CN111655727A

CN111655727A - 抗α突触核蛋白抗体

Info

Publication number: CN111655727A
Application number: CN201880080860.7A
Authority: CN
Inventors: P·道内; K·L·泰森; M·克里挨克; L·德里希特尔维德; D·J·莱特伍德; D·J·麦克米兰; P·C·艾略特; T·S·贝克
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-09-11
Also published as: KR20200099168A; BR112020010508A2; EP3724228A1; GB201720970D0; IL303672A; TW201927810A; IL303672B1; UY38012A; JP2021507693A; EA202091482A1; PH12020551006A1; JP7326281B2; ECSP20039610A; TWI806940B; AU2018382527A1; TW202346343A; RU2020123300A3; CL2020001607A1; IL275223A; PE20201062A1

Abstract

本发明涉及结合α突触核蛋白的抗体及其片段，其能够结合作为单体和呈原纤维形式的α突触核蛋白和预防由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集。本发明的抗体用于治疗α突触核蛋白病，包括帕金森氏病。

Description

抗α突触核蛋白抗体

发明领域

本发明涉及抗α突触核蛋白抗体和使用所述抗α突触核蛋白抗体治疗突触核蛋白病的方法。具体地，本发明涉及抗人α突触核蛋白抗体及其在治疗帕金森氏病中的用途。

发明背景

α突触核蛋白是根本上呈不同形式存在的140个氨基酸长的可溶性小蛋白质。α突触核蛋白主要发现于突触前神经末梢并且尽管其准确功能尚未可知，但研究人员认为其在多个神经退化性过程中起中心作用。

过去15年，已证实α突触核蛋白在所有形式的帕金森氏病的发病机制中起重要作用。α突触核蛋白基因的基因突变或基因倍增引起家族性早期发作帕金森氏病(PD)。有趣地，在基因座倍增家族中，病原作用明显依赖于基因剂量。基因二倍化引起相对早期发作形式的PD(约47岁)，其具有正常病程，而基因三倍化与极早发作年龄(约33岁)和极快速的病程相关。在帕金森氏病的所有形式中，α突触核蛋白是路易体的主要成分(疾病的关键病理标志)。

路易体病变在病程期间扩大，并且提出α突触核蛋白充当阮病毒样蛋白，其异常折叠以形成有毒寡聚物和聚集体，其可从受影响的神经元扩散至不受影响的神经元(OlanowC.W等人.Movement Disorders,Vol 28,No.1,2013)。当前存在的治疗无法终止疾病扩散并且仅辅助治疗与运动神经元依赖性活动的进行性损失相关的症状。在2014年，Tran H.T.等人(Tran H.T.等人,Cell Reports 7,2054-2065,June 26,2014)证实，向先前纹状体内注射α突触核蛋白预成型原纤维的小鼠腹膜内施用异常折叠的α突触核蛋白的单克隆抗体减少路易体病变、改善黑质多巴胺能神经元损失和改善运动损伤。因此，仍需要可在PD及其他突触核蛋白病中发挥治疗效果的被动免疫治疗。

发明概述

本发明通过提供根据以下实施方案的抗α突触核蛋白抗体解决以上确认的需求。

实施方案1：一种与α突触核蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含：

a.轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:1的CDR-L1；根据SEQ ID NO:2的CDR-L2和根据SEQ ID NO:3的CDR-L3；和

b.重链可变区，其包含根据SEQ ID NO:4的CDR-H1；选自SEQ ID NO:5的CDR-H2和选自SEQ ID NO:6的CDR-H3。

实施方案2：根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中参考SEQ ID NO:3在位置6处的氨基酸残基甘氨酸(Gly；G)被丙氨酸(Ala；A)置换。

实施方案3：根据实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段结合参考SEQ ID NO:8在位置113与129之间的α突触核蛋白的两个或更多个氨基酸残基，其中该抗体或其抗原结合片段至少结合氨基酸残基D119、N122和Y125。

实施方案4：根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段防止由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集。

实施方案5：根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段能够结合作为单体和呈原纤维形式的α突触核蛋白。

实施方案6：根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其对呈原纤维形式的α突触核蛋白的结合亲和力高于对呈单体形式的α突触核蛋白的结合亲和力，其中对单体α突触核蛋白的解离常数(K_D)比对呈原纤维形式的α突触核蛋白高至少10倍。

实施方案7：根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其对呈原纤维形式的α突触核蛋白的(K_D)为60pM或更小。

实施方案8：根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是嵌合、人源化或人抗体。

实施方案9：根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是全长抗体。

实施方案10：根据实施方案9的抗体或其抗原结合片段，其中该全长抗体选自IgG1、IgG4或IgG4P。

实施方案11：根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中该抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv、dAb或V_HH。

实施方案12：根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

a.根据SEQ ID NO:13的轻链可变区和选自SEQ ID NO:25的重链可变区；或

b.根据SEQ ID NO:17的轻链可变区和选自SEQ ID NO:25的重链可变区；或

c.根据SEQ ID NO:21的轻链可变区和选自SEQ ID NO:25的重链可变区。

实施方案13：根据实施方案1至11中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

a.根据SEQ ID NO:14的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链；或

b.根据SEQ ID NO:18的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链；或

c.根据SEQ ID NO:22的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链。

实施方案14：一种经分离的多核苷酸，其编码根据实施方案1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段。

实施方案15：根据实施方案14的经分离的多核苷酸，其中该多核苷酸编码：

a.轻链可变区，其中所述多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:15、19或23至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:15或19或23；或

iii.基本上由SEQ ID NO:15、19或23组成；或

b.重链可变区，其中所述多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:27至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:27；或

iii.基本上由SEQ ID NO:27组成；或

c.轻链，其中所述多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:16、20或24至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:16、20或24；或

iii.基本上由SEQ ID NO:16、20或24组成；

d.重链，其中所述多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:28至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:28；或

iii.基本上由SEQ ID NO:28组成。

实施方案16：一种克隆或表达载体，其包含一种或多种根据实施方案14或15中任一项的多核苷酸。

实施方案17：一种宿主细胞，其包含：

a.一种或多种根据实施方案14或15中任一项的多核苷酸或

b.一种或多种根据实施方案16的表达载体。

实施方案18：一种用于产生根据实施方案1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在产生该抗体或其抗原结合片段的合适条件下培养根据实施方案17的宿主细胞和分离该抗体或其抗原结合片段。

实施方案19：一种药物组合物，其包含根据实施方案1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂，其中该药物组合物包含一种或多种另外的活性成分。

实施方案20：根据实施方案1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案19的药物组合物，其用于治疗。

实施方案21：根据实施方案1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案19的药物组合物，其用于治疗一种或多种突触核蛋白病。

实施方案22：根据实施方案21所使用的抗体或其抗原结合片段，其中该突触核蛋白病选自帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)。

实施方案23：根据实施方案22所使用的抗体或其抗原结合片段，其中该突触核蛋白病是帕金森氏病。

实施方案24：一种治疗患者中的突触核蛋白病的方法，其包括向该患者施用治疗有效量的根据实施方案1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案19的药物组合物。

实施方案25：根据实施方案24的方法，其中该突触核蛋白病选自帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)，优选帕金森氏病。

实施方案26：根据实施方案1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案19的药物组合物，其用于诊断突触核蛋白病，优选诊断帕金森氏病。

附图说明

图1.(A)α突触核蛋白表达的样品的SDS-PAGE。具有His标签(1)和在通过TEV蛋白酶移除His标签之后(2)的α突触核蛋白，对经TEV蛋白酶处理的人α突触核蛋白的Superdex75尺寸排阻色谱(3)。蛋白质分子量标记物SeeBluePlus2(Invitrogen)(M)。B)从Expi293上清液纯化作为野生型未标记蛋白质的人α突触核蛋白的SDS-PAGE。(4)蛋白质分子量标记物SeeBluePlus2(Invitrogen)(M)。

图2.(A)无荧光的单体和在540nm下具有最大荧光的原纤维通过JC-1测定进行的原纤维分析。(B)单体人α突触核蛋白的无规螺旋光谱(波长1646cm^-1)和重组人α突触核蛋白原纤维中的分子间β折叠形成(波长1625-1630cm^-1)的典型实例。

图3.ELISA结合测定。(A)小鼠5811Fab10HIS与重组人α突触核蛋白单体和原纤维以及人α突触核蛋白的肽PVDPDNEAYE的ELISA结合和(B)小鼠5811IgG 1与重组人α突触核蛋白单体和原纤维的ELISA结合。

图4.(A)蛋白质印迹，显示小鼠5811IgG1与人α突触核蛋白和人β突触核蛋白的结合。1.人α突触核蛋白；2.人α突触核蛋白(rPeptide)；3.人β突触核蛋白(rPeptide)；标记物，MagicMark XP。(B)NMR化学位移变化，显示人α突触核蛋白上所预测的小鼠5811Fab的表位。

图5.抑制5811Fab与固定的α突触核蛋白的结合(对于每一种测试肽，分别地左侧的柱对应单体并且右侧的柱对应原纤维)。

图6.用于表征表位的丙氨酸扫描的蛋白质印迹。(A)人α突触核蛋白的野生型和单一氨基酸突变体(His标记)的4-12％Bis/Tris NuPage测定。泳道：M,SeeBluePlus2；1,h a-syn V118A；2,h a-syn D119A；3,h a-syn P120A；4,h a-syn D121A；5,h a-syn N122A；6,ha-syn E123A；7,h a-syn A124S；8,h a-syn Y125A；9,h a-syn E126A；10,h a-syn M127A；11,h a-syn P128A；12和13h a-syn野生型。PVDF印迹使用(B)5811mFab和(C)5811mlgG作为一抗。泳道：M,SeeBluePlus2；1,h a-syn V118A；2,h a-syn D119A；3,h a-syn P120A；4,ha-syn D121A；5,h a-syn N122A；6,h a-syn E123A；7,h a-syn A124S；8,h a-syn Y125A；9,h a-syn E126A；10,h a-syn M127A；11,h a-syn P128A；12h a-syn wt(His–标记的)；13,MagicMark XP；14,h a-syn野生型(未标记)。

图7.轻链人源化。5811对应大鼠可变轻链序列。5811gL5、5811gL8和5811gL14对应抗体5811可变轻链的人源化移植物，使用IGKV1-39人种系作为受体框架。CDR以粗体/带下划线显示。供体残基以粗体/斜体显示并且加阴影：Y71。用于修饰潜在脱酰胺位点的CDR-L3的突变以粗体/带下划线和加阴影显示：G94A。

图8.重链人源化。5811对应大鼠可变重链序列。5811gH4对应抗体5811可变重链的人源化移植物，使用IGHV3-15人种系作为受体框架。CDR以粗体/带下划线显示。供体残基以粗体/斜体显示并且加阴影：A49和A100。

图9.免疫组织化学。来自(A-E)PD和(F-H)非PD患者的脑切片的免疫反应性。(A-C)在PD患者的颞叶皮质中，抗体5811mIgG1标记一些细胞的神经纤维网和细胞质；观测到偶发性路易体样结构(白色箭头)。(D、E)抗体5811mIgG1标记PD患者的黑质中的路易体样特征(白色箭头)。(F、G)在非PD颞叶皮质组织中，抗体5811mIgG1还标记神经纤维网，但未观测到路易体样结构。(H)在非PD个体的黑质中未观测到路易体样结构；黑色箭头指向非特异性标记，对应于含神经黑素的神经元和神经元纤维。比例尺＝50μm。

图10.基于细胞的聚集测定(HEK细胞)；本发明的抗体能够抑制由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集，其中IC₅₀低于5nM。误差棒表示测量的标准误差(SEM,N＝4,n＝12)。

图11.基于细胞的聚集测定(原代神经元)。根据本发明的抗体能够抑制表达内源性含量的α突触核蛋白的小鼠原代神经元上由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集，其中IC₅₀低于5nM。误差棒表示平均值的标准误差(SEM,N＝5,n＝17)。

图12.在注射有小鼠PFF的SNCA-OVX小鼠的不同脑区中，α突触核蛋白病变(箭头)的免疫组织化学图像。

图13.在大脑皮质、纹状体和黑质中，SNCA-OVX小鼠的不同脑区中的α突触核蛋白病变的量化。

图14.野生型小鼠中的α突触核蛋白抗体5811的药物动力学概况。

发明详述

现将参照特定的非限制性方面及其实施方案并且参考某些图和实施例描述本发明。

除非另外说明，否则技术术语根据其常见含义使用。如果向某些术语传递特定含义，则将在使用所述术语的上下文中给出术语的定义。

如果本发明说明书和权利要求书中使用术语“包含”，其不排除其他组件。出于本发明的目的，术语“由…组成”视为术语“包含”的优选实施方案。

当提及单数名词时，如果使用不定冠词或定冠词，例如“一个”、“一种”或“所述”，则此包括该名词的复数，除非另有陈述。

如本文所用，术语“治疗”、“医治”及其类似术语是指获得所要的药理学和/或生理学效果。该效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可具预防性，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言可具治疗性。因此治疗涵盖哺乳动物、尤其人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防可能易患该疾病、但尚未诊断出患有该疾病的受试者中出现该疾病；(b)抑制该疾病，即阻滞其发展；以及(c)缓解该疾病，即促使该疾病消退。

“治疗有效量”是指抗α突触核蛋白抗体或其抗原结合片段在施用至哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以产生对该疾病的这样的治疗的量。治疗有效量将根据抗α突触核蛋白抗体或其抗原结合片段、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、重量等而变化。

在整个本说明书中，术语“分离的”意指视具体情况而定，抗体、抗原结合片段或多核苷酸存在于不同于其在自然界中所存在于的环境的物理环境中。

本发明提供与α突触核蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

在一个实施方案中，参考SEQ ID NO：3的位置6的氨基酸残基甘氨酸(Gly；G)被丙氨酸(Ala；A)置换。

α突触核蛋白(或αsyn；α-突触核蛋白；a-syn或任何其他已知的同义词)是指该蛋白质的通用名称，包括但不限于其他物种(小鼠，猴子等)的可变剪接变体、突变体和α突触核蛋白。除非另有说明，否则当意图或明确提及人α突触核蛋白时，这种α突触核蛋白包含SEQ ID NO：8或Uniprot P37840中给出的序列。

MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(SEQID NO：8)。

本文所用的术语“抗体”通常是指完整的(整个)抗体，即包含两条重链和两条轻链的元件。所述抗体可包含例如根据WO2007/024715中公开的分子DVD-Ig的其他另外的结合结构域，或根据WO2011/030107中所述的所谓的(FabFv)₂Fc。因此，本文所用的抗体包括双价、三价或四价全长抗体。

抗体的抗原结合片段包括单链抗体(即全长重链和轻链)；Fab，经修饰的Fab，Fab'，经修饰的Fab'，F(ab’)₂，Fv，Fab-Fv，Fab-dsFv，单结构域抗体(例如V_H或V_L或V_HH)，scFv，二价、三价或四价抗体，Bis-scFv，双抗体，三抗体，三链抗体，四抗体和上述任一种的表位结合片段(参见例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法是本领域众所周知的(参见例如Verma等人.,1998,Journal ofImmunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式首先在WO2009/040562中公开，并且其二硫化物稳定形式Fab-dsFv首先在WO2010/035012中公开。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169，WO2005/003170和WO2005/003171中描述的Fab和Fab′片段。多价抗体可以包含多重特异性，例如，双特异性或可以是单特异性的(参见例如WO 92/22583和WO05/113605)。后者的一个这样的例子是如WO92/22583中所述的Tri-Fab(或TFM)。

替代性的抗原结合片段包含连接至两个scFv或dsscFv的Fab，scFv或dsscFv各自结合相同或不同靶标(例如一个scFv或dsscFv结合治疗靶标并且一个scFv或dsscFv通过结合例如白蛋白增加半衰期)。这样的抗体片段描述于国际专利申请公开号WO2015/197772中，其以全文引用的方式并入本文中并且尤其参照抗体片段的讨论。

典型Fab’分子包含重链和轻链对，其中重链包含可变区VH、恒定结构域CH1和天然或经修饰的饺链区并且轻链包含可变区VL和恒定结构域CL。根据本公开内容的Fab’的二聚体产生F(ab’)₂，其中例如二聚化可通过饺链进行。

根据本发明的抗体或其抗原结合片段与α突触核蛋白的表位结合。在本发明内，术语“表位”对于构象和线性表位而言可互换使用，其中构象表位由抗原的氨基酸一级序列的不连续的部分构成并且线性表位通过连续氨基酸所形成的序列形成。

表位可通过本领域中已知的任何合适的表位定位方法结合本发明所提供的抗体中的任一种来鉴别。这样的方法的实例包括筛选衍生自全长α突触核蛋白的不同长度的肽的结合于本发明的抗体或其片段和鉴别可特异性结合于含有抗体识别的表位的序列的抗体的最小片段。α突触核蛋白肽可以以合成方式或通过蛋白水解消化α突触核蛋白产生。结合抗体的肽可通过例如质谱分析来鉴别。在另一个实例中，可用NMR光谱法或X射线结晶学鉴别本发明的抗体所结合的表位。在鉴别后，表位可用于制备结合本发明的抗体的片段并且必要时用作免疫原以获得结合相同表位的另外的抗体。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段结合参考SEQ ID NO:8在位置113与129之间的α突触核蛋白的两个或更多个氨基酸残基。具体地，抗体或其抗原结合片段至少结合参考SEQ ID NO:8的氨基酸残基D119、N122和Y125。

优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段防止由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集。

