CN108642081B - 一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：第一步：利用基因合成和酶切连接的方法构建得到载体Tol2‑9*GRE‑HSV.U123‑Luciferase‑SV40pA‑Tol2；第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；第三步：培育所述受精卵获得糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼。本发明相对于其他方法检测糖皮质激素活性的方法来比较更容易定性和定量。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
近年来，由于生活压力和环境变化的加快，抑郁病症也成为侵袭人类健康的重要疾病，据统计，在每个人生活中的或多或少的生命时间都会受到抑郁病的困扰。有些重型抑郁症患者可能最终走向自杀的极端来结束自己的生命。临床的研究发现几乎80%的抑郁症患者都发现糖皮质激素受体的表达降低的现象。糖皮质激素受体是生物体下丘脑-垂体-肾上腺主要的下游受体，通过绑定肾上腺分泌的糖皮质激素（皮质醇）来调节包括代谢、行为、生理等各种生物过程。所以，糖皮质激素作为研究抗抑郁病的过程中是一个非常有效的靶点。以前的细胞模型，由于作用比较单一，也不能反应整体的动物现象，无法评估药物的体内状况。传统的实验动物如小鼠，作为药物筛选的模型费用高，造模的时间长，并且无法实现高通量的药物筛选。
斑马鱼是一种热带硬骨鱼，由于和人类基因的高度同源性和诸多的优势作为生物医学研究的模式生物已经达到将近四十年的历史。并且研究发现斑马鱼的糖皮质激素受体和人的糖皮质激素受体结构，功能和作用的机制具有高度的类似。由此利用遗传操作技术，构建了一种糖皮质激素应答原件的转基因斑马鱼，由此我们构建了糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶基因转基因斑马鱼品系。此斑马鱼品系可用来进行糖皮籽激素受体作为靶点的抑郁类药物的高通量筛选和环境糖皮质类激素水质污染的监测，具有快速，直接和易量化的特征。
发明内容
本发明目的在于提供一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：
第一步：利用基因合成和酶切连接的方法构建得到载体Tol2-9*GRE-HSV.U123-Luciferase-SV40pA-Tol2；
第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；
第三步：培育所述受精卵获得糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼。
优选的技术方案为：在第二步中，采用显微注射的方法。
优选的技术方案为：还包括提取F1代斑马鱼基因组，然后利用PCR方法对糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼进行鉴定；所述PCR方法的的引物序列为：
正向引物：GTGTCCGATTCAGTCATGCC；
反向引物：CTGGTTGTTTCTGTCAGGCC。
附图说明
附图1为载体图。
附图2为PCR电泳图。
附图3为地塞米松处理糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的荧光检测结果。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明的方法能够快速简便地检测糖皮质激素的活性和药物对下丘脑-垂体-肾上腺轴的紊乱。并且本发明不需要昂贵的仪器设备，灵敏度高，还能够反映个体的生理状况，最低可检测ng级别的糖皮质激素的浓度。本发明可应用于研究垂体-下丘脑-肾上腺轴相关的生物基础研究，药物对体-下丘脑-肾上腺轴的影响，以及环境中糖皮质激素的浓度测定。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
参见图1~3所示，须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法
一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：
第一步：利用基因合成和酶切连接的方法构建得到载体Tol2-9*GRE-HSV.U123-Luciferase-SV40pA-Tol2；
第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；
第三步：培育所述受精卵获得糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼。
优选的实施方式为：在第二步中，采用显微注射的方法。
优选的实施方式为：还包括提取F1代斑马鱼基因组，然后利用PCR方法对糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼进行鉴定；所述PCR方法的的引物序列为：
正向引物SEQ ID No.1：GTGTCCGATTCAGTCATGCC；
反向引物SEQ ID No.2：CTGGTTGTTTCTGTCAGGCC。
PCR检测方法具体包括：
A、基因组提取，步骤如下：取斑马鱼尾鳍，加入20μl 50Mm NaOH，95℃10min后加入20μl50mM tris，12000rpm离心2min，取上清做模板，PCR反应。
B、PCR反应如下：ddH2O：10.8μl；（2）dNTPs：2μl；Taq酶 buffer：2μl；正向引物：1μl；反向引物：2μl；模板DNA2μl；Taq酶：0.2μl。扩增程序。98℃3min，进入循环扩增阶段：98℃20s →65℃ 20s → 72℃ 30sec，循环40次，最后在72℃保温10min，4℃∞。
C、PCR电泳结果如图2所示，有580bp条带，即为可遗传斑马鱼。
地塞米松处理糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼，检测荧光值得改变，结果如图3，本实验结果，用不同浓度的地塞米松处理转基因斑马鱼，发现随着处理浓度的升高，荧光值呈现明显的升高，并且在1nM也能明显地激活该转基因斑马鱼，说明该转基因斑马鱼比较灵敏。
