KR20090022231A

KR20090022231A - 에스트로겐 반응성 리포터 유전자가 도입된 제브라피쉬 및이를 이용한 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20090022231A
Application number: KR1020070087391A
Authority: KR
Inventors: 박재학; 김동재
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-08-30
Filing date: 2007-08-30
Publication date: 2009-03-04
Also published as: KR100984643B1

Abstract

본 발명은 에스트로겐 반응성 리포터 유전자가 도입된 제브라피쉬 및 이를 이용한 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자(zebrafish brain aromatase gene)의 인접 프로모터와 상기 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 형광단백질 리포터 유전자가 연결된 유전자 컨스트럭트가 도입된 제브라피쉬 및 여기에 시험물질을 처리한 후 리포터 유전자의 발현정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 스크리닝 방법은 에스트로겐 활성을 가진 화합물을 결정하기 위한 새로운 생체 내(in vivo) 시스템으로서 상기 시스템은 생체 내 기능을 모사할 수 있으므로 생체 내에서 에스트로겐 활성을 가진 화합물을 신속하고 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

에스트로겐 화합물, 제브라피쉬, 뇌 아로마타제 유전자, 스크리닝

Description

에스트로겐 반응성 리포터 유전자가 도입된 제브라피쉬 및 이를 이용한 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법{Zebrafish introduced estrogen responsive reporter gene and method for screening estrogenic chemicals using the same}

내재성 에스트로겐(Endogenous estrogens)은 유선, 자궁, 질, 난소, 고환, 부고환 및 전립샘과 같은 여성 및 남성의 생식기관의 발달, 유지 및 기능에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 또한, 에스트로겐은 골 유지(bone maintenance), 중추신 경계 및 심혈관계에 영향을 준다(Couse and Korach, 1999 Endocr. Rev. 20, 358-41; Emmen and Korach, 2003 Gynecol. Endocrinol. 17(2), 169-17; Enmark et al., 1997 . J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 4258-426; Wang et al., 2003 Proc. Natl. Aca. Sci. U.S.A. 100, 703-70).

에스트로겐의 효과는 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)에 결합함으로써 매개된다(Evans, 1988 Science. 240, 889-895). 포유동물에는 2개의 에스트로겐 수용체가 있다(ER-α 및 ER-β) (Green et al., 1986 Nature. 320(6058), 134-13). 에스트로겐 수용체는 핵내 수용체(nuclear receptor) 수퍼패밀리 (superfamily)에 속하며(Mangelsdorf D. J. et al., 1995 Cell 83, 835), 배 발생기에는 다양한 생물학적 기능을 조절하고, 그 이후에는 생리학적인 조절 기능을 하는 것으로 알려져 있다. ER은 A/B, C, D, 및 E/F의 6개 영역(domain)으로 이루어져 있다. E 영역은 에스트로겐 결합 영역(estrogen binding domain), C 영역은 DNA 결합 영역(DNA binding domain)이며, 핵 이행 신호 영역(nuclear localization signal domain), 열 충격 단백질 90(heatshock protein 90, hsp 90) 결합 영역(binding domain), 이량체 형성 영역, 전사 활성화 인자(transcription activating factor, AF)의 기능을 하는 것으로써 N 말단 (A/B 영역)에 존재하는 AF-1 및 C 말단(E/F 영역)에 존재하는 AF-2로 특정되어 있다(Mangelsdorf, D. J. et al., Cell 83, 835, 1995; Tsai, M. J. et al., Annu. Rev.Biochem. 63, 451, 1994; Barettino, D. et al., EMBO J. 13, 3039, 1994; Durand, B. et al., EMBO J. 13, 5370,1994; Kumar, V. et al., Cell 51, 941, 1987). ER-중합체(dimer)를 사용하는 리간드는 에스트로겐 유도성 유전자의 5'조절 영역에 존재하는 에스트로겐 반응성 요소(estrogen responsive elements, EREs)에 대해 높은 친화력을 가지며, 상기 동형 중합체(homodimer) 복합체는 이러한 유전자들의 전사인자로서 기능한다 (McDonnell et al., 1995 Mol Endocrinol, 9(6), 659-6).

