TWI444617B - 一種質體用於檢測環境壓力之用途與其應用方法 - Google Patents

Description

一種質體用於檢測環境壓力之用途與其應用方法

本發明係關於一種檢測環境壓力質體之用途，其中該質體包含：(1)上游開放轉譯框架(upstream open reading frame)序列；及(2)螢光基因片段。

本發明亦關於表現本發明質體的基因轉殖魚之應用，故本發明另關於藥物篩選與檢測水質汙染之方法。

上游開放轉譯框架(upstream open reading frame,uORF)為位於5'端不轉譯區(5' untranslated region,UTR)訊息核醣核酸(mRNA)，其影響許多真核基因的轉譯效率。uORF在人類與老鼠的基因轉譯中約有接近一半的量，且普遍存在各物種中。內含uORF之基因轉譯(transcript)其功能涉及生長、分化與增生，且uORF調節的轉譯控制作用在基因之表現上，其扮演重要的角色，然目前尚未發展出可用以研究其分子機制的動物模式(knock-in animal model)。

轉譯因子CCAAT/增強子結合蛋白之同源蛋白質(enhancer-binding protein homologous protein)(CHOP)為C/EBP家族的一員，且在增生、分化與內質網(ER)壓力上有其重要的角色，破壞ER平衡之刺激會影響蛋白質之折疊，及造成未折疊與錯誤折疊的蛋白質累積，最後產生ER壓力。chop 基因在未受壓力下，僅微量表現，並存在於細胞質內，然過大的壓力會誘發chop 基因的表現，並累積在細胞核內而抑制Bcl-2 基因的轉錄，最後導致細胞的凋亡，因此，chop 基因之表現為高度調控的，且在不同壓力刺激下，可被快速誘發而對刺激做反應；chop 基因之誘發表現涉及轉錄與後轉錄的機制，且位於chop mRNA 5' UTR之uORF會抑制轉譯之效率，然目前並無可利用之動物模式，以做進一步之研究，難以更了解ER相關壓力下，uORF ^chop 調節的轉譯控制作用的分子調控機制。

近年來隨著現代化的不斷演進，工業的持續發展，環境汙染日亦嚴重，許多工廠排放廢污水至河川中，或是其他農業與生活廢氣物等五花八門的污染源造成水質的改變，破壞河川與周邊的生態，進而最終亦影響人類的健康與生活品質，故水質的檢測相當重要，目前水質檢測多使用化學儀器分析來進行，然儀器昂貴，開發中國家不易負擔，倘有其他檢測方式，能提供更即時、迅速與低成本的檢測，可為另一種選擇，對於水質之監控亦有其重要的貢獻。

隨著環境污染的增加，意味著人類生活中之刺激物增加，癌症等後天甚至先天之疾病的發生機率隨之增加，對於新藥物之需求亦與日俱增，藥物之研發與摘選極為重要，動物模式可為一有效的利器，然目前發展出之動物模式並不多，用於藥物篩選之動物模式更是微乎其微，美國專利US 2005155087雖述及利用斑馬魚做為藥物摘選工具，然此案僅透過觀察其發育與基因型變化做判斷，僅能定性難以定量，倘能發展出其他動物模式，將對藥物之摘選與研究有極大的助益。

本發明係提供一種檢測環境壓力質體之用途，其中該質體包含：(1)上游開放轉譯框架(upstream open reading frame)序列，該序列如SEQ ID NO:1；及(2)螢光基因片段，且其中該螢光基因連接於SEQ ID NO:1序列之3’端。本發明亦提供一種受壓力刺激會表現螢光蛋白質之基因轉殖魚，其表現一質體，其中該質體包含：(1)上游開放轉譯框架(upstream open reading frame)序列，該序列如SEQ ID NO:1；及(2)螢光基因片段；本發明所使用之質體架構如圖一(A)所示，其亦包含適用於哺乳類中之啟動子。本發明之基因轉殖魚受到環境壓力刺激時，魚體會表現螢光蛋白質，而在一般正常環境下，魚體內螢光蛋白質不會表現或僅微弱表現。

