CN101289665A - 一种建立抗帕金森病动物模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学中神经病学、老年医学及转基因技术领域。具体提供一种建立抗帕金森病动物模型的方法及该抗帕金森病动物模型，在该动物的基因组中转入了外源性Parkin－Flag表达盒，所述表达盒含有(a)大鼠烯醇化酶的启动子，(b)－globin基因的一部分和Parkin－Flag或Parkin－Flag，(c)人生长激素小基因或SV40多腺苷酸加尾信号。本发明还提供了获得的抗帕金森病动物模型在用于筛选治疗帕金森病的基因靶点中的用途。

Description

一种建立抗帕金森病动物模型的方法

技术领域

本发明涉及生物医学中神经病学、老年医学及转基因技术领域。更具体地，涉及一种抗帕金森病小鼠模型，建立该抗帕金森病小鼠模型的方法，以及该抗帕金森病小鼠模型的用途。

背景技术

帕金森病是一种慢性的中枢神经系统退行性疾病，其发病率随年龄的增加而升高，随着我国人口老龄化进程的发展，帕金森病病人的人数逐年增多。目前，帕金森病的确切致病原因尚不清楚，普遍的观点认为其病因有环境因素，也有遗传因素，或是由两者共同引发(Vila M and Przedborski S.Nature Medicine 2004，10Suppl：S58-62)。已知的帕金森病相关基因有：α-synuclein、parkin、synphilin-1、UCH-L1、presenilin、DJ-1、PINK1、LRRK2、NR4A2等。帕金森病表现为多巴胺能神经元的进行性丢失，该疾病有一个显著的病理标志，即神经元细胞内的Lewy小体，小体有多种蛋白组成，α-synuclein，parkin，synphilin-1，UCH-L1是其主要成分。在正常神经细胞内，错误折叠，功能异常的蛋白通常被泛素化，再经蛋白降解系统被清除掉。而在患帕金森病病人的神经细胞内，错误折叠，功能异常的蛋白不能被蛋白降解系统清除，而是形成沉积物，最终导致神经细胞的凋亡。

Parkin是一种E3泛素蛋白连接酶，也是泛素蛋白降解系统中重要的一环。它可以将E2泛素结合酶上的泛素转移到其底物蛋白上，从而导致底物蛋白的降解。目前已经发现的Parkin的底物有：α-Synuclein、CDCrel-1/CDCrel-2(cell divisioncontrol-related protein 1/2，属于GTPase家族，与递质释放相关)、Synphilin-1(功能不详)、Pael-R(Parkin-associated endothelin receptor-like receptor，一种推测的G-蛋白偶联受体)、Tubulin、Synaptotagmin XI(一种钙离子结合蛋白)、P38(氨酰-tRNA合成酶复合体的一种组分)和cyclin E(A.Wood-Kaczmar，S.Gandhi andN.W.Wood.TRENDS in Molecular Medicine 2006，12(11)：521-528)。Parkin可以调节细胞生长、细胞凋亡，并在突触传递中发挥作用。新近发现Parkin能够抑制单胺氧化酶的表达；促进线粒体的生物再生，而这些功能同Parkin的E3连接酶作用无关。

小鼠Parkin蛋白由465个氨基酸残基构成，包括C端的两个Ring结构域(负责与E2酶作用)。它是一种广泛表达的蛋白，如在脑、肾脏、睾丸中都有表达，但其在脑内的表达最强，黑质、纹状体、皮层和海马为高表达区域。

对帕金森病人人群的基因分析表明，Parkin蛋白的突变与帕金森病有直接的相关性。一向来至欧洲的调查显示，早发性PD(45岁前)病人中，50％家族性的和18％散发性的PD与Parkin的突变相关。已有研究发现Parkin蛋白可以保护多巴胺能神经细胞免受镁离子对它们的损伤，还可以减少多巴胺诱导的神经细胞的凋亡(Houbo Jiang，YongRen，Jinghui Zhao and Jian Feng.Human Molecular Genetics，2004，13(16)：1745-1754)。