在此特定情形下，术语“防止”(及其语法变异)在本文中可与术语“抑制”互换使用并且指示根据本发明的抗体对于由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集所具有的作用。该效果就以下而言可为预防性的：完全或部分防止聚集；或完全或部分减少(即阻断)已开始进一步进行的聚集，或完全或部分减少进一步聚集的出现；或完全或部分逆转已出现的聚集。

不希望受理论所束缚，据信根据本发明的抗体或其抗原结合片段i)与呈单体形式的α突触核蛋白结合并且防止α突触核蛋白形成寡聚物和聚集体；和/或ii)与呈寡聚和原纤维形式的α突触核蛋白结合并且防止α突触核蛋白在神经元之间扩散和/或iii)与呈寡聚和原纤维形式的α突触核蛋白结合并防止由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集，优选内源性α突触核蛋白聚集。

如本文所用的关于α突触核蛋白的术语“原纤维”、“原纤维形式”或“呈原纤维形式”意欲指α突触核蛋白的非单体形式，包括α突触核蛋白寡聚物，其可构成脑结构内和之间的扩散种类。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段能够结合作为单体和呈原纤维形式的α突触核蛋白。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段对呈原纤维形式的α突触核蛋白的结合亲和力强于对作为单体的α突触核蛋白的结合亲和力。其特征在于对单体α突触核蛋白的解离常数(K_D)比对呈原纤维形式的α突触核蛋白的解离常数高至少10倍。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段对单体α突触核蛋白的解离常数(K_D)小于60pM。在另一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段对呈原纤维形式的α突触核蛋白的解离常数(K_D)小于30pM。

如本文所用，术语“K_D”是指解离常数，其由K_d与K_a的比率(即，K_d/K_a)得到并且以摩尔浓度(M)表示。K_d和K_a分别是指特定抗原-抗体(或其抗原结合片段)相互作用的解离速率和缔合速率。抗体的K_D值可使用本领域中充分确立的方法测定。用于测定抗体的K_D的方法是通过使用表面等离子体共振(诸如

系统，例如本文中的实施例中所描述)，使用经分离的天然或重组α突触核蛋白、其合适的融合蛋白/多肽或其原纤维。在一个实例中，亲和力使用如本文中的实施例所描述的重组人α突触核蛋白来测量。对于表面等离子体共振，将靶分子固定于固相上并且在沿流动池延伸的移动相中暴露于配体。如果发生配体结合至固定的靶标，则局部折射率改变，导致SPR角的变化，其可通过检测反射光强度的变化而进行实时监测。可分析SPR信号的变化速率以对于结合反应的缔合和解离相产生表观速率常数。这些值的比率给出表观平衡常数(亲和力)(参见例如Wolff等人，Cancer Res.53:2560-65(1993))。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段对呈原纤维的α突触核蛋白的结合亲和力高于对作为单体的α突触核蛋白的结合亲和力(即较小的K_D)。术语“亲和力”是指抗体或其抗原结合片段与α突触核蛋白之间的相互作用的强度。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段阻断或防止或减少由α突触核蛋白诱导、优选由呈原纤维形式的α突触核蛋白诱导的聚集。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段对阻断由呈原纤维形式的α突触核蛋白诱导的聚集具有小于10nM的IC₅₀，优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段对阻断呈原纤维形式的α突触核蛋白诱导的聚集具有小于5nM的IC₅₀。

如本文所用的术语IC₅₀是指一半的最大抑制浓度，其是物质(诸如抗体)在抑制特定生物或生物化学功能(在本发明中是由α突触核蛋白(优选呈原纤维形式的α突触核蛋白)诱导的聚集)方面的效果的量度。IC₅₀是定量量度，其指示将指定生物过程抑制一半所需的特定物质的量。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段不结合β突触核蛋白和/或γ突触核蛋白并且对α突触核蛋白具有特异性。

如本文所用的“特异性”意欲指抗体仅识别其特异于的抗原，或相比于与其非特异于的抗原的(γ和β突触核蛋白)的结合，抗体对其特异于的抗原(例如α突触核蛋白)的结合亲和力更高，例如至少5、6、7、8、9、10倍更高的结合亲和力。

根据本发明的抗体可使用本领域中已知的任何合适的方法获得。α突触核蛋白多肽/蛋白质包括融合蛋白、(重组地或天然地)表达多肽的细胞可用于制造特异性识别α突触核蛋白的抗体。多肽可以是“成熟”多肽或其生物学活性片段或衍生物。

在一个实施方案中，多肽(即抗原)是人α突触核蛋白单体或其片段，优选如下文实施例中所描述的制备。

用于免疫宿主的多肽可通过本领域中熟知的方法，从包含表达系统的经基因工程改造的宿主细胞制备，或其可从天然生物来源回收。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另外规定，否则这些互换地使用。α突触核蛋白多肽或其片段在一些实例中可以是较大蛋白质(诸如融合蛋白，例如与亲和标签或类似物融合的融合蛋白)的部分。

在需要对动物进行免疫接种的情况下，可使用熟知并且常规的方案，参见例如Handbook of Experimental Immunology,D.M.Weir(ed.),Vol 4,Blackwell ScientificPublishers,Oxford,England,1986)，通过向动物、优选非人动物施用多肽来获得针对α突触核蛋白多肽产生的抗体。可对许多恒温动物进行免疫接种，诸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最适合的。

单克隆抗体可通过本领域中已知的任何方法制备，诸如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,1975,Nature,256:495-497)、三源杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人.,1983,Immunology Today,4:72)和EBV杂交瘤技术(Cole等人.,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,pp77-96,Alan R Liss,Inc.,1985)。

用于本发明的抗体还可使用单淋巴细胞抗体方法，通过例如由Babcook,J.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15):7843-7848I；WO92/02551；WO2004/051268和WO2004/106377所描述的方法通过克隆和表达从经选择用于产生特异性抗体的单淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生。

对抗体的筛选可使用用于测量与α突触核蛋白的结合的测定和/或用于测量在抗体或其片段存在下抑制α突触核蛋白形成原纤维的测定来进行。

根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含互补决定区(CDR)，三个来自重链并且三个来自轻链。一般而言，CDR位于框架中并且一起形成可变区。按照惯例，抗体或其抗原结合片段的重链可变区中的CDR称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3并且在轻链可变区中称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。其在从各链的N端至C端的方向上顺序编号。

CDR根据Kabat等人设计的系统常规编号。此系统阐述于Kabat等人.,1987,inSequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health andHuman Services,NIH,USA(下文称“Kabat等人(同前文献)”中。本说明书中使用此编号系统，除非其中另有说明。

Kabat残基名称不总是直接与氨基酸残基的线性编号对应。对应于基础可变结构域结构的缩短或插入结构组分、是否为框架或互补决定区(CDR)，实际线性氨基酸序列含有的氨基酸可比严格Kabat编号少或含有其他氨基酸。对于给定的抗体，可通过将抗体序列的同源残基与“标准”Kabat编号序列比对来确定残基的正确Kabat编号。

根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)。然而，根据Chothia(Chothia,C.and Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987)),等效于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另外规定，否则如本文所用的“CDR-H1”在指残基26至35，如Kabat编号系统与Chothia拓朴环定义的组合所描述。

根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)。

在一个实施方案中，抗体可以是嵌合、人源化或人抗体或其片段。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可包含在其中产生抗体的动物的框架区。举例而言，如果抗体在大鼠中产生，则其将包含如本文所定义和主张的CDR和大鼠抗体的框架区，诸如包含根据SEQ ID NO:9的轻链可变区(其核苷酸序列示于SEQID NO:11中)和根据SEQ ID NO:10的重链可变区(其核苷酸序列示于SEQ ID NO:12中)的抗体或其抗原结合片段。

嵌合抗体通常使用重组DNA方法制备。DNA可通过以人L和H链的编码序列取代对应的非人(例如小鼠)H和L恒定区来修饰(Morrison；PNAS 81,6851(1984))。

人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链，如果抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，则其是特定种系序列的“产物”或“来源于”特定种系序列。此类系统包括用感兴趣的抗原使携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫或用感兴趣的抗原筛选呈现在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”人种系免疫球蛋白序列的人抗体或其片段可通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较并且选择在序列上最接近人抗体序列(即最大同一性％)的人种系免疫球蛋白序列来如此识别。作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可含有与种系序列相比因例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变所致的氨基酸差异。然而，所选人抗体通常在氨基酸序列上与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同，并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如小鼠种系序列)相比时鉴别人抗体为人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体可在氨基酸序列上与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、或至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，来源于特定人种系序列的人抗体与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比将呈现不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体可呈现异于由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。

人抗体可通过本领域技术人员已知的多种方法生产。人抗体可通过杂交瘤方法使用人骨髓瘤或小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系制得(Kozbor,J Immunol；(1984)133:3001；Brodeur,Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications,pp51-63,Marcel Dekker Inc,1987)。替代性方法包括使用噬菌体文库或转基因小鼠，其两者均利用人可变区库(Winter G；(1994)Annu Rev Immunol12:433-455,Green LL,(1999)JImmunol Methods 231:1 1-23)。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。

如本文所用，术语“人源化抗体分子“是指这样的抗体分子，其中重链和/或轻链含有一个或多个来自移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中的供体抗体(例如非人抗体，诸如小鼠或兔单克隆抗体)的CDR(视需要包括一个或多个经修饰的CDR)。关于综述，参见Vaughan等人,Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，仅将来自上文所描述的CDR中的任一种的决定特异性的残基中的一个或多个转移至人抗体框架而非转移整个CDR(参见例如，Kashmiri等人，2005,Methods,36,25-34)。在一个实施方案中，仅将来自上文所描述的CDR中的一种或多种的决定特异性的残基转移至人抗体框架。在另一个实施方案中，仅将来自上文所描述的各个CDR的决定特异性的残基转移至人抗体框架。

在移植CDR时，关于衍生CDR的供体抗体的类别/类型，可使用任何合适的受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物和人框架区。

适当地，根据本发明的人源化抗体具有包含人受体框架区以及一个或多个本文中特别提供的CDR的可变结构域。因此，在一个实施方案中提供结合α突触核蛋白、优选人α突触核蛋白的阻断人源化抗体，其中可变结构域包含人受体框架区和非人供体CDR。

可用于本发明的人框架的实例为KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同前文献)。举例而言，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链并且EU、LAY和POM可用于重链和轻链两者。可替代地，可使用人种系序列；这些可在http://www.imgt.org/处获得。

在根据本发明的人源化抗体或其抗原结合片段中，受体重链和轻链不必衍生自相同抗体并且可视需要包含具有衍生自不同链的框架区的复合链。

本发明的人源化抗体的轻链的合适的框架区来源于人种系IGKV1-39，其具有SEQID NO:29并且其核苷酸序列示于SEQ ID NO:31中。

因此，在一个实施方案中，提供人源化抗体或其抗原结合片段，其包含CDR-L1的SEQ ID NO:1中给出的序列、CDR-L2的SEQ ID NO:2中给出的序列和CDRL3的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7中给出的序列，其中轻链框架区来源于人种系IGKV1-39。

根据本发明的人源化抗体或其抗原结合片段的重链的合适的框架区来源于人种系IGHV3-15，其具有如SEQ ID NO:30中所示的序列并且其核苷酸序列示于SEQ ID NO:32中。

在一个实施方案中，提供人源化抗体或其抗原结合片段，其包含CDR-H1的SEQ IDNO:4中给出的序列、CDR-H2的SEQ ID NO:5中给出的序列和CDR-H3的SEQ ID NO:6中给出的序列，其中重链框架区来源于人种系IGHV3-15。

在另一个实施方案中，提供一种人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：

轻链可变区，其包含根据SEQ ID NO:1中给出的序列的CDR-L1、根据SEQ ID NO:2中给出的序列的CDR-L2和根据SEQ ID NO:3或SEQID NO:7中给出的序列的CDR-L3，其中轻链框架区来源于人种系IGKV1-39；和

重链可变区，其包含根据SEQ ID NO:4中给出的序列的CDR-H1、根据SEQ ID NO:5中给出的序列的CDR-H2和根据SEQ ID NO:6中给出的序列的CDR-H3，其中重链框架区来源于人种系IGHV3-15。

在根据本发明的人源化抗体或其抗原结合片段中，框架区可能不具有与受体抗体的那些相同的序列。举例而言，可将异常残基改变为受体链类别或类型中较频繁存在的残基。替代地，可改变在受体框架区中所选择的残基以使其对应于在供体抗体中的相同位置出现的残基(参见Reichmann等人，1998,Nature,332,323-324)。此类改变应保持在恢复供体抗体的亲和力所必需的最小程度。用于选择受体框架区中的可能需要改变的残基的方案阐述于WO91/09967中。

因此，在一个实施方案中，框架中的1、2、3、4、5、6、7或8个残基被替代的氨基酸残基置换。

因此，在一个实施方案中，提供一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变结构域的位置71处的残基(Phe(F)71)(参考SEQ ID NO:17或18)是供体残基(Tyr(Y)71)，参见例如SEQ ID NO:13和14中给出的序列。

在另一个实施方案中，提供一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中重链可变结构域的参考SEQ ID NO:30的位置49和100(Gly(G)49和Thr(T)100)中的每一个处的残基是供体残基(Ala 49和Ala 100)，参见例如SEQ ID NO:25和26中给出的序列。

在一个实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含：

1.根据SEQ ID NO:13的轻链可变区和选自SEQ ID NO:25的重链可变区；或

2.根据SEQ ID NO:17的轻链可变区和选自SEQ ID NO:25的重链可变区；或

3.根据SEQ ID NO:21的轻链可变区和选自SEQ ID NO:25的重链可变区。

在一个实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含与本文所公开的序列80％相似或相同的序列，例如相比于相关序列(例如可变结构域序列、CDR序列或不包括CDR的可变结构域序列)的部分或全部85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同。在一个实施方案中，相关序列是SEQ ID NO:25。在一个实施方案中，相关序列是SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:21。

在一个实施方案中，本发明提供结合人α突触核蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，其中轻链可变结构域包含具有与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:21中给出的序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列和/或其中重链可变结构域包含具有与SEQ ID NO:25中给出的序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。

在一个实施方案中，本发明提供结合人α突触核蛋白的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:21中给出的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同的轻链可变结构域但其中该抗体或其抗原结合片段具有CDR-L1的SEQ ID NO:1中给出的序列、CDR-L2的SEQ ID NO:2中给出的序列和CDR-L3的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7中给出的序列。

在一个实施方案中，本发明提供结合人α突触核蛋白的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:25中给出的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同的重链可变结构域但其中该抗体或其抗原结合片段具有CDR-H1的SEQ ID NO:4中给出的序列、CDR-H2的SEQ ID NO:5中给出的序列和CDR-H3的SEQ ID NO:6中给出的序列。

如本文所用，“同一性”表示在所比对序列的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基相同。如本文所用，“相似性”表示在所比对序列的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基的类型相似。举例而言，可用亮氨酸取代异亮氨酸或缬氨酸。通常可以彼此取代的其他氨基酸包括(但不限于)：

-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；

-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；

-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；

-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和

-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。同一性和相似性的程度可容易地计算(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991,可从NCBI获得的BLAST^TM软件(Altschul,S.F.等人.,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等人.,1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656)。

在一个实施方案中，抗原结合片段可以是但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab’、经修饰的Fab’、F(ab’)₂、Fv、单结构域抗体(例如，VH或VL或V_HH)、scFv、dsscFv、二价抗体、三价抗体或四价抗体、双scFv、双抗体、三抗体、四抗体以及上述任一种的表位结合片段(参见例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法是本领域众所周知的(参见例如Verma等人.,1998,Journal of ImmunologicalMethods,216,165-181)。用于本发明的其他抗体片段包括WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中所描述的Fab和Fab’片段。多价抗体可包含多重特异性，例如双特异性，或可以是单特异性(参见例如WO92/22853、WO05/113605、WO2009/040562和WO2010/035012)。

替代性的抗原结合片段包含连接至两个scFv或dsscFv的Fab，scFv或dsscFv各自结合相同或不同靶标(例如一个scFv或dsscFv结合治疗靶标并且一个scFv或dsscFv通过结合例如白蛋白增加半衰期)。所述抗体片段描述于国际专利申请公开号WO2015/197772中，其以全文引用的方式并入本文中并且尤其参照抗体片段的讨论。

本发明的抗体分子的恒定区结构域如果存在则可根据抗体分子的建议功能和尤其是可能需要的效应功能来选择。举例而言，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。具体地，当抗体分子意图用于治疗用途并且需要抗体效应功能时，可使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同种型。可替代地，当抗体分子意欲用于达成治疗目的并且不需要抗体效应功能时可使用IgG2和IgG4同种型。应理解还可使用这些恒定区结构域的序列变体。举例而言，如Angal等人.,Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中所述，可使用其中位置241的丝氨酸已改变成脯氨酸的IgG4分子。本领域技术人员还理解抗体可进行多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸盐异构化和天冬酰胺去酰胺化。常见修饰为由于羧肽酶作用而损失羧基端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)(如Harris,RJ.Journal ofChromatography 705:129-134,1995中所述)。因此，可缺乏抗体重链的C端赖氨酸。

在一个实施方案中，抗体的C端氨基酸在翻译后修饰期间裂解。

在一个实施方案中，抗体的N端氨基酸在翻译后修饰期间裂解。

在另一个实施方案中，本发明的抗体可包含具有全长重链和轻链的完全抗体或其抗原结合片段。举例而言，全长抗体选自IgG1、IgG4或IgG4P。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：