本發明中之基因轉殖魚可為易於實驗觀察、處理與培養之魚類，該魚可為斑馬魚、青鱂魚、鱂魚、慈鯛、孔雀魚或鬥魚。

本發明中之螢光基因可為綠色、紅色、籃色或黃色之螢光基因。在一實施例中，此螢光基因為綠色之螢光基因。在另一實施例中，此螢光基因為紅色之螢光基因。

本發明亦關於轉殖螢光魚之應用，因本發明之轉殖螢光魚具有受到環境壓力刺激後出現螢光蛋白質的特性，故利用此特性建立一動物模式之平台，故本發明亦提供一種檢測水質汙染之方法與一種藥物篩選之方法；一種檢測水質汙染之方法，包括：(1)將本發明中之基因轉殖魚置入待測之水體，其中該魚表現一包含SEQ ID NO:1與螢光基因片段之質體，其中螢光基因片段係連接於SEQ ID NO:1序列之3’端；及(2)觀察魚體之螢光蛋白質表現的變化。其中，該水質汙染為水質受外在影響造成水質改變，可為物理性或化學性之變化，如：重金屬汙染、農藥汙染或溫度變化。本發明中之基因轉殖魚在正常水質環境下，魚體內螢光蛋白質不會表現或僅微弱表現，當水質受污染而改變時，刺激魚表現螢光蛋白質，且其表現之程度與水體之汙染程度成正比，當污染越嚴重，螢光蛋白質表現越多；另，螢光蛋白質表現之部位與型態亦與污染之種類有關，由其表現之部位可知不同污染造成之影響為何。

本發明之基因轉殖魚或胚胎提供一種動物模式平台，其可用於uORF^CHOP 調控機制之相關研究，故本發明亦提供一種藥物篩選之方法，其包括：(1)將待測藥物施予於本發明之基因轉殖魚之胚胎，其中該魚胚胎表現一包含SEQ ID NO:1與螢光基因片段之質體，其中螢光基因片段係連接於SEQ ID NO:1序列之3’端；與(2)觀察魚胚胎之螢光蛋白表現之變化。其中，該藥物為造成內質網壓力之藥物，造成細胞中鈣離子從內質網釋放出來，進而會造成細胞之死亡。藥物施予方式可為直接或間接施予，直接施予可為將藥物以注射或飼料餵食方式施予，而間接施予可為將藥物加入水體或培養液中，將魚胚胎培養於內；施予方式可依藥物型態與作用不同而調整，施予時間之長短亦然。

因一般正常環境下，魚胚胎內不會有螢光蛋白質之表現或僅呈現微弱之表現，而當魚胚胎受藥物之刺激後，胚胎才明顯表現螢光蛋白質，且其表現之程度與藥物毒性程度成正比，當藥物毒性越強，螢光蛋白質表現越多；同時，螢光蛋白質表現之部位與型態亦與藥物之種類有關，由其表現部位之差異可知不同藥物對不同部位之影響，可推知藥物之作用。

本發明之藥物篩選方法可應用於偵測藥物之副作用，在正常狀態下本發明之轉殖營光魚胚胎不會表現營光蛋白質，然倘一藥物具有毒性或有副作用，即刺激魚胚胎表現營光蛋白質，故可知該藥是否對特定部位造成刺激與壓力。

下述的實施例僅作為本發明代表性的不同面向及特徵，而非用來限制本發明。

實驗材料與方法 斑馬魚之飼養與觀察

斑馬魚之飼養參考前人所述之方法(Westerfield,M.,1995,The Zebrafish Book,3rd ed. University of Oregon Press,Eugene,880 OR)，利用螢光顯微鏡〈MZ FLIII,Leica〉與共軛焦分光光譜顯微鏡(confocal spectral microscope,TCS SP5,Leica)觀察螢光蛋白之表現。

質體建構

本發明所使用之質體如圖一(A)所示，內含與螢光素酶(luciferase,Lu)結合之人類uORF ^chop 片段(huORF ^chop )之phuORF ^chop 與phuORF ^chop -Lu質體，則如先前所述(Chen,Y.J.,et. al,2010,Nucleic Acids Res .,38,764-777)。利用順向引子SEQ ID NO:2與反向引子SEQ ID NO:3經PCR取得斑馬魚之uORF ^chop 基因片段(zfuORF ^chop )，將此zfuORF ^chop 片段插入紅色螢光蛋白reporterDsRed (Clontech)之上游，接著，將質體phuORF ^chop 中之huORF ^chop 片段置換為zfuORF ^chop -DsRed片段，即取得pzfuORF ^chop -DsRed質體，抽取受精後72小時的斑馬魚胚胎之全部RNAs(利用Superscript III Reverse Transcriptase Kit,Invitrogen)，以產生cDNA資料庫，將斑馬魚Nrg 基因之編碼序列以RT-PCR方式選殖(clone)，在將此序列插入pGEMTeasy質體(Promega)，再將此次選殖之Nrg 編碼序列插入pCS2+載體，形成pCS2+zNrg。