发明内容

本发明的目的就是提供一种抗帕金森病的小鼠模型以及建立该抗帕金森病小鼠模型的方法。

本发明的进一步目的是提供该抗帕金森病模型的用途。

本发明在现有技术科学实验的基础上，提供一种抗帕金森病的小鼠模型。所述的在神经元细胞内过表达Parkin的转基因小鼠对诱发帕金森病的神经毒素具有一定的抵抗作用。该类模型还能成为筛选治疗帕金森病的基因靶点的工具。

在本发明的第一方面，提供了一种产生抗帕金森病小鼠模型的方法，包括步骤：

(i)提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)大鼠烯醇化化酶的启动子，(b)-globin基因的一部分和Parkin-Flag或Parkin-Flag，(c)人生长激素小基因或SV40多腺苷酸加尾信号；

(ii)用显微技术将步骤(i)中的线性化的构建物基因引入C57/BL6x CBA子一代小鼠或C57/BL6小鼠受精卵；

(iii)将步骤(ii)的受精卵移植到假孕的远交系ICR小鼠的输卵管；

(iv)产生转基因的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中整合有Parkin-Flag表达盒，所述表达盒含有(a)大鼠烯醇化化酶的启动子，(b)-globin基因的一部分和Parkin-Flag或Parkin-Flag，(c)人生长激素小基因或SV40多腺苷酸加尾信号。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：(v)对步骤(iv)获得的转基因小鼠进行鉴定。

在另一优选例中，所述的鉴定是通过PCR。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：

(vi)将获得的转基因小鼠与正常的C57/BL6小鼠杂交，以获得子代。

在本发明的第二方面，通过了用上述方法获得了抗帕金森病的小鼠模型。

在本发明的第三方面，提供了一种用本发明上述方法获得的抗帕金森病小鼠模型的用途，它被用于泛素-蛋白降解系统参与帕金森病的病理进程机制的研究和筛选治疗帕金森病的基因靶点。

本发明将Parkin cDNA融合Flag小标志物(以利于蛋白的鉴定及区别于内源性Parkin蛋白)克隆在神经元特异性的转基因载体中，经显微技术获得了转基因小鼠，从而建立了一种抗帕金森病的小鼠模型；在此基础上完成了本发明。

在本发明中Parkin cDNA来自小鼠，编码445个氨基酸残基，包括N末端的泛素样结构域(Ubiquitin-like domain，UBL)和C末端的Ring-IBR-Ring结构域，在蛋白的羧基末端融合了Flag小标志物；

在本发明中采用了神经元特异性的烯醇化酶的启动子，启动子来源大鼠。

在本发明的产生转基因动物的方法中，首先构建一转基因构建物，该构建物从5′至3′依次含有(a)大鼠烯醇化酶的启动子，(b)-globin基因的一部分和Parkin-Flag或Parkin-Flag，(c)人生长激素小基因或SV40多腺苷酸加尾信号；

在获得了构建物之后，可用常规方法将线性化的构建物转入受精卵中，待小鼠出生后用PCR检测鉴定Parkin-Flag是否整合入其基因组，从而获得转基因小鼠。

本发明抗帕金森病小鼠模型的主要用途包括：用于泛素-蛋白降解系统参与帕金森病的病理进程机制的研究和筛选治疗帕金森病的基因靶点。

本发明的主要优点在于：Parkin可泛素化α-synuclein、synphilin-1等许多蛋白，再通过蛋白降解系统，使得这些底物被降解，特异地在小鼠神经元中过表达Parkin，能成为有效抗帕金森病的动物模型。

附图说明

图1显示MSCV-Parkin-Flag转染HEK293T细胞株后，在荧光显微镜下的检测结果和通过Western Blot检测到了约52KD-54KD的Parkin-Flag蛋白。

图2A是神经元特异性过表达Parkin-Flag的转基因构建物prNSE-globin-Parkin-Flag-hGH。

图2B是神经元特异性过表达Parkin-Flag的转基因构建物prNES-Parkin-Flag-SV40。

图3A是转基因质粒prNSE-globin-Parkin-Flag-hGH用限制性内切酶Not I和BssHII酶切后，回收6.8kb的片段，含rNES-globin-Parkin-Flag-hGH。

