BR112020010508A2

BR112020010508A2 - anticorpos anti-alfa-sinucleína

Info

Publication number: BR112020010508A2
Application number: BR112020010508-2A
Authority: BR
Inventors: Patrick Downey; Kerry Louise Tyson; Marco Kriek; Lorenzo De Lichtervelde; Daniel John Lightwood; David James MCMILLAN; Peter Charles Elliott; Terence Seward Baker
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-11-24
Also published as: KR20200099168A; EP3724228A1; GB201720970D0; IL303672A; TW201927810A; IL303672B1; UY38012A; JP2021507693A; EA202091482A1; PH12020551006A1; JP7326281B2; ECSP20039610A; TWI806940B; AU2018382527A1; TW202346343A; RU2020123300A3; CL2020001607A1; IL275223A; PE20201062A1; CN111655727A

Abstract

A presente invenção se refere a anticorpos de ligação à alfa-sinucleína e fragmentos dos mesmos, capazes de se ligarem à alfa-sinucleína como um monômero e em fibrilas e previnem a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína. Os anticorpos da presente invenção são para uso no tratamento de alfa-sinucleinopatias, incluindo a doença de Parkinson.

Description

“ANTICORPOS ANTI-ALFA-SINUCLEÍNA” CAMPO DE INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-alfa-sinucleína e a um método de uso dos mesmos para tratar sinucleinopatias. Em particular, a presente invenção se refere a anticorpos anti-alfa-sinucleína humanos e a seu uso no tratamento da doença de Parkinson.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A alfa-sinuclena é uma pequena proteína solúvel longa de 140 aminoácidos existente em formas radicalmente diferentes. A alfa-sinucleina é encontrada principalmente nos terminais nervosos pré-sinápticos e, embora sua função precisa seja desconhecida, os pesquisadores acreditam que ela desempenha um papel central em vários processos neurodegenerativos.

[0003] Nos últimos 15 anos, demonstrou-se que a alfa-sinucleína desempenha um papel fundamental na patogênese de todas as formas da doença de Parkinson. As mutações genéticas ou multiplicações genéticas do gene da alfa-sinucleína causam a doença de Parkinson (DP) de início precoce familiar. Curiosamente, nas famílias de multiplicação de locus genético, o efeito patogênico é claramente dependente da dosagem do gene. As duplicações genéticas causam uma forma de início relativamente precoce de DP (-47 anos), que tem um curso normal da doença, enquanto as triplicações gênicas estão associadas a uma idade muito precoce de início (-33 anos) e a um curso muito rápido da doença. Em todas as formas da doença de Parkinson, a alfa-sinucleína é o principal constituinte dos corpos de Lewy, a principal característica patológica da doença.

[0004] A patologia dos corpos de Lewy se expande durante o curso da doença e se propõe que a alfa-sinucleína atue como um príon, como uma proteína, que se desdobra incorretamente para formar oligômeros tóxicos e agregados que podem se propagar a partir de neurônios afetados a não afetados (Olanow CW et al. Movement Disorders, volume 28, nº 1, 2013). As terapias existentes atualmente não são capazes de impedir a propagação da doença e apenas auxiliam no tratamento dos sintomas associados à perda progressiva de atividades dependentes de neurônios motores. Em

2014, Tran HT et al (Tran HT et al, Cell Reports 7, 2.054 a 2.065, 26 de junho de 2014) mostraram que a administração intraperitoneal de um anticorpo monoclional para alfa- sinucleína incorretamente dobrada a camundongos previamente injetados de modo intrastrial com fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleína reduziu a patologia de corpos de Lewy, melhorou a perda de neurônios dopaminérgicos de substância nigra e aprimorou os comprometimentos motores. Portanto, ainda permanece a necessidade de uma imunoterapia passiva que possa exercer efeitos terapêuticos na DP e em outras sinucleinopatias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A presente invenção aborda a necessidade acima identificada, fornecendo anticorpos anti-alfa-sinucleína de acordo com as seguintes modalidades.

[0006] Modalidade 1: Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 selecionada a partir da SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 selecionada a partir da SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 selecionada a partir da SEQ ID NO: 6.

[0007] Modalidade 2: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a Modalidade 1, em que o resíduo de aminoácido glicina (Gly; G) na posição 6, com referência à SEQ ID NO: 3, é substituído por alanina (Ala; A).

[0008] Modalidade 3: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com as Modalidades 1 ou 2, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a dois ou mais resíduos de aminoácidos de alfa-sinucleína entre as posições 113 e 129, com referência à SEQ ID NO: 8, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga pelo menos a resíduos de aminoácidos D119, N122 e Y125.

[0009] Modalidade 4: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo,

de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína.

[0010] Modalidade 5: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é capaz de se ligar à alfa-sinucleína como um monômero e em fibrilas.

[0011] Modalidade 6: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, que tem uma afinidade de ligação superior para alfa-sinucleína em fibrilas em comparação com alfa-sinucleina como monômero caracterizada por uma constante de dissociação (Kp) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para alfa-sinucleína em fibrilas.

[0012] Modalidade 7: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, que tem uma (Ko) para alfa- sinucleína em fibrilas de 60 pM ou menos.

[0013] Modalidade 8: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

[0014] Modalidade 9: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.

[0015] Modalidade 10: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a Modalidade 9, em que o anticorpo de comprimento total é selecionado a partir de uma IgG1, IgG4 ou IgG4P.

[0016] Modalidade 11: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado a partir de um fragmento Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv, um dAb ou um VHr.

[0017] Modalidade 12: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou b. uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25.

[0018] Modalidade 13: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 11, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: a. uma cadeia leve, de acordo com a SEQ ID NO: 14, e uma cadeia pesada, de acordo com a SEQ ID NO: 26; ou b. uma cadeia leve, de acordo com a SEQID NO: 18, e uma cadeia pesada de acordo, com a SEQ ID NO: 26; ou c. uma cadeia leve, de acordo com a SEQ ID NO: 22, e uma cadeia pesada, de acordo com a SEQ ID NO: 26.

[0019] Modalidade 14: Um polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 13.

[0020] Modalidade 15: O polinucleotídeo isolado, de acordo com a Modalidade 14, em que o polinucleotídeo codifica: a. uma região variável de cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 15, 19 ou 23; ou ii. compreende a SEQ ID NO: 15 ou 19 ou 23; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 15, 19 ou 23; ou b. uma região variável de cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: iv. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 27; ou v. compreende a SEQ ID NO: 27; ou vi. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 27; ou c. uma cadeia leve, em que o polinucleotídeo: vii. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 16, 20 ou 24; ou viii. compreende SEQ ID NO: 16, 20 ou 24; ou ix. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 16, 20 ou 24; d. uma cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: x. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 28; ou xi. compreende SEQ ID NO: 28; ou xii. consiste essencialmente de SEQ ID NO: 28.

[0021] Modalidade 16: Um vetor de clonagem ou expressão que compreende um ou mais polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das Modalidades 14 ou 15.

[0022] Modalidade 17: Uma célula hospedeira que compreende: a. um ou mais polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das Modalidades 14 ou 15, ou b. um ou mais vetores de expressão, de acordo com a Modalidade 16.

[0023] Modalidade 18: Um processo para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 13, que compreende cultivar a célula hospedeira, acordo com a modalidade 17, em condições adequadas para a produção do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e isolar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0024] Modalidade 19: Uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 13, e um ou mais carreadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, em que a composição farmacêutica compreende um ou mais ingredientes ativos adicionais.

[0025] Modalidade 20: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 13, ou a composição farmacêutica, de acordo com a Modalidade 19, para uso em terapia.

[0026] Modalidade 21: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a qualquer uma das Modalidades 1 a 13, ou a composição farmacêutica, de acordo com a Modalidade 19, para uso no tratamento de uma ou mais sinucleinopatias.

[0027] Modalidade 22: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a Modalidade 21, em que a sinucleinopatia é selecionada a partir de doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e herdadas da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1).

[0028] Modalidade 23: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a Modalidade 22, em que a sinucleinopatia é a doença de Parkinson.

[0029] Modalidade 24: Um método de tratamento de uma sinucleinopatia em um paciente que compreende administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 13, ou a composição farmacêutica, de acordo com a Modalidade 19.

[0030] Modalidade 25: O método de acordo com a Modalidade 24, em que a sinucleinopatia é selecionada a partir da doença de Parkinson (DP) (incluindo as formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), preferencialmente doença de Parkinson.

[0031] Modalidade 26: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a qualquer uma das Modalidades 1 a 13, ou a composição farmacêutica, de acordo com a Modalidade 19, para uso no diagnóstico de sinucleinopatia, de preferência no diagnóstico da doença de Parkinson.

BREVE DESCRIÇÃO DOS OS DESENHOS

[0032] Figura 1. (A) SDS-PAGE de amostras de expressão de alfa-sinucleína. Alfa-sinucleína com etiqueta de His (1) e após a remoção da etiqueta de His por protease de TEV (2), cromatografia por exclusão de tamanho Superdex 75 na alfa- sinucleína humana tratada com protease de TEV (3). Marcador de peso molecular de proteínas SeeBluePlus2 (Invitrogen) (M). (B) SDS-PAGE de alfa-sinucleína humana purificada a partir do sobrenadante Expi293 como proteína não etiquetada de tipo selvagem (4). Marcador de peso molecular de proteínas SeeBluePlus2 (Invitrogen) (M).

[0033] Figura 2, (A) Análise de fibrila pelo ensaio JC-1 de um monômero sem fluorescência e de fibrilas com uma fluorescência máxima a 540 nm. (B) Exemplo típico para o espectro de enrolamento aleatório de alfa-sinucleína humana monomérica (comprimento de onda de 1.646 cm!) e formação de inter-B-folhas em fibrilas de sinucleína-alfa humana recombinante (comprimento de onda de 1.625 a

1.630 cm”).

[0034] Figura 3. Ensaio de ligação ELISA. Ligação ELISA de (A) Fab10HIS de camundongo 5811 a monômero e fibrilas de alfa-sinucleína humana recombinante e peptídeo PVDPDNEAYE de alfa-sinucleína humana e (B) IgG1 de camundongo 5811 a monômero e fibrilas de alfa-sinucleína humana recombinante.

[0035] Figura 4. (A) Western blot que mostra a ligação de IgG1 de camundongo 5811 à alfa-sinucleína humana e beta-sinucleína humana. 1, alfa-sinucleína humana; 2, alfa-sinucleína humana (rPeptídeo); 3, beta-sinucleíina humana (rPeptídeo); Marcador, MagicMark XP. (B) Alterações de deslocamentos químicos em RMN que mostram o epítopo previsto de Fab de camundongo 5811 em alfa-sinucleína humana.

[0036] Figura 5. Inibição da ligação de Fab 5811 à alfa-sinucleína imobilizada (barras à esquerda, monômero e fibrilas à direita, respectivamente, para cada um dos peptídeos testados).

[0037] Figura 6. Western blot de varredura de alanina para a caracterização do epítopo. (A) 4 a 12% de análise NuPage Bis/Tris de mutantes de aminoácido único e do tipo selvagem de alfa-sinucleína humana (com etiqueta His). Linhas: M,

SeeBluePlus2; 1, h a-syn V118A; 2, h a-syn D119A; 3, h a-syn P120A; 4, h a-syn D121A; 5, h a-syn N122A; 6, h a-syn E123A; 7, h a-syn A1248; 8, h a-syn Y125A; 9, h a-syn E126A; 10, h a-syn M127A; 11, h a-syn P128A; 12 e 13 h de a-syn do tipo selvagem. PVDF blot usando (B) mFab 5811 e (C) mlgG 5811 como primários anticorpos. Linhas: M, SeeBluePlus2; 1, h a-syn V118A; 2, h a-syn D119A; 3, h a-syn P120A; 4, h a-syn D121A; 5, h a-syn N122A; 6, h a-syn E123A; 7, h a-syn A124S; 8, h a-syn Y125A; 9, h a-syn E126A; 10, h a-syn M127A; 11, h a-syn P128A; 12 h de a- syn do tipo selvagem (com etiqueta His); 13, MagicMark XP; 14, h a-syn do tipo selvagem (sem etiqueta).

[0038] Figura 7. Humanização da cadeia leve. 5811 é para a sequência de cadeias leves variáveis do rato. 5811gL5, 5811gL8 e 5811gL14 são para os enxertos humanizados de cadeia leve variável de anticorpo 5811 utilizando a linha germinativa humana IGKV1-39 como a estrutura aceitadora. As CDRs são mostradas em negrito/sublinhado. O resíduo doador é mostrado em negrito/itálico e está sombreado: Y71. A mutação na CDR-L3 para modificar um potencial local de desamidação é mostrada em negrito/sublinhado e está sombreada: G94A.

[0039] Figura 8. Humanização da cadeia pesada. 5811 é para a sequência de cadeias pesadas variáveis de rato. 581 1gH4 é para o enxerto humanizado de cadeia pesada variável de anticorpo 5811 utilizando a linha germinativa humana IGHV3-15 como a estrutura aceitadora. As CDRs são mostradas em negrito/sublinhado. Os resíduos doadores são mostrados em negrito/itálico e são sombreados: A49 e A100.

[0040] Figura 9. Imuno-histoquímica. Imunorreatividade nas seções cerebrais de pacientes com DP (A-E) e pacientes sem DP (F-H). (A, C). No córtex temporal de pacientes com DP, o anticorpo 5811 mIgG1 marcou o neurópilo e o citoplasma de algumas células; as estruturas semelhantes a corpos de Lewy ocasionais foram observadas (setas brancas). (D, E) O anticorpo 5811 mIgG1 marcou recursos semelhantes a corpos de Lewy (setas brancas) na substância nigra de pacientes com DP. (F, G) Nos tecidos corticais temporais de não DP, o anticorpo 5811 mIgG1 também marcou o neurópilo, mas nenhuma estrutura semelhante a corpos de Lewy foi observada. (H) Nenhuma estrutura semelhante a corpos de Lewy foi observada na substância nigra de um indivíduo sem DP; setas pretas apontam para etiquetamento inespecífico correspondente a neurônios e fibras neuronais contendo neuromelanina.

Barra de escala = 50 um.

[0041] Figura 10. Ensaio de agregação à base de células (células HEK); anticorpos da presente invenção foram capazes de inibir a agregação de alfa- sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína, com ICs5o inferior a 5 nM. Barras de erro representam erro padrão de medição (SEM, N=4,n=12).

[0042] Figura 11. Ensaio de agregação à base de células (neurônios primários).

Os anticorpos de acordo com a presente invenção foram capazes de inibir a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína em neurônios primários de camundongo que expressam níveis endógenos de alfa-sinucleína, com uma ICso inferior a 5 nM. Barras de erro representam erro padrão da média (SEM, N =5,n=17).

[0043] Figura 12. Imagens imuno-histoquímicas da patologia da alfa-sinucleina (setas) em diferentes regiões do cérebro de camundongos SNCA-OVX injetados com PFF de camundongo.

[0044] Figura 13. Quantificação da patalogia da alfa-sinucleíina em diferentes regiões do cérebro de camundongos SNCA-OVX no córtex cerebral, neoestriado e substância nigra.

[0045] Figura 14. Perfis farmacocinéticos de um anticorpo 5811 de alfa-sinucleína em camundongos do tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0046] A presente divulgação será agora descrita em relação a aspectos não limitativos particulares e modalidades dos mesmos e com referência a certas figuras e exemplos.

[0047] Os termos técnicos são usados pelo senso comum, salvo indicação em contrário. Se um significado específico levar a termos específicos, definições de termos serão fornecidas no contexto em que os termos são usados.

[0048] Quando o termo “compreendendo” é usado na presente descrição e reivindicações, ele não exclui outros elementos. Para os fins da presente divulgação,

o termo “consistindo em” é considerado uma modalidade preferencial do termo “composto de”.

[0049] Quando um artigo indefinido ou definido é usado quando se refere a um substantivo singular, por exemplo, “um”, “uma” ou “a/o”, isso inclui um plural desse substantivo, a menos que algo mais seja especificamente indicado.

[0050] Conforme usado aqui, os termos “tratamento”, “tratando” e similares, referem-se à obtenção do efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção total ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. O tratamento abrange, portanto, qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em humanos, e inclui: (a) impedir que a doença ocorra em um indivíduo que possa estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo; (b) inibir a doença, isto é, interromper seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, isto é, causar regressão da doença.

[0051] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere à quantidade de um anticorpo anti-alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que, quando administrado a um mamífero ou a outro indivíduo para o tratamento de uma doença, é suficiente para produzir um tal tratamento para a doença. A quantidade terapeuticamente eficaz variará dependendo do anticorpo anti-alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, da doença e sua gravidade e da idade, peso, etc., do indivíduo a ser tratado.

[0052] O termo “isolado” significa, ao longo deste relatório descritivo, que o anticorpo, fragmento de ligação a antígeno ou polinucleotídeo, conforme o caso, existe em um meio físico distinto daquele em que pode ocorrer na natureza. A presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína, em que o anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 selecionada a partir da SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 selecionada a partir da SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 selecionada a partir da SEQ ID NO: 6.

[0053] Em uma modalidade, o resíduo de aminoácido glicina (Gly; G) na posição 6, com referência à SEQ ID NO: 3 é substituído por alanina (Ala; A).

[0054] A alfa-sinucleína (ou alfa-sin; a-sinucleína; a-sin ou qualquer outro sinônimo conhecido) refere-se ao nome geral desta proteína e inclui, sem se limitar a, variantes de splicing alternativos, mutantes e alfa-sinucleína de outras espécies (camundongo, macaco, etc.). A menos que especificado de outra forma, quando a alfa-sinucleína humana é pretendida ou mencionada explicitamente, essa alfa- sinucleína compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 8 ou na Uniprot P37840.

[0055] — MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGV

VHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKN EEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA (SEQ ID NO: 8).

[0056] O termo “anticorpo”, como aqui utilizado, geralmente se refere a anticorpos intactos (inteiros), isto é, que compreendem os elementos de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. O anticorpo pode compreender outros domínios de ligação adicionais, por exemplo, de acordo com a molécula DVD-lg, como divulgada no documento WO 2007/024715, ou o chamado (FabFv)2Fc descrito no documento WO?2011/030107. Assim, o anticorpo como empregado aqui, inclui os anticorpos bi, tri ou tetravalentes de comprimento total.

[0057] Os fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos incluem anticorpos de cadeia única (isto é, uma cadeia pesada e uma cadeia leve de comprimento total); Fab, Fab modificado, Fab', Fab modificado, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, anticorpos de domínio único (por exemplo, Vx ou Vi ou VHH ), scFv, anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diacorpos, tricorpos, triacorpos, tetracorpos e fragmentos de ligação a epítopos de qualquer um dos anteriores (ver, por exemplo, Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9): 1.126 a 1.136; Adair e Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209 a 217). Os métodos para criar e fabricar esses fragmentos de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165 a 181). O formato Fab-Fv foi divulgado pela primeira vez no documento WOZ2009/040562 e suas versões estabilizadas com dissulfeto, o Fab-dsFv, foi divulgado pela primeira vez no documento WO2010/035012. Outros fragmentos de anticorpo para uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab' descritos nos Pedidos de Patente Internacionais WO2005/003169, WO2005/003170 e WO2005/003171. Os anticorpos multivalentes podem compreender múltiplas especificidades, por exemplo, biespecíficos ou podem ser monoespecíficos (ver, por exemplo, WO 92/22583 e WOO5/113605). Um exemplo deste último é um Tri-Fab (ou TEM) como descrito no documento WO92/22583.

[0058] Um fragmento de ligação a antígeno alternativo compreende um Fab ligado a dois scFvs ou dsscFvs, cada scFv ou dsscFv se liga ao mesmo alvo ou a um alvo diferente (por exemplo, um scFv ou dsscFv se liga a um alvo terapêutico e um scFv ou dsscFv que aumenta a meia-vida ao se ligar, por exemplo, à albumina). Tais fragmentos de anticorpo são descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2015/197772, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade e particularmente no que diz respeito à discussão de fragmentos de anticorpo.

[0059] Uma molécula de Fab' típica compreende um par de cadeia pesada e cadeia leve em que a cadeia pesada compreende uma região variável VH, um domínio constante CH1 e uma região de dobradiça natural ou modificada e a cadeia leve compreende uma região variável VL e um domínio constante CL. Os dímeros de um Fab', de acordo com a presente divulgação, criam um F(ab')2, onde, por exemplo, a dimerização pode ser através da dobradiça.

[0060] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, se liga a um epítopo da alfa-sinucleína. Na presente invenção, o termo “epítopo” é usado de forma intercambiável para epítopos conformacionais e lineares, onde um epítopo conformacional é composto de seções descontinuadas da sequência primária de aminoácidos do antígeno e um epítopo linear é formado por uma sequência formada por aminoácidos contínuos.

[0061] O epítopo pode ser identificado por qualquer método de mapeamento de epítopos adequado conhecido na técnica em combinação com qualquer um dos anticorpos fornecidos pela presente invenção. Exemplos de tais métodos incluem a seleção de peptídeos de comprimentos variados derivados da alfa-sinucleina de comprimento total para ligação ao anticorpo ou fragmento da presente invenção e identificam o menor fragmento que pode se ligar especificamente ao anticorpo contendo a sequência do epítopo reconhecido pelo anticorpo. Os peptídeos de alfa- sinucleína podem ser produzidos sinteticamente ou por digestão proteolítica da proteína alfa-sinucleína. Os peptídeos que se ligam ao anticorpo podem ser identificados por, por exemplo, análise espectrométrica de massa. Em outro exemplo, a espectroscopia de RMN ou a cristalografia de raios X pode ser usada para identificar o epítopo ligado por um anticorpo da presente invenção. Uma vez identificado, o epítopo pode servir para a preparação de fragmentos que se ligam a um anticorpo da presente invenção e, se necessário, utilizados como um imunogênio para se obter anticorpos adicionais que se ligam ao mesmo epítopo.

[0062] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, se liga a dois ou mais resíduos de aminoácidos de alfa-sinucleína entre a posição 113 e 129, com referência à SEQ ID NO: 8. Em particular, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga pelo menos a resíduos de aminoácidos D119, N122 e Y125 com referência à SEQ ID NO: 8.

[0063] De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína.