顯微注射與基因轉殖魚之製備

微注射方法如Westerfield,M.(2000,The Zebrafish Book: AGuide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio ))所述，利用SP6 Message Machine Kit(Ambion)獲得訊息核醣核酸(mRNA)，將其稀釋至濃度為44毫微克/微升，並以酵素Pvu I處理phuORF ^chop -GFP與pzfuORF ^chop -dsRed質體使其為線型，再將此質體注射入一個細胞期(one-cell stage)之胚胎，注射之用量為2.3毫微升(於15毫微克/微升之DNA溶液中)。在斑馬魚生長至成魚後，將注射後的斑馬魚配對(pair-crossing)以辨認具轉殖基因之生殖品系傳遞的親代(Founders,G0)，以熱壓力處理其24 hpf之子代，並在48 hpf時做篩選，具GFP表現(F1 generation)之子代繼續培養至成魚，以建立轉殖品系。

斑馬魚腦之注射方法參照Gutzman,J.等人(2009,J. Vis. Exp .,pii,1218.doi,10.3791/1218.)之方法，差異為此發明使用之胚胎為72-hpf。在注射前，先將茴香黴素(anisomycin,4莫耳濃度)與雷帕黴素(rapamycin,500微莫耳濃度)與0.1%酚紅混合，注射約2.3毫微升之量至胚胎的腦中。

細胞培養、轉染與藥物處理

HEK293T與HeLa細胞株以前述方式(Chen,Y.J. et al.,2010,Nucleic Acids Res.,38,764-777.)培養，培養24小時後，置換新的培養液2小時後，再接著加入DMSO,2.5微克/毫升衣霉素(tunicamycin,Sigma)、1微莫耳濃度毒胡蘿蔔素(thapsigargin,Sigma)、0.5微莫耳濃度茴香黴素(anisomycin)、600微莫耳濃度吲哚美洒辛(indomethacin)或10毫莫耳濃度柳酸鈉(sodium salicylate,Sigma)，並在處理0~4小時後，收集細胞。

原位雜交染色(Whole-mount in situ hybridization,WISH)、西方點墨法(Western blot analysis)與雙螢光素酶分析法(dual luciferase assay)

WISH之流程如前述(Dev. Biol. ,2009;336,232-245)，差異為chop 與類雙股RNA活化蛋白激酶之ER激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase,PERK )之編碼序列係利用RT-PCR分離，並以DIG標示以做為核糖探針(riboprobe)。

西方點墨法與雙螢光素酶分析法亦參照先前之方法(Nucleic Acids Res. ,2010;38,764-777)，差異在將每個胚胎之去卵黃樣品(deyolked samples)溶於2 μl微升之2倍十二基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)樣品緩衝液中，並於95℃下培養5分鐘。在離心機中，以全速離心1分鐘移除不溶粒子，再將樣品注入12% SDS電泳膠(每條7個胚胎)；抗體使用之比例分別為1:750(GFP,Santa Cruz與β-actin,abcam)與1:2000(DsRed,abcam)。

細胞死亡分析

在藥物處理前，將phuORF ^chop -GFP或phuORF ^chop -BikDD之穩定轉殖珠(培養於含10% FBS與100微克/毫升的青黴素/鏈黴素之DMEM培養液中)接種於10公分培養皿，接著加入內含600微莫耳濃度吲哚美洒辛(indomethacin)之新鮮培養液，0~4小時後，收集細胞以進行細胞死亡分析，將細胞懸浮於磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中，加入10微升之台酚藍(trypan blue)至90微升的細胞懸浮液中。利用血球計決定細胞死亡，存活率(%)為活細胞數量除以總細胞之數量，平均值為三次獨立之實驗。

壓力處理

在熱與冷逆境處理實驗中，將30個72-hpf去卵膜(dechorionated)的胚胎加入2毫升離心管中，再分別處理40℃ 1小時及5℃ 12小時。收集處理過的胚胎至3公分之培養皿中，在28.5℃下培養至96 hpf。30個去卵膜(dechorionated)的胚胎在37~40℃下熱逆境處理1小時或40℃下處理20至60分鐘，以觀察胚胎對壓力強度的反應。將成魚置於盛裝水並提供空氣之500毫升水槽中，並在40℃之熱逆境處理下培養2小時，接著移置28.5℃培養24小時。