한편, 에스트로겐 모조물(mimics)로서 작용하는 다수의 천연 및 인공의 물질들은 정상적인 내분비 기능을 파괴함으로써 인간 및 야생 동물의 불임을 유발한다(Guillette et al., 1994 Environ Health Perspect. 102(8),680-68; Jobling et al., 1998 Biol Reprod. 67(2), 515-52). 이러한 에스트로겐 모사물을 내분비계장애물질(Endocrine Distruptors, EDs)이라 한다. 상기 내분비장애물질은 호르몬 수용체의 결합부위를 점령함으로써 생체내 호르몬과 동일하게 작용하거나, 호르몬과 경합(competition)함으로써 그 작용을 방해하고, 또는 호르몬의 합성이나 사이토크롬(cytochrome) P450등의 대사효소 작용을 방해하여 그 농도를 변화시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 이들 내분비계장애물질은 여러 호르몬 중 성호르몬에 의한 체내 조절계의 혼란을 야기하여 야생생물 및 인간의 생식에 악영향을 미쳐 심각한 문제로 대두되고 있다. 현재, 일상생활에서 접하는 여러 화학물질들이 EDs로 분류되고 있는데, 이들의 영향력이 기존의 일반 독성과 같이 개체의 죽음으로 끝나는 것이 아닌 종의 멸종이라는 점에서 인간뿐만 아니라 야생생물에 대하여도 그 심각성이 매우 크다.

따라서, 이러한 에스트로겐 모사물을 스크리닝하기 위해, 다양한 생체 내 및 시험관 내 분석방법이 연구되어 왔다. 그러나, 마우스 자궁비대 시험(mouse uterotrophic assay)과 같은 생체 내 분석방법은 비용 및 시간이 많이 소요되고 어려우며 큰 스케일의 스크리닝에 있어서는 적합하지 않다. 한편, 경쟁적 리간드 결합 시험, 세포 증식 시험, 리포터 유전자의 전사 활성을 이용한 유전적으로 변이된 효모 세포 및 인간 세포주를 이용한 시험과 같은 실험관 내 분석방법은 큰 스케일의 스크리닝에 있어서 보다 더 편리하다(Zacharewski, T.R, 1997 Sci. Techno. 31, 613-62). 그러나, 이러한 실험관 내 분석방법은 생체 내 대사적 전환 및 파괴를 간과할 수 있다. 따라서, 생체 내 기능을 모사할 수 있으며 큰-스케일의 스크리닝에 적합한 편리한 방법을 개발할 필요성이 있다.

이에 본 발명자들은 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법을 연구하던 중, 에스트로겐 반응성 리포터 유전자로서 제브라피쉬 뇌 아로마타제의 인접 프로모터 영역을 도입하여 외래 에스트로겐-반응성 모자이크 제브라피쉬를 개발하고, 이를 이용하여 에스트로겐 화합물을 신속하고 효과적으로 스크리닝할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자(zebrafish brain aromatase gene)의 인접 프로모터와 상기 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 리포터 유전자가 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 플라스미드가 도입된 제브라피쉬 수정란을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 플라스미드가 도입되고 에스트로겐 화합물에 특이적으로 리포터 유전자가 발현되는 형질전환 제브라피쉬를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 플라스미드가 도입된 제브라피쉬 수정란에 시험물질을 처리하고 리포터 유전자의 발현정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터와 상기 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 리포터 유전자가 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드가 도입된 제브라피쉬 수정란을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드가 도입되고 에스트로겐 화합물에 특이적으로 리포터 유전자가 발현되는 형질전환 제브라피쉬를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드가 도입된 제브라피쉬 수정란에 시험물질을 처리하고 리포터 유전자의 발현정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 에스트로겐 화합물에 대해 특이적으로 반응을 나타내는 리포터 유전자가 도입된 모자이크 리포터 제브라피쉬를 개발하였다는 데에 특징이 있다.