1.根据SEQ ID NO:14的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链；或

2.根据SEQ ID NO:18的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链；或

3.根据SEQ ID NO:22的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体作为α突触核蛋白结合抗体融合蛋白提供，该融合蛋白包含免疫球蛋白部分，例如Fab或Fab'片段和直接或间接连接于其的一种或两种单结构域抗体(dAb)，例如如WO2009/040562、WO2010035012、WO2011/030107、WO2011/061492和WO2011/086091(均以引用的方式并入本文中)中所述。

在一个实施方案中，融合蛋白包含任选地通过二硫键连接的两种结构域抗体，例如作为可变重链(VH)和可变轻链(VL)对。

在一个实施方案中，融合蛋白的Fab或Fab’元素具有与单结构域抗体相同或相似的特异性。在一个实施方案中，Fab或Fab’具有与单结构域抗体不同的特异性，换言之，融合蛋白是多价的。在一个实施方案中，根据本发明的多价融合蛋白具有白蛋白结合位点，例如其中的VH/VL对提供白蛋白结合位点。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含根据SEQ ID NO:13或17或21的轻链可变区和选自SEQ ID NO:25的重链可变区。举例而言，抗体是全长IgG4抗体，其包含根据SEQ ID NO:13或17或21的轻链可变区和选自SEQ ID NO:25的重链可变区。在另一个实例中，抗体是全长IgG4抗体，其包含根据SEQ ID NO:14、18或22的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链。在又一个实例中，抗原结合片段是Fab’，其包含根据SEQ ID NO:13、17或21的轻链可变区和选自SEQ ID NO:25的重链可变区。

在一个优选实施方案中，用于治疗的抗体或其抗原结合片段或包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物是包含以下的抗体或其抗原结合片段：

a.轻链可变区，其包含根据SEQ ID NO:1的CDR-L1；根据SEQ ID NO:2的CDR-L2和根据SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的CDR-L3；和重链可变区，其包含根据SEQ ID NO:4的CDR-H1；根据SEQ ID NO:5的CDR-H2和根据SEQ ID NO:6的CDR-H3；或

b.根据SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:21的轻链可变区和选自SEQID NO:25的重链可变区；或

c.根据SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:22的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链；

其中该抗体或其抗原结合片段结合α突触核蛋白上的表位，该表位包含参考SEQID NO:8的至少残基D119、N122和Y125。

甚至更优选地，抗体或其抗原结合片段不与β突触核蛋白交叉反应并且结合α突触核蛋白，其对单体α突触核蛋白的解离常数(K_D)比对呈原纤维形式的α突触核蛋白的解离常数高至少10倍。

生物分子诸如抗体或片段含有酸性和/或碱性官能团，从而给予分子净正或负电荷。总体上“观察到”的电荷的量将取决于实体的绝对氨基酸序列、3D结构中带电基团的局部环境和分子的环境条件。等电点(pI)是特定分子或其溶剂可接触表面不携带净电荷时的pH。在一个实例中，根据本发明的抗α突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可经工程改造以具有合适的等电点。这可能产生具有更稳固特性，尤其是合适的溶解性和/或稳定性概况和/或改善的纯化特征的抗体和/或片段。

因此，在一个方面中，本发明提供人源化抗α突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其经工程改造以具有不同于最初鉴别的抗体的等电点的等电点。抗体可能例如通过置换氨基酸残基进行改造，诸如用一个或多个碱性氨基酸残基置换酸性氨基酸残基。可替代地，可引入碱性氨基酸残基或可移除酸性氨基酸残基。可替代地，如果分子具有不可接受地高的pI值，则可视需要引入酸性残基以降低pI。当调控pI时必须注意保持抗体或片段的所期望的活性是重要的。因此，在一个实施方案中，经工程改造的抗体或其抗原结合片段具有与“未经修饰”的抗体或片段相同或基本上相同的活性。

可使用诸如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html和http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html的程序预测抗体或片段的等电点。

应理解，本发明提供的抗体的亲和力可使用本领域中已知的任何合适的方法改变。本发明因此还涉及本发明的抗体分子的变体，其具有对α突触核蛋白，尤其人α突触核蛋白的改善亲和力。此类变体可以通过多种亲和力成熟方案获得，包括使CDR突变(Yang等人.,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等人.,Bio/Technology,10,779-783,1992)、使用大肠杆菌的突变株(Low等人.,J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等人.,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等人.,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人.,Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)论述了这些亲和力成熟方法。

视需要，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可与一种或多种效应分子结合。应理解，效应分子可包含单一效应分子或如此连接以形成可附着至本发明的抗体或其抗原结合片段的单一部分的两种或更多种所述分子。在需要获得连接至效应分子的抗体片段的情况下，这可通过其中抗体片段直接或通过偶联剂连接至效应分子的标准化学或重组DNA程序来制备。使所述效应分子与抗体结合的技术为本领域中所熟知的(Hellstrom等人.,Controlled Drug Delivery,2nd Ed.,Robinson等人.,eds.,1987,pp.623-53；Thorpe等人.,1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等人.,1999,Pharmacology andTherapeutics,83,67-123)。特定化学程序包括例如WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476和WO 03/031581中所述的程序。可替代地，在效应分子为蛋白质或多肽的情况下，键可使用重组DNA程序，例如如WO 86/01533和EP0392745中所述来实现。

如本文所使用的术语效应分子包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物学活性蛋白质(例如酶)、其他抗体或抗体片段、合成的或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(尤其放射性碘)、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报导基团，诸如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。

效应分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括任何对细胞不利(例如杀死)的试剂。实例包括康普瑞汀(combrestatin)、尾海兔素(dolastatin)、埃博霉素(epothilone)、星形抱菌素(staurosporin)、类美登素(maytansinoid)、海绵素(spongistatin)、根瘤菌素(rhizoxin)、软海绵素(halichondrin)、杆孢菌素(roridin)、海米斯林(hemiasterlin)、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌素D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊昔(etoposide)、特诺波赛(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾丸酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素及其类似物或同源物。

效应分子还包括(但不限于)抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷基化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)和洛莫司汀(lomustine,CCNU)、环硫磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链唑霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(anthracycline)(例如道诺霉素(以前为红比霉素)和阿霉素)、抗生素(例如放线菌素D(以前为放射菌素)、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素、安曲霉素(anthramycin,AMC)、卡奇霉素或倍癌霉素(duocarmycin))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。

其他效应分子可包括螯合的放射性核素，诸如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物，诸如但不限于烷基磷酸胆碱、拓朴异构酶I抑制剂、紫杉醇类和苏拉明(suramin)。

其他效应分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括(但不限于)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括(但不限于)免疫球蛋白、毒素(诸如相思子毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)、蛋白质(诸如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤维蛋白溶酶原活化因子)、血栓形成剂或抗血管生成剂(例如血管生长抑素或内皮生长抑素)或生物反应调节剂诸如淋巴激素、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子和免疫球蛋白。

其他效应分子可包括可用于例如诊断中的可检测物质、可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层成像)和非放射性顺磁性金属离子。关于可与用作诊断剂的抗体缀合的金属离子，一般参见美国专利号4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光物质包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光物质包括鲁米诺；合适的生物发光物质包括荧光素酶、荧光素和水母素；并且合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。

在另一个实例中，效应分子可增加抗体在体内的半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体跨越上皮屏障传递至免疫系统。此类型的合适的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，诸如WO05/117984中描述的那些化合物。

一般而言，在效应分子是聚合物的情况下，它可以是合成的或者天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化亚烷基聚合物或者带支链或不带支链的多糖，例如同多糖或杂多糖。

可能存在于上述的合成聚合物上的特定任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。

合成的聚合物的具体实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任选取代的聚(乙二醇)诸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、右旋糖酐、糖原或其衍生物。

在一个实施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，诸如人血清白蛋白或其片段。

本文中使用的“衍生物”旨在包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应性基团诸如马来酰亚胺等。可以将反应性基团直接连接至聚合物或者通过接头区段连接至聚合物。将理解的是，这样的基团的残基会在一些情况下形成产物的一部分，作为抗体片段和聚合物之间的连接基团。

聚合物的大小可以根据需要而改变，但是一般将在平均分子量500Da至50000Da的范围内，例如5000至40000Da诸如20000至40000Da。可以特别地基于产品的预期用途(例如定位至某些组织(诸如肿瘤)或延长循环半衰期的能力)选择聚合物的大小(对于综述，参见Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，当产品旨在离开循环并渗透组织时(例如用于肿瘤的治疗)，使用小分子量的聚合物(例如具有约5000Da的分子量)可以是有利的。对于产品保持于循环中的应用，使用更高分子量的聚合物(例如具有20000Da至40000Da范围内的分子量)可以是有利的。

合适的聚合物包括聚亚烷基聚合物，诸如聚(乙二醇)，或者特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且特别是具有约15000Da至约40000Da范围内的分子量。

在一个实例中，将用于本发明的抗体附接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个具体实例中，抗体是抗体片段并且PEG分子可以通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离的氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基)进行附接。这样的氨基酸可以天然存在于抗体片段中或者可以通过使用重组DNA方法被工程化至片段中(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971，WO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子是修饰的Fab片段，其中所述修饰是向其重链的C-末端添加一个或多个氨基酸以允许效应分子的附接。合适地，额外的氨基酸形成含有一个或多个半胱氨酸残基的修饰的铰链区，效应分子可以附接至所述半胱氨酸残基。可以使用多个位点来附接两个或更多个PEG分子。

合适地，PEG分子通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基进行共价连接。被附接至修饰的抗体片段的每个聚合物分子可以共价连接至位于该片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价连接一般会是二硫键或者特别是硫-碳键。在巯基被用作附接点的情况下，可以使用适当活化的效应分子，例如巯基选择性衍生物诸如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化的聚合物可以在制备如上所述的聚合物修饰的抗体片段的过程中用作起始材料。活化的聚合物可以是任何含有巯基反应性基团(诸如α-卤代羧酸或酯，例如碘乙酰胺、酰亚胺，例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物)的聚合物。这样的起始材料可以通过市售获得(例如来自Nektar(以前是Shearwater Polymers Inc.),Huntsville,AL,USA)或者可以使用常规化学方法从市售可得的起始材料进行制备。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可从Nektar，以前是Shearwater；Rapp Polymere；和SunBio获得)和M-PEG-SPA(可从Nektar，以前是Shearwater获得)。

在一个实施方案中，抗体是修饰的Fab片段、Fab’片段或diFab，其为PEG化的，即具有共价附接至其的PEG(聚(乙二醇))，例如根据EP 0948544或EP1090037中所公开的方法(还参见"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and BiomedicalApplications",1992,J.Milton Harris(ed),Plenum Press,New York,"Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications",1997,J.Milton Harrisand S.Zalipsky(eds),American Chemical Society,Washington DC和"BioconjugationProtein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences",1998,M.Aslam andA.Dent,Grove Publishers,New York；Chapman,A.2002,Advanced Drug DeliveryReviews 2002,54:531-545)。在一个实例中，将PEG附接至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接至修饰的铰链区中的单个巯基的马来酰亚胺基团。可以将赖氨酸残基共价连接至马来酰亚胺基团并且可以将具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物附接至赖氨酸残基上每个胺基。因此，附接至Fab片段的PEG的总分子量可以为约40,000Da。

具体的PEG分子包括N,N’-双(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修饰的赖氨酸的2-[3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基]乙酰胺，也被称为PEG2MAL40K(可从Nektar，以前是Shearwater获得)。

PEG接头的备选来源包括NOF，其供应GL2-400MA3(其中下述结构中的m是5)和GL2-400MA(其中m是2)并且n是约450：

也就是说，每个PEG为约20,000Da。

因此，在一个实施方案中PEG是2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧)-1-{[3-(6-马来酰亚胺基-1-氧己基)氨基]丙氧基}己烷(2臂分支的PEG,-CH₂)₃NHCO(CH₂)₅-MAL，Mw 40,000，称为SUNBRIGHT GL2-400MA3。

下列类型的进一步可选的PEG效应分子可获自Dr Reddy、NOF和Jenkem：

在一个实施方案中，根据本发明的Fab或Fab’缀合至PEG分子。

在一个实施方案中，提供经聚乙二醇化的抗体(例如具有本文中所述的PEG)，其通过链中在氨基酸226处或约氨基酸226处的半胱氨酸氨基酸残基(例如重链的氨基酸226(通过顺序编号)，例如SEQ ID NO:26的氨基酸224)连接。

在一个实施方案中，本公开内容提供一种Fab’PEG分子，其包含一种或多种PEG聚合物，例如1或2种聚合物，诸如40kDa聚合物。

根据本发明的Fab’-PEG分子可尤其有利，因为其具有与Fc片段无关的半衰期。在一个实施方案中，提供缀合于诸如PEG分子、淀粉分子或白蛋白分子的聚合物的Fab’。在一个实施方案中，提供缀合于诸如PEG分子、淀粉分子或白蛋白分子的聚合物的scFv。在一个实施方案中，根据本发明的Fab或Fab’与人血清白蛋白缀合。在一个实施方案中，抗体或片段缀合于淀粉分子，例如以增加半衰期。将淀粉缀合于蛋白质的方法如US8,017,739中所述，其以引用的方式并入本文中。

本发明还提供一种经分离的多核苷酸，其编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的经分离的多核苷酸可包含合成DNA(例如通过化学处理产生)、cDNA、基因组DNA或其任何组合。

分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的抗体或其抗原结合片段的DNA序列。所需DNA序列可使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成。适当时可使用定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术。

在一个实施方案中，根据本发明的经分离的多核苷酸编码：

a.轻链可变区，其中该多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:23至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:23；或

iii.基本上由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:23组成；

b.重链可变区，其中该多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:27至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:27；或

iii.基本上由SEQ ID NO:27组成；

c.轻链，其中该多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24；或

iii.基本上由SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24组成；

d.重链，其中该多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:28至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:28；或

iii.基本上由SEQ ID NO:28组成。

本发明还提供克隆或表达载体，其包含一种或多种本文中所述的多核苷酸。在一个实例中，根据本发明的克隆或表达载体包含一种或多种经分离的多核苷酸，该经分离的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:15、16、19、20、23、24、27或28的序列。

可用于构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员所熟知的。就此而盲，参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(ed),Wiley Interscience,New York和由Cold Spring Harbor Publishing出版的ManiatisManual。

还提供一种宿主细胞，其包含根据本发明的一种或多种经分离的多核苷酸序列或包含编码本发明的抗体的一种或多种经分离的多核苷酸序列的一种或多种克隆或表达载体。任何合适的宿主细胞/载体系统均可用于表达编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。可使用细菌，例如大肠杆菌及其他微生物系统，或还可使用真核(例如哺乳动物的)宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。

用于本发明的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)的合适的类型可包括CHO和CHO-K1细胞，包括dhfr-CHO细胞，诸如可与DHFR选择标记物一起使用的CHO-DG44细胞和CHO-DXB11细胞或可与谷氨酰胺合成酶选择标记物一起使用的CHOK1-SV细胞。用于表达抗体的其他细胞类型包括淋巴细胞性细胞系，例如NSO骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞。宿主细胞可用根据本发明的经分离的多核苷酸序列或表达载体稳定转化或转染。

在一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞是用表达载体稳定转染的CHO-DG44细胞，该表达载体包含本发明的经分离的多核苷酸序列，优选包含根据SEQ ID NO:15和27或SEQ ID NO:19和27或SEQ ID NO:23和27或SEQ ID NO:16和28或SEQ ID NO:20和28或SEQID NO：24和28的经分离的多核苷酸序列。

本发明还提供一种用于产生根据本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适于产生根据本发明的抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据本发明的宿主细胞，和分离该抗体或其抗原结合片段。

抗体或其抗原结合片段可仅包含重链或轻链多肽，在此情况下仅需使用重链或轻链多肽编码序列转染宿主细胞。为了产生包含重链和轻链两者的抗体或其抗原结合片段，细胞系可用两种载体转染，第一载体编码轻链多肽并且第二载体编码重链多肽。可替代地，可使用单一载体，载体包含编码轻链和重链多肽的序列。

因此，提供一种用于培养宿主细胞并且表达抗体或其片段、分离该抗体或其片段并且任选地将其纯化以得到经分离的抗体或片段的方法。在一个实施方案中，该方法进一步包括将效应分子缀合于分离的抗体或片段，例如缀合于尤其如本文所述的PEG聚合物的步骤。

因此，在一个实施方案中，提供经纯化的抗α突触核蛋白抗体或其片段，例如人源化抗体或其片段，尤其是根据本发明的抗体或其片段，其基本上从内毒素和/或宿主细胞蛋白质或DNA纯化，尤其不含或基本上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白质或DNA。

基本上不含内毒素一般意指每毫克抗体产物的内毒素含量为1EU或更低，诸如每毫克产物0.5或0.1EU。

基本上不含宿主细胞蛋白质或DNA一般意指每毫克抗体产物的宿主细胞蛋白质和/或DNA含量为400μg或更低，诸如100μg/mg或更低，尤其是适当时20μg/mg。

因为本发明的抗体适用于治疗、诊断和/或预防病理病状，诸如α突触核蛋白病，所以本发明还提供一种药物或诊断组合物，其包含与药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂中的一种或多种组合的根据本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段是单一活性成分。在另一个实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段与一种或多种另外的活性成分组合。可替代地，药物组合物包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段是单一活性成分并且其可与其他试剂、药物或激素组合地(例如同时、顺序或分开)单独向患者施用。

在另一个实施方案中，药物组合物包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:13或17或21的轻链可变区并且包含SEQ ID NO:25的重链可变区，例如包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25。

