CN108642082B - 一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法 - Google Patents
一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108642082B CN108642082B CN201810268674.8A CN201810268674A CN108642082B CN 108642082 B CN108642082 B CN 108642082B CN 201810268674 A CN201810268674 A CN 201810268674A CN 108642082 B CN108642082 B CN 108642082B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- zebra fish
- glucocorticoid receptor
- tol2
- vector
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 title claims abstract description 55
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 102100021752 Corticoliberin Human genes 0.000 description 2
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- KLVRDXBAMSPYKH-RKYZNNDCSA-N corticotropin-releasing hormone (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(N)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CNC=N1 KLVRDXBAMSPYKH-RKYZNNDCSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 2
- 230000004179 hypothalamic–pituitary–adrenal axis Effects 0.000 description 2
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- DVTPRYHENFBCII-IMJSIDKUSA-N (2S,4S)-4-hydroxy-2,3,4,5-tetrahydrodipicolinic acid Chemical compound O[C@H]1C[C@@H](C(O)=O)N=C(C(O)=O)C1 DVTPRYHENFBCII-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 1
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 108010022152 Corticotropin-Releasing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 241000207929 Scutellaria Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001780 adrenocortical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001430 anti-depressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229940041967 corticotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 210000002963 paraventricular hypothalamic nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/40—Fish
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：第一步：利用斑马鱼基因克隆和酶切连接的方法构建得到载体Tol2‑Crystallin启动子‑EGFP‑pA‑EF1α启动子‑GRcDNA‑pA‑Tol2；第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；第三步：培育所述受精卵获得全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。本发明相对于其他方法来研究糖皮质激素受体的功能和以糖皮质激素受体为靶标的药物筛选提供便利。
Description
技术领域
本发明涉及一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
下丘脑-垂体-肾上腺轴（The hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA orHTPA axis）是生物体内能够通过反馈调节稳定集体的一个系统。下丘脑的室旁核的分泌可以促进抗利尿激素和促肾上腺皮质激素释放激素作用于垂体，刺激垂体分泌肾上腺皮质激素，然后作用于肾上腺皮质分泌糖皮质激素。糖皮质激素通过绑定糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor，GR）可以反馈作用于下丘脑和垂体（分别抑制CRH和ACTH的合成与分泌），形成反馈调节环路。HPA轴在包括免疫，压力应答等很多生理的稳态过程中起着重要的作用。临床的研究发现，几乎80%的抑郁症患者都发现糖皮质激素受体的表达降低的现象，并且青年期的不利因素会造成GR表达的异常，影响到成年后的情绪和精神疾病。所以研究GR的功能解析对于很多疾病的治疗提供新的思路。并且糖皮质激素受体作为研究抗抑郁病的过程中是一个非常有效的靶点。
斑马鱼是一种热带硬骨鱼，由于和人类基因的高度同源性和诸多的优势作为生物医学研究的模式生物已经达到将近四十年的历史。并且研究发现斑马鱼的糖皮质激素受体和人的糖皮质激素受体结构、功能和作用的机制具有高度的类似。由此利用遗传操作技术，构建了一种全身过量表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。此斑马鱼品系可用来进行糖皮质激素受体相关的功能研究，也为以糖皮质激素受体为靶点的药物筛选提供便利。
发明内容
本发明目的在于提供一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：
第一步：利用斑马鱼基因克隆和酶切连接的方法构建得到载体Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2；
第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；
第三步：培育所述受精卵获得全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。
优选的技术方案为：在第二步中，采用显微注射的方法。
优选的技术方案为：还包括提取F1代斑马鱼基因组，然后利用PCR方法对全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼进行鉴定；所述PCR方法的的引物序列为：
正向引物：GGTGAACTTCAAGATCCGCC；
反向引物：CTTGTACAGCTCGTCCATGC。
