ES2949570T3 - Cabezal integrado de lectura optoelectrónica y cartucho de fluidos útiles para la secuenciación de ácidos nucleicos - Google Patents

Cabezal integrado de lectura optoelectrónica y cartucho de fluidos útiles para la secuenciación de ácidos nucleicos Download PDF

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Mark Wang
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Abstract

Un aparato de detección que tiene un cabezal de lectura que incluye una pluralidad de microfluorómetros colocados para adquirir simultáneamente una pluralidad de imágenes de campo amplio en un plano común; y (b) una etapa de traducción configurada para mover el cabezal de lectura a lo largo de un sustrato que está en el plano común. El sustrato puede ser una celda de flujo que se incluye en un cartucho, incluyendo también el cartucho una carcasa para (i) un depósito de muestra; (ii) una línea fluídica entre el depósito de muestra y la celda de flujo; (iii) varios depósitos de reactivo en comunicación fluida con la celda de flujo, (iv) al menos una válvula configurada para mediar la comunicación fluida entre los depósitos y la celda de flujo; y (v) al menos una fuente de presión configurada para mover líquidos desde los depósitos a la celda de flujo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Cabezal integrado de lectura optoelectrónica y cartucho de fluidos útiles para la secuenciación de ácidos nucleicos
Antecedentes
Las realizaciones de la presente descripción se refieren en general a aparatos y métodos para la manipulación de fluido y la detección óptica de muestras, por ejemplo, en procedimientos de secuenciación de ácidos nucleicos. El documento US 2010/157086 A1 se refiere a sistemas y métodos para la formación de imágenes de ensayo. Además, los documentos US 2008-151-363 A1 y US 2004/224317 A1 se refieren a sistemas y métodos correspondientes para obtener imágenes de muestras en pozos, métodos que pueden usar fluorescencia para la detección.
Nuestro genoma proporciona un modelo para predecir muchas de nuestras predisposiciones inherentes tales como nuestras preferencias, cualidades, susceptibilidad a la enfermedad y capacidad de respuesta a fármacos terapéuticos. Un genoma humano individual contiene una secuencia de más de 3 mil millones de nucleótidos. Las diferencias en sólo una fracción de esos nucleótidos imparten muchas de nuestras características únicas. La comunidad de investigación está haciendo un esfuerzo impresionante en desentrañar las características que conforman el modelo y con la comprensión más completa de cómo la información en cada modelo se refiere a la salud humana. Sin embargo, nuestra comprensión está lejos de ser completa y esto dificulta el movimiento de la información de los laboratorios de investigación a la clínica donde la esperanza es que un día cada una de ellas tenga una copia de nuestro propio genoma personal de modo que podamos sentarnos con nuestro médico para determinar las opciones apropiadas para un estilo de vida saludable o una evolución adecuada del tratamiento.
El cuello de botella actual es una cuestión de rendimiento y escala. Un componente fundamental del desentrañado del modelo para cualquier individuo dado es determinar la secuencia exacta de los 3 mil millones de nucleótidos en su genoma. Las técnicas están disponibles para hacer esto, pero esas técnicas normalmente cuestan miles y miles de dólares y tardan muchos días en realizarse. Además, la relevancia clínica de la secuencia genómica de cualquier individuo es una cuestión de comparar características únicas de su secuencia genómica (es decir, su genotipo) con genomas de referencia que están correlacionados con características conocidas (es decir, fenotipos). El problema de escala y rendimiento se vuelve evidente cuando se considera que los genomas de referencia se crean en base a las correlaciones de un genotipo con un fenotipo que surgen de estudios de investigación que normalmente usan miles de individuos para ser estadísticamente válidos. Por tanto, los miles de millones de nucleótidos pueden secuenciarse eventualmente para miles de individuos para identificar cualquier correlación de un genotipo con un fenotipo clínicamente relevante. También se hace más evidente la necesidad de tecnologías de secuenciación muy económicas y rápidas, multiplicadas además por el número de enfermedades, respuestas de fármacos y otras características clínicamente relevantes.
Lo que se necesita es una reducción en el coste de la secuenciación que impulse grandes estudios de correlación genética llevados a cabo por científicos de investigación y que hagan que la secuenciación sea accesible en el entorno clínico para el tratamiento de pacientes individuales que producen decisiones de cambio de vida. Las realizaciones de la invención expuestas en el presente documento satisfacen esta necesidad y también proporcionan otras ventajas.
Breve resumen
La presente descripción proporciona un aparato de detección según la reivindicación 1 que incluye (a) un carro que incluye una pluralidad de microfluorómetros, en donde cada uno de los microfluorómetros tiene un objetivo configurado para la detección de imagen de campo amplio, en donde la pluralidad de microfluorómetros está colocada para adquirir simultáneamente una pluralidad de imágenes de campo ancho en un plano común, y en donde cada una de las imágenes de campo ancho es de un área diferente del plano común; (b) una etapa de traslación configurada para mover el carro en al menos una dirección paralela al plano común; y (c) una etapa de muestra configurada para sujetar un sustrato en el plano común, y en donde cada uno de los microfluorómetros además comprende un módulo de enfoque automático dedicado, y en donde el módulo de enfoque automático para un primer microfluorómetro del aparato está configurado para integrar datos de un módulo de enfoque automático para un segundo microfluorómetro del aparato, por lo que el módulo de enfoque automático altera el foco del primer microfluorómetro basándose en la posición de enfoque del primer microfluorómetro y la posición de enfoque del segundo microfluorómetro.
Esta descripción proporciona además un método para adquirir imágenes de un sustrato según la reivindicación 12, que incluye las etapas de (a) proporcionar un sustrato que incluye características fluorescentes sobre una superficie; (b) adquirir una pluralidad de imágenes de campo ancho de una primera parte de la superficie usando una pluralidad de microfluorómetros, donde cada uno de los microfluorómetros adquiere una imagen de campo ancho a partir de una ubicación diferente de la superficie, donde la pluralidad de microfluorómetros están fijados a un portador; y (c) trasladar el carro en una dirección paralela a la superficie y repetir (b) para una segunda parte de la superficie que además comprende enfocar individualmente cada microfluorómetro en la pluralidad de microfluorómetros usando una técnica de enfoque automático, en donde cada uno de los microfluorómetros comprende un módulo de autoenfoque; en donde el módulo de enfoque automático usado para un primer microfluorómetro de la pluralidad de microfluorómetros integra datos de un módulo de enfoque automático usado para un segundo microfluorómetro de la pluralidad de microfluorómetros, por lo que el foco del primer microfluorómetro se ajusta en base a la posición de enfoque del primer microfluorómetro y la posición de enfoque del segundo microfluorómetro. El método puede usar cualquiera de los aparatos expuestos en otra parte de la presente memoria, pero no es necesario que sea tan limitado en todas las realizaciones.
También se proporciona un cartucho fluídico que incluye (a) una celda de flujo que tiene una superficie ópticamente transparente, una entrada y una salida; y (b) una carcasa hecha de un material que es ópticamente opaco e impermeable a líquidos acuosos, en donde el alojamiento contiene: (i) un depósito de muestra; (ii) una línea de fluidos entre el depósito de muestra y la entrada de la celda de flujo; (iii) una pluralidad de depósitos de reactivo en comunicación de fluidos con la celda de flujo a través de la entrada de la celda de flujo, (iv) al menos una válvula configurada para mediar la comunicación de fluidos entre los depósitos y la entrada de la celda de flujo; y (v) al menos una fuente de presión configurada para mover líquidos desde el depósito de muestra o los depósitos de reactivo hasta la celda de flujo a través de la entrada de la celda de flujo, en donde una ventana ópticamente transparente interrumpe el alojamiento y un puerto de entrada interrumpe el alojamiento, en donde el puerto de entrada está en comunicación de fluidos con el depósito de muestra, y en donde la superficie ópticamente transparente se coloca en la ventana. Esta descripción proporciona además un método de secuenciación que incluye las etapas de (a) proporcionar un cartucho de fluidos que tiene (i) una celda de flujo que tiene una superficie ópticamente transparente, (ii) una muestra de ácido nucleico, (iii) una pluralidad de reactivos para una reacción de secuenciación y (iv) un sistema fluídico para suministrar los reactivos a la celda de flujo; b) suministrar un aparato de detección que comprende (i) una pluralidad de microfluorómetros, en donde cada uno de los microfluorómetros comprende un objetivo configurado para la detección de imagen de campo ancho, y (ii) una etapa de muestra; (c) suministrar el cartucho de fluidos a la etapa de muestra, en donde la superficie ópticamente transparente se coloca en el plano de imágenes; y (d) llevar a cabo operaciones fluídicas de un procedimiento de secuenciación de ácido nucleico en el cartucho de fluidos y las operaciones de detección del procedimiento de secuenciación de ácido nucleico en el aparato de detección, en donde (i) los reactivos se administran a la célula de flujo mediante el sistema fluídico, y (ii) las características de ácido nucleico son detectadas por la pluralidad de microfluorómetros.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un dispositivo de detección optoelectrónico (izquierda) y un cartucho de fluidos (derecha) útil para la secuenciación de ácidos nucleicos.
La Figura 2 muestra un diseño óptico para un microfluorómetro individual que tiene trayectorias de haz de excitación y emisión ortogonales.
La Figura 3 muestra un diseño óptico para un microfluorómetro.
La Figura 4 muestra una disposición de cuatro microfluorómetros en relación con una celda de flujo que tiene dos canales. La Figura 5 muestra un aparato de enfoque automático que puede usarse en un microfluorómetro.
La Figura 6 muestra en el panel A: vistas superiores de una disposición de cuatro canales en una celda de flujo (izquierda) y una disposición lineal de objetivos en una sola fila (derecha), y en el panel B: una celda de flujo que tiene ocho canales (izquierda) y una disposición de ocho objetivos en dos filas lineales de cuatro.
La Figura 7 muestra vistas superiores de una disposición de seis canales en una celda de flujo (izquierda) y una disposición de objetivos de relleno hexagonal en dos filas (derecha).
La Figura 8 muestra una vista en perspectiva de una disposición de ocho microfluorómetros para un aparato de detección. La Figura 9 muestra una vista en planta inferior de una disposición de ocho microfluorómetros para un aparato de detección. La Figura 10 muestra un diseño óptico para un microfluorómetro individual que tiene trayectorias de haz de excitación y emisión paralelas.
La Figura 11 muestra una vista en perspectiva superior de una etapa Y para un aparato de detección.
La Figura 12 muestra una vista en perspectiva inferior de una etapa Y para un aparato de detección.
La Figura 13 muestra una vista en perspectiva superior de una etapa Y que sostiene una disposición de ocho microfluorómetros.
La Figura 14 muestra un diagrama de bloques eléctricos para un aparato de detección.
La Figura 15 muestra una vista despiezada de un cartucho de fluidos con celda de flujo.
La Figura 16 muestra un mapa de fluido para un cartucho de fluido.
La Figura 17 muestra una válvula giratoria de inyección de cuatro muestras.
La Figura 18 muestra un mapa fluídico para un sistema de reutilización de reactivos que usa flujo unidireccional y dos válvulas.
La Figura 19 muestra un mapa fluídico para un sistema de reutilización de reactivos que usa flujo alternativo y una única válvula.
Descripción detallada
Esta descripción proporciona métodos y aparatos para la detección de alta resolución de áreas planas tales como las presentes en superficies de sustrato. Una aplicación particularmente útil es la formación de imágenes basadas por medios ópticos en una muestra biológica que está presente en una superficie. Por ejemplo, los métodos y aparatos establecidos en la presente descripción pueden usarse para obtener imágenes de características de ácido nucleico que están presentes en matrices de ácido nucleico, tales como las usadas en aplicaciones de secuenciación de ácido nucleico. Puede usarse una variedad de técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos que utilizan muestras y/o reactivos detectables de manera óptica. Estas técnicas son particularmente adecuadas para los métodos y aparatos de la presente descripción y, por tanto, destacan diversas ventajas para realizaciones particulares de la invención. Algunas de esas ventajas se exponen a continuación con fines ilustrativos y, aunque se ejemplifican aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, las ventajas pueden extenderse también a otras aplicaciones.
Con respecto a algunos de los ejemplos expuestos en el presente documento, las características destacadas de muchas técnicas de secuenciación de ácido nucleico son (1) el uso de detección multicolor [por ejemplo, a menudo cuatro fluoróforos diferentes se usan, uno para cada uno de los diferentes tipos de nucleótidos a, C, g y T (o U) presentes en ácidos nucleicos], (2) distribución de grandes números de fragmentos diferentes de una muestra de ácido nucleico (por ejemplo, fragmentos de una muestra genómica, muestra de ARN o derivado de ellas) sobre la superficie de una matriz y (3) ciclos repetidos de procesamiento fluídico y formación de imágenes de las matrices. Las realizaciones de los métodos y aparatos descritos en la presente descripción son particularmente útiles para la secuenciación de ácidos nucleicos porque pueden proporcionar la capacidad de imágenes de alta resolución de superficies de matriz en múltiples colores y en múltiples repeticiones. Por ejemplo, las realizaciones expuestas en el presente documento permiten obtener una imagen de una superficie a una resolución que está en el intervalo de cientos, decenas o incluso de un solo dígito. Como tales, pueden resolverse características de ácido nucleico que tienen vecino más cercano, separación promedio de centro a centro que es inferior a 100 micrómetros, 50 micrómetros, 10 micrómetros, 5 micrómetros o menos. En realizaciones particulares, se pueden adquirir imágenes de campo amplio de superficies, que incluyen, por ejemplo, imágenes que cubren un área de 1 mm2 o más de una matriz. Las imágenes pueden adquirirse en múltiples colores simultáneamente o secuencialmente, por ejemplo, para identificar marcadores fluorescentes asociados de manera única con diferentes tipos de nucleótidos. Además, las imágenes pueden adquirirse secuencialmente para múltiples ciclos de una técnica de secuenciación. Las imágenes de un área dada de la matriz pueden compararse de manera fiable desde cada ciclo para determinar la secuencia de cambios de color detectada para cada característica de ácido nucleico en la matriz. La secuencia de cambios de color se puede usar a su vez para inferir las secuencias de los fragmentos de ácido nucleico en cada característica.
En realizaciones particulares, un aparato de la presente divulgación incluye uno o más microfluorómetros. Cada uno de los microfluorómetros puede incluir una fuente de radiación de excitación, un detector y un objetivo para formar una subunidad integrada de un cabezal de lectura. Otros componentes ópticos pueden estar presentes en cada microfluorómetro. Por ejemplo, un divisor de haz puede estar presente para proporcionar una configuración de detección epifluorescente compacta, por lo que el divisor de haz se coloca para dirigir la radiación de excitación desde la fuente de radiación de excitación al objetivo y para dirigir la radiación de emisión desde el objetivo al detector.
Una ventaja de usar un diseño de microfluorómetro integrado es que el microfluorómetro se puede mover convenientemente, por ejemplo en una operación de escaneo, para permitir la formación de imágenes de un sustrato que es más grande que el campo de visión del microfluorómetro. En realizaciones particulares, pueden combinarse varios microfluorómetros para formar un cabezal de lectura. Varias configuraciones para la combinación de cabezas de lectura se exponen a continuación y se pueden seleccionar para adaptarse a un formato particular para un sustrato que se va a formar imágenes, manteniendo al mismo tiempo un tamaño relativamente compacto para la cabeza de lectura general. El tamaño relativamente pequeño y la masa baja del cabezal de lectura en varias realizaciones de la presente descripción dan como resultado una inercia relativamente baja de manera que el cabezal de lectura se apoya rápidamente después de ser movido, favoreciendo así el escaneo rápido de una matriz de ácido nucleico u otro sustrato. En algunos casos, los microfluorómetros pueden fijarse a un carro de manera que no se puedan mover independientemente en al menos algunas dimensiones durante el curso de una aplicación analítica tal como una ejecución de secuenciación de ácido nucleico. Por ejemplo, múltiples microfluorómetros pueden fijarse permanentemente de manera que no sean móviles independientemente entre sí en dimensiones x e y (donde al menos una de x o y es la dirección de escaneo). Los microfluorómetros pueden, sin embargo, accionarse independientemente en la dimensión z para proporcionar control de foco independiente. Los grados de libertad reductores entre varios microfluorómetros diferentes de un aparato de la presente descripción proporcionan protección contra la pérdida de alineación durante el envío, manipulación y uso del aparato.
En algunas realizaciones, cada uno de los múltiples microfluorómetros que están presentes en un cabezal o carro leído puede tener un módulo de enfoque automático dedicado. Por consiguiente, cada microfluorómetro se puede enfocar independientemente. En algunas realizaciones, un módulo de enfoque automático particular en un cabezal de lectura, aunque dedicado al accionamiento de un microfluorómetro particular, no obstante, puede recibir información de al menos otro módulo de enfoque automático en la cabeza de lectura y la información de ese módulo de enfoque automático particular y del al menos otro módulo de enfoque automático puede usarse para determinar un accionamiento apropiado para lograr el foco deseado para el microfluorómetro particular. De esta manera, el foco para cualquier microfluorómetro dado puede determinarse por consenso entre dos o más microfluorómetros presentes en el mismo cabezal o carro leído.
En modalidades particulares, una muestra que debe detectarse en un método o aparato expuesto en la presente descripción puede proporcionarse en un formato de cartucho. Por ejemplo, el cartucho puede incluir un sustrato a detectar junto con otros componentes fluídicos utilizados para procesar el sustrato para la detección. Tomando el ejemplo más específico de una aplicación de secuenciación de ácidos nucleicos, el cartucho puede incluir una celda de flujo capaz de presentar un conjunto de características de ácidos nucleicos a un dispositivo de detección, y opcionalmente uno o más de los reservorios para contener reactivos de secuenciación, reservorios para contener reactivos de preparación de muestras, reservorios para contener productos de desecho generados durante la secuenciación, y/o bombas, válvulas y otros componentes capaces de mover fluidos a través de la celda de flujo. Un cartucho de fluidos como tal puede proporcionar las ventajas de un formato conveniente y compacto para el almacenamiento y procesamiento de una muestra y reactivos para la secuenciación de ácidos nucleicos.
En realizaciones particulares, un cartucho de fluido puede configurarse para permitir la reutilización de uno o más reactivos. Por ejemplo, el cartucho de fluido puede configurarse para suministrar un reactivo a una celda de flujo, luego retirar el reactivo de la celda de flujo y luego volver a introducir el reactivo a la celda de flujo. Una ventaja de reutilizar reactivos es reducir los desechos y el coste de los procedimientos que utilizan reactivos costosos y/o reactivos que se suministran a altas concentraciones (o en grandes cantidades).
