KR20200099168A - 항-알파 시누클레인 항체 - Google Patents

항-알파 시누클레인 항체 Download PDF

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케리 루이스 타이슨
마르코 크리크
리히테르벨트 로렌쵸 드
다니엘 죤 라이트우드
데이빗 제임스 맥밀란
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Abstract

본 발명은 단량체로서의 알파 시누클레인 및 피브릴에서의 알파 시누클레인에 결합할 수 있고 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집을 방지할 수 있는 알파 시누클레인 결합 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 파킨슨병을 포함한 알파 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 것이다.

Description

항-알파 시누클레인 항체
본 발명은 항-알파 시누클레인 항체 및 이를 사용하여 시누클레인병증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항-인간 알파 시누클레인 항체 및 이의 파킨슨병의 치료에서의 용도에 관한 것이다.
알파 시누클레인은 근본적으로 상이한 형태로 존재하는 작은 가용성 140개 아미노산 길이의 단백질이다. 알파 시누클레인은 주로 시냅스전 신경 말단에서 발견되며, 그의 정확한 기능은 알려져 있지 않지만, 연구자들은 이것이 여러 신경퇴행 과정에서 중심적인 역할을 한다고 생각한다.
지난 15년 동안, 알파 시누클레인은 모든 형태의 파킨슨병의 발병에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 알파 시누클레인 유전자의 유전적 변이 또는 유전자 증식은 가족성 조기 발병 파킨슨병(PD)을 유발한다. 흥미롭게도 유전자 좌위 증식 패밀리에서, 병원성 효과는 분명히 유전자량에 의존한다. 유전자 중복은 정상적인 질환 경과를 갖는 비교적 조기 발병 형태의 PD(~47세)를 유발하는 반면, 유전자 삼중중복은 매우 이른 발병 연령(~33세) 및 매우 빠른 질환 경과와 연관된다. 모든 형태의 파킨슨병에서, 알파 시누클레인은 질환의 핵심 병리학적 특징인 루이소체의 주요 성분이다.
루이소체 병리는 질환의 경과 동안 확장되고, 알파 시누클레인은 프리온 유사 단백질로서 작용하며, 이는 미스폴딩되어 영향을 받은 뉴런으로부터 영향을 받지 않은 뉴런으로 퍼질 수 있는 독성 올리고머 및 응집체를 형성하는 것으로 제안된다(Olanow C.W et al. Movement Disorders, Vol 28, No. 1, 2013). 현재의 기존 요법은 질환 확산을 막을 수 없으며, 운동-뉴런 의존적 활동의 점진적인 손실과 연관된 증상의 치료에만 도움을 준다. 2014년에, Tran H.T. 등(Tran H.T. et al, Cell Reports 7, 2054-2065, June 26, 2014)은 이전에 알파 시누클레인 전형성된 피브릴이 선조체내로 주사된 마우스에게 미스폴딩된 알파 시누클레인에 대한 단클론 항체를 복강내 투여하는 것이 루이소체 병리를 감소시키고, 흑색질 도파민작동성 뉴런 손실을 개선하고, 운동 장애를 개선하였음을 보여주었다. 따라서, PD 및 다른 시누클레인병증에서 치료 효과를 발휘할 수 있는 수동적인 면역요법이 여전히 필요하다.
본 발명은 하기 실시양태에 따른 항-알파 시누클레인 항체를 제공함으로써 상기 확인된 요구를 해결한다.
실시양태 1: 알파 시누클레인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 이의 단편은
a. 서열번호: 1로부터 선택된 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b. 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5로부터 선택된 CDR-H2 및 서열번호: 6으로부터 선택된 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 2: 실시양태 1에 있어서, 서열번호: 3과 관련하여 위치 6에서의 아미노산 잔기 글리신(Gly; G)이 알라닌(Ala; A)으로 대체된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 3: 실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여 위치 113 및 129 사이의 알파 시누클레인의 2개 이상의 아미노산 잔기에 결합하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 아미노산 잔기 D119, N122 및 Y125에 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 4: 실시양태 1 내지 실시양태 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편은 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인의 응집을 방지하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 5: 실시양태 1 내지 실시양태 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단량체로서의 알파 시누클레인 및 피브릴에서의 알파 시누클레인에 결합할 수 있는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 6: 실시양태 1 내지 실시양태 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)를 특징으로 하는, 단량체로서의 알파 시누클레인과 비교하여 피브릴에서의 알파 시누클레인에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 7: 실시양태 1 내지 실시양태 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피브릴에서의 알파 시누클레인에 대해 60 pM 이하의 (KD)를 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 8: 실시양태 1 내지 실시양태 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 9: 실시양태 1 내지 실시양태 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체는 전장 항체인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 10: 실시양태 9에 있어서, 전장 항체는 IgG1, IgG4 또는 IgG4P로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 11: 실시양태 1 내지 실시양태 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dAb 또는 VHH로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 12: 실시양태 1 내지 실시양태 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 이의 단편은
a. 서열번호: 13에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호: 17에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역
을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 13: 실시양태 1 내지 실시양태 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 이의 단편은
a. 서열번호: 14에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄; 또는
b. 서열번호: 18에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄; 또는
c. 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 14: 실시양태 1 내지 실시양태 13 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 15: 실시양태 14에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는
a. 경쇄 가변 영역으로서, 폴리뉴클레오타이드가
i. 서열번호: 15, 19 또는 23과 적어도 90% 동일하거나; 또는
ii. 서열번호: 15, 또는 19 또는 23을 포함하거나; 또는
iii. 서열번호: 15, 19 또는 23으로 본질적으로 구성되는 것인
경쇄 가변 영역; 또는
b. 중쇄 가변 영역으로서, 폴리뉴클레오타이드가
iv. 서열번호: 27과 적어도 90% 동일하거나; 또는
v. 서열번호: 27을 포함하거나; 또는
vi. 서열번호: 27로 본질적으로 구성되는 것인
중쇄 가변 영역; 또는
c. 경쇄로서, 폴리뉴클레오타이드가
vii. 서열번호: 16, 20 또는 24와 적어도 90% 동일하거나; 또는
viii. 서열번호: 16, 20 또는 24를 포함하거나; 또는
ix. 서열번호: 16, 20 또는 24로 본질적으로 구성되는 것인
경쇄;
d. 중쇄로서, 폴리뉴클레오타이드가
x. 서열번호: 28과 적어도 90% 동일하거나; 또는
xi. 서열번호: 28을 포함하거나; 또는
xii. 서열번호: 28로 본질적으로 구성되는 것인
중쇄
를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 16: 실시양태 14 또는 15에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
실시양태 17:
a. 실시양태 14 또는 15에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는
b. 실시양태 16에 따른 하나 이상의 발현 벡터
를 포함하는 숙주 세포.
실시양태 18: 실시양태 17에 따른 숙주 세포를 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기 위한 적합한 조건 하에 배양하는 단계 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 실시양태 1 내지 실시양태 13 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생산 방법.
실시양태 19: 실시양태 1 내지 실시양태 13 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 하나 이상의 추가의 활성 성분을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
실시양태 20: 치료에 사용하기 위한 실시양태 1 내지 실시양태 13 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 19에 따른 약제학적 조성물.
실시양태 21: 하나 이상의 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 실시양태 1 내지 실시양태 13 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 19에 따른 약제학적 조성물.
실시양태 22: 실시양태 21에 있어서, 시누클레인병증은 파킨슨병(PD: Parkinson's disease)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB: dementia with Lewy bodies), 확산성 루이소체병(DLBD: Diffuse Lewy Body Disease), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD: Lewy body variant of Alzheimer's disease), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA: multiple system atrophy), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1: neurodegeneration with brain iron accumulation type-1)로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 23: 실시양태 22에 있어서, 시누클레인병증은 파킨슨병인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시양태 24: 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 19에 따른 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 시누클레인병증을 치료하는 방법.
실시양태 25: 실시양태 24에 있어서, 시누클레인병증은 파킨슨병(PD)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB), 확산성 루이소체병(DLBD), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1), 바람직하게는 파킨슨병으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 26: 시누클레인병증의 진단, 바람직하게는 파킨슨병의 진단에 사용하기 위한 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 19에 따른 약제학적 조성물.
도 1. (A) 알파 시누클레인 발현 샘플의 SDS-PAGE. His 태그를 갖는 알파 시누클레인(1) 및 TEV 프로테아제에 의한 His 태그의 제거 후의 알파 시누클레인(2), TEV 프로테아제 처리된 인간 알파-시누클레인 상의 Superdex 75 크기 배제 크로마토그래피(3). 단백질 분자량 마커 SeeBluePlus2(Invitrogen)(M). (B) 야생형 태그되지 않은 단백질로서 Expi293 상층액으로부터 정제된 인간 알파-시누클레인의 SDS-PAGE. (4) 단백질 분자량 마커 SeeBluePlus2(Invitrogen)(M).
도 2. (A) 형광이 없는 단량체 및 540 nm에서 최대 형광을 갖는 피브릴의 JC-1 분석에 의한 피브릴 분석. (B) 단량체 인간 알파-시누클레인의 랜덤 코일 스펙트럼(파장 1646 cm-1) 및 재조합 인간 알파-시누클레인 피브릴에서 β-시트간 형성(파장 1625-1630 cm-1)에 대한 전형적인 예.
도 3. ELISA 결합 분석. (A) 재조합 인간 알파 시누클레인 단량체 및 피브릴 및 인간 알파 시누클레인의 펩타이드 PVDPDNEAYE에 대한 마우스 5811 Fab10HIS의 ELISA 결합 및 (B) 재조합 인간 알파 시누클레인 단량체 및 피브릴에 대한 마우스 5811 IgG1의 ELISA 결합.
도 4. (A) 인간 알파-시누클레인 및 인간 베타-시누클레인에 대한 마우스 5811 IgG1의 결합을 나타내는 웨스턴 블롯. 1, 인간 알파-시누클레인; 2, 인간 알파-시누클레인(rPeptide); 3, 인간 베타-시누클레인(rPeptide); 마커, MagicMark XP. (B) 인간 알파 시누클레인 상의 마우스 5811 Fab의 예측된 에피토프를 나타내는 NMR 화학적 이동 변화.
도 5. 고정화된 알파 시누클레인에 대한 5811 Fab의 결합의 억제(시험된 각각의 펩타이드에 대해, 각각 좌측의 막대, 단량체 및 우측의 막대, 피브릴).
도 6. 에피토프의 특징규명을 위한 알라닌 스캐닝의 웨스턴 블롯. (A) 인간 알파-시누클레인(His-태그됨)의 야생형 및 단일 아미노산 변이체의 4-12% Bis/Tris NuPage 분석. 레인: M, SeeBluePlus2; 1, h a-syn V118A; 2, h a-syn D119A; 3, h a-syn P120A; 4, h a-syn D121A; 5, h a-syn N122A; 6, h a-syn E123A; 7, h a-syn A124S; 8, h a-syn Y125A; 9, h a-syn E126A; 10, h a-syn M127A; 11, h a-syn P128A; 12 및 13 h a-syn 야생형. 일차 항체로서 (B) 5811 mFab 및 (C) 5811 mIgG를 사용한 PVDF 블롯. 레인: M, SeeBluePlus2; 1, h a-syn V118A; 2, h a-syn D119A; 3, h a-syn P120A; 4, h a-syn D121A; 5, h a-syn N122A; 6, h a-syn E123A; 7, h a-syn A124S; 8, h a-syn Y125A; 9, h a-syn E126A; 10, h a-syn M127A; 11, h a-syn P128A; 12 h a-syn wt(His-태그됨); 13, MagicMark XP; 14, h a-syn 야생형(태그 없음).
도 7. 경쇄 인간화. 5811은 랫트 가변 경쇄 서열에 대한 것이다. 5811gL5, 5811gL8 및 5811gL14는 수용자 프레임워크로서 IGKV1-39 인간 생식계열(germline)을 사용한 항체 5811 가변 경쇄의 인간화된 이식편에 대한 것이다. CDR은 굵게/밑줄로 표시되어 있다. 공여자 잔기는 굵게/이탤릭체로 표시되어 있고 음영 처리된다: Y71. 잠재적인 탈아미드화 부위를 변형시키기 위한 CDR-L3에서의 변이는 굵게/밑줄로 표시되어 있고 음영 처리된다: G94A.
도 8. 중쇄 인간화. 5811은 랫트 가변 중쇄 서열에 대한 것이다. 5811gH4는 수용자 프레임워크로서 IGHV3-15 인간 생식계열을 사용한 항체 5811 가변 중쇄의 인간화된 이식편에 대한 것이다. CDR은 굵게/밑줄로 나타나 있다. 공여자 잔기는 굵게/이탤릭체로 표시되어 있고 음영 처리된다: A49 및 A100.
도 9. 면역조직화학. (A-E) PD 및 (F-H) 비-PD 환자로부터의 뇌 절편에서의 면역반응성. (A-C) PD 환자의 측두엽 피질에서, 항체 5811 mIgG1은 일부 세포의 신경망(neuropil) 및 세포질을 표지하였고; 때때로 루이소체 유사 구조가 관찰되었다(흰색 화살표). (D, E) 항체 5811 mIgG1은 PD 환자의 흑색질에서 루이소체 유사 특징(흰색 화살표)을 표지하였다. (F, G) 비-PD 측두엽 피질 조직에서, 항체 5811 mIgG1은 또한 신경망을 표지하였으나, 루이소체 유사 구조는 관찰되지 않았다. (H) 비-PD 개체의 흑색질에서 루이소체 유사 구조가 관찰되지 않았고; 검은색 화살표는 뉴로멜라닌 함유 뉴런 및 뉴런 섬유에 상응하는 비특이적 표지화를 가리킨다. 척도 막대 = 50 μm.
도 10. 세포 기반 응집 분석(HEK 세포); 본 발명의 항체는 5 nM 미만의 IC50으로 알파-시누클레인 피브릴에 의해 유도된 알파 시누클레인 응집을 억제할 수 있었다. 오차 막대는 측정의 표준 오차(SEM, N=4, n=12)를 나타낸다.
도 11. 세포 기반 응집 분석(일차 뉴런). 본 발명에 따른 항체는 5 nM 미만의 IC50으로 내인성 수준의 알파 시누클레인을 발현하는 마우스 일차 뉴런 상에서 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도된 알파 시누클레인 응집을 억제할 수 있었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM, N=5, n=17)를 나타낸다.
도 12. 마우스 PFF가 주사된 SNCA-OVX 마우스의 상이한 뇌 영역에서 알파 시누클레인 병리(화살표)의 면역조직화학 사진.
도 13. 대뇌 피질, 선조체 및 흑색질(흑질)에서 SNCA-OVX 마우스의 상이한 뇌 영역에서 알파 시누클레인 병리의 정량.
도 14. 야생형 마우스에서 알파 시누클레인 항체 5811의 약동학적 프로파일.
본 개시내용은 이제 특정한 비제한적인 양태 및 이의 실시양태와 관련하여 그리고 특정 도면 및 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
기술 용어는 달리 나타내지 않는 한 이들의 일반 상식에 의해 사용된다. 특정 의미가 특정 용어에 전달되는 경우, 용어의 정의는 용어가 사용되는 문맥에서 제공될 것이다.
용어 "포함하는"이 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 경우, 그것은 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "구성되는"은 용어 "포함하는"의 바람직한 실시양태로 간주된다.
단수 명사를 언급할 때 부정관사 또는 관사, 예컨대 "어느", "어느 것" 또는 "그것"이 사용되는 경우, 이는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 복수의 명사를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/거나 질환 및/또는 질환으로 인한 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 따라서, 치료는 포유동물에서, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 포함하며, 이는 (a) 질환에 걸리기 쉽지만 아직 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉, 그의 발달을 정지시키는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다.
"치료적 유효량"은 질환을 치료하기 위해 포유동물 또는 다른 대상체에게 투여될 때, 이러한 질환의 치료를 생성하기에 충분한 항-알파 시누클레인 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 항-알파 시누클레인 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 질환 및 그의 중증도 및 치료될 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
용어 "단리된"은, 본 명세서 전반에 걸쳐, 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리뉴클레오타이드가 경우에 따라 자연에서 발생할 수 있는 것과 구별되는 물리적 환경에 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명은 알파 시누클레인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 이의 단편은
a. 서열번호: 1로부터 선택된 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b. 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5로부터 선택된 CDR-H2 및 서열번호: 6으로부터 선택된 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 실시양태에서, 서열번호: 3과 관련하여 위치 6에서의 아미노산 잔기 글리신(Gly; G)은 알라닌(Ala; A)으로 대체된다.
알파 시누클레인(또는 알파 syn; a-시누클레인; a-syn 또는 임의의 다른 공지된 동의어)은 이 단백질의 일반 명칭을 지칭하며, 비제한적으로, 다른 종(마우스, 원숭이 등)으로부터의 알파 시누클레인, 선택적 스플라이싱 변이체 및 돌연변이체를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 인간 알파 시누클레인이 의도되거나 명시적으로 언급될 때, 이러한 알파 시누클레인은 서열번호: 8 또는 Uniprot P37840에 제공된 서열을 포함한다.
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본원에 사용된 바와 같이 용어 '항체'는 일반적으로 온전한(전체) 항체, 즉, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 요소를 포함하는 항체에 관한 것이다. 항체는 예를 들어 WO 제2007/024715호에 개시된 바와 같은 분자 DVD-Ig, 또는 WO제2011/030107호에 기재된 소위 (FabFv)2Fc와 같이 추가의 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 항체는 2가, 3가 또는 4가 전장 항체를 포함한다.
항체의 항원 결합 단편은 단쇄 항체(즉, 전장 중쇄 및 경쇄); Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 단일 도메인 항체(예컨대 VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 디아바디, 트리바디, 트리아바디, 테트라바디 및 상기 중 어느 것의 에피토프 결합 단편을 포함한다(예를 들어, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217 참고). 이들 항체 단편을 생성 및 제작하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181 참고). Fab-Fv 포맷은 WO제2009/040562호에 처음 개시되었고, 이의 이황화물 안정화된 버전인 Fab-dsFv는 WO제2010/035012호에 처음 개시되었다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 WO제2005/003169호, WO제2005/003170호 및 WO제2005/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성을 포함할 수 있고, 예컨대 이중특이적이거나 또는 단일특이적일 수 있다(예를 들어, WO 제92/22583호 및 WO제05/113605호 참고). 후자의 하나의 예는 WO제92/22583호에 기재된 바와 같은 Tri-Fab(또는 TFM)이다.
대안적인 항원 결합 단편은 2개의 scFv 또는 dsscFv에 연결된 Fab를 포함하고, 각각의 scFv 또는 dsscFv는 동일하거나 상이한 표적에 결합한다(예컨대, 치료 표적에 결합하는 하나의 scFv 또는 dsscFv 및, 예를 들어, 알부민에 결합함으로써 반감기를 증가시키는 하나의 scFv 또는 dsscFv). 이러한 항체 단편은 국제 특허 출원 공개 WO제2015/197772호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가, 특히 항체 단편의 논의와 관련하여 본원에 참조로 포함되어 있다.
전형적인 Fab' 분자는 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함하고, 중쇄는 가변 영역 VH, 불변 도메인 CH1 및 천연 또는 변형된 힌지 영역을 포함하며, 경쇄는 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함한다. 본 개시내용에 따른 Fab'의 이량체는 F(ab')2를 생성하며, 여기서 예를 들어, 이량체화는 힌지를 통해 이뤄질 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 시누클레인의 에피토프에 결합한다. 본 발명 내에서, 용어 "에피토프"는 입체형태적 및 선형 에피토프 모두에 대해 상호교환적으로 사용되며, 입체형태적 에피토프는 항원의 아미노산 일차 서열의 불연속 구획으로 구성되고 선형 에피토프는 연속적인 아미노산에 의해 형성된 서열에 의해 형성된다.