[0064] Nesse contexto específico, o termo “prevenir” (e variantes gramaticais dos mesmos) é aqui utilizado intercambiavelmente com o termo “inibir” e indica o efeito que os anticorpos, de acordo com a presente invenção, têm em relação à agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir total ou parcialmente a agregação; ou reduzir completa ou parcialmente, isto é, bloquear a agregação que já teve início a partir da progressão adicional, ou redução completa ou parcial da ocorrência de agregação adicional; ou da reversão total ou parcial da agregação que já ocorreu.

[0065] Sem desejar se ater à teoria, acredita-se que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção se ligue à alfa- sinucleína: i) na forma monomérica e impede a alfa-sinucleína de formar oligômeros e agregados; e/ou ii) na forma oligomérica e fibrilar e impede alfa-sinucleína de propagar neurônios para neurônios e/ou iii) na forma oligomérica e/ou fibrilar e impede a agregação de alfa- sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleina, de preferência a agregação endógena de alfa-sinucleína.

[0066] O termo "fibrilas”, “forma fibrilar”” ou “em fibrilas”, conforme usado aqui em relação à alfa-sinucleína, deve se referir a formas não monoméricas de alfa- sinucleína, incluindo oligômeros de alfa-sinucleíina, que podem constituir as espécies que se espalham dentro e entre estruturas cerebrais.

[0067] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, é capaz de se ligar à alfa-sinucleína como um monômero e em fibrilas. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem uma afinidade de ligação mais forte à alfa-sinucleina nas fibrilas em comparação com a alfa-sinucleina como monômero. Esse é caracterizado por uma constante de dissociação (Kp) de pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para a alfa-sinucleina em fibrilas.

[0068] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma constante de dissociação (Ko) de menos do que 60 pM para alfa-sinucleína monomérica. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma constante de dissociação (Ko) de menos do que 30 pM para alfa- sinucleína em fibrilas.

[0069] O termo “Krv”, como aqui utilizado, refere-se à constante de dissociação que é obtida a partir da razão entre Ka e Ka (isto é, KW/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Ka e Ka referem-se à taxa de velocidade de dissociação e associação, respectivamente, de uma interação particular entre anticorpo-antígeno (fragmento de ligação a antígeno do mesmo). Os valores de Kp para os anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para a determinação da Kp de um anticorpo é usando ressonância de plasma de superfície, tal como o sistema Biacore6, por exemplo, como descrito nos Exemplos aqui apresentados, utilizando alfa-sinucleína natural ou recombinante isolada, uma proteína/polipeptídeo de fusão adequado da mesma ou fibrilas da mesma. Em um exemplo, a afinidade é medida usando alfa-sinucleína humana recombinante, conforme descrito nos Exemplos no presente documento. Para a ressonância e plasma de superfície, as moléculas-alvo são imobilizadas em uma fase sólida e expostas a ligantes em uma fase móvel que corre ao longo de uma célula de fluxo. Se ocorrer a ligação do ligante ao alvo imobilizado, o índice de refração local muda, levando a uma mudança no ângulo da SPR, que pode ser monitorada em tempo real, detectando alterações na intensidade da luz refletida. As taxas de alteração do sinal da SPR podem ser analisadas para produzir constantes de taxa aparentes para as fases de associação e dissociação da reação de ligação. A razão desses valores fornece a constante de equilíbrio aparente (afinidade) (ver, por exemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2.560 a 2.565 (1993)).

[0070] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma maior afinidade de ligação (isto é, menor Kp) para a alfa-sinucleína em fibrilas em comparação com a alfa-sinucleina como monômero. O termo “afinidade” refere-se à força de interação entre o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e alfa-sinucleína.

[0071] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, bloqueia ou impede ou reduz a agregação induzida por alfa-sinucleína, de preferência, induzida por alfa-sinucleína em fibrilas.

[0072] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma IC5so de menos do que 10 nM para o bloqueio da agregação induzida por alfa-sinucleína em fibrilas, de um modo preferencial, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma IC5o de menos do que 5 nM para bloquear a agregação induzida por alfa-sinucleína em fibrilas.

[0073] O termo ICs5o, como aqui utilizado, refere-se à meia concentração inibitória máxima, que é uma medida da eficácia de uma substância, tal como um anticorpo, na inibição de uma função biológica ou bioquímica específica, na presente invenção, agregação induzida por alfa-sinucleína, de preferência alfa-sinucleína em fibrilas. À IC50o é uma medida quantitativa que indica a quantidade de uma substância em particular necessária para inibir um dado processo biológico pela metade.

[0074] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, não se liga à beta-sinucleína e/ou gama- sinucleína e são específicos para alfa-sinucleína.

[0075] “Específico”, tal como aqui utilizado, pretende referir-se a um anticorpo que só reconhece o antígeno ao qual é específico ou um anticorpo que tem afinidade significativamente mais elevada de ligação para o antígeno ao qual é específico (por exemplo, alfa-sinucleína) em comparação com a ligação a antígenos aos quais é não específico (gama e beta-sinucleínas), por exemplo, pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes maior afinidade de ligação.

[0076] Os anticorpos, de acordo com a presente invenção, podem ser obtidos usando qualquer método adequado conhecido na técnica. O polipeptídeo/proteína alfa-sinucleína incluindo proteínas de fusão, células (recombinante ou naturalmente) que expressam o polipeptídeo podem ser usadas para produzir anticorpos que reconhecem especificamente a alfa-sinucleína. O polipeptídeo pode ser o polipeptídeo “maduro” ou um fragmento biologicamente ativo ou derivado do mesmo.

[0077] Em uma modalidade, o polipeptídeo (isto é, antígeno) é o monômero de alfa-sinucleína humana ou um fragmento do mesmo, produzido de preferência como descrito nos Exemplos abaixo.

[0078] Os polipeptídeos, para uso na imunização de um hospedeiro, podem ser preparados por processos bem conhecidos na técnica a partir de células hospedeiras modificadas geneticamente compreendendo sistemas de expressão ou podem ser recuperados de fontes biológicas naturais. No presente pedido, o termo “polipeptídeos” inclui peptídeos, polipeptídeos e proteínas. Eles são usados de forma intercambiável, a menos que especificado de outra forma. O polipeptídeo alfa- sinucleína ou um fragmento do mesmo pode, em alguns casos, fazer parte de uma proteína maior, tal como uma proteína de fusão, por exemplo, fundida a um marcador de afinidade ou similar.

[0079] Os anticorpos gerados contra o polipeptídeo alfa-sinucleína podem ser obtidos, onde a imunização de um animal é necessária, administrando os polipeptídeos a um animal, preferencialmente um animal não humano, usando protocolos conhecidos e de rotina, consulte, por exemplo, Handbook of Experimental Immunology, DM Weir (ed.), Vol. 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muitos animais de sangue quente, como coelhos, camundongos, ratos, ovelhas, vacas, camelos ou porcos podem ser imunizados. No entanto, camundongos, coelhos, porcos e ratos são geralmente mais adequados.

[0080] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica, como a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495 a 497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Inmunology Today, 4:72) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, páginas 77 a 96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0081] Os anticorpos para uso na invenção também podem ser gerados usando métodos de anticorpo de linfócito único por clonagem e expressão de cDNAs da região variável de imunoglobulina gerados a partir de linfócitos únicos selecionados para a produção de anticorpos específicos por, por exemplo, os métodos descritos por Babcook, J. et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7.843 a 7848; WOS92/02551; WO2004/051268 e WO2004/106377.

[0082] O rastreio de anticorpos pode ser realizado usando ensaios para medir a ligação à alfa-sinucleína e/ou ensaios para medir a inibição da alfa-sinucleína para formar fibrilas na presença do anticorpo ou fragmento do mesmo.

[0083] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs), três de uma cadeia pesada e três de uma cadeia leve. Geralmente, as CDRs estão em uma estrutura e juntas formam uma região variável. Por convenção, as CDRs na região variável de cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno são referidas como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 e nas regiões variáveis da cadeia leve como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. Elas são numeradas sequencialmente na direção do N-terminal para o C-terminal de cada cadeia.

[0084] As CDRs são numeradas convencionalmente de acordo com um sistema desenvolvido por Kabat et al. Este sistema é estabelecido em Kabat et al., 1987, em Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, NIH, EUA (daqui em diante “Kabat et al. (Supra)”). Esse sistema de numeração é usado no presente relatório descritivo, exceto onde indicado em contrário,

[0085] As designações de resíduos Kabat nem sempre correspondem diretamente à numeração linear dos resíduos de aminoácidos. A sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos adicionais do que na numeração estrita de Kabat, correspondente a um encurtamento ou inserção em um componente estrutural, seja estrutura ou região determinante de complementaridade (CDR), da estrutura básica de domínio variável. A numeração correta de resíduos de Kabat pode ser determinada para um determinado anticorpo pelo alinhamento de resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”.

[0086] As CDRs do domínio variável da cadeia pesada estão localizadas nos resíduos 31-35 (CDR-H1), resíduos 50-65 (CDR-H2) e resíduos 95-102 (CDR-H3) de acordo com o sistema de numeração Kabat. Contudo, de acordo com Chothia (Chothia, C. e Lesk, AMJ Mol. Biol., 196, 901 a 917 (1987)), o laço equivalente a CDR- H1 se estende do resíduo 26 ao resíduo 32. Assim, a menos que indicado de outra forma “CDR-H1”, conforme aqui utilizado, pretende referir-se aos resíduos 26 a 35,

conforme descrito por uma combinação do sistema de numeração Kabat e definição de loop topológico de Chothia.

[0087] As CDRs do domínio variável da cadeia leve estão localizadas nos resíduos 24-34 (CDR-L1), resíduos 50-56 (CDR-L2) e resíduos 89-97 (CDR-L3) de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[0088] Em uma modalidade, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, humanizado ou humano ou fragmento do mesmo.

[0089] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, pode compreender as regiões de estrutura dos animais nas quais o anticorpo foi criado. Por exemplo, se o anticorpo foi criado em um rato, ele irá compreender as CDRs como definidas e reivindicadas aqui e as regiões de estrutura do anticorpo de rato tal como um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 9 (cuja sequência nucleotídica é mostrada na SEQ ID NO: 11) e uma região variável de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 10 (cuja sequência nucleotídica é mostrada na SEQ ID NO: 12).

[0090] Os anticorpos quiméricos são tipicamente produzidos usando métodos de DNA recombinante. O DNA pode ser modificado substituindo a sequência de codificação por cadeias L e H humanas pelas regiões H e L correspondentes não humanas (por exemplo, murinas) correspondentes (Morrison; PNAS 81, 6.851 (1984)).

[0091] Os anticorpos humanos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas ou leves de comprimento total que são “o produto de” ou “derivadas” de uma sequência germinativa específica se as regiões variáveis ou cadeias de comprimento total do anticorpo forem obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico carregando genes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou rastrear uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana exibida no fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano ou fragmento do mesmo que é “o produto de” ou “derivado de” uma sequência de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana pode ser identificado como tal comparando a sequência de aminoácidos do anticorpo humano com as sequências de aminoácidos das imunoglobulinas da linhagem germinativa humana e selecionando a sequência de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana mais próxima em sequência (ou seja, maior % de identidade) da sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é “o produto de” ou “derivado de” uma sequência de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana específica pode conter diferenças de aminoácidos em comparação com a sequência da linhagem germinativa, devido, por exemplo, a mutações somáticas que ocorrem naturalmente ou à introdução intencional de mutação sítio-dirigida. No entanto, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90% idêntico em sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina humana de linhagem germinativa e contém os resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com a imunoglobulina da linhagem germinativa de sequências de aminoácidos de outras espécies (por exemplo, sequências de linhagem germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência germinativa humana específica não exibirá mais do que diferenças de aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais que 5, ou mesmo não mais que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa.

[0092] Os anticorpos humanos podem ser produzidos por um número de métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Os anticorpos humanos podem ser produzidos pelo método do hibridoma usando linhagens celulares de mieloma humano ou heteromieloma de camundongo-humano (Kozbor, J. Immunol; (1984) 133: 3001; Brodeur, Monoclional Isolated Antibody Production Techniques and Applications,

páginas 51 a 63, Marcel Dekker Inc, 1987). Métodos alternativos incluem o uso de bibliotecas de fagos ou camundongos transgênicos, ambos os quais utilizam repertórios de regiões variáveis humanas (Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12: 433 a 455, Green LL, (1999) J Immuno!l Methods 231:1 1 a 23).

[0093] Em uma modalidade preferencial da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a divulgação é humanizado.

[0094] Como aqui utilizado, o termo “molécula de anticorpo humanizado” se refere a uma molécula de anticorpo, em que a cadeia pesada e/ou cadeia leve contém uma ou mais CDRs (incluindo, caso se pretenda, uma ou mais CDRs modificadas) de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo não humano, como um anticorpo monoclonal de murino ou coelho) enxertado em uma estrutura de região variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (por exemplo, um anticorpo humano). Para uma revisão, consulte Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535 a 539, 1998. Em uma modalidade, em vez de toda a CDR ser transferida, apenas um ou mais dos resíduos determinantes da especificidade de qualquer uma das CDRs descritas acima são transferidos para a estrutura de anticorpos humanos (ver, por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25 a 34). Em uma modalidade, apenas os resíduos determinantes da especificidade de uma ou mais das CDRs descritas acima são transferidos para a estrutura de anticorpo humano. Em outra modalidade, apenas os resíduos determinantes da especificidade de cada uma das CDRs descritas acima são transferidos para a estrutura de anticorpo humano.

[0095] Quando as CDRs são enxertadas, qualquer sequência de estrutura de região variável aceitadora apropriada pode ser usada tendo em conta a classe/tipo de anticorpo doador do qual as CDRs são derivadas, incluindo regiões de estrutura de camundongo, primata e humana.

[0096] Adequadamente, o anticorpo humanizado, de acordo com a presente invenção, tem um domínio variável que compreende regiões estruturais aceitadoras humanas, bem como uma ou mais das CDRs fornecidas aqui especificamente. Assim, é fornecido em uma modalidade um anticorpo humanizado de bloqueio que se liga à alfa-sinucleína, de preferência alfa-sinucleína humana, em que o domínio variável compreende regiões estruturais aceitadoras humanas e CDRs dadoras não humanas.

[0097] Exemplos de estruturas humanas que podem ser utilizadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, UE, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al., Supra). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usados para a cadeia pesada, REI pode ser usado para a cadeia leve e UE, LAY e POM podem ser usados para a cadeia pesada e a cadeia leve. Alternativamente, podem ser utilizadas sequências de linhagem germinativa humana; essas estão disponíveis em: http://www.imgt.org/.

[0098] Em um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, as cadeias pesada e leve do aceitador não precisam necessariamente ser derivadas do mesmo anticorpo e podem, se desejado, compreender cadeias compostas com regiões estruturais derivadas de cadeias diferentes.

[0099] Uma região de estrutura adequada para a cadeia leve do anticorpo humanizado da presente invenção é derivada da linhagem germinativa humana IGKV1-39 que tem SEQ ID NO: 29 e cuja sequência nucleotídica é mostrada em SEQ ID NO: 31.

[0100] Desse modo, em uma modalidade é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 e a sequência dada em SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7 para CDRL3, em que a região de estrutura de cadeia leve é derivada da linhagem germinativa humana IGKV1-39.

[0101] Uma região estrutural adequada para a cadeia pesada do anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, é derivada da linhagem germinativa humana IGHV3-15 que tem a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 39 e cuja sequência nucleotídica é mostrada na SEQ ID NO: 32.

[0102] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para CDR-H3, em que a região de estrutura de cadeia pesada é derivada da linhagem germinativa humana IGHV3-15.

[0103] Em outra modalidade, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

[0104] uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 de acordo com a sequência dada na SEQ ID NO: 1, uma CDR-L2 de acordo com a sequência dada na SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a sequência dada na SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7, em que a região de estrutura de cadeia leve é derivada da linhagem germinativa humana IGKV1-39 e

[0105] uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 de acordo com a sequência dada na SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 de acordo com a sequência dada na SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 de acordo com a sequência dada na SEQ ID NO: 6, em que a região de estrutura de cadeia pesada é derivada da linhagem germinativa humana IGHV3-15.

[0106] Em um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, as regiões estruturais podem não ter as mesmas sequências como aquelas do anticorpo aceitador. Por exemplo, resíduos incomuns podem ser alterados para resíduos que ocorrem com mais frequência para essa classe ou tipo de cadeia aceitadora. Alternativamente, os resíduos selecionados nas regiões estruturais aceitadoras podem ser alterados de forma a corresponderem aos resíduos encontrados na mesma posição no anticorpo doador (ver Riechmann et al., 1998, Nature, 332, 323 a 324). Tais alterações devem ser mantidas no mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para selecionar resíduos nas regiões da estrutura aceitadora que podem precisar ser alteradas é apresentado no documento WO91/09967.

[0107] Assim, em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos na estrutura são substituídos por um resíduo de aminoácido alternativo.

[0108] Desse modo, em uma modalidade, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o resíduo na posição 71 (Phe (F) 71) do domínio variável da cadeia leve (com referência à SEQ ID NO: 17 ou 18) é um resíduo doador (Tyr (Y) 71), ver, por exemplo, a sequência dada na SEQ ID NO:

13e14.

[0109] Em outra modalidade, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que os resíduos em cada uma das posições 49 e 100 (Gly (G) 49 e Thr (T) 100), com referência à SEQ ID NO: 30 do domínio variável de cadeia pesada são resíduos doadores (Ala 49 e Ala 100), ver, por exemplo, a sequência dada na SEQ ID NO: 25 e 26.

[0110] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

1. uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou

2. uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou

3. uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25.

[0111] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma sequência que é 80% semelhante ou idêntica a uma sequência divulgada neste documento, por exemplo, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% sobre parte ou toda a sequência relevante, por exemplo, uma sequência de domínio variável, uma sequência de CDR ou uma sequência de domínio variável, excluindo as CDRs. Em uma modalidade, a sequência relevante é SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade, a sequência relevante é SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21.

[0112] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína humana que compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou semelhança com a sequência dada na SEQ ID

NO: 13, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e/ou em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % de identidade ou semelhança com a sequência dada na SEQ ID NO: 25.

[0113] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína humana em que o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem um domínio variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% semelhante ou idêntico ao da sequência dada na SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21, mas em que o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7 para CDR-L3.

[0114] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína humana, em que o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem um domínio variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% semelhante ou idêntico ao da sequência dada na SEQID NO: 25, mas em que o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.

[0115] “Identidade”, como usado aqui, indica que em qualquer posição específica nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é idêntico entre as sequências. “Similaridade”, como usado aqui, indica que, em qualquer posição específica nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo semelhante entre as sequências. Por exemplo, a leucina pode ser substituída por isoleucina ou valina. Outros aminoácidos que geralmente podem ser substituídos um pelo outro incluem, mas não estão limitados a: - fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos com cadeias laterais aromáticas);

- lisina, arginina e histidina (aminoácidos com cadeias laterais básicas); - aspartato e glutamato (aminoácidos com cadeias laterais ácidas); - asparagina e glutamina (aminoácidos com cadeias laterais de amida); e - cisteína e metionina (aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre).

[0116] Os graus de identidade e similaridade podem ser facilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, Nova York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, DW, ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, AM, e Griffin, HG, eds., Humana Press, Nova Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., ed., M Stockton Press, Nova York, 1991, o software BLAST TY disponível na NCBI (Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403 a 410; Gish, W. & States, DJ 1993, Nature Genet. 3: 266 a 272. Madden, TL et al., 1996, Meth. Enzymol. 266: 131 a 141; Altschul, SF et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3.389 a 3.402; Zhang, J. & Madden, TL 1997, Genome Res. 7: 649 a 656).

[0117] Em uma modalidade, o fragmento de ligação a antígeno pode ser, mas não está limitado a, um Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio único (por exemplo, VH ou VL ou VHH), scFv, dsscFv, anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos itens acima (ver, por exemplo, Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech.23 (9): 1.126 a 1.136; Adair e Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2 (3), 209 a 217). Os métodos para criar e fabricar esses fragmentos de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165 a 181). Outros fragmentos de anticorpo para uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab' descritos nos documentos WO2005/003169, WO2005/003170 e WOZ2005/003171. Anticorpos multivalentes podem compreender múltiplas especificidades, por exemplo, biespecíficos ou podem ser monoespecíficos (ver, por exemplo, WOS92/22853, WOO05/113605, WO2009/040562 e WO2010/035012).

[0118] Um fragmento de ligação a antígeno alternativo compreende um Fab ligado a dois scFvs ou dsscFvs, cada scFv ou dsscFv se liga ao mesmo alvo ou a um alvo diferente (por exemplo, um scFv ou dsscFv se liga a um alvo terapêutico e um scFv ou dsscFv que aumenta a meia-vida ao se ligar, por exemplo, à albumina). Tais fragmentos de anticorpo são descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2015/197772, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade e particularmente no que diz respeito à discussão de fragmentos de anticorpo.

[0119] Os domínios da região constante da molécula de anticorpo da presente invenção, se presentes, podem ser selecionados levando em conta a função proposta da molécula de anticorpo e, em particular, as funções efetoras que podem ser necessárias. Por exemplo, os domínios da região constante podem ser domínios IgA, 1gD, IgE, IgG ou IgM humanos. Em particular, podem ser utilizados domínios da região constante de IgG humana, especialmente dos isotipos IgG1 e IgG3, quando a molécula de anticorpo se destina a usos terapêuticos e são necessárias funções efetoras de anticorpos. Alternativamente, os isotipos IgG2 e IgG4 podem ser utilizados quando a molécula de anticorpo se destina a fins terapêuticos e as funções efetoras de anticorpos não são necessárias. Será apreciado que variantes de sequência desses domínios de região constante também podem ser usadas. Por exemplo, moléculas de IgG4 nas quais a serina na posição 241 foi alterada para prolina como descrito em Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105 a 108 pode ser usado. Será entendido por um indivíduo versado na técnica que os anticorpos podem sofrer uma variedade de modificações pós-traducionais. O tipo e extensão dessas modificações dependem muitas vezes da linhagem celular hospedeira usada para expressar o anticorpo, bem como as condições de cultura. Essas modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação da metioninay formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um resíduo básico carbóxi-terminal (tal como lisina ou arginina), devido à ação de carboxipeptidases (como descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129 a 134, 1995). Por conseguinte, a lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo pode estar ausente.