제브라피쉬는 척추동물의 초기 신경발생 조절을 이해하기 위한 중요한 모델을 제공하는데, 이는 비교적 간단한 신경계를 갖고 있으며 초기 발생에 관한 많은 유전자들이 동정되어 폭 넓게 연구되고 있기 때문이다. 이들은 특히 많은 배를 얻을 수 있고 비교적 빠른 시간에 성체로 성장하므로 유전학적 분석에 매우 적합하다. 더우기 이들 배의 신경계 골격이 확립되는 발생 하루동안에는 완전히 투명하게 보여 가시적인 관찰이 용이하다.

본 발명에서는 에스트로겐 화합물에 대해 특이적으로 반응을 나타내는 리포터 유전자로서 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터와 상기 프로모터 에 의해 그 발현이 조절되는 리포터 유전자가 연결된 유전자 컨스트럭트를 사용한다.

상기 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자는 사이토크롬 P450 아로마타제 B(AroB)를 코딩하며 경골 어류 내의 에스트로겐으로 안드로겐을 향족화(aromatize)하는 중요한 효소이다(Tchoudakova et al., 2001 J Steroid Biochem Mol Biol. 78(5), 427-43). AroB의 발현은 방사 교세포에 한정적이며(Menuet et al., 2003 J Comp Neurol. 21;462(2),180-19; Menuet et al., 2005 J Comp Neurol. 16;485(4),304-32) 이의 발현은 에스트로겐에 의해 상향조절되는 것으로 알려져 있다(Kazeto et al., 2004 Aquat Toxicol. 69(1), 25-3).

바람직하게는, 본 발명의 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 리포터 유전자는 전사를 조절하는 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 것으로 그 전사활성을 용이하게 측정할 수 있는 어떠한 리포터 유전자로도 제한 없이 사용할 수 있다. 리포터 유전자는 당 업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며, 그 예로는 이에 한정되지는 않으나, EGFP(enhanced green fluorescent protein), GFP (green fluorescence protein), RFP(red fluorescence protein) 등과 같은 형광단백질 유전자, 루시퍼라아제 유전자 및 β-갈락토시다제 유전자 등이 있다. 바람직하게는 상기 리포터 유전자로는 그 발현여부를 현미경으로 검경함으로써 용이하게 관찰할 수 있는 형광단백질 유전자를 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예 에서는 EGFP를 사용하였다.

상기 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터와 상기 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 리포터 유전자가 연결된 유전자 컨스트럭트는 적합한 플라스미드 내로 삽입될 수 있다.

따라서, 본 발명은 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터와 상기 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 리포터 유전자가 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함한 재조합 플라스미드를 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 재조합 플라스미드는 서열번호 1로 표시되는 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자(zebrafish brain aromatase gene)의 인접 프로모터에 EGFP 유전자가 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하며, 도 1에 개시된 개열지도를 갖는 재조합 플라스미드 pzfAroB-EGFP일 수 있다.

상기 재조합 플라스미드 pzfAroB-EGFP를 포함하는 E. coli(Escherichia coli pzfAroB-EGFP)를 2007년 7월 31일자로 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 11163BP로 기탁하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터 영역을 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 제브라피쉬 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하여 수득하고 이를 적합한 제한효소로 자른 후 EGFP를 포함한 벡터의 EGFP 상류에 삽입하여 재조합 플라스미드 pzfAroB-EGFP를 제작하였다(실시예 <1-2> 및 도 1 참조).

본 발명의 재조합 플라스미드는 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 제브라피쉬 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 미세주입법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation), PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법, 트랜스펙션 시약(예를 들어, GeneJamer 또는 GenePORTER)을 이용한 직접 전달법(direct delivery)(Sussman, R. Direct DNA delivery into zebrafish embryos employing tissue culture techniques. Genesis. 2001 Sep;31(1):1-5), 판트록픽 레트로바이러스 벡터(pantropic retroviral vector)를 이용한 피부를 통한 유전자 전달법(Paul, et all, Reporter gene expression in fish following cutaneous infection with pantropic retroviral vectors. Mar Biotechnol (NY). 2001 Jun;3(Supplement 1):S81-7) 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 재조합 플라스미드 pzfAroB-EGFP를 미세주입법에 의해 단일세포(single cell) 상태의 제브라피쉬의 수정란으로 도입하였다(실시예 <1-3> 참조).