Los cartuchos de fluidos de la presente descripción pueden proporcionar una ventaja de la modularidad mediante la cual diferentes muestras pueden procesarse de manera fluida en un primer módulo (es decir, el cartucho de fluidos) que está en comunicación óptica con un segundo módulo (por ejemplo, un microfluorómetro, cabezal de lectura o aparato de detección). Un cartucho de fluidos puede contener muestras, reactivos y hardware fluídico suficientes para un procedimiento de procesamiento fluídico completo (por ejemplo, un procedimiento de secuenciación de ácido nucleico) y el cartucho de fluidos puede suministrarse a un aparato de detección. Una vez que se completan los procedimientos de fluidos y detección, el cartucho de fluidos puede retirarse de manera que el aparato de detección esté listo para otro procedimiento. Debido a que el módulo fluídico y el módulo de detección son separables, el presente sistema permite evaluar múltiples muestras diferentes al tiempo que se evita el riesgo de contaminación cruzada entre las muestras. Esto proporciona ventajas para realizaciones donde los componentes de detección son relativamente caros y técnicamente difíciles de ensamblar, evitando mantenimiento innecesario, descontaminación o eliminación de componentes ópticos que pueden ser necesarios cuando los componentes fluídicos y componentes ópticos no son modulares.
La Figura 1 muestra un dispositivo de barrido óptico ilustrativo 1 que explota ventajas de optoelectrónica integrada y fluidos basados en cartuchos que se proporcionan por varias realizaciones expuestas en la presente memoria. El dispositivo ilustrativo 1 incluye una carcasa 2 que contiene diversos componentes fijos que incluyen, por ejemplo, componentes ópticos, componentes computacionales, fuente de alimentación, ventilador y similares. Una pantalla 3 presente, por ejemplo, en la cara frontal de la carcasa 2 funciona como una interfaz gráfica de usuario que puede proporcionar diversos tipos de información, tales como el estado operativo, el estado de un procedimiento analítico (p. ej., una ejecución de secuenciación) que se lleva a cabo, el estado de transferencia de datos a o desde el dispositivo 1, instrucciones de uso, advertencias o similares. Un receptáculo de cartucho 4 también está presente en la cara frontal de la carcasa 2. Como se muestra, el receptáculo del cartucho 4 puede configurarse como una ranura que tiene una puerta protectora 5. Un indicador de estado 6 , en forma de luz indicadora en el bastidor del receptáculo del cartucho en este ejemplo, está presente y puede configurarse para indicar la presencia o ausencia de un cartucho en el dispositivo 1. Por ejemplo, la luz indicadora 6 puede cambiar de encendido o de un color a otro para indicar la presencia o ausencia de un cartucho. Botón de control de potencia 7 está presente en la cara frontal de la carcas 2 en este ejemplo como marca distintiva 8 tal como el nombre del fabricante o instrumento.
También en la Figura 1 se muestra un cartucho fluídico ilustrativo 10 que se puede usar para proporcionar una muestra y reactivos al dispositivo 1. El cartucho de fluidos 10 incluye una carcasa 11 que protege diversos componentes fluídicos tales como depósitos, conexiones fluídicas, bombas, válvulas y similares. Una celda de flujo 12 se integra en el cartucho de fluidos en una posición donde está en comunicación fluida con reactivos dentro de la carcasa. La carcasa 11 tiene una abertura 13 a través de la cual una cara de la celda de flujo 12 se expone de tal manera que puede interactuar ópticamente con el dispositivo de escaneo óptico 1 cuando el cartucho de fluidos 10 se coloca en el receptáculo del cartucho 4. La carcasa del cartucho 11 también incluye un puerto de muestra 14 para la introducción de una muestra de ácido nucleico diana. Un código de barras 15 u otras marcas distintivas legibles por máquina pueden estar presentes opcionalmente en la carcasa del cartucho 11, por ejemplo, para proporcionar seguimiento y gestión de muestras. Otras marcas 16 también puede estar presente en la carcasa para una identificación conveniente por un usuario humano, por ejemplo, para identificar el fabricante, el análisis analítico soportado por el cartucho de fluidos, el número de lote, la fecha de caducidad, las advertencias de seguridad y similares.
El aparato que se muestra en la figura 1 es a modo de ejemplo. A continuación, se exponen con más detalle realizaciones a modo de ejemplo adicionales de los métodos y el aparato de la presente descripción que pueden usarse alternativa o adicionalmente al ejemplo de la figura 1.
En la presente memoria se proporciona un aparato de detección, que tiene (a) un carro que incluye una pluralidad de microfluorómetros, en donde cada uno de los microfluorómetros incluye un objetivo configurado para la detección de imágenes de campo amplio, en donde la pluralidad de microfluorómetros se coloca para adquirir simultáneamente una pluralidad de imágenes de campo ancho en un plano común, y en donde cada una de las imágenes de campo ancho es de un área diferente del plano común; (b) una etapa de traslación configurada para mover el carro en al menos una dirección paralela al plano común; y (c) una etapa de muestra configurada para sujetar un sustrato en el plano común.
Se puede usar un aparato de detección (o un microfluorómetro individual) de la presente divulgación para obtener una o más imágenes a una resolución que sea suficiente para distinguir características en una escala de micras. Por ejemplo, un microfluorómetro que se usa en un aparato de detección puede tener una resolución suficiente para distinguir características que están separadas por, como máximo, 500 μm, 100 μm, 50 μm, 10 μm, 5 μm, 4 μm, 3 μm, 2 μm o 1 μm. También es posible una resolución más baja, por ejemplo, una resolución que distingue las características que están separadas por más de 500 μm.
Un aparato de detección (o un microfluorómetro individual) de la presente divulgación es adecuado para la detección de superficies de alta resolución. Por consiguiente, las matrices que tienen características con separación promedio en el intervalo de micrómetros son sustratos especialmente útiles. En realizaciones particulares, se puede usar un aparato de detección o microfluorómetro para obtener una o más imágenes de una matriz que tiene características con separación de centro a centro para vecinos más cercanos, en promedio o por debajo de 500 μm, 100 μm, 50 μm, 10 μm, 5 μm, 4 μm, 3 μm, 2 μm o 1 μm. En muchas realizaciones, las características de una matriz no son contiguas, están separadas, por ejemplo, por menos de 100 μm, 50 μm, 10 μm, 5 μm, 1 μm o 0,5 μm. Sin embargo, las características no necesitan separarse. En cambio, algunas o todas las características de una matriz pueden ser contiguas entre sí.
Puede usarse cualquiera de una variedad de matrices (también denominadas “ micromatrices” ) conocidas en la técnica. Una matriz típica contiene características, cada una con una sonda individual o una población de sondas. En el último caso, la población de sondas en cada sitio es típicamente homogénea que tiene una sola especie de sonda. Por ejemplo, en el caso de una matriz de ácido nucleico, cada característica puede tener múltiples especies de ácido nucleico cada una con una secuencia común. Sin embargo, en algunas realizaciones, las poblaciones en cada característica de una matriz pueden ser heterogéneas. De manera similar, las matrices de proteínas pueden tener características con una sola proteína o una población de proteínas típicamente, pero no siempre, que tienen la misma secuencia de aminoácidos. Las sondas se pueden unir a la superficie de una matriz, por ejemplo, mediante enlace covalente de las sondas a la superficie o mediante interacciones no covalentes de las sondas con la superficie. En algunas modalidades, las sondas, tales como las moléculas de ácido nucleico, pueden unirse a una superficie a través de una capa de gel como se describe, por ejemplo, en el documento US 2011 /0059865 A1.
Las matrices ilustrativas incluyen, sin limitación, un BeadChip Array disponible de Illumina®, Inc. (San Diego, CA) u otros tales como aquellos donde las sondas están unidas a perlas que están presentes en una superficie (p. ej., perlas en pocillos en una superficie) tales como las descritas en las patentes US-6.266.459; 6.355.431; 6.770.441; 6.859.570; o 7.622.294; o la publicación PCT n.° WO 00/63437. Otros ejemplos de micromatrices disponibles comercialmente que pueden usarse incluyen, por ejemplo, una micromatriz Affymetrix® GeneChip® u otra micromatriz sintetizada de acuerdo con técnicas a las que se hace referencia a veces como VLSIPS™ (Síntesis de polímeros inmovilizados de muy gran escala). También se puede usar una micromatriz de manchas en un aparato o sistema de acuerdo con algunas realizaciones de la invención. Una micromatriz de puntos a modo de ejemplo es una matriz CodeLink™ comercializada por Amersham Biosciences. Otra micromatriz útil es una que se fabrica usando métodos de impresión por chorro de tinta tales como la tecnología SurePrint™ disponible en Agilent Technologies.
Otras matrices útiles incluyen aquellas que se usan en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, las matrices que tienen amplicones de fragmentos genómicos (a menudo denominados grupos) son particularmente útiles, tales como las descritas en Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082. Otro tipo de matriz que es útil para la secuenciación de ácidos nucleicos es una matriz de partículas producidas a partir de una técnica de PCR en emulsión. Los ejemplos se describen en Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), WO 05/010145, US 2005/0130173 o US 2005/0064460. Aunque las matrices anteriores se han descrito en el contexto de aplicaciones de secuenciación, se entenderá que las matrices se pueden usar en otras realizaciones que incluyen, por ejemplo, aquellas que no incluyen una técnica de secuenciación.
Ya sea configurado para la detección de una matriz u otra muestra, uno o más microfluorómetros que están presentes en un aparato de detección pueden configurarse para detección de campo amplio. El diámetro de campo para un microfluorómetro individual puede ser, por ejemplo, al menos 0,5 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm o más. Mediante la elección de componentes ópticos apropiados, el diámetro del campo también puede limitarse a un área máxima y, como tal, el diámetro del campo puede ser, por ejemplo, no mayor de 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm o 1 mm. Por consiguiente, en algunas modalidades, una imagen obtenida por un microfluorómetro individual puede tener un área que está en un intervalo de 0,25 mm2 a 25 mm2.
Además de configurarse para la detección de campo amplio, un microfluorómetro puede configurarse para tener una apertura numérica (NA) que es mayor que 0,2. Por ejemplo, la NA de un objetivo usado en un microfluorómetro de la presente divulgación puede ser al menos 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5. Alternativa o adicionalmente, puede ser deseable restringir la NA del objetivo para que no sea mayor de 0,8, 0,7, 0,6 o 0,5. Los métodos y aparatos establecidos en la presente memoria son particularmente útiles cuando se produce la detección a través de un objetivo que tiene una NA entre 0,2 y 0,5.
En realizaciones de detección de matriz, un aparato de detección (o microfluorómetro individual) puede configurarse para obtener una imagen digital de la matriz. Típicamente, cada píxel del aparato de detección digital (o microfluorómetro individual) recogerá la señal de no más de una característica única en cualquier adquisición de imágenes dada. Esta configuración minimiza la “pendiente cruzada” no deseada entre las características en la imagen. El número de píxeles que detectan la señal de cada característica se puede ajustar en base al tamaño y la forma de las características de las que se forman imágenes y según la configuración del aparato de detección digital (o microfluorómetro individual). Por ejemplo, cada característica puede detectarse en una imagen dada en no más de aproximadamente 16 píxeles, 9 píxeles, 4 píxeles o 1 píxel. En realizaciones particulares, cada imagen puede utilizar un promedio de 6,5 píxeles por característica, 4,7 píxeles por característica o 1 píxel por característica. El número de píxeles utilizados por característica puede reducirse, por ejemplo, reduciendo la variabilidad en la posición de las características en el patrón de la matriz y ajustando la tolerancia para la alineación del aparato de detección a la matriz. Tomando como ejemplo un detector digital que está configurado para usar menos de 4 píxeles por característica, la calidad de imagen puede mejorarse mediante el uso de una matriz de características de ácido nucleico ordenadas en lugar de una matriz de agrupaciones de ácido nucleico distribuidas aleatoriamente.
Se entenderá que un aparato de detección que tiene múltiples microfluorómetros puede detectar un área de un plano común que es aproximadamente equivalente al número de microfluorómetros multiplicado por el área de campo amplio detectada por cada microfluorómetro. No es necesario que las áreas sean contiguas. Por ejemplo, pueden colocarse 2 o más microfluorómetros para detectar regiones discretas de un plano común que están separados por un área no detectada. Sin embargo, si se desea, pueden colocarse múltiples microfluorómetros para detectar áreas que son contiguas, pero no superpuestas. En realizaciones alternativas, un aparato de detección que tiene múltiples microfluorómetros puede detectar un área de un plano común que es sustancialmente menor que el número de microfluorómetros multiplicado por el área de campo amplio detectada por cada microfluorómetro. Esto puede suceder, por ejemplo, cuando múltiples microfluorómetros están posicionados para detectar áreas que tienen al menos una superposición parcial. Como se establece con más detalle en otra parte en la presente descripción, no es necesario adquirir múltiples imágenes en un formato que se use o que incluso soporta la reconstrucción de una imagen completa de una matriz u otro plano común que se ha detectado.
Una disposición óptica ilustrativa para un microfluorómetro 100 se muestra en la Figura 2. El microfluorómetro 100 está dirigida a una celda de flujo 170 que tiene una capa superior 171 y una capa inferior 173 que están separados por un canal lleno de fluido 175. En la configuración mostrada, la capa superior 171 es ópticamente transparente y el microfluorómetro 100 se enfoca a un área 176 en la superficie interior 172 de la capa superior 171. En una configuración alternativa, el microfluorómetro 100 se puede enfocar en la superficie interior 174 de la capa inferior 173. Una o ambas superficies pueden incluir características de matriz que deben detectarse por el microfluorómetro 100.
El microfluorómetro 100 incluye un objetivo 101 que está configurada para dirigir radiación de excitación desde una fuente de radiación 102 a la celda de flujo 170 y para dirigir la emisión desde la celda de flujo 170 a un detector 108. En el diseño ilustrativo, la radiación de excitación de la fuente de radiación 102 pasa a través de una lente 105 a continuación, aunque un divisor de haz 106 y luego a través del objetivo de su manera a la celda de flujo 170. En la realización mostrada, la fuente de radiación incluye dos diodos emisores de luz (LED) 103 y 104, que producen radiación a diferentes longitudes de onda entre sí. La radiación de emisión de la celda de flujo 170 es capturada por el objetivo 101 y es reflejada por el divisor de haz a través de la óptica de acondicionamiento 107 y al detector 108 (p. ej., un sensor CMOS). El divisor de haz 106 funciona para dirigir la radiación de emisión en una dirección ortogonal a la trayectoria de la radiación de excitación. La posición del objetivo puede moverse en la dimensión z para alterar el foco del microfluorómetro. El microfluorómetro 100 puede moverse hacia adelante y hacia atrás en la dirección y para capturar imágenes de varias áreas de la superficie interior 172 de la capa superior 171 de la celda de flujo 170.
La Figura 3 muestra una vista despiezada de un microfluorómetro ilustrativo para fines de demostrar la disposición funcional para diversos componentes ópticos. Se muestran dos fuentes de excitación, que incluyen un LED verde (LEDG) y un LED rojo (LEDR). La luz de excitación de cada pase a través de una lente de colector de LED verde (L6) y la lente de colector de LED rojo (L7), respectivamente. Un espejo de pliegue LED (M1) refleja la radiación de excitación verde a un dicroico combinador (F5) que refleja la radiación de excitación verde a través de un filtro de excitación (F2), luego a través de un divisor de haz de diodo láser (F3), luego a través de un tope de campo de excitación (FS), luego a través de un grupo de lentes de proyección de excitación L2 a una excitación/emisión dicroico (F4) que refleja la radiación de excitación verde a través de un grupo de lentes objetivo estacionario (L3) y un grupo de lentes objetivo de traslación (L4) a la superficie de una celda de flujo (FC). La radiación de excitación roja pasa desde la lente colectora de LED roja (L7) al dicroico combinador (F5) después de lo cual la radiación de excitación roja sigue la misma ruta que la radiación de excitación verde a la superficie de la celda de flujo (FC). Como se muestra en la figura, el enfoque se acciona moviendo el grupo de lentes objetivo de traslación (L4) hacia arriba y hacia abajo (es decir, a lo largo de la dimensión z). La emisión de la superficie de la celda de flujo (FC) pasa a través del grupo de lentes objetivo de traslación (L4), y luego a través del grupo de lentes objetivo estacionario (L3) a la dicroica de excitación/emisión (F4) que pasa por la radiación de emisión al grupo de proyección de emisión (L1) a través del filtro de emisión y luego al sensor de imagen CMOS (S1). Un diodo láser (LD) también se dirige a través de un grupo de lentes de acoplamiento de diodo láser (L5) al divisor de haz de diodo láser (F3) que refleja la radiación de diodo láser a través del tope de campo de excitación (FS), el grupo de lentes de proyección de excitación (L2), el dicroico de excitación/emisión (F4), el grupo de lentes de objetivo estacionario (L3) y el grupo de lentes objetivo de traslación (L4) a la celda de flujo (FC).
Como se demuestra en las modalidades ilustrativas de la Figura 2 y Figura 3 , cada uno de los microfluorómetros puede incluir un divisor de haz y un detector, en donde el divisor de haz se coloca para dirigir la radiación de excitación desde una fuente de radiación de excitación al objetivo y para dirigir la radiación de emisión desde el objetivo al detector. Como se muestra en las figuras, cada microfluorómetro puede incluir opcionalmente una fuente de radiación de excitación tal como un LED. En este caso, cada microfluorómetro puede incluir una fuente de radiación dedicada, de manera que la cabeza de lectura incluye varias fuentes de radiación separadas cada una en microfluorómetros individuales. En algunas realizaciones, dos o más microfluorómetros pueden recibir radiación de excitación de una fuente de radiación común. Como tales, los dos o más microfluorómetros pueden compartir una fuente de radiación. En una configuración ejemplar, una única fuente de radiación puede dirigir la radiación a un divisor de haz que se coloca para separar la radiación de excitación en dos o más haces y dirige los haces a dos o más microfluorómetros respectivos. Adicional o alternativamente, la radiación de excitación puede dirigirse desde una fuente de radiación a uno, dos o más microfluorómetros a través de una o más fibras ópticas.