[0120] Em uma modalidade, um aminoácido C-terminal a partir do anticorpo é clivado durante as modificações pós-traducionais.

[0121] Em uma modalidade, um aminoácido N-terminal a partir do anticorpo é clivado durante as modificações pós-traducionais.

[0122] Em outra modalidade, o anticorpo da presente invenção pode compreender um anticorpo completo com cadeias leve e pesada de comprimento total ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Por exemplo, o anticorpo de comprimento total é selecionado a partir de uma IgG1, a IgG4 ou uma IgG4P.

[0123] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende:

1. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26; ou

2. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 18 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26; ou

3. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26.

[0124] Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente divulgação é fornecido como proteína de fusão de anticorpo de ligação à alfa-sinucleína, que compreende uma porção química de imunoglobulina, por exemplo, um fragmento Fab ou Fab', e um ou dois anticorpos de domínio único (dAb) ligados direta ou indiretamente ao mesmo, por exemplo, como descrito nos documentos WOZ2009/040562, —“WO2010035012, WOZ2011/030107, WOZ2Z011/061492 e WOZ2011/086091, todos aqui incorporados por referência.

[0125] Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende dois anticorpos de domínio, por exemplo, como um emparelhamento pesado variável (VH) e leve variável (VL), opcionalmente ligado por uma ligação dissulfeto.

[0126] Em uma modalidade, o elemento Fab ou Fab' da proteína de fusão tem a mesma ou semelhante especificidade para o único domínio de anticorpo ou anticorpos. Em uma modalidade, o Fab ou Fab' tem uma diferente especificidade para o anticorpo ou anticorpos de domínio único, ou seja, a proteína de fusão é multivalente. Em uma modalidade, uma proteína de fusão multivalente, de acordo com a presente invenção, tem um local de ligação de albumina, por exemplo, um par de VH/VL no mesmo fornece um local de ligação de albumina.

[0127] Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou 17 ou 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25. Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo IgG4 de comprimento total que compreende uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou 17 ou 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25. Em outro exemplo, o anticorpo é um anticorpo I9gG4 de comprimento total compreendendo uma cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 14, 18 ou 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26. Em ainda outro exemplo, o fragmento de ligação a antígeno é um Fab' que compreende uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13, 17 ou 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25.

[0128] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para uso em terapia é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 de acordo com a SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR- H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 de acordo com a SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 de acordo com a SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26;

[0129] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 8, pelo menos os resíduos D119, N122 e Y125.

[0130] Ainda mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que não reage de forma cruzada com beta-sinucleína e se liga à alfa-sinucleína com uma constante de dissociação (Ko) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para o alfa-sinucleina em fibrilas.

[0131] As moléculas biológicas, como anticorpos ou fragmentos, contêm grupos funcionais ácidos e/ou básicos, dando assim à molécula uma carga líquida positiva ou negativa. A quantidade total de carga “observada” dependerá da sequência absoluta de aminoácidos da entidade, do ambiente local dos grupos carregados na estrutura 3D e das condições ambientais da molécula. O ponto isoelétrico (pi) é o pH no qual uma determinada molécula ou superfície acessível ao solvente não carrega carga elétrica líquida. Em um exemplo, o anticorpo anti-alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, pode ser manipulado para ter um ponto isoelétrico apropriado. Isso pode levar a anticorpos e/ou fragmentos com propriedades mais robustas, em particular perfis de solubilidade e/ou estabilidade adequados e/ou características de purificação melhoradas.

[0132] Assim, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-alfa- sinucleína humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo manipulado para ter um ponto isoelétrico diferente daquele do anticorpo originalmente identificado. O anticorpo pode, por exemplo, ser manipulado substituindo um resíduo de aminoácido, como a substituição de um resíduo de aminoácido ácido por um ou mais resíduos de aminoácidos básicos. Alternativamente, os resíduos de aminoácidos básicos podem ser introduzidos ou os resíduos de aminoácidos ácidos podem ser removidos. Alternativamente, se a molécula tiver um valor de pl inaceitavelmente alto, resíduos ácidos podem ser introduzidos para diminuir o pl, conforme necessário. É importante que, ao manipular o pl, seja tomado cuidado para reter a atividade desejável do anticorpo ou fragmento. Assim, em uma modalidade, o anticorpo manipulado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade que o anticorpo ou fragmento “não modificado”.

[0133] Programas como *“ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi tool.hntml e http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d abim/compo-p.html, podem ser usados para prever o ponto isoelétrico do anticorpo ou fragmento.

[0134] Será apreciado que a afinidade dos anticorpos fornecidos pela presente invenção pode ser alterada usando qualquer método adequado conhecido na técnica. A presente invenção, portanto, também se refere a variantes das moléculas de anticorpo da presente invenção, que possuem uma afinidade melhorada pela alfa- sinucleína, em particular pela alfa-sinucleína humana. Tais variantes podem ser obtidas por vários protocolos de maturação por afinidade, incluindo a mutação das CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392 a 403, 1995), embaralhamento de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779 a 783, 1992), uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359 a 368, 1996), embaralhamento de DNA (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724 a 733, 1997), exibição de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77 a 88, 1996) e PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288 a 291,1998). Vaughan et al. (supra) discute esses métodos de maturação por afinidade.

[0135] Se desejado, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, pode ser conjugado com uma ou mais moléculas efetoras. Será apreciado que a molécula efetora pode compreender uma única molécula efetora ou duas ou mais dessas moléculas ligadas de modo a formar uma porção única que pode ser ligada aos anticorpos ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção. Onde se deseja obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, isso pode ser preparado por procedimentos químicos ou de DNA recombinante padrão nos quais o fragmento de anticorpo está ligado diretamente ou através de um agente de acoplamento à molécula efetora. As técnicas para conjugar essas moléculas efetoras a anticorpos são bem conhecidas na técnica (ver Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2º Ed., Robinson et al., Eds., 1987, páginas 623 a 653; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62: 119 a 158 e Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67 a 123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, os descritos nos documentos WO 93/06231, WO

92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO 03/031581. Alternativamente, onde a molécula efetora é uma proteína ou polipeptídeo, a ligação pode ser alcançada usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo, como descrito nos documentos WO 86/01533 e EP0392745.

[0136] O termo molécula efetora, conforme aqui utilizado, inclui, por exemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo, enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpos, polímeros sintéticos ou naturais, ácidos nucleicos e fragmentos dos mesmos, por exemplo, DNA, RNA e fragmentos dos mesmos, radionuclídeos, particularmente radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórteres, tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia de RMN ou ESR.

[0137] Exemplos de moléculas efetoras podem incluir citotoxinas ou agentes citotóxicos, incluindo qualquer agente que seja prejudicial (por exemplo, extermínio) para células. Os exemplos incluem combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrina, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etomidina, etoposídeo, vinoposídeo, tenopositazina, ristidinas, hemiasterinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposidina, etoposídeo, di-hidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos.

[0138] As moléculas efetoras também incluem, mas sem limitação, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalano, carmustina (BSNU) e CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol|, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente, daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (dactinomicina (anteriormente, actinomicina), bleomicina,

mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicina ou duocarmicina) e agentes antitimóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

[0139] Outras moléculas efetoras podem incluir radionuclídeos quelados, como 111Ih e 90Y, Lu1i77, Bismuto213, Califórnio252, Irídio 192 e Tungstênio 188/Rênio188; ou fármacos tais como, sem limitação, alquilfosfolininas, inibidores da topoisomerase |, taxoides e suramina.

[0140] Outras moléculas efetoras incluem proteínas, peptídeos e enzimas. As enzimas de interesse incluem, mas sem limitação, enzimas proteolíticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. As proteínas, polipeptídeos e peptídeos de interesse incluem, mas não estão limitados a, imunoglobulinas, toxinas, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria, uma proteína, tal como insulina, fator de necrose tumoral, a-interferão, g-interferão, fator de crescimento nervoso, fator de crescimento derivado de plaquetas ou ativador de plasminogênio tecidual, um agente trombótico ou antiangiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina ou um modificador de resposta biológica, como uma linfoquina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), fator estimulador de colônias de granulócitos de macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator de crescimento de nervos (NGF) ou outro fator de crescimento e imunoglobulinas.

[0141] Outras moléculas efetoras podem incluir substâncias detectáveis úteis, por exemplo, em diagnóstico. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, nuclídeos radioativos, metais emissores de pósitrons (para uso na tomografia por emissão de pósitrons) e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. Ver geralmente a Patente nº US 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para uso como diagnóstico. Enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos protéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina;y materiais fluorescentes adequados incluem umbelliferona, — fluoresceína, isotiocianato — de — fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansilo e fitoeritinay materiais luminescentes adequados incluem luminol; materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina e aequorina; e nuclídeos radioativos adequados incluem 1251, 1311, 111In e 99Tc.

[0142] Em outro exemplo, a molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou melhorar a entrega de um anticorpo através de uma barreira epitelial ao sistema imunológico. Exemplos de moléculas efetoras adequadas deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação à albumina ou compostos de ligação à albumina, tais como os descritos no documento WO05/117984.

[0143] Quando a molécula efetora é um polímero, esse pode, em geral, ser um polímero sintético ou de ocorrência natural, por exemplo, um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo, um homo ou heteropolissacarídeo.

[0144] Substituintes opcionais específicos que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.

[0145] Exemplos específicos de polímeros sintéticos incluem poli(etilenoglicol), poli(propilenoglicol), álcool poli(vinílico) de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituídos ou seus derivados, especialmente poli(etilenoglicol) opcionalmente substituído, como metoxipoli(etilenoglicol) ou derivados do mesmo.

[0146] Polímeros específicos de ocorrência natural incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou seus derivados.

[0147] Em uma modalidade, o polímero é albumina ou um fragmento do mesmo, tal como albumina sérica humana ou um fragmento do mesmo.

[0148] “Derivados”, conforme aqui utilizado, pretende incluir derivados reativos, por exemplo, grupos reativos seletivos a tiol, como maleimidas e similares. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento de ligação ao polímero. Será apreciado que o resíduo de um grupo desse tipo em alguns casos fará parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.

[0149] O tamanho do polímero pode variar conforme desejado, mas geralmente estará em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50.000 Da, por exemplo, de 5.000 a 40.000 Da, como de 20.000 a 40.000 Da. O tamanho do polímero pode, em particular, ser selecionado com base no uso pretendido do produto, por exemplo, capacidade de localizar certos tecidos, como tumores ou prolongar a meia-vida circulante (para revisão, ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531 a 545). Assim, por exemplo, onde o produto se destina a deixar a circulação e penetrar nos tecidos, por exemplo, para uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de pequeno peso molecular, por exemplo, com um peso molecular de cerca de 5.000 Da. Para aplicações em que o produto permanece em circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de maior peso molecular, por exemplo, com um peso molecular na faixa de 20.000 Da a 40.000 Da.

[0150] Os polímeros adequados incluem um polímero de polialquileno, tal como um poli(etilenoglicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etilenoglicol) ou um derivado do mesmo, e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15.000 Da a cerca de 40.000 Da.

[0151] Em um exemplo, os anticorpos para uso na presente invenção estão ligados a porções químicas de poli(etilenoglicol) (PEG). Em um exemplo específico, o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas de PEG podem ser ligadas através de qualquer grupo funcional de cadeia lateral de aminoácidos ou de aminoácidos terminais disponíveis localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo, qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxila ou carboxila livre. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser manipulados no fragmento usando métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971, WO2008/038024). Em um exemplo, a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado, em que a modificação é a adição à extremidade C-terminal da sua cadeia pesada de um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efetora. Adequadamente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada contendo um ou mais resíduos de cisteína aos quais a molécula efetora pode ser ligada. Vários locais podem ser usados para conectar duas ou mais moléculas de PEG.

[0152] As moléculas de PEG adequadamente estão ligadas covalentemente através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polímero ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser ligada covalentemente ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente será geralmente uma ligação dissulfeto ou, em particular, uma ligação enxofre-carbono. Quando um grupo tiol é utilizado como ponto de ligação de moléculas efetoras adequadamente ativadas, por exemplo, podem ser utilizados derivados seletivos de tiol, como maleimidas e derivados de cisteína. Um polímero ativado pode ser usado como material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificados com polímero, como descrito acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo tiol reativo tal como um ácido ou éster a-halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinilsulfona, ou um dissulfeto. Tais materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, da Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EUA) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida disponíveis comercialmente usando procedimentos químicos convencionais. Moléculas particulares de PEG incluem metoxi-PEG-amina 20K (obtidas junto à Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; e SunBio) e M- PEG-SPA (obtidas junto à Nektar, anteriormente Shearwater).

[0153] Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento Fab modificado, fragmento Fab' ou diFab que é PEGuilado, ou seja, possui PEG (poli(etilenoglico!)) covalentemente ligado a ele, por exemplo, de acordo com o método divulgado em EP 0948544 ou EP1090037 [ver também “Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nova lorque, “Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris e S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, Nova York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531 a 545]. Em um exemplo, o PEG está ligado a uma cisteína na região da dobradiça. Em um exemplo, um fragmento Fab modificado por PEG possui um grupo maleimida covalentemente ligado a um único grupo tiol em uma região de dobradiça modificada. Um resíduo de lisina pode ser covalentemente ligado ao grupo maleimida e a cada um dos grupos amina no resíduo de lisina pode ser ligado um polímero metoxipoli(etilenoglicol) com um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total do PEG ligado ao fragmento Fab pode, portanto, ser de aproximadamente 40.000 Da.

[0154] Moléculas particulares de PEG incluem 2-[3-(N- maleimido)propionamido]etilamida de N, N'-bis(metoxipoli(etilenoglicol) 20.000 MW) lisina modificada, também conhecida como PEG2MAL 40K (obtida junto à Nektar, anteriormente Shearwater).

[0155] Fontes alternativas de ligantes PEG incluem NOF que fornece GL2- 400MA3 (em que m na estrutura abaixo é 5) e GL2-400MA (em que mé 2) e né aproximadamente 450: H,CO-(CH,CH,O), — H o NAN Cala SÓ o 2 mé2zou5

[0156] Ou seja, cada PEG é de cerca de 20.000 Da.

[0157] Assim, em uma modalidade, o PEG é 2,3-Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-([3- (6-maleimido-1-0x0-hexil)amino]propiloxiXhexano (o PEG ramiíificado com 2 braços, - CH2) SNHCO(CH2)5-MAL, Mw 40.000, conhecido como SUNBRIGHT GL2-400MA3.

[0158] Moléculas efetoras de PEG alternativas adicionais do seguinte tipo:

CH,O-(CH,CH,O)n o EN o o

[0159] estão disponíveis junto a Dr. Reddy, NOF e Jenkem.

[0160] Em uma modalidade, o Fab ou Fab' de acordo com a presente invenção é conjugado com uma molécula de PEG.

[0161] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo que é PEGuilado (por exemplo, com um PEG aqui descrito), ligado através de um resíduo de aminoácido cisteína no ou próximo ao aminoácido 226 na cadeia, por exemplo, aminoácido 226 da cadeia pesada (por numeração sequencial), por exemplo, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 26.

[0162] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece uma molécula Fab'PEG compreendendo um ou mais polímeros de PEG, por exemplo, 1 ou 2 polímeros, como um polímero ou polímeros de 40 kDa.

[0163] As moléculas Fab'-PEG de acordo com a presente divulgação podem ser particularmente vantajosas pelo fato de terem uma meia-vida independente do fragmento Fc. Em uma modalidade, é fornecido um Fab' conjugado com um polímero, tal como uma molécula de PEG, uma molécula de amido ou uma molécula de albumina. Em uma modalidade, é fornecido um scFv conjugado com um polímero, como uma molécula de PEG, uma molécula de amido ou uma molécula de albumina. Em uma modalidade, o Fab ou Fab' de acordo com a presente divulgação é conjugado à albumina sérica humana. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento é conjugado com uma molécula de amido, por exemplo, para aumentar a meia-vida. Métodos de conjugação de amido a uma proteína como descrito no documento US

8.017.739 são aqui incorporados por referência.

[0164] A presente invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção. O polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo, produzido por processamento químico, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mesmos.

[0165] Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar codificação de sequências de DNA para o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte, utilizando técnicas de síntese de oligonucleotídeos. As técnicas de mutagênese síitio-dirigida e de reação em cadeia polimerase (PCR) podem ser usadas como apropriado.

[0166] Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado de acordo com a invenção codifica: a. uma região variável de cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23; ou ii. compreende SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23; ou iii, consiste essencialmente em SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23; b. uma região variável de cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 27; ou ii. compreende a SEQ ID NO: 27; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 27; c. uma cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 24; ou ii. compreende SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 24; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 24; d. uma cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 28; ou ii. compreende SEQ ID NO: 28; ou iii. consiste essencialmente de SEQ ID NO: 28.

[0167] A presente invenção também fornece um vetor de clonagem ou expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos aqui descritos. Em um exemplo, o vetor de clonagem ou expressão de acordo com a presente invenção compreende um ou mais polinucleotídeos isolados compreendendo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27 ou 28.

[0168] Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, os métodos de transfecção e os métodos de cultura são bem conhecidos dos especialistas na técnica. A esse respeito, é feita referência a “Current Protocols in Molecular Biology", 1999, FM Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nova York e ao Maniatis Manual produzido pela Cold Spring Harbor Publishing.

[0169] Também é fornecida uma célula hospedeira compreendendo uma ou mais sequências polinucleotídicas isoladas de acordo com a invenção ou um ou mais vetores de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências polinucleotídicas isoladas que codificam um anticorpo da presente invenção. Qualquer célula hospedeira/sistema vetorial adequado pode ser utilizado para expressão das sequências polinucleotídicas que codificam o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção. Podem ser utilizados sistemas bacterianos, por exemplo, E. coli, e outros sistemas microbianos ou sistemas eucarióticos, por exemplo, mamíferos, de expressão de células hospedeiras. As células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células CHO, mieloma ou hibridoma.

[0170] Tipos adequados de ovário de hamster chinês (células CHO) para uso na presente invenção podem incluir células CHO e CHO-K1 incluindo células dhfr-CHO, como células CHO-DG44 e células CHO-DXB11 e que podem ser usadas com um marcador selecionável DHFR ou células CHOK1-SV que podem ser usadas com um marcador selecionável de glutamina sintetase. Outros tipos de células utilizados na expressão de anticorpos incluem linhagens celulares linfocíticas, por exemplo, células de mieloma NSO e células SP2, células COS. A célula hospedeira pode ser transformada ou transfectada estavelmente com as sequências polinucleotídicas isoladas ou os vetores de expressão de acordo com a presente invenção.

[0171] Em uma modalidade, a célula hospedeira, de acordo com a presente invenção, é uma célula CHO-DG44 estavelmente transfectada com um vetor de expressão que compreende as sequências polinucleotídicas isoladas da presente invenção, compreendendo preferencialmente as sequências polinucleotídicas isoladas de acordo com a SEQ ID NO: 15 e 27, ou SEQ ID NO: 19 e 27 ou SEQ ID NO: 23 e 27 ou SEQ ID NO: 16 e 28 ou SEQ ID NO: 20 e 28 ou SEQ ID NO: 24 e 28.

[0172] A presente invenção também fornece um processo para a produção de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção em condições adequadas para a produção do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com invenção e isolamento do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0173] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, caso em que apenas uma sequência de codificação de polipeptídeo de cadeia pesada ou cadeia leve precisa ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que compreende cadeias pesadas e leves, a linhagem celular pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor codificando um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor codificando um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, pode ser utilizado um único vetor, incluindo o vetor que codifica sequências que codificam polipeptídeos de cadeia leve e cadeia pesada.

[0174] Assim, é fornecido um processo para cultivar uma célula hospedeira e expressar um anticorpo ou um fragmento do mesmo, isolando o último e opcionalmente purificando-o para fornecer um anticorpo ou fragmento isolado. Em uma modalidade, o processo compreende ainda a etapa de conjugar uma molécula efetora ao anticorpo ou fragmento isolado, por exemplo, conjugando-se com um polímero de PEG, em particular, como aqui descrito.

[0175] Assim, em uma modalidade, é fornecido um anticorpo anti-alfa-sinucleína purificado ou fragmento do mesmo, por exemplo, um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo, em particular um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a invenção, em uma forma substancialmente purificada, em particular livre ou substancialmente livre de endotoxina e/ou proteína ou DNA da célula hospedeira.

[0176] Substancialmente livre de endotoxina pretende-se geralmente referir-se a um teor de endotoxina de 1 UE por mg de produto de anticorpo ou menos, como 0,5 ou 0,1 UE por mg de produto.

[0177] Substancialmente livre de proteína ou DNA da célula hospedeira, geralmente se refere ao teor da proteína e/ou de DNA da célula hospedeira de 400 ug por mg de produto de anticorpo ou menos, como 100 ug por mg ou menos, em particular 20 ug por mg, conforme apropriado.

[0178] Como os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento, diagnóstico e/ou profilaxia de uma condição patológica como uma alfa-sinucleinopatia, a presente invenção também fornece uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, em combinação com um ou mais de um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, é o único ingrediente ativo. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, se combina com um ou mais ingredientes ativos adicionais. Alternativamente, as composições farmacêuticas compreendem o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, que é o único ingrediente ativo e que pode ser administrado individualmente para um paciente em combinação (por exemplo, simultaneamente, sequencialmente ou separadamente) com outros agentes, fármacos ou hormônios.

[0179] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 13 ou 17 ou 21 e compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 25, por exemplo, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 25.

[0180] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser administradas adequadamente a um paciente para identificar a quantidade terapeuticamente eficaz necessária. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, conforme aqui utilizado, refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessário para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição direcionada, ou exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, geralmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Essa informação pode então ser usada para determinar doses e vias úteis para administração em humanos.

[0181] A quantidade terapeuticamente eficaz precisa para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado da doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, peso e gênero do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinação (ou combinações) de medicamentos, sensibilidades da reação e tolerância/resposta à terapia. Esse valor pode ser determinado por experimentação de rotina e está sob julgamento do médico responsável. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 500 mg/kg, por exemplo, 0,1 mg/kg a 200 mg/Kkg, como 100 mg/kg. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de um agente ativo da invenção por dose.

[0182] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter adicionalmente líquidos como água, solução salina, glicerol e etanol. Além disso, substâncias auxiliares, tals como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias tampão de pH, podem estar presentes nessas composições. Tais carreadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo paciente.