따라서 본 발명은 본 발명의 재조합 플라스미드가 도입된 제브라피쉬 수정란 및 상기 수정란으로부터 성체로 자란 제브라피쉬를 제공한다. 상기 본 발명의 제브라피쉬는 에스트로겐 반응성 리포터 유전자가 도입되어 있으므로, 에스트로겐 화 합물에 대해 특이적인 반응을 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 플라스미드가 도입된 제브라피쉬 수정란에 에스트라디올(E2)을 처리하고 리포터 유전자(EGFP)의 발현 영역은 관찰한 결과(실시예 3 참조), 전뇌에 위치해 있는 후구(olfactory bulb), 종뇌(telencephalon), 시신경교차전야(preoptic area) 및 시상하부(mediobasal hypothalamus)에서 발현됨을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 한편, 수정후 48시간에 E2-처리된 야생형 제브라피쉬 수정란에서 AroB 전사물의 발현 패턴을 조사한 결과, AroB 발현은 종뇌, 시신경교차전야 및 시상하부에 위치해 있음이 보고 된 바 있다(Menuet et al., 2005 J Comp Neurol. 16;485(4),304-32). 상기 종래에 보고된 E2-유도된 AroB 전사물의 분포는 본 발명의 EGFP 발현과 일치하였다. 한편, E2-유도된 AroB 전사물이 36hpf에 검출되었으나 본 발명의 EGFP 발현은 3dpf에 검출할수 있었다.

나아가, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 모자이크 리포터 제브라피쉬 수정란에서 헵타클로로의 EGFP 유도능을 시험하였다(실시예 3 참조). 광범위하게 살충제로 사용되어 온 헵타클로로는 많은 국가에서 금지되어 있으나 물바닥에 사는 물고기(bottom fish) 및 도심 근처의 퇴적물에서 높은 수준으로 잔존해 있다(Brown et al., 1998 Mar. Pollut. Bull. 37, 67-8). 헵타클로로는 환경 내분비계 장애물질(environmental endocrine disruptor, EDC)로 알려져 있으며 갑각류에서 EDC로서 작용한다(Snyder and Mulder, 2001 Aquat Toxicol. 55(3-4), 177-19). 헵타클로로는 물과 퇴적물에 존재하기 때문에 직접적으로 독성을 나타내지는 않으나, 상기 살충제는 먹이사슬(food chain)을 통해 간접적으로 인간과 접촉할 수 있다. 한편, 상기 헵타클로로는 본 발명의 모자이크 리포터 제브라피쉬 배(embyro)의 뇌에서 EGFP 발현을 유도하였으며, E2 처리시와 유사하게 그 발현 영역은 시신경교차전야 및 시상하부였다(도 5 참조).

따라서, 본 발명의 모자이크 리포터 제브라피쉬는 내분비계 장애물질인 에스트로겐 화합물을 신속하고 효과적으로 스크리닝하는데 이용될 수 있다.

한편, 본 발명자들의 이전의 연구에서 언급한 바와 같이(Seoket al., 2006 J Biotechnol. 126(3), 406-1), 물고기 게놈에 미세주입된 형질전환 유전자의 융합은 물고기에서 다소 드물게 일어난다(Iyengar et al., 1996 Transgenic Res. 5(3), 147-16). 따라서, 미세주입된 개체의 대부분은 형질전환 유전자를 염색체외에 포함한다. 따라서, 딸 세포(daughter cells)에서 유전이 무작위적으로 일어나고 그 결과 유전적 모자이크를 유발한다. 본 발명의 모자이크 리포터 제브라피쉬 배(embryo)와 같은 일시적인 발현 시스템은 생식계열 형질전환체(germline transgenics)의 개발에 비해 초기단계의 유전자 발현 연구를 위한 효과적이고 신속한 방법이다(Adam et al., 2000 Exp Cell Res. 256(1), 282-29).