优选的技术方案为：所述Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建包括Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-Tol2载体的构建、Tol2-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建和利用同源重组的技术将Crystallin启动子-EGFP-pA片段重组进入Tol2- EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体。
附图说明
附图1为载体图。
附图2为PCR电泳图。
附图3为可遗传的全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼眼睛有绿色荧光蛋白的表达。
附图4为荧光定量PCR反应测定糖皮质激素受体表达量和下游靶基因表达量。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明的优点是可遗传鱼是全身过表达的糖皮质激素受体，是可以反映体内的过量表达糖皮质激素受体后全身的生理，生化和行为。再者，本发明利用眼睛特异性EGFP表达。这样可遗传的转基因斑马鱼更容易辨别。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
参见图1~4所示，须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例：一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法
一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：
第一步：利用斑马鱼基因克隆和酶切连接的方法构建得到载体Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2；
第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；
第三步：培育所述受精卵获得全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。
鉴定可通过两种方式；第一种，直接观察斑马鱼研究，可遗传的全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼眼睛在荧光显微镜下有绿色。第二种，是提取F1代斑马鱼基因组，利用PCR方法，鉴定的引物序列为：正向引物：GGTGAACTTCAAGATCCGCC；反向引物：CTTGTACAGCTCGTCCATGC。为了证明全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼是否成功，利用荧光定量PCR检测糖皮质激素受体和下游靶基因的表达。
优选的实施方式为：在第二步中，采用显微注射的方法。
优选的实施方式为：还包括提取F1代斑马鱼基因组，然后利用PCR方法对全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼进行鉴定；所述PCR方法的的引物序列为：
正向引物SEQ ID No.1：GGTGAACTTCAAGATCCGCC；
反向引物SEQ ID No.2：CTTGTACAGCTCGTCCATGC。
具体的PCR检测包括下列步骤：
A、基因组提取，步骤如下：取斑马鱼尾鳍，加入20μl 50Mm NaOH，95℃10min后加入20μl50mM tris，12000rpm离心2min，取上清做模板，PCR反应。正向引物SEQ ID No.1、反向引物SEQ ID No.2。
B、PCR反应如下：ddH2O：10.8μl；（2）dNTPs：2 μl；Taq酶 buffer：2μl；正向引物：1μl；反向引物：2 μl；模板DNA 2μl；Taq酶：0.2μl。扩增程序。98℃3min，进入循环扩增阶段：98℃ 20s →65℃ 20s → 72℃ 30sec，循环40次，最后在72℃保温10min，4℃∞。
C、PCR电泳结果如图2所示，图2中有372bp条带，即为可遗传斑马鱼。
利用荧光显微镜，将发育3-4天的斑马鱼放在绿色过滤镜片下观察，在可遗传的全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼眼睛有绿色荧光蛋白的表达，结果如图3。
利用荧光定量PCR反应测定糖皮质激素受体表达量和下游靶基因表达量，结果如图4。
由图4可知，糖皮质激素受体和下游的靶基因在全身过表达糖皮质激素斑马鱼组中的表达明显升高，表明该转基因斑马鱼成功构建。
优选的实施方式为：所述Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建包括Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-Tol2载体的构建、Tol2-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建和利用同源重组的技术将Crystallin启动子-EGFP-pA片段重组进入Tol2- EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体。
斑马鱼是一种热带淡水鱼类。由于其体积小，发育周期短，繁殖能力强，通体透明的优势，已经在生物基础研究领域广泛地应用。在本发明中所用的斑马鱼是AB品系的斑马鱼，AB品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。在斑马鱼的生理状况中，糖皮质激素的系统和人类是完全一样的，并且也具有保守的基因和保守的反馈调节系统。转基因激素是现在在斑马鱼研究中常用的集团因操作技术，能够对基因的功能，调节研究更加便利。本研究就是利用转基因技术获得转基因斑马鱼。
载体Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2的构建具体包括：
一、Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-Tol2载体的构建。
PCR反应扩增Crystallin启动子，启动子克隆引物序列如下：正向引物序列SEQ IDNo.3：TCGAGCAATTGGTGC，反向引物序列SEQ ID No.4：TGCTGGGAAGGCTGG。PCR反应体系如下：斑马鱼基因组：1微升；正向引物：1微升；反向引物：1微升，KOD 酶缓冲液：25微升；KOD酶：1微升；dNTP: 10微升；双蒸水：12微升。循环条件如下：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒；60℃退火20秒；68℃延伸30秒，最后延伸68℃10分钟。PCR产物大小为634bp，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其序列为SEQ ID No.5。将PCR产物进行胶回收后，和pT2xex-GFP载体分别进行酶切反应，酶切反应体系如下：Xhol：1微升； BamI：1微升；酶切缓冲液：2微升，胶回收产物10微升；双蒸水：6微升。混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时。酶切后进行胶回收，回收片段进行连接反应，连接反应如下：载体酶切片段：1微升；Crystallin启动子酶切片段7微升；T4连接酶：1微升；T4连接酶缓冲液：1微升。连接反应如下：PCR仪中，22℃ 1小时，16℃ 2小时。连接结束后进行转化反应，挑取正确的克隆。由此构建得到Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-Tol2载体。
二、Tol2- EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建