[0183] Formas adequadas para administração incluem formas adequadas para administração parentérica, por exemplo, por injeção ou infusão, por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua, na forma intravenosa, inalável ou subcutânea. Quando o produto é para injeção ou infusão, pode adotar a forma de uma suspensão,

solução ou emulsão em um veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservação, estabilização e/ou dispersantes. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a invenção pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado. Formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas.

[0184] Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Por conseguinte, é aqui fornecido o uso de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento.

[0185] Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. Preferencialmente, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são adaptadas para administração a seres humanos.

[0186] Assim, em outro aspecto, a presente invenção fornece o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para uso em terapia, e em especial para uso no tratamento de uma ou mais alfa-sinucleinopatias. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma ou mais sinucleinopatias a um paciente que compreende a administração ao dito paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, ou de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0187] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para uso em terapia é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 de acordo com a SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO:

7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR- H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 de acordo com a SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 de acordo com a SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26;

[0188] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo que compreende, com referência à SEQ ID NO: 8, pelo menos os resíduos D119, N122 e Y125 e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso em terapia. De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que não reage de forma cruzada com beta-sinucleina e se liga à alfa-sinucleína com uma constante de dissociação (Ko) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleina monomérica do que para a alfa-sinucleina em fibrilas.

[0189] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso no tratamento de uma ou mais sinucleinopatias, é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 de acordo com a SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR- H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 de acordo com a SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 de acordo com a SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26;

[0190] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo que compreende, com referência à SEQ ID NO: 8, pelo menos os resíduos D119, N122 e Y125. De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que não reage de forma cruzada com beta-sinucleíina e se liga à alfa-sinucleína com uma constante de dissociação (Kp) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para a alfa-sinucleína em fibrilas.

[0191] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de uma ou mais sinucleinopatias em um paciente que compreende administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 de acordo com a SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR- H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 de acordo com a SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 de acordo com a SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26;

[0192] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-

sinucleina, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo que compreende, com referência à SEQ ID NO: 8, pelo menos os resíduos D119, N122 e Y125. De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que não reage de forma cruzada com beta-sinucleíina e se liga à alfa-sinucleína com uma constante de dissociação (Kp) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para a alfa-sinucleína em fibrilas.

[0193] As alfa-sinucleinopatias de acordo com a presente invenção compreendem, mas sem limitação, doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1). De preferência, a ALFA-sinucleinopatia é a doença de Parkinson (DP).

[0194] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso no tratamento da doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e herdadas da doença de Parkinson), Demência com Lewy corpos (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), de preferência a doença de Parkinson (DP) é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 de acordo com a SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR- H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 de acordo com a SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 de acordo com a SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID

NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26;

[0195] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleina, em que, opcionalmente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 8, pelo menos os resíduos D119, N122 e Y125 e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso em terapia. De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que não reage de forma cruzada com beta-sinucleína e se liga à alfa-sinucleína com uma constante de dissociação (Kp) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para a alfa-sinucleína em fibrilas.

[0196] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento da doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA), e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), de preferência doença de Parkinson (DP), a um paciente que compreende a administração ao dito paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 de acordo com a SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR- H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 de acordo com a SEQ

ID NO: 5 e uma CDR-H3 de acordo com a SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26;

[0197] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína, em que, opcionalmente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 8, pelo menos os resíduos D119, N122 e Y125 e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso em terapia. De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que não reage de forma cruzada com beta-sinucleína e se liga à alfa-sinucleína com uma constante de dissociação (Kp) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para a alfa-sinucleína em fibrilas.

[0198] Alternativamente, a invenção também fornece o uso de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma alfa-sinucleinopatia, em que a alfa-sinucleinopatia é preferencialmente a doença de Parkinson (PD) (incluindo formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DCL), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), mais preferencialmente doença de Parkinson (PD), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 de acordo com a SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-

H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 de acordo com a SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 de acordo com a SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26;

[0199] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína, em que, opcionalmente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 8, pelo menos os resíduos D119, N122 e Y125 e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso em terapia. De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que não reage de forma cruzada com beta-sinucleína e se liga alfa-sinucleína com uma constante de dissociação (Kp) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para a alfa-sinucleina em fibrilas.

[0200] Também faz parte da presente invenção o uso dos anticorpos anti-alfa- sinucleína ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo para uso como agentes diagnosticamente ativos ou em ensaios de diagnóstico, por exemplo, para diagnosticar alfa-sinucleinopatias, tais como a doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DCL), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1).

[0201] O diagnóstico pode ser realizado preferencialmente em amostras biológicas. Uma “amostra biológica” abrange uma variedade de tipos de amostra obtidos de um indivíduo e pode ser usada em um teste de diagnóstico ou monitoramento. A definição abrange líquido cefalorraquidiano, sangue como plasma e soro e outras amostras líquidas de origem biológica, como urina e saliva, amostras de tecido sólido, como uma amostra de biópsia ou culturas de tecidos ou células derivadas dele e sua progênie. A definição também inclui amostras que foram manipuladas de qualquer forma após sua aquisição, como por tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento para certos componentes, como polinucleotídeos.

[0202] O teste de diagnóstico pode, de preferência, ser realizado em amostras biológicas que não estão em contato com o corpo humano ou animal. Esses testes de diagnóstico também são chamados de testes in vitro. O teste de diagnóstico in vitro pode depender de um método in vitro de detecção de alfa-sinucleína em uma amostra biológica que foi obtida de um indivíduo que compreende as etapas de i) contato da amostra biológica com anticorpo anti-alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como descrito aqui; e ii) detecção da ligação do anticorpo anti- alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo à alfa-sinucleína. Ao comparar o nível de alfa-sinucleína detectado ou a presença de uma forma específica de alfa-sinucleína pós-traducional com um controle adequado, uma ou mais alfa- sinucleinopatias podem ser identificadas. Esse método de detecção pode, portanto, ser usado para determinar se um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma alfa-sinucleinopatia, incluindo a determinação do estágio (gravidade) de uma alfa- sinucleinopatia.

[0203] Portanto, a presente invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo para uso no diagnóstico de uma alfa-sinucleinopatia, de preferência no diagnóstico da doença de Parkinson (PD), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 de acordo com a SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR- H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 de acordo com a SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 de acordo com a SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26;

[0204] em que, opcionalmente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 8, pelo menos os resíduos D119, N122 e Y125.

[0205] As sequências incluídas na presente invenção são mostradas na Tabela 1: TABELA 1 SEQ ID NO: | SEQUÊNCIA CDR-L1 KASQNINKNLD CDR-L2 YANNLOT CDR-L3 YQYKNGWT CDR-H1 GFTFNNAAMY CDR-H2 RIRTKPNNYATSYADSVKG CDR-H3 |6 ——— |[DYSRGDR Variante | 7 YQYKNAWT 1 da CDR-L3 Alfa- MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKE sinuclein GVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAV a humana VTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEG P37840 APQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA VvL de NIQMTQSPPVLSASVGDRVTLSCKASQNINKNLDWY rato QQAKHGEAPKLLMYYANNLQTGIPSRFSGSGSGTDYT 5811 LTISSLOPEDVATYYCYQYKNGWTFGGGTKLELK VvH de | 10 EMQLVESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFNNAAMY rato WVRQAPGKGLEWVARIRTKPNNYATSYADSVKGRF 5811 TISRDDSKSMVYLQMDNLKSEDTAMYYCTADYSRG

DRWGQGVMVTVSS Nucleotíd | 11 aacatccagatgacccagtetectecagtectatetacatetataggagac eo de VL agagtcactcteagetgcaaagcaagtceagaacattaataagaacttag de rato actggtatcagcaaaagcatggagaagctecaaaactcectgatgtattat gcaaacaatttacaaacgggcatccecateaaggtteagtagcagtagate tggaacagattacacgctceaccateagcagectgcagectaaagatgattg ccacatattactgctatcagtataagaatgggtagacatteggtagaggca ccaagctggaactgaaa Nucleotíd | 12 Gaaatgcagctggtggagtctagtgagaggattgagtacagcctaaggagt eo de VH cattgaaaatctcatgtgcagcectetggattcaccettcaataatgctgccatg de rato tactgggtcegecaggactecaggaaagggtctagaatagattgctegeat aagaactaaacctaataattatgcaacatcttatgctgatticagtgaaagg cagattcaccatctccagagatgattcaaaaagcatggtctacctacaaat ggataacttgaaaagigaggacacagccatgtattactgtacagcagatt actccagaggtgacaggtggggccaaggagtcatagtcacagtetega ge Região V [13 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKNLDWY de 5811 QQKPGKAPKLLIYYANNLAOTGVPSRFSGSGSGTDYT gL5 LTISSLAPEDFATYYCYQYKNGWTFGQGTKVEIK Cadeia 14 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKNLDWY leve de QQAKPGKAPKLLIYYANNLATGVPSRFSGSGSGTDYT 5811 gL5 LTISSLAPEDFATYYCYQYKNGWTFGQGTKVEIKRT

VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL

SKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC Nucleotíd | 15 Gacatccagatgacccagagcecceegagctecetgtecgcateagtagg]a eo de gatcgcgtgactattacgtgcaaagcctegcagaacatcaacaagaace região V tegactagtatcagcagaagecaggaaaggcgcctaagcetactgateta de 5811 ctacgccaacaatctecagaceggegtgecetegeggttctecggateta gL5 ggtcecgagtactgattacaccctgaccattagetecettecaaceggaggactt cgccacctattactgctaccagtacaagaacagctagacttttagacaag gcaccaaggtegaaatcaag Nucleotíd | 16 Gacatccagatgacccagagecegagetecetatecgcateagtaggg eo de gatcgcgtgactattacgtgcaaagcectegeagaacatcaacaagaace cadeia tegactagtatcagcagaagecaggaaaggcgcctaagetactgateta leve de ctacgccaacaatctecagaceggegtgecetegegattctecggateta 5811 gL5 ggtecgagtactgattacaccctgaccattagetecetteaaceggaggactt cgccacctattactgctaccagtacaagaacgagcetagacttttagacaag gcaccaaggtegaaatcaagegtacggtagecgactecetecgtattcatet teccacecectecegacgageagetgaagteeggcacegectecgtegtgtge ctgctgaacaacttctaccccegegaggecaaggtacagtagaaggtag acaacgcccetgcagtceggcaacteccaggaatcegtcacegageagg actccaaggacagcacctactecetgtectecacectgacectatecaag gcegactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagigacccacea gggcctatecagececgtgaccaagitectteaaceggggegagtge Região V | 17 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKNLDWY de 5811 QQKPGKAPKLLIYYANNLOTGVPSRFSGSGSGTDFT gL8 LTISSLOPEDFATYYCYQYKNGWTFGQGTKVEIK Cadeia 18 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKNLDWY leve de QQAKPGKAPKLLIYYANNLATGVPSRFSGSGSGTDFT 5811 gL8 LTISSLAPEDFATYYCYQYKNGWTFGQGTKVEIKRT

VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC

Nucleotíd | 19 Gacatccagatgacccagagecegagcetecetatecgcateagtagga eo de gatcgcgtgactattacgtgcaaagcctegcagaacatcaacaagaace região V tegactggtatcagcagaagecaggaaaggcgcctaagetactgatcta de 5811 ctacgccaacaatctecagaceggegtgeectegegattctecggateta gL8 ggtecgagtactgatttraccectgaccattagctecettecaaceggaggactt cgccacctattactgctaccagtacaagaacgagcetagacttttagacaag gcaccaaggtegaaatceaag Nucleotíd | 20 Gacatccagatgacccagagecegagetecetatecgcateagtaggg eo de gatcgcgtgactattacgtgcaaagcectegcagaacatcaacaagaace cadeia tegactagtatcagcagaagecaggaaaggcgcctaagcetactgateta leve de ctacgccaacaatctecagaceggegtgecetegegagttctecggateta 5811 gL8 gatccgatactgaatttcaceetagaccattagetecettcaaceggaggactt cgccacctattactgctaccagtacaagaacagcetagacttttagacaag gcaccaaggtegaaatceaagegtacggtagecgactecetecagtattcatet teccacectecegacgageagetgaagteeggcacegectecgtegtgtge ctgctgaacaacttctaccccegegaggecaaggtgcagtagaaggtag acaacgccctgcagtceggcaacteccaggaatcegtcacegageagg actccaaggacagcacctactecetatectecacectgaccectatecaag gcegactacgagaagcacaaggtatacgcctgegaagtgacccacea gggcctatecagececgtgaccaagtectticaaceggggegagtge Região V | 21 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKNLDWY de 5811 QQKPGKAPKLLIYYANNLAOTGVPSRFSGSGSGTDFT gL14 LTISSLOPEDFATYYCYQYKNAWTFGQGTKVEIK Cadeia 22 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKNLDWY leve de QQKPGKAPKLLIYYANNLQOTGVPSRFSGSGSGTDFT 5811 LTISSLOPEDFATYYCYQYKNAWTFGOQGTKVEIKRTV gL14 AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK

ADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC Nucleotíd | 23 Gacatccagatgacccagagecegagcetecetgtecgeateagtagga eo de gatcgcgtgactattacgtgcaaagcctegcagaacatcaacaagaace região V tegactggtatcagcagaagecaggaaaggcgcectaagetactgateta de 5811 ctacgccaacaatctecagaceggegtgecetegegattctecggateta gL14 ggtecgagtactgatttraccectgaccattagctecettecaaceggaggactt cgccacctattactgctaccagtacaagaacgcttagacttttggacaagg caccaaggtcgaaatcaag Nucleotíd | 24 Gacatccagatgacccagagecegagetecetatecgcateagtaggg eo de gatcgcgtgactattacgtgcaaagcectegcagaacatcaacaagaace cadeia tegactagtattcagcagaagcecaggaaaggcgcctaagetactgateta leve de ctacgccaacaatctecagaceggegtgecetegegattctecggateta 5811 ggtcecggtactgatttracectgaccattagetecettrcaaceggaggactt gL14 cgccacctattactgctaccagtacaagaacacttggacttttagacaagg caccaaggtcegaaateaagegtacggtaggeegetecetecatatteatett cecacectecgacgagcagetgaagtecggeacegectecgtegtatae ctgctgaacaacttetacceccegegaggecaaggatacagtgagaagatag acaacgccctgcagtceggcaacteccaggaatcegtcacegageagg actccaaggacagcacctactecetgtectecacectgaccecetatecaag gcegactacgagaagcacaaggtatacgectacgaagtgacecacea gggcctgtecageceegtgaccaagtectteaaceggggegagtgo Região V | 25 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNNAAMY de 5811 WVRQAPGKGLEWVARIRTKPNNYATSYADSVKGRF gH4 TISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTADYSRGD

RWGQGTMVTVSS Cadeia 26 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNNAAMY pesada WVRQAPGKGLEWVARIRTKPNNYATSYADSVKGRF de 5811 TISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTADYSRGD gH4 RWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA

ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVD KRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSLGK Nucleotíd | 27 Gaagtgcagcttatagagageggaggatagactegtgaagectagegga eo de tcetetgegectatectacgeegecteggagtticaccttitaacaatacegeaa região V tatattgggteagacaggeceegggaaagagtttagaatagatagetaga de 5811 atteggactaagccecaacaactacgegacctectacgcegatagegtga gH4 agggcagattcaccatetecegggacgactraaagaacacgctatacct ccaaatgaactccctgaaaacegaggacacegcecgtatactactgcace geggactacteceggggegategectagggacaggggactatagtcactga tcetegagt Nucleotíd | 28 gaagtgcagcttatagagageggaggatagactegtgaagectageggat eo de ctctgegectgtectgegecgectegggatticacetttaacaatgcegcaat cadeia gtattgggtecagacaggcccegggaaagagtttagaatgggtagetagga pesada attcggactaagcccaacaactacgegacctectacgcegatagegtga de 5811 agggcagattcaccatctecegggacgactraaagaacacgactataccet gH4 ccaaatgaactccctgaaaacegaggacacegcecgtatactactgcace geggactacteceggagegategectagggacaggggactatagtcacta tctegagtgectecaccaagggccecctecgtatticectetagececttgete ceggtecacetecgagtetacegecgacetetaggctacetagtcaaggact acttcccegagecegigacagtgatectggaactetagegecetgaceteca gegtgcacaccttecetgcegtactacagtectecggectatacteccetate ctcegtegtgacegtgceectectecagectaggcaccaagacctacacct gtaacgtggaccacaagccectecaacacceaaggtagacaagegggta gaatctaagtacggcectecetgecececetgeeetgececectgaatttetag geggaccttecgtattectattccccccaaageccaaggacaccctgatg atctcceggaceceegaagitgacctgcgtagtggtggacgtatcccagg aagatccegaggtecagttcaattggtacgtagacggcgtagaagtaca caatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactecaccetaceg ggtagtatecgtgctgacegtgctgcaccaggactggctgaacggcaaa gagtacaagtgcaaggtgtecaacaagggcctacectecageategaa aagaccatctcecaaggecaagggecagececgegagececagatata cacccetgeceectagecaggaagagatgaccaagaaccaggtatecet gacctgatctggtcaagggcettetaccectecgacattgcegtagaatagga gtccaacggecagcecegagaacaactacaagaccaccececcectatact ggacagcgacggctcecttettectatactetegactaacegtggacaagte ceggtageaggaagacaacgtettetectactecgtgatacacgaggece tgcacaaccactacacccagaagtecetgtecetgagectaggcaag Estrutura | 29 DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY aceitador QQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFT a de LTISSLAOPEDFATYYCQQASYSTPWTFGQGTKVEIK IGKV1-39 JK1 humana Estrutura | 30 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMS aceitador WVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRF a de TISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDAFDVW IGHV3- GQGTMVTVSS JH3 humana Nucleotíd | 31 gacatccagatgacccagtctecatectecetatetgcatetataggagac eo de agagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaat estrutura tggtatcagcagaaaccagggaaagceccectaagetectgatetatactae aceitador atccagtttacaaagtggggteccatcaagattcagtageagtgagatctag a de gacagatttcactcteacceateageagtetgcaaccetgaagattttacaact IGKV1-39 tactactgtcaacagagttacagtacccecctiggacgtteggecaagggac JK1 caaggtggaaatcaaa humana Nucleotíd | 32 Gaggtgcagctggtggagtctaggaggagacttggtaaagectagggggt eo de cecettagactetectgtacagectetggattcactttcagtaacgcctagatg estrutura agctgggteegecaggctecagggaagggagctagagtggattagecat aceitador attaaaagcaaaactgatggtgggacaacagactacgctgcaccegta a de aaaggcagattcaccatctcaagagatgatticaaaaaacacgctatatct IGHV3- gcaaatgaacagcctgaaaacegaggacacagccgtagtattactatace 15 JH3 acagatgcttttaatatetagggeccaagagacaatgagtcacegtetettea humana a-sin 68- | 33 GAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKN 140 EEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEP humana EAVEKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKD de Fc de TLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVR coelho TARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKC

KVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREEL SSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTT PAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMH

EALHNHYTQKSISRSPGK Cadeia 34 NIQMTAOSPPVLSASVGDRVTLSCKASQNINKNLDWY leve QQAKHGEAPKLLMYYANNLQTGIPSRFSGSGSGTDYT quimérica LTISSLAPEDVATYYCYQYKNGWTFGGGTKLELKRT de 5811 DAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINV de rato KWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTL camundo TKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC ngo cadeia 35 EMQLVESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFNNAAMY pesada WVRQAPGKGLEWVARIRTKPNNYATSYADSVKGRF quimérica TISRDDSKSMVYLQMDNLKSEDTAMYYCTADYSRG de 5811 DRWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSM de rato VTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLOQ camundo SDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVD ngo KKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLT

PKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTAPR EEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAF PAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSL TCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTD GSYFVYSKLNVQOKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHH

TEKSLSHSPGK Cadeia 36 EMQLVESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFNNAAMY pesada WVRQAPGKGLEWVARIRTKPNNYATSYADSVKGRF de Fab- TISRDDSKSMVYLQMDNLKSEDTAMYYCTADYSRG

HIS DRWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSM quimérico VTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLOQ de 5811 SDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVD de rato KKIVPRDCHHHHHHHHHH camundo ngo

[0206] A invenção será agora descrita adicionalmente por meio de exemplos com referências a modalidades ilustradas nos desenhos anexos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: EXPRESSÃO DE MONÔMERO E FIBRILAS DE ALFA-SINUCLEÍNA

HUMANA

[0207] Um gene que codifica a alfa-sinucleína humana foi gerado sinteticamente e subclonado no vetor pMH 10His TEV (contendo um promotor de CMV) usando técnicas padrão de biologia molecular, para criar um vetor projetado para produzir alfa-

sinucleina com uma etiqueta 10His-TEV N-terminal. O vetor resultante foi transfectado para células Expi293F usando o sistema de expressão Expi293TM (Invitrogen), seguindo os protocolos do fabricante. A proteína alfa-sinucleína acumulada no meio de cultura de onde foi recuperada usando uma coluna excel HisTrap de cromatografia por afinidade de íons metálicos imobilizados (GE Healthcare). A coluna foi lavada com TrisHCI 25 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0 e a proteína eluída com um gradiente escalonado de imidazol 500 mM no mesmo tampão. A etiqueta 10His foi removida utilizando protease de TEV. A amostra foi então concentrada e dessalinizada antes de reaplicar a proteína clivada à coluna excel HisTrap e coletar a alfa-sinucleina clivada no fluxo. A alfa-sinucleína foi ainda purificada por filtração em gel em uma coluna HiLoad 26/6800 Superdex 75 (GE Healthcare) e a endotoxina foi removida por passagem sobre um cartucho Proteus NoEndo (Generon). A alfa-sinucleína purificada foi confirmada como monomérica por SEC MALS (Figura 1A).

[0208] A alfa-sinucleína humana do tipo selvagem (não etiquetada) também foi expressa em células Expi293F. A proteína foi recuperada do meio de cultura por troca aniônica usando uma coluna HiTrap Q (GE Healthcare). A coluna foi lavada com TrisHCI 20 mM, pH 8,0, e a proteína eluída usando um gradiente de cloreto de sódio a 400 mM. As frações foram concentradas e dessalinizadas passando por uma coluna HiPrep 26/10 (GE Healthcare) e eluídas com TrisHCI 20 mM, pH 8,0. A proteína foi ainda purificada usando uma coluna MonoQ 10/100GL, eluída com um gradiente de cloreto de sódio a 400 mM em TrisHCI 20 mM pH 8,0, seguida de filtração em gel em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare), com eluição em pH PBS 7,4 (Figura 1B).