抑制劑之使用濃度取決於藥物對胚胎在28.5℃下處理24小時的毒性；將毒胡蘿蔔素(thapsigargin,Sigma)、17AAG(Sigma)、AG1478(Calbiochem)與LY294002(Calbiochem)溶於二甲亞碸(DMSO)中，煮沸胚胎培養液以置備脫氧水(Deoxygenated water)，所有的藥物皆以胚胎培養液稀釋至所需濃度；藥物之處理分別為1微莫耳濃度的毒胡蘿蔔素(thapsigargin)處理胚胎24小時、10微莫耳濃度的17AAG處理胚胎24小時、30微莫耳濃度的LY294002處理5小時、4毫莫耳濃度CoCl₂ 處理24小時、1.5%酒精處理24小時、5微莫耳濃度的AG1478處理16小時，以及脫氧水處理4小時，控制組之胚胎則以等量之DMSO溶液處理，當此等72-hpf的胚胎處理藥物時，其皆培養於28.5℃，且藥物處理於3公分培養皿中進行，其內含30個胚胎與3毫升胚胎培養液；藥物處理後，以胚胎培養液沖洗2次將藥物移除；接著收集胚胎至新的3公分培養皿中，培養至胚胎發育到96-hpf期。

胚胎細胞分離與流式細胞儀(Fluorescence activated cell sort,FACS)分析

收集400個huORFZ品系的120 hpf胚胎至2 ml的離心管中，並使胚胎懸浮於1.2毫升欲熱28℃之胰蛋白酶溶液(PBS,pH 8;0.25%胰蛋白酶；1毫莫耳濃度EDTA)中，在28℃下培養24分鐘，且於每12分鐘時以1毫升吸量管(pipette tip)打散此混合物50次，直至全部細胞完全分離，再加入0.2毫升終止溶液(30% FBS;6毫莫耳濃度CaCl₂ ;PBS)，並再將此細胞混合物來回打散50次，並於28℃下反應5分鐘以終止胰蛋白酶活性。將細胞以3,000轉/分鐘(rpm)之轉速離心5分鐘，再加入1毫升分類溶液(含5%胎牛血清、50單位/毫升的青黴素/、0.05毫克/毫升的鏈黴素之磷酸鹽緩衝溶液)。

在室溫無菌環境下，利用細胞分類系統(FACSAriacell sorting system,BD Bioscience,CA)進行FACS分析，並使用標準流程，且當細胞存活率大於95%時，分離5×10⁵ 個有GFP反應之細胞，並抽取1300 pg RNA以用於微陣列分析(microarray analysis)。

微陣列分析(Microarray analysis)

使用斑馬魚寡核苷酸試劑組(Oligo Microarray Kit,Agilent,Taiwan)進行分析，其中內含95,000個探針涵蓋45,000個基因，獲得之微陣列數據以程式(Agilent Certified Service Provider Program,Welgene Biotech Co.,Agilent,Taiwan)進行分析。

反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)

將等數量之有GFP反應與無GFP反應之細胞離心，使其懸浮於200毫升抽取試劑中(Trizol Reagent,Invitrogen)中，再儲存於-80℃。進行定量PCR時，利用1微克的RNA產生第一股cDNA，調整cDNA濃度為200毫微克/微升，定量PCR流程採用廠商建議流程(7900HT Fast Real-Time PCR System,Applied Biosystems,CA)。透過與完整胚胎抽取RNA的標準曲線比較，以決定基因表現量，因不論在有或無GFP之細胞中，ef1a mRNA之量皆相同，故將有或無GFP表現之細胞的數值皆與ef1a 相比以將數值標準化，獲得相對之表現量；計算三次重複之測量結果以得標準差。

染色體去氧核醣核酸(Genomic DNA)抽取與南方點墨法分析

染色體去氧核醣核酸抽取與南方點墨法之分析方法採用Chou等人(2001,Transgenic Res. ,10,303-315)之方法，50個72-hpf斑馬魚胚胎在55℃下，以蛋白酶K(proteinase K,200微克/毫升)溶液(內含0.5% SDS與25毫莫耳濃度EDTA)處理16小時，從野生型或F3 huORFZ胚胎抽取之染色體DNA以Hin dIII或Xba I處理，並移至尼龍膜上(Amersham,U.S.A)，使用EGFP特定之DIG標記探針(500 bps)做雜合反應，其由一順向引子(ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA)與反向引子(AGAAGATGGTGCGCTCCTGG)經PCR製備；在與DIG標記的探針經雜合反應後，再經硝基藍四氮唑(nitroblue tetrazolium)與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(Roche)反應，2小時後可見陽性訊號。