Se entenderá que los componentes particulares mostrados en las figuras son ejemplares y pueden reemplazarse con componentes de función similar. Por ejemplo, puede usarse cualquiera de una variedad de fuentes de radiación en lugar de un LED. Las fuentes de radiación particularmente útiles son lámparas de arco, láseres, fuentes de luz semiconductores (SLS) o diodos láser. Los LED pueden adquirirse, por ejemplo, de Luminus (Billerica, Mass). De manera similar, una variedad de detectores son útiles que incluyen, pero no se limitan a, un sensor de dispositivo de carga acoplada (CCD); tubos fotomultiplicadores (PMT); o sensor complementario de semiconductor de óxido metálico (CMOS). Un detector particularmente útil es un sensor CMOS de 5 megapíxeles (MT9P031) comercializado por Aptina Imaging (San José, CA).
La Figura 2 y Figura 3 muestran realizaciones ejemplares de un microfluorómetro que incluye dos fuentes de excitación. Esta configuración es útil para detectar al menos dos fluoróforos que se excitan en diferentes longitudes de onda, respectivamente. Si se desea, un microfluorómetro se puede configurar para incluir más de dos fuentes de excitación. Por ejemplo, un microfluorómetro puede incluir al menos 2, 3, 4 o más fuentes de excitación diferentes (es decir, fuentes que producen diferentes longitudes de onda entre sí). De forma alternativa o adicional, se pueden usar divisores de haz y filtros ópticos para expandir el intervalo de longitudes de onda de excitación disponibles de una fuente de radiación individual. Se puede hacer un uso similar de múltiples fuentes de radiación y/o filtrado óptico de rayos de excitación divididos para realizaciones donde varios microfluorómetros comparten excitación de una o más fuentes de radiación. Como se establece con más detalle en otra parte en la presente descripción, la disponibilidad de múltiples longitudes de onda de excitación es particularmente útil para aplicaciones de secuenciación que utilizan varias etiquetas de fluoróforo diferentes.
La Figura 4 muestra una disposición ejemplar de cuatro microfluorómetros en una única cabeza de lectura 150. Los cuatro microfluorómetros están dispuestos en un diseño escalonado con respecto a los canales 161 y 162 de una celda de flujo 160. En la disposición mostrada, dos de los microfluorómetros (correspondientes a detectores 108a y 108c) se configuran para obtener imágenes de regiones separadas de un primer canal 161 y los otros dos microfluorómetros (correspondientes a detectores 108b y 108d) se configuran para obtener imágenes de regiones separadas de un segundo canal 162. Como se muestra, los microfluorómetros (correspondientes a los detectores 108a y 108c) se escalonan con respecto a los microfluorómetros (correspondientes a los detectores 108b y 108d) en la dimensión x de manera que los dos pares de microfluorómetros pueden detectar los canales adyacentes 161 y 162 respectivamente. Los microfluorómetros tienen cada uno una ruta ortogonal de emisión y excitación (como se muestra en la Figura 2) con las fuentes de radiación 102 colocado en el mismo lado del cabezal de lectura, opuesto a la celda de flujo 160. Dos de los detectores 108a y 108c se colocan en un primer lado del cabezal de lectura y los otros dos detectores 108b y 108d se colocan en el lado opuesto, ambos lados son ortogonales al lado donde se colocan las fuentes de excitación. En la realización ilustrativa mostrada en la Figura 4 las cuatro fuentes de radiación están en contacto térmico con un único disipador de calor grande 120. Un único disipador de calor grande proporciona un mayor grado de disipación de calor que muchas configuraciones que usan un disipador de calor individual para cada fuente de radiación. Sin embargo, si las fuentes de radiación individuales deseadas se pueden acoplar térmicamente a disipadores de calor individuales (véase, por ejemplo, la Figura 8 y la descripción relacionada a continuación). Una ventaja de la disposición de los microfluorómetros mostrados en la Figura 4 es la provisión de un cabezal de lectura compacta. Se pueden derivar ventajas similares para realizaciones donde se intercambian las posiciones relativas de la fuente de excitación y el detector en cada microfluorómetro (véase, por ejemplo, la Figura 8 y la descripción relacionada a continuación).
La cabeza de lectura 150 mostrado en la Figura 4 se coloca para explorar en la dimensión y. La dimensión y es paralela a la longitud de la celda de flujo 160 de tal manera que el movimiento del cabezal de lectura 150 en una operación de escaneo dará como resultado la formación de imágenes de áreas a lo largo de la longitud de la celda de flujo 160. Los detectores 108a, 108b, 108c y 108d se colocan en lados opuestos del cabezal de lectura 150, y en lados opuestos de la celda de flujo 160, los lados de la celda de flujo que se extienden a lo largo de la dirección de escaneo. La orientación del cabezal de escaneo 150 con respecto a la celda de flujo 160 y la dirección de barrido es ilustrativa. Otras orientaciones también son útiles, incluyendo, por ejemplo, la orientación que se muestra en la Figura 13 en donde los detectores se colocan en lados opuestos del cabezal de lectura pero en una posición hacia adelante y hacia atrás con respecto a la dirección de escaneo.
Un microfluorómetro, o cabezal de lectura que tiene varios microfluorómetros, puede colocarse por encima de una celda de flujo (con respecto a la flecha de gravedad) como se ejemplifica para varias modalidades expuestas en la presente descripción. Sin embargo, también es posible colocar un microfluorómetro, o un cabezal de lectura, debajo de una celda de flujo. Por consiguiente, una celda de flujo puede ser transparente en el lado superior, lado inferior o ambos lados con respecto a las longitudes de onda de la excitación y radiación de emisión usada. De hecho, en algunas realizaciones puede ser deseable colocar microfluorómetros en ambos lados de una celda de flujo o para colocar cabezas de lectura en ambos lados de una celda de flujo. También son posibles otras orientaciones con respecto a la gravedad, que incluyen, por ejemplo, una orientación lateral a lateral entre una celda de flujo y un microfluorómetro (o cabezal de lectura).
Se puede configurar un microfluorómetro o cabezal de lectura para detectar las dos superficies internas opuestas de una celda de flujo desde un solo lado de la celda de flujo. Por ejemplo, el microfluorómetro o el cabezal de lectura pueden emplear un compensador óptico que se inserta y se retira para detectar superficies alternativas de la celda de flujo. Los métodos y aparatos ilustrativos para detectar superficies interiores opuestas de una celda de flujo tal como el uso de compensadores ópticos se describen en el documento US 8.039.817. Un compensador es opcional, por ejemplo, dependiendo de la NA y/o la resolución óptica del aparato.
Un microfluorómetro usado en un aparato o método expuesto en el presente documento incluye un módulo de enfoque automático. Por consiguiente, múltiples microfluorómetros que están presentes en un cabezal de lectura tienen cada uno un módulo de enfoque automático dedicado. Un módulo de enfoque automático ilustrativo 1600 se muestra en la Figura 5. El módulo incluye un receptáculo 1602 para un objetivo de un microfluorómetro (por ejemplo, la lente de objetivo de traslación mostrada en Figura 3). El receptáculo 1602 se fija a un soporte deslizante 1603 que tiene un brazo de palanca 1604. El brazo de palanca 1604 interactúa funcionalmente con un motor 1610 que está configurado para mover el brazo de palanca hacia arriba y hacia abajo (a lo largo de la dirección z). Como tal, el motor 1610 activa el movimiento del objetivo en la dirección z para alterar el foco. El motor 1610 es un actuador lineal que usa un tornillo principal. La rotación de un tornillo principal interno bajo fuerza de rotación del motor provoca que la tuerca principal 1613, a través de la cual se enrosca el tornillo principal, su mueva hacia arriba y hacia abajo. La tuerca principal 1613 se coloca entre dos cojinetes 1611a y 1611b. El movimiento de la tuerca de avance se desvía contra el resorte 1608. La tuerca principal 1613 está en contacto físico con el brazo de palanca 1604 de tal manera que el movimiento hacia arriba y hacia abajo de la tuerca de avance acciona el movimiento hacia arriba y hacia abajo del soporte deslizante 1603 y, en consecuencia, el objetivo. Un sensor 1609 está situado en el lado inferior del módulo de enfoque automático separado del accionador por un separador 1612.
El módulo de enfoque automático 1600 mostrado en la Figura 5 incluye además un soporte estructural que tiene un cuerpo lateral 1607 conectado a un plano posterior 1614 y conectarse a una flexión superior 1606 y una flexión inferior 1605. La rigidez puede proporcionarse mediante la estructura de marco de la caja del cuerpo lateral 1607. La rigidez adicional es proporcionada por dos soportes de triángulo 1615a y 1615b entre el cuerpo lateral 1607 y plano posterior 1614. Los flexiones 1606 y 1605 puede moldearse conjuntamente con el soporte deslizante para proporcionar alta tolerancia entre el soporte deslizante 1603 y cuerpo lateral 1607.
Como se muestra en la modalidad ilustrativa de la Figura 5, un módulo de enfoque automático que se usa en un microfluorómetro puede incluir un detector y un actuador, en donde el actuador está configurado para alterar el foco del microfluorómetro con respecto al plano común, y en donde el detector está configurado para dirigir el movimiento del actuador. Como tal, un módulo de enfoque automático puede incluir un detector dedicado que dirige el movimiento del actuador. El detector dedicado puede funcionar en un bucle cerrado con el actuador sin necesidad de comunicar datos fuera del microfluorómetro o fuera del cabezal de detección para lograr un enfoque automático. Alternativa o adicionalmente, un detector fuera del módulo de enfoque automático, tal como el detector de imágenes que se usa para la formación de imágenes de campo amplio, puede dirigir el movimiento del actuador. Por lo tanto, el mismo detector que se usa para la formación de imágenes de campo amplio y para emitir datos de imagen a una unidad de procesamiento fuera del microfluorómetro o la cabeza de lectura también se puede usar para lograr un enfoque automático.
En realizaciones particulares, los módulos de enfoque automático para dos o más microfluorómetros en un cabezal de lectura pueden configurarse para comunicarse entre sí. Por ejemplo, un módulo de enfoque automático para un primer microfluorómetro de un cabezal de lectura está configurado para integrar datos de un módulo de enfoque automático para un segundo microfluorómetro del aparato. De esta manera, el módulo de enfoque automático para el primer microfluorómetro altera el foco del primer microfluorómetro basándose en la posición de foco percibida del primer microfluorómetro y la posición de foco percibida del segundo microfluorómetro. Por lo tanto, un detector para un módulo de enfoque automático puede configurarse de manera que esté dedicado a enfocar generalmente a través de un cabezal de lectura mientras no está configurado para la adquisición de imágenes analíticas. La información de dos módulos de enfoque automático diferentes puede ser útil para determinar la inclinación de la punta del cabezal de lectura. La inclinación de la punta no deseable se puede corregir mediante un accionamiento compensatorio de uno o más microfluorómetros en base a la información de inclinación de la punta.
Aunque se ha ejemplificado un enfoque automático con respecto a un motor de tornillo principal, se entenderá que se pueden usar módulos de enfoque automático que usan otras modalidades de accionamiento que incluyen, por ejemplo, aquellas que usan un motor piezo o motor de bobina de voz en lugar del motor de tornillo principal ejemplificado anteriormente.
Un cabezal de lectura puede incluir dos o más microfluorómetros, por ejemplo, unidos a un carro. Para realizaciones que utilizan una celda de flujo multicanal, el cabezal de lectura puede incluir un número de microfluorómetros que corresponden al número de canales en la celda de flujo. Como se demuestra previamente por el ejemplo de la Figura 4 , puede estar presente más de un microfluorómetro por canal de celda de flujo. En realizaciones particulares, un cabezal de lectura puede proporcionar un solo microfluorómetro por canal de flujo. En la disposición ilustrativa mostrada en la Figura 6, la celda de flujo tiene cuatro canales y el cabezal de lectura tiene cuatro microfluorómetros. La figura muestra una vista en planta superior de la celda de flujo y objetivos de los microfluorómetros. Para facilitar la demostración, no se muestran los componentes de los microfluorómetros distintos de los objetivos; sin embargo, esos componentes se pueden colocar para lograr un diseño compacto, por ejemplo, a lo largo de las líneas ejemplificadas en otra parte del presente documento. Como se muestra en el panel A de Figura 6 , los cuatro objetivos pueden disponerse en una relación lineal de manera que los objetivos estén estrechamente empaquetados y una línea recta imaginaria pasa a través del punto central de cada objetivo. La línea imaginaria puede desplazarse en un ángulo con respecto a la dimensión y, la dimensión y correspondiente a la dimensión más larga de la celda de flujo (o dirección de barrido). El ángulo puede estar entre 0° y 90° en el cuadrante x-y y puede seleccionarse para acomodar la separación de los canales en la celda de flujo (y el espaciado de los objetivos en el cabezal de lectura). La Figura 6A muestra un ángulo relativamente bajo de desplazamiento para una línea que pasa a través de objetivos estrechamente compactados que reciben canales relativamente empaquetados. Se puede usar un ángulo de desplazamiento más alto para acomodar canales que están separados por mayores distancias entre sí u objetivos que se empaquetan menos estrechamente.
El panel B de la Figura 6 muestra una disposición de múltiples objetivos en dos líneas. Aquí, la celda de flujo incluye ocho canales y la cabeza de lectura tiene ocho microfluorómetros. El empaquetamiento general de los objetivos en las dos líneas es aproximadamente rectilíneo. La disposición acomoda objetivos estrechamente compactados y dos conjuntos de canales estrechamente empaquetados (es decir, un primer conjunto de cuatro canales estrechamente empaquetados y un segundo conjunto de cuatro canales estrechamente empaquetados). En este ejemplo, los dos conjuntos de canales estrechamente empaquetados están separados por un espaciado mayor que el espacio que separa los canales individuales en cada conjunto de cuatro. Se entenderá que el empaquetamiento general de los objetivos en las dos líneas puede desplazarse de rectilíneas para acomodar diferentes disposiciones de canal. Además, como se establece con respecto a una sola línea de objetivos, el ángulo de desplazamiento de la línea imaginaria que discurre a través de los centros de ambas líneas de objetivos puede alterarse y/o la distancia entre los objetivos se puede alterar para acomodar diferentes disposiciones de canal.
La Figura 7 muestra una disposición de múltiples objetivos en los que una línea imaginaria que discurre a través de los centros de los objetivos está en un ángulo de 90° con respecto a la dimensión más larga de la celda de flujo (o dirección de barrido). La línea imaginaria se extiende a lo largo del eje x. En este ejemplo, los objetivos están en dos filas y están empaquetados hexagonalmente. El empaquetamiento Hexagonal proporciona la ventaja de la compactación máxima en el plano x-y. El cabezal de lectura se muestra con seis objetivos y la celda de flujo tiene seis canales. Se entenderá que se pueden usar disposiciones similares para un cabezal de lectura que tiene solo cuatro objetivos o para cabezas de lectura que tienen más de seis objetivos (por ejemplo, ocho objetivos como se muestra en la Figura 8, Figura 9 y Figura 13). Como es evidente por comparación visual, los canales de celda de flujo están separados más en la disposición de la Figura 7 que en la disposición de la Figura 6. Sin embargo, la separación de los canales en ambos casos está dentro de un intervalo útil y conveniente, por ejemplo, para aplicaciones de secuenciación de ácido nucleico.
Como se demuestra por los ejemplos de la Figura 6 y la Figura 7, cada objetivo en un cabezal de lectura puede colocarse para obtener imágenes de al menos una parte de un canal de flujo individual. Cada objetivo puede colocarse a la imagen uno y solo un canal de una celda de flujo que tiene varios canales. Un objetivo individual puede colocarse para obtener imágenes de una parte de uno y solo un canal, por ejemplo, cuando se ubica en una posición de etapa y particular. El barrido en la dimensión y puede permitir que toda o parte del canal se forme imágenes a través del objetivo. En algunos casos, por ejemplo, cuando el diámetro de campo del objetivo (u otros componentes ópticos limitantes de un microfluorómetro) es menor que el ancho del canal, el objetivo también puede escanearse en la dimensión x para obtener imágenes de todo o parte del canal. Se pueden colocar múltiples objetivos y sus respectivos microfluorómetros de manera que varios de los objetivos se coloquen para obtener imágenes para al menos una parte de uno y solo un canal. Por supuesto, el movimiento de un cabezal de lectura que contiene los objetivos múltiples y sus respectivos microfluorómetros puede producirse en la dirección y y/o x para obtener imágenes de todo o parte de cada canal respectivo. Estas configuraciones particulares son útiles para las celdas de flujo multicanal como se ejemplifica anteriormente. Sin embargo, se entenderá que las configuraciones y principios subyacentes expuestos anteriormente se pueden aplicar a una disposición apropiada de varias celdas de flujo individuales, cada una con un solo canal. Además, como es el caso generalmente para los métodos y aparatos establecidos en la presente memoria, las disposiciones se pueden aplicar a sustratos distintos de las celdas de flujo.
Vista en perspectiva de un cabezal de lectura 1000 que tiene una disposición de ocho microfluorómetros se muestra en la Figura 8. Cada microfluorómetro tiene un diseño compacto similar al mostrado en la Figura 3. Para facilitar la demostración, los componentes de solo uno de los microfluorómetros están etiquetados en la Figura 8 y se describirá aquí. Sin embargo, como es visible en la Figura 8, cada uno de los microfluorómetros tiene componentes y configuraciones similares. Dos fuentes de excitación están presentes en cada microfluorómetro, incluyendo un LED verde 1040 y un LED rojo 1030. La luz de excitación de los LED pasa a través de una lente de colector de LED verde 1075 y lente colectora de LED roja 1076, respectivamente. Un espejo de pliegue LED 1074 refleja la radiación de excitación verde a un combinador del combinador 1073 que refleja la radiación de excitación verde a través de un divisor de haz de diodos láser 1072, a continuación a través de una lente de proyección de excitación 1071 a una dicroica de excitación/emisión 1060 que refleja la radiación de excitación verde a través de un objetivo 1010. La radiación de excitación roja pasa de la lente colectora de LED roja 1076 al combinador dicroico 1073, después de lo cual la radiación de excitación roja sigue la misma ruta que la radiación de excitación verde. El objetivo 1010 se coloca para recoger radiación de emisión y dirigirlo a través de la dicroica de excitación/emisión 1060 que pasa la radiación de emisión al sensor de imagen CMOS 1080. Un diodo láser 1301 se coloca para dirigir la radiación a través de un grupo de lentes de acoplamiento de diodo láser 1401 al divisor de haz de diodos láser 1072 lo que refleja la radiación de diodo láser a través de la lente de proyección de excitación 1071, la dicroica de excitación/emisión 1060, y el objetivo 1010. Módulo de enfoque automático 1600 está acoplado al menos a parte del objetivo 1010 y configurado para desplazar el objetivo 1010 arriba y abajo (es decir, a lo largo de la dimensión z). El módulo de enfoque automático puede, pero no es necesario, incluir componentes del aparato de enfoque automático ejemplificado en la Figura 5. Se entenderá que pueden estar presentes componentes ópticos adicionales en la cabeza de lectura 1000 incluyendo, pero sin limitación, los ilustrados en la Figura B. Además, ciertos componentes ópticos pueden estar ausentes del cabezal de lectura 1000 o modificado en la cabeza de lectura 1000 para adaptarse a aplicaciones particulares. Los tableros de circuito impreso 1701 y 1702 pueden configurarse para comunicarse con los detectores, módulos de enfoque automático y/o fuentes de excitación.