[0209] Esse monômero de alfa-sinucleína do tipo selvagem (não etiquetado) foi usado para preparar as fibrilas de alfa-sinucleína obtidas por agitação do monômero de alfa-sinucleína recombinante purificado (9-10 mg/ml em PBS pH7,4) a 1.200 rpm, 37 ºC em uma incubadora com agitação Vortemp56 (Labnet) continuamente por 10 dias. A formação de fibrila foi avaliada pelo ensaio JC-1 (Lee et al., Biochem. J. 2009, 418, 311 a 323) e espectroscopia de infravermelho por transformada C de Fourier da solução. O monômero não incorporado nas soluções de fibrila foi avaliado por ultracentrifugação e por passagem através de uma membrana de corte de 100 KDa seguida por eletroforese em gel. Somente fibrilas com resposta JC-1 >15, baixa quantidade de monômero solúvel (<5%) e espectro de FTIR com absorção principal entre 1.625 e 1.630 cm-1 foram utilizadas em estudos posteriores (Figura 2). As fibrilas preparadas foram armazenadas a -80 ºC. EXEMPLO 2: IMUNIZAÇÃO E ISOLAMENTO DE ANTICORPOS

[0210] Inúmeras estratégias de imunização usando várias espécies e imunógenos foram realizadas. O anticorpo 5811 foi derivado de um rato fêmea Sprague Dawley (>180 g) que tinha recebido imunização subcutânea com 50 ug de monômero de alfa- sinucleína não etiquetado do tipo selvagem expresso como descrito acima (SEQ ID NO: 8).

[0211] Os ratos receberam 3 injeções de reforço em intervalos de 21 dias usando adjuvante de Freund incompleto (IFA) com sangramentos tirados, da veia caudal, 14 dias após a imunização. O término ocorreu 14 dias após o último reforço com suspensões celulares únicas de células mononucleares sanguíneas do baço, de linfonodos, da medula óssea e periféricas preparadas e congeladas em 10% de DMSO/FCS a -80 ºC.

CULTURA DE CÉLULAS B

[0212] As culturas de células B foram preparadas usando um método semelhante ao descrito por Tickle et al, 2015. J Biomol Screen: 20 (4), 492 a 497. Resumidamente, as células B derivadas de linfonodos ou esplenócitos de animais imunizados foram cultivadas a uma densidade de aproximadamente 2.000 a 5.000 células por poço em placas de cultura de tecidos com 96 poços com código de barras e 200 ul/poço de meio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado com 10% de FCS (Sigma Aldrich), 2% de HEPES (Sigma Aldrich), 1% de L-glutamina (Gibco BRL), 1% de solução de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL), 0,1% de B-mercaptoetanol (Gibco BRL), 1% de sobrenadante PBMC humano ativado (BSS) e de células de timoma EL4 murino mutantes irradiadas com raios X (5x10%/poço) durante sete dias a 37 ºC em uma atmosfera de 5% de CO». As culturas foram estabelecidas utilizando células B a partir de todos os animais imunizados e, no total, cerca de 1,7x10º células

B foram amostradas.

[0213] 5811, um anticorpo de acordo com a presente invenção, foi gerado a partir de células B derivadas de linfonodos ativados que foram cultivadas a uma densidade de aproximadamente 2.000 células por poço. O nódulo linfático linfonodo foi usado em adição a esplenócitos para a revelação de anticorpo para nos dar uma fonte alternativa de células B da qual se fez a amostra e identificação de novos anticorpos. Aproximadamente 3,3x10º células foram amostradas a partir dos ratos imunizados de alfa-sinucleína humana monomérica de comprimento total.

TRIAGEM PRIMÁRIA

[0214] A presença de anticorpos humanos específicos da alfa-sinucleína nos sobrenadantes da cultura de células B foi determinada usando um ensaio de ligação à base de fluorescência homogêneo usando esferas Superavidin'y (Bangs Laboratories) revestidas com monômero de comprimento total da alfa-sinucleína humana recombinante biotinilada como fonte de antígeno-alvo. A alfa-sinucleína humana recombinante, tal como aqui descrita, foi biotinilada utilizando 3 vezes um excesso molar de biotina. Um baixo excesso molar de biotina foi utilizado para evitar a modificação completa de todos os sete resíduos de lisina que residem na molécula de alfa-sinucleína. O monômero de alfa-sinucleína foi incubado durante a noite a 40 ºC com a biotina e a biotina livre foi removida no dia seguinte utilizando uma coluna de dessalinização por rotação Zeba'"Y. A triagem envolveu a transferência de 10 ul de sobrenadante a partir de placas de cultura de tecidos de 96 poços com código de barras em placas de ensaio com paredes pretas de 384 poços com código de barras contendo monômero de alfa-sinucleína humana recombinante biotinilada imobilizado em esferas de Superavidin (10 ul/poço) utilizando um manipulador de líquidos Agilent Bravo. A ligação foi revelada com um conjugado Alexafluor647 específico de fragmento de Fcy de IgG antirrato de cabra (Jackson). As placas foram lidas em um TTP Labtech Mirrorball, a fim de identificar poços contendo IgG específica de alfa- sinucleína.

TRIAGEM SECUNDÁRIA

[0215] Após a triagem primária, os sobrenadantes positivos foram consolidados em placas mestras com código de barras de 96 poços usando um robô coletor de Beckman Coulter BiomekNXP e células B em placas de cultura de células congeladas a -80 ºC. As placas mestras foram triadas em um ensaio ELISA de captura de estreptavidina utilizando monômero de alfa-sinucleina humana recombinante biotinilada ou fibrilas de alfa-sinucleína humana recombinante biotiniladas. Isso foi realizado para identificar poços que deram ligação à alfa-sinucleína humana recombinante monomérica e fibrilar e para excluir quaisquer poços falsos positivos mostrando ligação fora do alvo às esferas Superavidin'", Dada a natureza insolúvel das fibrilas, os protocolos convencionais de revestimento ELISA, que são usados com proteínas em solução, não eram favorecidos. Foi decidido que um protocolo mínimo de biotinilação fosse empregado para preservar a estrutura fibrilar e facilitar o revestimento eficiente das fibrilas em uma placa ELISA pré-revestida com estreptavidina.

[0216] As fibrilas totais biotiniladas de alfa-sinucleína foram geradas, como aqui descrito, combinando o monômero de alfa-sinucleína recombinante biotinilado (como descrito acima) com um excesso de 50 vezes de alfa-sinucleína recombinante não marcada em PBS. A formação de fibrila foi confirmada pelo ensaio JC1 (Lee et al., Biochem. J. 2009, 418, 311 a 323).

[0217] O monômero biotinilado ou as fibrilas biotiniladas em PBS foram capturados em placas Maxisorp de 384 poços revestidas com estreptavidina em um tampão de revestimento de carbonato (dH2O + 0,16% de Na2COs + 0,3% de NaHCO;). As placas foram bloqueadas com 1% p/v de PEG/PBS e depois incubadas com 10 ul/poço de sobrenadante da cultura de células B (diluído 1:1 com tampão de bloqueio). O conjugado HRP específico de fragmento Fcy de IgG antirrato de cabra conjugado a HRP secundário (Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch) foi adicionado a placas, seguido de visualização da ligação com o substrato TMB (3,3',5,5'- Tetrametilbenzidina, da EMD Millipore; 10 ul/poço). A densidade óptica foi medida em 630 nM usando o leitor de microplacas BioTek Synergy 2. O ensaio de ligação primário identificou 83 ocorrências e, após a triagem de ELISA, 29 dessas se mostraram ligadas à alfa-sinucleína humana recombinante monomérica e fibrilar.

[0218] Os sobrenadantes de células B que demonstram sinais mais fortes de ligação ELISA a fibrilas recombinantes foram selecionados para análise posterior por ressonância plasmônica de superfície para identificar aqueles com a melhor taxa de dissociação no monômero de alfa-sinucleína humana recombinante, fibrilas de alfa- sinucleína humana recombinantes e fibrilas de alfa-sinucleína recombinantes de camundongo. Os sobrenadantes a partir de 26 células B diferentes foram testados, 19 poços deram taxas de dissociação (Kd) <1x10º em monômero de alfa-sinucleina humana recombinante. Dessas, 6 deram taxas de dissociação (kd) inferiores a 1x10º em monômero de alfa-sinucleina de camundongo recombinante. Todos os 19 sobrenadantes foram selecionados para recuperação de região variável.

RECUPERAÇÃO DE REGIÃO VARIÁVEL

[0219] Para permitir a recuperação dos genes da região variável de anticorpos a partir de uma seleção de sobrenadantes de interesse, uma etapa de deconvolução teve que ser realizada para permitir a identificação das células B específicas do antígeno em um determinado poço que continha uma população heterogênea de células B. Isso foi alcançado utilizando o método de focos fluorescentes (Clargo et al,

2014. MAbs: 6 (1), 143 a 159) Resumidamente, células B secretoras de imunoglobulina de um poço positivo foram misturadas com esferas de estreptavidina (New England Biolabs) revestidas com fibrilas de alfa-sinucleina humana recombinante biotiniladas (geradas usando a mistura 1:50 como descrito acima) e uma diluição final de 1:1.200 de um conjugado FITC específico de fragmento Fcy de IgG antirrato de cabra (Jackson). Após a incubação estática a 37 ºC durante 1 hora, as células B específicas do antígeno podem ser identificadas devido à presença de um halo fluorescente que circunda essas células B. Vários desses clones individuais de células B, identificados usando um microscópio Olympus, foram então colhidos com um micromanipulador Eppendorf e depositados em um tubo de PCR.

[0220] Os genes da região variável do anticorpo foram recuperados a partir de células únicas por transcrição reversa (RT)-PCR usando iniciadores específicos da região variável de cadeia pesada e leve. Dois ciclos de PCR foram realizados com os locais de restrição aninhados que incorporaram a segunda PCR nas extremidades 3'

e 5', permitindo a clonagem da região variável em um vetor de expressão de mamífero de Fcy1 de IgG de camundongo ou Fab-10HIS (VH) ou kappa de camundongo (VL). Os genes de anticorpos anti-alfa-sinucleína de 9 sobrenadantes diferentes foram clonados com sucesso em vetores de expressão. Os construtos de cadeia pesada e leve foram cotransfectados em células Expi-293 usando anticorpos 5811 mFab ou 5811 mIgG1 recombinantes quiméricos de rato-camundongo ExpiFectamine 293 (Invitrogen), compreendendo as regiões variáveis de 5811 de rato e as regiões constantes de camundongo (de acordo com a SEQ ID NO : 34 e 35 para a IgG e SEQ ID NO: 34 e 36 para o Fab) expressas em balão Erlenmeyer de 125 ml! em um volume de 30 ml. Após 5 a 7 dias de expressão, os sobrenadantes foram colhidos e purificados usando cromatografia de afinidade.

TRIAGEM ELISA DE SOBRENADANTES TRANSITÓRIOS

[0221] Os anticorpos quiméricos de rato-camundongo purificados foram então submetidos à triagem adicional por ELISA. O monômero e fibrilas de alfa-sinucleina humana recombinante biotinilados foram capturados em placas Maxisorp de 384 poços (ThermoScientific/Nunc) revestidas com estreptavidina em tampão de revestimento de carbonato (dH2O + 0,16% de Na2COs + 0,3% de NaHCO;). Placas separadas também foram revestidas com um peptídeo biotinilado correspondente aos resíduos 117 a 126 da alfa-sinucleína humana de acordo com a SEQ ID NO: 8 (peptídeo PVDPDN EAYE) para verificar se os transientes se ligam a essa ou a uma região diferente da molécula. As placas foram bloqueadas com 1% p/v de PEG/PBS e depois incubadas com várias diluições de sobrenadante transitório purificado. O anticorpo de Fc de IgG anticamundongo de cabra conjugado a HRP secundário (Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch) foi adicionado às placas, seguido de visualização de ligação com substrato de TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina, junto à Merck; 10 ul/poço). A densidade óptica foi medida em 630 nM usando o leitor de microplacas BioTek Synergy 2. Os dados para anticorpo 5811, como Fcy1 de IgG (que compreendem SEQ ID Nos: 34 e 5) e como um Fab (que compreende SEQ ID Nos: 34 e 36) são mostrados nas Figuras 3A e 3B. Como pode ser visto, os anticorpos 5811 mostram a ligação à alfa-sinucleína humana recombinante monomérica e fibrilar, e também mostram a ligação ao peptídeo PVDPDNEAYE.

[0222] Foi realizada uma caracterização adicional para determinar as propriedades de atividade, afinidade e avidez, de ligação ao epítopo e biofísicas de tais anticorpos. A não ser que explicitamente mencionado que uma versão humanizada foi utilizada, os experimentos foram realizados com os anticorpos quiméricos de rato-camundongo (5811 mFab ou 5811 mIlgG1). EXEMPLO 3: CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS

CINÉTICA BIACORE

[0223] A cinética de interação foi determinada usando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície em um instrumento Biacore T200. Três diferentes ligantes incluindo monômero de alfa-sinucleína humana de comprimento total recombinante, fibrilas de alfa-sinucleína humana recombinante purificadas e fibrilas de alfa- sinucleína de camundongo recombinante purificadas, preparadas como descrito aqui, foram imobilizados, cada um, em três células de fluxo diferentes de uma superfície de chip CM5 usando química de acoplamento de amina. Os três ligantes foram preparados em NaAc 10 mM, pH 3,5 e imobilizados em superfícies de células de fluxo separadas para atingir um nível de imobilização de cerca de 30 unidades de resposta (UR) para monômero de alfa-sinucleína, cerca de 40 UR para fibrilas de alfa- sinucleína humana e cerca de 300 UR para fibrilas de alfa-sinucleína de camundongo, respectivamente, a uma taxa de fluxo de 10 ulímin. O tampão HBS-EP+ (GE Healthcare Bio-Sciences AB) foi usado como tampão de corrida para imobilização de ligantes e ensaio de cinética. A ligação de anticorpo 5811 mlgG1 monoclonal anti-alfa- sinucleína e anticorpo 5811 mFab monoclonal contra os três ligantes foi então medida. Os anticorpos mIgG1 ou mFab monoclonais foram injetados a 7 concentrações diferentes de 800 nM a 0,195 nM ao longo dos 3 células de fluxo com um tempo de contato de 3 minutos e um tempo de dissociação de 30 minutos, a uma taxa de fluxo de 100 ul/min. A superfície foi regenerada por uma injeção de HCI 50 mM durante 90 s a 10 ul/min, e outra injeção de HCl 50 mM durante 60 s a 10 ul/min. Os dados foram analisados usando o software de avaliação Biacore T200 (versão 3.0), usando o modelo de analito bivalente com nenhuma contribuição em massa assumida (RI = O)

e Rmax global para o formato mIgG1, e o modelo 1:1 com contribuição em massa flexível (RI local) e Rmax global.

[0224] Os valores cinéticos para a ligação de mIgG1 e mFab aos alvos imobilizados são mostrados na Tabela 2. O formato mIlgG1 mostrou afinidade seletiva aparente em relação às fibrilas de alfa-sinucleína humana em comparação com a afinidade ao monômero de alfa-sinucleína humana, já que a constante de dissociação KD é 10 vezes menor para fibrilas humanas. TABELA 2

KD KD 1 1 ka1 kd1 (n kal kd1 (n [kal kd1 KD1 (1/Ms) |(1/s) M) |(UMs) |(1/s) M) |(U/Ms) |(1/s) (nM) 5811 1,26E+ |3,69E- [0,2 |1,04E+ |6,28E- 3,12E+ |1,34E- |42,92 re ls o fa a o da 5811 4,21E+ |2,25E- |O,5 |1,05E+ |2,87E- [0,0 [6,94E+ |8,27E- [119,0

LIGAÇÃO À BETA SINUCLEÍNA

[0225] A ligação de antibióticos criados contra a alfa-sinucleína humana para beta- sinucleína humana foi testada por Western blot usando o rPeptídeo beta-sinucleína. Um (1) micrograma de sinucleína foi executado em um gel Bis/Tris 4 a 12% e transferido para membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada em PBS com 3% de BSA e 0,1% de Tween20. O anticorpo 5811 mIgG1 foi adicionado à mancha bloqueada e incubado durante 1 hora à temperatura ambiente, lavado com PBS, 0,1% Tween 20 e incubado durante 1 hora com um conjugado secundário de anticorpo-HRP (conjugado de anticoelho H + L HRP, Bethyl A120-101P). A mancha foi lavada extensivamente em PBS com 0,1% de Tween20, PBS e água. A quimi-luminescência foi medida após a adição do substrato de Western blot ECL (Pierce). Como mostrado na Figura 4 (A) faixa 3, o anticorpo 5811 mIgG1 não se liga à beta-sinucleína humana.

MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS RMN

[0226] A alfa-sinucleína humana foi clonada no vetor de expressão pET28a, de modo que a proteína foi expressa sem nenhuma etiqueta. O construto foi transformado em células E. coli BL21 (DE3) (Stratagene), e as células foram cultivadas em meio definido com DL-glicose marcado com C'*? e sulfato de amônio marcado com N'* na presença e na ausência de óxido de deutério (D2O). A expressão foi induzida a OD 600 nm = 1 com IPTG 300 mM e a cultura foi incubada a 30 ºC por 4 horas. As células foram sedimentadas e lisadas por três ciclos de congelação-descongelação em 100 ml de tampão de lise (20 mM Tris/HCI pH 8,0, 25 unidades de benzonase (Merck Millipore), coquetel inibidor de protease completo EDTA (2 comprimidos, Roche) e 10 mg de lisozima (Sigma)). O lisado foi clarificado por centrifugação a 18.000 rpm, e o lisado clarificado passou por um filtro de 0,22 (Stericup, Millipore). O lisado estéril foi carregado em um MonoQ 10/100GL (GE Healthcare) equilibrado com Tris/HCI 20 mM pH 8,0, 5CV e a proteína foi eluída com um gradiente para NaCl 500 mM no mesmo tampão. A purificação adicional das frações mais puras foi repetida na coluna MonoQ 10/100GL, após uma diluição de 5 vezes em 20 mM de Tris/HCI pH 8,0. As frações mais puras foram reunidas, concentradas com um concentrador de centrífuga de 10 kDa MWCO (Centriprep, Millipore), purificadas por exclusão de tamanho em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare), e eluidas em tampão de fosfato de sódio 25 mM, NaCl 100 mM (pH 6,4). As frações da coluna Superdex 75 foram reunidas e azida de sódio (0,02% de concentração final) e AEBSF (10 UM de concentração final) foram adicionados. A concentração final de proteína foi de aproximadamente 5 mg/ml.

[0227] O anticorpo de Fab 5811 de rato-camundongo foi expresso em CHO SXE como entidades etiquetadas com His e purificado a partir do sobrenadante por cromatografia de afinidade com etiqueta His, ligando a proteína ao HisTrap Excel (GE Healthcare) a partir do sobrenadante e eluindo-a com imidazol 250 mM em PBS. À piscina de eluição foi carregada em HiTrap GammaBind Plus Sepharose (GE Healthcare), a coluna foi lavada com PBS e a proteína eluída com glicina 0,1 M-HCl a pH 2,6, e o pH foi ajustado para pH 6 com fosfato de sódio 0,75 M de pH 9. A proteína Fab-His eluída foi trocada de tampão para tampão RMN (fosfato de sódio 25 mM, pH 6,4, NaCl 100 mM) em uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10. As frações de proteína Fab-His foram concentradas e os inibidores de protease AEBSF (concentração final de 10 UM) e azida de sódio (concentração final de 0,02%) foram adicionados antes da esterilização do filtro sobre um filtro Millex GV 0,22 um.

[0228] A ligação de epítopo do anticorpo 5811 com uma VL de SEQ ID NO.: 9 e uma VH de SEQ ID NO: 10 foi determinada usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear heteronuclear (RMN) usando um fragmento de anticorpo Fab. ATRIBUIÇÃO DA ESTRUTURA DE A-SINUCLEÍNA

[0229] As amostras de RMN tinham tipicamente 350 ul em volume com uma concentração de proteína de 360 uM marcada com *ºC/"*N ou 430 uM 2H/12C/"SN de alfa-sinucleína humana marcada em tubos Shigemi de 5 mm. As condições de tampão foram 100 mM de NaCl, 25 mM de fosfato de sódio pH 6,4, 10 uM de AEBSF, 0,02% de NaN;z. Todas as experiências foram registradas a 20 ºC em um espectrômetro Bruker AVIII de 600 MHz ou Bruker AVII de 800 MHz, equipado com sondas de refrigeração criogênica. As ligações sequenciais entre sinais de RMN de estrutura de resíduos na proteína, Hn(i)-N(i)-N(i+1), foram feitas usando um experimento 3D (H)N(CA)NNL (Weisemann et al., 1993 3D Triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR 3) registradas com larguras espectrais de 28, 28 e 10 ppm e tempos de aquisição de 117 (F1), 117 (F2) e 140 (F3) ms nas dimensões **N, **N e 'H, respectivamente, com 8 varreduras por incremento e um atraso de relaxamento de 1,58. A amostragem não uniforme foi empregada com uma densidade de amostragem de 10% (4.000 de 40.000 pontos hipercomplexos), resultando em um tempo total de aquisição de 2,75 dias. As conexões sequenciais foram confirmadas e os tipos de resíduos identificados usando experimentos de TROSY-HNCA (Grzesiek e Bax, 1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432 a 440; Salzmann et.al., 1998. TROSY in triple-resonance experiments: new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA. 95, 13.585 a 13.590) e TROSY-HNCACB (Wittekind e Mueller, 1993 HNCACB, a High-Sensitivity 3D NMR Experiment to Correlate Amide-Proton and Nitrogen Resonances with the Alpha- and Beta-Carbon Resonances in Proteins. J. Magn. Reson. Ser. B 101, 201 a 205; Salzmann et.al., 1999. TROSY-type Triple Resonance Experiments for Sequential NMR Assignment of Large Proteins. J. Am. Chem. Soc. 121, 844 a 848). O experimento TROSY-HNCA foi registrado com larguras espectrais de 23, 28, 10 ppm e tempos de aquisição de 12,1 (F1), 21,7 (F2) e 100 (F3) ms nas dimensões *ºC, **N e 'H, respectivamente (8 varreduras por incremento, atraso de relaxamento de 1,5 s, tempo total de aquisição de 1 dia) enquanto o TROSY- HNCACB foi registrado com larguras espectrais de 56, 28 e 10 ppm e tempos de aquisição de 8,2 (F1), 21,7 (F2) e 100 (F3) ms nas dimensões *ºC, **N e 'H, respectivamente (8 varreduras por incremento, atraso de relaxamento de 1,5 s, tempo total de aquisição de 1,7 dias). As atribuições de carbonila da estrutura foram obtidas a partir de um espectro TROSY-HNCO (Grzesiek e Bax, 1992 Improved 3D triple- resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432 a 440; Salzmann et.al., 1998. TROSY in triple-resonance experiments: new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95,

13.585 a 13.590) registradas com larguras espectrais de 10, 29, 10 ppm e tempos de aquisição de 80 (F1), 21,7 (F2) e 150 (F3) ms nas dimensões "ºC, **N e 'H, respectivamente (8 varreduras por incremento e um atraso de relaxamento de 1,5s). A amostragem não uniforme foi empregada com uma densidade amostral de 15% (1.208 de 8.050 pontos hipercomplexos), resultando em um tempo total de aquisição de 19 horas. Os espectros de RMN foram processados usando NMRPipe ((Delaglio et al., 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277 a 293), com previsão linear usada para estender o tempo efetivo de aquisição em nitrogênio por até 1 vez. Os dados amostrados não uniformes foram reconstruídos usando o método de limiar suave iterativo de Harvard (Hyberts et al., 2012 Application of iterative soft thresholding for last reconstruction of NMR data non-uniformly sampled with multidimensional Poisson Gap scheduling. J Biomol NMR 52, 315 a 327 com os dados reconstruídos para o próximo número de Fourier,

aumentando os tempos de aquisição indireta em até 60%. A análise dos dados foi realizada usando Sparky (Goddard e Kneller, DG SPARKY 3. In., University of California, San Francisco), resultando na atribuição das ressonâncias de prótons e nitrogênio de 133 resíduos, correspondendo a 99% dos resíduos, excluindo resíduos de prolina e metionina N-terminal. O único outro resíduo de alfa-sinucleína que não foi atribuído foi o ácido aspártico na posição 2.