實驗結果 (一)　藥物篩選 細胞在誘導ER壓力的藥物處理下，huORF ^chop 抑制基因的轉譯

為了解在ER壓力環境下，細胞中huORF ^chop 對基因轉譯調控的反應，將HEK293T細胞轉染phuORF ^chop -GFP質體，再接著處理誘導ER壓力藥物衣霉素(tunicamycin)與毒胡蘿蔔素(thapsigargin)，其透過從細胞的ER釋放鈣離子。在正常狀態下，難以偵測到GFP之表現，然若細胞以衣霉素(tunicamycin)或毒胡蘿蔔素(thapsigargin)處理後，GFP之呈現將明顯增加(如圖一(A))；同樣地，相對於未處理的細胞，在經藥物處理的細胞中，其內生性的CHOP蛋白亦顯著的增加(如圖一(A))；這些結果顯示細胞中huORF ^chop 對基因轉譯調控的抑制作用被此等誘導ER壓力之藥物所阻斷。

接著建構另一表現質體(phuORF ^chop -BikDD)，其可轉譯BikDD的組成性活性型(constitutive active form)，且由huORF ^chop 所驅動；從圖一(B)結果顯示BikDD蛋白之表現僅在細胞處理不同的誘導ER壓力之藥物時，BikDD蛋白才被偵測到，意即huORF ^chop 失去其抑制能力，並由下游mRNA之編碼使功能性之BikDD轉譯。在另一實例中，細胞以phuORF ^chop -BikDD轉染，並觀察吲哚美洒辛(indomethacin)處理4小時後之細胞凋亡情形，結果發現細胞死亡之量與BikDD表現量成正比。在此兩實驗中，細胞凋亡的結果皆顯示轉譯之BikDD為有功能性的，細胞凋亡由BikDD之表現所調控；此證據顯示在誘導ER壓力藥物之處理下，將會刺激在huORF ^chop 序列後之下游基因轉譯成有功能之蛋白質。

細胞中之人類與斑馬魚之uORF ^chop 序列(huORF ^chop 與zfuORF ^chop )抑制下游報導基因之轉譯

將線型的pGFP與phuORF ^chop -GFP質體微注射入斑馬魚胚胎內，微注射phuORF ^chop -GFP質體的胚胎僅觀察到微弱的GFP訊號(圖二(B))，而微注射pGFP質體的控制組胚胎，則可偵測到GFP的訊號(圖二(A))。將huORF ^chop 與GFP報導基因分別由zfuORF ^chop 與DsRed取代，以建構pzfuORF ^chop -DsRed質體，結果顯示zfuORF ^chop 序列亦抑制DsRed報導基因之表現(圖二(D))，且進一步進行RT-PCT與西方點墨法分析，以確認在含uORF ^chop 序列之質體中的報導基因經轉錄(圖二(I))，但未經轉譯(圖二(J))；為移除螢光蛋白表現下降為在轉錄程度的控制之可能性，微注射有或無uORF ^chop 序列之質體mRNA，在兩實驗中，雖然控制組中之gfp 與DsRed 之mRNAs皆分佈平均(圖二(E)與(G))，但在注射內含uORF ^chop 序列的mRNA之胚胎中，並未能偵測到GFP蛋白(圖二(F)與(H))；RT-PCR顯示huORF ^chop -GFP -mRNA與DsRed -mRNA皆存在於胚胎中，但西方點墨法則僅顯示DsRed蛋白質的存在(圖二(K))，可推知下游報導音機的轉譯被uORF ^chop 序列所抑制。綜上，uORF ^chop 可抑制下游基因之轉譯，且不論其序列來源為人類或斑馬魚。

具有huORF ^chop 序列之基因轉殖品系huORFZ之發育

將由Pvu I處理過之線型phuORF ^chop -GFP微注射入斑馬於胚胎內，以產生具有huORF ^chop -GFP之基因轉殖品系，篩選可能的親代(founder)，以決定24-hpf的胚胎熱逆境處理48小時後，是否即呈現GFP的訊號，從篩選出的375個G0親代(founder)取得7個F1(founder)轉殖基因品系；此後，分別產生7個遺傳穩定的F2異型合子品系(heterozygotic strain)。從這7個轉殖基因品系產生的所有胚胎，皆具有共通的特徵為其皆不具有GFP訊號，除非經過熱逆境壓力之處理。依據GFP訊號之強度越強、表現GFP之細胞數量越高，及胚胎中GFP表現之孟德爾遺傳百分比對熱逆境壓力之反應，選擇一轉殖基因品系以做為進一步的實驗研究，且稱此品系為huORFZ品系。