따라서, 본 발명은 재조합 플라스미드가 도입된 제브라피쉬 수정란에 시험물질을 처리하고 리포터 유전자의 발현정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 에스트로 겐 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법은 (a) 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터와 상기 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 리포터 유전자가 결합된 유전자 컨스트럭트가 도입된 제브라피쉬 수정란에 검출하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "에스트로겐 화합물"이란 에스트로겐 모조물(mimics)로서 작용하는 다수의 천연 및 인공의 물질들을 말한다. 바람직하게는 상기 에스트로겐 화합물은 정상적인 생체의 내분비계 기능을 파괴하는 활성을 갖는 물질을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 "시험물질(test agent)"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.

한편, 상기 (a) 단계에서 시험물질의 처리는 제브라피쉬 수정란의 수정 후 1~2시간 후에 처리하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 수정 후 2시간째의 단일 세포 상태의 제브라피쉬 수정란에 에스트로겐 화합물을 처리하였다(실시예 3 참조).

상기 (b) 단계에서 리포터 유전자의 발현정도는 당 업계에 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 리포터 유전자로서 형광단백질 유전자를 사용한 경우 현미경으로 검경함으로써 용이하게 그 발현을 측정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 NIBA2 필터가 장착된 올림푸스 IX70 현미경(Olympus IX70 microscope equipped with a NIBA2 filter, λex = 470490 nm; λem = 510550 nm)을 이용하여 형광단백질의 발현을 관찰하였다(실시예 3 참조).

상기 (b) 단계에서 리포터 유전자는 에스트로겐 화합물에 특이적으로 전뇌에 위치해 있는 후구(olfactory bulb), 종뇌(telencephalon), 시신경교차전야(preoptic area) 및 시상하부(mediobasal hypothalamus)로 이루어진 영역 중 어느 하나에서 발현된다. 따라서, 리포터 유전자의 발현이 상기 영역에서 검출되는 경우 시험물질은 에스트로겐 화합물로 판정할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 에스트로겐 반응성 리포터 유전자가 도입된 제브라피쉬를 이용한 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법은 에스트로겐 활성을 가진 화합물을 결정하기 위한 새로운 생체 내(in vivo) 시스템으로서 상기 시스템 은 생체 내 기능을 모사할 수 있으므로 생체 내에서 에스트로겐 활성을 가진 화합물을 신속하고 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

본 발명에 따른 모자이크 리포터 제브라피쉬의 제조

<1-1> 제브라피쉬 사육

성어 제브라피쉬는 이전에 공지된 방법에 따라 28.5℃에서 14시간:10시간(낮:밤) 주기로 사육하였다(Westerfileld, 1998, The Zebrafish Book University of Oregon Press, Euegene, OR. USA). 성숙된 제브라피쉬의 사료로는 프레쉬워터 아쿠아리움 플레이크푸드(Freshwater Aquarium Flakefood, TetraWerke, Melle, Germany) 및 브라인 쉬림프(brine shrimp, San Francisco Bay Brand, Inc., Newark, CA, USA)를 이용하였다. 관리와 실험처치는 서울대학교 실험동물자원관리원의 가이드라인에 의거하여 실시하였다(승인번호 SNU-050418-2).

<1-2> 플라스미드 제작

제브라피쉬의 뇌 아로마타제(brain aromatase)에 의해 조절되는 리포터 플라스미드(pzfAroB-EGFP)는 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터 영역(proximal promoter region)과 EGFP(형광단백질) 리포터 유전자를 결합함으로써 제작하였다(도 1).

즉, 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터 영역(서열번호 1)을 다음의 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 제브라피쉬 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하였다.

zfAroB-F; 정방향 프라이머(서열번호 2)

5'-CCGCTCGAGGTTCAAAGCCCTCCCAAATA-3'

zfAroB-R; 역방향 프라이머(서열번호 3).