La Figura 9 muestra una vista en planta inferior del cabezal de lectura 1000. Nuevamente para facilitar la demostración, los componentes de solo uno de los microfluorómetros se etiquetan en la Figura 9 y se describe en la presente descripción. El LED rojo 1030 se muestra en comunicación térmica con sumidero de calor 1201 y en alineación óptica con la lente colectora del LED rojo 1076. El LED verde es oculto por el LED rojo 1030 y la mayoría de la trayectoria de excitación está oculta por el módulo de enfoque automático 1600 en esta vista. El objetivo 1010 es visible como una parte del sensor de imagen CMOS 1080; sin embargo, la mayor parte de la trayectoria de emisión está oculta en esta vista. Como es evidente a partir de las figuras, los objetivos se disponen en dos filas y se empaquetan hexagonalmente.
Las configuraciones descritas anteriormente ejemplifican un cabezal de lectura en donde cada uno de los microfluorómetros incluye al menos una fuente de radiación, un divisor de haz y un detector, en donde el divisor de haz está colocado para dirigir la radiación de excitación desde la fuente de radiación de excitación al objetivo y para dirigir la radiación de emisión desde el objetivo al detector, en donde la radiación de excitación y la radiación de emisión se dirigen en direcciones mutuamente ortogonales. En las modalidades, ejemplificadas en la Figura 8 y Figura 9 los detectores para varios microfluorómetros están dispuestos en un primer lado del cabezal de lectura que está opuesto al plano común al que se enfocan los objetivos, un subconjunto de las fuentes de radiación está dispuesto en un segundo lado del cabezal de lectura (el segundo lado es ortogonal al primer lado y ortogonal al plano común) y un segundo subconjunto de las fuentes de radiación está dispuesto en un tercer lado del cabezal de lectura (el tercer lado está opuesto al segundo lado, ortogonal al primer lado y ortogonal al plano común). Como alternativa, y como se ilustra en la Figura 4 , las fuentes de radiación para varios microfluorómetros están dispuestas en un primer lado del cabezal de lectura que está enfrente del plano común al que se enfocan los objetivos, un primer subconjunto de los detectores está dispuesto en un segundo lado del cabezal de lectura (el segundo lado es ortogonal al primer lado y ortogonal al plano común) y el segundo subconjunto de los detectores está dispuesto en un tercer lado del carro (el tercer lado está opuesto al segundo lado, ortogonal al primer lado y ortogonal al plano común).
Además de las realizaciones anteriores en las que las trayectorias de excitación y emisión son ortogonales, las configuraciones donde las trayectorias de emisión y excitación son paralelas también pueden ser útiles. En este caso, la(s) fuente(s) de radiación de excitación y el detector pueden estar presentes en el mismo lado del cabezal de lectura. Una disposición ilustrativa para un microfluorómetro 800 se muestra en la Figura 10, donde radiación de excitación de la fuente de excitación 805 pasa a través de óptica de excitación 806 a la superficie del prisma 807 lo que refleja la radiación de excitación a la superficie del prisma 802 que refleja la radiación de excitación a través del objetivo 801. La emisión pasa a través del objetivo 801, luego a través del divisor de haz 802 a la lente de proyección 803 y luego el detector 804. La ruta de emisión es paralela a gran parte de la ruta de excitación. El detector y la fuente de radiación de excitación están ubicados en el mismo lado del microfluorómetro, opuesto y paralelo al plano de detección. Una guía 810 se configura para interactuar con una celda de flujo o sustrato para alinear el objetivo. Se puede usar una guía similar en otros microfluorómetros establecidos en la presente descripción. El diseño para microfluorómetro 800 es un ejemplo con fines de demostrar una disposición paralela de trayectorias de excitación y emisión. Pueden incluirse otros componentes tales como los mostrados en otras figuras en el presente documento que incluyen, pero no se limitan a, un módulo de enfoque automático. Por ejemplo, una fuente de excitación 809 para un módulo de enfoque automático se muestra y produce excitación que pasa a través de la superficie del prisma 807 y se refleja por la superficie del prisma 802 para pasar a través del objetivo 801. Varios microfluorómetros 800 puede disponerse para tener objetivos en una o más líneas como se ilustra en la Figura 6 y Figura 7.
Como se demuestra por las realizaciones ejemplares anteriores, un cabezal de lectura puede incluir una pluralidad de objetivos, cada objetivo está dedicado a un solo microfluorómetro. Por lo tanto, un microfluorómetro de la presente divulgación puede incluir una variedad de componentes ópticos, tales como uno o más detectores, fuentes de radiación de excitación, lentes divisores de haz, espejos o similares, que forman un tren óptico que dirige la radiación de excitación a través de un solo objetivo y/o que recibe radiación de emisión a través de un solo objetivo. En tales modalidades, el objetivo puede configurarse como una macro lente que tiene un amplio campo de visión. En realizaciones alternativas, un microfluorómetro de la presente divulgación puede incluir una variedad de componentes ópticos que dirige la radiación de excitación a través de varios objetivos y/o que reciben radiación de emisión a través de varios objetivos. Por lo tanto, un microfluorómetro individual puede incluir varios trenes ópticos que incluyen varios objetivos. En realizaciones que incluyen varios objetivos por microfluorómetro, los objetivos pueden configurarse opcionalmente como una matriz de microlentes. Cada objetivo entre varios en un microfluorómetro particular (por ejemplo, cada microlente en una matriz de microlentes) puede configurarse opcionalmente para un enfoque independiente, por lo que cada objetivo puede moverse en la dimensión z independiente de otros objetivos en el mismo microfluorómetro. Alternativa o adicionalmente, los diversos objetivos pueden configurarse para el enfoque global de manera que todos puedan moverse juntos en la dimensión z.
Se entenderá que los diversos componentes de un cabezal de lectura que se exponen en la presente descripción pueden mezclarse y combinarse de varias formas para lograr una función similar a las ilustradas en la presente descripción. Por ejemplo, como se establece en el párrafo anterior, un cabezal de lectura puede incluir varios objetivos y cada uno de esos objetivos puede dedicarse a un solo microfluorómetro o, alternativamente, varios de esos objetivos pueden compartirse por un solo microfluorómetro. De manera similar, y como se expone anteriormente en el presente documento, cada microfluorómetro puede incluir al menos una fuente de excitación dedicada o, alternativamente, dos o más microfluorómetros pueden recibir radiación de excitación de una fuente de radiación compartida. Por lo tanto, no es necesario que una correspondencia entre el número de microfluorómetros en un cabezal de lectura particular y el número de componentes ejemplificados en este documento para cualquier realización microfluorómetro. En cambio, uno o más de los componentes ejemplificados en este documento como útiles en un microfluorómetro pueden compartirse por varios microfluorómetros en un cabezal de lectura particular.
Un cabezal de lectura de la presente descripción es particularmente útil para escanear métodos y aparatos, por ejemplo, debido a su tamaño relativamente compacto y una masa baja que proporciona baja inercia. La inercia reducida permite que la cabeza de lectura se apoye más rápidamente después del movimiento, permitiendo así que las imágenes de alta resolución se obtengan más rápidamente de lo que sería el caso de un cabezal de lectura de inercia más alta para el que el movimiento residual del cabezal leído causaría borrosidad y pérdida de resolución. Las configuraciones para lograr el movimiento de la cabeza de lectura se expondrán con más detalle a continuación. Sin embargo, en primer lugar, debe observarse que la ventaja de baja inercia, no pretende ser una limitación o requisito para un aparato o método expuesto en el presente documento. Más bien, un cabezal de lectura de la presente descripción puede mantenerse en una posición estática para todo o parte de un protocolo de detección. Por ejemplo, un procedimiento de secuenciación, tal como los que usan las etapas de fluido y de formación de imágenes expuestas en el presente documento, se puede llevar a cabo usando un cabezal de lectura que es estático durante al menos uno y quizás todos los ciclos del procedimiento de secuenciación.
Como primer ejemplo de una realización de cabezal de lectura estático, un cabezal de lectura puede incluir un número suficiente de microfluorómetros para detectar u obtener una imagen de una parte deseada de una superficie u otro objeto. Por lo tanto, la cabeza de lectura no necesita moverse en las dimensiones x o y. Por ejemplo, varios microfluorómetros pueden disponerse linealmente para capturar fotogramas de imagen a lo largo de toda la longitud (o al menos a lo largo de la longitud objetivo efectiva) de un canal de celda de flujo. De manera similar, usando una disposición de empaque apropiada de varias filas de microfluorómetros, tales como los establecidos en la presente descripción, se pueden formar imágenes de varios canales de celdas de flujo (presentes en una o más celdas de flujo) a lo largo de su longitud total (o al menos a lo largo de la longitud objetivo efectiva). Como se expone anteriormente en el presente documento, los fotogramas de imagen obtenidos para un canal individual pueden ser contiguos, pero no es necesario que lo sean.
Como un segundo ejemplo de una realización de cabezal de lectura estática, un cabezal de lectura puede permanecer en una posición fija con respecto a las dimensiones x e y mientras que un sustrato que es detectado por el cabezal de lectura se traslada en la dimensión x y/o y. Por ejemplo, se puede proporcionar un aparato que tenga una etapa de traslación que esté configurada para presentar un sustrato al cabezal de lectura. La etapa de traslación puede moverse en un movimiento de paso y brote o continuo para permitir el escaneo del sustrato por el cabezal de lectura estático. En realizaciones particulares, el sustrato es una celda de flujo que puede fijarse a la etapa de traslación. La celda de flujo puede traducirse como parte de un cartucho de fluidos, como los ejemplificados a continuación, o la celda de flujo puede trasladarse independientemente de cualquier cartucho de fluidos. Por lo tanto, la etapa de traslación puede configurarse para fijar un cartucho de fluidos al que está unida una celda de flujo y mover el cartucho de fluidos junto con la celda de flujo o la etapa de traslación puede configurarse para mover solo la celda de flujo mientras el cartucho de fluidos permanece en una posición estática o fija.
De acuerdo con los ejemplos anteriores, el movimiento relativo entre un cabezal de escaneo (o microfluorómetro) y un sustrato puede lograrse mediante el movimiento físico del cabezal de escaneo (o microfluorómetro), el movimiento físico del sustrato o el movimiento físico de ambos. Se entenderá que las cabezas de lectura estática a las que se hace referencia en las primera y segunda realizaciones ilustrativas anteriores no necesitan ser estáticas con respecto al movimiento en la dimensión z. Más bien, las cabezas de lectura estática pueden incluir uno o más microfluorómetros que tienen módulos de enfoque automático. Alternativa o adicionalmente, las cabezas de lectura pueden moverse en su conjunto en la dimensión z, por ejemplo, para lograr un foco global al menos a una aproximación aproximada.
Volviendo ahora a las realizaciones en las que se traslada un cabezal de lectura, la Figura 11 y Figura 12 muestran las vistas superior e inferior, respectivamente, de una etapa de traslación ilustrativa en el eje y 200 para un cabezal de lectura. En esta realización ejemplar, la etapa y está configurada para la traslación en la dimensión y, pero no en la dimensión x. Por lo tanto, un cabezal de lectura transportada por la etapa de traslación y 200 será capaz de moverse en la dimensión y el cabezal de lectura o microfluorómetros individuales en el mismo pueden ser capaces de moverse en la dimensión z (por ejemplo, mediante autoenfoque), pero el cabezal de lectura no será capaz de moverse en la dimensión x. Se puede fijar un cabezal de lectura al carro 201 que tiene un área base 241 colocado para soportar el lado inferior del cabezal de lectura y un bastidor 240 configurado para restringir el cabezal de lectura de un movimiento lateral a lado. El carro 201 incluye además una guía de brida 243 y una guía de collar 242. Una abertura 244 en el área base 241 proporciona una ventana entre un cabezal de lectura y un sustrato para ser detectado por el cabezal de lectura. Los componentes mencionados anteriormente del carro 201 puede formar una estructura monolítica.
El carro está configurado para moverse a lo largo de un marco de la etapa y 207 a través de un primer eje 203, a lo largo de la cual la guía de collar 242 y un segundo eje 204 a lo largo del cual la guía de brida 243. Los ejes están orientados a lo largo del eje y de manera que el carro 201 se dirige para deslizarse hacia adelante y hacia atrás a lo largo de la dimensión y a través de las guías. El primer eje 203 se mantiene al marco de la etapa y 207 por inserción en referencia 215 en una primera pared lateral 250 y en referencia 218 en una segunda pared lateral 251. El primer eje 203 se sujeta al datum 215 con el elemento de soporte 252 y se sujeta al datum 218 con el elemento de soporte 253. El segundo eje 204 se mantiene al marco de la etapa y 207 por inserción en referencia 214 en una primera pared lateral 250 y en referencia 217 en una segunda pared lateral 251. El primer eje 204 se sujeta al datum 214 con la pinza del eje 206 y se sujeta al datum 217 con la pinza del eje 205.
El movimiento del carro 201 se acciona mediante la rotación del tornillo principal 202 que se enrosca a través de una tuerca principal 260 y que está fijado al marco de la etapa y 207 por inserción en un datum sobre la primera pared lateral 250 y en un datum 219 en la segunda pared lateral 251. El tornillo de plomo 202 se sujeta en su lugar con los mismos miembros de soporte 252 y 253 que sujetan el primer eje 203. La rotación del tornillo principal 202 es accionada por el motor 212 que está montado en el miembro de soporte 252. Un codificador 208 se configura para interactuar con el motor 212 a través de una correa 210 que interactúa con el rotor 209 en el codificador y el rotor 211 en el motor 212. El tensor de correa 220 interactúa con la cinta 210.
Una abertura 230 pasa a través del suelo 216 del marco de fase y 207. La abertura 230 se coloca para acomodar la trayectoria de la abertura 244 en el área base 241 del carro 201 a medida que atraviesa el marco de la etapa y. Un cabezal de lectura se coloca en el carro de manera que los objetivos se dirigen a través de la abertura 244 y a través de la abertura 230 a lo largo de una trayectoria atravesada por el carro. Por consiguiente, la abertura 230 acomoda la formación de imágenes de un área alargada a lo largo del eje y mediante el movimiento de un cabezal de lectura fijada al carro.
La relación estructural y funcional entre la etapa de traslación y 200 y el cabezal de lectura 1000 se muestra en la Figura 13. La orientación de los objetivos 1010 con respecto a la dirección de escaneo de la etapa de traslación y 200 es similar al ejemplificado en la Figura 7 (excepto que el cabezal de lectura 1000 tiene dos objetivos adicionales). Se puede orientar una celda de flujo con respecto a la etapa de traslación y 200 como se muestra en la Figura 7.
Como se ilustra anteriormente, un carro puede configurarse para mover un cabezal de lectura, por ejemplo, en una operación de escaneo. Alternativa o adicionalmente, un carro se puede configurar para evitar el movimiento relativo entre los microfluorómetros individuales de un cabezal de lectura en las dimensiones x e y. Un carro no necesita proporcionar esta función, por ejemplo, si la cabeza de lectura incluye otros elementos de estructura que impiden el movimiento transversal relativo entre microfluorómetros individuales, por ejemplo, un cabezal de lectura puede formarse a partir de un conjunto comoldeado. El conjunto comoldeado se puede fijar a su vez a un carro. No obstante, en algunas realizaciones, el carro puede desempeñar al menos un papel auxiliar en la prevención del movimiento transversal relativo entre los microfluorómetros individuales de un cabezal de lectura. Además, se entenderá que un cabezal de lectura que se forma a partir de un conjunto comoldeado puede usarse para realizaciones que no emplean un carro.
Cualquier etapa que se use en un método o aparato expuesto en la presente descripción puede configurarse para escanear a través de un movimiento discontinuo o continuo. El escaneo continuo, a menudo denominado escaneo de paso y cierre, generalmente implica el movimiento incremental de un microfluorómetro o cabezal de escaneo en la dirección y (o x) y detección (por ejemplo, adquisición de imágenes) entre movimientos, mientras que el microfluorómetro o cabezal de escaneo está en un estado temporalmente estático. El escaneo continuo por otro lado generalmente implica la detección o la adquisición de imágenes mientras el microfluorómetro o el cabezal de escaneo se mueven. En una realización particular, la exploración continua puede llevarse a cabo en modo de integración de retardo de tiempo (TDI). En consecuencia, la señal obtenida por elementos de píxeles a lo largo de la dimensión de escaneo puede recogerse en un contenedor común y leerse como un solo valor. El modo TDI puede proporcionar ventajas de mayor velocidad de procesamiento de señal y mayor precisión. Las disposiciones ópticas ejemplares que pueden incluirse en un microfluorómetro o la cabeza de lectura para acomodar la detección del modo TDI se describen, por ejemplo, en el documento US 7.329.860.
El movimiento de un microfluorómetro o cabezal de barrido en una dimensión x o y, por ejemplo, para acomodar modalidades de barrido continuo o discontinuo, puede controlarse mediante un codificador u otro dispositivo. En el ejemplo de la etapa y 200, el movimiento puede controlarse mediante el codificador 208. Como se ha expuesto anteriormente en el presente documento, el escaneo (ya sea por técnicas continuas o discontinuas) puede dar como resultado la adquisición de tramas contiguas o no contiguas de un sustrato u otro objeto bajo detección. Por lo tanto, la suma total de porciones que se forman imágenes por escaneo puede ser contigua (pero no superposición), no contigua o superposición. El sistema no necesita configurarse para obtener imágenes de todo el sustrato u objeto (por ejemplo, superficie de la matriz) y no necesita hacerlo de una manera que permita producir una imagen compuesta.