에피토프는 본 발명에 의해 제공된 어느 하나의 항체와 조합하여 당업계에 공지된 임의의 적합한 에피토프 맵핑 방법에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법의 예는 전장 알파 시누클레인으로부터 유래된 다양한 길이의 펩타이드를 본 발명의 항체 또는 이의 단편에의 결합에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 항체에 의해 인식되는 에피토프의 서열을 함유하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 가장 작은 단편을 확인한다. 알파 시누클레인 펩타이드는 합성적으로 또는 알파 시누클레인 단백질의 단백질 분해에 의해 생산될 수 있다. 항체에 결합하는 펩타이드는, 예를 들어, 질량 분광 분석에 의해 확인될 수 있다. 또 다른 예에서, NMR 분광학 또는 X선 결정학은 본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일단 확인되면, 에피토프는 본 발명의 항체에 결합하는 단편을 제조하는 역할을 할 수 있고, 필요한 경우, 동일한 에피토프에 결합하는 추가의 항체를 수득하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여 위치 113 및 129 사이의 알파 시누클레인의 2개 이상의 아미노산 잔기에 결합한다. 특히, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여 적어도 아미노산 잔기 D119, N122 및 Y125에 결합한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집을 방지한다.
이 특정 문맥 내에서, 용어 "방지하다"(및 이의 문법적 변형)는 본원에서 용어 "억제하다"와 상호교환적으로 사용되며 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집에 대해 본 발명에 따른 항체가 갖는 효과를 나타낸다. 효과는 응집을 완전히 또는 부분적으로 방지하거나; 또는 완전히 또는 부분적으로 감소시키거나, 즉, 이미 시작된 응집이 추가 진행되는 것을 완전히 또는 부분적으로 차단하거나, 또는 추가 응집의 발생을 완전히 또는 부분적으로 감소시키거나; 또는 이미 발생한 응집을 완전히 또는 부분적으로 역전시키는 측면에서 예방적일 수 있다.
이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
i) 단량체 형태의 알파 시누클레인에 결합하고 알파 시누클레인이 올리고머 및 응집체를 형성하는 것을 방지하고/거나;
ii) 올리고머 및 피브릴 형태의 알파 시누클레인에 결합하고 알파 시누클레인이 뉴런에서 뉴런으로 확산하는 것을 방지하고/거나
iii) 올리고머 및/또는 피브릴 형태의 알파 시누클레인에 결합하고 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집, 바람직하게는 내인성 알파 시누클레인 응집을 방지하는 것으로 여겨진다.
알파 시누클레인과 관련하여 본원에 사용된 용어 "피브릴", "피브릴 형태" 또는 "피브릴에서의"는 뇌 구조 내 및 사이에서 확산하는 종을 구성할 수 있는, 알파 시누클레인 올리고머를 포함하는 알파 시누클레인의 비단량체 형태를 지칭하는 것을 의미한다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단량체로서의 알파 시누클레인 및 피브릴에서의 알파 시누클레인에 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단량체로서의 알파 시누클레인과 비교하여 피브릴에서의 알파 시누클레인에 대해 더 강한 결합 친화성을 갖는다. 이것은 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)를 특징으로 한다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단량체 알파 시누클레인에 대해 60 pM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 피브릴에서의 알파 시누클레인에 대해 30 pM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 수득된 해리 상수를 지칭하며, 이는 몰 농도(M)로 표현된다. Kd 및 Ka는 각각 특정 항원-항체(또는 이의 항원 결합 단편) 상호작용의 해리 속도 및 결합 속도를 지칭한다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 단리된 천연 또는 재조합 알파 시누클레인, 이의 적합한 융합 단백질/폴리펩타이드 또는 이의 피브릴을 사용하여, 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 Biacore® 시스템을 사용하는 것에 의한다. 일 예에서, 친화성은 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 재조합 인간 알파 시누클레인을 사용하여 측정된다. 표면 플라즈몬 공명을 위해, 표적 분자는 고상에 고정화되고 유세포를 따라 진행하는 이동상 중의 리간드에 노출된다. 고정화된 표적에 리간드가 결합하면, 국부 굴절률이 변화하여, SPR 각도의 변화를 초래하고, 이는 반사광의 강도 변화를 검출함으로써 실시간으로 모니터링될 수 있다. SPR 신호의 변화 속도는 분석되어 결합 반응의 결합 및 해리 단계에 대한 겉보기 속도 상수를 산출할 수 있다. 이들 값의 비율은 겉보기 평형 상수(친화성)를 제공한다(예컨대, Wolff et al, Cancer Res. 53:2560-65(1993) 참고).
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단량체로서의 알파 시누클레인과 비교하여 피브릴에서의 알파 시누클레인에 대해 더 높은 결합 친화성(즉, 더 작은 KD)을 갖는다. 용어 "친화성"은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 알파 시누클레인 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 시누클레인에 의해 유도되는 응집, 바람직하게는, 피브릴에서의 알파 시누클레인에 의해 유도되는 응집을 차단 또는 방지 또는 감소시킨다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 피브릴에서의 알파 시누클레인에 의해 유도되는 응집을 차단하기 위해 10 nM 미만의 IC50을 가지며, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 피브릴에서의 알파 시누클레인에 의해 유도되는 응집을 차단하기 위해 5 nM 미만의 IC50을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 IC50은 특정 생물학적 또는 생화학 기능, 본 발명에서 알파 시누클레인, 바람직하게는 피브릴에서의 알파 시누클레인에 의해 유도되는 응집을 억제하는 데 있어서, 항체와 같은 물질의 효과의 척도인 절반 최대 억제 농도를 지칭한다. IC50은 주어진 생물학적 과정을 절반으로 억제하기 위해 특정 물질이 얼마나 많이 필요한지 나타내는 정량적 척도이다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 베타 시누클레인 및/또는 감마 시누클레인에 결합하지 않고 알파 시누클레인에 특이적이다.
본원에 사용된 바와 같이 특이적이라는 것은 특이적인 항원만을 인식하는 항체 또는 비특이적인 항원(감마 및 베타 시누클레인)에 대한 결합과 비교하여, 특이적인 항원(예컨대, 알파 시누클레인)에 대해 유의하게 더 높은 결합 친화성, 예를 들어 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10배 높은 결합 친화성을 갖는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 발명에 따른 항체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 융합 단백질을 포함하는 알파 시누클레인 폴리펩타이드/단백질, 폴리펩타이드를 발현하는 세포(재조합으로 또는 천연으로)는 알파 시누클레인을 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 폴리펩타이드는 '성숙한' 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 유도체일 수 있다.
일 실시양태에서, 폴리펩타이드(즉, 항원)는, 바람직하게는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 생산된, 인간 알파 시누클레인 단량체 또는 이의 단편이다.
숙주를 면역화하는 데 사용하기 위한 폴리펩타이드는 발현 시스템을 포함하는 유전 조작된 숙주 세포로부터 당업계에 널리 공지된 공정에 의해 제조될 수 있거나, 이들은 천연 생물학적 공급원으로부터 회수될 수 있다. 본 출원에서, 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함한다. 이들은 달리 명시되지 않는 한 상호교환적으로 사용된다. 알파 시누클레인 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 일부 경우에 예를 들어 친화성 태그 등에 융합된 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 부분일 수 있다.
알파 시누클레인 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체는, 동물의 면역화가 필요한 경우, 널리 공지되고 일상적인 프로토콜을 사용하여, 폴리펩타이드를 동물, 바람직하게는 비인간 동물에게 투여함으로써 수득될 수 있으며, 예를 들어 문헌[Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986)]을 참고한다. 많은 온혈 동물, 예컨대 토끼, 마우스, 랫트, 양, 소, 낙타 또는 돼지가 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 랫트가 일반적으로 가장 적합하다.
단클론 항체는 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 또한 특이적 항체의 생산을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시키는 단일 림프구 항체 방법을 사용하여, 예를 들어, 문헌[Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l; WO제92/02551호; WO제2004/051268호 및 WO제2004/106377호]에 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다.
항체의 스크리닝은 알파 시누클레인에 대한 결합을 측정하는 분석 및/또는 항체 또는 이의 단편의 존재하에 피브릴을 형성하는 알파 시누클레인의 억제를 측정하는 분석을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄로부터 3개 및 경쇄로부터 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일반적으로, CDR은 프레임워크 내에 있으며, 함께 가변 영역을 형성한다. 관례상, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역 내의 CDR은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 지칭되며, 경쇄 가변 영역 내의 CDR은 CDR-L1-CDR-L2 및 CDR-L3으로 지칭된다. 이들은 각 사슬의 N-말단에서 C-말단의 방향으로 순차적으로 넘버링된다.
CDR은 통상적으로 카바트 등에 의해 고안된 체계에 따라 넘버링된다. 이 체계는 문헌[Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA(이하 "카바트 등(상기)")]에 제시되어 있다. 달리 나타내지 않는 한, 이 넘버링 체계가 본 명세서에서 사용된다.
카바트 잔기 명칭은 항상 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 직접 상응하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은, 기본 가변 도메인 구조의 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR)에 관계없이, 구조적 구성요소의 단축 또는 삽입에 상응하는 엄격한 카바트 넘버링보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 카바트 넘버링은 항체의 서열 내의 상동성의 잔기를 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 초티아(Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1과 동등한 루프는 잔기 26부터 잔기 32까지 연장된다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 'CDR-H1'은 카바트 넘버링 체계 및 초티아의 위상적 루프 정의의 조합에 의해 기재된 바와 같이 잔기 26 내지 35를 지칭하는 것으로 의도된다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.
일 실시양태에서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체가 생성된 동물의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체가 랫트에서 생성된 경우, 그것은 본원에 정의되고 청구된 CDR 및 서열번호: 9에 따른 경쇄 가변 영역(뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 11에 나타나 있음) 및 서열번호: 10에 따른 중쇄 가변 영역(뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 12에 나타나 있음)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 랫트 항체의 프레임워크 영역을 포함할 것이다.
키메라 항체는 전형적으로 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산된다. DNA는 상응하는 비인간(예컨대 쥣과) H 및 L 불변 영역을 인간 L 및 H 사슬에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 변형될 수 있다(Morrison; PNAS 81, 6851(1984)).
인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 사슬이 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우 특정 생식계열 서열"의 생성물"이거나 특정 생식계열 서열"로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 형질전환 마우스를 관심 항원으로 면역화하거나 관심 항원을 갖는 파아지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 생성물" 또는 인간 생식계열 면역글로불린 서열"로부터 유래된" 인간 항체 또는 이의 단편은 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고 인간 항체의 서열과 서열이 가장 가까운(즉, 가장 큰 % 동일성) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 상기와 같이 확인될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 생성물" 또는 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열"로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어, 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위 지향 돌연변이의 의도적 도입으로 인해, 생식계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 90% 동일하고 다른 종(예컨대, 쥣과 생식계열 서열)의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열과 비교할 때 인간 항체를 인간인 것으로 확인하는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노선 서열과 아미노산 서열이 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
인간 항체는 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 생산될 수 있다. 인간 항체는 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주를 사용한 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다(Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001; Brodeur, Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63, Marcel Dekker Inc, 1987). 대안적인 방법은 인간 가변 영역 레퍼토리를 이용하는 파아지 라이브러리 또는 형질전환 마우스의 사용을 포함한다(Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231:1 1-23).
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 '인간화 항체 분자'는 중쇄 및/또는 경쇄가 수용자 항체(예컨대, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 이식된 공여자 항체(예컨대, 쥣과 또는 토끼 단클론 항체와 같은 비인간 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(원하는 경우, 하나 이상의 변형된 CDR 포함)을 함유하는 항체 분자를 지칭한다. 검토를 위해, 문헌[Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참고한다. 일 실시양태에서, 전체 CDR이 전달되기보다는, 상기 본원에 기재된 CDR 중 어느 하나로부터의 하나 이상의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다(예를 들어, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34 참고). 일 실시양태에서, 상기 본원에 기재된 하나 이상의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 본원에 기재된 CDR 각각으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다.
CDR이 이식되는 경우, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 포함하는, CDR이 유래된 공여자 항체의 클래스/유형과 관련하여 임의의 적절한 수용자 가변 영역 프레임워크 서열이 사용될 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체는 인간 수용자 프레임워크 영역뿐만 아니라 본원에 구체적으로 제공된 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 도메인을 갖는다. 따라서, 일 실시양태에서 알파 시누클레인, 바람직하게는 인간 알파 시누클레인에 결합하는 차단 인간화 항체가 제공되며, 가변 도메인은 인간 수용자 프레임워크 영역 및 비인간 공여자 CDR을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(상기 카바트 등). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 사용될 수 있고, REI는 경쇄에 사용될 수 있으며, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 모두에 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식계열 서열이 사용될 수 있고; 이들은 http://www.imgt.org/에서 이용가능하다.
본 발명에 따른 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서, 수용자 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없으며, 원하는 경우 상이한 사슬로부터 유래된 프레임워크 영역을 갖는 복합 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체의 경쇄에 대한 적합한 프레임워크 영역은 서열번호: 29를 갖는 인간 생식계열 IGKV1-39로부터 유래되고, 이의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 31에 나타나 있다.
따라서, 일 실시양태에서, CDR-L1에 대해 서열번호: 1에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호: 2에 제시된 서열 및 CDRL3에 대해 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 경쇄 프레임워크 영역은 인간 생식계열 IGKV1-39로부터 유래된다.
본 발명에 따른 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄에 대한 적합한 프레임워크 영역은 서열번호: 30에 나타난 바와 같은 서열을 갖는 인간 생식계열 IGHV3-15로부터 유래되고, 이의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 32에 나타나 있다.
일 실시양태에서, CDR-H1에 대해 서열번호: 4에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호: 5에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호: 6에 제시된 서열을 포함하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 중쇄 프레임워크 영역은 인간 생식계열 IGHV3-15로부터 유래된다.
또 다른 실시양태에서,
서열번호: 1에 제시된 서열에 따른 CDR-L1, 서열번호: 2에 제시된 서열에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 제시된 서열에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, 경쇄 프레임워크 영역은 인간 생식계열 IGKV1-39로부터 유래된 것인 경쇄 가변 영역 및
서열번호: 4에 제시된 서열에 따른 CDR-H1, 서열번호: 5에 제시된 서열에 따른 CDR-H2 및 서열번호: 6에 제시된 서열에 따른 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, 중쇄 프레임워크 영역은 인간 생식계열 IGHV3-15로부터 유래된 것인 중쇄 가변 영역
을 포함하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
본 발명에 따른 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서, 프레임워크 영역은 수용자 항체와 동일한 서열을 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 비일반적인 잔기는 상기 수용자 사슬 클래스 또는 유형에 대해 보다 빈번하게 발생하는 잔기로 변화될 수 있다. 대안적으로, 수용자 프레임워크 영역 내의 선택된 잔기는 이들이 공여자 항체 내의 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 변화될 수 있다(Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324 참고). 이러한 변화는 공여자 항체의 친화성을 회복하는 데 필요한 최소한으로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있을 수 있는 수용자 프레임워크 영역 내의 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 WO제91/09967호에 제시되어 있다.
따라서, 일 실시양태에서, 프레임워크 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 잔기는 대안적인 아미노산 잔기로 대체된다.
따라서, 일 실시양태에서, 경쇄의 가변 도메인(서열번호: 17 또는 18과 관련하여)의 위치 71에서의 잔기(Phe(F) 71)가 공여자 잔기(Tyr(Y) 71)인 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 예를 들어 서열번호: 13 및 14에 제시된 서열을 참고한다.
또 다른 실시양태에서, 중쇄의 가변 도메인의 서열번호: 30과 관련하여 위치 49 및 100 각각에서의 잔기(Gly(G) 49 및 Thr(T) 100)가 공여자 잔기(Ala 49 및 Ala 100)인 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 예를 들어 서열번호: 25 및 26에 제시된 서열을 참고한다.
일 실시양태에서, 본 발명은
1. 서열번호: 13에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
2. 서열번호: 17에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
3. 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역
을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 서열에 80% 유사하거나 동일한, 예를 들어 관련 서열의 일부 또는 전체, 예를 들어 가변 도메인 서열, CDR 서열 또는 CDR을 제외한 가변 도메인 서열에 대해 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일 실시양태에서, 관련 서열은 서열번호: 25이다. 일 실시양태에서, 관련 서열은 서열번호: 13, 서열번호: 17 또는 서열번호: 21이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 경쇄를 포함하는 인간 알파 시누클레인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 경쇄의 가변 도메인이 서열번호: 13, 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고/거나 중쇄의 가변 도메인이 서열번호: 25에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 인간 알파 시누클레인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서열번호: 13, 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 CDR-L1에 대해 서열번호: 1에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호: 2에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 제시된 서열을 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 인간 알파 시누클레인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서열번호: 25에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 CDR-H1에 대해 서열번호: 4에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호: 5에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호: 6에 제시된 서열을 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, "동일성"은 정렬된 서열에서의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열 간에 동일하다는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, "유사성"은 정렬된 서열에서의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열 간에 유사한 유형임을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린을 치환할 수 있다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 비제한적으로 하기를 포함한다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산);
- 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산). 동일성 및 유사성 정도는 쉽게 계산될 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, NCBI로부터 이용가능한 BLAST™ 소프트웨어(Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
일 실시양태에서, 항원 결합 단편은, 비제한적으로, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예컨대, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, dsscFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 상기 중 어느 것의 에피토프 결합 단편일 수 있다(예를 들어, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217 참고). 이들 항체 단편을 생성 및 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181 참고). 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 WO제2005/003169호, WO제2005/003170호 및 WO제2005/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성을 포함할 수 있고, 예컨대 이중특이적이거나 또는 단일특이적일 수 있다(예를 들어, WO 제92/22853호, WO제05/113605호, WO제2009/040562호 및 WO제2010/035012호 참고).
대안적인 항원 결합 단편은 2개의 scFv 또는 dsscFv에 연결된 Fab를 포함하고, 각각의 scFv 또는 dsscFv는 동일하거나 상이한 표적에 결합한다(예컨대, 치료 표적에 결합하는 하나의 scFv 또는 dsscFv 및, 예를 들어, 알부민에 결합함으로써 반감기를 증가시키는 하나의 scFv 또는 dsscFv). 이러한 항체 단편은 국제 특허 출원 공개 WO제2015/197772호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가, 특히 항체 단편의 논의와 관련하여 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은, 존재하는 경우, 항체 분자의 제안된 기능, 및 특히 요구될 수 있는 효과기 기능과 관련하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있고, 특히 항체 분자가 치료 용도로 의도되고 항체 효과기 기능이 필요한 경우 IgG1 및 IgG3 이소타입의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료 목적으로 의도되고 항체 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 IgG2 및 IgG4 이소타입이 사용될 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변이체가 또한 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 문헌[Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30(1), 105-108]에 기재된 바와 같이 위치 241의 세린이 프롤린으로 변화된 IgG4 분자가 사용될 수 있다. 또한 항체가 다양한 번역 후 변형을 겪을 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 이들 변형의 유형 및 정도는 종종 항체를 발현하는 데 사용되는 숙주 세포주뿐만 아니라 배양 조건에 의존한다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변화를 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다제의 작용으로 인한 카르복시-말단 염기성 잔기(예컨대, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다(Harris, RJ. Journal of 크로마토그래피 705:129-134, 1995에 기재된 바와 같음). 따라서, 항체 중쇄의 C-말단 리신은 부재할 수 있다.
일 실시양태에서, 항체로부터의 C-말단 아미노산은 번역 후 변형 동안 절단된다.
일 실시양태에서, 항체로부터의 N-말단 아미노산은 번역 후 변형 동안 절단된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전장 항체는 IgG1, IgG4 또는 IgG4P로부터 선택된다.
일 실시양태에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
1. 서열번호: 14에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄; 또는
2. 서열번호: 18에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄; 또는
3. 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체는, 예를 들어 모두 본원에 참고로 포함된 WO제2009/040562호, WO제2010035012호, WO제2011/030107호, WO제2011/061492호 및 WO제2011/086091호에 기재된 바와 같은, 면역글로불린 모이어티, 예를 들어 Fab 또는 Fab' 단편, 및 이에 직접 또는 간접적으로 연결된 하나 또는 2개의 단일 도메인 항체(dAb)를 포함하는 알파 시누클레인 결합 항체 융합 단백질로서 제공된다.
일 실시양태에서, 융합 단백질은, 선택적으로 이황화물 결합에 의해 연결된, 예를 들어 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 쌍으로서 2개의 도메인 항체를 포함한다.
일 실시양태에서, 융합 단백질의 Fab 또는 Fab' 요소는 단일 도메인 항체 또는 항체들과 동일하거나 유사한 특이성을 갖는다. 일 실시양태에서, Fab 또는 Fab'는 단일 도메인 항체 또는 항체들과 상이한 특이성을 가지며, 즉 융합 단백질은 다가이다. 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 다가 융합 단백질은 알부민 결합 부위를 가지며, 예를 들어 그 안의 VH/VL 쌍은 알부민 결합 부위를 제공한다.