MAPEAMENTO DO LOCAL DE LIGAÇÃO DO FRAGMENTO 5811FAB DE

ANTICORPO

[0230] O mapeamento do local de ligação de 5811 foi executado usando uma amostra de 150 uM de a-Sinucleína humana etiquetada com 2H/"?C/"SN contendo um excesso molar de 10% do Fab 5811 não etiquetado. As amostras foram preparadas no mesmo tampão, como descrito acima, para a atribuição da estrutura da a- Sinucleína. As alterações de deslocamento químico *H, *?N e ºC foram determinadas por comparação do espectro de Trosy-HNCO ((Grzesiek e Bax, 1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432 a 440; Salzmann et.al., 1998. TROSY in triple-resonance experiments: new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 13.585 a 13.590) registrado no complexo de alfa-sinucleína/Fab com um espectro de controle equivalente registrado na alfa-sinucleína livre. O experimento de controle de Trosy-HNCO da alfa-sinucleína livre foi registrado com larguras espectrais de 10, 28 e 10 ppm e de tempos de aquisição de 80 (F1), 1,7 (F2) e 150 (F3) ms nas dimensões de ºC, **N e 1H, respectivamente (16 varreduras por incremento, atraso de relaxamento de 1,5 s). A amostragem não uniforme foi empregada com uma densidade amostral de 25% (2.013 de 8.050 pontos hipercomplexos), resultando em um tempo total de aquisição de 2,7 dias. O experimento TROSY- HNCO do complexo de a-Sinucleína/Fab foi registrado com larguras espectrais de 10, 28 e 10 ppm e tempos de aquisição de 80 (F1), 21,7 (F2) e 80 (F3) ms nas dimensões de 1ºC, '”*N e 1H, respectivamente (32 varreduras por incremento, atraso de relaxamento de 1,5 s). A amostragem não uniforme foi empregada com uma densidade amostral de 25% (1.119 de 4.477 pontos hipercomplexos), resultando em um tempo total de aquisição de 2,8 dias. Os espectros de RMN foram processados usando NMRPipe (Delaglio et al., 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277 a 293) com reconstrução dos dados NUS realizados usando mddnmr. (Orekhov e Jaravine, 2011. Analysis of non-uniformly sampled spectra with Multi-Dimensional Decomposition. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc., 59, páginas 271 a 292). O tempo de aquisição eficaz da dimensão nitrogênio foi aumentado em até 1 vez durante a reconstrução dos dados.

[0231] As alterações de deslocamento químico foram analisadas usando a abordagem de deslocamento mínimo (Williamson et al., 1997 Mapping the binding site for matrix metalloproteinase on the N-terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases-2 by NMR chemical shift perturbation. Biochemistry 36, 13.882 a

13.889), essencialmente como descrito anteriormente ((Veverka et al., 2008 Structural characterization of the interaction of MTOR with phosphatidic acid and a novel class of inhibitor: compelling evidence for a central role of the FRB domain in small molecule- mediated regulation of MTOR. Oncogene 27, 585 a 595), com exceção de uma modificação na equação usada para calcular a alteração do deslocamento químico combinado (A5) para incluir o deslocamento químico de carbonila, resultando na seguinte equação: nó = VESADAF SNANE + (5CACYE 3

[0232] onde AôHn, Aône Adc são as diferenças nos deslocamentos químicos de 1H, SN e 1%C, respectivamente. aN e aC correspondem a fatores de escala de 0,2 e 0,35, respectivamente, usados para compensar as diferenças nas faixas de deslocamento químico dos deslocamentos químicos de prótons de amida, nitrogênio e carbonila.

[0233] Para identificar os locais de ligação de Fab (epítopos) em alfa-sinucleína, um histograma de deslocamento mínimo combinado versus sequência proteica foi usado para revelar regiões de alfa-sinucleína contendo sinais significativamente perturbados. Se o tamanho da mudança de deslocamento químico combinado para aminoácidos individuais exceder um valor limite da média da mudança de deslocamento químico combinado para todos os aminoácidos mais um desvio padrão dessa média, esses resíduos foram selecionados para avaliação adicional como possíveis resíduos de contato no local de ligação de Fab.

[0234] Os resíduos significativamente perturbados foram identificados como aqueles cujo deslocamento mínimo foi pelo menos maior que a média mais um desvio padrão de todos os deslocamentos calculados. Quatro limiares diferentes foram aplicados para identificar resíduos ligados pelo Fab. Os resíduos envolvidos no local de ligação são classificados com crescente rigor como: aqueles cujo deslocamento mínimo excede a média mais um desvio padrão de todos os deslocamentos calculados (sendo >0,025574); aqueles cujo deslocamento mínimo excede a média mais dois desvios padrão de todos os deslocamentos calculados (sendo >0,042552); aqueles cujo deslocamento mínimo excede a média mais três desvios padrão de todos os deslocamentos calculados (sendo >0,059530); aqueles cujo deslocamento mínimo excede a média mais quatro desvios padrão de todos os deslocamentos calculados (sendo >0,076508). Nessa análise, os resíduos de prolina não podem ser identificados uma vez que não contêm prótons de amida.

[0235] O epítopo de alfa-sinucleína para o 5811 Fab é, portanto, definido com estringência crescente como média mais um desvio padrão de todos os deslocamentos calculados: E114, D115, V118, D119, D121, N122, E123, A124, Y125, E126, M127, S129, Q134, D135 e Y136; média mais dois desvios padrão de todos os deslocamentos calculados: V118, D119, D121, N122, Y125, M127, D135 e Y136; média mais três desvios padrão de todos os deslocamentos calculados: V118, D119, D121, N122, M127, D135 e Y 136; nenhum resíduo foi deslocado acima da média mais quatro desvios padrão de todos deslocamentos calculados.

[0236] Usando a numeração de aminoácido usada na Sequência de Referência NCBI NP 000336.1, verificou-se que o 5811 Fab se liga a pelo menos os seguintes resíduos de alfa-sinucleína (média + 3 DP) V118, D119, D121, N122, Y125, M127, D135 e Y 136. O anticorpo também pode se ligar a todos os seguintes resíduos (média + 1 DP) E114, D115, V118, D119, D121, N122, E123, A124, Y 125, E126, M127, S129, Q134, D135 e Y136.

[0237] Como mostrado na Figura 4B, o deslocamento químico de RMN mudou na alfa-sinucleína humana dCN após ligação com 5811 mFab. O epítopo previsto de 5811 mFab parece compreender resíduos dentro de aminoácidos 114 e 136 de alfa- sinucleína humana (SEQ ID NO: 8).

MAPEAMENTO DE PEPTÍDEOS

[0238] Uma caracterização adicional do epítopo ligado por anticorpo 5811 mFab foi realizada usando peptídeos curtos (tipicamente 9-mer ou 10-mer) representativos e cobrindo a região C-terminal da alfa-sinucleína humana. Esses foram utilizados em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície competitiva para testar se algum era capaz de inibir a ligação do anticorpo a qualquer fibrila de alfa-sinucleína monomérica ou de alfa-sinucleína pré-formada imobilizadas em um chip de Biacore. Um peptídeo que mostra o nível máximo de inibição foi então selecionado para estudos de cocristalização com o anticorpo, a fim de confirmar o epítopo exato.

[0239] Os peptídeos foram fornecidos pela Peptide Protein Research Ltd., Bishop's Waltham, Reino Unido, e foram sintetizados pela química dos peptídeos em fase sólida Fmoc, de acordo com o método de Atherton e Sheppard. (Ref: Atherton, E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press). Os terminais peptídicos N e C foram tapados com grupos acetila e amida, respectivamente, exceto no caso dos peptídeos representando o N- terminal e o C-terminal da a-sinucleína, onde os grupos amino e carboxila, respectivamente, permaneceram livres. As soluções de estoque de peptídeo foram preparadas em DMSO a 10 mM. A lista completa de peptídeos é mostrada na Tabela

3. TABELA 3

[0240] O monômero de alfa-sinucleína humano recombinante e as fibrilas de alfa- sinucleína pré-formadas foram imobilizadas em um chip CM5 usando um instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare). Após a ativação da superfície do carboximetil dextrano por injeção de 100 ul de uma mistura fresca 1:1 (v/v) de N-hidroxissuccimida 50 mM e 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida 200 mM a uma taxa de fluxo de 10 ul/min de HBS-EP (GE Healthcare) como tampão de corrida, o acoplamento foi obtido através da injeção de 100 ul de monômero e fibrilas, a 5 UM em acetato de 10 mM pH 5,0, em células de fluxo separadas. Uma célula de fluxo de referência foi ativada da mesma maneira e, em seguida, todas as superfícies das células de fluxo foram desativadas com um pulso de 50 ul de 1 M de etanolamina HCI pH 8,5.

[0241] As soluções peptídicas foram preparadas em tampão de corrida a 100 uM e um controle de peptídeo em branco foi preparado como uma diluição de 1 em 100 de DMSO em tampão de corrida. Uma solução de 5811 mFab foi preparada a 50,5 nM em tampão de corrida antes de pré-incubar 198 ul com 2 ul de controle em branco ou peptídeo diluído para produzir uma mistura final de 50 nM de Fab e peptídeo ou controle 1 uM. Os sensogramas foram registrados para cada amostra, injetando 30 ul da mistura a 10 ul/min e registrando um ponto de relatório 5 segundos antes do final da injeção. O chip foi regenerado no final de cada ciclo por duas injeções de 10 ml de HCI 40 mM e uma injeção de NaOH 5 mM. Os ciclos de controle foram alternados com ciclos de peptídeos.

[0242] O grau de inibição de cada peptídeo foi calculado como a variação percentual nas unidades de resposta medidas no ponto do relatório em comparação com aquelas da média de ciclos de controle adjacentes.

[0243] O nível de inibição de cada peptídeo de alfa-sinucleína é mostrado na Figura 5. Uma inibição significativa de 5811 mFab para monômeros e fibrilas de alfa- sinucleína foi apenas observada para os peptídeos C-terminal AS113-122, AS115-

124, AS117-126 e AS119- 128, onde os níveis de inibição para qualquer uma das formas de a-sinucleína eram muito semelhantes. O nível mais forte de inibição foi observado para o peptídeo AS117-126 a 81% e 90% para ligação ao monômero e fibrila, respectivamente. Os resíduos em comum dos quatro peptídeos acima são 119 para 122 que, desse modo, compreendem parte do epitopo. Uma vez que o nível de inibição cai para entre apenas 2 a 5% para os peptídeos AS113-122 e AS119-128, os resíduos 115 a 118 e 123 a 124 devem também compreender parte do epítopo.

[0244] O resultado desse estudo sugeriu que o epítopo do anticorpo 5811 compreende os resíduos 115 a 124 (DMPVDPDNEA).

VARREDURA DE ALANINA

[0245] Os únicos mutantes de aminoácidos de alfa-sinucleína humana (com etiqueta His) foram preparados e expressos no sistema Expi293 (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Os resíduos de alanina foram colocados em posições 118 a 128, com a exceção do resíduo 124, que já é uma alanina e que foi alterada para uma serina (Tabela 4). As proteínas mutantes foram purificadas a partir de sobrenadantes obtidos após centrifugação (4.200 rpm, 2 horas), seguida de filtração estéril (Stericup, Millipore). Os sobrenadantes foram carregados em uma coluna HisTrap Excel (GE Healthcare) pré-equilibrada e lavados com fosfato de sódio 25 mM e NaCl 500 mM. A proteína ligada foi eluída com um gradiente de imidazol até 500 MM no mesmo tampão. As frações com proteína de interesse foram identificadas por eletroforese em gel NuPage, reunidas, concentradas usando um Centriprep 10 kKDa MWCO (Millipore) e tiveram o tampão trocado em uma coluna PD- para PBS. As frações de proteína foram concentradas usando um concentrador giratório centrífugo Ultracel 3 kKDa MWCO (Millipore). O concentrado foi passado através de um filtro de esterilização de 0,22 mM (Millex GV, Millipore) e armazenado a -20 ºC. Todos os mutantes foram expressos em quantidade semelhante à alfa- sinucleína humana do tipo selvagem (Figura 6A). TABELA 4

[0246] Os mutantes de alfa-sinucleína humana foram analisados em um gel NuPage 4 a 12% de Bis/Tris usando 1 micrograma por proteína por faixa e manchados sobre uma membrana PVDF (mini-pilha iBlot, Thermo Fisher Scientific). A mancha foi bloqueada em tampão de bloco (albumina de soro bovino a 3%, Tween20 a 0,1% em solução salina tamponada com fosfato, PBS) e foi incubada com o anticorpo 5811 mFab ou com o anticorpo 5811 mIgG1. A mancha foi lavada após 1 hora de incubação à temperatura ambiente com 0,1% de Tween em PBS. A mancha foi incubada por 1 hora com o anticorpo de detecção secundário conjugado de HRP de Fc de IgG anticamundongo de (AB5879, Abcam) em tampão de bloco, lavada e detectada por quimioluminescência após a adição de substrato ECL Western Blotting (Pierce).

[0247] Como mostrado na Figura 6B e 6C, 3 mutantes correspondentes à alfa- sinucleína humana D119A, N122A e Y125A não foram reconhecidos pelos anticorpos 5811 mFab e 5811 mIgG1. Essa análise sugere que esses aminoácidos em alfa- sinucleína humana podem ser essenciais para a ligação de anticorpos 5811 mFab e 5811 mIgG1 à alfa-sinucleína humana. EXEMPLO 4: HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPOS

[0248] O anticorpo 5811 de rato foi humanizado por enxerto das CDRs da região V de rato em estruturas de região V de anticorpo da linhagem germinativa humana. À fim de recuperar a atividade do anticorpo, vários resíduos de estrutura da região V de rato também foram retidos na sequência humanizada. Esses resíduos foram selecionados usando o protocolo delineado por Adair et al. (WO 91/09967). Os alinhamentos das sequências de região V (doadora) do anticorpo de rato com as sequências da região V da linhagem germinativa humana (aceitadora) são mostrados nas Figuras 7 e 8, em conjunto com as sequências humanizadas projetadas. As CDRs enxertadas da sequência doadora para a aceitadora são as definidas por Kabat (Kabat et al., 1987), com exceção da CDR-H1 onde a definição combinada de Chothia/Kabat é usada (consulte, Adair et al., 1991 Humanized antibodies. WOS91/09967).

[0249] Os genes que codificam uma série de sequências variantes das regiões V das cadeias pesada e leve foram projetados e construídos por uma abordagem de síntese automatizada pela DNA2.0 Inc. Outras variantes das regiões V das cadeias pesada e leve foram criadas pela modificação dos genes VH e VK por mutagênese oligonucleotídeo-direcionada, incluindo, em alguns casos, mutações nas CDRs. Para a expressão transiente em células de mamífero, os genes da região V da cadeia leve humanizados foram clonados no vetor de expressão de cadeia leve UCB pMhCK, que contém DNA que codifica a região constante da cadeia humana Kapa (alotipo Km3). Os genes da região V da cadeia pesada humanizados foram clonados no vetor de expressão de cadeia pesada UCB gama-4 humana PMHy4PFL, que contém DNA que codifica a região constante de cadeia pesada gama-4 humana com a mutação de estabilização de dobradiça S241P (Angal et al., Mol. Immunol. 1993, 30 (1): 105 a 108). O anticorpo 5811 rato-humano quimérico (compreendendo SEQ ID NOs: 9 e 10) também foi preparado de forma semelhante. A cotransfecção dos vetores de cadeia pesada e leve resultantes em células de suspensão Expi293TY foi conseguida usando reagente de transfecção ExpiFectamine'V 293 (A14525, ThermoFisher Scientific), e proporcionou a expressão dos anticorpos humanizados recombinantes em ambos os formatos I9gG4P ou Fab-HIS humanos.

[0250] A região V humana IGKV1-39 mais região J JK1 (IMGT, http://www.imgt.org/) foi escolhida como a aceitador para as CDRs de cadeia leve do anticorpo 5811. Os resíduos de estrutura de cadeia leve em enxertos GL5, GL8 e gL14 são todos da linhagem germinativa humana, com a exceção do resíduo 71 (com referência à SEQ ID No: 13), onde o resíduo doador tirosina (Y71) foi retido. O resíduo 94 em CDRL3 de enxerto gL 14 foi mutado de um resíduo de glicina (G) para alanina (A), modificando assim um potencial local de desamidação de asparagina.

[0251] A região V humana IGHV3-15 mais região J JH3 (IMGT, http://www.imgt.org/) foi escolhida como a aceitadora para as CDRs de cadeia pesada do anticorpo 5811. Os resíduos de estrutura de cadeia pesada em enxerto GH4 são todos derivados do gene da linhagem germinativa humana, com a exceção dos resíduos 49 e 100 (com referência à SEQ ID NO: 25), em que os resíduos doadores alanina (A49) e alanina (A100) foram retidos, respectivamente.

[0252] As cadeias de anticorpo humanizado variantes e combinações das mesmas foram expressas e avaliadas para a sua potência relativa ao anticorpo parental, suas propriedades biofísicas e adequação para processamento a jusante.

[0253] Como mostrado na Tabela 5, todos os enxertos retiveram a mesma afinidade ou similar que o anticorpo parental rato-humano à alfa-sinucleína em fibrilas. TABELA 5 Variante deResíduos Resíduos Afinidade lanticorpo 5811 doadores “dedoadores de (KD) cadeia leve — cadeia pesada Lo 1 Meme 5811 de rato- 1,56E+06 /2,42E-05/15,6 humano quimérico 5811gL5gH4 — NT1 nao, Ag4 12,74E+06 19,10E-05 [15,0 prisma amos breno — EXEMPLO 5: IMUNO-HISTOQUÍMICA

[0254] A imuno-histoquímica foi realizada por Asterand Bioscience (Royston, Reino Unido). As criosseções (10 um) foram submetidas primeiro ao procedimento de recuperação de antígeno usando as soluções de recuperação de alvos Dako PT Link e EnVision FLEX (pH 6) a 97 ºC por 20 minutos com aquecimento e resfriamento automático.

Todas as etapas de incubação a seguir foram realizadas à temperatura ambiente.

As criosseções foram secas ao ar por 30 minutos, fixadas em paraformaldeído a 4%, preparadas em 1X PBS por 10 minutos, lavadas com o tampão de lavagem Dako EnVision'y FLEX (Dako) e depois carregadas em um instrumento Dako Autostainer Plus.

A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das seções com o bloco de peroxidase Dako (Dako) por 5 minutos.

As seções foram então lavadas duas vezes com 1X PBS antes da incubação com o bloco de proteínas Dako CSA Il (Dako) durante 10 minutos.

A solução de bloco de proteína foi removida por jato de ar e as seções incubadas durante 30 minutos com anticorpo I9G1 de rato-camundongo 5811 (que compreende as SEQ ID NOs: 34 e 35) diluído (0,05 ug/ml) em diluente de anticorpo Dako (Dako). Após a incubação, as seções foram lavadas duas vezes com 1X PBS, depois incubadas com substrato de HRP de polímero Dako Flex anticamundongo (Dako) por 20 minutos, lavadas duas vezes e depois incubadas com substrato de diaminobenzidina (Dako) por 10 minutos.

A reação cromogênica foi interrompida por lavagem das lâminas com água destilada.