Se muestra un diagrama de bloques eléctrico para un aparato de detección en la Figura 14. Una placa de circuito impreso (PCB) de lectura está presente en un cabezal de lectura (véase, por ejemplo, PCB 1701 y 1702 en la Figura 8) y está conectada a una PCB principal que está contenida típicamente dentro de la carcasa del aparato de detección. En realizaciones alternativas, la PCB principal puede ubicarse fuera del instrumento. Los datos pueden comunicarse entre al PCB de lectura y la PCB principal a través de la línea LVDS. Por ejemplo, se puede usar un cable flexible plano (FFC) de 0,5 mm de paso, de 36 hilos para la línea de LVDS. La línea LVDS puede configurarse para comunicar datos de imagen desde la PCB de lectura a la PCB principal, e instrucciones de control de cámara desde la PCB principal hasta la PCB de lectura. Las dos placas de circuito impreso también están conectadas por una línea de alimentación, como un FFC de 30 hilos y 1 mm de paso con soporte de cobre que transmite energía desde una fuente de alimentación de 24 voltios a través de la placa de circuito impreso principal. Las conexiones FFC están configuradas para tener suficiente longitud y flexibilidad para permitir que la PCB de lectura se mueva con la cabeza de lectura mientras que la PCB principal permanece estacionaria.
En el ejemplo de la Figura 14, la PCB principal también está conectada a un ordenador personal (PC) de análisis primario exterior a través de conectores I/F de USB 3.0. En algunas realizaciones, el ordenador de análisis primario puede ubicarse dentro del alojamiento del aparato de detección. Sin embargo, la colocación del ordenador de análisis primario fuera del instrumento permite usar el uso intercambiable de una variedad de ordenadores para diferentes aplicaciones, el mantenimiento conveniente del ordenador de análisis primario mediante reemplazo sin tener que interrumpir la actividad del aparato de detección y la huella pequeña para el aparato de detección. Puede usarse cualquiera de una variedad de ordenadores que incluyen, por ejemplo, un ordenador de sobremesa, un ordenador portátil o un servidor que contiene un procesador en comunicación operativa con memoria accesible e instrucciones para la implementación de los métodos implementados por ordenador descritos en el presente documento. La PCB principal también está conectada a una pantalla de cristal líquido (LCD) para la comunicación a un usuario humano. También pueden usarse otras interfaces de usuario.
En algunas realizaciones, una interfaz de usuario puede incluir una pantalla (por ejemplo, una LCD) para visualizar o solicitar información de un usuario y un dispositivo de entrada de usuario (por ejemplo, un teclado) para recibir entradas de usuario. En algunas realizaciones, la pantalla y el dispositivo de entrada del usuario son el mismo dispositivo. Por ejemplo, la interfaz de usuario puede incluir una pantalla táctil configurada para detectar el toque de un usuario y también identificar la ubicación del toque en la pantalla. Sin embargo, se pueden utilizar otros dispositivos de entrada de usuario, tales como un ratón, un panel táctil, un teclado numérico, un escáner de mano, un sistema de reconocimiento de voz, un sistema de reconocimiento de movimiento y similares.
La PCB de lectura incluye ocho transmisores DS90CR217 para transferir datos de sensores individuales (es decir, detectores) a la línea LVDS, un regulador de conmutación de 3,3 voltios, un regulador de conmutación de 5 voltios y unidades buck de LED para las fuentes de radiación de excitación LED.
La PCB principal incluye un FPGA procesador configurado para aceptar datos de imagen del LVDS. Un tampón de trama DDR3 DIMM se conecta electrónicamente al FPGA procesador. La PCB principal también incluye un regulador de control térmico y circuitos de control para diversos motores de accionamiento, tales como un motor de eje y, motor de cartucho, motor de válvula y motor de bomba.
Esta descripción proporciona además un método para adquirir imágenes de un sustrato, que incluye las etapas de (a) proporcionar un sustrato que incluye características fluorescentes sobre una superficie; (b) adquirir una pluralidad de imágenes de campo ancho de una primera parte de la superficie usando una pluralidad de microfluorómetros, donde cada uno de los microfluorómetros adquiere una imagen de campo ancho a partir de una ubicación diferente de la superficie, donde la pluralidad de microfluorómetros están fijados a un portador; y (c) trasladar el carro en una dirección paralela a la superficie y repetir (b) una segunda parte de la superficie. El método puede usar cualquiera de los aparatos expuestos en otra parte de la presente memoria, pero no es necesario que sea tan limitado en todas las realizaciones.
Las realizaciones de los presentes métodos encuentran uso particular para técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, los protocolos de secuenciación por síntesis (SBS) son particularmente aplicables. En la SBS, se controla la extensión de un iniciador de ácido nucleico a lo largo de una plantilla de ácido nucleico para determinar la secuencia de nucleótidos en la plantilla. El procedimiento químico subyacente puede ser polimerización (por ejemplo, catalizada por una enzima polimerasa) o ligamiento (por ejemplo, catalizada por una enzima ligasa). En una realización particular de SBS basada en polimerasa, se añaden nucleótidos marcados por fluorescencia a un cebador (extendiéndose de ese modo el cebador) de forma dependiente del molde, de modo que puedan usarse la detección del orden y el tipo de nucleótidos añadidos al cebador para determinar la secuencia del molde. Puede someterse una pluralidad de moldes diferentes a una técnica de SBS en una superficie en condiciones en donde pueden distinguirse eventos que se producen para diferentes moldes. Por ejemplo, los moldes pueden estar presentes en la superficie de una matriz de modo que los diferentes moldes sean distinguibles espacialmente entre sí. Normalmente, los moldes se producen en las características que tienen múltiples copias del mismo molde (a veces denominadas “agrupamientos” o “colonias” ). Sin embargo, también es posible realizar SBS en matrices donde cada característica tiene una molécula de molde individual presente, de modo que las moléculas de molde individuales pueden descomponerse la una de la otra (a veces denominadas “ matrices de moléculas individuales” ).
Las celdas de flujo proporcionan un sustrato conveniente para alojar una matriz de ácidos nucleicos. Las celdas de flujo son convenientes para técnicas de secuenciación porque las técnicas implican normalmente la administración repetida de reactivos en ciclos. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc., pueden fluir hacia/a través de una celda de flujo que aloja una matriz de moldes de ácidos nucleicos. Esas características donde la extensión del cebador provoca que se incorpore un nucleótido marcado, por ejemplo, usando métodos o aparatos expuestos en el presente documento. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que finalice la extensión adicional del cebador una vez que se haya añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, puede añadirse a un iniciador un análogo de nucleótido que tenga una fracción de terminador reversible, de modo que no se produzca una extensión posterior hasta que se suministre un agente desbloqueante para eliminar la fracción. Por tanto, para realizaciones que usan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Los lavados pueden llevarse a cabo entre las diversas etapas de suministro. A continuación, el ciclo puede repetirse n veces para extender el cebador por n nucleótidos, detectando de ese modo una secuencia de longitud n. Se describen técnicas de secuenciación a modo de ejemplo, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008), los documentos WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082.
Para la etapa de suministro de nucleótidos de un ciclo de SBS, puede suministrarse un solo tipo de nucleótido cada vez o pueden suministrarse múltiples tipos de nucleótidos diferentes (por ejemplo, A, C, T y G juntos). Para una configuración de administración de nucleótidos en la que solo esté presente un solo tipo de nucleótido cada vez, no es necesario que los diferentes nucleótidos tengan etiquetas distintas, ya que se pueden distinguir en función de la separación temporal inherente a la administración individualizada. En consecuencia, un método o aparato de secuenciación puede usar detección de un solo color. Por ejemplo, un microfluorómetro o un cabezal de lectura sólo necesita proporcionar excitación en una única longitud de onda o en un único intervalo de longitudes de onda. Por tanto, un microfluorómetro o cabezal de lectura sólo necesita tener una única fuente de excitación y la filtración multibanda de excitación no tiene por qué ser necesaria. Para una configuración de suministro de nucleótidos en donde el suministro da como resultado que estén presentes múltiples nucleótidos diferentes en la celda de flujo al mismo tiempo, pueden distinguirse características que incorporan diferentes tipos de nucleótidos en función de los diferentes marcadores fluorescentes que se fijan a los respectivos tipos de nucleótidos en la mezcla. Por ejemplo, pueden usarse cuatro nucleótidos diferentes, cada uno con uno de cuatro fluoróforos diferentes. En una realización, los cuatro fluoróforos diferentes pueden distinguirse usando excitación en cuatro regiones diferentes del espectro. Por ejemplo, un microfluorómetro o cabezal de lectura puede incluir cuatro fuentes de radiación de excitación diferentes. Alternativamente, un cabezal de lectura puede incluir menos de cuatro fuentes de radiación de excitación diferentes, pero puede utilizarse filtración óptica de la radiación de excitación desde una única fuente para producir diferentes intervalos de radiación de excitación en la celda de flujo.
En algunas realizaciones, pueden detectarse cuatro nucleótidos diferentes en una muestra (por ejemplo, matriz de características de ácidos nucleicos) usando menos de cuatro colores diferentes. Como primer ejemplo, puede detectarse un par de tipos de nucleótidos en la misma longitud de onda, pero distinguirse en función de la diferencia de intensidad de un miembro del par en comparación con el otro, o en función de un cambio en un miembro del par (por ejemplo, mediante modificación química, modificación fotoquímica o modificación física) que hace que aparente aparezca o desaparezca una señal aparente en comparación con la señal detectada para el otro miembro del par. A modo de segundo ejemplo, pueden detectarse tres de los cuatro tipos de nucleótidos diferentes en condiciones particulares mientras que un cuarto tipo de nucleótido carecerá de una etiqueta detectable en esas condiciones. En una realización de la SBS del segundo ejemplo, puede determinarse la incorporación de los primeros tres tipos de nucleótidos en un ácido nucleico basándose en la presencia de sus respectivas señales, y puede determinarse la incorporación del cuarto tipo de nucleótido en el ácido nucleico basándose en la ausencia o detección mínima de cualquier señal. Como tercer ejemplo, puede detectarse un tipo de nucleótido en dos imágenes diferentes o en dos canales diferentes (por ejemplo, puede usarse una mezcla de dos especies que tengan la misma base, pero pueden usarse marcadores diferentes, o puede usarse una única especie que tenga dos marcadores, o puede usarse una única especie que tenga un marcador que se detecte en ambos canales), mientras que otros tipos de nucleótidos se detectan en no más de una de las imágenes o canales. En este tercer ejemplo, la comparación de las dos imágenes o dos canales sirve para distinguir los diferentes tipos de nucleótidos.
Las tres configuraciones a modo de ejemplo en el párrafo anterior no son mutuamente excluyentes y pueden usarse en diversas combinaciones. Un realización ilustrativa es un método SBS que usa nucleótidos bloqueados de manera reversible (rbNTP) que tienen marcadores fluorescentes. En este formato, pueden suministrarse cuatro tipos de nucleótidos diferentes a una matriz de características de ácidos nucleicos que van a secuenciarse y debido a los grupos de bloqueo reversibles se producirá uno y sólo un evento de incorporación en cada característica. Los nucleótidos suministrados a la matriz en este ejemplo pueden incluir un primer tipo de nucleótido que se detecta en un primer canal (por ejemplo, rbATP que tiene un marcador que se detecta en el primer canal cuando se excita con una primera longitud de onda de excitación), un segundo tipo de nucleótido que se detecta en un segundo canal (por ejemplo, rbCTP que tiene un marcador que se detecta en el segundo canal cuando se excita con una segunda longitud de onda de excitación), un tercer tipo de nucleótido que se detecta tanto en el primer como en el segundo canal (por ejemplo, rbTTP que tiene al menos un marcador que se detecta en ambos canales cuando se excita con la primera y/o segunda longitud de onda de excitación) y un cuarto tipo de nucleótido que carece de un marcador que se detecta en cualquiera de los canales (por ejemplo, rbGTP que no tiene marcador extrínseco).
Una vez que los cuatro tipos de nucleótidos se han puesto en contacto con la matriz en el ejemplo anterior, puede llevarse a cabo un procedimiento de detección, por ejemplo, para capturar dos imágenes de la matriz. Las imágenes pueden obtenerse en canales independientes y pueden obtenerse de manera simultánea o secuencial. Una primera imagen obtenida usando la primera longitud de onda de excitación y emisión en el primer canal mostrará características que incorporan el primer y/o tercer tipo de nucleótido (por ejemplo, A y/o T). Una segunda imagen obtenida usando la segunda longitud de onda de excitación y emisión en el segundo canal mostrará características que incorporan el segundo y/o tercer tipo de nucleótido (por ejemplo, C y/o T). La identificación inequívoca del tipo de nucleótido incorporado en cada característica puede determinarse comparando las dos imágenes para llegar a lo siguiente: características que muestran sólo en el primer canal incorporado el primer tipo de nucleótido (por ejemplo, A), características que muestran sólo en el segundo canal incorporado el segundo tipo de nucleótido (por ejemplo, C), características que se muestran en ambos canales incorporados el tercer tipo de nucleótido (por ejemplo, T) y características que no muestran en ningún canal incorporado el cuarto tipo de nucleótido (por ejemplo, G). Obsérvese que la ubicación de las características que incorporan G en este ejemplo puede determinarse a partir de otros ciclos (donde se incorpora al menos uno de los otros tres tipos de nucleótidos). El aparato y los métodos a modo de ejemplo para distinguir cuatro nucleótidos diferentes usando la detección de menos de cuatro colores se describen, por ejemplo, en la patente solicitud de patente estadounidense con número de n.° 61/538294.
En un método de secuenciación, un microfluorómetro puede adquirir al menos dos imágenes de campo ancho de la misma área de una superficie durante cada ciclo, en donde cada una de las al menos dos imágenes de campo ancho se adquiere mediante el uso de diferentes longitudes de onda de excitación o emisión. Por ejemplo, durante cada ciclo, un microfluorómetro puede adquirir dos, tres o cuatro imágenes de campo ancho de la misma área de una superficie durante cada ciclo, en donde cada una de las dos imágenes de campo ancho detecta fluorescencia en diferentes regiones del espectro. Alternativa o adicionalmente, un microfluorómetro puede adquirir imágenes de campo amplio que detectan fluorescencia en no más de dos, tres o cuatro regiones diferentes del espectro para un área dada de una superficie durante un ciclo de secuenciación determinado. Por ejemplo, un microfluorómetro puede excitar un área de una superficie de celda de flujo con radiación en no más de dos, tres o cuatro regiones diferentes del espectro durante un ciclo dado y/o un microfluorómetro puede adquirir imágenes de campo amplio de un área dada de una superficie en no más de dos, tres o cuatro regiones diferentes del espectro durante un ciclo dado. Pueden obtenerse diferentes imágenes de campo amplio en diferentes momentos (por ejemplo, secuencialmente) o en algunas modalidades pueden obtenerse dos o más imágenes de campo ancho simultáneamente.
En el contexto de la presente descripción “diferentes imágenes de campo amplio de un área” se refiere a dos o más imágenes de campo ancho de la misma área que se adquieren en diferentes condiciones de excitación y/o emisión. Alternativamente, pueden adquirirse dos o más imágenes de campo amplio separadas de la misma área bajo las mismas o al menos condiciones de excitación y emisión similares. Por ejemplo, se pueden obtener múltiples tramas para un área de un objeto dado bajo una condición de detección de fluorescencia dada y las tramas se pueden añadir conjuntamente. La adición conjunta puede proporcionar la ventaja de aumentar la señal al ruido en comparación con la obtención de un solo cuadro en las mismas condiciones. Un ejemplo adicional es que la adición conjunta se puede realizar junto con excitación pulsada para reducir la fotolesión a la muestra en comparación con la excitación continua de la muestra durante un período de tiempo prolongado (que puede o no lograr una intensidad de señal o relación señal a ruido similar).
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden unirse a una superficie y amplificarse antes o durante la secuenciación. Por ejemplo, la amplificación puede llevarse a cabo usando amplificación puente para formar agrupamientos de ácidos nucleicos en una superficie. Los métodos de amplificación puente útiles se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.641.658; US 2002/0055100; US 7.115.400; US 2004/0096853; US 2004/0002090; US 2007/0128624; o US 2008/0009420. Otro método útil para amplificar ácidos nucleicos en una superficie es la amplificación por círculo rodante (ACR), por ejemplo, tal como se describe en Lizardi etal, Nat. Genet. 19:225-232 (1998) y el documento US 2007/0099208 A1. La PCR en emulsión sobre perlas también puede usarse, por ejemplo, tal como se describe en Dressman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), documentos WO 05/010145, US 2005/0130173 o US 2005/0064460.
Como se ha expuesto anteriormente, las realizaciones de secuenciación son un ejemplo de un proceso repetitivo. Los métodos de la presente descripción son muy adecuados para procesos repetitivos. Algunas realizaciones se exponen a continuación.
Esta descripción proporciona un método para adquirir imágenes de un sustrato, que incluye las etapas de (a) proporcionar un sustrato que incluye características fluorescentes sobre una superficie; (b) adquirir una pluralidad de imágenes de campo ancho de una primera parte de la superficie usando una pluralidad de microfluorómetros, donde cada uno de los microfluorómetros adquiere una imagen de campo ancho a partir de una ubicación diferente de la superficie, donde la pluralidad de microfluorómetros están fijados a un portador; (c) trasladar el carro en una dirección paralela a la superficie y repetir (b) una segunda parte de la superficie; y (d) devolver el carro a una posición para adquirir una segunda pluralidad de imágenes de campo ancho de la primera porción de la superficie. Opcionalmente, el método puede incluir además una etapa de modificación de las características fluorescentes en la superficie después de (c) y antes (d), en donde la segunda pluralidad de imágenes de campo ancho son diferentes de la primera pluralidad de imágenes de campo amplio.
En realizaciones particulares, las etapas (a) a (c) del método anterior corresponden a la(s) etapa(s) de detección de una técnica de secuenciación. En una realización relacionada, la etapa (d) por lo que el carro se devuelve corresponde a un segundo ciclo de una técnica de secuenciación. En este ejemplo, la modificación de las características fluorescentes en la superficie puede incluir una o más de las etapas bioquímicas de una técnica de secuenciación. Las técnicas de secuenciación ilustrativas que se pueden usar en el método se exponen anteriormente o se conocen de otro modo en la técnica.