在F3中，外源DNA片段的傳遞百分比例在下一代的轉殖品系huORFZ中為48.7%(在78個胚胎中，有38個胚胎具有GFP表現)，此與孟德爾遺傳一致，顯示轉殖基因插入至huORFZ基因體的單一位置；抽取huORFZ胚胎中的基因體DNAs，並以Hin dIII或Xba I切割，以EGFP特定的DIG標示探針進行南方點墨法分析，當基因體DNAs以Hin dIII切割時，在膠上可看到兩條主要的6.1 kb與9.2 kb帶，而當以Xba I切割時，則看到兩條主要的6.1 kb與4.8 kb帶，顯示形成轉殖基因DNA片段之頭對尾、尾對尾與頭對頭concatemer。依對應已知濃度(10毫微克)的PvuI -cut phuORF ^chop -GFP訊號強度，可計算出此質體每單套基因體約200複製。

ER與ER相關之壓力可調控具有huORF ^chop 序列的轉殖基因品系huORFZ之轉譯抑制作用

在huORFZ胚胎中，huORF ^chop -gfp mRNA為廣泛性的轉錄從10至96 hpf(圖三(A))，然而，在正常環境下，GFP訊號在這些一個細胞期至96 hpf的胚胎中並不明顯(圖三(B))，只有當huORFZ胚胎受到ER相關壓力之處理時，才會出現明顯之GFP訊號(圖三(B))；當huORFZ胚胎在72 hpf時，以熱逆境處理，在96 hpf時期，可在腦、脊髓與頭部間質中觀察到GFP的訊號((圖三(B))，但在huORFZ控制組與熱逆境處理之胚胎中，其中的huORF ^chop -gfp mRNA之分布型態與表現量並未因處理而改變(圖三(C))；其在熱逆境處理8小時後，首先偵測到頭部區域之GFP訊號(圖三(D))，再者，在huORFZ胚胎中，GFP訊號之反應性似乎取決於其所受到的壓力強度。觀察壓力強度與時序，以分析被uORF ^chop 調節的轉譯抑制作用調控之GFP強度，結果發現在37℃至40℃之熱逆境處理1小時後，GFP訊號逐漸的增強(圖三(E))；此外，huORFZ胚胎在40℃之處理下，同時延長培養時間時，亦出現更強之誘發的GFP強度(圖三(F))；由結果可知，下游基因的轉譯程度取決於壓力的強度；再者，在huORFZ的成魚中，huORF ^chop 調節的轉譯控制對熱逆境壓力有反應；因此，在huORFZ品系中，huORF ^chop 標記的下游報導基因之轉譯可被控制。

同時採用其他不同的ER與ER相關的壓力處理，當huORFZ胚胎暴露於冷逆境、毒胡蘿蔔素(thapsigargin)、酒精、脫氧水與CoCl₂ (hypoxia-mimetic agents)的處理後，檢測GFP之表現，當以不同壓力處理，結果顯示GFP表現之型態不一定相同(圖四)；例如，在胚胎冷逆境或酒精處理後，在腦與脊髓中可明顯偵測到GFP之表現；當胚胎以毒胡蘿蔔素(thapsigargin)處理後，在腦中可大量偵測到GFP，但在腦部間質中則僅能微弱地偵測到GFP之表現；當以脫氧水培養胚胎後，在腦與脊髓中可明顯偵測到GFP之表現；當以CoCl₂ 培養胚胎後，在在腦與脊髓中亦可明顯偵測到GFP之表現，但在尾部的肌肉組織中僅少量偵測到。在另外的實例中，可將藥物直接注射入huORFZ胚胎中，以誘導報導基因之表現；將茴香黴素(anisomycin)注射入huORFZ胚胎後，在腦與脊椎可大量偵測到GFP，但在腎臟原體內(kidney primordia)僅微弱偵測到(圖四(B))；將雷帕黴素(rapamycin)注射入胚胎後，僅在後腦區域與脊髓偵測到GFP之表現(圖四(B))；從以上結果可發現不同組織對不同壓力有其不同之反應，且若將72-hpf胚胎施予熱逆境處理，其神經組織會對此刺激有反應，而心臟、眼與肌肉細胞對相同刺激產生反應，則為當以96-hpf胚胎處理後才會產生；因此，不同組織在不同胚胎階段對壓力產生反應，總而言之，huORF ^chop 序列的轉譯抑制作用對壓力之反應為依階段與組織有其不同之反應。