斑马鱼是一种热带淡水鱼类。由于其体积小，发育周期短，繁殖能力强，通体透明的优势，已经在生物基础研究领域广泛地应用。在本发明中所用的斑马鱼是AB品系的斑马鱼，AB品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。在斑马鱼的生理状况中，糖皮质激素的系统和人类是完全一样的，并且也具有保守的基因和保守的反馈调节系统。转基因激素是现在在斑马鱼研究中常用的集团因操作技术，能够对基因的功能，调节研究更加便利。本研究就是利用转基因技术获得转基因斑马鱼。
稳定可遗传的糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的鉴定可通过两种方式；第一种，通过化学发光仪直接检测荧光值，第二种，是提取F1代斑马鱼基因组，利用PCR方法，鉴定的引物序列为：正向引物：GTGTCCGATTCAGTCATGCC；反向引物：CTGGTTGTTTCTGTCAGGCC。为了证明糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼是否成功，利用地塞米松处理获得的稳定可遗传的斑马鱼，结果发现荧光值明显升高，微量的地塞米松就可以呈现出明显的激活性作用。
Tol2-9*GRE-HSV.U123-Luciferase-SV40pA-Tol2的构建包括：
体外直接合成9*GRE原件，序列SEQ ID No.3。将9*GRE原件酶切连接到pT2xex-GFP载体，9*GRE原件和pT2xex-GFP载体分别酶切反应如下：双蒸水：15微升；buffer：2微升；合成9*GRE原件序列：3微升；Xhol：0.2微升；BamH1：0.2微升；2.混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时。酶切结束后进行胶回收目的片段，然后进行连接反应。连接反应如下：9*GRE原件酶切片段：6微升；连接酶buffer：2微升；酶切9*GRE原件载体：1微升；T4连接酶：1微升；PCR仪中，22℃1小时，16℃forever。连接转化。挑取正确克隆。然后利用用同源重组的技术将luciferase序列（SEQ ID No.4）重组进入Tol2-9*GRE-HSV123-EGFP-SV40pA载体。
重组过程如下：首先PCR扩增出luciferase片段。反应引物序列如下：正向引物序列SEQ ID No.5：AAAGAATTCCTCGACGGATCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAA；反向引物SEQ IDNo.6序列：CATGTCTGGATCATCATCGATTCGAGTTTTCCGGTAAGACCTT。PCR反应体系如下：luciferase质粒模板：1微升；正向引物：1微升；反向引物：1微升，KOD 酶缓冲液：25微升；KOD酶：1微升；dNTP: 10微升；KOD酶：1微升；双蒸水：12微升。循环条件如下：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒；60℃退火20秒；68℃延伸1分钟，最后延伸68℃10分钟。PCR产物大小为1.6kb，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将Tol2-9*GRE-HSV123-EGFP-SV40pA载体双酶切线性化，酶切反应体系如下：BamH1：1微升；Cla1：1微升；酶切缓冲液：2微升，BamH1：1微升；Tol2-9*GRE-HSV123-EGFP-SV40pA质粒：10微升；双蒸水：7微升。混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时。酶切后进行胶回收，回收片段进行重组反应，反应体系如下：酶切回收的Tol2-9*GRE-HSV123-EGFP-SV40pA载体：1微升；PCR回收产物：7微升；重组缓冲液：2微升；重组酶：1微升。重组反应如下：55℃ 1小时；75℃ 30分钟。然后进行转化反应，挑取正确的克隆。载体如图1所示。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
<110>苏州木芮生物科技有限公司
<120>一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法
<160>9
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
GTGTCCGATT CAGTCATGCC
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
CTGGTTGTTT CTGTCAGGCC
<210>3
<211>270
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
ACTACGTCGA GCTGTACAGG ATGTTCTACT ACGTCGAGCT GTACAGGATG TTCTACTACG 60
TCGAGCTGTA CAGGATGTTC TACTACGTCG AGCTGTACAG GATGTTCTAC TACGTCGAGC 120
TGTACAGGAT GTTCTACTAC GTCGAGCTGT ACAGGATGTT CTACTACGTC GAGCTGTACA 180
GGATGTTCTA CTACGTCGAG CTGTACAGGA TGTTCTACTA CGTCGAGCTG TACAGGATGT 240
TCTACTACGT CGAGCTGTAC AGGATGTTCT 270
<210>4
<211>1592
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
ATGGAAGACG CCAAAAACAT AAAGAAAGGC CCGGCGCCAT TCTATCCGCT GGAAGATGGA 60
ACCGCTGGAG AGCAACTGCA TAAGGCTATG AAGAGATACG CCCTGGTTCC TGGAACAATT 120
GCTTTTACAG ATGCACATAT CGAGGTGGAC ATCACTTACG CTGAGTACTT CGAAATGTCC 180
GTTCGGTTGG CAGAAGCTAT GAAACGATAT GGGCTGAATA CAAATCACAG AATCGTCGTA 240
TGCAGTGAAA ACTCTCTTCA ATTCTTTATG CCGGTGTTGG GCGCGTTATT TATCGGAGTT 300