일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 13 또는 17 또는 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 항체는 서열번호: 13 또는 17 또는 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함하는 전장 IgG4 항체이다. 또 다른 예에서, 항체는 서열번호: 14, 18 또는 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄를 포함하는 전장 IgG4 항체이다. 또 다른 예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 13, 17 또는 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함하는 Fab'이다.
일 바람직한 실시양태에서는, 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a. 서열번호: 1에 따른 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5에 따른 CDR-H2 및 서열번호: 6에 따른 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호: 13 또는 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열번호: 14 또는 서열번호: 18 또는 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함하고,
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여, 적어도 잔기 D119, N122 및 Y125를 포함하는 에피토프에 대한 알파 시누클레인에 결합한다.
보다 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 베타-시누클레인과 교차반응하지 않으며 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)로 알파 시누클레인에 결합한다.
생물학적 분자, 예컨대 항체 또는 단편은, 산성 및/또는 염기성 작용기를 함유함으로써 분자에게 순 양전하 또는 음전하를 제공한다. 전체적인 "관찰된" 전하의 양은 독립체의 절대 아미노산 서열, 3D 구조에서 하전된 그룹의 국소 환경 및 분자의 환경 조건에 의존할 것이다. 등전점(pI)은 특정 분자 또는 이의 용매 접근가능한 표면이 순 전하를 갖지 않는 pH이다. 일 예에서, 본 발명에 따른 항-알파 시누클레인 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적절한 등전점을 갖도록 조작될 수 있다. 이것은 보다 강한 특성, 특히 적합한 용해도 및/또는 안정성 프로파일 및/또는 개선된 정제 특징을 갖는 항체 및/또는 단편을 야기할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 원래 확인된 항체와 상이한 등전점을 갖도록 조작된 인간화 항 알파 시누클레인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 항체는, 예를 들어 아미노산 잔기를 대체함으로써, 예컨대 산성 아미노산 잔기를 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 대체함으로써 조작될 수 있다. 대안적으로, 염기성 아미노산 잔기가 도입될 수 있거나 산성 아미노산 잔기가 제거될 수 있다. 대안적으로, 분자가 허용가능하지 않게 높은 pI 값을 갖는 경우, 필요에 따라 pI를 낮추기 위해 산성 잔기가 도입될 수 있다. pI를 조작할 때 항체 또는 단편의 원하는 활성을 유지하기 위해 주의해야 하는 것이 중요하다. 따라서, 일 실시양태에서, 조작된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 "변형되지 않은" 항체 또는 단편과 동일한 또는 실질적으로 동일한 활성을 갖는다.
** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html과 같은 프로그램이 항체 또는 단편의 등전점을 예측하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 항체의 친화성이 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 변경될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서 본 발명은 또한 알파 시누클레인, 특히 인간 알파 시누클레인에 대해 개선된 친화성을 갖는 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이다. 이러한 변이체는 CDR를 돌연변이시키는 것(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 사슬 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), E. coli의 돌연변이 균주의 사용(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파아지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 성적 PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함하는 많은 친화성 성숙 프로토콜에 의해 수득될 수 있다. 문헌[Vaughan et al.(상기)]은 이러한 친화성 성숙 방법을 논의한다.
원하는 경우, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 효과기 분자(들)에 접합될 수 있다. 효과기 분자가 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하기 위해 연결된 단일 효과기 분자 또는 2개 이상의 이러한 분자를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 효과기 분자에 연결된 항체 단편을 수득하기를 원하는 경우, 이는 항체 단편이 직접 또는 커플링제를 통해 효과기 분자에 연결되는 표준 화학 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 이러한 효과기 분자를 항체에 접합시키는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다(Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123 참고). 특정 화학적 절차는, 예를 들어, WO 제93/06231호, WO제 92/22583호, WO 제89/00195호, WO 제89/01476호 및 WO 제03/031581호에 기재된 것을 포함한다. 대안적으로, 효과기 분자가 단백질 또는 폴리펩타이드인 경우, 연결은, 예를 들어 WO 제86/01533호 및 EP제0392745호에 기재된 바와 같은, 재조합 DNA 절차를 사용하여 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 효과기 분자는, 예를 들어, 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 자연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예컨대 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오드, 방사성동위원소, 킬레이트화된 금속, 나노입자 및 리포터 그룹, 예컨대 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광학에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
효과기 분자의 예는 세포독소 또는 세포에 유해한(예컨대, 사멸시키는) 임의의 제제를 포함하는 세포독성제를 포함할 수 있다. 예는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스테르린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다.
효과기 분자는 또한, 비제한적으로, 항대사물질(예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아마이신 또는 두오카르마이신), 및 항-유사분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다.
다른 효과기 분자는 킬레이트화된 방사성핵종, 예컨대 111In 및 90Y, Lu177, 비스무트213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 약물, 예컨대, 비제한적으로, 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민을 포함할 수 있다.
다른 효과기 분자는 단백질, 펩타이드 및 효소를 포함한다. 관심 효소는, 비제한적으로, 단백질분해 효소, 가수분해효소, 리아제, 이소머라제, 전이효소를 포함한다. 관심 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는, 비제한적으로, 면역글로불린, 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예컨대 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성제, 혈전제 또는 항-혈관신생제, 예컨대 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는, 생물학적 반응 변형제, 예컨대 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린을 포함한다.
다른 효과기 분자는 예를 들어 진단에 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성활성 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층촬영에 사용), 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 일반적으로 진단제로서 사용하기 위한 항체에 접합될 수 있는 금속 이온의 대해서는 미국 특허 제4,741,900호를 참고한다. 적합한 효소는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타 갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하고; 적합한 보결 그룹은 스트렙타비딘, 아비딘 및 바이오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질은 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하고; 적합한 발광 물질은 루미놀을 포함하고; 적합한 생물발광 물질은 루시퍼라제, 루시페린, 및 애쿼린을 포함하며; 적합한 방사성 핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
또 다른 예에서, 효과기 분자는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시키고/거나 항체의 면역원성을 감소시키고/거나 항체를 상피 장벽을 통해 면역 체계에 전달하는 것을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 효과기 분자의 예는 WO제05/117984호에 기재된 바와 같이 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물을 포함한다.
효과기 분자가 중합체인 경우, 그것은, 일반적으로, 합성 또는 자연 발생 중합체, 예를 들어 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지된 사슬 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지되거나 비분지된 다당류, 예컨대 호모- 또는 헤테로-다당류일 수 있다.
전술한 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 구체적인 선택적인 치환기는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시기를 포함한다.
합성 중합체의 구체적인 예는 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지된 사슬 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알콜) 또는 이의 유도체, 특히 선택적으로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체를 포함한다.
구체적인 자연 발생 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이의 유도체를 포함한다.
일 실시양태에서, 중합체는 알부민 또는 이의 단편, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편이다.
본원에 사용된 바와 같이 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어 말레이미드 등과 같은 티올 선택적 반응기를 포함하는 것으로 의도된다. 반응기는 중합체에 직접 또는 링커 세그먼트를 통해 연결될 수 있다. 이러한 기의 잔기는 일부 경우에 항체 단편 및 중합체 간의 연결기로서 생성물의 일부를 형성할 것임이 이해될 것이다.
중합체의 크기는 원하는 대로 달라질 수 있지만, 일반적으로 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들어 5000 내지 40000 Da, 예컨대 20000 내지 40000 Da의 평균 분자량 범위일 것이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 의도된 용도, 예를 들어 종양과 같은 특정 조직에 국소화하거나 순환 반감기를 연장시키는 능력에 기초하여 선택될 수 있다(검토를 위해, Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545 참고). 따라서, 예를 들어, 생성물이, 예를 들어 종양의 치료에 사용하기 위해, 순환을 떠나 조직에 침투하는 것이 의도되는 경우, 예를 들어 약 5000 Da의 분자량을 갖는 작은 분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환에 유지되는 적용의 경우, 예를 들어 20000 Da 내지 40000 Da 범위의 분자량을 갖는 더 높은 분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) 또는, 특히, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체, 및 특히 약 15000 Da 내지 약 40000 Da 범위의 분자량을 갖는 것을 포함한다.
일 예에서, 본 발명에 사용하기 위한 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 일 특정 예에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편에 위치한 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 자유 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카르복실기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에서 자연적으로 발생할 수 있거나 재조합 DNA 방법을 사용하여 단편으로 조작될 수 있다(예를 들어, US 제5,219,996호; US 제5,667,425호; WO제98/25971호, WO제2008/038024호 참고). 일 예에서, 본 발명의 항체 분자는 변형된 Fab 단편이며, 변형은 효과기 분자의 부착을 허용하기 위해 하나 이상의 아미노산을 그의 중쇄의 C-말단에 부가하는 것이다. 적합하게, 추가의 아미노산은 효과기 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 다수의 부위가 2개 이상의 PEG 분자를 부착하는 데 사용될 수 있다.
적합하게 PEG 분자는 항체 단편에 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올기를 통해 공유 결합된다. 변형된 항체 단편에 부착된 각각의 중합체 분자는 단편에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유 결합될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 이황화물 결합 또는, 특히, 황-탄소 결합일 것이다. 티올기가 부착점으로서 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 효과기 분자, 예를 들어 티올 선택적 유도체, 예컨대 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기재된 바와 같은 중합체 변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응기, 예컨대 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예컨대 아이오도아세타미드, 이미드, 예컨대 말레이미드, 비닐 설폰 또는 이황화물을 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로 수득될 수 있거나(예를 들어, Nektar, 이전에 Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA로부터) 또는 종래의 화학 절차를 사용하여 상업적으로 이용가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 특정 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(Nektar, 이전에 Shearwater; Rapp Polymere; 및 SunBio로부터 수득가능함) 및 M-PEG-SPA(Nektar, 이전에 Shearwater로부터 수득가능함)를 포함한다.
일 실시양태에서, 항체는 페길화된, 즉, 예컨대 EP 제0948544호 또는 EP제1090037호에 개시된 방법에 따라, 공유 부착된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))를 갖는 변형된 Fab 단편, Fab' 단편 또는 diFab이다[또한 "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545 참고]. 일 예에서 PEG는 힌지 영역 내의 시스테인에 부착된다. 일 예에서, PEG 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역 내의 단일 티올기에 공유 결합된 말레이미드기를 갖는다. 리신 잔기는 말레이미드기에 공유 결합될 수 있고, 리신 잔기 상의 아민기 각각에 대략 20,000 Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착된다. 따라서, Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da일 수 있다.
특정 PEG 분자는, PEG2MAL40K(Nektar, 이전에 Shearwater로부터 수득가능함)로도 공지된, N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000) 변형된 리신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드를 포함한다.
PEG 링커의 대안적인 공급원은 GL2-400MA3(하기 구조에서의 m은 5임) 및 GL2-400MA(m은 2임)를 공급하는 NOF를 포함하고, n은 대략 450이다:
Figure pct00002
다시 말해서, 각각의 PEG는 약 20,000 Da이다.
따라서, 일 실시양태에서, PEG는 SUNBRIGHT GL2-400MA3으로 공지된 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-{[3-(6-말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시} 헥산(2 아암 분지된 PEG, -CH2）3NHCO(CH2)5-MAL, Mw 40,000이다.
하기 유형의 추가의 대안적인 PEG 효과기 분자는
Figure pct00003
Dr Reddy, NOF 및 Jenkem으로부터 이용가능하다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 Fab 또는 Fab'는 PEG 분자에 접합된다.
일 실시양태에서, 사슬에서 아미노산 226 또는 그 부근의 시스테인 아미노산 잔기, 예를 들어 중쇄의 아미노산 226(순차적 넘버링에 의해), 예를 들어 서열번호: 26의 아미노산 224를 통해 부착된, 페길화된(예를 들어, 본원에 기재된 PEG를 갖는) 항체가 제공된다.
일 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 PEG 중합체, 예를 들어 40 kDa 중합체 또는 중합체들과 같은 1 또는 2개의 중합체를 포함하는 Fab'PEG 분자를 제공한다.
본 개시내용에 따른 Fab'-PEG 분자는 Fc 단편과 무관한 반감기를 갖는다는 점에서 특히 유리할 수 있다. 일 실시양태에서, PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자와 같은 중합체에 접합된 Fab'가 제공된다. 일 실시양태에서, PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자와 같은, 중합체에 접합된 scFv가 제공된다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 Fab 또는 Fab'는 인간 혈청 알부민에 접합된다. 일 실시양태에서, 항체 또는 단편은, 예를 들어 반감기를 증가시키기 위해, 전분 분자에 접합된다. 전분을 단백질에 접합시키는 방법은 본원에 참조로 포함된 US 제8,017,739호에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 화학적 가공에 의해 생산된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
분자 생물학의 표준 기술은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 DNA 서열을 제조하는 데 사용될 수 있다. 원하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위 지향 돌연변이 유발 및 중합효소 사슬 반응(PCR) 기술이 적절하게 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드는
a. 경쇄 가변 영역으로서, 폴리뉴클레오타이드가
i. 서열번호: 15 또는 서열번호: 19 또는 서열번호: 23과 적어도 90% 동일하거나; 또는
ii. 서열번호: 15 또는 서열번호: 19 또는 서열번호: 23을 포함하거나; 또는
iii. 서열번호: 15 또는 서열번호: 19 또는 서열번호: 23으로 본질적으로 구성되는 것인 경쇄 가변 영역;
b. 중쇄 가변 영역으로서, 폴리뉴클레오타이드가
i. 서열번호: 27과 적어도 90% 동일하거나; 또는
ii. 서열번호: 27을 포함하거나; 또는
iii. 서열번호: 27로 본질적으로 구성되는 것인 중쇄 가변 영역;
c. 경쇄로서, 폴리뉴클레오타이드가
i. 서열번호: 16 또는 서열번호: 20 또는 서열번호: 24와 적어도 90% 동일하거나; 또는
ii. 서열번호: 16 또는 서열번호: 20 또는 서열번호: 24를 포함하거나; 또는
iii. 서열번호: 16 또는 서열번호: 20 또는 서열번호: 24로 본질적으로 구성되는 것인 경쇄;
d. 중쇄로서, 폴리뉴클레오타이드가
i. 서열번호: 28과 적어도 90% 동일하거나; 또는
ii. 서열번호: 28을 포함하거나; 또는
iii. 서열번호: 28로 본질적으로 구성되는 것인 중쇄
를 코딩한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 일 예에서, 본 발명에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는 서열번호: 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27 또는 28로부터 선택된 서열을 포함하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
벡터가 구축될 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel(ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참고한다.
또한 본 발명에 따른 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현에 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어 E. coli, 및 다른 미생물 시스템이 사용될 수 있거나, 진핵, 예를 들어 포유동물, 숙주 세포 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)의 적합한 유형은 CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포와 같은 dhfr- CHO 세포를 포함하고 DHFR 선별 마커와 함께 사용될 수 있는 CHO 및 CHO-K1 세포 및 글루타민 합성효소 선별 마커와 함께 사용될 수 있는 CHOK1-SV 세포를 포함할 수 있다. 항체를 발현하는 데 사용하기 위한 다른 세포 유형은 림프구성 세포주, 예컨대, NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포를 포함한다. 숙주 세포는 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 발현 벡터로 안정적으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 숙주 세포는 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열번호: 15 및 27 또는 서열번호: 19 및 27 또는 서열번호: 23 및 27 또는 서열번호: 16 및 28 또는 서열번호: 20 및 28 또는 서열번호: 24 및 28에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터로 안정적으로 형질감염된 CHO-DG44 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 숙주 세포를 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생산 방법을 제공한다.
중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드 코딩 서열만이 숙주 세포를 형질감염시키는 데 사용될 필요가 있는 경우, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드만을 포함할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 모두를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생산을 위해, 세포주는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 벡터인 2개의 벡터로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 단일 벡터가 사용될 수 있다.
따라서, 숙주 세포를 배양하고 항체 또는 이의 단편을 발현시키고, 후자를 단리하고 선택적으로 이를 정제하여 단리된 항체 또는 단편을 제공하는 방법이 제공된다. 일 실시양태에서, 방법은 효과기 분자를 단리된 항체 또는 단편에 접합시키는 단계, 예를 들어 특히 본원에 기재된 바와 같은 PEG 중합체에 접합시키는 단계를 추가로 포함한다.
따라서 일 실시양태에서, 실질적으로 정제된 형태인, 특히 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA가 없거나 실질적으로 없는, 정제된 항-알파 시누클레인 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 인간화 항체 또는 이의 단편, 특히 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
내독소가 실질적으로 없다는 것은 일반적으로 항체 생성물 1 mg당 1 EU 이하, 예컨대 생성물 1 mg당 0.5 또는 0.1 EU의 내독소 함량을 지칭하는 것으로 의도된다.
숙주 세포 단백질 또는 DNA가 실질적으로 없다는 것은 일반적으로 항체 생성물 1 mg당 400 μg 이하, 예컨대 1 mg당 100 μg 이하, 특히 적절하게는 1 mg당 20 μg의 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량을 지칭하는 것으로 의도된다.
본 발명의 항체는 알파 시누클레인병증과 같은 병리학적 상태의 치료, 진단 및/또는 예방에 유용하므로, 본 발명은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 조합된 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 또는 진단 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유일한 활성 성분이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 추가의 활성 성분과 조합된다. 대안적으로, 약제학적 조성물은 유일한 활성 성분인 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그것은 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 조합하여(예컨대, 동시에, 순차적으로 또는 별도로) 환자에게 개별적으로 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 약제학적 조성물은 서열번호: 13 또는 17 또는 21의 경쇄 가변 영역을 포함하고 서열번호: 25의 중쇄 가변 영역을 포함하는, 예를 들어 서열번호: 13 및 서열번호: 25 또는 서열번호: 17 및 서열번호: 25 또는 서열번호: 21 및 서열번호: 25의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 필요한 치료적 유효량을 확인하기 위해 환자에게 적합하게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "치료적 유효량"은 표적화된 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하거나, 또는 감지가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 항체의 경우, 치료적 유효량은 세포 배양 분석 또는 동물 모델에서, 일반적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 초기에 추정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이후, 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하는 데 사용될 수 있다.
인간 대상체에 대한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 요법에 대한 내성/반응에 좌우될 것이다. 이 양은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있으며, 임상의의 판단에 속한다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예컨대 100 mg/kg일 것이다. 약제학적 조성물은 용량당 미리 결정된 양의 본 발명의 활성제를 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 제공될 수 있다.
치료 조성물에서 약제학적으로 허용가능한 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 또한, 습윤 또는 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약제학적 조성물을 환자가 섭취하기 위한 정제, 환제, 드라제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제제화되게 한다.
투여를 위한 적합한 형태는 비경구 투여에 적합한 형태, 예컨대 주사 또는 주입에 의한 형태, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 형태, 정맥내, 흡입가능한 또는 피하 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 유성 또는 수성 비히클에서 현탁액, 용액 또는 유화액의 형태를 취할 수 있고, 제제화제, 예컨대 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적절한 멸균 액체와 함께 사용하기 전에 재구성을 위한 건조 형태일 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다.
제제화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 따라서, 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도가 본원에 제공된다.
치료될 대상체는 동물일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인간 대상체에게 투여하기에 적합하다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한, 특히 하나 이상의 알파 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 하나 이상의 시누클레인병증을 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서는, 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a. 서열번호: 1에 따른 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5에 따른 CDR-H2 및 서열번호: 6에 따른 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호: 13 또는 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열번호: 14 또는 서열번호: 18 또는 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함하고,
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화되고 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집을 방지하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여, 적어도 잔기 D119, N122 및 Y125를 포함하는 에피토프에 대한 알파 시누클레인에 결합하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 베타-시누클레인과 교차반응하지 않고 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)로 알파 시누클레인에 결합한다.
또 다른 실시양태에서는, 하나 이상의 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a. 서열번호: 1에 따른 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5에 따른 CDR-H2 및 서열번호: 6에 따른 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호: 13 또는 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열번호: 14 또는 서열번호: 18 또는 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함하고;
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화되고 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집을 방지하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여, 적어도 잔기 D119, N122 및 Y125를 포함하는 에피토프에 대한 알파 시누클레인에 결합한다. 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 베타-시누클레인과 교차반응하지 않고 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)로 알파 시누클레인에 결합한다.