Após a cromogênese, as seções foram removidas do Dako Autostainer Plus e manualmente contrastadas com hematoxilina, desidratadas em uma série ascendente de etanol, limpas em três mudanças de xileno e tampadas com tampa deslizante sob meio de montagem DPX (Sigma-Aldrich). As imagens digitais de seções coradas foram obtidas usando um sistema Aperio ScanScope AT Turbo (Leica Biosystems). O anticorpo 5811 mIgG1 foi testado em seções cerebrais derivadas de cinco diferentes doadores de pS129-alfa-sinucleína-positivas e três diferentes de pS129-alfa-sinucleina- negativas (1 seção/doador). O anticorpo 5811 mIgG1 marcou o neurópilo e recursos semelhantes a corpos de Lewy ocasionais no córtex temporal e substância nigra de pacientes com DP (Figura 9A-E). Nos tecidos cerebrais de não DP, o anticorpo 5811 mIgG1 marcou o neurópilo no córtex temporal, mas nenhuma estrutura semelhante a corpos de Lewy foram observadas no córtex ou substância nigra (Figura 9F-H). Essas observações sugerem que o anticorpo 5811 mIgG1 se liga à alfa-sinucleína normal no neurópilo de tecidos cerebrais de pacientes com DP e pacientes sem DP, ao mesmo tempo em que se liga à a-sinucleína patológica presente em corpos de Lewy em pacientes com DP apenas. EXEMPLO 6: CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS HUMANIZADOS

[0255] Três anticorpos IgG4P humanizados Ab5811 (5811gL5gH4; 5811gL8gH4 5811gL14gH4; sequências na Tabela 1) foram testados para avaliar as suas características bioquímicas e biofísicas, incluindo estabilidade térmica (Tm), pl experimental, hidrofobicidade, solubilidade (ensaio de precipitação PEG), estabilidade de agregação em uma interface ar/líquido e estabilidade química em relação à propensão de desamidação de Asn93 em CDR-L3 (5811gL14gH4 tem motivo N(93)A e tanto 581 1gL8gH4 quanto gL5gH4 têm motivo N(93)G). MEDIÇÕES DE ESTABILIDADE TÉRMICA (Twm)

[0256] A temperatura de fusão (Tm) ou a temperatura no ponto médio do desdobramento, foi determinada usando o ensaio Thermofluor. Nesse método, o corante fluorescente SYPROO laranja foi usado para monitorar o processo de desdobramento da proteína, ligando-se a regiões hidrofóbicas que ficam expostas à medida que a temperatura aumenta.

[0257] A mistura de reação continha 5 ul de corante larania SYPROS 30x (InvitrogenTY), diluído com PBS a partir da solução estoque 5000X e 45 ul de amostra a 0,12 mg/ml (em PBS pH 7,4). Cerca de 10 ul da mistura foram distribuídos em quadruplicado em uma placa de poço óptico de 384 PCR e foram executados em um sistema de PCR em tempo real rápido 7900HT (Applied Biosystems'Y). O dispositivo de aquecimento do sistema de PCR foi ajustado de 20 ºC a 99 ºC, com uma taxa de aumento de 1,1 ºC/min. Um dispositivo acoplado à carga monitorou as alterações de fluorescência nos poços. Os aumentos de intensidade foram plotados, e o ponto de inflexão da inclinação (ou inclinações) foi usado para calcular a Tm, conforme descrito abaixo. A Tm para cada molécula de anticorpo foi obtida em PBS pH 7,4 e acetato de sódio 50 mM/cloreto de sódio 125 mM pH 5,0, sendo tampões de pré-formulação comuns.

[0258] A estabilidade térmica para todos os três anticorpos humanizados é mostrada na Tabela 6. Uma transição foi observada em PBS pH 7,4 e essa foi atribuída a ambos os desdobramentos de domínio CH2e Fab. Em acetato de sódio 50 mM/cloreto de sódio 125 mM pH 5,0, foram observadas duas transições. A Tm mais baixa foi atribuída ao domínio de desdobramento de CH2 e a segunda transição foi atribuída ao domínio Fab. A partir dessa análise, os anticorpos 5811gL8gH4 e 5811gL5gH4 têm estabilidade térmica comparável com o anticorpo 5811gL14gH4, apenas um pouco menos estável termicamente. TABELA 6 ITm(1) médiaErro Erro IAnticorpo ITm(2) média ºC em E ms OT pIm | pres ri) Esc pe e

PI EXPERIMENTAL

[0259] O pl experimental de 581 1gL14gH4, 581 1gL8gH4 e 581 1gL5gH4 foi obtido usando o sistema cIEF ICE3TY imageado de todo o capilar (Protein Simple). As amostras foram preparadas pela mistura do seguinte: 30 ul de amostra (de um estoque de 1 mg/ml em água de grau HPLC), 35 ul de 1% de solução de metilcelulose (Protein Simple), anfólitos de 4 ul de pH 3 a 10 (Pharmalyte), 0,5 ml de 4,65 e 0,5 ul 9,77 de marcadores de pl sintéticos (ProteinSimple), 12,5 ul de solução de ureia 8 M (Sigma-AldrichO). Foi utilizada água de grau HPLC para perfazer o volume final até 100 ul. A mistura foi agitada no vórtex brevemente para garantir a mistura completa e centrifugada a 10.000 rpm por 3 minutos para remover as bolhas de ar antes da análise. As amostras foram focalizadas durante 1 minuto a 1,5 kV, seguido por 5 minutos a 3 kV, e imagens A280 do capilar foram feitas usando o software ProteinSimple. Os eletroferogramas resultantes foram analisados primeiro usando o software iCE3 e os valores de pl foram atribuídos (relação linear entre os marcadores de pl). Os eletroferogramas calibrados foram então integrados usando o software Empower&O (Waters).

[0260] O pl experimental de todas as moléculas estava na faixa de 8,80 a 9,23, com uma espécie principal a 9,09. Não houve diferença para a distribuição de espécies ácidas/básicas que era típica para moléculas IgG4P. Os pls experimentais foram elevados e, por conseguinte, poderiam ajudar no processo de fabricação dos anticorpos. CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA (HIC)

[0261] Os anticorpos humanizados 5811gL14gH4, 5811gL8gH4 e 5811gL5gH4 foram avaliados quanto aos seus comportamentos de hidrofobicidade por Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC). Em HIC, os anticorpos se ligam à fase estacionária hidrofóbica na presença de altas concentrações de sais polares e dessorvem na fase móvel à medida que a concentração de sal diminui. Um tempo de retenção mais longo equivale a uma maior hidrofobicidade.

[0262] As amostras de anticorpo a 2 mg/ml foram diluídas 1:2 com sulfato de amônio 1,6 M e PBS (pH 7,4). 5 ug (10 ul) da amostra foram injetados em uma coluna Dionex ProPac'"M HIC-10 (100 mm x 4,6 mm) conectada em série a uma HPLC binária Agilent 1200 com um detector de fluorescência. A separação foi monitorada por fluorescência intrínseca (comprimentos de onda de excitação e emissão, 280 nm e 340 nm, respectivamente).

[0263] Usando tampão A (0,8 M de sulfato de amónio 100 mM Fosfato pH 7,4) e tampão B (100 mM de fosfato pH 7,4), a amostra foi analisada utilizando uma eluição de gradiente como se segue: (i) dois minutos de espera, a 0% de B, (ii) gradiente linear de O a 100% de B em 30 minutos (0,8 ml/minuto) (iii) a coluna foi lavada com 100% de B por 2 minutos e reequilibrada em 0% de B por 10 minutos antes da próxima injeção da amostra. A temperatura da coluna foi mantida a 20 ºC. Os padrões exibindo baixa e alta hidrofobicidade mais um controle também foram analisados na mesma sequência de execução para permitir a normalização dos tempos de retenção (Tabela 11). O tempo de retenção (RT) da amostra foi normalizado contra os padrões baixo e alto de hidrofobicidade usando a seguinte equação:

[(Amostra (RT) - baixo padrão (RT)/alto padrão (RT) - baixo padrão (RT) ] x 100

[0264] Todos os três anticorpos 5811gL14gH4, 5811gL8gH4 e 5811gL5gH4 mostraram tempos de retenção normalizados semelhantes e hidrofobicidade baixa semelhante, ou seja, por eluição a partir da coluna em menos de 5 minutos (ver Tabela 7). A baixa hidrofobicidade ajuda na estabilidade (ou seja, reduz a agregação) durante a fabricação. TABELA 7

MEDIÇÃO DE SOLUBILIDADE USANDO UM ENSAIO DE PRECIPITAÇÃO DE POLIETILENO GLICOL (PEG).

[0265] A estabilidade coloidal dos anticorpos humanizados 5811gL14gH4, 5811gL8gH4 e 5811gL5gH4 foi analisada utilizando um ensaio de precipitação de polietileno glicol (PEG). O PEG foi utilizado para reduzir a solubilidade da proteína de uma maneira quantitativa definível, aumentando as concentrações de PEG (p/v) e medindo a quantidade de proteína restante na solução. Esse ensaio serviu para imitar o efeito da solubilidade de alta concentração sem o uso de métodos de concentração convencionais.

[0266] A precipitação induzida por PEG de anticorpos 581 1gL14gH4, 581 1gL8gH4 e 5811gL5gH4 foi investigada na presença de 7 a 18% de PEG-3350 em PBS pH 7,4 e acetato de sódio 50 mM/cloreto de sódio 125 mM pH 5,0. As amostras de anticorpo foram trocadas de tampão usando diálise e a concentração ajustada para 2 mg/ml. À fim de minimizar a precipitação sem equilíbrio, a preparação da amostra consistiu na mistura de soluções 2 x proteína e 2 x PEG na razão de 1:1 em volume. Após a mistura, as amostras foram incubadas a 37 ºC por 30 minutos para redissolver os agregados sem equilíbrio. Após uma incubação durante a noite a 20 ºC, as amostras foram centrifugadas por 60 min (4.000 g). Alíquotas do sobrenadante foram transferidas para placas ópticas de 96 poços com meio volume e a absorbância a 280 nm foi medida usando um leitor de placas BMG Labtech FLUOstarº Omega LVIS A2Z80. Os dados de concentração foram plotados versus % de PEG e o ponto médio calculado (LogEC50), (gerado de um ajuste de curva de regressão não linear, inclinação variável) foi obtido como uma medida da solubilidade coloidal relativa das amostras. Nesse ensaio, o LogEC50 mais alto equivale a uma maior estabilidade coloidal.

[0267] Como mostrado na Tabela 8, não foi observada diferença na estabilidade coloidal entre os três anticorpos diferentes. Uma maior estabilidade coloidal foi observada no tampão de acetato pH 5 como mostrado pelo maior valor de logEC50. TABELA 8 [ RSRS PERTO Valores de melhor 5811gL14gH/5811gL8gH 1581 1gL5gH|5811gL149 5811gL8g [5811gL5g Inclinação "CN CNCNCECEOS Erro padrão) Fo ne bos nm nes Doo | EFEITO DE TENSÃO NA INTERFACE AR/LÍQUIDO (ENSAIO DE AGREGAÇÃO)

[0268] Esse ensaio serve para imitar as tensões às quais anticorpos poderiam ser submetidos durante a fabricação (por exemplo, ultrafiltração). As proteínas, como anticorpos, tendem a desdobrar quando expostas a uma interface ar-líquido, onde superfícies hidrofóbicas são apresentadas ao ambiente hidrofóbico (ar) e superfícies hidrofílicas ao ambiente hidrofílico (água). A agitação das soluções de proteínas alcança uma grande interface ar-líquido que pode impulsionar a agregação.

[0269] As amostras de anticorpos humanizados 5811gL14gH4, 5811gL8gH4 e 5811gL5gH4 em PBS pH 7,4 e acetato de sódio 50 mM/cloreto de sódio 125 mM pH

5,0 foram estressadas por vórtex usando um Eppendorf Thermomixer Comfort'Y, Antes do vórtex, a concentração foi ajustada a 1 mg/ml usando os coeficientes de extinção apropriados (1,41 Abs 280 nm, 1 mg/ml, 1 cm de comprimento do caminho) e a absorbância a 280 nm, 340 nm e 595 nm obtida usando um espectrofotômetro Varian Caryº 50-Bio para estabelecer a leitura do tempo zero. Cada amostra foi dividida em tubos cônicos de 1,5 ml com tampa Eppendorf & (4x 250 ul) e sujeita a condições rigorosas para testar a robustez por vórtex a 1.400 rpm a 25 ºC por até 24 horas. A agregação dependente do tempo (turbidez) foi monitorada por medição das amostras em 24 horas após o vórtice a 595 nm usando um espectrofotômetro Varian Cary“ 50-Bio. Os valores médios de absorbância foram plotados versus o tempo para cada amostra.

[0270] A molécula de anticorpo 5811gL5gH4 exibiu maior estabilidade de agregação em comparação com 5811gL14gH4 e 5811gL8gH4. Todos os anticorpos apresentaram maior estabilidade de agregação em PBS pH 7,4. ESTABILIDADE QUÍMICA - ESTUDO DE ESTRESSE DE DESAMIDAÇÃO

[0271] Um estudo de estresse acelerado foi realizado usando todos os três anticorpos: 581 1gL5gH4; 581 1gL8gH4 e 581 1gL14gH4 para determinar a propensão à desamidação de um local potencial identificado: Asn (93) na cadeia leve de CDR3 onde 5811gL14gH4 tem um motivo Asn (93)Ala e tanto 5811gL8gH4 quanto gL5gH4 têm um motivo Asn(93)GIy.

[0272] Os três anticorpos foram submetidos a condições conhecidas por favorecer a desamidação de resíduos de Asn(N) (Tris 50 mM/cloreto de sódio 125 mM, pH 8,0/37 ºC). Além disso, as amostras também foram preparadas em acetato de sódio 50 mM/cloreto de sódio 125 mM pH 5,0 como uma condição de controle para avaliar a desamidação basal antes do estresse. A concentração final da amostra em cada um dos tampões foi ajustada para -5 mg/ml e, em seguida, dividida em duas alíquotas, onde uma foi armazenado a 4 ºC e outra a 37 ºC por até 5 semanas. Uma alíquota foi removida imediatamente (TO) e em 2 semanas e 5 semanas e armazenada a -20 ºC.

[0273] A desamidação basal no resíduo de Asn(93) foi medida nas amostradas não estressadas (50 mM de acetato de sódio/125 mM de sódio cloreto pH 5/4 ºC)ea propensão à desamidação de Asn(93) foi obtida usando as amostras estressadas por 2 semanas/pH 8/37 “ºC, gerando um peptídeo tríptico contendo a sequência de interesse. Resumidamente, 80 ug de cada amostra foram reduzidos com DTT e desnaturados com cloridrato de guanidina a 37 ºC. As amostras foram então alquiladas com iodoacetamida à temperatura ambiente, antes da troca de tampão em 7,5 mM Tris/1,5 mM de CaCl2 de pH 7,9 (colunas giratórias Zeba'Y de 7 k;Da MWCO, Thermo Fisher) e cerca de 3 horas de incubação com tripsina (1:23 v/v) a 37 ºC. À proteólise foi interrompida por adição de ácido trifluoracético a 0,1% v/v e as amostras armazenadas a -20 ºC. No descongelamento, as amostras foram centrifugadas para remover o precipitado.

[0274] Os peptídeos resultantes foram separados e analisados em uma coluna Waters BEH C18 em interface com um espectrômetro de massa Thermo Fusion" executando um método orbitrap-orbitrap dependente de dados de íon positivo com fragmentação por dissociação induzida por colisão (CID). Os dados de LC-MS e MS? foram analisados usando software Thermo Xcalibur"" e Pepfinder"", O peptídeo de interesse (LC N93-K102) foi analisado para avaliar a porcentagem de modificação química.

[0275] A espectrometria de massa de mapeamento de peptídeos mostrou que o nível de desamidação basal de Asn(93) foi menor para 5811gL14gH4 em comparação com 581 1gL8gH4 e 581 1gL5gHA4. A diferença entre as moléculas era não inesperada, uma vez que tem sido demonstrado que apesar da predição da propensão à desamidação é difícil, os resíduos de Asn(N) seguidos por um resíduo de GIy(G) mostram uma maior propensão à desamidação do que aqueles seguidos com o resíduo de Ala(A) mais volumoso (Robinson, N. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 2001, 98, 4.367 a 4.372).

[0276] Para todos os três anticorpos, uma baixa taxa de desamidação foi observada em Asn(93), ou seja, 1,2% a 1,4% por semana. As diferenças de massa do peptídeo N93-K102 de cadeia leve para 581 1gL5gH4 e 5811gL8gH4 incluíram uma modificação de -17 Da (provavelmente a espécie de succinimida intermediária) e +1 Da (produto totalmente desamidado em Asn(93)), ao passo que a succinimida foi não observada para 581 1gL14gH4 (Tabela 9). TABELA 9 Fremeto fona Beans Pio nenem Por cento(%) Desamidação mais succinimida Asn(93) Succinimida CP nn PE Crer miar | Basal Basal semanas semanas química total por semana Não Não 5811gL14gH4/1,2 lobservad jobservad 1,4 a a periasana Se pe e a is

[0277] A taxa geral de desamidação foi baixa para todos os anticorpos, embora tenha sido observada mais heterogeneidade para 581 1gL5gH4 e 581 1gL8gH4. EXEMPLO 7: ENSAIO DE AGREGAÇÃO BASEADA EM CÉLULAS

[0278] As células HEK Freestyle 293F (células de suspensão) foram preparadas a 0,7x10º células/ml em meio de expressão Freestyle 293 (InvitrogenTVY) e cultivadas a 300x10º células/ml. A transfecção foi realizada de acordo com as instruções do fabricante e, brevemente, 600 ug de pcDNA3.1 (+) incorporando o gene da alfa- sinucleína foram misturados em 20 ml de meio OptiMEM, enquanto a 293Fectina foi ilustrada em meio OptiMEM (Invitrogen'!Y) e incubada por 5 minutos à temperatura ambiente. O DNA diluído foi adicionado e incubado à temperatura ambiente durante minutos antes de ser adicionado gota a gota nas células (20 ml por frasco). As células foram incubadas durante 24 horas a 37 ºC, 125 rom, 8% de CO». As células foram usadas imediatamente ou congeladas na concentração de 5 milhões de células/ml em FBS + 10% de DMSO.

[0279] Caso as células tenham sido previamente congeladas, os criotubos foram descongelados e as células ressuspensas em meio Freestyle 293, centrifugadas a 500 g durante 5 minutos, o sobrenadante foi descarregado e o sedimento foi ressuspenso em meio Freestyle 293 (Life Technologies!Y) + Pen/Strep (InvitrogenTY)

a 2x106 células/ml. Em uma placa de 384 poços (Grainer""), foram adicionados 20 ul de suspensão de células (a um total de cerca de 40.000 células/poço). A cada poço, foram adicionados 150 nM de fibrilas alfa-sinucleína humana (preparadas como descritas aqui no Exemplo 1) seguidos pelos anticorpos 5811gL5gH4 IgG4P, 5811 gL8gH4 IGG4P e 5811 gL14gH4 IGgG4P (sequências na Tabela 1) em PBS a serem testadas (em várias concentrações). As placas foram incubadas a 37 ºC, 5% de CO», 95% de umidade em um incubador de cultura de células durante 2 dias.

[0280] No fim do segundo dia, o meio foi aspirado a partir de todas as cavidades e lavou-se a placa deixando 20 ul por poço. Cerca de 50 ul de PBS foi adicionado a cada poço e as placas foram centrifugadas a 500 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado a partir de todas as cavidades com um lavador de placas, deixando 20 ul de meio em cada poço. Adicionou-se Versene (Lonza'Y) (50 ul/poço) e as placas foram centrifugadas a 500 g por 5 minutos, o sobrenadante foi aspirado deixando apenas 20 ul de meio por poço. Cada poço foi suplementado com 20 ul de 8% de formaldeído (solução 16% em água, Life Technologies'!Y) + 2% de Triton X-100 (VWRTY) em PBS. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos e depois 50 ul de tampão de FACS constituído por HBSS (livre de cálcio- magnésio VWRTY) + 2% de FBS + 2 mM de EDTA, (Life Technologies'Y) foram adicionados. As placas foram centrifugadas a 2.000 g durante 1 minuto e o sobrenadante foi aspirado deixando apenas 20 ul de meio em cada poço. Cada poço foi ainda suplementado com 20 ul de tampão de FACS com anticorpo alfa-sinucleína anti-pSer129 (AbcamTY) diluído 1:300. As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente e, em seguida, cada poço foi suplementado com 50 ul de tampão de FACS antes da centrifugação de novo a 2.000 g durante 1 minuto. O sobrenadante foi removido antes de cada poço ser suplementado com anticorpo secundário — anticoelho conjugado com Alexafluor647 diluído 1:500 (Life Technologies"Y) e DAP! (Life Technologies"!"Y). As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente no escuro, e, em seguida, 50 ul de tampão de FACS foram adicionados e as placas foram centrifugadas a 2.000 g durante 1 minuto. Após a lavagem, mais tampão FACS foi adicionado e as placas estavam prontas para serem colocadas no citômetro de fluxo (BD FACS Canto ||) para a leitura.

[0281] Os dados do FACS foram analisados usando o software FlowJo. Primeiramente, as células únicas vivas foram fechadas utilizando dispersão frontal e lateral. Em segundo, eventos de DAPI+ foram fechados e seu número foi usado como uma medida do número de células individuais nucleadas vivas. Finalmente, as células positivas para fosfo-serina 129-alfa-sinucleíina (pSer129+) foram fechadas. A porcentagem de células pSer129+ em relação a todas as células DAPI+ foi usada como uma medida de agregação. Os dados foram normalizados em relação aos poços tratados apenas com fibrilas e sem anticorpo, e expressos como uma porcentagem. Os resultados são resumidos na Figura 10 que mostra a capacidade dos anticorpos testados de inibirem a agregação induzida por fibrilas de alfa-sinucleína em célula que expressa alfa-sinucleína. Esses dados confirmam que os anticorpos, de acordo com a presente invenção, foram capazes de bloquear a agregação induzida por fibrilas de alfa-sinucleína, com IC5o a cerca de ou inferior a 5 nM. EXEMPLO 8: ENSAIO DE AGREGAÇÃO DE NEURÔNIOS PRIMÁRIOS

[0282] Os hipocampos de embriões de camundongo E17 foram dissecados em tampão de dissecação (HBSS sem cálcio e sem magnésio, 0,6% de D-(+)-Glicose, 20 mM de Hepes). O tampão de dissecção foi então removido e substituído por uma solução de dissociação (HBSS sem cálcio e sem magnésio, 0,6% de D-(+)-Glicose, mM de HEPES, 40 U/m de papaína, 1 mg/ml de DNase, 1 mM de L-cisteína, 0,5 mM de EDTA). Após 30 minutos de incubação a 37 ºC, o tampão de dissociação foi removido e os hipocampos foram lavados 3x com meio de revestimento (Meio Neurobasal'Y, suplemento B27 a 2%, GlutaMAX 1mM, FBS a 2,5%, FBS a 2,5%, 50 unidades/ml de penicilina-estreptomicina). Os aglomerados de tecido foram triturados com uma pipeta de 1 ml para obter uma suspensão de célula única. As células foram diluídas para a concentração apropriada no meio de revestimento. Cerca de 15.000 células foram plaqueadas em cada poço de uma placa de 384 poços revestida com PDL. As células foram em seguida mantidas em uma incubadora de cultura de células, a 37 ºC, 5% de CO>, 95% de umidade.