根据本发明的药物组合物可适当地向患者施用以鉴别所需的治疗有效量。如本文所用，术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向的疾病或病状或展现可检测的治疗或预防效果所需要的治疗剂的量。关于任何抗体，治疗有效量可最初在细胞培养测定中或在动物模型中，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类中估算。动物模型还可用于确定施用的适当浓度范围和途径。这样的信息可随后用于确定用于施用至人的剂量和途径。

人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度、受试者的整体健康、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/反应性。此量可以通过常规实验确定并且在临床医师的判断范围内。一般而言，治疗有效量将为0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，诸如100mg/Kg。药物组合物可以以每剂量含有预定量的本发明的活性剂的单位剂型呈现。

治疗组合物中药学上可接受的载剂可另外含有液体，诸如水、生理盐水、甘油和乙醇。另外，诸如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质的辅助物质可存在于所述组合物中。这些载剂使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，以便患者摄入。

合适的施用形式包括适用于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过快速注射或连续输液、静脉内、可吸入或皮下形式。在产品用于注射或输注的情况下，其可采用在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式并且其可含有配制试剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可呈干燥形式，用于在使用之前用合适的无菌液体重构。还可制备适于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。

一旦配制，本发明的组合物可直接施用至受试者。因此，本文提供根据本发明的抗体或其抗原结合片段用于制造药剂的用途。

待治疗的受试者可以是动物。优选地，根据本发明的药物组合物经调整以用于向人受试者施用。

因此，在另一方面中，本发明提供抗体或其抗原结合片段或包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其用于治疗，并且尤其用于治疗一种或多种α突触核蛋白病。在另一方面中，本发明提供治疗患者中的一种或多种突触核蛋白病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的抗体或其抗原结合片段或包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

在一个实施方案中，用于治疗的抗体或其抗原结合片段或包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物是包含以下的抗体或其抗原结合片段：

其中该抗体或其抗原结合片段经人源化并且防止由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集，其中该抗体或其抗原结合片段结合α突触核蛋白上的表位，该表位包含参考SEQ ID NO:8的至少残基D119、N122和Y125并且其中该抗体或其抗原结合片段用于治疗。优选地，抗体或其抗原结合片段不与β突触核蛋白交叉反应并且结合α突触核蛋白，其对单体α突触核蛋白的解离常数(K_D)比对呈原纤维形式的α突触核蛋白的解离常数高至少10倍。

在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段或包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物用于治疗一种或多种突触核蛋白病，其是包含以下的抗体或其抗原结合片段：

其中该抗体或其抗原结合片段经人源化并且防止由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集，其中该抗体或其抗原结合片段结合α突触核蛋白上的表位，该表位包含参考SEQ ID NO:8的至少残基D119、N122和Y125。优选地，抗体或其抗原结合片段不与β突触核蛋白交叉反应并且结合α突触核蛋白，其对单体α突触核蛋白的解离常数(K_D)比对呈原纤维形式的α突触核蛋白的解离常数高至少10倍。

在另一个实施方案中，提供一种治疗患者中的一种或多种突触核蛋白病的方法，其包括向该患者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段或包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

根据本发明的α突触核蛋白病包括但不限于帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)。优选地，α突触核蛋白病是帕金森氏病(PD)。

在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段或包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物用于治疗帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)，优选帕金森氏病(PD)，其是包含以下的抗体或其抗原结合片段：

其中该抗体或其抗原结合片段经人源化并且防止由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集，其中任选地该抗体或其抗原结合片段结合α突触核蛋白上的表位，该表位包含参考SEQ ID NO:8的至少残基D119、N122和Y125并且其中该抗体或其抗原结合片段是用于治疗。优选地，抗体或其抗原结合片段不与β突触核蛋白交叉反应并且结合α突触核蛋白，其对单体α突触核蛋白的解离常数(K_D)比对呈原纤维形式的α突触核蛋白的解离常数高至少10倍。

在另一个实施方案中，提供一种治疗患者中的帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)，优选帕金森氏病(PD)的方法，其包括向该患者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段或包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

可替代地，本发明还提供抗体或其抗原结合片段用于制造用于治疗α突触核蛋白病的药剂的用途，其中该α突触核蛋白病优选是帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)，更优选帕金森氏病(PD)，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

此外，本发明的部分是抗α突触核蛋白抗体或抗原结合片段用作诊断活性剂或用于诊断测定的用途，例如用于诊断α突触核蛋白病，诸如帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)。

诊断优选可针对生物样品进行。“生物样品”涵盖获自个体的多种样品类型并且可用于诊断或监测测定。该定义涵盖脑脊髓液，诸如血浆和血清的血液，和生物来源的其他液体样品，诸如尿液和唾液，固体组织样品诸如活检样品或组织培养物或从其衍生的细胞及其子代。定义还包括已在其获取之后以任何方式进行了操纵的样品，诸如通过试剂处理、增溶、或富集某些组分，诸如多核苷酸。

诊断测试优选可针对不与人或动物身体接触的生物样品进行。此类诊断测试还称为体外测试。体外诊断测试可依赖于检测已获自受试者的生物样品中的α突触核蛋白的体外方法，其包括以下步骤：i)使生物样品与如本文所述的抗α突触核蛋白抗体或其抗原结合片段接触；和ii)检测抗α突触核蛋白抗体或其抗原结合片段与α突触核蛋白的结合。通过与合适的对照比较检测到的α突触核蛋白水平或α突触核蛋白的特异性翻译后修饰形式的存在，可鉴别一种或多种α突触核蛋白病。此类检测方法因此可用于判定受试者是否患有α突触核蛋白病，或处于发展α突触核蛋白病的风险中，包括确定α突触核蛋白病的阶段(严重程度)。

因此，本发明提供用于诊断α突触核蛋白病、优选诊断或帕金森氏病(PD)的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含:

其中任选地该抗体或其抗原结合片段结合α突触核蛋白上的表位，该表位包含参考SEQ ID NO:8的至少残基D119、N122和Y125。

本发明中所包括的序列显示于表1中：

表1

现将参照附图中示出的实施方案，通过实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1：人α突触核蛋白单体和原纤维的表达

编码人α突触核蛋白的基因使用标准分子生物学技术以合成方式产生并且亚克隆于载体pMH 10His TEV(含有CMV启动子)中，以产生经工程改造以产生具有N端10His-TEV标签的α突触核蛋白的载体。所得载体使用Expi293^TM表达系统(Invitrogen)根据制造商的方案转染于Expi293F细胞中。α突触核蛋白在培养基中积累，使用固定的金属离子亲和色谱HisTrap excel柱(GE Healthcare)从该培养基回收α突触核蛋白。柱用25mMTrisHCl,300mMNaCl,pH 8.0洗涤，并且蛋白质在相同缓冲液中用分级梯度的500mM咪唑洗脱。使用TEV蛋白酶移除10His标签。样品随后经浓缩并且去盐，之后将裂解的蛋白质重新施加于HisTrap excel柱并且收集流通液中的裂解的α突触核蛋白。α突触核蛋白进一步通过凝胶过滤在HiLoad26/600Superdex 75柱(GE Healthcare)上纯化，并且内毒素通过穿过Proteus NoEndo滤筒(Generon)来移除。纯化的α突触核蛋白通过SEC MALS证实为单体(图1A)。

还在Expi293F细胞中表达野生型(未标记的)人α突触核蛋白。使用HiTrap Q柱(GEHealthcare)通过阴离子交换从培养基回收蛋白质。柱用20mMTrisHCl pH 8.0洗涤，并且蛋白质使用氯化钠梯度洗脱至400mM。级分经浓缩并且通过穿过HiPrep 26/10柱(GEHealthcare)去盐并且用20mMTrisHCl pH 8.0洗脱。蛋白质使用MonoQ 10/100GL柱进一步纯化，在20mMTrisHCl pH 8.0中用氯化钠梯度洗脱至400mM，之后在HiLoad 26/600Superdex 75柱(GE Healthcare)上凝胶过滤，其中洗脱在PBS pH7.4中(图1B)。

此未标记的野生型α突触核蛋白单体用于制备α突触核蛋白原纤维，其通过在Vortemp56振荡培养箱(Labnet)中，在1200rpm,37℃下将纯化的单体(PBS pH7.4中的9-10mg/mL)连续搅拌10天来获得。原纤维形成通过溶液的JC-1测定(Lee等人，Biochem.J.2009,418,311-323)，和C傅立叶变换红外光谱分析来测定。原纤维溶液中的未掺入单体通过超速离心和通过穿过100KDa截止膜之后通过凝胶电泳来测定。在进一步研究中仅使用具有JC-1反应＞15、较低量的可溶性单体(＜5％)和主要吸收峰在1625与1630cm-1之间的FTIR光谱的原纤维(图2)。所制备的原纤维在-80℃下储存。

实施例2：免疫接种和抗体分离

进行使用各种物种和免疫原的大量免疫接种策略。抗体5811来源于雌性SpragueDawley大鼠(＞180g)，其已接受50μg的如上文所述表达的未标记的野生型α突触核蛋白单体(SEQ ID NO:8)的皮下免疫接种。

使用不完全弗氏佐剂(IFA)，以21天时间间隔给予大鼠3次加强注射，免疫后第14天从尾部静脉放血。在最终加强注射之后第14天终止，在-80℃下在10％DMSO/FCS中制备和冷冻脾、淋巴结、骨髓和外周血单核细胞的单细胞悬浮液。

B细胞培养物

B细胞培养物使用类似于Tickle等人.,2015.J Biomol Screen:20(4),492-497所描述的方法的方法制备。简言之，来自经免疫接种的动物的淋巴结或脾细胞来源的B细胞在5％CO₂的氛围中在37℃下于带有条形码的96孔组织培养板中以约2000-5000个细胞/孔的密度培养7天，该培养板具有补充有以下的200μl/孔RPMI 1640培养基(GibcoBRL):10％FCS(Sigma Aldrich)、2％HEPES(Sigma Aldrich)、1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)、1％青霉素/链霉素溶液(Gibco BRL)、0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)、1％活化的人PBMC上清液(BSS)和X射线辐射的突变EL4小鼠胸腺瘤细胞(5x10⁴个/孔)。使用来自经免疫接种的所有动物的B细胞建立培养物，并且取样总计约1.7×10⁹个B细胞。

根据本发明的抗体5811由活化的淋巴结来源的B细胞产生，所述B细胞以约2000个细胞/孔的密度培养。除了脾细胞以外，还将淋巴结用于抗体发现以得到B细胞的替代源，从其可采样并鉴别新颖抗体。从经免疫接种全长单体人α突触核蛋白的大鼠取样约3.3×10⁸个细胞。

初次筛选

使用涂布有作为靶抗原的来源的生物素化的重组人α突触核蛋白全长单体的Superavidin^TM珠粒(Bangs Laboratories)，使用基于荧光的均质结合测定确定B细胞培养上清液中的人α突触核蛋白特异性抗体的存在。如本文所述的重组人α突触核蛋白使用3倍摩尔过量的生物素进行生物素化。按顺序使用低摩尔过量的生物素以避免存在于α突触核蛋白分子内的全部七个赖氨酸残基的完全修饰。在40℃下使α突触核蛋白单体与生物素一起孵育过夜并且第二天使用Zeba^TM旋转去盐柱移除游离生物素。筛选涉及将10μl上清液从带条形码的96孔组织培养板转移到带条形码的384孔黑壁测定板中，该测定板含有使用Agilent Bravo液体处理器固定在Superavidin珠粒(10μl/孔)上的生物素化的重组人α突触核蛋白单体。结合通过山羊抗大鼠IgG Fcγ片段特异性Alexafluor647缀合物(Jackson)展现。在TTP Labtech Mirrorball上对培养板读数以便鉴别含有α突触核蛋白特异性IgG的孔。

二次筛选

在初次筛选之后，使用Beckman Coulter BiomekNXP命中拣选机器人将阳性上清液合并在带条形码的96孔主培养板上并且细胞培养板中的B细胞在-80℃下冷冻。随后使用生物素化的重组人α突触核蛋白单体或生物素化的重组人α突触核蛋白原纤维在抗生蛋白链菌素捕获ELISA测定中筛选主培养板。这用于鉴别提供与单体和原纤维重组人α突触核蛋白两者的结合的孔，并用于排除显示与Superavidin^TM珠粒的脱靶结合的任何假阳性孔。鉴于原纤维的不溶性质，与溶液中的蛋白质一起使用的常规ELISA涂布方案不是有利的。决定采用最小生物素标记方案以保存原纤维结构并且促进原纤维在预涂布有抗生蛋白链菌素的ELISA板上的有效涂布。

通过在PBS中组合生物素化的重组α突触核蛋白单体(如上文所述)与50倍过量的未标记的重组α突触核蛋白，如本文所述产生生物素化的α突触核蛋白总原纤维。通过JC1测定(Lee等人.,Biochem.J.2009,418,311-323)证实原纤维形成。

将PBS中的生物素化的单体或生物素化的原纤维捕获于涂布有碳酸盐涂布缓冲液(dH₂O+0.16％Na₂CO₃+0.3％NaHCO₃)中的抗生蛋白链菌素的384孔Maxisorp培养板上。培养板用1％w/v PEG/PBS封闭并且接着与10μl/孔的B细胞培养物上清液(用封闭缓冲液1:1稀释)一起孵育。向培养板中添加二抗HRP缀合的山羊抗大鼠IgG Fcγ片段特异性HRP缀合物(Jackson)，随后利用TMB底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，得自EMD Millipore；10μl/孔)可视化结合。使用BioTek Synergy 2微量板读取器，在630nM测量光密度。初次结合测定鉴别83个命中并且在ELISA筛选之后，其中的29个显示与单体和原纤维重组人α突触核蛋白两者结合。

选择展现对重组原纤维的最强ELISA结合信号的B细胞上清液用于通过表面等离子体共振进一步分析以鉴别具有对重组人α突触核蛋白单体、重组人α突触核蛋白原纤维和重组小鼠α突触核蛋白原纤维的最佳解离速率的那些。测试26种不同B细胞的上清液，19个孔对重组人α突触核蛋白单体给出＜1x10^-5的解离速率(kd)。在这些中，6个孔对重组小鼠α突触核蛋白单体给出小于1x10^-5的解离速率(kd)。选择所有19种上清液以用于可变区恢复。

可变区恢复

为允许从选择的感兴趣的上清液恢复抗体可变区基因，必须进行解卷积步骤以实现在含有B细胞的异质群体的指定孔中的抗原特异性B细胞的鉴别。这使用荧光焦点方法(Clargo等人.,2014.MAbs:6(1),143-159)实现。简言之，使阳性孔中的分泌免疫球蛋白的B细胞与涂布有生物素化的重组人α突触核蛋白原纤维(使用如上文所述的1:50混合物产生)和山羊抗大鼠IgG Fcγ片段特异性FITC缀合物(Jackson)的1:1200最终稀释液的抗生蛋白链菌素珠粒(New EnglandBiolabs)混合。在37℃静态孵育1小时之后，由于在该B细胞周围存在荧光光环而可鉴别出抗原特异性B细胞。接着利用Eppendorf微操作器挑选多个使用Olympus显微镜鉴别的这些个别B细胞克隆并且沉积至PCR管中。

使用重链和轻链可变区特异性引物，通过逆转录(RT)-PCR从单细胞中回收抗体可变区基因。利用并入3’和5’末端处的限制位点的嵌套式2°PCR进行两轮PCR，使得可变区克隆至小鼠IgG Fcγ1或Fab-10HIS(VH)或小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体中。来自9种不同上清液的抗α突触核蛋白抗体基因成功克隆到表达载体中。使用ExpiFectamine 293(Invitrogen)将重链和轻链构建体共转染于Expi-293细胞中并且以30ml体积在125ml锥形瓶中表达大鼠-小鼠嵌合重组抗体5811mFab或5811mIgG1(包含大鼠5811可变区和小鼠恒定区(对于IgG，SEQ ID NO:34和35；对于Fab，SEQ ID NO:34和36))。5-7天表达之后，收集上清液并且使用亲和色谱纯化。

短暂上清液的ELISA筛选

随后通过ELISA使经纯化的大鼠-小鼠嵌合抗体经受进一步筛选。将生物素化的重组人α突触核蛋白单体和原纤维捕获于涂布有碳酸盐涂布缓冲液(dH₂O+0.16％Na₂CO₃+0.3％NaHCO₃)中的抗生蛋白链菌素的384孔Maxisorp培养板(ThermoScientific/Nunc)上。独立的培养板还涂布有对应于根据SEQ ID NO:8(肽PVDPDNEAYE)的人α突触核蛋白的残基117至126的生物素化的肽以检查是否短暂结合于此区域或分子上的不同区域。培养板用1％w/v PEG/PBS封闭并且接着与纯化的短暂上清液的几个稀释液一起孵育。向培养板中添加二抗HRP缀合的山羊抗小鼠IgG Fc抗体(Stratech Scientific Ltd/JacksonImmunoResearch)，随后利用TMB底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，得自EMD Millipore；10μl/孔)可视化结合。使用BioTek Synergy 2微量板读取器，在630nM测量光密度。呈IgGFcγ1(包含SEQ ID NO:34和35)形式和呈Fab(包含SEQ ID NO:34和36)形式的抗体5811的数据显示于图3A和3B中。如可见的，5811抗体显示与单体和原纤维重组人α突触核蛋白两者的结合，并且还显示与PVDPDNEAYE肽的结合。

进行进一步表征以测定这样的抗体的活性、亲和力和亲合力、表位结合和生物物理学特性。除非明确提及使用人源化形式，否则使用大鼠-小鼠嵌合抗体(5811mFab或5811mIgG 1)进行实验。

实施例3：抗体表征

Biacore动力学

通过使用表面等离子体共振技术在Biacore T200仪器上测定相互作用动力学。使用胺-偶联化学在CM5芯片表面的三个不同流动池上各自固定三种不同配体，所述配体包括如本文所述制备的重组全长人α突触核蛋白单体、经纯化的重组人α突触核蛋白原纤维和经纯化的重组小鼠α突触核蛋白原纤维。三种配体在10mMNaAc,pH 3.5中制备，并且固定于独立的流动池表面上以在10μl/min的流动速率下达到以下固定水平：分别地对于α突触核蛋白单体约30反应单位(RU)、对于人α突触核蛋白原纤维约40RU，和对于小鼠α突触核蛋白原纤维约300RU。缓冲液HBS-EP+(GE healthcare Bio-Sciences AB)用作运行缓冲液以进行配体固定和动力学分析。随后测量抗α突触核蛋白单克隆5811mIgG1抗体和单克隆5811mFab抗体对三种配体的结合。在100μl/min的流动速率下，在3个流动池上以800nM至0.195nM的7种不同浓度注射单克隆mIgG1或mFab抗体，接触时间为3分钟并且解离时间为30分钟。通过在10μl/min下持续90s的50mMHCl的一次注射，并且在10μl/min下持续60s的50mMHCl的再次注射来重新产生表面。使用Biacore T200评估软件(版本3.0)，使用二价分析物模型(假设对于mIgG1形式无体积贡献(bulk contribution)(RI＝0)和全局Rmax)和1:1模型(具有柔性体积贡献(局部RI)与全局Rmax)分析数据。

mIgG1和mFab与固定靶标的结合的动力学值显示于表2中。mIgG1形式显示与对人α突触核蛋白单体的亲和力相比对人α突触核蛋白原纤维有明显的选择性亲和力，其中解离常数KD对于人原纤维要低超过10倍。

表2

与β突触核蛋白的结合

使用rPeptideβ突触核蛋白通过蛋白质印迹测试针对人α突触核蛋白产生的抗体与人β突触核蛋白的结合。在4-12％Bis/Tris凝胶上运行1微克的突触核蛋白并且印迹于PVDF膜上。将膜在具有3％BSA和0.1％Tween20的PBS中封闭。将抗体5811mIgG1添加至经封闭的印迹并且在室温下孵育1小时，用PBS、0.1％Tween20洗涤并且与二抗-HRP缀合物(抗兔H+L HRP缀合物，Bethyl,A120-101P)一起孵育1小时。将印迹在具有0.1％Tween20、PBS和水的PBS中充分洗涤。在添加ECL蛋白质印迹底物(Pierce)之后测量化学发光。如图4(A)第3泳道中所示，抗体5811mIgG1不与人β突触核蛋白结合。

表位定位

NMR

将人α突触核蛋白克隆到pET28a表达载体中，使得表达无任何标签的蛋白质。将构建体转移至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞(Stratagene)中，并且在氧化氘(D₂O)存在和缺失下在具有C¹³标记的DL-葡萄糖和N¹⁵标记的硫酸铵的成分确定培养基中生长细胞。在OD600nm＝1下用300mMIPTG诱导表达并且在30℃下将培养物孵育4小时。使细胞沉淀并且通过在100ml裂解缓冲液(20mMTris/HClpH 8.0,25单位核酸酶(Merck Millipore)、完整EDTA游离蛋白酶抑制剂混合物(2个片剂，Roche)和10mg溶菌酶(Sigma))中进行三次冷冻-融化循环来裂解。通过在18000rpm下离心来澄清裂解产物，并且使澄清的裂解产物穿过0.22μm过滤器(Stericup,Millipore)。将无菌裂解产物装载于用20mMTris/HCl pH8.0,5CV平衡的MonoQ10/100GL(GE Healthcare)上并且在相同缓冲液中用达到500mMNaCl的梯度洗脱蛋白质。在MonoQ 10/100GL柱上重复最纯级分的进一步纯化，之后在20mMTris/HCl pH 8.0中进行5倍稀释。合并最纯级分，用10kDa MWCO离心浓缩器(Centriprep,Millipore)浓缩，通过尺寸排阻在HiLoad 26/600Superdex 75柱(GE Healthcare)上纯化，并且在25mM磷酸钠缓冲液、100mMNaCl(pH 6.4)中洗脱。合并来自Superdex 75柱的级分并且添加叠氮化钠(0.02％最终浓度)和AEBSF(10μM最终浓度)。最终蛋白质浓度为约5mg/ml。

使大鼠-小鼠5811Fab抗体在CHO SXE中表达为经His标记的实体并且通过His标签亲和色谱从上清液纯化，使该蛋白质与来自上清液的HisTrap Excel(GE Healthcare)结合并且用PBS中的250mM咪唑洗脱。将洗脱库装载于HiTrap GammaBind Plus Sepharose(GEHealthcare)上，柱用PBS洗涤并且蛋白质用0.1M甘氨酸-HCl pH 2.6洗脱，并且用0.75M磷酸钠pH 9将pH值调节至pH 6。在HiPrep 26/10去盐柱上将洗脱的Fab-His蛋白质缓冲液交换于NMR缓冲液(25mM磷酸钠pH 6.4,100mMNaCl)中。浓缩Fab-His蛋白质级分并且添加蛋白酶抑制剂AEBSF(10μM最终浓度)和叠氮化钠(0.02％最终浓度)，之后在Millex GV 0.22μm过滤器上进行过滤器灭菌。

使用抗体的Fab片段，使用异核核磁共振(NMR)光谱分析测定具有SEQ ID NO.:9的VL和SEQ ID NO.:10的VH的抗体5811的表位结合。

α突触核蛋白的主链分配

NMR样品通常体积为350μl，在5mm Shigemi试管中蛋白质浓度为360μM ¹³C/¹⁵N标记或430μM ²H/¹³C/¹⁵N标记的人α突触核蛋白。缓冲条件为100mMNaCl、25mM磷酸钠pH 6.4、10μM AEBSF、0.02％NaN₃。所有实验均在20℃、在装配有低温冷却探针的600MHz BrukerAVIII或800MHz Bruker AVII光谱仪上记录。蛋白质中残基的主链NMR信号之间的顺序连接H_N(i)-N(i)-N(i±1)使用3D(H)N(CA)NNH实验(Weisemann等人.,1993 3D Triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15Nresonances in 15N-and 13C-labelled proteins.J.Biomol.NMR 3)进行，该实验分别记录28、28和10ppm的谱宽和在¹⁵N、¹⁵N和¹H维度中117(F1)、117(F2)和140(F3)ms的获取时间，每个增量8次扫描和1.5s松弛延迟。非均一取样在10％(40000个超复数点中的4000个)的取样密度下使用，得到2.75天的总获取时间。使用TROSY-HNCA(Grzesiek and Bax,1992Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31kDaprotein.J.Magn.Reson.96,432–440；Salzmann等人,1998.TROSY in triple-resonanceexperiments:new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95,13585-90)和TROSY-HNCACB(Wittekind and Mueller,1993HNCACB,a High-Sensitivity 3D NMR Experiment to Correlate Amide-Proton andNitrogen Resonances with the Alpha-and Beta-Carbon Resonances inProteins.J.Magn.Reson.Ser.B 101,201–205；Salzmann等人,1999.TROSY-type TripleResonance Experiments for Sequential NMR Assignment of LargeProteins.J.Am.Chem.Soc.121,844-848)实验证实顺序连接并且鉴别残基类型。TROSY-HNCA实验在¹³C、¹⁵N和¹H维度中分别利用23、28、10ppm的谱宽和12.1(F1)、21.7(F2)和100(F3)ms的获取时间记录(每个增量8次扫描，1.5秒松弛延迟，1天总获取时间)，而TROSY-HNCACB在¹³C、¹⁵N和¹H维度中分别利用56、28和10ppm的谱宽和8.2(F1)、21.7(F2)和100(F3)ms的获取时间记录(每个增量8次扫描，1.5秒松弛延迟，1.7天总获取时间)。主链羰基赋值获自TROSY-HNCO光谱(Grzesiek and Bax,1992Improved 3D triple-resonance NMRtechniques applied to a 31kDa protein.J.Magn.Reson.96,432–440；Salzmann等人,1998.TROSY in triple-resonance experiments:new perspectives for sequentialNMR assignment of large proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95,13585-90)，该TROSY-HNCO光谱在¹³C、¹⁵N和¹H维度中分别利用10、29、10ppm的谱宽和80(F1)、21.7(F2)和150(F3)ms的获取时间记录(每个增量8次扫描和1.5s松弛延迟)。非均一取样像在15％(8050个超复数点中的1208个)的取样密度下使用，得到19小时的总获取时间。NMR光谱使用NMRPipe(Delaglio等人.,1995NMRPipe:a multidimensional spectral processing systembased on UNIX pipes.J.Biomol.NMR 6,277–93)处理，其中使用线性预测将氮气中的有效获取时间延长高达1倍。使用Harvard迭代软阈值法(Hyberts等人.,2012Application ofiterative soft thresholding for fast reconstruction of NMR data non-uniformlysampled with multidimensional Poisson Gap scheduling.J Biomol NMR 52,315-27)重构非均一取样数据，其中数据经重构为下一傅里叶数，将间接获取时间提高高达60％。使用Sparky(Goddard and Kneller,D.G.SPARKY 3.In.,University of California,SanFrancisco)进行数据分析，从而得到133个残基(对应于99％残基(不包括脯氨酸残基和N端甲硫氨酸))的酰胺质子和氮共振的赋值。α突触核蛋白的唯一未赋值的另一残基是位置2处的天冬氨酸。

定位抗体5811Fab的片段的结合位点

使用含有10％摩尔过量的未经标记的5811Fab的经²H/¹³C/¹⁵N标记的人α突触核蛋白的150μM样品进行5811的结合位点的定位。在如上文针对α突触核蛋白的主链分配所述相同的缓冲液中制备样品。¹H、¹⁵N和¹³C化学位移变化通过比较在α突触核蛋白/Fab复合物上记录的TROSY-HNCO(Grzesiek and Bax,1992Improved 3D triple-resonance NMRtechniques applied to a 31kDa protein.J.Magn.Reson.96,432–440；Salzmann等人,1998.TROSY in triple-resonance experiments:new perspectives for sequentialNMR assignment of large proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95,13585-90)光谱与在游离α突触核蛋白上记录的等效对照光谱来测定。游离α突触核蛋白的对照TROSY-HNCO实验像在¹³C、¹⁵N和¹H维度中分别利用10、28和10ppm的谱宽和80(F1)、21.7(F2)和150(F3)ms的获取时间记录(每个增量16次扫描，1.4s松弛延迟)。非均一取样(NUS)像在25％(8050个超复数点中的2013个)的取样密度下使用，得到2.5天的总获取时间。α突触核蛋白/Fab复合物的TROSY-HNCO实验在¹³C、¹⁵N和¹H维度中分别利用10、28和10ppm的谱宽和80(F1)、21.7(F2)和80(F3)ms的获取时间记录(每个增量32次扫描，1.5s松弛延迟)。非均一取样在25％(4477个超复数点中的l119个)的取样密度下使用，得到2.8天的总获取时间。使用NMRPipe(Delaglio等人.,1995NMRPipe:a multidimensional spectral processing systembased on UNIX pipes.J.Biomol.NMR 6,277–93)处理NMR光谱，并使用mddnmr(Orekhovand Jaravine,2011.Analysis of non-uniformly sampled spectra with Multi-Dimensional Decomposition.Prog.Nucl.Magn.Reson.Spectrosc.,59,p 271-292)进行NUS数据的重构。在数据重构过程中，氮维度的有效获取时间增加高达1倍。

使用最小位移法(Williamson等人.,1997Mapping the binding site formatrix metalloproteinase on the N-terminal domain of the tissue inhibitor ofmetalloproteinases-2by NMR chemical shift perturbation.Biochemistry 36,13882–9)分析化学位移变化，基本上如先前所述(Veverka等人.,2008Structuralcharacterization of the interaction of mTOR with phosphatidic acid and anovel class of inhibitor:compelling evidence for a central role of the FRBdomain in small molecule-mediated regulation of mTOR.Oncogene 27,585–95)，但对用于计算组合化学位移变化(Δδ)的方程进行了修改，以包括羰基化学位移，得出以下方程：

其中Δδ_HN、Δδ_N和Δδ_C分别是¹H、¹⁵N和¹³C化学位移的差。αN和αC分别对应于0.2和0.35的比例因子，用于考虑酰胺质子、氮和羰基化学位移的化学位移范围的差异。

为了鉴定α突触核蛋白上的Fab结合位点(表位)，使用组合的最小位移相对蛋白质序列的直方图来揭示包含明显扰动信号的α突触核蛋白的区域。如果个别氨基酸的组合化学位移变化的大小超过所有氨基酸的组合化学位移变化平均值的阈值加一个相对于该平均值的标准偏差，则选择这些残基作为Fab结合位点中的可能接触残基以便进一步评价。

显著扰动残基鉴别为最小位移至少大于所计算所有位移的平均值加一个标准偏差的残基。应用四种不同阈值鉴别Fab所结合的残基。涉及结合位点的残基依据递增的严格度如下评分：最小位移超过所计算所有位移的平均值加一个标准偏差的残基(＞0.025574)；最小位移超过所计算所有位移的平均值加两个标准偏差的残基(＞0.042552)；最小位移超过所计算所有位移的平均值加三个标准偏差的残基(＞0.059530)；最小位移超过所计算所有位移的平均值加四个标准偏差的残基(＞0.076508)。在此分析中，脯氨酸残基由于其不含酰胺质子而未能鉴别。

5811Fab的α突触核蛋白表位因此依据递增的严格度定义为所计算所有位移的平均值加一个标准偏差：E114,D115,V118,D119,D121,N122,E123,A124,Y125,E126,M127,S129,Q134,D135和Y136；所计算所有位移的平均值加两个标准偏差：V118,D119,D121,N122,Y125,M127,D135和Y136；所计算所有位移的平均值加三个标准偏差：V118,D119,D121,N122,M127,D135和Y136；相对于所计算所有位移的平均值加四个标准偏差无残基位移。

使用用于NCBI参考序列NP_000336.1的氨基酸编号，发现5811Fab结合至少以下α突触核蛋白残基(平均值+3SD)：V118,D119,D121,N122,Y125,M127,D135和Y136。抗体还可结合所有以下残基(平均值+1SD)：E114,D115,V118,D119,D121,N122,E123,A124,Y125,E126,M127,S129,Q134,D135和Y136。

如图4B中所示，在与5811mFab结合时，dCN人α突触核蛋白的NMR化学位移发生变化。5811mFab的预测表位表达似乎在人α突触核蛋白(SEQ ID NO:8)的氨基酸114和136内包含残基。

肽作图

与抗体5811mFab结合的表位的进一步表征通过使用代表人α突触核蛋白并且覆盖人α突触核蛋白的C端区域的短(通常为9聚体或10聚体)肽进行。这些用于竞争性表面等离子体共振测定以确定任一种是否能够抑制抗体与固定在Biacore芯片上的单体α突触核蛋白或预成型α突触核蛋白原纤维的结合。随后选择显示最大抑制水平的肽以进行与抗体的共同结晶研究以便证实准确的表位。

肽由Peptide Protein Research Ltd.,Bishop’s Waltham,U.K.供应并且通过Fmoc固相肽化学根据Atherton和Sheppard的方法合成。(参考文献：Atherton,E.；Sheppard,R.C.(1989).Solid Phase peptide synthesis:a practicalapproach.Oxford,England:IRL Press)。N和C肽端分别用乙酰基和酰胺基封端，不同之处在于在表示α突触核蛋白的N端和C端的肽的情况下，其中胺基和羧基分别保持游离。以10mM在DMSO中制备肽储备溶液。肽的完整列表示于表3中。

表3

使用Biacore 3000仪器(GE Healthcare)将重组人α突触核蛋白单体和预成型α突触核蛋白原纤维固定在CMS芯片上。在通过以10μl/min的作为运行缓冲液的HBS-EP(GEHealthcare)的流动速率注射100μl 50mMN-羟基丁二酰亚胺与200mM1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亚胺的新鲜1:1(v/v)混合物来活化羧甲基葡聚糖表面之后，通过在单独的流动池上注射在10mM乙酸盐pH 5.0中的5μM的100μl单体和原纤维来实现偶联。参考流动池以相同方式活化并且随后所有流动池表面以1M乙醇胺.HCl pH 8.5的50μl脉冲去活化。

肽溶液以100μM在运行缓冲液中制备并且肽空白对照制备为在运行缓冲液中1/100的DMSO的稀释液。在运行缓冲液中以50.5nM制备5811mFab的溶液，之后与2μl空白对照或稀释肽一起预孵育198μl以得到50nM Fab与1μM肽或对照的最终混合物。通过以10μl/min注射30μl混合物并且在注射结束前5秒记录报导点来记录各样品的传感图。通过注射两次10μl 40mMHCI和一次5mMNaOH在每次循环结束时重新产生芯片。使对照循环与肽循环交替进行。