또 다른 실시양태에서는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 하나 이상의 시누클레인병증을 치료하는 방법이 제공되며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a. 서열번호: 1에 따른 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5에 따른 CDR-H2 및 서열번호: 6에 따른 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호: 13 또는 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열번호: 14 또는 서열번호: 18 또는 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함하고;
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화되고, 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집을 방지하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여, 적어도 잔기 D119, N122 및 Y125를 포함하는 에피토프에 대한 알파 시누클레인에 결합한다. 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 베타-시누클레인과 교차반응하지 않고 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)로 알파 시누클레인에 결합한다.
본 발명에 따른 알파 시누클레인병증은, 비제한적으로, 파킨슨병(PD)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB), 확산성 루이소체병(DLBD), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1)을 포함한다. 바람직하게는, 알파 시누클레인병증은 파킨슨병(PD)이다.
또 다른 실시양태에서는, 파킨슨병(PD)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB), 확산성 루이소체병(DLBD), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1), 바람직하게는 파킨슨병(PD)의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물이 제공되며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a. 서열번호: 1에 따른 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5에 따른 CDR-H2 및 서열번호: 6에 따른 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호: 13 또는 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열번호: 14 또는 서열번호: 18 또는 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함하고;
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화되고, 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집을 방지하며, 선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여, 적어도 잔기 D119, N122 및 Y125를 포함하는 에피토프에 대한 알파 시누클레인에 결합하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 베타-시누클레인과 교차반응하지 않고 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)로 알파 시누클레인에 결합한다.
또 다른 실시양태에서는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 파킨슨병(PD)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB), 확산성 루이소체병(DLBD), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1), 바람직하게는 파킨슨병(PD)을 치료하는 방법이 제공되며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a. 서열번호: 1에 따른 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5에 따른 CDR-H2 및 서열번호: 6에 따른 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호: 13 또는 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열번호: 14 또는 서열번호: 18 또는 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함하고;
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화되고, 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집을 방지하며, 선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여, 적어도 잔기 D119, N122 및 Y125를 포함하는 에피토프에 대한 알파 시누클레인에 결합하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 베타-시누클레인과 교차반응하지 않고 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)로 알파 시누클레인에 결합한다.
대안적으로, 본 발명은 또한 알파 시누클레인병증을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공하고, 알파 시누클레인병증은 바람직하게는 파킨슨병(PD)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB), 확산성 루이소체병(DLBD), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1), 보다 바람직하게는 파킨슨병(PD)이며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a. 서열번호: 1에 따른 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가병 영역; 및 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5에 따른 CDR-H2 및 서열번호: 6에 따른 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호: 13 또는 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열번호: 14 또는 서열번호: 18 또는 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함하고;
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화되고, 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집을 방지하며, 선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여, 적어도 잔기 D119, N122 및 Y125를 포함하는 에피토프에 대한 알파 시뉴클레인에 결합하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 베타-시누클레인과 교차반응하지 않고 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)로 알파 시누클레인에 결합한다.
또한 본 발명의 일부는, 예를 들어 파킨슨병(PD)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB), 확산성 루이소체병(DLBD), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1)과 같은 알파 시누클레인병증을 진단하기 위한, 진단 활성제로서 또는 진단 분석에서 사용하기 위한 항-알파 시누클레인 항체 또는 항원 결합 단편의 용도이다.
진단은 바람직하게는 생물학적 샘플 상에서 수행될 수 있다. "생물학적 샘플"은 개체로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포함하고 진단 또는 모니터링 분석에 사용될 수 있다. 정의는 뇌척수액, 혈액, 예컨대 혈장 및 혈청, 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플, 예컨대 소변 및 타액, 고체 조직 샘플, 예컨대 생검 시료 또는 조직 배양액 또는 이로부터 유래된 세포 및 이의 자손을 포함한다. 정의는 또한 시약 처리, 가용화, 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 특정 구성요소의 농축과 같이, 이들의 입수 후에 임의의 방식으로 조작된 샘플을 포함한다.
진단 시험은 바람직하게는 인간 또는 동물 신체와 접촉하지 않은 생물학적 샘플 상에서 수행될 수 있다. 이러한 진단 시험은 시험관내 방법으로도 지칭된다. 시험관내 진단 시험은 i) 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-알파 시누클레인 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 ii) 알파 시누클레인에 대한 항-알파 시누클레인 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 개체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 알파 시누클레인을 검출하는 시험관내 방법에 의존할 수 있다. 검출된 알파 시누클레인 수준 또는 알파 시누클레인의 특정한 번역 후 변형된 형태의 존재를 적합한 대조군과 비교함으로써, 하나 이상의 알파 시누클레인병증이 확인될 수 있다. 따라서, 이러한 검출 방법은 알파 시누클레인병증의 단계(중증도)를 결정하는 것을 포함하여, 대상체가 알파 시누클레인병증을 갖거나 발생할 위험이 있는지 결정하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 알파 시누클레인병증의 진단에, 바람직하게는 파킨슨병(PD)의 진단에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a. 서열번호: 1에 따른 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5에 따른 CDR-H2 및 서열번호: 6에 따른 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호: 13 또는 서열번호: 17 또는 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열번호: 14 또는 서열번호: 18 또는 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
를 포함하고;
선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여, 적어도 잔기 D119, N122 및 Y125를 포함하는 에피토프에 대한 알파 시누클레인에 결합한다.
본 발명에 포함되는 서열이 표 1에 나타나 있다:
표 1
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
본 발명은 이제 첨부 도면에 예시된 실시양태를 참조하여 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 인간 알파 시누클레인 단량체 및 피브릴의 발현
인간 알파-시누클레인을 코딩하는 유전자를 합성적으로 생성하고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 벡터 pMH 10His TEV(CMV 프로모터 함유) 내로 서브클로닝하여, N-말단 10His-TEV 태그를 갖는 알파 시누클레인을 생산하도록 조작된 벡터를 생성하였다. 생성된 벡터를 제조사의 프로토콜에 따라 Expi293TM 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하여 Expi293F 세포 내로 형질감염시켰다. 알파 시누클레인 단백질은 배양 배지에 축적되었고, 상기 배양 배지로부터 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 HisTrap 엑셀 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 회수하였다. 컬럼을 25 mM TrisHCl, 300 mM NaCl, pH8.0으로 세척하고, 단백질을 동일한 완충액 중의 500 mM 이미다졸의 단계적 구배로 용리시켰다. 10His 태그를 TEV 프로테아제를 사용하여 제거하였다. 그리고 나서, 샘플을 농축시키고 탈염시킨 후 절단된 단백질을 HisTrap 엑셀 컬럼에 재적용하고 절단된 알파 시누클레인을 통과액에서 수집하였다. 알파 시누클레인을 HiLoad 26/600 Superdex 75 컬럼(GE Healthcare)에서 겔 여과에 의해 추가로 정제하고, Proteus NoEndo 카트리지(Generon)를 통과시켜 내독소를 제거하였다. 정제된 알파 시누클레인은 SEC MALS에 의해 단량체인 것으로 확인되었다(도 1A).
야생형(태그되지 않음) 인간 알파 시누클레인을 또한 Expi293F 세포에서 발현시켰다. 단백질을 HiTrap Q 컬럼(GE Healthcare)을 사용한 음이온 교환을 통해 배양 배지로부터 회수하였다. 컬럼을 20 mM TrisHCl pH 8.0으로 세척하고, 400 mM까지의 염화 나트륨 구배를 사용하여 단백질을 용리시켰다. 분획을 HiPrep 26/10 컬럼(GE Healthcare)을 통과시켜 농축 및 탈염시키고 20 mM TrisHCl pH 8.0으로 용리시켰다. 단백질을 MonoQ 10/100GL 컬럼을 사용하여 추가로 정제하고, 20 mM TrisHCl pH 8.0에서 400 mM까지의 염화 나트륨 구배로 용리시킨 다음, PBS pH 7.4에서의 용리와 함께, HiLoad 26/600 Superdex 75 컬럼(GE Healthcare)에서 겔 여과하였다(도 1B).
이 야생형 태그되지 않은 알파 시누클레인 단량체를 사용하여 10일 동안 지속적으로 Vortemp56 진탕 인큐베이터(Labnet)에서 1200 rpm, 37℃에서 정제된 단량체(PBS pH 7.4에서 9-10 mg/mL)를 교반함으로써 알파-시누클레인 피브릴을 제조하였다. 용액의 JC-1 분석(Lee et al., Biochem. J. 2009, 418, 311-323), 및 C 푸리에 변환 적외선 분광학에 의해 피브릴 형성을 평가하였다. 피브릴 용액 중의 혼입되지 않은 단량체를 초원심분리에 의해 그리고 100 KDa 컷오프 막 통과 후 겔 전기영동에 의해 평가하였다. JC-1 반응 > 15, 소량의 가용성 단량체(< 5%) 및 1625 및 1630 cm-1 사이의 주요 흡수를 갖는 FTIR 스펙트럼을 갖는 피브릴만을 추가 연구에 사용하였다(도 2). 제조된 피브릴을 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2: 면역화 및 항체 단리
다양한 종 및 면역원을 사용하는 많은 면역화 전략을 수행하였다. 항체 5811은 상기 기재된 바와 같이 발현된 50 μg의 야생형 태그되지 않은 알파 시누클레인 단량체(서열번호: 8)를 이용한 피하 면역화를 받은 암컷 스프라구에 다울레이 랫트(> 180 g)로부터 유래되었다.
면역화 14일 후 꼬리 정맥으로부터 채혈한 혈액을 갖는 불완전 프로인트 보조제(IFA)를 사용하여 21일 간격으로 랫트에게 3회 부스터 주사를 제공하였다. -80℃에서 10% DMSO/FCS에서 제조 및 동결된 비장, 림프절, 골수 및 말초 혈액 단핵 세포의 단일 세포 현탁액으로 최종 부스트 후 14일에 종결하였다.
B 세포 배양
B 세포 배양액을 문헌[Tickle et al., 2015. J Biomol Screen: 20(4), 492-497]에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 제조하였다. 간략하게, 면역화된 동물로부터의 림프절 또는 비장세포 유래 B 세포를 5% CO2의 대기 중에 37℃에서 7일 동안 10% FCS(Sigma Aldrich), 2% HEPES(Sigma Aldrich), 1% L-글루타민(Gibco BRL), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Gibco BRL), 0.1% β-머캅토에탄올(Gibco BRL), 1% 활성화된 인간 PBMC 상층액(BSS) 및 X선 조사된 돌연변이체 EL4 쥣과 흉선종 세포(5x104/웰)가 보충된 200 μl/웰 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)를 갖는 바코드된 96-웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 대략 2000-5000 세포의 밀도로 배양하였다. 배양을 면역화된 모든 동물의 B 세포를 사용하여 설정하였고, 총 대략 1.7 x 109개의 B 세포를 샘플링하였다.
본 발명에 따른 항체 5811을 웰당 대략 2000개의 세포의 밀도로 배양된 활성화된 림프절 유래된 B 세포로부터 생성하였다. 신규한 항체를 샘플링하고 확인하는 B 세포의 대안적인 공급원을 제공하기 위한 항체 발견을 위해 비장 세포 외에도 림프절을 사용하였다. 대략 3.3x108개의 세포를 전장 단량체 인간 알파 시누클레인 면역화된 랫트로부터 샘플링하였다.
일차 스크리닝
표적 항원의 공급원으로서 바이오티닐화된 재조합 인간 알파 시누클레인 전장 단량체가 코팅된 수퍼아비딘(Superavidin)™ 비드(Bangs Laboratories)를 사용한 균일 형광 기반 결합 분석을 사용하여 B 세포 배양 상층액에서 인간 알파 시누클레인 특이적 항체의 존재를 결정하였다. 본원에 기재된 바와 같은 재조합 인간 알파 시누클레인을 3배 몰 과량의 바이오틴을 사용하여 바이오티닐화하였다. 알파 시누클레인 분자 내에 존재하는 7개의 모든 리신 잔기의 완전한 변형을 피하기 위해 낮은 몰 과량의 바이오틴을 사용하였다. 알파 시누클레인 단량체를 바이오틴과 함께 40℃에서 인큐베이션하고, 다음날 유리 바이오틴을 Zeba™ 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 제거하였다. 스크리닝은 애질런트 브라보(Agilent Bravo) 액체 핸들러를 사용하여 바코드된 96-웰 조직 배양 플레이트로부터 10 μl의 상층액을 수퍼아비딘 비드(10 ul/웰)에 고정화된 바이오티닐화된 재조합 인간 알파 시누클레인 단량체를 함유하는 바코드된 384-웰 검은 벽 분석 플레이트 내로 이동시키는 것을 수반하였다. 결합을 염소 항-랫트 IgG Fcγ 단편 특이적 Alexafluor647 접합체(Jackson)로 밝혀내었다. 알파 시누클레인 특이적 IgG를 함유하는 웰을 확인하기 위해 TTP Labtech Mirrorball 상에서 플레이트를 판독하였다.
이차 스크리닝
일차 스크리닝 후, 양성 상층액을 베크만 쿨터 BiomekNXP 적중-피킹(hit-picking) 로봇을 사용하여 96-웰 바코드된 마스터 플레이트 상에서 통합하고, 세포 배양 플레이트 내의 B 세포를 -80℃에서 동결시켰다. 그리고 나서, 바이오티닐화된 재조합 인간 알파 시누클레인 단량체 또는 바이오티닐화된 재조합 인간 알파 시누클레인 피브릴을 사용하여 스트렙타비딘-포획 ELISA 분석에서 마스터 플레이트를 스크리닝하였다. 이를 수행하여 단량체 및 피브릴 재조합 인간 알파 시누클레인 모두에 대한 결합을 제공하는 웰을 확인하고, 수퍼아비딘™ 비드에 대한 오프-표적 결합을 나타내는 임의의 위양성 웰을 배제하였다. 피브릴의 불용성 특성을 고려할 때, 용액 중의 단백질과 함께 사용되는 종래의 ELISA 코팅 프로토콜은 선호되지 않았다. 피브릴 구조를 보존하고 스트렙타비딘이 미리 코팅된 ELISA 플레이트 상에 피브릴의 효율적인 코팅을 용이하게 하기 위해 최소 바이오티닐화 프로토콜을 사용하기로 결정하였다.
바이오티닐화된 재조합 알파 시누클레인 단량체(상기 기재된 바와 같음)를 PBS 중의 50배 과량의 표지되지 않은 재조합 알파 시누클레인과 조합함으로써, 바이오티닐화된 알파 시누클레인 총 피브릴을 본원에 기재된 바와 같이 생성하였다. 피브릴 형성을 JC1 분석에 의해 확인하였다(Lee et al., Biochem. J. 2009, 418, 311-323).
PBS 중의 바이오티닐화된 단량체 또는 바이오티닐화된 피브릴을 카르보네이트 코팅 완충액(dH2O + 0.16% Na2CO3 + 0.3% NaHCO3) 중의 스트렙타비딘이 코팅된 384-웰 맥시소프(Maxisorp) 플레이트 상에서 포획하였다. 플레이트를 1% w/v PEG/PBS로 차단한 다음 10 μl/웰의 B 세포 배양 상층액(차단 완충액으로 1:1 희석됨)과 함께 인큐베이션하였다. 이차 HRP 접합된 염소 항-랫트 IgG Fcγ 단편 특이적 HRP 접합체(Jackson)를 플레이트에 첨가한 후, TMB 기질(EMD Millipore로부터의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘; 10 μl/웰)로 결합을 가시화하였다. 바이오텍 시너지(Biotek Synergy) 2 마이크로플레이트 리더를 사용하여 630 nM에서 광학 밀도를 측정하였다. 일차 결합 분석은 83개의 적중을 확인하였고, ELISA 스크리닝 후, 이들 중 29개는 단량체 및 피브릴 재조합 인간 알파 시누클레인 모두에 결합하는 것으로 나타났다.
재조합 인간 알파 시누클레인 단량체, 재조합 인간 알파 시누클레인 피브릴 및 재조합 마우스 알파 시누클레인 피브릴 상에서 최상의 오프-속도를 갖는 것을 확인하기 위해, 재조합 피브릴에 대해 가장 강한 ELISA 결합 신호를 나타내는 B 세포 상층액을 표면 플라즈몬 공명에 의한 추가 분석을 위해 선택하였다. 26개의 상이한 B 세포로부터의 상층액을 시험하였고, 19개의 웰은 재조합 인간 알파 시누클레인 단량체 상에서 < 1x10-5의 오프-속도(kd)를 제공하였다. 이들 중에서, 6개는 재조합 마우스 알파 시누클레인 단량체 상에서 1x10-5 미만의 오프-속도(kd)를 제공하였다. 19개의 모든 상층액을 가변 영역 회수를 위해 선택하였다.
가변 영역 회수
관심 상층액의 선택으로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하기 위해, B 세포의 이종 집단을 함유한 주어진 웰에서 항원 특이적 B 세포의 확인을 가능하게 하는 디컨볼루션(deconvolution) 단계를 수행해야 했다. 이것은 형광 초점 방법을 사용하여 달성되었다(Clargo et al., 2014. MAbs: 6(1), 143-159). 간략하게, 양성 웰로부터의 면역글로불린 분비 B 세포를 바이오티닐화된 재조합 인간 알파 시누클레인 피브릴(상기 기재된 바와 같이 1:50 혼합물을 사용하여 생성됨)이 코팅된 스트렙타비딘 비드(New England Biolabs) 및 염소 항-랫트 IgG Fcγ 단편 특이적 FITC 접합체(Jackson)의 1:1200 최종 희석액과 혼합하였다. 37℃에서 1시간 동안 정적 인큐베이션 후, 항원 특이적 B 세포는 B 세포를 둘러싸는 형광 할로(halo)의 존재로 인해 확인될 수 있었다. 그리고 나서, 올림푸스 현미경을 사용하여 확인된 많은 이들 개별 B 세포 클론을 에펜도르프 미세조작기로 픽킹하고 PCR 튜브에 넣었다.
항체 가변 영역 유전자를 중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이적 프라이머를 사용한 역전사(RT)-PCR에 의해 단일 세포로부터 회수하였다. 3' 및 5' 말단에 제한 부위를 혼입시키는 네스티드 2° PCR로 2회의 PCR을 수행하여, 가변 영역을 마우스 IgG Fcγ1 또는 Fab-10HIS(VH) 또는 마우스 카파(VL) 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 9개의 상이한 상층액으로부터의 항-알파 시누클레인 항체 유전자를 발현 벡터 내로 성공적으로 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄 작제물을 ExpiFectamine 293(Invitrogen)을 사용하여 Expi-293 세포 내로 공동 형질감염시키고, 랫트-마우스 키메라 재조합 항체 5811 mFab 또는 5811 mIgG1(랫트 5811 가변 영역 및 마우스 불변 영역 포함)(IgG에 대한 서열번호: 34 및 35 및 Fab에 대한 서열번호: 34 및 36에 따름)을 30 ml의 부피로 125 ml 엘렌마이어 플라스크에서 발현시켰다. 5-7일 발현 후, 상층액을 채취하고 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
일시적 상층액의 ELISA 스크리닝
그리고 나서, 정제된 랫트-마우스 키메라 항체를 ELISA에 의해 추가로 스크리닝하였다. 바이오티닐화된 재조합 인간 알파 시누클레인 단량체 및 피브릴을 카르보네이트 코팅 완충액(dH2O + 0.16% Na2CO3 + 0.3% NaHCO3) 중의 스트렙타비딘으로 코팅된 384-웰 맥시소프 플레이트(ThermoScientific/Nunc) 상에서 포획하였다. 개별 플레이트를 또한 서열번호: 8(펩타이드 PVDPDNEAYE)에 따른 인간 알파 시누클레인의 잔기 117 내지 126에 상응하는 바이오티닐화된 펩타이드로 코팅하여 일시물(transient)이 분자 상의 이 영역 또는 다른 영역에 결합하였는지 여부를 확인하였다. 플레이트를 1% w/v PEG/PBS로 차단시킨 다음, 정제된 일시적 상층액의 몇 개의 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 이차 HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG Fc 항체(Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch)를 플레이트에 첨가한 후, TMB 기질(EMD Millipore로부터의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘; 10 μl/웰)로 결합을 가시화하였다. 광학 밀도를 바이오텍 시너지 2 마이크로플레이트 리더를 사용하여 630 nM에서 측정하였다. IgG Fcγ1(서열번호: 34 및 35 포함)로서 그리고 Fab(서열번호: 34 및 36 포함)로서 항체 5811에 대한 데이터가 도 3A 및 3B에 나타나 있다. 알 수 있는 바와 같이, 5811 항체는 단량체 및 피브릴 재조합 인간 알파 시누클레인 모두에 대한 결합을 나타내며, 또한 PVDPDNEAYE 펩타이드에 대한 결합을 나타낸다.