También se proporciona un cartucho fluídico que incluye (a) una celda de flujo que tiene una superficie ópticamente transparente, una entrada y una salida; y (b) una carcasa hecha de un material que es ópticamente opaco e impermeable a líquidos acuosos, en donde el alojamiento contiene: (i) un depósito de muestra; (ii) una línea de fluidos entre el depósito de muestra y la entrada de la celda de flujo; (iii) una pluralidad de depósitos de reactivo en comunicación de fluidos con la celda de flujo a través de la entrada de la celda de flujo, (iv) al menos una válvula configurada para mediar la comunicación de fluidos entre los depósitos y la entrada de la celda de flujo; y (v) al menos una fuente de presión configurada para mover líquidos desde el depósito de muestra o los depósitos de reactivo hasta la celda de flujo a través de la entrada de la celda de flujo, en donde una ventana ópticamente transparente interrumpe el alojamiento y un puerto de entrada interrumpe el alojamiento, en donde el puerto de entrada está en comunicación de fluidos con el depósito de muestra, y en donde la superficie ópticamente transparente se coloca en la ventana.
La vista exterior de un cartucho fluídico ilustrativo 10 se muestra en la Figura 1 y se ha descrito anteriormente. La Figura 15 muestra una vista despiezada de un cartucho de fluidos 2000. La carcasa del cartucho de fluidos está formada por una carcasa 2001 que se acopla con una base 2002. La carcasa está en el lado superior del cartucho de fluidos como se muestra e incluye un área de recepción 2009 para una celda de flujo 2020. La celda de flujo se expone al exterior de la carcasa a través de una ventana 2010. Uno o más puertos 2013 en la carcasa permitir que la muestra u otros reactivos se suministren a los depósitos en el interior del cartucho de fluidos 2000. La base 2002 incluye una abertura 2012 que está configurada para aceptar una bandeja de reactivo 2003. La bandeja de reactivo 2003 se puede acoplar con el cartucho de fluidos insertando en la abertura 2012 de manera que los depósitos de reactivos individuales en la bandeja están en comunicación fluida con líneas de fluidos individuales para el suministro de reactivos a la celda de flujo. El alojamiento también contiene válvulas 2005 y 2006 que interfaz con bombas para mover los reactivos a través de las líneas de fluido. También contenida dentro de la carcasa hay una bolsa de desechos 2004 que tiene una entrada 2011 que interactúa con líneas de fluido de la celda de flujo 2020.
La carcasa de un cartucho de fluidos (por ejemplo, la carcasa 2001 y/o base 2002 del cartucho de fluidos 2000) puede estar hecho de un material que sea opaco a la radiación en una parte particular del espectro. Por ejemplo, la carcasa puede ser opaca a la radiación UV, VIS y/o IR con el fin de proteger los reactivos del foto-daño debido a la radiación en estas longitudes de onda. Por ejemplo, un material que es opaco a la radiación UV es beneficioso para evitar el daño a los ácidos nucleicos entre otros reactivos utilizados en las reacciones de secuenciación. Como otro ejemplo, puede ser deseable usar un material que sea opaco a la radiación en el intervalo de longitud de onda absorbido por fluoróforos utilizados como marcadores en una reacción de secuenciación.
El alojamiento para un cartucho de fluidos será típicamente impermeable a los líquidos alojados en el mismo. Por lo tanto, la carcasa puede proporcionar una barrera secundaria además de los depósitos contenidos dentro. Los materiales ilustrativos incluyen plásticos tales como policarbonato o poliestireno, o metales tales como aluminio o acero inoxidable. Los materiales que son químicamente inertes a los reactivos alojados en el cartucho de fluidos son generalmente deseables. Los depósitos individuales u otros componentes fluidos en un cartucho de fluidos tendrán propiedades similares de impermeabilidad a los fluidos y pueden opcionalmente ser opacos. Los materiales pueden ser rígidos o flexibles. Por ejemplo, cualquiera de una variedad de depósitos de reactivos establecidos en la presente descripción o usado de otra manera en un cartucho de fluidos puede ser una bolsa flexible como se ejemplifica para el depósito de desechos 2004.
Como se ilustra mediante la Figura 1 y Figura 15 un cartucho de fluidos puede configurarse para contener una variedad de componentes dentro de una carcasa. Por ejemplo, en varias modalidades, uno o más de los componentes fluídicos establecidos en la presente descripción pueden estar completamente contenidos dentro de la carcasa. De hecho, en modalidades particulares, todos los componentes fluidos de una modalidad particular pueden contenerse completamente en el cartucho de fluidos. Por ejemplo, una carcasa de cartucho puede contener uno o más depósitos de muestras, uno o más depósitos de reactivo, uno o más depósitos de desechos, uno o más depósitos de mezcla, una o más válvulas configuradas para mediar la comunicación de fluidos entre un depósito y una celda de flujo, una o más fuentes de presión configuradas para mover líquidos desde un depósito a una celda de flujo, o una o más líneas de fluido entre un depósito y una celda de flujo. Sin embargo, se entenderá que en algunas modalidades al menos parte de algunos componentes fluidos puede estar presente fuera del alojamiento. Por ejemplo, una superficie de una celda de flujo a través de la cual se producirá la detección puede estar fuera de una carcasa del cartucho.
En realizaciones particulares, un cartucho fluídico puede incluir un área de recepción que está dimensionada para sujetar firmemente una celda de flujo, por ejemplo, mediante un ajuste por compresión. Sin embargo, en otras modalidades, el área de recepción puede ser mayor que la huella de una celda de flujo que está o estará presente en el cartucho de fluidos. Por lo tanto, la celda de flujo puede ocupar un espacio de recepción en la carcasa que está dimensionado y conformado para permitir que la celda de flujo flote en relación con la carcasa. Una configuración que acomoda el flotador de una celda de flujo puede ser ventajosa para la alineación de la celda de flujo con el componente óptico de un aparato de detección después de que el cartucho de fluidos se haya colocado en el instrumento. El alineamiento se puede lograr mediante la inserción de uno o más pasadores de alineación en el área de recepción por el aparato de detección, por ejemplo, en los casos en los que las clavijas se alinean previamente con un microfluorómetro de un cabezal de lectura del aparato de detección. Por consiguiente, el área de recepción puede incluir un accesorio para al menos un pasador de alineación u otro miembro de alineación. Las configuraciones ilustrativas para alinear una celda de flujo flotante que se pueden adaptar a un cartucho de fluidos de la presente descripción se describen en US n.° serie 13/273.666 (publicada como US 2012/0270305 A1). En realizaciones que utilizan el flotador de celda de flujo, la conexión fluídica desde la celda de flujo a otros componentes fluídicos del cartucho será generalmente flexible. Por ejemplo, el tubo flexible puede conectar una celda de flujo a componentes de fluidos fijos de un cartucho.
Un cartucho de fluidos de la presente descripción no necesita incluir un dispositivo de detección u otros componentes de detección descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un cartucho de fluidos puede configurarse para excluir un detector, un microfluorómetro o un cabezal de lectura tal como los descritos en la presente descripción o aquellos útiles en un método expuesto en la presente descripción. En modalidades de secuenciación de ácido nucleico, un detector, microfluorómetro o cabezal de lectura que se usa para detectar ácidos nucleicos en una celda de flujo (u otro sustrato) de un cartucho de fluidos puede ubicarse fuera del alojamiento para el cartucho de fluidos. De manera similar, para otras modalidades, un detector, un microfluorómetro o un cabezal de lectura que se usa para detectar una característica particular de un sustrato puede excluirse del interior de una carcasa para un cartucho de fluidos, que se ubica fuera del alojamiento en su lugar. Se entenderá que en al menos algunas configuraciones se puede excluir un tipo de detector de un cartucho de fluidos, mientras que otro tipo de detector puede estar presente. Por ejemplo, un cartucho de fluidos puede excluir un dispositivo de detección usado para detectar ácidos nucleicos en una celda de flujo, pero puede incluir un detector usado para evaluar una característica de un fluido en el cartucho o para evaluar un componente del cartucho. Más específicamente, un cartucho puede incluir un detector para temperatura, presión, caudal u otras características de los fluidos utilizados en el cartucho. Otros ejemplos de componentes que pueden excluirse de un cartucho de fluidos incluyen, pero no se limitan a, filtros ópticos, lentes, objetivos, cámaras (por ejemplo, cámaras CCD o cámaras CMOS), fuentes de radiación de excitación (por ejemplo, LED) o similares.
En la figura 16 se muestra un mapa de fluido para un cartucho de fluido a modo de ejemplo. La celda de flujo 2020 tiene ocho carriles, cada uno conectado fluídicamente a una de las ocho líneas de fluido individuales (etiquetadas colectivamente como 2047) que son accionadas individualmente por la válvula de entrada 2044. La válvula de entrada 2044 controla el flujo de fluido desde los cuatro depósitos de muestras 2030 a 2033. La válvula de entrada 2044 también controla el flujo de fluido desde varios depósitos de reactivos SBS 2035 y de varios depósitos de reactivo de amplificación 2036. La distribución y el flujo de fluidos desde los depósitos de reactivos SBS 2035 se controlan mediante la válvula de selección de reactivo 2043. La distribución y el flujo de fluidos desde los depósitos de reactivo de amplificación 2036 se controla mediante la válvula de selección de reactivo 2042 situada corriente arriba de la válvula de selección de reactivo 2043. Por consiguiente, la válvula de selección de reactivo 2043 se coloca para controlar la distribución y el flujo de reactivos tanto de los depósitos de reactivos SBS 2035 y los depósitos de reactivo de amplificación 2036.
El flujo de fluidos a través del sistema de la Figura 16 es impulsado por ocho bombas de jeringa separadas 2051 a 2058. Las bombas de jeringa se colocan para extraer fluidos a través del sistema de fluido y cada bomba puede accionarse individualmente mediante la válvula 2045. Por tanto, el flujo a través de cada canal de la celda de flujo puede controlarse individualmente mediante una fuente de presión dedicada. La válvula 2045 también se configuran para controlar el flujo de fluidos al depósito 2060 de desechos.
La Figura 16 ejemplifica un sistema de fluido en donde se extraen los fluidos mediante la acción de las bombas de jeringa aguas abajo. Se entenderá que un sistema de fluido útil puede usar otros tipos de dispositivos en lugar de bombas de jeringa para impulsar fluidos incluyendo, por ejemplo, presión positiva o negativa, bomba peristáltica, bomba de diafragma, bomba de pistón, bomba de engranajes o tornillo hidráulico. Además, estos y otros dispositivos pueden configurarse para extraer fluidos de una posición aguas abajo con respecto a una celda de flujo o para impulsar fluidos desde una posición aguas arriba.
La Figura 16 también ejemplifica el uso de ocho bombas de jeringa para ocho canales de una celda de flujo. Por tanto, el sistema de fluido incluye un número de bombas equivalente al número de canales en uso. Se entenderá que un sistema de fluido que es útil en un cartucho de fluido de la presente descripción puede tener un número menor de bombas (u otras fuentes de presión) que el número de canales en uso. Por ejemplo, varios canales pueden conectarse en comunicación de fluido a una bomba compartida y puede usarse una válvula para accionar el flujo de fluido a través de un canal individual.
La válvula giratoria ilustrativa 400 se muestra en la Figura 17. La estructura y la función de la válvula giratoria 400 se pueden entender en el contexto de un procedimiento de secuenciación como se expone a continuación. Por supuesto, se entenderá que la válvula se puede usar de formas similares para otras aplicaciones. En un protocolo de secuenciación donde cuatro muestras diferentes deben procesarse de forma fluida, la válvula giratoria 400 puede funcionar como una válvula giratoria de inyección de cuatro muestras usando un paso de 45 grados y también puede funcionar como un colector de cuatro a un colector para reactivos de secuenciación. En la vista superior de la Figura 17, la válvula giratoria 400a se coloca para permitir el flujo desde el depósito de reactivo común 401 a cuatro carriles de una celda de flujo. Más específicamente, en esta posición, los fluidos pueden fluir desde los reactivos comunes 401 puerto a través del puerto 402 al carril 1 (a través del puerto 411), al carril 2 (a través del puerto 412), al carril 3 (a través del puerto 413) y al carril 4 (a través del puerto 414). Sin embargo, en esta posición, los fluidos no fluyen desde los depósitos de muestras S1, S2, S3 o S4 porque los puertos 421 422, 423 y 424 se cierran para fluir desde el puerto 402. Un giro de 45 grados coloca la válvula giratoria 400b a la posición mostrada en la vista inferior de la Figura 17, permitiendo así que las muestras S1, S2, S3 y S4 sean inyectadas porque los puertos 411 412, 413 y 414 están abiertos para fluir desde los puertos 421 422, 423 y 424, respectivamente. Sin embargo, en este flujo de posición desde el puerto 402 se cierra, evitando así el flujo de reactivos comunes a los carriles de la celda de flujo.
En realizaciones particulares, un cartucho de fluido puede configurarse para permitir la reutilización de uno o más reactivos. Por ejemplo, el cartucho de fluido puede configurarse para suministrar un reactivo a una celda de flujo, luego retirar el reactivo de la celda de flujo y luego volver a introducir el reactivo a la celda de flujo. En una configuración, como se ilustra en la Figura 18, pueden configurarse fluidos de cartucho de manera que un depósito de reactivo esté en comunicación fluida con el puerto de entrada de una celda de flujo y el puerto de salida de la celda de flujo también está en comunicación fluida con el depósito de reactivo. Uno o más de los reactivos se pueden reutilizar en una red colectora de bucles de reactivo similares como se muestra en la Figura 18. Por ejemplo, la válvula 522 controla el flujo desde el depósito de lavado 524, el depósito IMX 525, el depósito SMX 526, depósito CLM 527 y el depósito de corte 528 a la celda de flujo 520. La bomba 521 se encuentra aguas abajo de la celda de flujo 520 y aguas arriba de la válvula 523. La válvula 523 controla el flujo desde la celda de flujo 520 hasta el depósito de residuos 535, el depósito IMX 525, el depósito SMX 526, el depósito CLM 527 y el depósito de corte 528.
Las líneas de fluidos que conectan los componentes anteriores de la Figura 18 se describirán aquí en el contexto de un ciclo de secuenciación donde los reactivos se suministran desde los depósitos a la celda de flujo y los reactivos usados se suministran desde la celda de flujo hasta los respectivos depósitos. En todas las etapas del ciclo ejemplificado a continuación, los fluidos se mueven bajo la fuerza de la presión producida por la bomba 521. En un primer paso del ciclo, la celda de flujo se lava abriendo la válvula 522 a la línea 501 y abriendo la válvula 523 a la línea 505 de forma que el fluido fluya desde el depósito de lavado 524 al depósito de residuos 535 a través de una ruta entre la válvula 522 y la válvula 523 que atraviesa la celda de flujo 520. Para todos los pasos descritos para la Fig. 18, la trayectoria entre la válvula 522 y la válvula 523 conduce desde la válvula 522 a la línea 502, a la entrada 530 de la celda de flujo 520, a través del canal 531 de la celda de flujo 520, a través de la salida 532 de la celda de flujo 520, a través de la línea 503, a la bomba 521 y luego a través de la línea 504 a la válvula 523. En un segundo paso del ciclo, se introduce IMX en la celda de flujo abriendo la válvula 522 a la línea 506 y abriendo la válvula 523 a la línea 505 de tal forma que el fluido fluye desde el depósito de IMX 525 al depósito de residuos 535 a través de la trayectoria entre la válvula 522 y la válvula 523 que atraviesa la celda de flujo 520. En un tercer paso del ciclo, el IMX usado se desplaza de la celda de flujo 520 al depósito de IMX 525 abriendo la válvula 522 a la línea 501 y abriendo la válvula 523 a la línea 510 de tal manera que el fluido de lavado desplaza el IMX de la trayectoria entre la válvula 522 y la válvula 523 que cruza a través de la celda de flujo 520. En un cuarto paso del ciclo, se introduce SMX en la celda de flujo abriendo la válvula 522 a la línea 507 y abriendo la válvula 523 a la línea 505 de tal forma que el fluido fluye desde el depósito de SMX 526 al depósito de residuos 535 a través de la trayectoria entre la válvula 522 y la válvula 523 que atraviesa la celda de flujo 520. En un quinto paso del ciclo, el SMX usado se desplaza de la celda de flujo 520 al depósito de SMX 526 abriendo la válvula 522 a la línea 501 y abriendo la válvula 523 a la línea 511 de tal manera que el fluido de lavado desplaza el SMX de la trayectoria entre la válvula 522 y la válvula 523 que cruza a través de la celda de flujo 520. Se pueden repetir pares similares de etapas para (1) introducir el reactivo CLM a la celda de flujo y para devolver el reactivo CLM usado al depósito CLM, y (2) introducir el reactivo de corte a la celda de flujo y devolver el reactivo de corte usado al depósito de eliminación.
Otro ejemplo de una configuración fluídica que proporciona reutilización de reactivo se muestra en la Figura 19. En este ejemplo, los fluidos para un cartucho están configurados de tal manera que cada depósito de reactivo está en comunicación fluida con un solo puerto de la celda de flujo 620. El flujo recíproco permite que cada reactivo fluya desde un depósito hasta la celda de flujo 620 y desde la celda de flujo 620 de vuelta al depósito, en donde la entrada de reactivos a la celda de flujo 620 y salida de los reactivos de la celda de flujo 620 se produce a través del mismo puerto de la celda de flujo 620. El reutilización de cuatro reactivos se ejemplifica en la Figura 19. Sin embargo, un sistema fluídico puede configurarse para más o menos reactivos a reutilizar en un formato alternativo similar. Como se muestra en la Fig. 19, la válvula 622 controla el flujo de fluidos entre la celda de flujo 620 y cada uno de los siguientes: el depósito de lavado 624, el depósito IMX 625, el depósito SMX 626, el depósito CLM 627 y el depósito de corte 628. En una primera dirección del flujo, la bomba 621 está configurada para extraer fluidos de la celda de flujo 620 a través de la línea 603 y para empujar fluidos al depósito de desechos 635 a través de la línea 605.
Las líneas de fluidos que conectan los componentes anteriores de la Figura 19 se describirán aquí en el contexto de un ciclo de secuenciación donde los reactivos se suministran desde los depósitos a la celda de flujo y los reactivos usados se suministran desde la celda de flujo hasta los respectivos depósitos. En una primera etapa del ciclo, la celda de flujo se lava mediante la válvula de apertura 622 a la línea 601 de tal manera que el fluido fluye desde el depósito de lavado 624 al depósito de desechos 635. La trayectoria entre la válvula 622 y el depósito de desechos 635 conduce desde la válvula 622 a la línea 602, al puerto 630 de la celda de flujo 620, a través del canal 631 de la celda de flujo 620, a través del puerto 632 de la celda de flujo 620, a través de la línea 603, a la bomba 621 y luego a través de la línea 605 al depósito de desechos 635. En un segundo paso del ciclo, se introduce IMX en la celda de flujo abriendo la válvula 622 a la línea 606 de tal manera que el fluido fluye desde el depósito de IMX 625 a través de la válvula 622 a la línea 602, al puerto 630 de la celda de flujo 620, a través del canal 631 de la celda de flujo 620, a través del puerto 632 de la celda de flujo 620, y parcialmente a través de la línea 603 (dejando así solución de lavado residual en una porción aguas abajo de la línea 603 hasta la bomba 621). En un tercer paso del ciclo, el reactivo IMX usado se devuelve desde la celda de flujo 620 al depósito IMX 625 abriendo la válvula 622 a la línea 606 e invirtiendo la dirección de la bomba 621 de tal manera que el reactivo IMX usado se devuelve desde la celda de flujo 620 al depósito IMX 625 a través del puerto 630 de la celda de flujo 620, a la línea de fluido 602, a través de la válvula 622 y luego a través de la línea de fluido 606 al depósito IMX 625. Durante la etapa tres, el flujo de la bomba 621 al depósito IMX 625 se produce durante el tiempo suficiente en el que una parte del reactivo IMX vuelve al depósito IMX 625, pero no lo suficientemente largo como para causar que una cantidad sustancial de la solución de lavado residual de la línea 603 entre en el depósito IMX 625. En una cuarta etapa del ciclo, la celda de flujo se lava como se describe para la primera etapa. En un quinto paso del ciclo, se introduce SMX en la celda de flujo abriendo la válvula 622 a la línea 607 de tal manera que el fluido fluye desde el depósito de SMX 626 a través de la válvula 622 a la línea 602, al puerto 630 de la celda de flujo 620, a través del canal 631 de la celda de flujo 620, a través del puerto 632 de la celda de flujo 620, y parcialmente a través de la línea 603 (dejando así solución de lavado residual en una porción aguas abajo de la línea 603 hasta la bomba 621). En un sexto paso del ciclo, el reactivo SMX usado se devuelve desde la celda de flujo 620 al depósito SMX 626 abriendo la válvula 622 a la línea 607 e invirtiendo la dirección de la bomba 621 de tal manera que el reactivo SMX usado se devuelve desde la celda de flujo 620 al depósito SMX 626 a través del puerto 630 de la celda de flujo 620, a la línea de fluido 602, a través de la válvula 622 y luego a través de la línea de fluido 607 al depósito SMX 626. Como con la etapa tres, el flujo de la bomba 621 durante la etapa seis provoca que una parte del reactivo SMX vuelva al depósito SMX 626, pero poca o ninguna solución de lavado residual de la línea 603 entra en el depósito SMX 626. Pueden repetirse tríos de pasos similares para (1) introducir reactivo CLM en la celda de flujo 620, devolver el reactivo CLM usado al depósito CLM 627 y lavar la celda de flujo 620, y (2) para introducir reactivo de corte en la celda de flujo 620, devolver el reactivo de corte usado al depósito de corte 628 y lavar la celda de flujo 620.
Los ejemplos de la Figura 18 y Figura 19 muestran un único depósito para cada reactivo. En consecuencia, la mezcla de reactivos usados con reactivos no utilizados del mismo tipo puede ocurrir a lo largo del proceso de fluidos. En esta modalidad, la fracción de reactivo reusado en el depósito aumentará con cada ciclo de fluidos. Por consiguiente, puede proporcionarse un volumen suficientemente grande de reactivo inicial para acomodar cualquier dilución o contaminación que pueda ocurrir mientras se mantiene un nivel deseado de calidad general de la reacción.
Como alternativa al uso de un solo depósito para cada reactivo, el sistema fluídico puede incluir varios depósitos para cada tipo de reactivo. Cada uno de los depósitos puede configurarse para su reutilización. Sin embargo, cada depósito puede someterse a un número de eventos de mezclado que es menor que el número de ciclos para la celda de flujo. Por consiguiente, se puede proporcionar un número apropiado de depósitos para cada tipo de reactivo para acomodar tanto un número deseado de ciclos para una celda de flujo como el número limitado de ciclos de reutilización aceptables para cada reactivo. Por ejemplo, se pueden proporcionar diez depósitos para un reactivo particular para acomodar un proceso de fluidos que tenga cien ciclos y un reactivo que se usará solo diez veces (es decir, se reusará nueve veces). En este ejemplo, una vez que uno de los diez depósitos se ha extraído de diez veces el sistema puede cambiar a un segundo de los diez depósitos. Se pueden configurar múltiples depósitos de reactivos para su reutilización en el sistema ilustrativo mostrado en la Figura 18, por ejemplo, interconectando los depósitos adicionales a la válvula 522 y la válvula 523 o interconectando cada subconjunto de depósitos con una válvula dedicada corriente arriba de la válvula 522 y corriente abajo de la válvula 523. Tomando el ejemplo de la Figura 19 múltiples reactivos pueden configurarse para su reutilización mediante la interconexión de los depósitos adicionales a la válvula 622 o interconectando cada subconjunto de depósitos con una válvula dedicada corriente arriba de la válvula 622 (en la dirección de entrada de la celda de flujo que está corriente abajo de la válvula 622 ej., en la dirección de salida de la celda de flujo).
Otra configuración útil para el reutilización de un reactivo dado es utilizar un depósito suplementario que esté separado de un depósito de reactivo. Tomando como ejemplo la configuración de la Figura 18, las líneas 510 511, 512 y 513 pueden fluir a depósitos suplementarios respectivos de manera que los reactivos no se dirijan de nuevo a depósitos de reactivo 525, 526, 527 y 528 después de ponerse en contacto con la celda de flujo. El reactivo usado puede suministrarse a continuación desde los respectivos depósitos suplementarios a la celda de flujo a través de diferentes puertos en la válvula 522 o mediante una válvula separada. Volviendo al ejemplo del sistema fluídico de la Figura 19 se pueden añadir depósitos complementarios al sistema y se pueden añadir puertos a la válvula 622 para dirigir reactivos usados a los depósitos suplementarios. En consecuencia, el accionamiento de la válvula 622 se puede usar para dirigir reactivos usados a los depósitos suplementarios en lugar de a los depósitos de reactivo 625626, 627 y 628 después de que los reactivos se hayan puesto en contacto con la celda de flujo. Para realizaciones que incluyen un depósito suplementario que incluye, pero no se limita a, los ejemplificados en la Figura 18 y Figura 19 los reactivos utilizados (de un tipo particular) de varios ciclos se pueden mezclar en los depósitos suplementarios antes de su reutilización. Alternativamente, los reactivos usados pueden reutilizarse secuencialmente sin mezcla en los depósitos complementarios. Si los reactivos usados se mezclan o no, una vez que los reactivos se han reusado un número de veces predeterminado o deseable, los reactivos usados pueden enviarse a un depósito de residuos y el depósito suplementario se usa nuevamente para ciclos posteriores con una parte o alícuotas posteriores de reactivo usado.
Las configuraciones mostradas en la figura 18 y la figura 19 son ejemplos. Son posibles otras configuraciones también para lograr la reutilización de uno o más de los reactivos usados en un procedimiento particular. Se entenderá que en algunas configuraciones de reutilización de reactivos, las configuraciones de fluido para la reutilización de reactivos sólo se usarán para un subconjunto de los reactivos usados en un procedimiento particular. Por ejemplo, un primer subconjunto de los reactivos puede ser lo suficientemente robusto como para reutilizarse, mientras que un segundo subconjunto puede ser propenso a contaminación, degradación u otros efectos no deseados después de un solo uso. Por consiguiente, el sistema de fluido puede configurarse para reutilizar el primer subconjunto de reactivos, mientras que los fluidos para el segundo conjunto de reactivos se configurarán para un solo uso.
Un reactivo particular puede reutilizarse cualquier número de veces deseado para adaptarse a un procedimiento particular. Por ejemplo, uno o más de los reactivos ejemplificados en el presente documento, descrito en una referencia citada en el presente documento, o conocido de otro modo para su uso en un procedimiento expuesto en el presente documento, puede reutilizarse al menos 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50 o más veces. De hecho, cualquiera de una variedad de reactivos deseados puede reutilizarse durante al menos muchas veces.
Las configuraciones de fluido y los métodos para reutilización de reactivos, aunque se ejemplifican para un procedimiento de secuenciación de ácidos nucleicos, pueden aplicarse a otros procedimientos, en particular procedimientos que implican ciclos repetidos de suministro de reactivos. Los procesos a modo de ejemplo incluyen la secuenciación de polímeros tales como polipéptidos, polisacáridos o polímeros sintéticos y también incluyen síntesis de tales polímeros.
La Figura 18, la Figura 19 y otros ejemplos proporcionados en la presente memoria con respecto a métodos y aparatos para reutilizar reactivo se han descrito en el contexto de un solo canal para una celda de flujo. Se entenderá que pueden aplicarse métodos y aparatos similares a una celda de flujo que tiene múltiples canales. Por consiguiente, un cartucho de fluidos de la presente descripción puede incluir una celda de flujo que tiene múltiples canales y puede incluir además un sistema fluídico configurado para proporcionar reactivo nuevo para todo o un subconjunto de los canales. Por ejemplo, los canales individuales pueden conectarse a un sistema fluídico configurado como se muestra en la Figura 18 o Figura 19 o como se describe en otra parte de la presente descripción.
Un cartucho de fluidos de la presente descripción puede incluir una conexión de entrada/salida (E/S) para habilitar la comunicación entre el cartucho de fluidos y un aparato de detección que recibe el cartucho de fluidos. La conexión de E/S se puede usar para coordinar operaciones fluídicas que se producen en el cartucho de fluidos con operaciones de detección que se producen en el aparato de detección. Por ejemplo, en un procedimiento de secuenciación de ácido nucleico, el suministro fluídico de reactivos de secuenciación a una celda de flujo puede coordinarse con la detección de la celda de flujo mediante el aparato de detección en uno o más ciclos del procedimiento de secuenciación. En la realización de la Figura 14 el conector de E/S puede permitir la comunicación entre el cartucho de fluidos y la PCB principal.
Como será evidente a partir de las modalidades ilustrativas de secuenciación de ácido nucleico expuestas en la presente descripción, los depósitos en un cartucho de fluidos de la presente descripción pueden contener reactivos útiles para un procedimiento de secuenciación de ácido nucleico. Por ejemplo, pueden estar presentes reactivos útiles para una técnica de secuenciación por síntesis que incluyen, por ejemplo, una polimerasa, un nucleótido marcado con fluorescencia o una solución de lavado. Varios nucleótidos marcados con fluorescencia diferentes pueden estar presentes como una mezcla en un solo depósito o cada uno solo en un depósito separado. Los nucleótidos etiquetados pueden tener restos de terminación reversibles para su uso en la secuenciación del terminador reversible en cuyo caso también puede estar presente un depósito que contiene un agente de desbloqueo. Otros reactivos de secuenciación de ácido nucleico que pueden incluirse en un cartucho de fluidos incluyen los establecidos anteriormente en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Bentley y otros, Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082. En particular, los reactivos de secuenciación de ácidos nucleicos disponibles en Illumina, como los suministrados en los kits TruSeq®-SBS, pueden incluirse en un cartucho fluídico.
Los depósitos de un cartucho de fluidos también pueden incluir una muestra de ácido nucleico que se va a secuenciar. Varias muestras pueden estar presentes cada una en su propio depósito. En algunas realizaciones, varias muestras se pueden mezclar en un solo depósito, por ejemplo, en casos donde las muestras se marcaron previamente con secuencias de etiqueta de ácido nucleico conocidas y luego se mezclaron entre sí.
Un cartucho de fluidos también puede incluir depósitos que contienen reactivos utilizados para la amplificación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, los reactivos utilizados para la amplificación de puente (también llamados amplificación de agrupamiento) pueden incluirse como los descritos en el documento US 5.641.658; US 2002/0055100; US 7.115.400; US 2004/0096853; US 2004/0002090; US 2007/0128624; o US 2008/0009420. En particular, los reactivos de amplificación de puente disponibles en Illumina, como los suministrados en los kits TruSeq®-RNA o de amplificación de ADN, pueden incluirse en un cartucho fluídico. Los reactivos útiles para la amplificación en círculo rodante (RCA) también pueden estar presentes en un cartucho de fluidos que incluye, por ejemplo, los descritos en Lizardi y otros, Nat. Genet. 19:225-232 (1998) y el documento US 2007/0099208 A 1. Los reactivos de PCR en emulsión también pueden usarse, por ejemplo, tal como se describe en Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), documentos WO 05/010145, US 2005/0130173 o US 2005/0064460.
Un cartucho fluídico de la presente descripción puede incluir dos o más partes de subcomponente que contienen diferentes reactivos. Las partes del subcomponente pueden configurarse para una combinación conveniente en un cartucho de fluidos, por ejemplo, a mano y sin el uso de herramientas. Por ejemplo, las partes del subcomponente se pueden combinar en un cartucho de fluidos usando ajuste a presión, encaje a presión entre accesorios complementarios macho y hembra, inserción en puertos de recepción de tamaño apropiado, sujeción o similares. Si se desea, se pueden usar conexiones que requieren herramientas, por ejemplo, el uso de un destornillador para conectar con tornillos, o el uso de una llave para girar un perno y/o una tuerca.
Las partes del subcomponente que forman un cartucho de fluidos pueden contener reactivos que se transportaron previamente y/o se almacenaron en diferentes condiciones. Por ejemplo, un primer subcomponente puede incluir reactivos que se almacenen a temperaturas de congelación (por ejemplo, por debajo de 0 0C, -20 0C o -70 0C), mientras que un segundo subcomponente puede incluir reactivos que se almacenen a una temperatura superior (por ejemplo, temperatura ambiente o superior a 20 0C, 0 0C, -20 0C o -70 °C). Por consiguiente, al menos algunos de los reactivos en depósitos de un subcomponente pueden ser sólidos congelados, mientras que todos los reactivos en los depósitos de otro subcomponente están en forma líquida. Dos o más partes subcomponentes que se han almacenado a diferentes temperaturas pueden combinarse en un cartucho de fluidos antes o después de que las temperaturas se equilibren a la temperatura ambiente (u otra temperatura común).
Los reactivos útiles para procesos fluídicos distintos de los procesos de secuenciación de ácido nucleico pueden proporcionarse en los depósitos de un cartucho de fluidos. Por ejemplo, un cartucho de fluidos puede contener reactivos útiles para la secuenciación de otros polímeros tales como polipéptidos, polisacáridos o polímeros sintéticos. Alternativa o adicionalmente, también pueden estar presentes reactivos útiles para la síntesis de dichos polímeros.
Sin embargo, volviendo a realizaciones relacionadas con la secuenciación de ácido nucleico esta descripción proporciona además un método de secuenciación que incluye las etapas de (a) proporcionar un cartucho fluídico que tiene (i) una celda de flujo que tiene una superficie ópticamente transparente, (ii) una muestra de ácido nucleico, (iii) una pluralidad de reactivos para una reacción de secuenciación, y (iv) un sistema fluídico para suministrar los reactivos a la celda de flujo; b) suministrar un aparato de detección que comprende (i) una pluralidad de microfluorómetros, en donde cada uno de los microfluorómetros comprende un objetivo configurado para la detección de imagen de campo ancho, y (ii) una etapa de muestra; (c) suministrar el cartucho de fluidos a la etapa de muestra, en donde la superficie ópticamente transparente se coloca en el plano de imágenes; y (d) llevar a cabo operaciones fluídicas de un procedimiento de secuenciación de ácido nucleico en el cartucho de fluidos y las operaciones de detección del procedimiento de secuenciación de ácido nucleico en el aparato de detección, en donde (i) los reactivos se administran a la célula de flujo mediante el sistema fluídico, y (ii) las características de ácido nucleico son detectadas por la pluralidad de microfluorómetros.
Cualquiera de una variedad de aparatos de detección y/o cartuchos de fluidos descritos en la presente descripción puede usarse en el método anterior. Una ventaja particular del aparato expuesto en la presente memoria es la modularidad que permite la secuenciación conveniente de diferentes muestras usando un único aparato de detección. Como se establece anteriormente en el presente documento, la(s) muestra(s), los reactivos y el hardware fluídico suficientes para un procedimiento de secuenciación completo pueden estar autónomos en un cartucho de fluidos que puede suministrarse a un aparato de detección para un procedimiento de secuenciación. Una vez que se completa el procedimiento de secuenciación, el cartucho de fluidos puede eliminarse de manera que el aparato de detección esté listo para otra ejecución de secuenciación. Separando el aparato de detección y el sistema fluídico en módulos separados, el presente sistema permite secuenciar múltiples muestras diferentes a la vez que se evita el riesgo de contaminación cruzada entre muestras que se producen para los sistemas existentes donde el aparato de detección y el sistema fluídico están integrados permanentemente. Además, para realizaciones donde los componentes de detección son relativamente caros y técnicamente difíciles de ensamblar, la modularidad establecida en la presente memoria proporciona ahorros de costes permitiendo que el aparato de detección se mantenga para uso repetido mientras que el precio típicamente más bajo y más fácil de ensamblar componentes fluidos se reemplazan o descartan por un acto que puede ser tan simple como presionar un botón de eyección.
Así pues, un método de secuenciación puede incluir las etapas de (a) proporcionar un cartucho de fluidos que tiene (i) una celda de flujo que tiene una superficie ópticamente transparente, (ii) una muestra de ácido nucleico, (iii) una pluralidad de reactivos para una reacción de secuenciación y (iv) un sistema fluídico para suministrar los reactivos a la celda de flujo; b) suministrar un aparato de detección que comprende (i) una pluralidad de microfluorómetros, en donde cada uno de los microfluorómetros comprende un objetivo configurado para la detección de imagen de campo ancho, y (ii) una etapa de muestra; (c) suministrar el cartucho de fluidos a la etapa de muestra, en donde la superficie ópticamente transparente se coloca en el plano de imágenes; (d) llevar a cabo operaciones fluídicas de un procedimiento de secuenciación de ácido nucleico en el cartucho de fluidos y las operaciones de detección del procedimiento de secuenciación de ácido nucleico en el aparato de detección, en donde (i) los reactivos se administran a la célula de flujo mediante el sistema fluídico, y (ii) las características de ácido nucleico son detectadas por la pluralidad de microfluorómetros; (e) retirar el cartucho de fluidos de la etapa de muestra; (f) suministrar un segundo cartucho de fluidos a la etapa de muestra; y (g) llevar a cabo operaciones fluídicas de un procedimiento de secuenciación de ácido nucleico en el segundo cartucho de fluidos y operaciones de detección del procedimiento de secuenciación de ácido nucleico en el aparato de detección.