利用PCR技术克隆GRcDNA。GRcDNA引物序列如下：正向引物序列SEQ ID No.6：ATGGATCAAGGAGGACTGGAG；反向引物序列SEQ ID No.7：TCATTTCTGGTGAAAGAGCAG。PCR反应体系如下：斑马鱼cDNA：1微升；正向引物：1微升；反向引物：1微升，KOD 酶缓冲液：25微升；KOD酶：1微升；dNTP: 10微升；双蒸水：12微升。循环条件如下：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒；60℃退火20秒；68℃延伸1分钟，最后延伸68℃10分钟。PCR产物大小为1.8kb，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR产物进行胶回收后，和pT2xex-GFP载体分别进行酶切反应，酶切反应体系如下：ClaI：1微升；BamHI：1微升；酶切缓冲液：2微升，胶回收产物10微升；双蒸水：6微升。混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时。酶切后进行胶回收，回收片段进行连接反应，连接反应如下：载体酶切片段：1微升；GRcDNA酶切片段7微升；T4连接酶：1微升；T4连接酶缓冲液：1微升。连接反应如下：PCR仪中，22℃1小时，16℃2小时。连接结束后进行转化反应，挑取正确的克隆。由此构建得到Tol2-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体。EF1α启动子的序列SEQID No.10。
三、Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建
利用同源重组的技术将Crystallin启动子-EGFP-pA片段重组进入Tol2- EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体。反应过程如下：首先PCR扩增出Crystallin启动子-EGFP-pA片段。反应引物序列如下：正向引物序列SEQ ID No.8：AGATGATCCCCCTGCTCG；反向引物序列SEQ ID No.9：AGATGATCCCCCTGCTCG。PCR反应体系如下：Crystallin启动子-EGFP-pA质粒：1微升；正向引物：1微升；反向引物：1微升，KOD 酶缓冲液：25微升；KOD酶：1微升；dNTP: 10微升；KOD酶：1微升；双蒸水：12微升。循环条件如下：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒；60℃退火20秒；68℃延伸1分钟，最后延伸68℃10分钟。PCR产物大小为1.8kb，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将Tol2- EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体单酶切线性化，酶切反应体系如下：Xhol1：1微升；酶切缓冲液：2微升，胶回收产物10微升；双蒸水：7微升。混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时。酶切后进行胶回收，回收片段进行重组反应，反应体系如下：酶切回收的Tol2-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体：1微升；PCR回收产物：7微升；重组缓冲液：2微升；重组酶：1微升。重组反应如下：55℃1小时；75℃30分钟。然后进行转化反应，挑取正确的克隆。载体图如图1所示。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
<110>苏州木芮生物科技有限公司
<120>一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法
<160>9
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
GGTGAACTTC AAGATCCGC C
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
CTTGTACAGC TCGTCCATGC
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
TCGAGCAATT GGTGC
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
TGCTGGGAAG GCTGG
<210>5
<211>635
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
TCGAGCAATT GGTGCTATCA TCATGACAAA GAGAAAAGAA ATCAGTTATT AGAAATGAGT 60
TATTAAAACT ATTATGATTA GAAATATGTT TCTTTCTCTT AAACAGGATT TAAGGGGAAA 120
ATATACAGGG AGCGAAAAAT TTTGACTTCA TCTGTATATA CATATAATAA ATAATACATC 180
AATAAATTCC ATCTAAATAC GCTACCATAT ATATATATAT ATGTATATAC ACACACACAC 240
ACACACCATC TAATATATGT CATGCTACAT TATTAACTTC AGTATGAAAT CTACTCTGCT 300
CTGGAGTGTA TCAGCGAGCG ACTCCTCTGC TCGGATTATC ATCACGTGAC CTCTGACCTG 360
AACACAGACC TCTCTTAGCC ATAGGTATAC AGCCTATAGC ATAGAGCTCG GGCTGAGAGG 420
GAAAGTGCCG CCGTCAGGGC TTTCCATTGA CAGTAAAATG CTTACGGCCT TCTGGGCGAT 480
GCGATGACCC TGCGCTTCGG CACGGCTGAA CTCTGATGAC GGCGTGTTTC TATTGTCCGC 540
CGCGCGCCGC TGTGCTGCCC TTGCCAGCGT ATAAAAGCTG CGGCAGTGGT GAGGAAGGCC 600
AGAGCGAGCC AGCCTTCCCA GCACAGCTGT AGTTT 635
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
ATGGATCAAG GAGGACTGGA G
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
TCATTTCTGG TGAAAGAGCA G
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
AGATGATCCC CCTGCTCG
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
AGATGATCCC CCTGCTCG
<210>10
<211>1159
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
GGATCCGTCG AGGAATTCTT TGCCAAAATG ATGAGACAGC ACAACAACCA GCACGTTGCC 60
CAGGAGCTGT AGGAAAGAGA AGAAGGCATG AACATGGTTA GCAGAGGGGC CCGGTTTGGA 120
CTCAGAGTAT TTTATCCTCA TCTCAAACAG TGTATATCAT TGTAACCATA AAGAGAAAGG 180
CAGGATGATG ACCAGGGTGT AGTTGTTTCT ACCAATAAGA ATATTTCCACG CCAGCCAGA 240