이러한 항체의 활성, 친화성 및 결합력, 에피토프 결합 및 생물물리학 특성을 결정하기 위해 추가 특징규명을 수행하였다. 인간화된 버전이 사용되었음을 명시적으로 언급하지 않는 한, 실험을 랫트-마우스 키메라 항체(5811 mFab 또는 5811 mIgG1)로 수행하였다.
실시예 3: 항체 특징규명
비아코어 ( Biacore ) 동역학
상호작용 동역학을 비아코어 T200 기기 상에서 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 결정하였다. 본원에 기재된 바와 같이 제조된 재조합 전장 인간 알파 시누클레인 단량체, 정제된 재조합 인간 알파 시누클레인 피브릴, 및 정제된 재조합 마우스 알파 시누클레인 피브릴을 포함하는 3개의 상이한 리간드를 각각 아민-커플링 화학을 사용하여 CM5 칩 표면의 3개의 상이한 유세포 상에 고정화시켰다. 3개의 리간드를 10 mM NaAc, pH 3.5에서 제조하고, 별도의 유세포 표면 상에 고정화시켜 10 μl/분의 유속으로, 각각 알파 시누클레인 단량체에 대해 약 30 반응 단위(RU), 인간 알파 시누클레인 피브릴에 대해 약 40 RU, 및 마우스 알파 시누클레인 피브릴에 대해 약 300 RU의 고정화 수준에 도달시켰다. 완충액 HBS-EP+(GE healthcare Bio-Sciences AB)를 리간드 고정화 및 동역학 분석 모두를 위한 러닝 완충액으로 사용하였다. 그리고 나서, 3개의 리간드에 대한 항-알파 시누클레인 단클론 5811 mIgG1 항체 및 단클론 5811 mFab 항체의 결합을 측정하였다. 단클론 mIgG1 또는 mFab 항체를 100 μl/분의 유속으로, 3분의 접촉 시간 및 30분의 해리 시간으로 3개의 유세포에 대해 800 nM 내지 0.195 nM의 7개의 상이한 농도로 주입하였다. 10 μl/분으로 90초 동안 50 mM HCl의 하나의 주입, 및 10 μl/분으로 60초 동안 50 mM HCl의 또 다른 주입에 의해 표면을 재생시켰다. mIgG1 포맷에 대해 가정된 벌크 기여 없음(RI=0) 및 글로벌 Rmax를 갖는 2가 분석물 모델, 및 유연한 벌크 기여(국소 RI) 및 글로벌 Rmax를 갖는 1:1 모델을 사용하는 Biacore T200 평가 소프트웨어(버전 3.0)을 사용하여 데이터를 분석하였다.
고정화된 표적에 대한 mIgG1 및 mFab 결합의 동역학 값이 표 2에 나타나 있다. 해리 상수 KD가 인간 피브릴에 대해 10배 넘게 낮기 때문에, mIgG1 포맷은 인간 알파 시누클레인 단량체에 대한 친화성과 비교하여 인간 알파 시누클레인 피브릴에 대해 명백한 선택적 친화성을 나타내었다.
표 2
Figure pct00009
베타 시누클레인에 대한 결합
인간 알파 시누클레인에 대해 생성된 항체의 인간 베타 시누클레인에의 결합을 rPeptide 베타 시누클레인을 사용한 웨스턴 블롯에 의해 시험하였다. 1 마이크로그램의 시누클레인을 4-12% Bis/Tris 겔 상에서 이동시키고, PVDF 막에 블롯팅하였다. 막을 3% BSA 및 0.1% Tween20을 갖는 PBS에서 차단하였다. 항체 5811 mIgG1을 차단된 블롯에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS, 0.1% Tween20으로 세척하고, 이차 항체-HRP 접합체(항 토끼 H+L HRP 접합체, Bethyl, A120-101P)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 0.1% Tween20을 갖는 PBS, PBS 및 물로 광범위하게 세척하였다. ECL 웨스턴 블롯 기질(Pierce)을 첨가한 후 화학발광을 측정하였다. 도 4(A) 레인 3에 나타낸 바와 같이, 항체 5811 mIgG1은 인간 베타-시누클레인에 결합하지 않는다.
에피토프 맵핑
NMR
인간 알파-시누클레인을 pET28a 발현 벡터 내로 클로닝하여, 단백질을 임의의 태그 없이 발현시켰다. 작제물을 E. coli BL21(DE3) 세포(Stratagene) 내로 형질전환시키고, 세포를 산화 중수소(D2O)의 존재 및 부재 하에 C13 표지된 DL-글루코스 및 N15 표지된 황산 암모늄을 갖는 한정 배지에서 성장시켰다. 300 mM IPTG를 이용하여 OD600 nm = 1에서 발현을 유도하고, 배양액을 4시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 100 ml 용해 완충액(20 mM Tris/HCl pH 8.0, 25 단위 벤조나제(Merck Millipore), 완전 EDTA 유리 프로테아제 억제제 칵테일(2 tablets, Roche) 및 10 mg 리소자임(Sigma))에서 3회의 동결-해동 사이클에 의해 펠렛화하고 용해시켰다. 용해물을 18,000 rpm에서 원심분리하여 정화시키고, 정화된 용해물을 0.22 μm 필터(Stericup, Millipore)를 통과시켰다. 멸균 용해물을 20 mM Tris/HCl pH 8.0, 5 CV로 평형화된 MonoQ 10/100GL(GE Healthcare)에 로딩하고, 단백질을 동일한 완충액에서 500 mM NaCl까지의 구배로 용리시켰다. 20 mM Tris/HCl pH 8.0에서 5배 희석 후, 가장 순수한 분획의 추가 정제를 MonoQ 10/100GL 컬럼 상에서 반복하였다. 가장 순수한 분획을 모으고, 10 kDa MWCO 원심 농축기(Centriprep, Millipore)로 농축하고, HiLoad 26/600 Superdex 75 컬럼(GE Healthcare) 상에서 크기 배제에 의해 정제하고, 25 mM 인산 나트륨 완충액, 100 mM NaCl(pH 6.4)에서 용리시켰다. Superdex 75 컬럼으로부터 분획을 모으고, 나트륨 아지드(0.02% 최종 농도) 및 AEBSF(10 μM 최종 농도)를 첨가하였다. 최종 단백질 농도는 대략 5 mg/ml이었다.
랫트-마우스 5811 Fab 항체를 His 태그된 독립체로서 CHO SXE에 발현시키고, His-태그 친화성 크로마토그래피에 의해 상층액으로부터 정제하고, 단백질을 상층액으로부터 HisTrap Excel(GE Healthcare)에 결합시키고, 이를 PBS 중의 250 mM 이미다졸로 용리시켰다. 용리 풀을 HiTrap GammaBind Plus Sepharose(GE Healthcare) 상에 로딩하고, 컬럼을 PBS로 세척하고, 단백질을 0.1M 글리신-HCl pH 2.6으로 용리시키고, pH를 0.75M 인산 나트륨 pH 9로 pH 6으로 조정하였다. 용리된 Fab-His 단백질을 HiPrep 26/10 탈염 컬럼 상에서 NMR 완충액(25 mM 인산 나트륨 pH 6.4, 100 mM NaCl)으로 완충액 교환하였다. Fab-His 단백질 분획을 농축하고, 프로테아제 억제제 AEBSF(10 μM 최종 농도) 및 나트륨 아지드(0.02% 최종 농도)를 첨가한 다음, Millex GV 0.22 μm 필터 상에서 여과 멸균하였다.
서열번호: 9의 VL 및 서열번호: 10의 VH를 갖는 항체 5811의 에피토프 결합을 항체의 Fab 단편을 사용한 이종핵 핵자기 공명(NMR) 분광학을 사용하여 결정하였다.
α- 시누클레인의 백본 할당
NMR 샘플은 전형적으로 5 mm Shigemi 튜브에 360 μM 13C/15N 표지된 또는 430 μM 2H/13C/15N 표지된 인간 알파 시누클레인의 단백질 농도를 갖는 350 μl 부피였다. 완충액 조건은 100 mM NaCl, 25 mM 인산 나트륨 pH 6.4, 10 μM AEBSF, 0.02% NaN3이었다. 모든 실험을 극저온으로 냉각된 프로브가 장착된 600 MHz Bruker AVIII 또는 800 MHz Bruker AVII 분광기 상에서 20℃에서 기록하였다. 증분당 8회의 스캔과 1.5초 이완 지연을 갖는, 각각 15N, 15N 및 1H 차원에서 28, 28 및 10 ppm의 스펙트럼 폭 및 117(F1), 117(F2) 및 140(F3)의 획득 시간으로 기록된 3D (H)N(CA)NNH 실험(Weisemann et al., 1993 3D Triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR 3)을 사용하여 단백질 내의 잔기의 백본 NMR 신호 사이의 순차적 연결 HN(i)-N(i)-N(i±1)을 수행하였다. 10%의 샘플링 밀도(40000개의 과복합 점(hyper-complex point) 중 4000개)로 불균일 샘플링을 사용하여, 2.75일의 총 획득 시간을 제공하였다. 순차적 연결을 확인하고, 잔기 유형을 TROSY-HNCA(Grzesiek and Bax, 1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432-440; Salzmann et.al., 1998. TROSY in triple-resonance experiments: new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 13585-90) 및 TROSY-HNCACB(Wittekind and Mueller, 1993 HNCACB, a High-Sensitivity 3D NMR Experiment to Correlate Amide-Proton and Nitrogen Resonances with the Alpha- and Beta-Carbon Resonances in Proteins. J. Magn. Reson. Ser. B 101, 201-205; Salzmann et.al., 1999. TROSY-type Triple Resonance Experiments for Sequential NMR Assignment of Large Proteins. J. Am. Chem. Soc. 121, 844-848) 실험을 사용하여 확인하였다. TROSY-HNCA 실험은 각각 13C, 15N 및 1H 차원에서 23, 28, 10 ppm의 스펙트럼 폭 및 12.1(F1), 21.7(F2) 및 100(F3) ms의 획득 시간으로 기록한 반면(증분당 8회 스캔, 1.5초 이완 지연, 1일 총 획득 시간), TROSY-HNCACB는 각각 13C, 15N 및 1H 차원에서 56, 28 및 10 ppm의 스펙트럼 폭 및 8.2(F1), 21.7(F2) 및 100(F3) ms의 획득 시간으로 기록하였다(증분당 8회 스캔, 1.5초 이완 지연, 1.7일 총 획득 시간). 각각 13C, 15N 및 1H 차원에서 10, 29, 10 ppm의 스펙트럼 폭 및 80(F1), 21.7(F2) 및 150(F3) ms의 획득 시간으로 기록된(증분당 8회 스캔 및 1.5초 이완 지연) TROSY-HNCO 스펙트럼(Grzesiek and Bax, 1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432-440; Salzmann et.al., 1998. TROSY in triple-resonance experiments: new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 13585-90)으로부터 백본 카르보닐 할당을 수득하였다. 15%의 샘플링 밀도(8050개의 과복합 점 중 1208개)로 불균일 샘플링을 사용하여, 19시간의 총 획득 시간을 제공하였다. NMR 스펙트럼을 NMRPipe(Delaglio et al., 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-93)를 사용하여 처리하였고, 선형 예측을 사용하여 질소에서의 유효 획득 시간을 최대 1배까지 연장하였다. 불균일 샘플링된 데이터를 하버드 반복 소프트 역치 방법을 사용하여 재구성하였고(Hyberts et al., 2012 Application of iterative soft thresholding for fast reconstruction of NMR data non-uniformly sampled with multidimensional Poisson Gap scheduling. J Biomol NMR 52, 315-27), 데이터를 다음 푸리에 수로 재구성하여, 간접 획득 시간을 최대 60%까지 증가시켰다. 데이터 분석을 Sparky(Goddard and Kneller, D.G. SPARKY 3. In., University of California, San Francisco)를 사용하여 수행하여, 프롤린 잔기 및 N-말단 메티오닌을 제외한 잔기의 99%에 해당하는, 133개의 잔기의 아미드 양성자 및 질소 공명을 할당하였다. 할당되지 않은 알파 시누클레인의 유일한 다른 잔기는 위치 2의 아스파르트산이었다.
항체 5811Fab 단편의 결합 부위의 맵핑
10% 몰 과량의 표지되지 않은 5811 Fab를 함유하는 2H/13C/15N 표지된 인간 α-시누클레인의 150 μM 샘플을 사용하여 5811의 결합 부위의 맵핑을 수행하였다. 샘플을 α-시누클레인의 백본 할당을 위해 상기 기재된 바와 같은 동일한 완충액에서 제조하였다. 알파 시누클레인/Fab 복합체 상에서 기록된 TROSY-HNCO(Grzesiek and Bax, 1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432-440; Salzmann et.al., 1998. TROSY in triple-resonance experiments: new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 13585-90) 스펙트럼을 자유 알파 시누클레인 상에 기록된 동등한 대조군 스펙트럼과 비교함으로써 1H, 15N 및 13C 화학적 이동 변화를 결정하였다. 자유 알파 시누클레인의 대조군 TROSY-HNCO 실험을 각각 13C, 15N, 및 1H 차원에서 10, 28 및 10 ppm의 스펙트럼 폭 및 80(F1), 21.7(F2) 및 150(F3) ms의 획득 시간으로 기록하였다(증분당 16회 스캔, 1.4초 지연 이완). 25%의 샘플링 밀도(8050개의 과복합 점 중 2013개)로 불균일한 샘플링(NUS)을 사용하여 2.5일의 총 획득 시간을 제공하였다. α-시누클레인/Fab 복합체의 TROSY-HNCO 실험을 각각 13C, 15N, 및 1H 차원에서 10, 28 및 10 ppm의 스펙트럼 폭 및 80(F1), 21.7(F2) 및 80(F3) ms의 획득 시간으로 기록하였다(증분당 32회 스캔, 1.5초 이완 지연). 25%의 샘플링 밀도(4477개의 과복합 점 중에서 1119개)로 불균일한 샘플링을 사용하여 2.8일의 총 획득 시간을 제공하였다. NMR 스펙트럼을 NMRPipe(Delaglio et al., 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-93)를 사용하여 처리하였고, NUS 데이터의 재구성을 mddnmr(Orekhov and Jaravine, 2011. Analysis of non-uniformly sampled spectra with Multi-Dimensional Decomposition. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc., 59, p 271-292)을 사용하여 수행하였다. 질소 차원의 유효 획득 시간을 데이터 재구성 동안 최대 1배까지 증가시켰다.
조합된 화학적 이동 변화(△δ)를 계산하는 데 사용되는 방정식이 카르보닐 화학적 이동을 포함하도록 변형하여 하기 방정식을 생성하는 것을 제외하고, 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이(Veverka et al., 2008 Structural characterization of the interaction of mTOR with phosphatidic acid and a novel class of inhibitor: compelling evidence for a central role of the FRB domain in small molecule-mediated regulation of mTOR. Oncogene 27, 585-95), 최소 이동 접근법((Williamson et al., 1997 Mapping the binding site for matrix metalloproteinase on the N-terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases-2 by NMR chemical shift perturbation. Biochemistry 36, 13882-9)을 사용하여 화학적 이동 변화를 분석하였다:
Figure pct00010
상기 식에서, △δHN, △δN 및 △δC는 각각 1H, 15N 및 13C 화학적 이동의 차이이다. αN 및 αC는 아미드 양성자, 질소 및 카르보닐 화학적 이동의 화학적 이동 범위의 차이를 설명하기 위해 사용된 각각 0.2 및 0.35의 척도 인자(scaling factor)에 해당한다.
알파 시누클레인 상의 Fab 결합 부위(에피토프)를 확인하기 위해, 조합된 최소 이동 대 단백질 서열의 히스토그램을 사용하여 유의하게 교란된 신호를 함유하는 알파 시누클레인의 영역을 밝혀내었다. 개별 아미노산에 대한 조합된 화학적 이동 변화의 크기가 모든 아미노산에 대한 조합된 화학적 이동 변화의 평균 + 상기 평균으로부터의 1 표준 편차의 역치 값을 초과하는 경우, 이들 잔기를 Fab 결합 부위에서 가능한 접촉 잔기로서 추가의 평가를 위해 선택하였다.
유의하게 교란된 잔기는 최소 이동이 모든 계산된 이동의 평균 + 1 표준 편차보다 적어도 큰 잔기로서 확인되었다. 4개의 상이한 역치를 적용하여 Fab에 의해 결합된 잔기를 확인하였다. 결합 부위에 관여하는 잔기를 엄격성을 증가시켜 최소 이동이 모든 계산된 이동의 평균 + 1 표준 편차를 초과하는 잔기(> 0.025574임); 최소 이동이 모든 계산된 이동의 평균 + 2 표준 편차를 초과하는 잔기(> 0.042552임); 최소 이동이 모든 계산된 이동의 평균 + 3 표준 편차를 초과하는 잔기(> 0.059530임); 최소 이동이 모든 계산된 이동의 평균 + 4 표준 편차를 초과하는 잔기(> 0.076508임)로서 스코어링하였다. 이 분석에서, 프롤린 잔기는 아미드 양성자를 함유하지 않으므로 확인될 수 없다.
따라서, 5811 Fab에 대한 알파 시누클레인 에피토프는 엄격성을 증가시켜 모든 계산된 이동의 평균 + 1 표준 편차로서 정의되고: E114, D115, V118, D119, D121, N122, E123, A124, Y125, E126, M127, S129, Q134, D135 및 Y136; 모든 계산된 이동의 평균 + 2 표준 편차로서 정의되며: V118, D119, D121, N122, Y125, M127, D135 및 Y136; 모든 계산된 이동의 평균 + 3 표준 편차로서 정의되고: V118, D119, D121, N122, M127, D135 및 Y136; 잔기는 모든 계산된 이동의 평균 + 4 표준 편차 이상으로 이동하지 않았다.
NCBI 참조 서열 NP_000336.1에 사용된 아미노산 넘버링을 사용하여, 5811 Fab는 적어도 하기 알파 시누클레인 잔기(평균 + 3 SD) V118, D119, D121, N122, Y125, M127, D135 및 Y136에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 항체는 또한 모든 하기 잔기(평균 + 1 SD) E114, D115, V118, D119, D121, N122, E123, A124, Y125, E126, M127, S129, Q134, D135 및 Y136에 결합할 수 있다.
도 4B에 나타낸 바와 같이, NMR 화학적 이동은 5811 mFab와의 결합시에 dCN 인간 알파 시누클레인 상에서 변화되었다. 5811 mFab의 예측된 에피토프는 인간 알파-시누클레인(서열번호: 8)의 아미노산 114 및 136 내의 잔기를 포함하는 것으로 보인다.
펩타이드 맵핑
인간 알파 시누클레인의 C-말단 영역을 대표하고 커버하는 짧은(전형적으로 9-머 또는 10-머) 펩타이드를 사용하여 항체 5811 mFab에 의해 결합된 에피토프의 추가 특징규명을 수행하였다. 이들은 어느 것이 비아코어 칩 상에 고정화된 단량체 알파 시누클레인 또는 전형성된 알파 시누클레인 피브릴에 대한 항체의 결합을 억제할 수 있는지 시험하기 위해 경쟁적 표면 플라즈몬 공명 분석에서 시험하였다. 그리고 나서, 정확한 에피토프를 확인하기 위해, 최대 억제 수준을 나타내는 펩타이드를 항체와의 공결정화 연구를 위해 선택하였다.
펩타이드는 펩타이드 프로틴 리서치사(Peptide Protein Research Ltd., Bishop's Waltham, U.K.)에 의해 제공되었고, Atherton 및 Sheppard의 방법에 따라 Fmoc 고상 펩타이드 화학에 의해 합성되었다(참고: Atherton, E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press). 아미노 및 카르복실기가 각각 자유로운 상태로 남아 있는 α-시누클레인의 N-말단 및 C-말단을 나타내는 펩타이드의 경우를 제외하고, N 및 C 펩타이드 말단을 각각 아세틸 및 아미드기로 캡핑하였다. 펩타이드 스톡 용액을 10 mM에서 DMSO에서 제조하였다. 펩타이드의 전체 목록이 표 3에 나타나 있다.