图3B是转基因质粒prNES-Parkin-Flag-SV40用限制性内切酶Sal I线性化(6.3kb)后，胶回收纯化图。

图3C显示了对rNSE-globin-Parkin-Flag-hGH转基因阳性小鼠鉴定，

其中，转基因阳性出现约580bp(Globin1和Park6)和约600bp(Primer 2和Primer4)条带，野生型或阴性小鼠无特异带扩增，以质粒DNA为阳性对照。

图3D显示了对rNES-Parkin-Flag-SV40转基因阳性小鼠鉴定，

其中，转基因阳性出现约550bp(NSE1和Park6)和约600bp(Primer 2和Primer4)条带，野生型或阴性小鼠无特异带扩增，质粒DNA为阳性对照。

图4A显示了子代小鼠RT-PCR鉴定的结果。

图4B显示了子代小鼠Western Blot检测的结果。

具体实施方式

实施例1：克隆小鼠的Parkin cDNA

抽提8周龄C57/BL6小鼠脑的总RNA，5g RNA在20 l体系中逆转录，取1 l为模板，在20 l体系中，利用引物Primer1：5’ACCTGAATTCAGATCTCCCGG TGACCATGATAGTGTTTGTC 3’(SEQ ID NO：3)和Primer3：5’CTTCTCCAAGGATCCTGAAGTGATG3’(SEQ ID NO：4)经PCR扩增Parkin cDNA 5’端。利用引物Primer2：5’CATCACTTCAGGATCCTTGGAGAAG 3’(SEQ ID NO：5)和Primer 4：5’GAACTCTAGAGAATTCTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCACGTCAAACCAGTGATCTC 3’(SEQ ID NO：6)经PCR扩增Parkin cDNA3’端。Primer 4中含有Flag标记序列(引物中下划线部分)，以利于蛋白的鉴定及区别于内源性Parkin蛋白；Primer 1和Primer 4中含有限制性内切酶EcoR I的切点(引物中斜体部分)。引物primer1和primer3的PCR产物经EcoR I和BamH I酶切后胶回收纯化，引物primer2和primer4的PCR产物经BamH I和Xba I酶切后胶回收纯化，两个DNA片断克隆至质粒载体pBluescript II SK中(Stratagene，EcoR I和Xba I酶切后用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)脱磷，胶回收纯化)，重组质粒命名为pBluescript Parkin-Flag，经DNA序列测定其序列完全正确(SEQ ID NO：1)，相应的氨基酸序列见SEQ ID NO：2；

用限制性内切酶EcoR I将Parkin-Flag片段从质粒pBluescript Parkin-Flag中切下，克隆至逆转录病毒载体MSCV-EGFP(来自Harinder Singh博士实验室，芝加哥大学分子遗传与细胞生物学系)的EcoR I位点，鉴定方向，重组质粒命名为MSCV-Parkin-Flag，转染人胚肾细胞株HEK293T(American Tissue CultureCollection)，采用Anti-Parkin抗体(#2132，Cell Signaling，U.S.A.)和Anti-Flag抗体(F3165，Sigma，U.S.A.)，结果显示MSCV-Parkin-Flag转染HEK293T细胞株后，在荧光显微镜下的检测结果和通过Western Blot检测到了约52KD-54KD的Parkin-Flag蛋白(图1)。

实施例2：

载体1：prNES-globin-Parkin-Flag-hGH质粒的构建

建立神经元特异性的转基因构建物prNES-globin-hGH，该构建物从5′至3′依次含有(a)大鼠烯醇化酶的启动子(长度为1.83kb)；(b)-globin基因的一部分(1.0kb)；(c)人生长激素小基因(提供PolyA尾)。

用限制性内切酶EcoR I将Parkin-Flag片段从质粒pBluescript Parkin-Flag中切下，克隆至神经元特异性的转基因构建物prNES-globin-hGH，建立神经元特异性过表达Parkin-Flag的转基因构建物prNSE-globin-Parkin-Flag-hGH(图2A)。

载体2：prNES-Parkin-Flag-SV40质粒的构建

建立神经元特异性的转基因构建物prNES-SV40，该构建物从5′至3′依次含有(a)大鼠烯醇化酶的启动子(长度为1.83kb)；(b)SV40多腺苷酸(提供PolyA尾)。