5'-CGGGATCCCCGTCCTCAGGCTTCCATCAT-3'

상기 프라이머 서열 중 밑줄 그은 부분은 각각 제한효소 사이트(site)를 나타낸다(Kazeto et al., 2001 Biochem Biophys Res Commun. 288(3), 503-50; Menuet et al., 2005 J Comp Neurol. 16;485(4),304-32). 이때, 유전자 증폭 조건은 다음과 같다: 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 45초간 신장을 35 사이클(cycle)로 수행하고, 최종적으로 72℃에서 7분간 신장하였다. 수득된 PCR 산물을 XhoI, BamHI 제한효소로 자른 후 T2KXIG 벡 터(Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Japan의 Koichi Kawakami 박사로부터 제공받음) EGFP 유전자의 앞쪽 XhoI/BamHI 사이트에 삽입하였다(Kawakami et al., 2004 Dev Cell. 7(1), 133-14).

상기와 같은 방법으로 제작된 재조합 플라스미드 pzfAroB-EGFP를 포함한 E. coli를 2007년 7월 31일자로 한국생명공학원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 11163BP로 기탁하였다.

<1-3> 재조합 플라스미드 pzfAroB-EGFP 및 트랜스포사제 mRNA의 미세주입

단일 세포(Single-cell) 상태의 제브라피쉬 수정란에 상기 실시예 <1-2>에서 제작한 재조합 플라스미드 pzfAroB-EGFP 및 트랜스포사제 mRNA(transposase mRNA)를 미세주입하였다. 상기 트랜스포사제 mRNA는 트랜스포사제 cDNA(Kawakami et al., 2004 Dev Cell. 7(1), 133-14)와 mMESSAGE mMACHINE SP6 키트(Ambion Inc., Austin, TX, USA)를 이용하여 시험관 내(in vitro)에서 합성하였다. 제브라피쉬의 수정란을 아가로스 램프(agarose ramps)에 옮겨 DNA/RNA 용액(25ng/L pzfAroB-EGFP의 환형 DNA와 25ng/L 트랜스포사제 mRNA 포함)을 미세주입기(micromanipulator, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, USA)에 장착된 마이크로피펫(micropipette)으로 미세주입하였다.

<실시예 2>

야생형 제브라피쉬 수정란에서 에스트로겐에 의해 유도된 AroB mRNA 발현수 준

수정 2시간 후에 페트리디쉬로 옮겨진 야생형 제브라피쉬 수정란을 에스트라디올(E2, 10^-6M) 또는 에탄올(0.1%)로 5일동안 처리하였다. 트리졸 시약(Trizol Reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 총 RNA를 수정란(n=20)으로부터 추출하였다. 상기 총 RNA를 대상으로 맥심 RT 프리믹스 키트(Maxime RT PreMix Kit, Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 반정량 RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)를 수행하였다. 총 RNA 1g을 RT 반응 혼합액과 혼합하여 45℃에서 60분, 95℃에서 5분간 반응시켰다. 상기 RT 반응액 8L를 이용하여 AroB 유전자 및 내부 대조군 유전자인 β-액틴에 특이적인 다음의 프라이머로 PCR 증폭을 수행하였다(Kishida et al., 2001 Endocrinology 142(2),740-75).

AroB-F; 정방향 프라이머(서열번호 4)

5'-GCAAATCGTACAGGAGATACAG-3'

AroB-R; 역방향 프라이머(서열번호 5)

5'-CGTCCAATGTTCAGGATTAG-3',

β-actin-F; 정방향 프라이머(서열번호 6)

5'-GGTATGGGACAGAAAGACAG-3'

β-actin-R; 역방향 프라이머(서열번호 7)

5'-AGAGTCCATCACGATACCAG-3'

PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분간 변성시킨 후 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 신장을 30 사이클 수행하고, 최종적으로 72℃에서 10분간 신장시켰다. 수득된 PCR 산물 9㎕를 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 포함하는 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 UV 투과조명기(transilluminator) 하에서 관찰하였다.