ATTTATATGC AGAAATATTC TACCTTATCA TTTAATTATA ACAATTGTTCT CTAAAACTG 300
TGCTGAAGTA CAATATAATA TACCCTGATT GCCTTGAAAA AAAAGTGATT AGAGAAAGTA 360
CTTACAATCT GACAAATAAA CAAAAGTGAA TTTAAAAATT CGTTACAAAT GCAAGCTAAA 420
GTTTAACGAA AAAGTTACAG AAAATGAAAA GAAAATAAGA GGAGACAATG GTTGTCAACA 480
GAGTAGAAAG TGAAAGAAAC AAAATTATCA TGAGGGTCCA TGGTGATACA AGGGACATCT 540
TCCCATTCTA AACAACACCC TGAAAACTTT GCCCCCTCCA TATAACATGA ATTTTACAAT 600
AGCGAAAAAG AAAGAACAAT CAAGGTCCCC AAACTCACCCT GAAGTTCTCA GGATCGGTC 660
GACCTGCAGG AAGCTTCAGC TAGAACTCGC CGCAGACCCGG TGAGGAAGAG AGCGAACCG 720
GGCCTTAACC ACCCTTTATA TAGCCGCCTC TACTGGGCGGG GATTAACCAT GACATCATC 780
AAGTCCAGAA TTCCCAAAG 799
TGCTAGAGGC GGGGTCTTGA CAGAACATTC AGCCTGTAAG CGTCTTGTAT ACTACAACTC 859
CCAGTAGCAC TAGGGCGGAT 879
GCAGCTGTTG AGTGAAACGC GCGAGTTATC ACGAAGTTAG GGCGAAAGGA AGGGTGGCAC 939
TCCCTAGTGC GTCATAAGCT 959
AGCTTGCATG CCTGAGAATTT CAGAATGTAA TGATACCTTT GTTAGATAAG GCTGTTTAC 1019
ATCTGATAGT GGACCTTAAG 1039
CCGACACTTA AATGATAAAA ACGGCAAAGA ATTGCAAGTT TGATTTGCAT TGGAAAGGGT 1099
CGCTGGCTTT TGTGTTACAC 1109
GCCCCTTATT TGTGCTTGAT TAGATGATCC CCCTGCTCGA GCCGGGCCCA 1159
Claims (3)
1.一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：利用斑马鱼基因克隆和酶切连接的方法构建得到载体Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2；
第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；
第三步：培育所述受精卵获得全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼；
所述Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建包括Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-Tol2载体的构建、Tol2-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建和利用同源重组的技术将Crystallin启动子-EGFP-pA片段重组进入Tol2- EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体。
2.根据权利要求 1所述的全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：在第二步中，采用显微注射的方法。
3.根据权利要求 1所述的全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：还包括提取F1代斑马鱼基因组，然后利用PCR方法对全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼进行鉴定；所述PCR方法的引物序列为：
正向引物：GGTGAACTTCAAGATCCGCC；
反向引物：CTTGTACAGCTCGTCCATGC。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810268674.8A CN108642082B (zh) | 2018-03-29 | 2018-03-29 | 一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810268674.8A CN108642082B (zh) | 2018-03-29 | 2018-03-29 | 一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108642082A CN108642082A (zh) | 2018-10-12 |
| CN108642082B true CN108642082B (zh) | 2022-05-13 |
Family
ID=63745191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810268674.8A Active CN108642082B (zh) | 2018-03-29 | 2018-03-29 | 一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108642082B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111944835B (zh) * | 2019-05-14 | 2022-03-29 | 南通大学 | 一种突变型gabrg2转基因斑马鱼癫痫模型的构建方法及应用 |
| CN115956540A (zh) * | 2022-12-23 | 2023-04-14 | 苏州木芮生物科技有限公司 | 一种糖皮质激素受体缺失的斑马鱼抑郁模型的构建方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090022231A (ko) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 에스트로겐 반응성 리포터 유전자가 도입된 제브라피쉬 및이를 이용한 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법 |
| CN104313043A (zh) * | 2014-09-29 | 2015-01-28 | 广东医学院附属医院 | 一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法及其应用 |
| CN105755106A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-07-13 | 厦门大学 | 一种二噁英类持久性有机污染物检测方法 |
| CN106070063A (zh) * | 2016-07-07 | 2016-11-09 | 贵州医科大学 | 带abcb4的转基因斑马鱼系及其建立方法 |
| CN106480093A (zh) * | 2016-10-21 | 2017-03-08 | 厦门大学 | 卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法 |
| CN111621522A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-04 | 浙江大学 | 一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法 |