用限制性内切酶EcoR I将Parkin-Flag片段从质粒pBluescript Parkin-Flag中切下，克隆至神经元特异性的转基因构建物prNES-SV40，建立神经元特异性过表达Parkin-Flag的转基因构建物prNES-Parkin-Flag-SV40(图2B)。

实施例3：

Parkin-Flag经显微技术引入小鼠受精卵以及转基因阳性鼠的产生

转基因质粒prNSE-globin-Parkin-Flag-hGH用限制性内切酶Not I和BssH II酶切后，回收6.8kb的片段(含rNES-globin-Parkin-Flag-hGH，图3A)。转基因质粒prNES-Parkin-Flag-SV40用限制性内切酶Sal I线性化(6.3kb)后，胶回收纯化(图3B)。将回收的DNA(约500拷贝)注射至小鼠受精卵的雄原核中，注射后的受精卵移植给假孕小鼠。约20天后，小鼠出生。

小鼠出生3周后，剪尾提取DNA，用两套PCR反应检测，引物如表1所示，分析是否有转基因整合。鉴定rNSE-globin-Parkin-Flag-hGH转基因的两套引物名称：Globinl(SEQ ID NO：7)和Park6(SEQ ID NO：10)、Primer 2(SEQ ID NO：5)和Primer4(SEQ ID NO：6)，鉴定prNES-Parkin-Flag-SV40转基因的两套引物名称：NSE1(SEQID NO：9)和Park6(SEQ ID NO：10)、Primer 2(SEQ ID NO：5)和Primer 4(SEQ IDNO：6)。

对rNSE-globin-Parkin-Flag-hGH转基因阳性小鼠鉴定结果显示，转基因阳性出现约580bp(Globinl和Park6)和约600bp(Primer 2和Primer 4)条带，野生型或阴性小鼠无特异带扩增。以质粒DNA为阳性对照。(图3C)。

对rNES-Parkin-Flag-SV40转基因阳性小鼠鉴定结果显示，转基因阳性出现约550bp(NSE1和Park6)和约600bp(Primer 2和Primer 4)条带，野生型或阴性小鼠无特异带扩增。以质粒DNA为阳性对照。(图3D)。

本发明获得rNSE-globin-Parkin-Flag-hGH转基因阳性Founder小鼠13只，这些小鼠经交配繁育建系，共建了3个转基因小鼠系。获得rNES-Parkin-Flag-SV40转基因阳性Founder小鼠6只，这些小鼠经交配繁育建系，共建了4个转基因小鼠系。

表1是本发明基因序列表。

表1

编号	序列(5’-3’或氨基端-羧基端)	SEQ ID NO
			1	Parkin-Flag	1
2	Parkin-Flag	2
			3	Primer 1	3
4	Primer 3	4
			5	Primer 2	5
6	Primer 4	6
			7	Globinl	7
8	Globin3	8
			9	NSE1	9
10	Park6	10
			11	Actin1	11
12	Actin2	12

实施例4：

Parkin-Flag在转基因小鼠脑内的表达

Founder小鼠建系后，对子代阳性小鼠的脑组织进行RT-PCR或Western Blot检测。抽取脑组织总RNA，逆转录后，用PCR反应检测是否有转基因在转录水平上的表达。引物名称：Globin3(SEQ ID NO：8)和Park6(SEQ ID NO：10)；Actin1(SEQID NO：11)和Actin2(SEQID NO：12)。图4A显示了子代小鼠RT-PCR鉴定的结果。利用引物Globin3和Park6，转基因表达阳性的出现约400bp条带，而基因组DNA可以扩增出约900bp条带，引物Actin 1和Actin 2可以扩增出约600bp的条带，actin作为模板量对照。提取RT-PCR阳性小鼠子代脑皮层组织的蛋白，进行Western Blot检测，所用抗体是Anti-Flag抗体(F3165，Sigma，U.S.A.)和Anti-actin抗体(Santa Cruz，sc-47778，U.S.A.)。图4B显示了子代小鼠WesternBlot检测的结果。利用Anti-Flag抗体鉴定，转基因阳性表达的出现大小约52k Da的条带，野生型小鼠未出现特异性条带。β-Actin作为蛋白加样的对照，大小约42kDa。