GCAGTTGCGC CCGCGAACGA CATTTATAAT GAACGTGAAT TGCTCAACAG TATGGGCATT 360
TCGCAGCCTA CCGTGGTGTT CGTTTCCAAA AAGGGGTTGC AAAAAATTTT GAACGTGCAA 420
AAAAAGCTCC CAATCATCCA AAAAATTATT ATCATGGATT CTAAAACGGA TTACCAGGGA 480
TTTCAGTCGA TGTACACGTT CGTCACATCT CATCTACCTC CCGGTTTTAA TGAATACGAT 540
TTTGTGCCAG AGTCCTTCG ATAGGGACAAG ACAATTGCAC TGATCATGAA CTCCTCTGGA 600
TCTACTGGTC TGCCTAAAG GTGTCGCTCTG CCTCATAGAA CTGCCTGCGT GAGATTCTCG 660
CATGCCAGAG ATCCTATTT TTGGCAATCAA ATCATTCCGG ATACTGCGAT TTTAAGTGTT 720
GTTCCATTCC ATCACGGTT TTGGAATGTTT ACTACACTCG GATATTTGAT ATGTGGATTT 780
CGAGTCGTCT TAATGTATA GATTTGAAGAA GAGCTGTTTC TGAGGAGCCT TCAGGATTAC 840
AAGATTCAAA GTGCGCTGC TGGTGCCAACC CTATTCTCCT TCTTCGCCAA AAGCACTCTG 900
ATTGACAAAT ACGATTTAT CTAATTTACAC GAAATTGCTT CTGGTGGCGC TCCCCTCTCT 960
AAGGAAGTCG GGGAAGCGG TTGCCAAGAGG TTCCATCTGC CAGGTATCAG GCAAGGATAT 1020
GGGCTCACTG AGACTACAT CAGCTATTCTG ATTACACCCG AGGGGGATGA TAAACCGGGC 1080
GCGGTCGGTA AAGTTGTTC CATTTTTTGAA GCGAAGGTTG TGGATCTGGAT ACCGGGAAA 1140
ACGCTGGGCG TTAATCAAA GAGGCGAACTG TGTGTGAGAG GTCCTATGATT ATGTCCGGT 1200
TATGTAAACA ATCCGGAAG CGACCAACGCC TTGATTGACA AGGATGGATGG CTACATTCT 1260
GGAGACATAG CTTACTGGG ACGAAGACGAA CACTTCTTCA TCGTTGACCGC CTGAAGTCT 1320
CTGATTAAGT ACAAAGGCT ATCAGGTGGCT CCCGCTGAAT TGGAATCCATC TTGCTCCAA 1380
CACCCCAACA TCTTCGACG CAGGTGTCGCA GGTCTTCCCG ACGATGACGCC GGTGAACTT 1440
CCCGCCGCCG TTGTTGTTT TGGAGCACGGA AAGACGATGA CGGAAAAAGAG ATCGTGGAT 1500
TACGTCGCCA GTCAAGTAA CAACCGCGAAA AAGTTGCGCG GAGGAGTTGTG TTTGTGGAC 1560
GAAGTACCGA AAGGTCTTA CCGGAAAACTC GA 1592
<210>5
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
AAAGAATTCC TCGACGGATC CATGGAAGAC GCCAAAAACA TAAA
<210>6
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>
CATGTCTGGA TCATCATCGA TTCGAGTTTT CCGGTAAGAC CTT
Claims (3)
1.一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：利用基因合成和酶切连接的方法构建得到载体Tol2-9*GRE-HSV.U123-Luciferase-SV40pA-Tol2；
第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；
第三步：培育所述受精卵获得糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼；
Tol2-9*GRE-HSV.U123-Luciferase-SV40pA-Tol2的构建包括：
体外直接合成9*GRE原件，序列SEQ ID No.3，将9*GRE原件酶切连接到pT2xex-GFP载体，9*GRE原件和pT2xex-GFP载体分别酶切反应如下：双蒸水：15微升；buffer：2微升；合成9*GRE原件序列：3微升；Xhol：0.2微升；BamH1：0.2微升；2.混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时；
酶切结束后进行胶回收目的片段，然后进行连接反应；
连接反应如下：9*GRE原件酶切片段：6微升；连接酶buffer：2微升；酶切9*GRE原件载体：1微升；T4连接酶：1微升；PCR仪中，22℃1小时，16℃forever；
连接转化；
挑取正确克隆；
然后利用同源重组的技术将luciferase序列重组进入Tol2-9*GRE-HSV123-EGFP-SV40pA载体。
2.根据权利要求 1所述的糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：在第二步中，采用显微注射的方法。
3.根据权利要求 1所述的全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：还包括提取F1代斑马鱼基因组，然后利用PCR方法对糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼进行鉴定；所述PCR方法的引物序列为：
正向引物：GTGTCCGATTCAGTCATGCC；
反向引物：CTGGTTGTTTCTGTCAGGCC。
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