在ER與ER相關壓力下使內生性 chop 基 因之轉錄與轉譯增加

為了解在ER與ER相關壓力下，huORFZ胚胎內之GFP訊號偵測是否與內生性chop 基因表現有關，將胚胎浸於內含ER壓力誘導藥物毒胡蘿蔔素(thapsigargin)或酒精之培養液，或是將胚胎以熱逆境處理，立即固定後，以chop 探針進行WISH分析，在以1 μM毒胡蘿蔔素(thapsigargin)(圖五(B))、40℃熱逆境(圖五(C))或1.5%酒精(圖五(D))處理之胚胎內，在頭部區域之chop 基因轉錄(chop transcripts)與控制組胚胎相比有明顯地增加，其中，圖五(B-D)chop 轉錄(transcripts)明顯表現於胚胎之眼睛與頭部區域，西方點墨法亦顯示當胚胎以毒胡蘿蔔素(thapsigargin)或熱逆境(圖五(I))處理後，CHOP蛋白質有明顯的增加；同時分析PERK 之轉錄(transcripts)，從結果發現當胚胎以許多不同壓力處理後(圖五(E)、(F)-(H))，其轉錄亦明顯增加，眼睛與頭部區域之PERK表現明顯被誘發；因此當遇到ER與ER相關壓力時，這些與ER壓力有關之基因會增加，且為轉錄與轉譯之層次。

(二)　水質污染檢測 重金屬逆境處理

以ZnSO₄ 、CoCl₂ 、NiSO₄ 與Cu SO₄ 處理魚胚胎(圖六(A)-(D))，於72~96 hpf經0.5毫莫耳濃度ZnSO₄ 處理的胚胎，可於腦部、後半部軀幹肌肉束觀察到大量綠螢光表現；於72~96 hpf經1毫莫耳濃度CoCl₂ 處理的胚胎，於腦部與肌肉束可觀察到大量綠螢光表現，其中以腦部表現量較多；於72~96 hpf經1毫莫耳濃度NiSO₄ 處理的胚胎，於腦部與肌肉束可觀察到大量綠螢光表現，其中以肌肉束表現量較強；於72~96 hpf經1毫莫耳濃度CuSO₄ 處理的胚胎，於皮膚可觀察到大量斑點狀綠螢光表現。

農藥處理

於72~96 hpf經19微莫耳濃度大滅松(Dimethoate)處理之胚胎，可於腦部與肌肉束觀察到微量綠螢光表現；於 72~96 hpf經6.25毫莫耳濃度丙烯醯胺(Acrylamide)處理之胚胎，可於腦部與脊柱觀察到綠螢光。

<110>　台灣大學

<120>　一種質體用於檢測環境壓力之用途與其應用方法

<130>　1543-NTU-TW

<160>　3

<170>　PatentIn version 3.5

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<211>　105

<212>　DNA

<213>　人類

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<212>　DNA

<213>　人造序列

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<223>　zfuORF正向引子

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<212>　DNA

<213>　人造序列

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<223>　zfuORF反向引子

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圖一係細胞內uORF ^cho 之特性(A)質體建構圖；(B)HEK293T細胞經phuORF ^chop -GFP轉染與衣霉素(tunicamycin,Tm;2.5微克/毫升)處理後，以西方點墨法分析GFP(左) or CHOP(右)之表現；(C)HEK293T細胞經phuORF ^chop -BikDD質體轉染與不同藥物(DMSO,PBS,2.5微克/毫升衣霉素(Tm)、1微莫耳濃度毒胡蘿蔔素(thapsigargin,Tg)、0.5微莫耳濃度MG132(MG)、600微莫耳濃度吲哚美洒辛(indomethacin,Indo),10毫莫耳濃度柳酸鈉(sodium salicylate,Sal)與0.5微莫耳濃度茴香黴素(anisomycin,An)處理後，以西方點墨法分析BikDD蛋白質之表現；(D)以吲哚美洒辛(Indo)處理穩定表現質體(pcDNA(左)或phuORF ^chop -BikDD(右))的細胞，再分析細胞死亡，星號表示有顯著差異(P<0.05)。

圖二係顯示在細胞內uORF ^chop 片段之直接轉譯抑制作用；將胚胎注射入不同質體，以螢光顯微鏡觀察報導基因在28 hpf時之表現；(A)pGFP；(B) phfuORF ^chop -GFP；(C) pDsRed(D)pzfuORF ^chop -DsRed；注射mRNA編碼之GFP(E);huORF ^chop -GFP(F);DsRed(G)或zfuORF ^chop -RFP(H)到一個細胞期之胚胎，並在28 hpf時觀察其螢光訊號；(I)以RT-PCR偵測注射質體的胚胎中之GFP cDNA，無啟動子的pGFP做為負控制組，其啟動子區域以Pvu I與Hin dIIII切割去除；(J)以西方點墨法偵測注射質體的胚胎內GFP的表現；(K)分別利用RT-PCR與西方點墨法偵測注射mRNA的胚胎內啟動子之cDNA與蛋白質的量，pGFP或pDsRed做為正控制組。