在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

一种建立抗帕金森病动物模型的方法序列

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

<120>一种建立抗帕金森病动物模型的方法

<130>11

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1464

<212>DNA

<213>小鼠

<400>1

acctgaattc agatctcccg gtgaccatga tagtgtttgt caggttcaac tccagctatg    60

gcttcccagt ggaggtcgat tctgacacca gcatcttgca gctcaaggaa gtggttgcta    120

agcgacaggg ggttccagct gaccagctgc gtgtgatttt tgccgggaag gagcttccga    180

atcacctgac ggttcaaaac tgtgacctgg aacaacagag tattgtacac atagtacaga    240

gaccacggag gagaagtcat gaaacaaatg catctggagg ggacgaaccc cagagcacct    300

cagagggctc catatgggag tccaggagct tgacacgagt ggacctgagc agccataccc    360

tgccggtgga ctctgtgggg ctggcggtca ttctggacac agacagtaag agggattcag    420

aagcagccag aggtccagca gttaaaccca cctacaacag ctttttcatc tactgcaaag    480

gcccctgcca caaggtccag cctggaaagc tccgagttca gtgtggcacc tgcaaacaag    540

caaccctcac cttggcccag ggcccatctt gctgggacga tgtcttaatt ccaaaccgga    600

tgagtggtga gtgccagtct ccagactgcc ctggaaccag agctgaattt ttctttaaat    660

gtggagcaca cccaacctca gacaaggaca cgtcggtagc tttgaacctg atcaccagca    720

acaggcgcag catcccttgc atagcgtgca cagatgtcag gagccctgtc ctggtcttcc    780

agtgtaacca ccgtcacgtg atctgtttgg actgtttcca cttgtattgt gtcacaagac    840

tcaacgatcg gcagtttgtc cacgatgctc aacttggcta ctccctgccg tgtgtagctg    900

gctgtcccaa ctccctgatt aaagagctcc atcacttcag gatccttgga gaagagcagt    960

acactaggta ccagcagtat ggggccgagg aatgcgtgct gcaaatggga ggtgtgctgt    1020

gcccccgtcc tggctgtgga gctggactgc tacctgaaca gggccagagg aaagtcacct    1080

gcgaaggggg caacggcctg ggctgcgggt ttgttttctg ccgggactgt aaggaagcat    1140

accatgaagg ggattgcgac tcactgctcg aaccctcagg agccacttct caggcctaca    1200

gggtggacaa aagagccgct gagcaagctc gctgggagga ggcctccaag gaaaccatca    1260

agaagaccac caagccttgt cctcgctgca acgtgccaat tgaaaaaaac ggaggatgta    1320

tgcacatgaa gtgtcctcag ccccagtgca agctggagtg gtgctggaac tgtggctgtg    1380

agtggaaccg agcctgcatg ggagatcact ggtttgacgt ggactacaag gacgacgatg    1440

acaagtaaga attctctaga gttc                                           1464

<210>2

<211>473

<212>PRT

<213>小鼠

<400>2

Met Ile Val Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser Tyr Gly Phe Pro Val Glu

1               5                   10                  15

Val Asp Ser Asp Thr Ser Ile Leu Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys

            20                  25                  30

Arg Gln Gly Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys

        35                  40                  45

Glu Leu Pro Asn His Leu Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Glu Gln Gln

    50                  55                  60

Ser Ile Val His Ile Val Gln Arg Pro Arg Arg Arg Ser His Glu Thr

65                  70                  75                  80

Asn Ala Ser Gly Gly Asp Glu Pro Gln Ser Thr Ser Glu Gly Ser Ile

                85                  90                  95

Trp Glu Ser Arg Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser His Thr Leu

            100                 105                 110

Pro Val Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu Asp Thr Asp Ser Lys