各种肽的抑制程度经计算为与相邻对照循环的平均值的响应单元相比在报导点处所测量的响应单元的百分比变化。

每个α突触核蛋白肽的抑制水平显示于图5中。仅针对C端肽AS113-122、AS115-124、AS117-126和AS119-128观察到5811mFab对α突触核蛋白单体或原纤维的显著抑制，其中对任一形式的α突触核蛋白的抑制的水平极其类似。对肽AS117-126观察到最强抑制水平，对于与单体和原纤维的结合的抑制分别为81％和90％。以上四种肽中的共有残基是119至122，其因此包含表位的部分。因为对肽AS113-122和AS119-128而言抑制水平降至仅2至5％，所以残基115至118和123至124还必须包含表位的部分。

此研究的结果表明抗体5811的表位包含残基115至124(DMPVDPDNEA)。

丙氨酸扫描

根据制造商说明在Expi293系统(Thermo Fisher Scientific)中制备和表达人α突触核蛋白(His标记)的单一氨基酸突变体。丙氨酸残基置于位置118至128处，例外之处在于残基124，其已经是丙氨酸并且被改变为丝氨酸(表4)。从上清液纯化突变蛋白质，该上清液在离心(4200rpm,2小时)接着无菌过滤(Stericup,Millipore)之后获得。将上清液装载于用25mM磷酸钠和500mMNaCl预平衡和洗涤的HisTrap Excel柱(GE Healthcare)上。在相同缓冲液中用咪唑的梯度洗脱结合的蛋白质直至500mM。具有感兴趣的蛋白质的级分通过NuPage凝胶电泳鉴别，合并，使用Centriprep 10kDa MWCO(Millipore)浓缩并且在PD-10柱上缓冲液交换于PBS中。使用Ultracel 3KDa MWCO离心旋转浓缩器(Millipore)浓缩蛋白质级分。使浓缩物穿过0.22mM灭菌过滤器(Millex GV,Millipore)并且储存于-20℃下。以与野生型人α突触核蛋白类似的量表达所有突变体(图6A)。

表4

在4-12％Bis/Tris NuPage凝胶上，使用1μg/蛋白质/泳道分析人α突触核蛋白的突变体并且印迹到PVDF膜(iBlot mini stack,Thermo Fisher Scientific)上。印迹在封闭缓冲液(磷酸盐缓冲盐水PBS中的3％牛血清白蛋白，0.1％Tween20)中封闭并且与抗体5811mFab或抗体5811mIgG1一起孵育。在室温下孵育1小时之后，用PBS中的0.1％Tween洗涤印迹。将印迹与第二检测抗体抗小鼠IgG Fc HRP缀合物(AB5879,Abcam)在封闭缓冲液中孵育1小时，洗涤并且在添加ECL蛋白质印迹底物(Pierce)之后检测化学发光。

如图6B和6C中所示，抗体5811mFab和5811mIgG1未识别对应于人α突触核蛋白D119A、N122A和Y125A的3种突变体。此分析表明，人α突触核蛋白中的这些氨基酸对于抗体5811mFab和5811mIgG1与人α突触核蛋白的结合而言是必需的。

实施例4：抗体人源化

通过将来自大鼠V区的CDR移植至人种系抗体V区框架上以使大鼠抗体5811人源化。为了恢复抗体活性，来自大鼠V区的许多框架残基还保留于人源化序列中。使用Adair等人(WO91/09967)概述的方案选择这些残基。大鼠抗体(供体)V区序列与人种系(受体)v区序列的比对以及所设计的人源化序列显示于图7和图8中。从供体移植至受体序列的CDR如Kabat(Kabat等人，1987)所定义，但其中使用组合的Chothia/Kabat定义的CDR-H1除外(参见Adair等人，1991Humanized antibodies.WO91/09967)。

通过DNA2.0 Inc.的自动化合成方法，设计并且构建编码多个变体重链和轻链V区序列的基因。通过寡核苷酸引导的诱变(在一些情况下包括在CDR内的突变)修饰VH和VK基因产生重链和轻链V区的其他变体。为了短暂表达于哺乳动物细胞中，将人源化轻链V区基因克隆到人UCB轻链表达载体pMhCK中，该表达载体含有编码人κ链恒定区的DNA(Km3同种异型)。将人源化重链V区基因克隆到人UCB人γ-4重链表达载体pMhγ4PFL中，该表达载体含有编码具有铰链稳定化突变S241P的人γ-4重链恒定区的DNA(Angal等人，Mol.Immunol.1993,30(1):105-8)。还类似地制备嵌合大鼠-人5811抗体(包含SEQ ID NO:9和10)。通过使用ExpiFectamine^TM293转染剂(A 14525,Thermo Fisher Scientific)将所得重链和轻链载体共同转染于Expi293^TM悬浮细胞中，并且提供人源化重组抗体以人IgG4P或Fab-HIS形式的表达。

选择人V区IGKV1-39与JK1 J-区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体5811轻链CDR的受体。移植物gL5、gL8和gL14中的轻链框架残基皆来自人种系基因，例外是残基71(参考SEQ ID NO:13)，其中保留了供体残基酪氨酸(Y71)。移植物gL14的CDRL3中的残基94由甘氨酸(G)突变成丙氨酸(A)残基，因此修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点。

选择人V区IGHV3-15与JH3 J-区(IMGT,http://www.imgt.org/)作为抗体5811的重链CDR的受体。移植物gH4中的重链框架残基皆来自人种系基因，例外是残基49和100(参考SEQ ID NO:25)，其中分别保留了供体残基丙氨酸(A49)和丙氨酸(A100)。

表达变体人源化抗体链及其组合并且评估其效力(相对于亲本抗体)、其生物物理学特性和用于下游处理的合适性。

如表5中所示，所有移植物均保留与亲本大鼠-人抗体对呈原纤维形式的α突触核蛋白的亲和力相同或相似的亲和力。

表5

实施例5：免疫组织化学

通过Asterand Bioscience(Royston,United Kingdoms)进行免疫组织化学。在自动加热和冷却下，使用Dako PT Link和EnVision FLEX靶修复溶液(pH 6)在97℃下使冷冻切片(10μm)首先进行抗原修复程序，持续20min。所有后续孵育步骤均在室温下进行。冷冻切片经风干30分钟，在于1×PBS中制备的4％多聚甲醛中固定10分钟，在DakoEnVision^TMFLEX洗涤缓冲液(Dako)中洗涤并且随后装载于Dako Autostainer Plus中。通过使切片与Dako过氧化物酶封闭剂(Dako)一起孵育5分钟来封闭内源性过氧化物酶活性。随后用1×PBS将切片洗涤两次，之后与Dako CSA II蛋白质封闭剂(Dako)一起孵育10分钟。通过喷气移除蛋白质封闭溶液并且使切片与在Dako抗体稀释剂(Dako)中稀释(0.05μg/ml)的5811大鼠-小鼠IgG1抗体(包含SEQ ID NO:34和35)一起孵育30分钟。在孵育之后，切片用1×PBS洗涤两次，随后与抗小鼠Dako Flex聚合物-HRP底物(Dako)一起孵育20分钟，洗涤两次并且随后与二氨基联苯胺底物(Dako)一起孵育10分钟。通过以蒸馏水冲洗载玻片停止显色反应。在色素形成之后，从Dako Autostainer Plus移出切片并且用苏木精对其人工复染，在递增系列的乙醇中脱水，并在更换三次的二甲苯中澄清并且滑动加上盖玻片处于DPX封固剂(Sigma-Aldrich)下。使用Aperio ScanScope AT Turbo系统(Leica Biosystems)获得染色切片的数字图像。在来源于五种不同的pS129-α突触核蛋白-阳性和三种不同的pS129-α突触核蛋白-阴性供体的脑切片(1个切片/供体)上测试抗体5811mIgG1。抗体5811mIgG1标记PD患者的颞叶皮质和黑质中的神经纤维网和偶发性路易体样特征(图9A-E)。在非PD脑组织中，抗体5811mIgG1标记颞叶皮质中的神经纤维网，但在皮质或黑质中未观察到路易体样结构(图9F-H)。这些观察结果表明，抗体5811mIgG1与来自PD和非PD患者的脑组织的神经纤维网中的正常α突触核蛋白结合，同时其与仅存在于PD患者中的路易体中的病理α突触核蛋白结合。

实施例6：人源化抗体的表征

测试三种Ab5811人源化IgG4P抗体(5811gL5gH4；5811gL8gH4 5811gL14gH4；表1中的序列)以测定其生物化学和生物物理学特征，包括热稳定性(T_m)、实验pI、疏水性、溶解度(PEG沉淀测定)、空气/液体界面处的聚集稳定性和相对于Asn93对CDR-L3的脱酰胺倾向的化学稳定性(5811gL14gH4具有N(93)A基序并且5811gL8gH4和gL5gH4两者具有N(93)G基序)。

热稳定性(T_m)测量

使用Thermofluor测定来测定熔融温度(Tm)或解折叠中点时的温度。在此方法中，使用荧光染料SYPRO橙通过与随着温度升高而暴露的疏水区域的结合来监测蛋白质解折叠过程。

反应混合物含有5μl 30x

橙色染料(Invitrogen^TM),用PBS从5000X储备溶液和45μl的0.12mg/ml样品(于PBS中，pH 7.4)稀释。将约10μl混合物一式四份分配于384PCR光学孔板中并且在7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems^TM)上运行。PCR系统加热装置设定于20℃至99℃，升高速率为1.1℃/min。电荷耦合装置监测孔中的荧光变化。对强度增加作图，并且利用斜率拐点计算T_m，如下文所述。在PBS pH7.4和50mM醋酸钠/125mM氯化钠pH 5.0(常见的预配制缓冲液)中获得各种抗体分子的T_m。

全部三种人源化抗体的热稳定性示于表6中。在PBS pH7.4中观察到一次转变并且这归因于CH₂和Fab结构域解折叠。在50mM醋酸钠/125mM氯化钠pH 5.0中，观察到两次转变。较低的T_m归因于CH₂解折叠结构域并且第二次转变归因于Fab结构域。根据此分析，抗体5811gL8gH4和5811gL5gH4具有相当的热稳定性，而抗体5811gL14gH4的热稳定性仅略低。

表6

实验pI

使用全毛细管成像cIEF iCE3 ^TM系统(Protein Simple)获得5811gL14gH4、5811gL8gH4和5811gL5gH4的实验pI。通过混合以下来制备样品：30μl样品(来自HPLC级水中的1mg/ml储备液)、35μl 1％甲基纤维素溶液(Protein Simple)、4μl pH 3-10两性电解质(Pharmalyte)、0.5μl 4.65合成pI标记物和0.5μl 9.77合成pI标记物(ProteinSimple)、12.5μl 8M尿溶液

使用HPLC级水将最终体积补足至100μL。将混合物简单涡旋以确保完全混合并且在分析前以10,000rpm离心3分钟以移除气泡。将样品在1.5kV下聚焦1min，随后在3kV下5min，并且使用ProteinSimple软件获取毛细管的A280图像。所得电泳图首先使用iCE3软件分析并且给pI值赋值(pI标志物之间的线性关系)。经校准的电泳图随后使用

软件(Waters)整合。

所有分子的实验pI皆在8.80-9.23范围内，其中主要物质处于9.09。对于IgG4P分子典型的酸性/碱性物质分布不存在差异。实验pI较高并且因此有助于抗体的制造过程。

疏水相互作用色谱(HIC)

通过疏水相互作用色谱(HIC)测定人源化抗体5811gL14gH4、5811gL8gH4和5811gL5gH4的疏水性行为。在HIC中，抗体在高浓度的极性盐的存在下结合于疏水性固定相并且随着盐浓度降低而解吸附到移动相中。较长的滞留时间等效于较高的疏水性。

使用1.6M硫酸铵和PBS(pH 7.4)按1:2稀释2mg/mL抗体样品。将5μg(10μL)样品注射于与具有荧光检测器的Agilent 1200二元HPLC串联连接的Dionex ProPac^TM HIC-10柱(100mm×4.6mm)上。通过内源荧光(激发和发射波长分别为280nm和340nm)监测分离。

使用缓冲液A(0.8M硫酸铵，100mM磷酸盐pH 7.4)和缓冲液B(100mM磷酸盐pH7.4)，使用如下梯度洗脱分析样品：(i)在0％B下保持2分钟，(ii)从0至100％B的线性梯度持续30分钟(0.8毫升/分钟)(iii)柱用100％B洗涤2分钟并且在0％B中重新平衡10分钟，之后进行下一次样品注射。将柱温度维持在20℃。还按相同运行顺序分析展现低和高疏水性的标准物以及对照以使滞留时间标准化。使用以下等式针对低疏水性和高疏水性标准物标准化样品的滞留时间(RT)：

[(样品(RT)-低标准物(RT)/高标准物(RT)-低标准物(RT)]x 100

全部三种抗体5811gL14gH4、5811gL8gH4和5811gL5gH4显示类似的标准化滞留时间和类似的低疏水性，即，从柱的洗脱少于5分钟(参见表7)。低疏水性在制造期间有助于稳定性(即减少聚集)。

表7

抗体(主要峰)	滞留时间(min)	标准化滞留时间(min)
			5811gL14gH4	4.7	2.9
5811gL8gH4	4.7	2.9
			5811gL5gH4	4.6	2.0

使用聚乙二醇(PEG)沉淀测定进行溶解度测量

使用聚乙二醇(PEG)沉淀分析分析人源化抗体5811gL14gH4、5811gL8gH4和5811gL5gH4的胶体稳定性。通过提高PEG的浓度(w/v)并且测量在溶液中剩余的蛋白质量，使用PEG以数量上可定义的方式降低蛋白质溶解度。此测定用于在不使用常规浓度方法下模仿高浓度溶解度的效果。

在PBS pH 7.4和50mM醋酸钠/125mM氯化钠pH 5.0中的7-18％PEG-3350的存在下研究人源化抗体5811gL14gH4、5811gL8gH4和5811gL5gH4的PEG诱导的沉淀。使用透析对抗体样品进行缓冲液交换并且将浓度调节至2mg/mL。为了将非平衡沉淀降至最少，样品制剂由混合的2×蛋白质和2×PEG溶液以1:1体积比组成。在混合之后，将样品在37℃下孵育30分钟以重新溶解非平衡聚集体。在20℃下过夜孵育之后，使样品离心60min(4000g)。将上清液的等分试样转移至一半体积的96孔光学培养板并且使用板读取器BMG Labtech FLU

Omega LVIS A280来测量280nm下的吸光度。将浓度数据相对于PEG％作图，并且计算的中点(LogEC50)(从非线性回归曲线拟合、可变斜率产生)作为样品的相对胶体溶解度的测量。在此测定中，较高LogEC50等效于较高胶体稳定性。

如表8中所示，观察到三种不同抗体之间的胶体稳定性无差异。如通过较大logEC50值所显示，在醋酸盐pH 5缓冲液中观察到较大胶体稳定性。

表8

空气-液体界面处的应力的影响(聚集测定)

此测定用于模仿在制造(例如超过滤)期间抗体将经受的应力。诸如抗体的蛋白质倾向于在暴露于空气-液体界面时解折叠，其中向疏水性环境(空气)呈现疏水性表面并且向亲水性环境(水)呈现亲水性表面。搅拌蛋白质溶液实现可驱动聚集的较大空气-液体界面。

使用Eppendorf恒温混匀仪Comfort^TM通过涡旋对PBS pH7.4和50mM醋酸钠/125mM氯化钠pH 5.0中的抗体5811gL14gH4、5811gL8gH4和5811gL5gH4的样品加压。在涡旋之前，使用合适的吸光度系数(1.41Ab 280nm,1mg/mL,1cm路径长度)将浓度调节至1mg/mL并且使用Varian

50-Bio分光光度计获得280nm、340nm和595nm下的吸光度以建立零时间读数。将各样品等分于1.5mL圆锥形

型带帽试管(4×250μL)中并且经受严格条件以便通过在1400rpm下在25℃下涡旋直至24小时来测试稳固性。使用VarianCary^TM50-Bio分光光度计，通过在595nm下涡旋24小时后测量样品来监测时间依赖性聚集(浊度)。针对各样品相对于时间绘制平均吸光度值。

抗体分子5811gL5gH4相比于5811gL14gH4和5811gL8gH4展现较大的聚集稳定性。所有抗体在PBS pH7.4中均显示较大的聚集稳定性。

化学稳定性-脱酰胺应力研究

全部三种抗体进行加速应力研究：5811gL5gH4、5811gL8gH4和5811gL14gH4，以用于测定一个鉴别的潜在位点的脱酰胺倾向：CDR3的轻链中的Asn(93)，其中5811gL14gH4具有Asn(93)Ala基序并且5811gL8gH4和gL5gH4两者具有Asn(93)Gly基序。

三种抗体经受已知促进Asn(N)残基的脱酰胺的条件(50mMTris/125mM氯化钠pH8.0/37℃)。另外，还在作为对照条件的50mM醋酸钠/125mM氯化钠pH 5.0中制备样品以测定加压之前的基础脱酰胺。将每种缓冲液中的样品的最终浓度调节至约5mg/mL并且随后分成两种等分试样，其中一种储存于4℃下并且另一种储存于37℃下最多5周。立即(T0)和在第2周和第5周移除等分试样并且储存于-20℃下。

针对非加压样品(50mM醋酸钠/125mM氯化钠pH 5/4℃)测量残基Asn(93)处的基础脱酰胺并且使用2周/pH 8/37℃加压样品通过产生含有感兴趣的序列的胰蛋白酶肽获得Asn(93)的脱酰胺倾向。简言之，使用DTT还原80μg的各样品并且在37℃下用盐酸胍变性。样品随后在室温下用碘乙酰胺烷基化，之后缓冲液交换于7.5mM Tris/1.5mM CaCl₂ pH 7.9(Zeba^TM 7kDa MWCO旋转柱,Thermo Fisher)中并且在37℃下与胰蛋白酶(1:23w/w)一起孵育约3小时。通过添加三氟乙酸至0.1％v/v停止蛋白水解并且将样品储存于-20℃下。在解冻后，样品经离心以移除沉淀。

所得肽经分离并且在与Thermo Fusion^TM质谱仪接合的Waters BEH C 18柱上分析，该质谱仪执行利用碰撞诱导解离(CID)断裂的阳离子、数据依赖性轨道阱-轨道阱方法。使用Thermo Xcalibur^TM和Pepfinder^TM软件分析LC-MS和MS²数据。分析感兴趣的肽(LC N93-K102)以测定化学修饰的百分比。

肽图谱质谱分析显示，相比于5811gL8gH4和5811gL5gH4,5811gL14gH4的基础Asn(93)脱酰胺水平较低。未意料到分子之间的差异，因为已证实尽管脱酰胺倾向的预测较为困难，但Gly(G)残基之前的Asn(N)残基显示比更大Ala(A)残基之前的那些Asn(N)残基更大的脱酰胺倾向(Robinson,N.E.等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2001,98,4367-4372)。

对于全部三种抗体，在Asn(93)处观察到低脱酰胺速率，即，每周1.2％-1.4％。5811gL5gH4和5811gL8gH4的轻链N93-K102肽的质量差异包括-17Da修饰(可能中间产物丁二酰亚胺物质)和+1Da(在Asn(93)处的完全脱酰胺的产物)，而未观察到5811gL14gH4的丁二酰亚胺(表9)。

表9

对于所有抗体而盲，脱酰胺总体速率较低，但针对5811gL5gH4和5811gL8gH4观察到更多的异质性。

实施例7：基于细胞的聚集测定

在Freestyle 293表达培养基(Invitrogen^TM)中以0.7×10⁶个细胞/毫升制备HEKFreestyle 293F细胞(悬浮液细胞)并且培养至300×10⁶个细胞/毫升。根据制造商说明书进行转染并且简单地将并入α突触核蛋白基因的600μg pcDNA3.1(+)混入20ml OptiMEM培养基中，同时将293Fectin稀释于OptiMEM培养基(Invitrogen^TM)中并且在室温下孵育5分钟。添加经稀释的DNA并且在室温下孵育20分钟，之后逐滴添加于细胞上(每个烧瓶20ml)。在37℃、125rpm、8％CO₂下将细胞孵育24小时。立即使用细胞或以5×10⁶个细胞/毫升的浓度将细胞冷冻于FBS+10％DMSO中。

如果细胞先前已经冷冻，则将冷冻小瓶解冻并且将细胞再悬浮于Freestyle 293培养基中，在500g下离心5分钟，排出上清液并且将沉淀以2×10⁶个细胞/毫升再悬浮于Freestyle 293培养基(Life Technologies^TM)+Pen/Strep(Invitrogen^TM)中。在384孔板(Grainer^TM)中，添加20μl细胞悬浮液(总计约40,000个细胞/孔)。向各孔添加150nM的人α突触核蛋白原纤维(如本文中实施例1中所述制备)，之后添加PBS中的待测试抗体5811gL5gH4IgG4P、5811gL8gH4IgG4P和5811gL14gH4 IgG4P(表1中的序列)(各种浓度)。在细胞培养培养箱中，在37℃、5％CO₂、95％湿度下将培养板孵育2天。

在第二天结束时，从所有孔抽吸培养基并且洗涤板，剩余20μl/孔。向各孔添加约50μl的PBS并且在500g下将培养板离心5分钟。用板洗涤器从所有孔抽吸上清液，在各孔中剩余20μl的培养基。添加Versene(Lonza^TM)(50μl/孔)并且在500g下将培养板离心5分钟，抽吸上清液，每孔仅剩余20μl培养基。向各孔补充PBS中的20μl 8％甲醛(16％水溶液，LifeTechnologies^TM)+2％Triton X-100(VWR^TM)。使培养板在室温下孵育15分钟并且其后添加由HBSS(不含钙-镁的VWR^TM)+2％FBS+2mM EDTA(Life Technologies^TM)组成的50μl FACS缓冲液。使培养板在2000g下离心1分钟并且抽吸上清液，在各孔中仅剩下20μl培养基。各孔进一步补充含有按1:300稀释的抗pSer129α突触核蛋白抗体(AbCam^TM)的20μl FACS缓冲液。使培养板在室温下孵育1小时并且随后各孔补充50μl FACS缓冲液，之后再次在2000g下离心1分钟。移除上清液，之后各孔补充1:500稀释的Alexafluor647-缀合的抗兔-二抗(LifeTechnologies^TM)和DAPI(Life Technologies^TM)。使培养板在黑暗中在室温下孵育1小时，并且随后添加50μl FACS缓冲液并且在2000g下将培养板离心1分钟。在洗涤后，添加更多的FACS缓冲液并且备好培养板以置于流式细胞仪(BD FACS Canto II)中进行读数。

使用FlowJo软件分析FACS数据。首先，使用正向和侧面散射门控活的单细胞。其次，门控DAPI+事件并且将其数目用作活的有核单细胞的数目的测量。最后，门控磷丝氨酸129-α突触核蛋白-阳性(pSer129+)细胞。pSer129+细胞相对于所有DAPI+细胞的百分比用作聚集的测量。相对于仅用原纤维处理并且无抗体的孔使数据标准化，并且表示为百分比。将结果概括于图10中，所述结果显示所测试抗体抑制表达α突触核蛋白的细胞上由α突触核蛋白原纤维诱导的聚集的能力。这些数据证实根据本发明的抗体能够阻断由α突触核蛋白原纤维诱导的聚集，IC₅₀约为或低于5nM。

实施例8：原代神经元聚集测定

在剥离缓冲液(不含钙和镁、含0.6％D-(+)-葡萄糖、20mM Hepes的HBSS)中从E17小鼠胚胎剥离Hippocampi。随后移除剥离缓冲液并且由解离溶液(不含钙和镁、含0.6％D-(+)-葡萄糖、20mM HEPES、40U/m木瓜蛋白酶、1mg/ml DNase、1mML半胱氨酸、0.5mM EDTA的HBSS)替换。在37℃下孵育30分钟后，移除解离缓冲液并且用铺板培养基(Neurobasal^TM培养基，2％B27补充物，1mM GlutaMAX,2.5％FBS,50单位/毫升青霉素-链霉素)将hippocampi洗涤3次。用1ml移液管磨碎组织凝集块以获得单细胞悬浮液。在铺板培养基中将细胞稀释至合适浓度。将约15000个细胞铺板于涂布PDL的384孔板的各孔中。随后将细胞保持在细胞培养培养箱中，处于37℃、5％CO₂、95％湿度下。

次日，用不含FBS的铺板培养基(Neurobasal^TM培养基，2％B27补充剂，1mMGlutaMAX,50单位/毫升青霉素-链霉素)替换80％的培养基。在铺板7天之后，移除培养基，各孔中剩余20μl。向各孔添加100nM的人α突触核蛋白原纤维(如本文中实施例1中所述制备)，之后添加PBS中的待测试抗体5811gL5gH4 IgG4P、5811gL8gH4IgG4P和5811gL14gH4IgG4P(表1中的序列)(各种浓度)。在细胞培养培养箱中，在37℃、5％CO₂、95％湿度下将培养板孵育另外的7天。在铺板十四天之后，从所有孔抽吸培养基，每孔剩余20μl。各孔用80μlDulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)洗涤。移除DPBS，并且在每孔40μl的固定缓冲液(含4％多聚甲醛的DPBS)中孵育细胞，持续15分钟。随后移除固定缓冲液并且另外用80μl DPBS洗涤细胞。移除DPBS并且每孔用40μl渗透缓冲液(含0.1％Triton X-100的DPBS)替换。在10分钟之后，移除渗透缓冲液，并且在每孔40μl的封闭缓冲液(含1％BSA和0.1％Triton X-100的PBS)中将细胞孵育1小时。随后移除封闭缓冲液并且用40μl/孔的一抗溶液(含0.3％兔抗磷丝氨酸129α突触核蛋白抗体(AbCam^TMab51253)的封闭缓冲液)替换。使抗体溶液在细胞上孵育1h，之后洗涤三次(每次90μl,PBS)。在最后一次洗涤之后，移除PBS并且用40μl的二抗溶液(含0.2％AlexaFluor488缀合的抗β-III-微管蛋白抗体的PBS中的0.1％AlexaFluor647缀合的抗兔抗体)替换。使二抗溶液在细胞上孵育1h，随后移除并且用40μl的包含0.3％CellMask Blue^TM的PBS替换。在孵育5分钟之后，用80μl PBS将孔洗涤3次，随后每孔填充有50μl PBS，之后用透明塑料薄膜密封培养板。

在Arrayscan板成像器(ThermoFisher Scientific^TM)中使培养板成像。使用来自同一制造商的HCS Scan^TM软件分析图像。使用β-III-微管蛋白信号监测神经元密度。排除显示损坏的神经元细胞层的(一个或多个)稀疏场，其由β-III-微管蛋白信号的表面的显著减少反映。最后，使用每个场pSer129α突触核蛋白信号的表面来量化病理α突触核蛋白聚集。

据信α突触核蛋白的S129处的磷酸化在控制α突触核蛋白正常功能以及调节其聚集、LB形成和神经毒性中起重要作用。在正常条件下，仅一小部分的α突触核蛋白在大脑中在S129处组成性磷酸化(Fujiwara H,等人.(2002)Nat Cell Biol,4,160–164)，而在患有突触核蛋白病的患者的大脑中已观察到pS129的显著积聚(Kahle PJ,等人.(2000)Ann N YAcad Sci,920,33–41)；Okochi M,等人.(2000)J Biol Chem,275,390–397)；Anderson JP,等人.(2006)J Biol Chem,281,29739–29752)。

相对于仅用原纤维而未用抗体处理的孔使数据标准化，并且表示为百分比。如图11中所示，全部三种抗体抑制表达内源性水平的α突触核蛋白的小鼠原代神经元上的由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集。这些数据证实5811gL5gH4 IgG4P、5811gL8gH4IgG4P和5811gL14gH4 IgG4P抗体能够阻断小鼠原代神经元上由α突触核蛋白原纤维诱导的聚集，IC₅₀低于5nM。

实施例9：体内VR5811功效的评估

在表达人α突触核蛋白的α突触核蛋白基因敲除小鼠的转基因模型(其后命名为SNCA-OVX；Charles River,France)中测试抗体5811gL5gH4 IgG4P(包含SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:26并且下文简称为VR5811)。

用VR5811和小鼠预成型原纤维(PFF)(如本文实施例1中所述制备)注射SNCA-OVX小鼠。还与在最后九个C端残基处结合α突触核蛋白的比较抗α突触核蛋白抗体(比较C-端Ab)一起注射阴性对照抗体和媒介物。这样的比较抗体(其具有与根据本发明的抗体不同的CDR)显示与本发明的抗体的相当的结合特征。比较C端Ab抗体对α突触核蛋白的亲和力与本发明的抗体类似并且具有类似的生物物理特性。其在基于细胞的测定上还有效防止α突触核蛋白聚集(表10)。

表10

在室温下在摇动器上，使抗体与PFF一起预孵育30分钟，之后直接施用至动物的大脑中。以1μg PFF/10μg抗体的比率在PBS中制备抗体/PFF混合物。pH 7.4下的PBS用作媒介物溶液。在组合脑内施用24小时之前注射抗体。

随后以30mg/kg的剂量向小鼠腹膜内施用抗体。针对SNCA-OVX小鼠，在第一次注射后7天给予第二次腹膜内注射，并且随后用相同方案(对于10ml/kg的施用体积以30mg/kg的剂量一次腹膜内注射/周)实行，持续11周，总计12次注射。将小鼠随机分配给药物治疗组并且实验对治疗是不知情的。

根据European Directive 2010/63/EU和比利时法律的指导原则进行动物实验。来自UCB Biopharma SPRL(LA1220040和LA2220363)的动物实验的道德委员会批准了实验方案(ASYN-IC-PARKINSON-MO)。在手术时，小鼠重量在25与30g之间并且为17周龄。小鼠圈养于笼子(每个笼子4只小鼠，Macrolon 2型)中。使其保持在12:12光/暗循环下，光循环在06:00h开始。温度维持在20-21℃并且湿度约为40％。在分配至实验组之前，所有动物能够自由获取标准的颗粒饲料和水。在手术之前和之后提供另外的营养和福利(Enviro-dri,Pharma Serv)。由动物护理人员每日监测动物健康。尽力将痛苦降至最低。在麻醉下进行处死。

使用腹膜内注射的50mg/kg的氯胺酮(Nimatek,Eurovet Animal Health B.V.)和0.5mg/kg的美托咪定(Domitor,Orion Corporation)的混合物在全身麻醉下进行手术。另外，给予2.5mg/kg阿替美唑(Antisedan,Orion Corporation)以支持唤醒。重组的纯化PFF经解冻并且在室温下声处理(Qsonica 500-20kHz；65％功率，30脉冲，1s开，1s关，持续一分钟)。随后在脑注射之前，使PFF与抗体预混合30分钟并且在室温下摇晃30分钟。以0.2μl/min的速率输注溶液(2μl)并且将针头静置原地持续另外的2.5分钟然后将其缓慢抽出。在右侧纹状体中在以下坐标处进行单侧注射：AP＝+0.20mm,ML＝-2.00mm,DV＝-3.20mm。

在麻醉之后，通过使用含有10U/ml肝素的冰冷的0.9％PBS以6ml/min的流动速率经由左心室的经心灌注来灌注小鼠，持续9分钟。切割右心房作为流出路径。接着，以6ml/min的流动速率用PBS中的冰冷的4％多聚甲醛灌注动物，持续15分钟。之后将大脑在4℃下(第0天)在含有4％多聚甲醛的PBS中固定过夜。第二天上午(+1天)，舍弃4％多聚甲醛并且在冷PBS中洗涤大脑并且孵育过夜。次日(+2天)，在PBS中洗涤大脑，持续最少1小时并且转移至含有15％蔗糖的PBS并且储存于4℃下直至输送。

在Neuroscience Associates(TN,USA)进行脑剖切。首先，用20％甘油和2％二甲亚砜处理大脑过夜以防止冷冻-人工产物，并且使用

技术包埋于明胶基质中。在固化之后，通过浸没于用压碎的干冰冷却至-70℃的异戊烷中快速冷冻块状物，并且安放在AO860滑动式切片机的冷冻台上。在冠状平面中以40μm将

块切片。将所有切片顺序收集于24个容器/块中，所述容器填充有抗原保存溶液(49％PBS pH 7.0,50％乙二醇，1％聚乙烯吡咯烷酮)。将未染色的切片立即储存于-20℃。

自由浮动的切片通过免疫化学用以1：30,000稀释的pSer129α突触核蛋白抗体(小鼠抗α突触核蛋白(pSer129)生物素-(Wako-010-26481))染色。来自封闭血清的所有孵育溶液继续使用合Triton X-100的Tris缓冲盐水(TBS)作为媒介物；所有溶液均用TBS冲洗。内源性过氧化物酶活性通过0.9％过氧化氢处理阻断并且非特异性结合利用1.26％正常全血清阻断。在冲洗之后，在室温下用一抗将切片染色过夜。媒介物溶液含有0.3％Triton X-100用于渗透。在冲洗之后，使切片与抗生物素蛋白-生物素-HRP复合物(Vectastain EliteABC试剂盒，Vector Laboratories,Burlingame,CA)在室温下一起孵育一小时。在冲洗之后，切片用二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)和0.0015％过氧化氢处理以产生可见反应产物，安放在胶凝化(涂胶)玻璃载玻片上，风干，用硫堇轻微染色，在醇中脱水，在二甲苯中澄清，以及用Permount封盖。

使用每个场pSer129α突触核蛋白信号的pSer129α突触核蛋白信号的定量来量化纹状体、皮质、底外侧杏仁核和黑质的同侧侧面中的病理α突触核蛋白聚集。对感兴趣区域(ROI)人工绘出并且用VisioPharm 6软件(VisioPharm)进行不同脑区中的pSer129α突触核蛋白信号的自动定量。为量化pSer129α突触核蛋白信号，使用线性贝叶斯算法(Bayesianalgorithm)，其提供信号区域(以μm2为单位的标记区域)的值。标记区域反映覆盖不同脑区的pSer129α突触核蛋白病变的量。以不知情方式进行所有定量直至统计分析结束。

针对标记区域％(即以μm²为单位的pSer129信号区域与以μm²为单位的感兴趣区域之间的比率)进行数据分析。对头端-尾端安置的多个脑切片重复测定标记区域％(纹状体：来自前囱+1.1至-0.94的13-14个切片；皮质：来自+1.1至-0.94的13-14个切片；底外侧杏仁核：-0.58与-2.06之间的6-10个切片；黑质：来自-2.54至-3.88的6-8个切片)，并且针对每个测试受试者分别计算AUC。

考虑单向ANOVA用于统计分析。ANOVA之后为在不进行任何多重性调节下在平均值之间的多个成对比较。(＊＊对应p<0.01并且＊对应p<0.05)。数据经对数变换以满足常态和同方差性准则。图表示未转化的数据的几何平均数。

如图12中所示，在向SNCA-OVX小鼠施用PFF 3个月之后，VR5811抗体明显减少包括纹状体、大脑皮质、杏仁核和黑质的不同脑区中的α突触核蛋白病变(即pSer129α突触核蛋白信号)。