실험군과 대조군 사이의 유의적인 차이는 던칸의 다중 범위 검정(Duncan's Multiple Range Test)에 의해 결정하였다(SAS ver. 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). P<0.05인 경우에 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과, E2 처리는 AroB 전사를 유도하는 것으로 나타났다. E2-처리된 수정란에서 AroB mRNA 발현(0.07±0.123)은 에탄올-처리된 수정란(2.06±0.17)에서 관찰된 수준에 비해 약 29배 높게 나타났다(도 2).

<실시예 3>

본 발명의 모자이크 리포터 제브라피쉬 수정란에서 에스트로겐에 의한 리포터 유전자의 발현

에스트로겐 화합물에 대한 본 발명의 모자이크 리포터 제브라피쉬 수정란의 반응을 확인하였다. 상기 실시예 <1-3>에서 수정 2시간 후 본 발명의 플라스미드가 미세주입된 제브라피쉬 수정란을 페트리디쉬로 옮긴 다음 에스트라디올(E2, 10^-6 M), 헵타클로로(heptachlor, 10^-6 M), 또는 에탄올(0.1%)을 처리하고 5일 동안 반응시켰다. 각각의 반응시 반응액의 절반을 매일 새로운 반응액으로 교체하였다. 반응이 완료된 후 NIBA2 필터가 장착된 올림푸스 IX70 현미경(Olympus IX70 microscope equipped with a NIBA2 filter, λex = 470490 nm; λem = 510550 nm)을 이용하여 형광단백질의 발현을 관찰하였다.

실험 결과, 에탄올 처리된 수정란에서는 EGFP 발현이 관찰되지 않았으나, E2-처리된 배아는 뇌에서 EGFP의 발현이 나타났다. EGFP 발현은 E2 처리 후 3일에 검출되었고, 처리 5일 후까지 증가하였다. 상기 EGFP 발현은 전뇌에 위치해 있는 후구(olfactory bulb), 종뇌(telencephalon), 시신경교차전야(preoptic area) 및 시상하부(mediobasal hypothalamus)에서 관찰되었다(도 3). E2 처리 5일 후 EGFP 발현 수준은 처리 3일 후에 비해 높게 나타났다(도 4).

본 발명의 모자이크 제브라피쉬에서 E2에 대한 반응에 있어서 리포터 유전자의 발현을 확인한 후, 본 발명자들은 헵타클로로의 에스트로겐 효과를 시험하였다. 헵타클로로(10^-6M)은 모자이크 리포터 제브라피쉬 배아의 뇌에서 EGFP 발현을 유도하였다. E2 처리시와 유사하게, EGFP 발현은 시신경교차전야 및 시상하부에서 발견되었다(도 5).

도 1은 제브라피쉬의 뇌 아로마타제(brain aromatase)에 의해 조절되는 리포터 플라스미드(pzfAroB-EGFP)의 개열지도이다.

도 2는 E2-처리된 야생형 제브라피쉬의 수정란에서 AroB mRNA 발현정도를 RT-PCR에 의해 측정한 결과이다.

결과는 평균±표준편차로 나타냄(n=3).

***: p<0.05에서 에탄올 처리된 수정란과 유의적인 차이가 있음.

도 3은 본 발명의 pzfAroB-EGFP가 미세주입된 수정란에서 E2 처리에 따른 EGFP의 발현을 현미경으로 관찰한 결과이다.

A, B: 에탄올 처리

C-H: E2 처리

A, C, E, G: 광학 현미경 하에서 관찰한 것임

B, D, F, H: 형광 현미경 하에서 관찰한 것임

ob: 후구(olfactory bulb), tel: 종뇌(telencephalon)

poa: 시신경교차전야(preoptic area)

mbh: 시상하부(mediobasal hypothalamus)

도 4는 본 발명의 pzfAroB-EGFP가 미세주입된 수정란에 E2를 3일(A) 또는 5일(B)가 처리한 후 EFGP의 발현 수준을 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.