Un segundo cartucho de fluidos incluirá generalmente una segunda muestra de ácido nucleico que es diferente de la muestra de ácido nucleico en el primer cartucho de fluidos. Sin embargo, si se desea, dos cartuchos fluídicos pueden incluir muestras duplicadas, por ejemplo, para proporcionar análisis estadístico u otras comparaciones técnicas. Un sistema o método de secuenciación de la presente descripción puede usarse repetidamente para un número de cartuchos de fluidos. Por ejemplo, se contempla que se puedan usar al menos 2, 5, 10, 50, 100 o 1000 o más cartuchos de fluidos.
En realizaciones particulares, una celda de flujo que contiene una pluralidad de canales puede manipularse y detectarse en comunicación de fluido de manera escalonada. Más específicamente, las manipulaciones de fluido pueden llevarse a cabo en un primer subconjunto de los canales en la celda de flujo mientras se produce la detección óptica para un segundo subconjunto de los canales. Por ejemplo, en una configuración, al menos cuatro canales lineales pueden disponerse paralelos entre sí en la celda de flujo (por ejemplo, los canales 1 a 4 pueden ordenarse en filas secuenciales). Las manipulaciones de fluido pueden llevarse a cabo en cualquier otro canal (por ejemplo, los canales 1 y 3) mientras se produce la detección para los otros canales (por ejemplo, canales 2 y 4). Esta configuración particular puede acomodarse usando un cabezal de lectura que tenga acoplados varios microfluorómetros en una configuración separada de modo que los objetivos se dirijan a cualquier otro canal de la celda de flujo. En este caso, el cabezal de lectura puede tener un número de microfluorómetros que es la mitad del número de canales en la celda de flujo. Asimismo, las válvulas pueden accionarse para dirigir el flujo de reactivos para un ciclo de secuenciación para alternar canales mientras que los canales que se detectan se mantienen en un estado de detección. En este ejemplo, un primer conjunto de canales alternos puede experimentar etapas de fluido de un primer ciclo de secuenciación y un segundo conjunto de canales alternos experimentan etapas de detección de un segundo ciclo de secuenciación. Una vez que se completan las etapas de fluido del primer ciclo y se completan las etapas de detección del segundo ciclo, el cabezal de lectura puede estar escalonado sobre (por ejemplo, a lo largo de la dimensión x) el primer conjunto de canales y válvulas alternos puede accionarse para suministrar reactivos de secuenciación al segundo conjunto de canales. Luego pueden completarse las etapas de detección para el primer ciclo (en el primer conjunto de canales) y pueden producirse etapas de fluido para un tercer ciclo (en el segundo conjunto de canales). Las etapas pueden repetirse de esta manera varias veces hasta que se haya realizado un número deseado de ciclos o hasta que se complete el procedimiento de secuenciación.
Una ventaja de las etapas de fluido y detección escalonadas expuestas anteriormente es proporcionar una ejecución de secuenciación global más rápida. En el ejemplo anterior, una ejecución de secuenciación más rápida dará como resultado la configuración escalonada (en comparación con la manipulación en comunicación de fluido de todos los canales en paralelo seguido de la detección de todos los canales en paralelo) si el tiempo requerido para la manipulación de fluido es aproximadamente el mismo que el tiempo requerido para la detección. Por supuesto, en realizaciones donde la programación para las etapas de detección no es la misma que la programación para las etapas de fluido, la configuración escalonada puede cambiarse de cualquier otro canal a un patrón más apropiado para acomodar el barrido paralelo de un subconjunto de canales mientras otro subconjunto de canales experimenta las etapas de fluido.
Según varias realizaciones expuestas anteriormente, se proporciona un aparato de detección que tiene un factor de forma relativamente compacto. En algunas realizaciones, un aparato de detección puede tener una huella que es aproximadamente 1 pie cuadrado y puede ocupar un volumen de aproximadamente 1 pie cúbico. Son posibles áreas y/o volúmenes más pequeños. También son útiles áreas de huella y/o volúmenes ligeramente más grandes. Como se ejemplifica en la presente descripción, un aparato puede tener una huella de pie relativamente pequeña y ocupar un volumen relativamente pequeño de espacio cuando está en un estado completamente funcional, por ejemplo, después de aceptar un cartucho de fluidos internamente. Se han ejemplificado varios aparatos en el presente documento en el contexto de su uso como unidades independientes capaces de realizar cualquiera de una variedad de procedimientos deseados. Sin embargo, esos ejemplos no pretenden ser limitantes y, de hecho, la forma compacta de las realizaciones expuestas anteriormente permite disponer varios aparatos en un espacio pequeño. Por ejemplo, varios aparatos pueden apilarse y/o colocarse en un armario o estante para su colocación conveniente. El armario o bastidor puede incluir uno o más estantes, cada uno definen uno o más espacios de recepción, y cada espacio de recepción puede estar configurado para alojar uno o más aparatos de detección.
Por consiguiente, varios aparatos de detección de la presente divulgación pueden usarse juntos en un sistema más grande, por lo que cada aparato de detección funciona efectivamente como un módulo o nodo del sistema. Por ejemplo, varios aparatos de detección pueden estar físicamente coubicados en un estante y pueden estar conectados electrónicamente. La red electrónica, ya sea para un aparato que se ubica conjuntamente o para un aparato que se ubica en ubicaciones distribuidas, puede permitir el análisis de datos global y/o el control global de la función del instrumento. Para las realizaciones de secuenciación de ácido nucleico, varios aparatos de detección diferentes pueden funcionar como un sistema de secuenciación, por ejemplo, para secuenciar la misma muestra (o subfracciones de la misma muestra) en paralelo. Un sistema de secuenciación de ácido nucleico puede incluir un ordenador de control que proporciona instrucciones a cada aparato de detección individual. Como tal, uno cualquiera del aparato de detección en el sistema de secuenciación de ácido nucleico puede tomar instrucciones de un ordenador de control que sea físicamente externo a ese aparato de detección. Los datos de secuencia de ácido nucleico de varios aparatos de detección pueden analizarse en el ordenador de control y/o en un ordenador de análisis separado. Por lo tanto, un ordenador central puede usarse para el análisis global de los datos de la secuencia de ácido nucleico de varios aparatos de detección diferentes en un sistema en red.
Pueden utilizarse mecanismos de retroalimentación en el control de varios aparatos de detección que forman módulos en un sistema más grande. Por ejemplo, los bucles de retroalimentación de control de calidad pueden usarse para observar parámetros que son determinantes o diagnósticos de la calidad de los datos de la secuencia de ácido nucleico y pueden tomarse acciones de respuesta adecuadas. En el documento US 7.835.871, por ejemplo, se describen bucles de retroalimentación ejemplares que pueden adaptarse fácilmente para su uso en un sistema de secuenciación modular de la presente divulgación. Un ordenador de control puede programarse para incluir bucles de retroalimentación en base a tales parámetros y respuestas para controlar la calidad de salida (por ejemplo, calidad de datos de secuencia) para una red del aparato de detección.
Los datos de secuencia de ácido nucleico que se obtienen a partir de uno o más aparatos de detección que funcionan como módulos o nodos en un sistema pueden analizarse en tiempo real. Los datos de secuencia pueden evaluarse contra un parámetro, por ejemplo comparando la secuencia de ácido nucleico adquirida en tiempo real con una secuencia estándar. Basándose en los resultados de la comparación, se puede tomar una decisión de si proceder o no con un procedimiento de secuenciación en uno o más del aparato de detección. Por ejemplo, las muestras ambientales o las muestras de patología pueden secuenciarse usando varios módulos en un sistema de secuenciación y los datos emitidos a partir de los módulos pueden compararse con secuencias conocidas para contaminantes sospechosos o patógenos. Una vez que se han recogido suficientes datos para determinar la presencia o ausencia de un contaminante o patógeno particular, la secuenciación puede detenerse en uno o más de los módulos. Los protocolos ilustrativos para análisis en tiempo real que pueden adaptarse a un sistema en red de la presente descripción se describen en el documento US 2011/0246084 A1. El análisis de datos y los procedimientos de decisión ilustrados anteriormente pueden realizarse de manera completamente automatizada sin intervención humana. Por ejemplo, los procedimientos pueden llevarse a cabo en un ordenador de control u otro ordenador que sea parte de un sistema de red expuesto en el presente documento.
Alternativa o adicionalmente a conectarse electrónicamente, varios aparatos de detección que se ubican físicamente en un bastidor pueden conectarse en red con respecto al suministro de muestras y/o reactivos. Por ejemplo, los cartuchos se pueden suministrar al aparato de detección apropiado utilizando un dispositivo autocargador o robótico. Específicamente, los cartuchos fluídicos pueden retirarse automáticamente de una ubicación de almacenamiento a los dispositivos de detección apropiados. El suministro automático puede estar bajo la(s) instrucción(es) de un ordenador de control u otro ordenador que esté conectado en red al sistema de secuenciación. Además, en algunas modalidades no todos los reactivos usados en un proceso de secuenciación de ácido nucleico necesitan estar contenidos en los cartuchos de fluidos que se usan en un sistema de secuenciación. Más bien, varios aparatos de detección pueden estar en comunicación fluida con uno o más depósitos que contienen reactivos a granel. En este caso, los reactivos pueden suministrarse a varios aparatos de detección desde una ubicación central de almacenamiento de fluidos, por ejemplo, mediante el uso de un sistema central de suministro de fluido. La administración de reactivos puede estar en la(s) instrucción(es) de un ordenador de control u otro ordenador que esté conectado en red a un sistema central de suministro de fluido o que esté en red a un aparato de detección individual en el sistema de secuenciación.
Varias realizaciones de la presente invención se han expuesto en el presente documento en el contexto de secuenciación de ácido nucleico o usando aplicaciones de secuenciación de ácido nucleico como ejemplo. Sin embargo, el aparato y los métodos expuestos en el presente documento no se limitan a aplicaciones de secuenciación de ácido nucleico. Otras aplicaciones son útiles también incluyen, pero no se limitan a, otros tipos de análisis de ácido nucleico tales como los que utilizan marcadores ópticamente detectados. Dos ejemplos son análisis de expresión llevados a cabo en matrices de ácido nucleico y análisis de genotipado llevados a cabo en matrices de ácido nucleico. En cualquier caso, un microfluorómetro, un cabezal de lectura o un aparato de detección expuesto en el presente documento se pueden usar para la detección de las matrices. Además, las matrices pueden incluirse en un cartucho de fluidos y manipularse fluídicamente mediante la modificación adecuada del cartucho de fluidos y los métodos establecidos en la presente descripción. Los métodos basados en matriz ilustrativos que pueden modificarse para su uso con el aparato y los métodos de la presente descripción incluyen, por ejemplo, los descritos en US 2003/0108900, US 2003/0215821 o US 2005/0181394.
Otros ensayos en fase sólida que se llevan a cabo en matrices o en sustratos de múltiples pocillos, tales como ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (Elisa), también pueden usarse en los métodos y aparatos establecidos en la presente descripción. Los formatos que usan marcadores fluorescentes son particularmente útiles ya que las etiquetas pueden detectarse mediante el uso de microfluorómetros, cabezales de lectura o aparatos de detección expuestos anteriormente. Además, los reactivos usados en los Elisa u otros ensayos en fase sólida pueden procesarse en un cartucho de fluidos similar a los establecidos en la presente descripción.
Los métodos y aparatos expuestos en el presente documento también pueden ser útiles para controlar la síntesis de moléculas que son ópticamente detectables o moléculas que se preparan usando reactivos, intermedios o productos secundarios ópticamente detectables. Las moléculas poliméricas que experimentan reacciones cíclicas son particularmente aplicables. Por ejemplo, la síntesis de ácidos nucleicos o polipéptidos utiliza grupos de bloqueo ópticamente detectables o intermedios que pueden detectarse usando un microfluorómetro, un cabezal de lectura o un aparato de detección expuesto en el presente documento. Las etapas de fluidos involucradas en los protocolos sintéticos pueden llevarse a cabo en un cartucho de fluidos similar a los establecidos en la presente descripción.
Otra aplicación útil de los métodos y aparatos establecidos en la presente descripción es la formación de imágenes microscópicas de objetos tales como muestras biológicas. Las muestras particularmente adecuadas son tejidos o células.
Las muestras pueden presentarse sobre un sustrato y detectarse como se ejemplifica en el presente documento para matrices de ácido nucleico. La obtención de imágenes de las propiedades fluorescentes de objetos, tales como muestras biológicas, es particularmente aplicable a los métodos y aparatos establecidos en la presente descripción. Pueden usarse microfluorómetros para tales aplicaciones y opcionalmente manipulaciones fluídicas, por ejemplo, para introducir reactivos marcados con fluorescencia, tales como etiquetas fluorescentes para moléculas diana, pueden realizarse.
A lo largo de esta solicitud, se han mencionado diversas publicaciones, patentes y solicitudes de patente.
El término “que comprende” se entiende en el presente documento como abierto, incluyendo no sólo los elementos citados, sino abarcando además cualquier elemento adicional.
A los efectos de la presente memoria, el término “cada uno” , cuando se utiliza en referencia a una colección de artículos, pretende identificar un artículo individual en la colección, pero no se refiere necesariamente a cada artículo de la colección, a menos que el contexto indique lo contrario con claridad.
Aunque la invención se ha descrito con referencia a los ejemplos proporcionados anteriormente, debe entenderse que pueden realizarse diversas modificaciones sin apartarse de la invención. Por consiguiente, la invención está limitada únicamente por las reivindicaciones.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un aparato de detección que comprende
    (a) un carro que comprende una pluralidad de microfluorómetros,
    en donde cada uno de los microfluorómetros comprende un objetivo configurado para la detección de imágenes de campo amplio,
    en donde la pluralidad de microfluorómetros se coloca para adquirir simultáneamente una pluralidad de imágenes de campo ancho en un plano común, y
    en donde cada una de las imágenes de campo ancho es de un área diferente del plano común;
    (b) una etapa de traslación configurada para mover el carro en al menos una dirección paralela al plano común; y
    (c) una etapa de muestra configurada para mantener un sustrato en el plano común; y en donde cada uno de los microfluorómetros además comprende un módulo de enfoque automático dedicado, y en donde el módulo de enfoque automático para un primer microfluorómetro del aparato está configurado para integrar datos de un módulo de enfoque automático para un segundo microfluorómetro del aparato, por lo que el módulo de enfoque automático altera el foco del primer microfluorómetro basándose en la posición de enfoque del primer microfluorómetro y la posición de enfoque del segundo microfluorómetro.
  2. 2. El aparato de detección de la reivindicación 1, en donde el módulo de enfoque automático comprende un detector y un accionador, en donde el accionador está configurado para alterar el foco del microfluorómetro con respecto al plano común, y en donde el detector está configurado para dirigir el movimiento del accionador.
  3. 3. El aparato de detección de la reivindicación 2, en donde el detector está configurado además para obtener la imagen de campo amplio.
  4. 4. El aparato de detección de la reivindicación 1 o 2, en donde cada uno de los microfluorómetros además comprende un divisor de haz y un detector, en donde el divisor de haz está colocado para dirigir radiación de excitación desde una fuente de radiación de excitación al objetivo y para dirigir la radiación de emisión desde el objetivo al detector.
  5. 5. El aparato de detección de la reivindicación 1 o 2, en donde cada uno de los microfluorómetros además comprende la fuente de radiación de excitación.
  6. 6. El aparato de detección de la reivindicación 5, en donde cada uno de los microfluorómetros además comprende al menos dos fuentes de radiación de excitación.
  7. 7. El aparato de detección de la reivindicación 1, 2 o 5, en donde el objetivo de cada uno de los microfluorómetros tiene una apertura numérica entre 0,2 y 0,5.
  8. 8. El aparato de detección de la reivindicación 1, 2, 5 o 7, en donde cada uno de los microfluorómetros está configurado para detectar a una resolución suficiente para distinguir características que tienen menos de 50 micras de distancia.
  9. 9. El aparato de detección de la reivindicación 1, 2, 5, 7 u 8, en donde la imagen de campo amplio para cada uno de los microfluorómetros tiene un área de al menos 1 mm2.
  10. 10. El aparato de detección de la reivindicación 1, 2, 5, 7, 8 o 9, en donde el carro impide el movimiento lateral entre los microfluorómetros.
  11. 11. El aparato de detección de la reivindicación 1, 2, 5, 7, 8, 9 o 10, en donde el carro comprende al menos 4 microfluorómetros, en donde los objetivos de los al menos cuatro microfluorómetros están dispuestos en al menos dos filas.
  12. 12. Un método para adquirir imágenes de un sustrato, que comprende
    (a) proporcionar un sustrato que comprende características fluorescentes sobre una superficie; (b) adquirir una pluralidad de imágenes de campo amplio de una primera parte de la superficie usando una pluralidad de microfluorómetros,
    en donde cada uno de los microfluorómetros adquiere una imagen de campo amplio de una ubicación diferente de la superficie,
    en donde la pluralidad de microfluorómetros se fija a un carro; y
    (c) trasladar el carro en una dirección paralela a la superficie y repetir (b) para una segunda parte de la superficie,
    que además comprende enfocar individualmente cada microfluorómetro en la pluralidad de microfluorómetros usando una técnica de enfoque automático, en donde cada uno de los microfluorómetros comprende un módulo de autoenfoque;
    en donde el módulo de enfoque automático usado para un primer microfluorómetro de la pluralidad de microfluorómetros integra datos de un módulo de enfoque automático usado para un segundo microfluorómetro de la pluralidad de microfluorómetros, por lo que el foco del primer microfluorómetro se ajusta en base a la posición de enfoque del primer microfluorómetro y la posición de enfoque del segundo microfluorómetro.
  13. 13. El método de la reivindicación 12, en donde la pluralidad de imágenes de campo ancho se adquiere simultáneamente en (b).
  14. 14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde el método además comprende
    (d) devolver el carro a una posición para adquirir una segunda pluralidad de imágenes de campo ancho de la primera porción de la superficie.
  15. 15. El método de la reivindicación 14, que además comprende modificar las características fluorescentes en la superficie después de (c) y antes de (d), en donde la segunda pluralidad de imágenes de campo ancho es diferente de la primera pluralidad de imágenes de campo amplio, en donde las características fluorescentes comprenden ácidos nucleicos y la modificación comprende alterar ácidos nucleicos en una técnica de secuenciación por síntesis.
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