[0283] No dia seguinte, 80% do meio foi substituído por meio de revestimento sem

FBS [Meio Neurobasal'Y, suplemento B27 a 2%, GlutaMAX 1 mM, 50 unidades/ml de Penicilina-Estreptomicina). Sete dias após o plaqueamento, o meio foi removido deixando 20 ul em cada poço. A cada poço, 100 nM de fibrilas de alfa-sinucleina humana (preparadas como aqui descritas no Exemplo 1) foram adicionados seguidos pelos anticorpos 5811gL5gH4 I9G4P, 5811 gL8gH4 IgG4P e 5811 gL14gH4 I9gG4P (sequências na Tabela 1) em PBS para ser testado (em várias concentrações). A placa foi incubada a 37 ºC, 5% de CO>, 95% de umidade em um incubador de cultura de células durante um período adicional de 7 dias. Quatorze dias após o revestimento, o meio foi aspirado de todos os poços, deixando 20 ul por poço. Cada poço foi lavado com 80 ul de solução salina de tampão com fosfato de DulBecco (DPBS). A DPBS foi removida e as células foram incubadas em 40 ul de tampão de fixação (DPBS com paraformaldeído a 4%) por poço por 15 minutos. O tampão de fixação foi então removido e as células foram lavadas novamente com 80 ul de DPBS. A DPBS foi removida e substituída por 40 ul de tampão de permeabilização (DPBS com 0,1% de Triton X-100) por poço. Após 10 minutos, o tampão de permeabilização foi removido e as células foram incubadas por 1 hora em 40 ul de tampão de bloqueio (PBS com 1% de BSA e 0,1% de Triton X-100) por poço. O tampão de bloqueio foi então removido e substituído por 40 ul/poço da solução de anticorpo primário (tampão de bloqueio com 0,3% de anticorpo alfa-sinucleína antifosfoserina 129 de coelho (AbCamTY ab51253). A solução de anticorpo foi incubada nas células por 1 h, seguido por três lavagens (90 ul/cada, PBS). Após a última lavagem, o PBS foi removido e substituído por 40 ul de solução de anticorpo secundário (anticorpo anticoelho conjugado com AlexaFluor647 a 0,1% em PBS com anticorpo anti-beta-lll-tubulina conjugado com AlexaFluor488 a 0,2%). A solução de anticorpo secundário foi incubada nas células por 1 h, em seguida, removida e substituída por 40 ul de PBS contendo 0,3% de CellMask Blue'Y. Após 5 min de incubação, os poços foram lavados 3 vezes com 80 ul de PBS, em seguida, encheu-se com 50 ul de PBS cada poço antes de a placa ser velada com uma película de plástico transparente.

[0284] As placas foram imageadas em um gerador de imagens Arrayscan (ThermoFisher ScientificTY). As imagens foram analisadas usando o software HCS

Scan"Y do mesmo fabricante. A densidade neuronal foi monitorada usando o sinal beta-lll-tubulina. Campos esparsos ou campos mostrando uma camada celular neuronal danificada, refletida por uma diminuição significativa na superfície do sinal beta-lll-tubulina, foram excluídos. Finalmente, a superfície do sinal pSer129 alfa- sinucleína por campo foi usada para quantificar a agregação patológica de alfa- sinucleína.

[0285] Acredita-se que a fosforilação em S129 da alfa-sinucleína desempenhe um papel importante no controle das funções normais da alfa-sinucleína, bem como na regulação de sua agregação, formação de LBs e neurotoxicidade. Sob condições normais, apenas uma pequena fracção de alfa-sinucleína é constitutivamente fosforilada em S129 no cérebro (Fujiwara H, et al. (2002) Cell Biol Nat, 4, 160 a 164), enquanto que foi observada uma acumulação drástica de pS129 no cérebro de pacientes que sofrem de sinucleinopatias (Kahle PJ, et al. (2000) Ann NY Acad Sci, 920, 33 a 41); Okochi M, et al. (2000) J. Biol Chem, 275, 390 a 397); Anderson JP et al. (2006) J. Biol Chem, 281, 29.739 a 29.752).

[0286] Os dados foram normalizados em relação aos poços tratados com apenas fibrilas e nenhum anticorpo, e expressos como uma percentagem. Como mostrado na Figura 11, todos os três anticorpos inibiram a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína em neurônios primários de camundongo que expressam níveis endógenos de alfa-sinucleína. Esses dados confirmam que os anticorpos 5811gL5gH4 IgG4P, 5811 gL8gH4 IgG4P e 5811 gL14gH4 IgG4P foram capazes de bloquear a agregação induzida por fibrilas de alfa-sinucleína em neurônios primários de camundongo, com ICso inferior a 5 nM. EXEMPLO 9: AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DO VR5811 IN VIVO

[0287] O anticorpo 581 1gL5qgH4 IGgG4P (que compreende SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 26 e doravante no presente pedido simplesmente chamado de VR5811)) foi testado em um modelo transgênico de camundongo Knockout de a-sinucleína que expressa alfa-sinucleína humana (a seguir denominada SNCA-OVX; Charles River, França).

[0288] Os camundongos SNCA-OVX foram injetados com VR5811 e fibrilas pré-

formadas murinas (PFF) (preparadas como descrito aqui no Exemplo 1). Um anticorpo de controle negativo e o veículo também foram injetados juntamente com um anticorpo comparador anti-alfa-sinucleína (comparador Ab C-term) que liga a alfa-sinucleína nos últimos nove resíduos C-terminais. Esse anticorpo comparador (que possui CDRs diferentes dos anticorpos de acordo com a presente invenção) mostrou características de ligação comparáveis aos anticorpos da presente invenção. O anticorpo Ab C- terminal comparador possui uma afinidade semelhante para a alfa-sinucleína, assim como os anticorpos da presente invenção e propriedades biofísicas semelhantes. Foi também eficaz ao impedir a agregação de alfa-sinucleína em ensaios baseados em células (Tabela 10). TABELA 10 A Ea em Ab C-terminal

[0289] Os anticorpos foram pré-incubados com os PFFs durante 30 minutos, em um agitador, à temperatura ambiente, antes da administração direta no cérebro dos animais. As misturas de anticorpos/PFFs foram preparadas em PBS em uma razão de 1 ug de PFFS/ 10 ug de anticorpos. Foi utilizado PBS a pH 7,4 como solução do veículo. O anticorpo foi injetado 24 horas antes da administração intracerebral combinada.

[0290] Os anticorpos foram então administrados intraperitonealmente a camundongos na dose de 30 mg/kg. A segunda injeção intraperitoneal foi administrada 7 dias após a primeira e, em seguida, foi realizada com o mesmo regime (uma injeção intraperitoneal//semana na dose de 30 mg/kg para um volume de administração de 10 ml/kg) por 11 semanas para um total de 12 injeções para camundongos SNCA-OVX. Os camundongos foram aleatoriamente designados para os grupos de tratamento medicamentoso e os pesquisadores foram cegos para o tratamento.

[0291] As experiências com animais foram realizadas de acordo com as diretrizes da Diretiva Europeia 2010/63/UE e da legislação belga. O comitê de ética para experimentação animal da UCB Biopharma SPRL (LA1220040 e LA2220363) aprovou o protocolo experimental (ASYN-IC-PARKINSON-MO). Os camundongos pesavam entre 25 e 30 g e tinham 17 semanas de idade no momento da cirurgia. Os camundongos foram alojados em gaiolas (4 camundongos por gaiola, Macrolon tipo 2). Eles foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12:12, com luz acesa às 06: 00h. A temperatura foi mantida a 20 a 21 ºC e a umidade era de cerca de 40%. Todos os animais tiveram acesso livre a comida e gotas de água padrão antes da atribuição aos grupos experimentais. Enriquecimento e bem-estar adicionais foram fornecidos (Enviro-dri, Pharma Serv) antes e após a cirurgia. A saúde animal foi monitorada diariamente pela equipe de assistência animal. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. O sacrifício foi realizado sob anestesia.

[0292] A cirurgia foi realizada sob anestesia geral utilizando uma mistura de 50 mg/kg de cetamina (Nimatek, Eurovet Animal Health BV) e 0,5 mg/kg de medetomidina (Domitor, Orion Corporation) injetada por via intraperitoneal. Além disso, 2,5 mg/kg de atipamezol (Antisedan, Orion Corporation) foram administrados para apoiar o despertar. Os PFFs purificados recombinantes foram descongelados e sonicados à temperatura ambiente (Qsonica 500 - 20 kHz; 65% de potência, por 30 pulsos de 1s LIGADO, 1 s DESLIGADO por um minuto). Os PFFs foram, em seguida, pré- misturados com os anticorpos durante 30 minutos e agitados à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da injeção no cérebro. A solução (2 ul) foi infundida a uma taxa de 0,2 ul/min e a agulha foi deixada no local por mais 2,5 minutos antes de sua retração lenta. As injeções foram realizadas unilateralmente no estriado direito nas seguintes coordenadas: PA = +0,20 mm, ML = -2,00 mm, DV = -3,20 mm.

[0293] Após anestesia, os camundongos foram perfundidos por perfusão transcardíaca com PBS a 0,9% gelado contendo 10 U/ml de heparina por 9 minutos a uma taxa de fluxo de 6 ml/min através do ventrículo esquerdo. O átrio direito foi cortado como uma via de saída. Posteriormente, os animais foram perfundidos com paraformaldeído a 4% gelado em PBS por 15 minutos a uma taxa de fluxo de 6 ml/min. Os cérebros foram pós-fixados durante a noite em PBS contendo paraformaldeído a 4% a 4 ºC (dia 0). Na manhã seguinte (dia +1), o paraformaldeído a 4% foi descartado e os cérebros foram lavados em PBS frio e incubados durante a noite. No dia seguinte (dia +2), os cérebros foram lavados em PBS por um período mínimo de 1 hora e transferidos para PBS contendo 15% de sacarose e armazenados a 4 “C até a remessa.

[0294] O corte cerebral foi realizado na Neuroscience Associates (TN, EUA). Primeiro, os cérebros foram tratados durante a noite com 20% de glicerol e 2% de dimetilsulfóxido para evitar artefatos de congelamento e incorporados em uma matriz de gelatina usando a Tecnologia MultiBrain&. Após a cura, os blocos foram congelados rapidamente por imersão em isopentano resfriado a -70 ºC com gelo seco picado e montados no estágio de congelamento de um micrótomo deslizante AO860. Os blocos MultiBrain& foram seccionados no plano coronal a 40 um. Todas as seções foram coletadas sequencialmente em 24 recipientes por bloco que foram preenchidos com solução Antigen Preserve (49% de PBS pH 7,0, 50% de etileno glicol, 1% de polivinilpirrolidona). As seções não coradas imediatamente foram armazenadas a -20 ºC.

[0295] As seções flutuantes foram coradas por imunoquímica com anticorpo alfa- sinucleína pSer129 (anti-alfa-sinucleína de camundongo (pSer129) Biotina - (Wako - 010-26481)), diluída a 1:30.000. Todas as soluções de incubação a partir do soro bloqueador utilizaram solução salina tamponada Tris (TBS) com Triton X-100 como veículo; todas as lavagens foram realizadas com TBS. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada por tratamento com peróxido de hidrogênio a 0,9% e a ligação não específica foi bloqueada com soro normal total de 1,26%. Após as lavagens, as seções foram coradas com um anticorpo primário durante a noite à temperatura ambiente. A solução do veículo continha 0,3% de Triton X-100 para permeabilização. Após as lavagens, as seções foram incubadas com um complexo avidina-biotina-HRP (Kit Vectastain Elite ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante uma hora à temperatura ambiente. Após as lavagens, as seções foram tratadas com tetra-

hidrocloreto de diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio a 0,0015% para criar um produto de reação visível, montado em lâminas de vidro gelatinizado (seco), secas ao ar, levemente coradas com tionina, desidratadas em álcoois, limpas em xileno e tampa - escorregou com Permount.

[0296] A quantificação do sinal de alfa-sinucleína pSer129 por sinal de alfa- sinucleína pSer129 de campo foi usada para quantificar a agregação patológica de alfa-sinucleína no lado ipsilateral do neoestriado, córtex, amígdala basolateral e substância nigra. As regiões de interesse (ROI) foram delineadas manualmente e foi realizada a quantificação automática de sinal de alfa-sinucleína pSer129 nas diferentes regiões do cérebro com software VisioPharm 6 (VisioPharm). Para quantificar o sinal de alfa-sinucleína pSer129, o algoritmo bayesiano linear, que fornece um valor de área de sinal (área de marcador em um2), foi utilizado. A área de marcador reflete a quantidade de patologia de alfa-sinucleína pSer129 que cobre as diferentes regiões do cérebro. Todas as quantificações foram realizadas em um modo cego até o fim da análise estatística.

[0297] As análises dos dados foram feitas na % da área do marcador (isto é, a razão entre a área do sinal pSer129 em um? e a região da região de interesse em um?). A % da área do marcador foi avaliada repetidamente para várias seções do cérebro posicionadas rostro-caudalmente (neoestriado: 13 a 14 seções de Bregma +1,1 a -0,94; córtex: 13 a 14 seções de +1,1 a -0,94; amígdala basolateral: 6 a 10 seções entre -0,58 a -2,06; substância nigra: 6 a 8 seções de -2,54 a -3,88), e uma AUC foi calculada separadamente para cada indivíduo testado.

[0298] — ANOVA unidirecional foi considerada para análise estatística. A ANOVA foi seguida por múltiplas comparações pareadas entre médias sem nenhum ajuste de multiplicidade. (com **, para p <0,01 e *, para p <0,05). Os dados foram transformados em log para atender aos critérios de normalidade e homoscedasticidade. Os gráficos representam as médias geométricas dos dados não transformados.

[0299] Como mostrado na Figura 12, o anticorpo VR5811 diminuiu acentuadamente a patologia da alfa-sinucleína (ou seja, sinal de alfa-sinucleina pSer129) em diferentes regiões do cérebro, incluindo o neoestriado, córtex cerebral,

amígdala e substância nigra trêê meses após a administração de PFFs em camundongos SNCA-OVX.

[0300] O anticorpo de controle negativo e o anticorpo C-terminal comparador não mostraram nenhum efeito na diminuição da patologia da alfa-sinucleína (sinal de alfa- sinucleína pSer129) em comparação com camundongos tratados com veículo injetados com os mesmos PFFs humanos.

[0301] A Figura 13 mostra a quantificação de alfa-sinucleína fosforilada em Ser129 em cada uma das regiões do cérebro analisadas em camundongos SNCA-OVX. Os resultados confirmam que VR5811 significativamente (p <0,05) reduz a patologia de alfa-sinucleína em diferentes regiões do cérebro incluindo o lado ipsilateral do neoestriado, córtex cerebral e a substância nigra em comparação com os três grupos de controle (isto é, veículo, 101,4 e o Ab C-term comp.).

[0302] Como resultado, quando testado em camundongos SNCA-OVX, o grupo tratado com 5811 apresentou uma significativa redução do nível de a-sinucleína pSer129 em três diferentes estruturas e entre essas, duas eram regiões distais a partir do local de injeção (córtex cerebral e substância nigra).

[0303] Isso confirma que os anticorpos que compreendem os recursos estruturais da presente invenção são capazes de prevenir in vivo a aparência de alfa-sinucleina fosforilada em Ser129. Além disso, os resultados demonstram que nem todos os anticorpos que se ligam à a-syn na região C-terminal são eficazes in vivo: o anticorpo comparador, que se liga à região C-terminal de uma a-syn com alta afinidade e é eficaz na prevenção da agregação de a-syn em ensaios baseados em células, falhou ao impedir a fosforilação de Ser129 in vivo.

[0304] Portanto, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, pode ser usado para o tratamento de alfa- sinucleinopatias caracterizadas por um aumento da fosforilação de Ser129, incluindo a doença de Parkinson (PD) (incluindo as formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB ), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), doenças de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA)

e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1). EXEMPLO 10: FARMACOCINÉTICA DO ANTICORPO 5811 EM CAMUNDONGOS

[0305] Camundongos machos C57/BI6 (n = 3 por medicamento) foram injetados por via intravenosa como uma dose única de 2mg/kg com anticorpo 5811gL14gH4 IgG4P (5811).

[0306] As amostras de sangue foram tomadas (0,083, 1, 4, 8, 24, 72, 120, 168 e 336 horas de injeções) a partir da veia da cauda e deixou-se coagular à temperatura ambiente. O soro foi isolado após centrifugação, que foi congelado até a análise. A quantificação do anticorpo 5811 foi realizada por LC-MS/MS. As amostras de soro do estudo foram descongeladas e quantificadas contra uma linha de calibração preparada usando o anticorpo 5811 adicionado em diferentes concentrações no soro de camundongo de controle. Antes de injetar as amostras no sistema LC-MS/MS, o soro foi desnaturado, reduzido e alquilado usando acetonitrila (VWR, Reino Unido), cloridrato de TCEP-Tris (2-carboxietil)fosfina (Sigma, Reino Unido) e iodoacetamida (Sigma, Reino Unido), respectivamente. As amostras alquiladas foram então reconstituídas em tampão de bicarbonato de amônio 100 mM (Sigma, Reino Unido) e digeridas durante a noite usando a enzima tripsina (Promega, Reino Unido) a 37 ºC. A digestão foi parada adicionando ácido fórmico às amostras para diminuir o pH e depois dessalinizada usando a placa Waters HLB SPE. O eluente resultante foi evaporado usando evaporador a vácuo. Depois que as amostras foram completamente secas, foram reconstituídas com 95/5: Água/Acetonitrila contendo ácido fórmico a 0,1% e injetadas no sistema LC-MS/MS. A análise LC-MS/MS foi realizada pelo sistema HPLC de destaque Schimadzu acoplado ao espectrômetro de massa triplo quádruplo AB Sciex QTrap 6500. A amostra digerida foi injetada pelo amostrador automático em uma coluna de cromatografia líquida de alta eficiência e fase reversa (coluna de peptídeo Phenomenex Aeris C18 100X2,1 mm, 2,6 um) que foi mantida a 50 ºC. Um gradiente linear de 5 a 70% de acetonitrila em ácido fórmico a 0,1% foi aplicado por 6 minutos e depois aumentado para 95% de acetonitrila em 0,1% de ácido fórmico durante 0,8 minuto a uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min. O espectrômetro de massa foi configurado para executar análise de monitoramento de reação múltipla para detectar transições múltiplas de peptídeos de 5811 a um tempo de permanência de 50 milissegundos por transição. A análise dos dados foi realizada no software Analyst 1.6.

[0307] Esses dados demonstram que o anticorpo 5811 possui propriedades farmacocinéticas muito boas (Tabela 11 e Figura 14) no camundongo, com base nos baixos valores de depuração medidos. Esses parecem ser superiores à faixa típica cotada para fármacos de IgG humanos doseados a camundongos (3 a 16 ml/dia/kg; Deng et al 2011 mAbs 3:1 61 a 66).

TABELA 11

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo é caracterizado pelo fato de que compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 selecionada a partir da SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 de acordo com a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 de acordo com a SEQID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 de acordo com a SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 selecionada a partir da SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 selecionada a partir da SEQ ID NO: 6.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido glicina (Gly; G) na posição 6 com referência à SEQ ID NO: 3 é substituído por alanina (Ala; A).

3. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a dois ou mais resíduos de aminoácidos de alfa-sinucleína entre as posições 113 e 129 com referência à SEQ ID NO: 8, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a pelo menos os resíduos de aminoácidos D119, N122 e Y125 com referência à SEQ ID NO: 8.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno impede a agregação de alfa-sinucleina induzida por fibrilas de alfa-sinucleína.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é capaz de se ligar à alfa- sinucleína como um monômero e em fibrilas.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que tem uma maior afinidade de ligação à alfa-sinucleina em fibrilas em comparação com a alfa- sinucleíina como monômero, definido por uma constante de dissociação (KD) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para alfa-sinucleina em fibrilas.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que tem uma (Ko) para alfa-sinucleína em fibrilas de 60 pM ou menos.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

9, Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de comprimento total é selecionado a partir de uma IgG1, IgG4 ou IgG4P.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado a partir de um Fab, um Fab', um F(ab')?, um scFv, um dAb ou um VHH.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou b. uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25; ou c. uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: a. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 14 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26; ou b. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 18 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26; ou c. uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 26.

14. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica: a. uma região variável de cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 15, 19 ou 23; ou ii. compreende a SEQ ID NO: 15 ou 19 ou 23; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 15, 19 ou 23; ou b. uma região variável de cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 27; ou ii. compreende a SEQ ID NO: 27; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 27; ou Cc. uma cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 16, 20 ou 24; ou ii. compreende SEQ ID NO: 16, 20 ou 24; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 16, 20 ou 24; d. uma cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 28; ou ii. compreende SEQ ID NO: 28; ou iii. consiste essencialmente na SEQ ID NO: 28.

16. Vetor de clonagem ou expressão caracterizado pelo fato de compreende um ou mais polinucleotídeos como definido em qualquer uma das reivindicações 14 ou 15.

17. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende: a. um ou mais polinucleotídeos como definidos em qualquer uma das reivindicações 14 ou 15 ou b. um ou mais vetores de expressão como definidos na reivindicação 16.

18. Processo para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira como definido na reivindicação 17, em condições adequadas para a produção do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e o isolamento do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

19. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, excipientes de diluentes, em que a composição farmacêutica opcionalmente compreende um ou mais ingredientes ativos adicionais.

20. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.

21. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma ou mais sinucleinopatias.

22. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é selecionada a partir da doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e herdadas da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doenças de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1).

23. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é a doença de Parkinson.

24. Método de tratamento de uma sinucleinopatia em um paciente caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 19.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é selecionada a partir da doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e herdadas da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doenças de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), preferencialmente doença de Parkinson.

26. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é para uso no diagnóstico de sinucleinopatia, de preferência no diagnóstico da doença de Parkinson.