圖三係轉殖品系huORFZ之特性；(A)在huORFZ胚胎中，以全覆式原位雜合染色(WISH)分析由uORF ^chop 驅動之gfp mRNA，uORF ^chop -gfp mRNA在10、24、48、72與96 hpf的胚胎中廣泛地表現於全胚胎，Tg(fli::GFP) 品系的胚胎為正控制組，野生型品系的胚胎為負控制組；(B)將野生型與huORFZ之72 hpf胚胎暴露於正常溫度(28℃)或熱逆境(40℃，1小時)下，觀察其螢光表現；(C)暴露於正常溫度或熱逆境處理的野生型與huORFZ胚胎的gfp mRNA之全覆式原位雜合染色法分析結果；(D)huORFZ品系之72-hpf幼蟲(larvae)暴露於之40℃熱逆境壓力1小時後，每隔兩小時拍攝GFP之螢光影像；(E)將72 hpf的huORFZ胚胎暴露於37℃至40℃下1小時，在96 hpf時觀察螢光訊號；(F)將72 hpf的huORFZ胚胎暴露於40℃20至60分鐘，在96 hpf觀察螢光訊號。

圖四係huORF ^chop 在斑馬魚胚胎內對不同刺激壓力的反應；(A)將胚胎經熱逆境(40℃)、冷逆境(4℃)、處理、毒胡蘿蔔素(thapsigargin)、酒精或脫氧水處理後，觀察96 hpf的huORFZ胚胎中GFP之螢光活性；(B)將茴香黴素(anisomycin)與雷帕黴素(rapamycin)直接注射入72 hpf胚胎的腦部，觀察96 hpf的huORFZ胚胎中GFP之螢光活性，注射DMSO之胚胎為負控制組。

圖五係不同壓力誘發內生性chop 與PERK 於頭部區域表現；(A-D)為chop 之WISH結果；(E-H)為PERK 之WISH結果；其中，胚胎為96 hpf的胚胎，(A)與(E)為控制組，(B)與(F)為經毒胡蘿蔔素處理之胚胎，(C)與(G)為熱逆境處理之胚胎，(D)與(H)為酒精處理之胚胎；(I)以西方點墨法偵測經毒胡蘿蔔素(thapsigargin)或40℃熱逆境處理的胚胎中CHOP蛋白質的表現，以α-微管蛋白(tubulin)做為內部標準。

圖六係斑馬魚胚胎對重金屬或農藥處理之反應；(A)為未受刺激之控制組胚胎；(B-E)以不同重金屬處理胚胎，再觀察其螢光表現；(I)胚胎經19微莫耳濃度大滅松處理，再觀察其螢光表現；(J)胚胎經6.25毫莫耳濃度丙烯醯胺處理，再觀察其螢光表現。

Claims (7)

1. 一種質體之用途，其係用於檢測內質網壓力，其中該質體包含：(1)SEQ ID NO：1；及(2)螢光蛋白基因片段，其中該螢光蛋白基因連接於SEQ ID NO：1序列之3’端。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該螢光蛋白基因為綠色或紅色螢光蛋白基因。
3. 如申請專利範圍2項之用途，其中該螢光蛋白基因在受到內質網壓力時會被轉譯。
4. 一種檢測水質汙染之方法，其包括：(1)將一種表現一質體之基因轉殖魚置入待測之水體，其中該質體包含：SEQ ID NO：1及螢光蛋白基因片段，其中該螢光蛋白基因片段係連接於SEQ ID NO：1序列之3’端；及(2)觀察魚體之螢光蛋白表現的變化，其中該汙染為重金屬汙染、農藥汙染或溫度變化。
5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中待測水體之汙染程度與魚體之螢光蛋白表現成正比。
6. 一種藥物篩選之方法，其包括：(1)將待測藥物施予於一種表現一質體之魚類胚胎，其中該質體包含：SEQ ID NO：1及螢光蛋白基因片段，其中該螢光蛋白基因片段係連接於SEQ ID NO：1序列之3’端；(2)觀察魚胚胎之螢光蛋白表現的變 化，其中該藥物為造成內質網壓力之藥物。
7. 如申請專利範圍第6項之方法，可用於偵測藥物之副作用。