표 3
Figure pct00011
재조합 인간 알파 시누클레인 단량체 및 전형성된 알파 시누클레인 피브릴을 비아코어 3000 기기(GE Healthcare)를 사용하여 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 러닝 완충액으로서 10 μl/분 HBS-EP(GE Healthcare)의 유속으로 50 mM N-하이드록시석신이미드 및 200 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드의 100 μl의 신선한 1:1(v/v) 혼합물을 주입하여 카르복시메틸 덱스트란 표면을 활성화시킨 후, 별도의 유세포 상에, 10 mM 아세테이트 pH 5.0에서의 5 μM로, 100 μl의 단량체 및 피브릴을 주입함으로써 커플링을 달성하였다. 참조 유세포를 동일한 방식으로 활성화시켰고, 이후 모든 유세포 표면을 1 M 에탄올아민.HCl pH 8.5의 50 μl 펄스로 비활성화시켰다.
펩타이드 용액을 100 μM에서 러닝 완충액에서 제조하고, 펩타이드 블랭크 대조군을 러닝 완충액에서 DMSO의 100분의 1 희석으로서 제조하였다. 198 μl를 2 μl의 블랭크 대조군 또는 희석된 펩타이드와 미리 인큐베이션하여 50 nM Fab 및 1 μM 펩타이드 또는 대조군의 최종 혼합물을 생성하기 전에, 5811 mFab의 용액을 러닝 완충액에서 50.5 nM에서 제조하였다. 30 μl의 혼합물을 10 μl/분으로 주입하고 주입 종료 5초 전에 보고 점을 기록함으로써 각각의 샘플에 대해 센소그램을 기록하였다. 칩을 40 mM HCl의 2개의 10 μl 주입 및 5 mM NaOH의 1개의 주입에 의해 각 사이클의 말기에 재생시켰다. 대조군 사이클이 펩타이드 사이클과 교대되었다.
각각의 펩타이드의 억제 정도를 인접한 대조군 사이클의 평균과 비교하여 보고 점에서 측정된 반응 단위의 백분율 변화로서 계산하였다.
각각의 알파 시누클레인 펩타이드의 억제 수준이 도 5에 나타나 있다. 알파 시누클레인 단량체 또는 피브릴에 대한 5811 mFab의 유의한 억제는 C-말단 펩타이드 AS113-122, AS115-124, AS117-126 및 AS119-128에 대해서만 관찰되었고, 여기서 α-시누클레인의 어느 한 형태에 대한 억제 수준은 매우 유사하였다. 가장 강한 억제 수준은 각각 단량체 및 피브릴에의 결합에 대해 81% 및 90%에서 펩타이드 AS117-126에 대해 관찰되었다. 상기 4개의 펩타이드에서 공통인 잔기는 에피토프의 일부를 포함하는 119 내지 122이다. 억제 수준이 펩타이드 AS113-122 및 AS119-128에 대해 단지 2 내지 5%로 떨어지기 때문에, 잔기 115 내지 118 및 123 내지 124는 또한 에피토프의 일부를 포함해야 한다.
이 연구의 결과는 항체 5811의 에피토프가 잔기 115 내지 124(DMPVDPDNEA)를 포함한다는 것을 시사하였다.
알라닌 스캐닝
인간 알파 시누클레인(His-태그됨)의 단일 아미노산 돌연변이체를 제조하고 제조사의 지침에 따라 Expi293 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 발현시켰다. 이미 알라닌이고 세린으로 변경된 잔기 124를 제외하고, 알라닌 잔기는 위치 118 내지 128에 위치하였다(표 4). 돌연변이체 단백질을 원심분리(4200 rpm, 2시간) 후 수득된 상층액으로부터 정제한 다음, 멸균 여과(Stericup, Millipore)하였다. 상층액을 미리 평형화된 HisTrap Excel 컬럼(GE Healthcare) 상에 로딩하고, 25 mM 인산 나트륨 및 500 mM NaCl로 세척하였다. 결합된 단백질을 동일한 완충액에서 최대 500 mM의 이미다졸의 구배로 용리시켰다. 관심 단백질을 갖는 분획을 NuPage 겔 전기영동에 의해 확인하고, 모으고, Centriprep 10 kDa MWCO(Millipore)를 사용하여 농축시키고, PD-10 컬럼 상에서 PBS 내로 완충액 교환하였다. 단백질 분획을 Ultracel 3 KDa MWCO 원심분리 스핀 농축기(Millipore)를 사용하여 농축시켰다. 농축물을 0.22 mM 멸균 필터(Millex GV, Millipore)를 통과시키고, -20℃에 보관하였다. 모든 돌연변이체는 야생형 인간 알파 시누클레인과 유사한 양으로 발현되었다(도 6A).
표 4
Figure pct00012
인간 알파 시누클레인의 돌연변이체를 레인마다 단백질당 1 마이크로그램을 사용하여 4-12% Bis/Tris NuPage 겔 상에서 분석하고, PVDF 막(iBlot mini stack, Thermo Fisher Scientific) 상에 블롯팅하였다. 블롯을 차단 완충액(3% 소 혈청 알부민, 인산 완충 식염수, PBS 중의 0.1% Tween20)에서 차단시키고, 항체 5811 mFab 또는 항체 5811 mIgG1과 함께 인큐베이션하였다. PBS 중의 0.1% Tween과 함께 실온에서 1시간 인큐베이션 후 블롯을 세척하였다. 블롯을 차단 완충액에서 이차 검출 항체 항-마우스 IgG Fc HRP 접합체(AB5879, Abcam)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, ECL 웨스턴 블롯팅 기질(Pierce)의 첨가 후 화학발광을 검출하였다.
도 6B 및 6C에 나타낸 바와 같이, 인간 알파 시누클레인 D119A, N122A 및 Y125A에 상응하는 3개의 돌연변이체는 항체 5811 mFab 및 5811 mIgG1에 의해 인식되지 않았다. 이 분석은 인간 알파-시누클레인에서의 이들 아미노산이 인간 알파 시누클레인에 대한 항체 5811 mFab 및 5811 mIgG1의 결합에 필수적일 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 항체 인간화
랫트 V-영역으로부터의 CDR을 인간 생식계열 항체 V-영역 프레임워크 상에 이식함으로써 랫트 항체 5811을 인간화하였다. 항체의 활성을 회복시키기 위해, 랫트 V-영역으로부터의 많은 프레임워크 잔기를 또한 인간화 서열에 유지시켰다. 이들 잔기를 Adair 등(WO91/09967)에 의해 개괄된 프로토콜을 사용하여 선택하였다. 랫트 항체(공여자) V-영역 서열과 인간 생식계열(수용자) V-영역 서열과의 정렬이, 설계된 인간화 서열과 함께, 도 7 및 8에 나타나 있다. 조합된 초티아/카바트 정의가 사용된 CDR-H1을 제외하고(Adair et al., 1991 Humanized antibodies. WO91/09967 참고), 공여자로부터 수용자 서열로 이식된 CDR은 카바트(카바트 등, 1987)에 의해 정의된 바와 같다.
많은 변이체 중쇄 및 경쇄 V-영역 서열을 코딩하는 유전자를 DNA2.0사의 자동 합성 접근법에 의해 설계하고 구축하였다. 일부 경우에, CDR 내의 돌연변이를 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 유도 돌연변이 유발에 의해 VH 및 VK 유전자를 변형시킴으로써 중쇄 및 경쇄 V-영역의 추가 변이체를 생성하였다. 포유동물 세포에서의 일시적 발현을 위해, 인간화 경쇄 V-영역 유전자를 인간 카파 사슬 불변 영역(Km3 동종형)을 코딩하는 DNA를 함유하는 UCB 경쇄 발현 벡터 pMhCK 내로 클로닝하였다. 인간화 중쇄 V-영역 유전자를 힌지 안정화 돌연변이 S241P를 갖는 인간 감마-4 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 UCB 인간 감마-4 중쇄 발현 벡터 pMhγ4PFL에 클로닝하였다(Angal et al., Mol. Immunol.1993, 30(1):105-8). 키메라 랫트-인간 5811 항체(서열번호: 9 및 10 포함)를 또한 유사하게 제조하였다. ExpiFectamineTM 293 형질감염 시약(A14525, ThermoFisher Scientific)을 사용하여 생성된 중쇄 및 경쇄 벡터의 Expi293TM 현탁액 세포 내로의 공동 형질감염을 달성하였고, 이는 인간 IgG4P 또는 Fab-HIS 포맷으로 인간화 재조합 항체의 발현을 제공하였다.
인간 V-영역 IGKV1-39 + JK1 J-영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 5811 경쇄 CDR에 대한 수용자로서 선택하였다. 이식편 gL5, gL8 및 gL14에서의 경쇄 프레임워크 잔기는, 공여자 잔기 티로신(Y71)이 유지된 잔기 71(서열번호: 13과 관련하여)을 제외하고, 모두 인간 생식계열 유전자 유래이다. 이식편 gL14의 CDRL3에서의 잔기 94는 글리신(G)으로부터 알라닌(A) 잔기로 돌연변이되어, 잠재적인 아스파라긴 탈아미드화 부위를 변형시켰다.
인간 V-영역 IGHV3-15 + JH3 J-영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 5811의 중쇄 CDR에 대한 수용자로서 선택하였다. 이식편 gH4에서의 중쇄 프레임워크 잔기는, 각각 공여자 잔기 알라닌(A49) 및 알라닌(A100)가 유지된 잔기 49 및 100(서열번호: 25와 관련하여)을 제외하고, 모두 인간 생식계열 유전자 유래이다.
변이체 인간화 항체 사슬, 및 이의 조합을 발현시키고, 모 항체에 대한 이들의 효능, 이들의 생물물리학 특성 및 하류 가공에 대한 적합성을 평가하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 모든 이식편은 피브릴에서의 알파 시누클레인에 대한 모 랫트-인간 항체와 동일하거나 유사한 친화성을 유지하였다.
표 5
Figure pct00013
실시예 5: 면역조직화학
면역조직화학을 Asterand Bioscience(Royston, United Kingdoms)에 의해 수행하였다. 동결절편(10 μm)을 자동 가열 및 냉각으로 97℃에서 20분 동안 Dako PT Link 및 EnVision FLEX Target Retrieval 용액(pH 6)을 사용하여 항원 검색 절차에 먼저 제출하였다. 하기의 모든 인큐베이션 단계는 실온에서 수행하였다. 동결절편을 30분 동안 공기 건조시키고, 1X PBS에서 제조된 4% 파라포름알데히드에서 10분 동안 고정화시키고, Dako EnVision™ FLEX 세척 완충액(Dako)에서 세척한 다음, Dako Autostainer Plus에 로딩하였다. 절편을 Dako 퍼옥시다제 차단액(Dako)과 함께 5분 동안 인큐베이션함으로써 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하였다. 그리고 나서, 절편을 1X PBS로 2회 세척한 후 Dako CSA II 단백질 차단액(Dako)과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 단백질 차단액을 공기 제트에 의해 제거하고, 절편을 Dako 항체 희석제(Dako)에서 희석된(0.05 μg/ml) 5811 랫트-마우스 IgG1 항체(서열번호: 34 및 35 포함)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 절편을 1X PBS로 2회 세척한 다음, 항-마우스 Dako Flex 중합체-HRP 기질(Dako)과 함께 20분 동안 인큐베이션하고, 2회 세척한 다음, 디아미노벤지딘 기질(Dako)과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 증류수로 세정하여 발색 반응을 중지시켰다. 발색 후, 절편을 Dako Autostainer Plus로부터 제거하고, 헤마톡실린으로 수작업으로 반대염색하고, 상승하는 일련의 에탄올에서 탈수하고, 자일렌의 3회 교환으로 정화시키고, DPX 모니터링 배지(Sigma-Aldrich) 하에서 커버슬립하였다. 염색된 절편의 디지털 이미지를 Aperio ScanScope AT Turbo 시스템(Leica Biosystems)을 사용하여 수득하였다. 항체 5811 mIgG1을 5명의 상이한 pS129-알파 시누클레인-양성 및 3명의 상이한 pS129-알파 시누클레인-음성 공여자(1 절편/공여자)로부터 유래된 뇌 절편 상에서 시험하였다. 항체 5811 mIgG1은 PD 환자의 측두엽 피질 및 흑색질에서 신경망 및 때때로 루이소체 유사 특징을 표지하였다(도 9A-E). 비-PD 뇌 조직에서, 항체 5811 mIgG1은 측두엽 피질에서 신경망을 표지하였지만, 루이소체 유사 구조는 피질 또는 흑색질에서 관찰되지 않았다(도 9F-H). 이들 관찰은 항체 5811 mIgG1이 PD 및 비-PD 환자로부터의 뇌 조직의 신경망에서 정상 알파 시누클레인에 결합하지만, PD-환자의 루이소체에만 존재하는 병리학적 α-시누클레인에 결합한다는 것을 시사한다.
실시예 6: 인간화 항체의 특징규명
3개의 Ab5811 인간화 IgG4P 항체(5811gL5gH4; 5811gL8gH4 5811gL14gH4; 표 1에서의 서열)를 시험하여 열 안정성(Tm), 실험적 pI, 소수성, 용해도(PEG 침전 분석), 공기/액체 계면에서의 응집 안정성 및 CDR-L3(5811gL14gH4는 N(93)A 모티프를 갖고, 5811gL8gH4 및 gL5gH4 모두는 N(93)G 모티프를 가짐) 상의 Asn93의 탈아미드화 성향에 대한 화학적 안정성을 포함하는 이들의 생화학 및 생물물리학 특징을 평가하였다.
열 안정성( T m ) 측정
용융 온도(Tm) 또는 언폴딩의 중간점에서의 온도를 Thermofluor 분석을 사용하여 결정하였다. 이 방법에서, 형광 염료 SYPRO orange를 온도가 증가함에 따라 노출되는 소수성 영역에 결합시킴으로써 단백질 언폴딩 공정을 모니터링하는 데 사용하였다.
반응 혼합물은 5000X 스톡 용액으로부터 PBS로 희석된 5 μl의 30x SYPRO® Orange 염료(InvitrogenTM) 및 0.12 mg/ml(PBS pH 7.4에서)에서 45 μl의 샘플을 함유하였다. 약 10 μl의 혼합물을 4 반복으로 384 PCR 광학 웰 플레이트에 분배하고 7900HT 고속 실시간 PCR 시스템(Applied BiosystemsTM) 상에서 작동시켰다. PCR 시스템 가열 장치를 1.1℃/분의 증가 속도로 20℃ 내지 99℃로 설정하였다. 전하 결합 장치는 웰 내의 형광 변화를 모니터링하였다. 강도 증가를 플롯팅하고, 경사(들)의 변곡점을 사용하여 하기에 기재된 바와 같이 Tm을 계산하였다. 각각의 항체 분자에 대한 Tm을 PBS pH 7.4 및 50 mM 아세트산 나트륨/125 mM 염화 나트륨 pH 5.0 모두에서 수득하였고, 이는 일반적인 예비 제제 완충액이다.
3개의 모든 인간화 항체에 대한 열 안정성이 표 6에 나타나 있다. 하나의 변화가 PBS pH 7.4에서 관찰되었고, 이는 CH2 및 Fab 도메인 언폴딩 모두에 기인하였다. 50 mM 아세트산 나트륨/125 mM 염화 나트륨 pH 5.0에서, 2개의 변화가 관찰되었다. 더 낮은 Tm은 CH2 언폴딩 도메인에 기인하였고, 제2 변화는 Fab 도메인에 기인하였다. 이 분석으로부터, 항체 5811gL8gH4 및 5811gL5gH4는 열적으로 약간 덜 안정한 항체 5811gL14gH4와 대등한 열 안정성을 갖는다.
표 6
Figure pct00014
실험적 pI
5811gL14gH4, 5811gL8gH4 및 5811gL5gH4의 실험적 pI를 전체-모세관 이미지화된 cIEF iCE3TM 시스템(Protein Simple)을 사용하여 수득하였다. 샘플을 하기를 혼합하여 제조하였다: 30 μL 샘플(HPLC 등급 물 중의 1 mg/mL 스톡으로부터), 35 μL의 1% 메틸셀룰로오스 용액(Protein Simple), 4 μL pH 3-10 양쪽성 물질(Pharmalyte), 0.5 μL의 4.65 및 0.5 μL 9.77 합성 pI 마커(ProteinSimple), 12.5 μL의 8 M 우레아 용액(Sigma-Aldrich®). HPLC 등급 물을 사용하여 최종 부피를 100 μL로 만들었다. 혼합물을 간략히 볼텍싱하여 완전히 혼합시키고 10,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 분석 전에 기포를 제거하였다. 샘플을 1.5 kV에서 1분 동안 포커싱한 후 3 kV에서 5분 동안 포커싱하고, 모세관의 A280 이미지를 ProteinSimple 소프트웨어를 사용하여 촬영하였다. 생성된 전기영동도를 먼저 iCE3 소프트웨어를 사용하여 분석하였고, pI 값을 할당하였다(pI 마커 사이의 선형 관계). 그리고 나서, 보정된 전기영동도를 Empower® 소프트웨어(Waters)를 사용하여 통합하였다.
모든 분자의 실험적 pI는 8.80-9.23의 범위에 있었고, 주요 종은 9.09였다. IgG4P 분자에 전형적인 산성/염기성 종 분포에는 차이가 없었다. 실험적 pI는 높았으므로, 항체의 제조 공정을 도울 것이다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
인간화 항체 5811gL14gH4, 5811gL8gH4 및 5811gL5gH4를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 통해 이들의 소수성 거동에 대해 평가하였다. HIC에서, 항체는 고농도의 극성 염의 존재하에 소수성 정지상(stationary phase)에 결합하고 염 농도가 감소함에 따라 이동상으로 탈착된다. 더 긴 체류 시간은 더 큰 소수성에 해당한다.
2 mg/mL의 항체 샘플을 1.6 M 황산 암모늄 및 PBS(pH 7.4)으로 1:2로 희석하였다. 5 μg(10 μL)의 샘플을 형광 검출기를 갖는 Agilent 1200 바이너리 HPLC에 직렬로 연결된 Dionex ProPacTM HIC-10 컬럼(100 mm x 4.6 mm) 상에 주입하였다. 고유한 형광(여기 및 방출 파장, 각각 280 nm 및 340 nm)에 의해 분리를 모니터링하였다.
완충액 A(0.8 M 황산 암모늄 100 mM 포스페이트 pH7.4) 및 완충액 B(100 mM 포스페이트 pH7.4)를 사용하여, 샘플을 다음과 같이 구배 용리를 사용하여 분석하였다, (i) 0% B에서 2분 유지, (ii) 30분(0.8 mL/분) 내에 0 내지 100% B의 선형 구배, (iii) 컬럼을 2분 동안 100% B로 세척하고, 다음 샘플 주입 전에 10분 동안 0% B에서 재평형화하였다. 컬럼 온도를 20℃에 유지시켰다. 낮은 및 높은 소수성을 나타내는 표준 및 대조군을 또한 동일한 실행 순서로 분석하여 체류 시간의 정규화를 허용한다. 샘플의 체류 시간(RT)을 하기 방정식을 사용하여 낮은 및 높은 소수성 표준에 대해 정규화하였다:
[(샘플(RT) - 낮은 표준(RT)/ 높은 표준(RT) - 낮은 표준(RT)] x 100
3개의 모든 항체 5811gL14gH4, 5811gL8gH4 및 5811gL5gH4는 유사한 정규화된 체류 시간 및 유사한 낮은 소수성을 나타내었고, 즉, 5분 미만 내에 컬럼으로부터 용출되었다(표 7 참고). 낮은 소수성은 제조 동안 안정성을 돕는다(즉, 응집을 감소시킨다).
표 7
Figure pct00015
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전 분석을 사용한 용해도 측정.
인간화 항체 5811gL14gH4, 5811gL8gH4 및 5811gL5gH4의 콜로이드 안정성을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전 분석을 사용하여 분석하였다. PEG(w/v)의 농도를 증가시키고 용액에 남아있는 단백질의 양을 측정함으로써, PEG를 정량적으로 정의가능한 방식으로 단백질 용해도를 감소시키는 데 사용하였다. 이 분석은 통상적인 농도 방법을 사용하지 않고 고농도 용해도의 효과를 모방하는 역할을 하였다.