阴性对照抗体和比较C端抗体显示与利用相同的人PFF注射的经媒介物处理的小鼠相比，在减少α突触核蛋白病变(pSer129α突触核蛋白信号)方面无作用。

图13显示在SNCA-OVX小鼠中分析的每一个脑区中的Ser129处磷酸化的α突触核蛋白的量化。结果证实与三个对照组(即媒介物、101.4和比较C端Ab)相比，VR5811显著(p<0.05)降低包括纹状体、大脑皮质和黑质的同侧侧面的不同脑区中的α突触核蛋白病变。

因此，在SNCA-OVX小鼠中测试时，用5811处理的组显示在三种不同结构中以及在远离注射部位的两个区域(大脑皮质和黑质)的那些结构中显著降低的pSer129α突触核蛋白水平。

此证实包含本发明的结构特征的抗体能够防止在体内出现在Ser129处磷酸化的α突触核蛋白。此外，结果显示并非全部结合C端区域中的a-syn的抗体均在体内有效：在基于细胞的测定中以高亲和力结合a-syn的C端并且有效防止a-syn聚集的比较抗体未能在体内防止Ser129磷酸化。

因此，根据本发明的抗体可用于治疗特征为Ser129磷酸化增加的α突触核蛋白病，包括帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)。

实施例10：小鼠中抗体5811的药代动力学

利用抗体5811gL14gH4 IgG4P(5811)以2mg/kg的单次剂量静脉内注射雄性C57/Bl6小鼠(每种药物n＝3)。

从尾部静脉取得血液样品(从注射0.083、1、4、8、24、72、120、168和336小时)并且使其在室温下凝结。在离心之后分离血清，随后使血清冷冻直至分析。通过LC-MS/MS进行5811抗体的量化。研究中的血清样品经解冻并且针对使用以不同浓度掺入对照小鼠血清中的5811抗体制备的校准线定量。在将样品注射于LC-MS/MS系统上之前，血清经变性、还原并且分别使用乙腈(VWR,UK)、TCEP-Tris(2-羧乙基)磷化氢盐酸盐(Sigma,UK)和碘乙酰胺(Sigma,UK)烷基化。经烷基化的样品随后在100mM碳酸氢二铵缓冲液(Sigma,UK)中重构并且在37℃下使用胰蛋白酶(Promega,UK)消化过夜。通过向样品添加甲酸以降低pH值来停止消化并且随后使用Waters HLB SPE板去盐。使用真空蒸发器蒸发所得洗脱剂。在将样品完全干燥之后，用含有0.1％甲酸的95/5：水/乙腈重构样品并且注射于LC-MS/MS系统上。通过偶联至AB Sciex QTrap 6500三重四极质谱仪的Schimadzu prominence HPLC系统进行LC-MS/MS分析。通过自动取样器将消化样品注射于逆相高效液相色谱柱(Phenomenex AerisC18肽柱100×2.1mm,2.6μm)上，该柱维持在50℃下。将0.1％甲酸中的5-70％乙腈的线性梯度施用6分钟并且随后以0.6ml/min的流动速率在0.8分钟内逐渐升至0.1％甲酸中的95％乙腈。设定质谱仪以进行多个反应监测分析，从而以50毫秒/转变的停留时间检测5811的肽的多个转变。使用Analyst 1.6软件版本进行数据分析。

这些数据显示，基于所测量的低清除值，抗体5811在小鼠中具有极好的药代动力学特性(表11和图14)。这些呈现出优于针对给药至小鼠的人IgG药物所引用的典型范围(3-16ml/天/kg；Deng等人2011mabs 3:1 61-66)。

表11

序列表

<110> UCB Biopharma sprl

<120> 抗体

<130> PF0129-WO

<150> GB1720970.1

<151> 2017-12-15

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 1

Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn Leu Asp

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 2

Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 3

Tyr Gln Tyr Lys Asn Gly Trp Thr

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Asn Asn Ala Ala Met Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 5

Arg Ile Arg Thr Lys Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 6

Asp Tyr Ser Arg Gly Asp Arg

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L3变体1

<400> 7

Tyr Gln Tyr Lys Asn Ala Trp Thr

1 5

<210> 8

<211> 140

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 9

Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Val Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys His Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Met

35 40 45

Tyr Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Lys Asn Gly Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 10

Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Ala

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Asp Tyr Ser Arg Gly Asp Arg Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rat VL核苷酸

<400> 11

aacatccaga tgacccagtc tcctccagtc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60

ctcagctgca aagcaagtca gaacattaat aagaacttag actggtatca gcaaaagcat 120

ggagaagctc caaaactcct gatgtattat gcaaacaatt tacaaacggg catcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggaacagat tacacgctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatgttg ccacatatta ctgctatcag tataagaatg ggtggacgtt cggtggaggc 300

accaagctgg aactgaaa 318

<210> 12

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rat VH核苷酸

<400> 12

gaaatgcagc tggtggagtc tggtggagga ttggtgcagc ctaaggagtc attgaaaatc 60

tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat aatgctgcca tgtactgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg gtctggaatg ggttgctcgc ataagaacta aacctaataa ttatgcaaca 180

tcttatgctg attcagtgaa aggcagattc accatctcca gagatgattc aaaaagcatg 240

gtctacctac aaatggataa cttgaaaagt gaggacacag ccatgtatta ctgtacagca 300

gattactcca gaggtgacag gtggggccaa ggagtcatgg tcacagtctc gagc 354

<210> 13

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL5可变区

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Lys Asn Gly Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL5轻链

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Lys Asn Gly Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 15

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL5可变区核苷酸

<400> 15

gacatccaga tgacccagag cccgagctcc ctgtccgcat cagtggggga tcgcgtgact 60

attacgtgca aagcctcgca gaacatcaac aagaacctcg actggtatca gcagaagcca 120

ggaaaggcgc ctaagctgct gatctactac gccaacaatc tccagaccgg cgtgccctcg 180

cggttctccg gatctgggtc cggtactgat tacaccctga ccattagctc ccttcaaccg 240

gaggacttcg ccacctatta ctgctaccag tacaagaacg gctggacttt tggacaaggc 300

accaaggtcg aaatcaag 318

<210> 16

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL5轻链核苷酸

<400> 16

gacatccaga tgacccagag cccgagctcc ctgtccgcat cagtggggga tcgcgtgact 60

attacgtgca aagcctcgca gaacatcaac aagaacctcg actggtatca gcagaagcca 120

ggaaaggcgc ctaagctgct gatctactac gccaacaatc tccagaccgg cgtgccctcg 180

cggttctccg gatctgggtc cggtactgat tacaccctga ccattagctc ccttcaaccg 240

gaggacttcg ccacctatta ctgctaccag tacaagaacg gctggacttt tggacaaggc 300

accaaggtcg aaatcaagcg tacggtggcc gctccctccg tgttcatctt cccaccctcc 360

gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420

cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 480

tccgtcaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 540

tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 600

tccagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgc 639

<210> 17

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL8可变区

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Lys Asn Gly Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL8轻链

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Lys Asn Gly Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811可变区核苷酸

<400> 19

gacatccaga tgacccagag cccgagctcc ctgtccgcat cagtggggga tcgcgtgact 60

attacgtgca aagcctcgca gaacatcaac aagaacctcg actggtatca gcagaagcca 120

ggaaaggcgc ctaagctgct gatctactac gccaacaatc tccagaccgg cgtgccctcg 180

cggttctccg gatctgggtc cggtactgat ttcaccctga ccattagctc ccttcaaccg 240

gaggacttcg ccacctatta ctgctaccag tacaagaacg gctggacttt tggacaaggc 300

accaaggtcg aaatcaag 318

<210> 20

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL8轻链核苷酸

<400> 20

gacatccaga tgacccagag cccgagctcc ctgtccgcat cagtggggga tcgcgtgact 60

attacgtgca aagcctcgca gaacatcaac aagaacctcg actggtatca gcagaagcca 120

ggaaaggcgc ctaagctgct gatctactac gccaacaatc tccagaccgg cgtgccctcg 180

cggttctccg gatctgggtc cggtactgat ttcaccctga ccattagctc ccttcaaccg 240

gaggacttcg ccacctatta ctgctaccag tacaagaacg gctggacttt tggacaaggc 300

accaaggtcg aaatcaagcg tacggtggcc gctccctccg tgttcatctt cccaccctcc 360

gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420

cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 480

tccgtcaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 540

tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 600

tccagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgc 639

<210> 21

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL14可变区

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Lys Asn Ala Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL14轻链

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Lys Asn Ala Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 23

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL14可变区核苷酸

<400> 23

gacatccaga tgacccagag cccgagctcc ctgtccgcat cagtggggga tcgcgtgact 60

attacgtgca aagcctcgca gaacatcaac aagaacctcg actggtatca gcagaagcca 120

ggaaaggcgc ctaagctgct gatctactac gccaacaatc tccagaccgg cgtgccctcg 180

cggttctccg gatctgggtc cggtactgat ttcaccctga ccattagctc ccttcaaccg 240

gaggacttcg ccacctatta ctgctaccag tacaagaacg cttggacttt tggacaaggc 300

accaaggtcg aaatcaag 318

<210> 24

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gL14轻链核苷酸

<400> 24

gacatccaga tgacccagag cccgagctcc ctgtccgcat cagtggggga tcgcgtgact 60

attacgtgca aagcctcgca gaacatcaac aagaacctcg actggtatca gcagaagcca 120

ggaaaggcgc ctaagctgct gatctactac gccaacaatc tccagaccgg cgtgccctcg 180

cggttctccg gatctgggtc cggtactgat ttcaccctga ccattagctc ccttcaaccg 240

gaggacttcg ccacctatta ctgctaccag tacaagaacg cttggacttt tggacaaggc 300

accaaggtcg aaatcaagcg tacggtggcc gctccctccg tgttcatctt cccaccctcc 360

gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420

cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 480

tccgtcaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 540

tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 600

tccagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgc 639

<210> 25

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gH4可变区

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Ala

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Asp Tyr Ser Arg Gly Asp Arg Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gH4重链

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Ala

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Asp Tyr Ser Arg Gly Asp Arg Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 27

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gH4可变区核苷酸

<400> 27

gaagtgcagc ttgtggagag cggaggtgga ctcgtgaagc ctggcggatc tctgcgcctg 60

tcctgcgccg cctcggggtt cacctttaac aatgccgcaa tgtattgggt cagacaggcc 120

ccgggaaagg gtttggaatg ggtggctagg attcggacta agcccaacaa ctacgcgacc 180

tcctacgccg atagcgtgaa gggcagattc accatctccc gggacgactc aaagaacacg 240

ctgtacctcc aaatgaactc cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccgcg 300

gactactccc ggggcgatcg ctggggacag gggactatgg tcactgtctc gagt 354

<210> 28

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811 gH4重链核苷酸

<400> 28

gaagtgcagc ttgtggagag cggaggtgga ctcgtgaagc ctggcggatc tctgcgcctg 60

tcctgcgccg cctcggggtt cacctttaac aatgccgcaa tgtattgggt cagacaggcc 120

ccgggaaagg gtttggaatg ggtggctagg attcggacta agcccaacaa ctacgcgacc 180

tcctacgccg atagcgtgaa gggcagattc accatctccc gggacgactc aaagaacacg 240

ctgtacctcc aaatgaactc cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccgcg 300

gactactccc ggggcgatcg ctggggacag gggactatgg tcactgtctc gagtgcctcc 360

accaagggcc cctccgtgtt ccctctggcc ccttgctccc ggtccacctc cgagtctacc 420

gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgacagt gtcctggaac 480

tctggcgccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccctgccg tgctgcagtc ctccggcctg 540

tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgccc tcctccagcc tgggcaccaa gacctacacc 600

tgtaacgtgg accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agcgggtgga atctaagtac 660

ggccctccct gccccccctg ccctgcccct gaatttctgg gcggaccttc cgtgttcctg 720

ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780

gtggtggacg tgtcccagga agatcccgag gtccagttca attggtacgt ggacggcgtg 840

gaagtgcaca atgccaagac caagcccaga gaggaacagt tcaactccac ctaccgggtg 900

gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960

gtgtccaaca agggcctgcc ctccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020

ccccgcgagc cccaggtgta caccctgccc cctagccagg aagagatgac caagaaccag 1080

gtgtccctga cctgtctggt caagggcttc tacccctccg acattgccgt ggaatgggag 1140

tccaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga cagcgacggc 1200

tccttcttcc tgtactctcg gctgaccgtg gacaagtccc ggtggcagga aggcaacgtc 1260

ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc 1320

ctgagcctgg gcaag 1335

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 116

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 31

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccttggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 32

<211> 348

<212> DNA

<213> 智人

<400> 32

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180

gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300

gatgcttttg atgtctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcttca 348

<210> 33

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 兔Fc人68-140 α突触核蛋白

<400> 33

Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln

20 25 30

Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp

35 40 45

Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu

50 55 60

Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Val Glu Lys Thr Val Ala Pro

65 70 75 80

Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly

85 90 95

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

100 105 110

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp

115 120 125

Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg

130 135 140

Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg

145 150 155 160

Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys

165 170 175

Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

180 185 190

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr

195 200 205

Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu

210 215 220

Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp

225 230 235 240

Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val

245 250 255

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro

260 265 270

Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His

275 280 285

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro

290 295 300

Gly Lys

305

<210> 34

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811大鼠-小鼠嵌合轻链

<400> 34

Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Val Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys His Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Met

35 40 45

Tyr Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Lys Asn Gly Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro

100 105 110

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

130 135 140

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn

145 150 155 160

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr

180 185 190

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 35

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811大鼠-小鼠嵌合重链

<400> 35

Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Ala

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Asp Tyr Ser Arg Gly Asp Arg Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro

210 215 220

Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp

260 265 270

Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser

305 310 315 320

Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln

340 345 350

Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe

355 360 365

Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu

370 375 380

Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe

385 390 395 400

Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn

405 410 415

Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

420 425 430

Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 36

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5811大鼠-小鼠嵌合 Fab-His重链

<400> 36

Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Ala

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Asp Tyr Ser Arg Gly Asp Arg Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys His His His His

210 215 220

His His His His His His

225 230

Claims

1.一种与α突触核蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含：

2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中参考SEQ ID NO:3在位置6处的氨基酸残基甘氨酸(Gly；G)被丙氨酸(Ala；A)置换。

3.权利要求1或权利要求2的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合参考SEQ ID NO:8在位置113与129之间的α突触核蛋白的两个或更多个氨基酸残基，其中所述抗体或其抗原结合片段至少结合参考SEQ ID NO:8的氨基酸残基D119、N122和Y125。

4.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段防止由α突触核蛋白原纤维诱导的α突触核蛋白聚集。

5.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合作为单体和呈原纤维形式的α突触核蛋白。

6.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其对呈原纤维形式的α突触核蛋白的结合亲和力高于对作为单体的α突触核蛋白的结合亲和力，其中对单体α突触核蛋白的解离常数(K_D)比对呈原纤维形式的α突触核蛋白高至少10倍。

7.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其对呈原纤维形式的α突触核蛋白的(K_D)为60pM或更小。

8.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合、人源化或人抗体。

9.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是全长抗体。

10.权利要求9的抗体或其抗原结合片段，其中所述全长抗体选自IgG1、IgG4或IgG4P。

11.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv、dAb或V_HH。

12.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含：

13.权利要求1至11中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含：

a.根据SEQ ID NO:14的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链；或

b.根据SEQ ID NO:18的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链；或

c.根据SEQ ID NO:22的轻链和根据SEQ ID NO:26的重链。

14.一种经分离的多核苷酸，其编码权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段。

15.权利要求14的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码：

a.轻链可变区，其中所述多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:15、19或23至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:15或19或23；或

iii.基本上由SEQ ID NO:15、19或23组成；或

b.重链可变区，其中所述多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:27至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:27；或

iii.基本上由SEQ ID NO:27组成；或

c.轻链，其中所述多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:16、20或24至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:16、20或24；或

iii.基本上由SEQ ID NO:16、20或24组成；

d.重链，其中所述多核苷酸：

i.与SEQ ID NO:28至少90％相同；或

ii.包含SEQ ID NO:28；或

iii.基本上由SEQ ID NO:28组成。

16.一种克隆或表达载体，其包含一种或多种权利要求14或15中任一项的多核苷酸。

17.一种宿主细胞，其包含：

a.一种或多种权利要求14或15中任一项的多核苷酸或

b.一种或多种权利要求16的表达载体。

18.一种产生权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在产生所述抗体或其抗原结合片段的合适条件下培养权利要求17的宿主细胞和分离所述抗体或其抗原结合片段。

19.一种药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂，其中所述药物组合物任选地包含一种或多种另外的活性成分。

20.权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求19的药物组合物，其用于治疗。

21.权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求19的药物组合物，其用于治疗一种或多种突触核蛋白病。

22.根据权利要求21使用的抗体或其抗原结合片段，其中所述突触核蛋白病选自帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)。

23.根据权利要求22使用的抗体或其抗原结合片段，其中所述突触核蛋白病是帕金森氏病。

24.一种治疗患者中的突触核蛋白病的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求19的药物组合物。

25.权利要求24的方法，其中所述突触核蛋白病选自帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特发和遗传形式)、路易体痴呆(DLB)、弥漫性路易体疾病(DLBD)、阿兹海默氏病的路易体变型(LBVAD)、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多发性系统萎缩症(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经退化(NBIA-1)，优选帕金森氏病。

26.权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求19的药物组合物，其用于诊断突触核蛋白病，优选诊断帕金森氏病。