도 5는 본 발명의 pzfAroB-EFGP가 미세주입된 수정란에서 헵타클로로의 처리 에 따른 EGFP의 발현을 현미경으로 관찰한 결과이다.

poa: 시신경교차전야(preoptic area)

mbh: 시상하부(mediobasal hypothalamus)

A, C, E: 광학 현미경 하에서 관찰한 것임.

B, D, F: 형광 현미경 하에서 관찰한 것임.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Zebrafish introduced estrogen responsive reporter gene and method for screening estrogenic chemicals using the same <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 520 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> proximal promoter region of the zebrafish brain aromatase gene <400> 1 gttcaaagcc ctcccaaata aacacataat aaaaacggat tacatgtacc ccaccgattt 60 gtaggaagcc aaacgagcgc tcgcatttct caggcaacat tgtttccatc cttcacatct 120 ttggtcaatg aaagctcatt cactggtttg gttctgggtc agtctgacct gccttcatta 180 aaagctcttc agagaatgaa agactggatc tggaaccaag acagaggtca acaaagccct 240 gaaaataaca agagtggagg aaaagatgtg tgtttcgcat taaagagcta acagtattgc 300 acacggcccg tttttatgtg ggttttcttc agccttctct actttggtcc atcattgttt 360 cattgttcag ctctggacgt gtctgctgga ctgctttgag ctttcaaaag cactttacaa 420 gaaaaatcct tggcaactgg ggattttagc agggggagag tatatatttg ggctgaaaca 480 cccgctgatg aagttgggga tgatggaagc ctgaggacgg 520 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zfAroB-F forward primer <400> 2 ccgctcgagg ttcaaagccc tcccaaata 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zfAroB-R reverse primer <400> 3 cgggatcccc gtcctcaggc ttccatcat 29 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AroB-F forward primer <400> 4 gcaaatcgta caggagatac ag 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AroB-R reverse primer <400> 5 cgtccaatgt tcaggattag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin-F forward primer <400> 6 ggtatgggac agaaagacag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin-R reverse primer <400> 7 agagtccatc acgataccag 20

Claims

제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자(zebrafish brain aromatase gene)의 인접 프로모터와 상기 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 리포터 유전자가 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 플라스미드.
제1항에 있어서, 상기 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터가 서열번호 1로 표시되는 것임을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 EGFP(enhanced green fluorescent protein), GFP (green fluorescence protein), RFP (red fluorescence protein), 루시퍼라아제 유전자 및 β-갈락토시다제 유전자로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
제1항에 있어서, 도 1에 개시된 개열지도를 갖는 재조합 플라스미드 pzfAroB-EGFP.
제4항의 재조합 플라스미드 pzfAroB-EGFP를 포함하는 E. coli(기탁번호 KCTC BP11163BP).
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 플라스미드가 도입된 제브라피쉬의 수정란.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 플라스미드가 도입되어 에스트로겐 화합물에 대해 특이적으로 형광단백질 리포터 유전자를 발현하는 형질전환된 제브라피쉬.
(a) 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자(zebrafish brain aromatase gene)의 인접 프로모터와 상기 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 리포터 유전자가 결합된 유전자 컨스트럭트가 도입된 제브라피쉬 수정란에 검출하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는 에스트로겐 반응성 리포터 유전자가 도입된 제브라피쉬를 이용한 에스트로겐 화 합물의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 제브라피쉬 뇌 아로마타제 유전자의 인접 프로모터 영역은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것임을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 리포터 유전자가 EGFP(enhanced green fluorescent protein), GFP (green fluorescence protein), RFP (red fluorescence protein), 루시퍼라아제 유전자 및 β-갈락토시다제 유전자로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 시험물질의 처리는 제브라피쉬 수정란의 수정 후 1~2시간 후에 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 리포터 유전자의 발현정도는 현미경으로 검경함으로써 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 리포터 유전자가 전뇌에 위치해 있는 후구(olfactory bulb), 종뇌(telencephalon), 시신경교차전야(preoptic area) 및 시상하부(mediobasal hypothalamus)로 이루어진 영역 중 어느 하나에서 발현되는 경우 에스트로겐 화합물로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.