        115                 120                 125

Arg Asp Ser Glu Ala Ala Arg Gly Pro Ala Val Lys Pro Thr Tyr Asn

    130                 135                 140

Ser Phe Phe Ile Tyr Cys Lys Gly Pro Cys His Lys Val Gln Pro Gly

145                 150                 155                 160

Lys Leu Arg Val Gln Cys Gly Thr Cys Lys Gln Ala Thr Leu Thr Leu

                165                 170                 175

Ala Gln Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met

            180                 185                 190

Ser Gly Glu Cys Gln Ser Pro Asp Cys Pro Gly Thr Arg Ala Glu Phe

        195                 200                 205

Phe Phe Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Asp Thr Ser Val

    210                 215                 220

Ala Leu Asn Leu Ile Thr Ser Asn Arg Arg Ser Ile Pro Cys Ile Ala

225                 230                 235                 240

Cys Thr Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn His Arg

                245                 250                 255

His Val Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu

            260                 265                 270

Asn Asp Arg Gln Phe Val His Asp Ala Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro

        275                 280                 285

Cys Val Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe

    290                 295                 300

Arg Ile Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Thr Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala

305                 310                 315                 320

Glu Glu Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly

                325                 330                 335

Cys Gly Ala Gly Leu Leu Pro Glu Gln Gly Gln Arg Lys Val Thr Cys

            340                 345                 350

Glu Gly Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Val Phe Cys Arg Asp Cys

        355                 360                 365

Lys Glu Ala Tyr His Glu Gly Asp Cys Asp Ser Leu Leu Glu Pro Ser

    370                 375                 380

Gly Ala Thr Ser Gln Ala Tyr Arg Val Asp Lys Arg Ala Ala Glu Gln

385                 390                 395                 400

Ala Arg Trp Glu Glu Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys

                405                 410                 415

Pro Cys Pro Arg Cys Asn Val Pro Ile Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met

            420                 425                 430

His Met Lys Cys Pro Gln Pro Gln Cys Lys Leu Glu Trp Cys Trp Asn

        435                 440                 445

Cys Gly Cys Glu Trp Asn Arg Ala Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp

    450                 455                 460

Val Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

465                 470

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>小鼠

<400>3

acctgaattc agatctcccg gtgaccatga tagtgtttgt c                        41

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>小鼠

<400>4

cttctccaag gatcctgaag tgatg                                          25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>小鼠

<400>5

catcacttca ggatccttgg agaag                                          25

<210>6

<211>63

<212>DNA

<213>小鼠

<400>6

gaactctaga gaattcttac ttgtcatcgt cgtccttgta gtccacgtca aaccagtgat    60

ctc                                                                  63

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>7

gcatataaat tctggctggc gtgg                                           24

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>小鼠

<400>8

cttggatcct gagaacttca gg                                    22

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>小鼠

<400>9

tgcgctcgct cggctctata ggc                                   23

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>10

tggctgctca ggtccactcg tgtc                                  24

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>小鼠

<400>11

atgggtagtc tgtcaggt                                         18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>小鼠

<400>12

atggatgacg atatcgct                                         18

Claims (8)

1、一种建立抗帕金森病动物模型的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)大鼠烯醇化酶的启动子，(b)-globin基因的一部分和Parlin-Flag或Parkin-Flag，(c)人生长激素小基因或SV40多腺苷酸加尾信号；

(ii)将步骤(i)中的线性化的构建物基因引入非人哺乳动物受精卵；

(iii)将步骤(ii)的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管；

(iv)产生转基因的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中整合有Parkin-Flag表达盒，所述表达盒含有(a)大鼠烯醇化酶的启动子，

(b)-globin基因的一部分和Parkin-Flag或Parkin-Flag，(c)

人生长激素小基因或SV40多腺苷酸加尾信号。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

(v)对步骤(iv)获得的转基因动物进行鉴定。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鉴定是通过PCR法。

4、如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

(vi)将获得的转基因动物与正常的非人哺乳动物杂交，以获得子代。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠。

6、如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鉴定是对转基因动物的组织用PT-PCR或Western Blot进行转基因的表达分析。

7、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Parkin是小鼠的Parkin。

8、一种权利要求1所述方法获得的抗帕金森病动物模型在用于筛选治疗帕金森病的基因靶点中的用途。

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