-
2018
- 2018-03-29 CN CN201810268674.8A patent/CN108642082B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090022231A (ko) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 에스트로겐 반응성 리포터 유전자가 도입된 제브라피쉬 및이를 이용한 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법 |
| CN104313043A (zh) * | 2014-09-29 | 2015-01-28 | 广东医学院附属医院 | 一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法及其应用 |
| CN105755106A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-07-13 | 厦门大学 | 一种二噁英类持久性有机污染物检测方法 |
| CN106070063A (zh) * | 2016-07-07 | 2016-11-09 | 贵州医科大学 | 带abcb4的转基因斑马鱼系及其建立方法 |
| CN106480093A (zh) * | 2016-10-21 | 2017-03-08 | 厦门大学 | 卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法 |
| CN111621522A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-04 | 浙江大学 | 一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108642082A (zh) | 2018-10-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nishihama et al. | Expansion of the cell plate in plant cytokinesis requires a kinesin-like protein/MAPKKK complex | |
| Hiller et al. | Developmental regulation of transcription by a tissue-specific TAF homolog | |
| Johansen et al. | Neural plasticity is affected by stress and heritable variation in stress coping style | |
| Hart et al. | Testis-specific murine centrin, Cetn1: genomic characterization and evidence for retroposition of a gene encoding a centrosome protein | |
| Kim et al. | Discovery of a novel, paternally expressed ubiquitin-specific processing protease gene through comparative analysis of an imprinted region of mouse chromosome 7 and human chromosome 19q13. 4 | |
| Klein et al. | Induction of mesoderm in Xenopus laevis embryos by translation initiation factor 4E | |
| CN109734798B (zh) | 飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂7及其编码基因与应用 | |
| CN108642082B (zh) | 一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法 | |
| Phinyo et al. | Characterization and expression analysis of Cyclin-dependent kinase 7 gene and protein in ovaries of the giant tiger shrimp Penaeus monodon | |
| WO2019206233A1 (zh) | 一种RNA编辑的CRISPR/Cas效应蛋白及系统 | |
| CN102187845B (zh) | 一种提高蚕丝产量的转基因方法 | |
| Beckmann et al. | Schistosoma mansoni: germ-line transformation approaches and actin-promoter analysis | |
| Taylor-Fishwick et al. | Cloning genomic INGAP: a Reg-related family member with distinct transcriptional regulation sites | |
| Proudfoot et al. | Transcriptional analysis of human zeta globin genes. | |
| CN109734789B (zh) | 飞蝗fk506结合蛋白46及其编码基因与应用 | |
| CN104232643B (zh) | RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用 | |
| Suzuki et al. | Diapause-associated transcription of BmEts, a gene encoding an ETS transcription factor homolog in Bombyx mori | |
| CN114134183B (zh) | 一种siglec15基因人源化动物模型的构建方法及应用 | |
| CN109694885B (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术制备PI3Kγ全身敲除模式小鼠方法及其应用和试剂盒 | |
| CN108642081B (zh) | 一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法 | |
| Muzaffar et al. | History of biotechnology | |
| Reid et al. | Cloning of a bovine voltage-gated K+ channel gene utilising partial amino acid sequence of a dendrotoxin-binding protein from brain cortex | |
| CN107058331A (zh) | 抵抗饮食诱导肥胖的猪r型载脂蛋白基因及猪r型载脂蛋白 | |
| MIN et al. | 307-bp Fragment in H0XA7 Upstream Sequence Is Sufficient for Anterior Boundary Formation | |
| CN110511938A (zh) | 一种短须裂腹鱼热应激蛋白hsp70基因、检测方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |