giratória tendo uma primeira posição para permitir o fluxo de líquido de um primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente para a célula de fluxo quando a célula de fluxo está na área de recepção da carcaça e para restringir o fluxo de líquido de um segundo reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente, e tendo uma segunda posição para permitir o fluxo de líquido do segundo reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente para a célula de fluxo quando a célula de fluxo está na área de recepção da carcaça e para restringir o fluxo de líquido do primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente.
2. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho compreende ainda uma válvula configurada para controlar o fluxo de fluido para o reservatório de resíduos.
3. Aparelho, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a válvula é configurada para controlar individualmente o fluxo de fluido de cada canal de uma pluralidade de canais da célula de fluxo.
4. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma bomba de seringa posicionada para puxar fluidos do primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente através da célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça.
5. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma pluralidade de bombas de seringa posicionadas para puxar fluidos do primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente através da célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça, cada bomba de seringa da pluralidade de bombas de seringa configurada para controlar individualmente o fluxo de fluido de cada canal de uma pluralidade de canais da célula de fluxo.
6. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a válvula giratória de seleção de reagente é uma primeira válvula giratória de seleção de reagente, em que a pluralidade de reservatórios de reagente é uma primeira pluralidade de reservatórios de reagente, o cartucho fluídico compreendendo ainda uma segunda válvula de seleção de reagente incluindo uma pluralidade de portas de entrada em respectiva comunicação fluídica com um reservatório de reagente correspondente de uma segunda pluralidade de reservatórios de reagente e uma porta de saída do reservatório de reagente em comunicação fluídica seletiva com uma porta de entrada da primeira válvula giratória de seleção de reagente.
7. Aparelho, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um reservatório de reagente da primeira pluralidade de reservatórios de reagente ou da segunda pluralidade de reservatórios de reagente compreende sequenciamento por reagentes de síntese.
8. Aparelho, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um reservatório de reagente da primeira pluralidade de reservatórios de reagente ou da segunda pluralidade de reservatórios de reagente compreende reagentes de amplificação.
9. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho compreende ainda um reservatório de amostra, o reservatório de amostra em comunicação fluídica seletiva com a célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça.
10. Aparelho, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o reservatório de amostra é seletivamente fluidamente acoplável a um único canal da célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça.
11. Aparelho de detecção CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um carro que compreende uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros compreende uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo, em que a pluralidade de microfluorômetros é posicionada para adquirir simultaneamente uma pluralidade das imagens de campo amplo em um plano comum, e em que cada uma das imagens de campo amplo é proveniente de uma área diferente do plano comum; (b) um estágio de translação configurado para mover o carro em pelo menos uma direção paralela ao plano comum; e (c) um estágio amostral configurado para manter um substrato no plano comum; um microfluorômetro; e um cartucho que compreende: uma carcaça compreendendo um material que é opticamente opaco e impermeável a líquidos aquosos, a carcaça compreendendo ainda uma área de recepção para receber uma célula de fluxo, em que a carcaça retém uma pluralidade de reservatórios de reagente; e uma válvula giratória de seleção de reagente incluindo uma pluralidade de portas de entrada em respectiva comunicação fluídica com um reservatório de reagente correspondente da pluralidade de reservatórios de reagente, uma porta de saída do reservatório de reagente em comunicação fluídica seletiva com a célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça, a válvula giratória tendo uma primeira posição para permitir o fluxo de líquido de um primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente para a célula de fluxo quando a célula de fluxo está na área de recepção da carcaça e para restringir o fluxo de líquido de um segundo reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente, e tendo uma segunda posição para permitir o fluxo de líquido do segundo reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente para a célula de fluxo quando a célula de fluxo está na área de recepção da carcaça e para restringir o fluxo de líquido do primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente.
12. Aparelho, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma bomba de seringa posicionada para puxar fluidos do primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente através da célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça.
13. Aparelho, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma pluralidade de bombas de seringa posicionadas para puxar fluidos do primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente através da célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça, cada bomba de seringa da pluralidade de bombas de seringa configurada para controlar individualmente o fluxo de fluido de cada canal de uma pluralidade de canais da célula de fluxo.
14. Aparelho, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a válvula giratória de seleção de reagente é uma primeira válvula giratória de seleção de reagente, em que a pluralidade de reservatórios de reagente é uma primeira pluralidade de reservatórios de reagente, o cartucho compreendendo ainda uma segunda válvula de seleção de reagente incluindo uma pluralidade de portas de entrada em respectiva comunicação fluídica com um reservatório de reagente correspondente de uma segunda pluralidade de reservatórios de reagente e uma porta de saída do reservatório de reagente em comunicação fluídica seletiva com uma porta de entrada da primeira válvula giratória de seleção de reagente.
15. Aparelho, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um reservatório de reagente da primeira pluralidade de reservatórios de reagente ou da segunda pluralidade de reservatórios de reagente compreende sequenciamento por reagentes de síntese.
16. Aparelho, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um reservatório de reagente da primeira pluralidade de reservatórios de reagente ou da segunda pluralidade de reservatórios de reagente compreende reagentes de amplificação.
17. Aparelho, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho compreende ainda um reservatório de amostra, o reservatório de amostra em comunicação fluídica seletiva com a célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça.
18. Aparelho, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o reservatório de amostra é seletivamente fluidamente acoplável a um único canal da célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça.
19. Aparelho de detecção CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um carro que compreende uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros compreende uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo, em que a pluralidade de microfluorômetros é posicionada para adquirir simultaneamente uma pluralidade das imagens de campo amplo em um plano comum, e em que cada uma das imagens de campo amplo é proveniente de uma área diferente do plano comum; (b) um estágio de translação configurado para mover o carro em pelo menos uma direção paralela ao plano comum; e (c) um estágio amostral configurado para manter um substrato no plano comum; um microfluorômetro; e um cartucho que compreende: uma carcaça que compreende uma área de recepção para receber uma célula de fluxo, em que a carcaça retém uma pluralidade de reservatórios de reagente; e uma válvula giratória de seleção de reagente incluindo uma pluralidade de portas de entrada em respectiva comunicação fluídica com um reservatório de reagente correspondente da pluralidade de reservatórios de reagente, uma porta de saída do reservatório de reagente em comunicação fluídica seletiva com a célula de fluxo responsiva à célula de fluxo sendo recebida na área de recepção da carcaça, a válvula giratória tendo uma primeira posição para permitir o fluxo de líquido de um primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente para a célula de fluxo quando a célula de fluxo está na área de recepção da carcaça e para restringir o fluxo de líquido de um segundo reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente, e tendo uma segunda posição para permitir o fluxo de líquido do segundo reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente para a célula de fluxo quando a célula de fluxo está na área de recepção da carcaça e para restringir o fluxo de líquido do primeiro reservatório de reagente da pluralidade de reservatórios de reagente.
20. Aparelho, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a válvula giratória de seleção de reagente é uma primeira válvula giratória de seleção de reagente, em que a pluralidade de reservatórios de reagente é uma primeira pluralidade de reservatórios de reagente, o cartucho fluídico compreendendo ainda uma segunda válvula de seleção de reagente incluindo uma pluralidade de portas de entrada em respectiva comunicação fluídica com um reservatório de reagente correspondente de uma segunda pluralidade de reservatórios de reagente e uma porta de saída do reservatório de reagente em comunicação fluídica seletiva com uma porta de entrada da primeira válvula giratória de seleção de reagente.
21. Aparelho de detecção CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um carro que compreende uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros compreende uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo, em que a pluralidade de microfluorômetros é posicionada para adquirir simultaneamente uma pluralidade das imagens de campo amplo em um plano comum, e em que cada uma das imagens de campo amplo é proveniente de uma área diferente do plano comum; (b) um estágio de translação configurado para mover o carro em pelo menos uma direção paralela ao plano comum; e (c) um estágio amostral configurado para manter um substrato no plano comum; um microfluorômetro; e um cartucho fluídico que compreende: uma célula de fluxo que compreende uma superfície opticamente transparente, uma entrada, uma saída e uma pluralidade de linhas; e uma carcaça que compreende um material que é opticamente opaco, em que a carcaça retém: uma pluralidade de reservatórios de amostra; um reservatório de reagente comum; uma válvula giratória incluindo uma pluralidade de portas de entrada de amostra em respectiva comunicação fluídica com um reservatório de amostra correspondente da pluralidade de reservatórios de amostra, uma porta de entrada de reservatório de reagente comum em comunicação fluídica com o reservatório de reagente comum, e uma pluralidade de portas de saída em respectiva comunicação fluídica com a pluralidade de linhas da célula de fluxo através de linhas fluídicas individuais, a válvula giratória tendo uma primeira posição para permitir o fluxo de líquido do reservatório de reagente comum para a pluralidade de linhas da célula de fluxo através da pluralidade de portas de saída e para restringir o fluxo de líquido da pluralidade de reservatórios de amostras, e tendo uma segunda posição para permitir o fluxo de líquido de cada reservatório de amostra da pluralidade de reservatórios de amostra para uma linha correspondente da pluralidade de linhas da célula de fluxo através da pluralidade de portas de saída e para restringir o fluxo de líquido do reservatório de reagente comum; e pelo menos uma fonte de pressão para mover líquidos da pluralidade de reservatórios de amostra ou do reservatório de reagente comum para a célula de fluxo através da entrada da célula de fluxo; em que uma janela opticamente transparente interrompe a carcaça, e em que a célula de fluxo está posicionada na janela opticamente transparente.
22. Aparelho, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a carcaça inclui uma área de recepção dimensionada para reter a célula de fluxo por um ajuste de compressão.
23. Aparelho, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a carcaça inclui uma área de recepção dimensionada para reter a célula de fluxo e permitir que a célula de fluxo flutue em relação à carcaça.
24. Aparelho, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho fluídico compreende ainda uma outra válvula conectada à saída da célula de fluxo e em que: a pelo menos uma fonte de pressão inclui uma pluralidade de bombas; e cada linha da pluralidade de linhas é respectivamente fluidicamente conectada a uma bomba da pluralidade de bombas através da outra válvula.
25. Aparelho, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho fluídico compreende ainda um reservatório de resíduos conectado fluidicamente à outra válvula.
26. Aparelho, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho fluídico compreende ainda um reservatório de lavagem conectado fluidicamente à válvula giratória.
27. Aparelho, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho fluídico compreende ainda uma pluralidade de reservatórios suplementares fluidamente conectados à célula de fluxo através da entrada da célula de fluxo e em que: a pelo menos uma fonte de pressão é uma bomba tendo uma direção reversa para mover líquidos usados da célula de fluxo para a pluralidade de reservatórios suplementares; e a válvula giratória tem portas diferentes para, respectivamente, direcionar os líquidos usados para a pluralidade de reservatórios suplementares.
28. Aparelho de detecção CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um carro que compreende uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros compreende uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo, em que a pluralidade de microfluorômetros é posicionada para adquirir simultaneamente uma pluralidade das imagens de campo amplo em um plano comum, e em que cada uma das imagens de campo amplo é proveniente de uma área diferente do plano comum; (b) um estágio de translação configurado para mover o carro em pelo menos uma direção paralela ao plano comum; e (c) um estágio amostral configurado para manter um substrato no plano comum; um microfluorômetro; e um cartucho fluídico que compreende: uma célula de fluxo que compreende uma superfície opticamente transparente, uma porta de entrada, uma porta de saída e uma pluralidade de linhas; e uma carcaça que compreende um material que é opticamente opaco, em que a carcaça retém: uma pluralidade de reservatórios de amostra; um reservatório de reagente comum em comunicação fluídica com a célula de fluxo através da porta de entrada da célula de fluxo e através da porta de saída da célula de fluxo; uma válvula giratória incluindo uma pluralidade de portas de entrada de amostra em respectiva comunicação fluídica com um reservatório de amostra correspondente da pluralidade de reservatórios de amostra, uma porta de entrada de reservatório de reagente comum em comunicação fluídica com o reservatório de reagente comum, e uma pluralidade de portas de saída em respectiva comunicação fluidica com a pluralidade de linhas da célula de fluxo através de linhas de fluido individuais, a válvula giratória tendo uma primeira posição para permitir o fluxo de líquido do reservatório de reagente comum para a pluralidade de linhas da célula de fluxo através da pluralidade de portas de saída e para restringir o fluxo de líquido da pluralidade de reservatórios de amostras, e tendo uma segunda posição para permitir o fluxo de líquido de cada reservatório de amostra da pluralidade de reservatórios de amostra para uma linha correspondente da pluralidade de linhas da célula de fluxo através da pluralidade de portas de saída e para restringir o fluxo de líquido do reservatório de reagente comum; uma bomba posicionada a jusante da célula de fluxo e a montante de uma segunda válvula, em que a bomba é uma fonte de pressão para mover líquidos da pluralidade de reservatórios de amostra ou do reservatório de reagente comum para a célula de fluxo através da porta de entrada da célula de fluxo; e a segunda válvula para controlar o fluxo de fluido da célula de fluxo para o reservatório de reagente comum; em que uma janela opticamente transparente interrompe a carcaça, e em que a célula de fluxo está posicionada na janela opticamente transparente.
29. Aparelho, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho fluídico compreende ainda: uma primeira linha fluídica conectando o reservatório comum à válvula giratória; uma segunda linha fluídica conectando a porta de saída da célula de fluxo à bomba; uma terceira linha fluídica conectando a bomba à segunda válvula; e uma quarta linha fluídica conectando o reservatório de reagente comum à segunda válvula.
30. Aparelho, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho fluídico compreende ainda: um reservatório de resíduos; e uma quinta linha fluídica conectando o reservatório de resíduos à segunda válvula.
31. Aparelho de detecção CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um carro que compreende uma pluralidade de microfluorômetros, em que cada um dos microfluorômetros compreende uma objetiva configurada para detecção de imagens de campo amplo, em que a pluralidade de microfluorômetros é posicionada para adquirir simultaneamente uma pluralidade das imagens de campo amplo em um plano comum, e em que cada uma das imagens de campo amplo é proveniente de uma área diferente do plano comum; (b) um estágio de translação configurado para mover o carro em pelo menos uma direção paralela ao plano comum; e (c) um estágio amostral configurado para manter um substrato no plano comum; um microfluorômetro; e um cartucho fluídico compreendendo: uma célula de fluxo que compreende uma superfície opticamente transparente, uma porta de entrada, uma porta de saída e uma pluralidade de linhas; e uma carcaça que compreende um material que é opticamente opaco, em que a carcaça retém: uma pluralidade de reservatórios de amostra; um reservatório de reagente comum em comunicação fluídica com a célula de fluxo através da porta de entrada da célula de fluxo; uma pluralidade de reservatórios suplementares em comunicação fluídica com a célula de fluxo através da porta de saída da célula de fluxo; uma primeira válvula giratória incluindo uma pluralidade de portas de entrada de amostra em respectiva comunicação fluídica com um reservatório de amostra correspondente da pluralidade de reservatórios de amostra, uma porta de entrada de reservatório de reagente comum em comunicação fluídica com o reservatório de reagente comum, e uma pluralidade de portas de saída em respectiva comunicação fluídica com a pluralidade de linhas da célula de fluxo através de linhas de fluido individuais, a primeira válvula giratória tendo uma primeira posição para permitir o fluxo de líquido do reservatório de reagente comum para a pluralidade de linhas da célula de fluxo através da pluralidade de portas de saída e para restringir o fluxo de líquido da pluralidade de reservatórios de amostras, e tendo uma segunda posição para permitir o fluxo de líquido de cada reservatório de amostra da pluralidade de reservatórios de amostra para uma linha correspondente da pluralidade de linhas da célula de fluxo através da pluralidade de portas de saída e para restringir o fluxo de líquido do reservatório de reagente comum; uma segunda válvula conectada a cada reservatório suplementar da pluralidade de reservatórios suplementares e à porta de saída da célula de fluxo; e uma bomba posicionada a jusante da célula de fluxo e a montante da segunda válvula, em que a bomba é uma fonte de pressão para mover líquidos da pluralidade de reservatórios de amostra ou do reservatório de reagente comum para a célula de fluxo através da porta de entrada da célula de fluxo; em que uma janela opticamente transparente interrompe a carcaça, e em que a célula de fluxo está posicionada na janela opticamente transparente.
32. Aparelho, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho fluídico compreende ainda: uma primeira linha fluídica conectando o reservatório de reagente à primeira válvula giratória; uma segunda linha fluídica conectando a porta de saída da célula de fluxo à bomba; uma terceira linha fluídica conectando a bomba à segunda válvula; e quartas linhas fluídicas conectando, respectivamente, cada reservatório suplementar da pluralidade de reservatórios suplementares à segunda válvula.
33. Aparelho, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho fluídico compreende ainda: um reservatório de resíduos; e uma quinta linha fluídica conectando o reservatório de resíduos à segunda válvula.
34. Aparelho, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que: a pluralidade de reservatórios suplementares está fluidamente conectada à primeira válvula giratória; e a primeira válvula giratória inclui portas dedicadas para fornecer líquidos usados de cada reservatório suplementar da pluralidade de reservatórios suplementares para a célula de fluxo.
35. Aparelho, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o cartucho fluídico compreende ainda uma terceira válvula fluidamente conectada à pluralidade de reservatórios suplementares para, respectivamente, fornecer líquidos usados de cada reservatório suplementar da pluralidade de reservatórios suplementares para a célula de fluxo.
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