인간화 항체 5811gL14gH4, 5811gL8gH4 및 5811gL5gH4의 PEG 유도된 침전을 PBS pH 7.4 및 50 mM 아세트산 나트륨 /125 mM 염화 나트륨 pH 5.0 중의 7-18% PEG-3350의 존재 하에 조사하였다. 항체 샘플을 투석을 사용하여 완충액을 교환하고, 농도를 2 mg/mL로 조정하였다. 비평형 침전을 최소화하기 위해, 샘플 제조는 2Х 단백질 및 2Х PEG 용액을 1:1 부피 비율로 혼합하는 것으로 구성되었다. 혼합 후, 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 비평형 응집체를 재용해시켰다. 20℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 샘플을 60분(4000g) 동안 원심분리하였다. 상층액의 분취량을 절반 부피 96 웰 광학 플레이트로 옮기고, 280 nm에서의 흡광도를 플레이트-리더 BMG Labtech FLUOstar® Omega LVIS A280을 사용하여 측정하였다. 농도 데이터를 PEG%에 대해 플롯팅하고, 계산된 중간점(LogEC50)(비선형 회귀 곡선 피트, 가변 곡선으로부터 생성됨)을 샘플의 상대적 콜로이드 용해도의 척도로서 수득하였다. 이 분석에서, 더 높은 LogEC50은 더 큰 콜로이드 안정성에 해당한다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 3개의 상이한 항체 사이에 콜로이드 안정성의 차이가 관찰되지 않았다. 더 큰 logEC50 값에 의해 나타낸 바와 같이 아세테이트 pH 5 완충액에서 더 큰 콜로이드 안정성이 관찰되었다.
표 8
Figure pct00016
공기-액체 계면에서의 응력 효과(응집 분석)
이 분석은 항체가 제조(예를 들어, 한외 여과) 동안 받을 응력을 모방하는 역할을 한다. 항체와 같은 단백질은 공기-액체 계면에 노출될 때 언폴딩되는 경향이 있으며, 여기서 소수성 표면은 소수성 환경(공기)에 제시되고 친수성 표면은 친수성 환경(물)에 제시된다. 단백질 용액의 교반은 응집을 유도할 수 있는 큰 공기-액체 계면을 달성한다.
PBS pH 7.4 및 50 mM 아세트산 나트륨/125 mM 염화 나트륨 pH 5.0에서의 인간화 항체 5811gL14gH4, 5811gL8gH4 및 5811gL5gH4의 샘플을 에펜도르프 Thermomixer ComfortTM를 사용하여 볼텍싱함으로써 응력을 가하였다. 볼텍싱 전에, 농도를 적절한 흡광 계수(1.41 Abs 280 nm, 1 mg/mL, 1 cm 경로 길이)를 사용하여 1 mg/mL로 조정하였고, Varian Cary® 50-Bio 분광광도계를 사용하여 280 nm, 340 nm 및 595 nm에서 흡광도를 수득하여 0시간 판독을 확립하였다. 각각의 샘플을 1.5 mL 원뿔형 에펜도르프®-스타일 캡핑된 튜브(4x 250 μL) 내로 분취하고 25℃에서 1400 rpm에서 최대 24시간 동안 볼텍싱하여 견고성을 시험하기 위해 엄격한 조건에 두었다. 시간 의존적 응집(탁도)을 Varian Cary™ 50-Bio 분광광도계를 사용하여 595 nm에서 볼텍싱 후 24시간에 샘플을 측정하여 모니터링하였다. 평균 흡광도 값을 각각의 샘플에 대하여 시간에 대해 플롯팅하였다.
항체 분자 5811gL5gH4는 5811gL14gH4 및 5811gL8gH4와 비교하여 더 큰 응집 안정성을 나타내었다. 모든 항체는 PBS pH 7.4에서 더 큰 응집 안정성을 나타내었다.
화학적 안정성 - 탈아미드화 응집 연구
3개의 모든 항체 5811gL5gH4; 5811gL8gH4 및 5811gL14gH4를 사용하여 가속화된 응력 연구를 수행하여 하나의 확인된 잠재적 부위인 CDR3의 경쇄에서의 Asn(93)의 탈아미드화 성향을 결정하였고, 여기서 5811gL14gH4는 Asn(93)Ala 모티프를 갖고 5811gL8gH4 및 gL5gH4 모두는 Asn(93)Gly 모티프를 갖는다.
3개의 항체를 Asn(N) 잔기의 탈아미드화를 선호하는 것으로 알려진 조건(50 mM Tris/125 mM 염화 나트륨 pH 8.0/37℃)에 두었다. 추가로, 응력 전의 기저 탈아미드화를 평가하기 위한 대조군 조건으로서 샘플을 또한 50 mM 아세트산 나트륨/125 mM 염화 나트륨 pH 5.0에서 제조하였다. 각각의 완충액에서의 샘플의 최종 농도를 ~5 mg/mL로 조정한 다음, 2개의 분취액으로 나누고, 최대 5주 동안 하나는 4℃에 보관하고 하나는 37℃에 보관하였다. 하나의 분취액을 즉시(T0) 및 2주 및 5주에 꺼내어 -20℃에 보관하였다.
잔기 Asn(93)에서의 기저 탈아미드화를 비응력된 샘플(50 mM 아세트산 나트륨/125 mM 염화 나트륨 pH 5/4℃) 상에서 측정하고, 관심 서열을 함유하는 트립틱 펩타이드를 생성함으로써 2주/pH 8/37℃ 응력된 샘플을 사용하여 Asn(93)의 탈아미드화 성향을 수득하였다. 간략하게, 80 μg의 각각의 샘플을 DTT로 환원시키고 37℃에서 구아니딘 하이드로클로라이드로 변성시켰다. 그리고 나서, 샘플을 실온에서 아이오도아세타미드로 알킬화한 후, 7.5 mM Tris/1.5 mM CaCl2 pH 7.9(ZebaTM 7 kDa MWCO 스핀 컬럼, Thermo Fisher)로 완충액 교환하고, 37℃에서 트립신(1:23 w/w)과 함께 대략 3시간 인큐베이션하였다. 트리플루오로아세트산을 0.1% v/v로 첨가하여 단백질분해를 중단시키고, 샘플을 -20℃에 보관하였다. 해동시, 샘플을 원심분리하여 침전물을 제거하였다.
생성된 펩타이드를 분리하고, 침전시키고, 충돌 유도 해리(CID) 단편화를 갖는 양이온, 데이터-의존적 오비트랩-오비트랩(orbitrap-orbitrap) 방법을 실행하는 Thermo Fusion™ 질량 분광기에 연결된 Waters BEH C18 컬럼 상에서 분석하였다. LC-MS 및 MS2 데이터를 Thermo Xcalibur™ 및 Pepfinder™ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 관심 펩타이드(LC N93-K102)를 분석하여 화학적 변형의 백분율을 평가하였다.
펩타이드 맵핑 질량 분석법은 기저 Asn(93) 탈아미드화 수준이 5811gL8gH4 및 5811gL5gH4와 비교하여 5811gL14gH4에서 더 낮다는 것을 보여주었다. 분자 사이의 차이는 예상되지 않았는데, 탈아미드화 성향의 예측이 어려움에도 불구하고, Asn(N) 잔기 이후의 Gly(G) 잔기는 부피가 큰 Ala(A) 잔기가 뒤따르는 것보다 더 큰 탈아미드화하는 성향을 나타내는 것으로 나타났기 때문이다(Robinson, N. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 4367-4372).
3개의 모든 항체에 대해, Asn(93)에서 낮은 탈아미드화 비율, 즉, 주당 1.2% - 1.4%가 관찰되었다. 5811gL5gH4 및 5811gL8gH4에 대한 경쇄 N93-K102 펩타이드의 질량 차이는 -17 Da 변형(아마도 중간 석신이미드 종) 및 +1 Da(Asn(93)에서 완전히 탈아미드화된 생성물)를 포함한 반면, 석신이미드는 5811gL14gH4에 대해 관찰되지 않았다(표 9).
표 9
Figure pct00017
탈아미드화의 전체 비율은 모든 항체에 대해 낮았지만, 5811gL5gH4 및 5811gL8gH4에 대해 더 많은 이질성이 관찰되었다.
실시예 7: 세포 기반 응집 분석
HEK Freestyle 293F 세포(현탁 세포)를 Freestyle 293 발현 배지(InvitrogenTM)에서 0.7x106 세포/ml로 제조하고, 300x106 세포/ml로 배양하였다. 형질감염을 제조사의 지침에 따라 수행하였고, 간략하게 알파-시누클레인 유전자를 포함하는 600 μg pcDNA3.1(+)을 20 ml OptiMEM 배지에서 혼합하는 반면, 293Fectin을 OptiMEM 배지(InvitrogenTM)에서 희석하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 희석된 DNA를 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 세포 상에 적가하였다(플라스크당 20 ml). 세포를 37℃, 125 rpm, 8% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 즉시 사용하거나 FBS + 10% DMSO에서 5백만 세포/ml의 농도로 동결시켰다.
세포가 미리 동결된 경우, 냉동바이알을 해동시키고 세포를 Freestyle 293 배지에 재현탁시키고, 500g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 방출하고, 펠렛을 2x106 세포/ml로 Freestyle 293 배지(Life TechnologiesTM)+ Pen/Strep(InvitrogenTM)에 재현탁시켰다. 384-웰 플레이트(GrainerTM)에서, 20 μl의 세포 현탁액을 첨가하였다(총 약 40,000 세포/웰). 각 웰에, 150 nM의 인간 알파-시누클레인 피브릴(실시예 1에서 본원에 기재된 바와 같이 제조됨)을 첨가한 후 시험될 PBS 중의 항체 5811gL5gH4 IgG4P, 5811 gL8gH4 IgG4P 및 5811 gL14gH4 IgG4P(표 1의 서열)를 첨가하였다(다양한 농도로). 플레이트를 2일 동안 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2, 95% 습도에서 인큐베이션하였다.
둘째 날 말기에, 배지를 모든 웰로부터 흡인하고, 플레이트를 세척하여, 웰당 20 μl를 남겼다. 약 50 μl의 PBS를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 500g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 플레이트 세척기를 이용하여 모든 웰로부터 흡인하여, 각 웰에 20 μl의 배지를 남겼다. Versene(LonzaTM)을 첨가하고(50 μl/웰), 플레이트를 500g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하여 웰당 20 μl의 배지만을 남겼다. 각 웰에 PBS 중의 20 μl 8% 포름알데히드(물 중의 16% 용액, Life TechnologiesTM)+ 2% 트리톤 X-100(VWRTM)을 보충하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, HBSS(칼슘-마그네슘이 없는 VWRTM) + 2% FBS + 2 mM EDTA(Life TechnologiesTM)로 구성된 50 μl의 FACS 완충액을 첨가하였다. 플레이트를 2000g에서 1분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하여 각 웰에 20 μl의 배지만을 남겼다. 각 웰에 1:300 희석된 항-pSer129 알파-시누클레인 항체(AbCamTM)를 갖는 20 μl의 FACS 완충액을 추가로 보충하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 각 웰에 50 μl의 FACS 완충액을 보충한 후, 2000g에서 1분 동안 다시 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 각 웰에 1:500 희석된 Alexafluor647 접합된 항-토끼-이차 항체(Life TechnologiesTM) 및 DAPI(Life TechnologiesTM)를 보충하였다. 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 μl의 FACS 완충액을 첨가하고, 플레이트를 2000g에서 1분 동안 원심분리하였다. 세척시, 더 많은 FACS 완충액을 첨가하고, 플레이트를 판독을 위해 유세포 분석기(BD FACS Canto II)에 배치할 준비를 하였다.
FACS 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 먼저, 전방 및 측방 산란을 사용하여 살아있는 단일 세포를 게이팅하였다. 둘째, DAPI+ 사건을 게이팅하고, 이들의 수를 살아있는 유핵 단일 세포의 수의 척도로서 사용하였다. 마지막으로, 포스포-세린 129-알파-시누클레인-양성(pSer129+) 세포를 게이팅하였다. 모든 DAPI+ 세포 대비 pSer129+ 세포의 백분율을 응집의 척도로서 사용하였다. 데이터를 피브릴만으로 처리되고 항체로 처리되지 않은 웰에 대비하여 정규화하고, 백분율로서 표현하였다. 결과가 도 10에 요약되어 있으며, 이는 알파 시누클레인을 발현하는 세포 상에서의 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도된 응집을 억제하기 위해 시험된 항체의 능력을 보여준다. 이들 데이터는 본 발명에 따른 항체가 약 5 nM 이하의 IC50으로, 알파-시누클레인 피브릴에 의해 유도된 응집을 차단할 수 있음을 확인시켜 준다.
실시예 8: 일차 뉴런 응집 분석
E17 마우스 배아로부터의 해마를 절개 완충액(칼슘이 없고 마그네슘이 없는 HBSS, 0.6% D-(+)-글루코스, 20 mM Hepes)에서 절개하였다. 그리고 나서, 절개 완충액을 제거하고, 해리 용액(칼슘이 없고 마그네슘이 없는 HBSS, 0.6% D-(+)-글루코스, 20 mM HEPES, 40 U/m 파파인, 1 mg/ml DNase, 1 mM L-시스테인, 0.5 mM EDTA)으로 대체하였다. 37℃에서 30분 인큐베이션 후, 해리 완충액을 제거하고, 해마를 플레이팅 배지(Neurobasal™ 배지, 2% B27 보충물, 1 mM GlutaMAX, 2.5% FBS, 50 단위/ml 페니실린-스트렙토마이신)로 3회 세척하였다. 조직 덩어리를 1 ml 피펫으로 적정하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 세포를 플레이팅 배지에서 적절한 농도로 희석하였다. 약 15000개의 세포를 PDL 코팅된 384-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 그리고 나서, 세포를 37℃, 5% CO2, 95% 습도에서 세포 배양 인큐베이터에 유지시켰다.
다음날, 배지의 80%를 FBS가 없는 플레이팅 배지[Neurobasal™ 배지, 2% B27 보충물, 1 mM GlutaMAX, 50 단위/ml 페니실린-스트렙토마이신)로 대체하였다. 플레이팅 7일 후, 배지를 제거하여 각 웰에 20 μl을 남겼다. 각 웰에, 100 nM의 인간 알파-시누클레인 피브릴(실시예 1에서 본원에 기재된 바와 같이 제조됨)을 첨가한 후, 시험될 PBS 중의 항체 5811gL5gH4 IgG4P, 5811 gL8gH4 IgG4P 및 5811 gL14gH4 IgG4P(표 1의 서열)를 첨가하였다(다양한 농도로). 플레이트를 추가 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2, 95% 습도에서 인큐베이션하였다. 플레이팅 14일 후, 배지를 모든 웰로부터 흡인하여 웰당 20 μl를 남겼다. 각 웰을 80 μl의 둘베코 포스페이트 완충 식염수(DPBS)로 세척하였다. DPBS를 제거하고, 세포를 15분 동안 웰당 40 μl의 고정화 완충액(4% 파라포름알데히드를 갖는 DPBS)에서 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 고정화 완충액을 제거하고, 세포를 80 μl의 DPBS로 다시 세척하였다. DPBS를 제거하고, 웰당 40 μl의 투과 완충액(0.1% 트리톤 X-100를 갖는 DPBS)으로 대체하였다. 10분 후, 투과 완충액을 제거하고, 세포를 웰당 40 μl의 차단 완충액(1% BSA 및 0.1% 트리톤 X-100를 갖는 PBS)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 차단 완충액을 제거하고, 40 μl/웰의 일차 항체 용액(0.3% 토끼 항-포스포-세린 129 알파-시누클레인 항체(AbCamTM ab51253)를 갖는 차단 완충액)으로 대체하였다. 항체 용액을 1시간 동안 세포 상에서 인큐베이션한 후, 3회 세척하였다(90 μl/각각, PBS). 마지막 세척 후, PBS를 제거하고, 40 μl의 이차 항체 용액(0.2% AlexaFluor488 접합된 항-베타-III-튜불린 항체를 갖는 PBS 중의 0.1% AlexaFluor647 접합된 항-토끼 항체)으로 대체하였다. 이차 항체 용액을 1시간 동안 세포 상에서 인큐베이션한 다음, 제거하고, 0.3% CellMask BlueTM을 포함하는 40 μl의 PBS로 대체하였다. 5분간 인큐베이션 후, 웰을 80 μl의 PBS로 3회 세척한 다음, 웰당 50 μl의 PBS로 채운 다음, 플레이트를 투명한 플라스틱 필름으로 밀봉하였다.
플레이트를 Arrayscan 플레이트 영상장치(ThermoFisher ScientificTM)에서 영상화하였다. 영상을 동일한 제조사의 HCS ScanTM 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 뉴런 밀도를 베타-III-튜불린 신호를 사용하여 모니터링하였다. 베타-III-튜불린 신호의 표면의 유의한 감소에 의해 반영된, 희박 지역(Sparse field) 또는 손상된 뉴런 세포 층을 나타내는 지역은 배제하였다. 마지막으로, 지역당 pSer129 알파 시누클레인 신호의 표면을 사용하여 병리학적 알파-시누클레인 응집을 정량화하였다.
알파 시누클레인의 S129에서의 인산화는 알파 시누클레인 정상 기능의 제어뿐만 아니라 그의 응집, LB 형성 및 신경독성의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 정상 조건 하에서, 알파 시누클레인의 작은 분획만이 뇌에서 S129에서 항시적으로 인산화되는 반면(Fujiwara H, et al. (2002) Nat Cell Biol, 4, 160-164), pS129의 극적인 축적이 시누클레인병증을 겪는 환자의 뇌에서 관찰되었다(Kahle PJ, et al.(2000) Ann N Y Acad Sci, 920, 33-41); Okochi M, et al.(2000) J Biol Chem, 275, 390-397); Anderson JP, et al.(2006) J Biol Chem, 281, 29739-29752).
데이터를 항체 없이 피브릴만으로 처리된 웰에 대비하여 정규화하였고, 백분율로 표현하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 3개의 모든 항체는 내인성 수준의 알파 시누클레인을 발현하는 마우스 일차 뉴런 상에서 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인 응집을 억제하였다. 이들 데이터는 5811gL5gH4 IgG4P, 5811 gL8gH4 IgG4P 및 5811 gL14gH4 IgG4P 항체가 5 nM보다 낮은 IC50으로, 마우스 일차 뉴런 상에서 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도된 응집을 차단할 수 있었음을 확인시켜 준다.
실시예 9: 생체내 VR5811 효능의 평가
항체 5811gL5gH4 IgG4P(서열번호: 14 및 서열번호: 26을 포함, 이하 VR5811로 간단히 지칭됨)를 인간 알파 시누클레인을 발현하는 α-시누클레인 넉아웃 마우스의 형질전환 모델(이하 SNCA-OVX로 지칭됨; Charles River, France)에서 시험하였다.
SNCA-OVX 마우스에게 VR5811 및 쥣과 전형성된 피브릴(PFF)(실시예 1에서 본원에 기재된 바와 같이 제조됨)를 주사하였다. 음성 대조군 항체 및 비히클을 또한 마지막 9개의 C-말단 잔기에서 알파 시누클레인에 결합하는 비교기 항-알파 시누클레인 항체(비교기 C-말단 Ab)와 함께 주사하였다. 이러한 비교기 항체(본 발명에 따른 항체와 상이한 CDR을 가짐)는 본 발명의 항체와 대등한 결합 특징을 나타내었다. 비교기 C-말단 Ab 항체는 알파 시누클레인에 대해 본 발명의 항체와 유사한 친화성 및 유사한 생물물리학 특성을 갖는다. 그것은 또한 세포 기반 분석 상에서 알파 시누클레인 응집을 예방하는 데 효과적이었다(표 10).
표 10
Figure pct00018
항체를 동물의 뇌에 직접 투여하기 전에 실온에서 진탕기 상에서 30분 동안 PFF와 함께 예비 인큐베이션하였다. 항체/PFF 혼합물을 1 μg PFF/10 μg 항체의 비율로 PBS에서 제조하였다. pH 7.4의 PBS를 비히클 용액으로서 사용하였다. 조합된 대뇌내 투여 24시간 전에 항체를 주사하였다.
그리고 나서, 항체를 30 mg/kg의 용량으로 마우스에게 복강내로 투여하였다. 두 번째 복강내 주사를 첫 번째 복강내 주사 7일 후에 제공한 다음, SNCA-OVX 마우스에게 총 12개의 주사에 대해 11주 동안 동일한 요법(10 ml/kg의 투여 부피에 대해 30 mg/kg의 용량으로 하나의 복강내 주사/주)으로 지속하였다. 마우스를 무작위로 약물 처리군으로 할당하였고, 실험자는 처리에 대해 맹검이었다.
동물 실험을 유럽 지침(European Directive) 2010/63/EU 및 벨기에 법의 지침에 따라 수행하였다. UCB Biopharma SPRL(LA1220040 및 LA2220363)의 동물 실험 윤리 위원회는 실험 프로토콜(ASYN-IC-PARKINSON-MO)을 승인하였다. 마우스의 체중은 25 내지 30 g이었고, 수술시에 17주령이었다. 마우스를 케이지에서 사육하였다(케이지당 4마리의 마우스, 마크롤론(Macrolon) 유형 2). 이들을 12:12 명/암 주기에 유지시켰고, 06:00시에 불을 켰다. 온도를 20-21℃로 유지시키고, 습도는 대략 40%였다. 모든 동물을 실험군으로 할당하기 전에 표준 펠렛 음식 및 물에 자유롭게 접근시켰다. 수술 전후에 추가적인 강화 및 복지를 제공하였다(Enviro-dri, Pharma Serv). 동물 건강을 동물 관리 직원에 의해 매일 모니터링하였다. 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다. 희생을 마취하에 수행하였다.
복강내로 주사된 50 mg/kg의 케타민(Nimatek, Eurovet Animal Health B.V.) 및 0.5 mg/kg의 메데토미딘(Domitor, Orion Corporation)의 혼합물을 사용하여 일반 마취 하에 수술을 수행하였다. 또한, 각성을 지원하기 위해 2.5 mg/kg 아티파메졸(Antisedan, Orion Corporation)을 제공하였다. 재조합 정제된 PFF를 해동시키고 실온에서 초음파 처리하였다(Qsonica 500 - 20 kHz; 1분 동안 1초 ON, 1초 OFF의 30 펄스에 대해 65% 전력). 그리고 나서, PFF를 항체와 30분 동안 미리 혼합하고, 뇌 주사 전에 30분 동안 실온에서 진탕하였다. 용액(2 μl)을 0.2 μl/분의 속도로 주입하고, 바늘을 느리게 잡아당기기 전에 추가 2.5분 동안 그대로 두었다. 주사를 하기 좌표에서 우측 선조체에서 편측으로 수행하였다: AP= +0.20 mm, ML= -2.00 mm, DV= -3.20 mm.
마취 후, 마우스를 좌심실을 통해 6 ml/분의 유속으로 9분 동안 10 U/ml 헤파린을 함유하는 빙냉 0.9% PBS를 이용한 경심 관류에 의해 관류시켰다. 우심방을 유출 경로로서 절단하였다. 이후, 동물을 6 ml/분의 유속으로 15분 동안 빙냉 PBS 중의 4% 파라포름알데히드로 관류시켰다. 뇌를 4℃에서 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS에서 밤새 후고정시켰다(0일). 다음날 아침(+1일), 4% 파라포름알데히드를 버리고, 뇌를 차가운 PBS에서 세척하고, 밤새 인큐베이션하였다. 다음날(+2일), 뇌를 최소 1시간 동안 PBS에서 세척하고, 15% 수크로스를 함유하는 PBS로 옮기고, 수송 때까지 4℃에 보관하였다.
뇌 절편화를 Neuroscience Associates(TN, USA)에서 수행하였다. 먼저, 동결 인공물을 방지하기 위해 뇌를 20% 글리세롤 및 2% 디메틸 설폭사이드로 밤새 처리하고, MultiBrain® Technology를 사용하여 젤라틴 매트릭스에 포매시켰다. 경화 후, 블록을 분쇄된 드라이 아이스로 -70℃로 냉각된 이소펜탄에 침지시켜 빠르게 동결시키고, AO860 슬라이딩 마이크로톰의 동결 단계에 장착하였다. MultiBrain® 블록을 40 μm의 관상면에서 절개하였다. 모든 절편을 항원 보존 용액(49% PBS pH 7.0, 50% 에틸렌 글리콜, 1% 폴리비닐 피롤리돈)이 채워진 블록당 24개의 용기에 순차적으로 수집하였다. 즉시 염색되지 않은 절편은 -20℃에서 보관하였다.
자유 부유 절편을 1:30,000으로 희석된 pSer129 알파 시누클레인 항체(마우스 항 알파 시누클레인(pSer129) 바이오틴 - (Wako - 010-26481))를 이용한 면역화학에 의해 염색하였다. 차단 혈청 이후로부터의 모든 인큐베이션 용액은 비히클로서 트리톤 X-100을 갖는 트리스 완충 식염수(TBS)를 사용하였고; 모든 세정은 TBS로 이뤄졌다. 0.9% 과산화수소 처리에 의해 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하고, 비특이적 결합을 1.26% 전체 정상 혈청으로 차단하였다. 세정 후, 절편을 실온에서 밤새 일차 항체로 염색하였다. 비히클 용액은 투과를 위해 0.3% 트리톤 X-100을 함유하였다. 세정 후, 절편을 실온에서 1시간 동안 아비딘-바이오틴-HRP 복합체(Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 인큐베이션하였다. 세정 후, 절편을 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) 및 0.0015% 과산화수소로 처리하여 가시적인 반응 생성물을 생성하고, 젤라틴화된(subbed) 유리 슬라이드 상에 장착하고, 공기 건조시키고, 티오닌으로 가볍게 염색하고, 알코올에서 탈수화시키고, 자일렌에서 제거하고, 퍼마운트(Permount)로 덮었다.
지역당 pSer129 알파 시누클레인 신호의 정량 - pSer129 알파 시누클레인 신호를 사용하여 선조체, 피질, 기저 측 편도체, 및 흑색질의 동측에서 병리학적 알파-시누클레인 응집을 정량하였다. 관심 영역(ROI)을 수작업으로 묘사하고, 상이한 뇌 영역에서 pSer129 알파 시누클레인 신호의 자동 정량화를 VisioPharm 6 소프트웨어(VisioPharm)로 수행하였다. pSer129 알파 시누클레인 신호를 정량하기 위해, 신호 영역(μm2의 마커 영역)의 값을 제공하는 선형 베이지안 알고리즘을 사용하였다. 마커 영역은 상이한 뇌 영역을 커버하는 pSer129 알파 시누클레인 병리의 양을 반영한다. 모든 정량은 통계 분석이 끝날 때까지 맹검 방식으로 수행하였다.
데이터 분석을 % 마커 영역(즉, μm2의 pSer129 신호 영역 및 μm2의 관심 영역 사이의 비율)에 대해 수행하였다. % 마커 영역을 상하방식으로 다수의 뇌 절편에 대해 반복적으로 평가하였고(선조체: 브레그마(Bregma) +1.1 내지 -0.94의 13-14개의 절편; 피질: +1.1 내지 -0.94의 13-14개의 절편; 기저 측 편도체: -0.58 내지 -2.06의 6-10개의 절편; 흑색질: -2.54 내지 -3.88의 6-8개의 절편), AUC를 모든 시험된 대상체에 대해 개별적으로 계산하였다.
통계 분석을 위해 일원 ANOVA를 고려하였다. ANOVA 후 임의의 다중성 조정이 없는 평균들 간의 다중 쌍별 비교를 수행하였다(**, p < 0.01 및 *, p < 0.05). 정규성(normality) 및 등분산(homoscedasticity) 기준을 총족시키기 위해 데이터를 로그 변환시켰다. 그래프는 변환되지 않은 데이터의 기하 평균을 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, VR5811 항체는 SNCA-OVX 마우스에게 PFF 투여 3개월 후 선조체, 대뇌 피질, 편도체 및 흑색질을 포함하는 상이한 뇌 영역에서 알파 시누클레인 병리(즉, pSer129 알파 시누클레인 신호)를 현저히 감소시켰다.
음성 대조군 항체 및 비교기 C-말단 항체는 동일한 인간 PFF가 주사된 비히클 처리된 마우스와 비교하여 알파 시누클레인 병리(pSer129 알파 시누클레인 신호)를 감소시키는 데 영향을 미치지 않았다.
도 13은 SNCA-OVX 마우스에서 분석된 각각의 뇌 영역에서 Ser129에서 인산화된 알파 시누클레인의 정량을 보여준다. 결과는 VR5811이 3개의 대조군(즉, 비히클, 101.4 및 비교기 C-말단 Ab)과 비교하여 선조체, 대뇌 피질 및 흑색질의 동측 면을 포함하는 상이한 뇌 영역에서 알파 시누클레인 병리를 유의하게(p < 0.05) 감소시킨다는 것을 확인시켜 준다.
그 결과, SNCA-OVX 마우스에서 시험될 때, 5811로 처리된 군은 3개의 상이한 구조에서 pSer129 α-시누클레인의 유의한 감소된 수준을 나타내었고, 이들 중에서, 2개는 주사 부위로부터 원위 영역이었다(대뇌 피질 및 흑색질).
이것은 본 발명의 구조적 특징을 포함하는 항체가 Ser129에서 인산화된 알파 시누클레인의 생체내 출현을 방지할 수 있음을 확인시켜 준다. 또한, 결과는 C-말단 영역에서 a-syn에 결합하는 모든 항체가 생체 내에서 효과적인 것은 아님을 입증하며: 높은 친화성으로 a-syn의 C-말단에 결합하고 세포 기반 분석에서 a-syn 응집을 예방하는 데 효과적인 비교기 항체는 생체 내에서 Ser129 인산화를 방지하지 못했다.
따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 파킨슨병(PD)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB), 확산성 루이소체병(DLBD), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1)를 포함하는, Ser129 인산화의 증가를 특징으로 하는 알파 시누클레인병증을 치료하는 데 사용될 수 있다.
실시예 10: 마우스에서 항체 5811의 약물동역학
수컷 C57/Bl6 마우스(약물당 n=3)에게 2 mg/kg의 단일 용량으로서 항체5811gL14gH4 IgG4P(5811)를 정맥내로 주사하였다.
꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 취하고(주사로부터 0.083, 1, 4, 8, 24, 72, 120, 168 & 336시간), 실온에서 응고시켰다. 원심분리 후 혈청을 단리한 다음, 분석 때까지 동결시켰다. 5811 항체의 정량을 LC-MS/MS에 의해 수행하였다. 연구로부터의 혈청 샘플을 해동시키고, 대조군 마우스 혈청 내로 상이한 농도로 첨가된 5811 항체를 사용하여 제조된 보정선에 대해 정량하였다. LC-MS/MS 시스템 상에 샘플을 주사하기 전에, 혈청을 변성시키고, 환원시키고, 각각 아세토니트릴(VWR, UK), TCEP-Tris(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(Sigma, UK) 및 아이오아세타미드(Sigma, UK)를 사용하여 알킬화시켰다. 그리고 나서, 알킬화된 샘플을 100 mM 암모늄 바이카르보네이트 완충액(Sigma, UK)에서 재구성하고, 37℃에서 트립신(Promega, UK) 효소를 사용하여 밤새 소화시켰다. 샘플에 포름산을 첨가하여 pH를 낮춤으로써 소화를 정지시킨 다음 Waters HLB SPE 플레이트를 사용하여 탈염시켰다. 생성된 용리액을 진공 증발기를 사용하여 증발시켰다. 샘플을 완전히 건조시킨 후, 이들을 0.1% 포름산을 함유하는 95/5: 물/아세토니트릴로 재구성하고, LC-MS/MS 시스템 상에 주입하였다. LC-MS/MS 분석을 AB Sciex QTrap 6500 삼중 사중극자 질량분광기가 결합된 Schimadzu prominence HPLC 시스템에 의해 수행하였다. 소화된 샘플을 오토샘플러에 의해 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(Phenomenex Aeris C18 펩타이드 컬럼 100 X 2.1 mm, 2.6 μm) 상에 주입하고, 이를 50℃에서 유지시켰다. 선 0.1% 포름산 중의 5-70% 아세토니트릴의 선형 구배를 6분 동안 적용한 다음, 0.6 ml/분의 유속으로 0.8분 동안 0.1% 포름산 중의 95% 아세토니트릴로 증가시켰다. 질량분광기를 전이당 50밀리초의 체류 시간에서 5811의 펩타이드의 다중 전이를 검출하기 위해 다중 반응 모니터링 분석을 실행하도록 설정하였다. 데이터 분석을 Analyst 1.6 소프트웨어 버전을 사용하여 수행하였다.
이들 데이터는 항체 5811이 측정된 낮은 제거(clearance) 값에 기초하여 마우스에서 매우 양호한 약동학적 특성(표 11 및 도 14)을 갖는다는 것을 입증한다. 이들은 마우스에 투여된 인간 IgG 약물에 대해 인용된 전형적인 범위(3-16 ml/일/kg; Deng et al 2011 mabs 3:1 61-66)보다 우수한 것으로 보인다.
표 11
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma sprl <120> Antibodies <130> PF0129-WO <150> GB1720970.1 <151> 2017-12-15 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 1 Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn Leu Asp 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Tyr Ala Asn Asn Leu Gln Thr 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 3 Tyr Gln Tyr Lys Asn Gly Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4 Gly Phe Thr Phe Asn Asn Ala Ala Met Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 5 Arg Ile Arg Thr Lys Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Asp Tyr Ser Arg Gly Asp Arg 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 variant 1 <400> 7 Tyr Gln Tyr Lys Asn Ala Trp Thr 1 5 <210> 8 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys 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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Lys Asn Gly Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Ala 20 25 30 Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Thr Lys Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Asp Tyr Ser Arg Gly Asp Arg Trp Gly Gln Gly Val 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat VL nucleotide <400> 11 aacatccaga tgacccagtc tcctccagtc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 ctcagctgca aagcaagtca gaacattaat aagaacttag actggtatca gcaaaagcat 120 ggagaagctc caaaactcct gatgtattat gcaaacaatt tacaaacggg catcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggaacagat tacacgctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgttg ccacatatta ctgctatcag tataagaatg ggtggacgtt cggtggaggc 300 accaagctgg aactgaaa 318 <210> 12 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat VH nucleotide <400> 12 gaaatgcagc tggtggagtc tggtggagga ttggtgcagc ctaaggagtc attgaaaatc 60 tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat aatgctgcca tgtactgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg gtctggaatg ggttgctcgc ataagaacta aacctaataa ttatgcaaca 180 tcttatgctg attcagtgaa aggcagattc accatctcca gagatgattc aaaaagcatg 240 gtctacctac aaatggataa cttgaaaagt gaggacacag ccatgtatta ctgtacagca 300 gattactcca gaggtgacag gtggggccaa ggagtcatgg tcacagtctc gagc 354 <210> 13 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5811 gL5 V-region <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn 20 25 30 Leu 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Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 15 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5811 gL5 V-region nucleotide <400> 15 gacatccaga tgacccagag cccgagctcc ctgtccgcat cagtggggga tcgcgtgact 60 attacgtgca aagcctcgca gaacatcaac aagaacctcg actggtatca gcagaagcca 120 ggaaaggcgc ctaagctgct gatctactac gccaacaatc tccagaccgg cgtgccctcg 180 cggttctccg gatctgggtc cggtactgat tacaccctga ccattagctc ccttcaaccg 240 gaggacttcg ccacctatta ctgctaccag tacaagaacg gctggacttt tggacaaggc 300 accaaggtcg aaatcaag 318 <210> 16 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5811 gL5 Light chain nucleotide <400> 16 gacatccaga tgacccagag cccgagctcc ctgtccgcat cagtggggga tcgcgtgact 60 attacgtgca aagcctcgca gaacatcaac aagaacctcg actggtatca gcagaagcca 120 ggaaaggcgc ctaagctgct gatctactac gccaacaatc tccagaccgg cgtgccctcg 180 cggttctccg gatctgggtc cggtactgat tacaccctga ccattagctc ccttcaaccg 240 gaggacttcg ccacctatta ctgctaccag tacaagaacg gctggacttt tggacaaggc 300 accaaggtcg aaatcaagcg tacggtggcc gctccctccg tgttcatctt cccaccctcc 360 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420 cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 480 tccgtcaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 540 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 600 tccagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgc 639 <210> 17 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5811 gL8 V-region <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys 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<210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 37 Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 38 Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 39 Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 40 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 41 Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 42 Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 43 Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 44 Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 45 Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 46 Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of C-terminus of alpha synuclein <400> 47 Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr 1 5 10

Claims (26)

  1. 알파 시누클레인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 이의 단편은
    a. 서열번호: 1로부터 선택된 CDR-L1; 서열번호: 2에 따른 CDR-L2 및 서열번호: 3에 따른 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    b. 서열번호: 4에 따른 CDR-H1; 서열번호: 5로부터 선택된 CDR-H2 및 서열번호: 6으로부터 선택된 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호: 3과 관련하여 위치 6에서의 아미노산 잔기 글리신(Gly; G)이 알라닌(Ala; A)으로 대체된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여 위치 113 및 129 사이의 알파 시누클레인의 2개 이상의 아미노산 잔기에 결합하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 8과 관련하여 적어도 아미노산 잔기 D119, N122 및 Y125에 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 시누클레인 피브릴에 의해 유도되는 알파 시누클레인의 응집을 방지하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 단량체로서 및 피브릴에서의 알파 시누클레인에 결합할 수 있는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 피브릴에서의 알파 시누클레인보다 단량체 알파 시누클레인에 대해 적어도 10배 높은 해리 상수(KD)를 특징으로 하는, 단량체로서의 알파 시누클레인과 비교하여 피브릴에서의 알파 시누클레인에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 피브릴에서의 알파 시누클레인에 대해 60 pM 이하의 (KD)를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 전장 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 전장 항체는 IgG1, IgG4 또는 IgG4P로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dAb 또는 VHH로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은
    a. 서열번호: 13에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
    b. 서열번호: 17에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 또는
    c. 서열번호: 21에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은
    a. 서열번호: 14에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄; 또는
    b. 서열번호: 18에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄; 또는
    c. 서열번호: 22에 따른 경쇄 및 서열번호: 26에 따른 중쇄
    를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제14항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는
    a. 경쇄 가변 영역으로서, 폴리뉴클레오타이드가
    i. 서열번호: 15, 19 또는 23과 적어도 90% 동일하거나; 또는
    ii. 서열번호: 15, 또는 19 또는 23을 포함하거나; 또는
    iii. 서열번호: 15, 19 또는 23으로 본질적으로 구성되는 것인
    경쇄 가변 영역; 또는
    b. 중쇄 가변 영역으로서, 폴리뉴클레오타이드가
    i. 서열번호: 27과 적어도 90% 동일하거나; 또는
    ii. 서열번호: 27을 포함하거나; 또는
    iii. 서열번호: 27로 본질적으로 구성되는 것인
    중쇄 가변 영역; 또는
    c. 경쇄로서, 폴리뉴클레오타이드가
    i. 서열번호: 16, 20 또는 24와 적어도 90% 동일하거나; 또는
    ii. 서열번호: 16, 20 또는 24를 포함하거나; 또는
    iii. 서열번호: 16, 20 또는 24로 본질적으로 구성되는 것인
    경쇄;
    d. 중쇄로서, 폴리뉴클레오타이드가
    i. 서열번호: 28과 적어도 90% 동일하거나; 또는
    ii. 서열번호: 28을 포함하거나; 또는
    iii. 서열번호: 28로 본질적으로 구성되는 것인
    중쇄
    를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제14항 또는 제15항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  17. a. 제14항 또는 제15항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는
    b. 제16항에 따른 하나 이상의 발현 벡터
    를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제17항에 따른 숙주 세포를 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생산 방법.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 경우에 따라 하나 이상의 추가의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제13항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제13항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 시누클레인병증은 파킨슨병(PD: Parkinson's disease)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB: dementia with Lewy bodies), 확산성 루이소체병(DLBD: Diffuse Lewy Body Disease), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD: Lewy body variant of Alzheimer's disease), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA: multiple system atrophy), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1: neurodegeneration with brain iron accumulation type-1)로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제22항에 있어서, 시누클레인병증은 파킨슨병인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제19항에 따른 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 시누클레인병증을 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 시누클레인병증은 파킨슨병(PD)(특발성 및 유전성의 파킨슨병 포함), 루이소체 치매(DLB), 확산성 루이소체병(DLBD), 알츠하이머병의 루이소체형(LBVAD), 알츠하이머병과 파킨슨병의 조합, 다계통 위축증(MSA), 및 뇌의 철 축적을 수반하는 신경퇴행 유형-1(NBIA-1)로부터 선택되는, 바람직하게는 파킨슨병인 방법.
  26. 제1항 내지 제13항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 시누클레인병증의 진단, 바람직하게는 파킨슨병의 진단에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물.
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