BR112017005453B1 - Compostos de aminopiridiloxipirazol, seus usos, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

"AMINOPIRIDILOXIPIRAZOL, SEUS USOS, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA". A presente invenção refere-se a compostos de aminopiridiloxipirazol que inibem a atividade do receptor 1 do fator de transformação do crescimento beta (TGFβRl), composições farmacêuticas compreendendo os compostos, e métodos de uso dos compostos para tratar câncer, preferivelmente câncer de cólon, melanoma, carcinoma hepatocelular, câncer renal, glioblastoma, câncer pancreático, síndrome mielodisplásica, câncer de pulmão, e câncer gástrico, e/ou fibrose, preferivelmente fibrose do fígado e doença renal crônica.

Description

[001] A presente invenção se refere a compostos de aminopiri- diloxipirazol que inibem a atividade do receptor 1 do fator de transformação do crescimento beta (TGFβR1). Composições farmacêuticas compreendendo os compostos e métodos de uso dos compostos para tratar câncer, preferivelmente câncer de cólon, melanoma, carcinoma hepato- celular (HCC), câncer renal, glioblastoma (GBM), câncer pancreático, síndrome mielodisplásica (MDS), câncer de pulmão, e câncer gástrico, e/ou fibrose, preferivelmente fibrose do fígado e doença renal crônica.

[002] O fator de transformação do crescimento beta (TGF-beta ou TGFβ) é uma citocina multifuncional que se liga aos complexos hetero- méricos de receptores quinase serina/treonina TGF-beta tipo I e tipo II e ativa o complexo receptor TGF-beta, o qual fosforila e ativa SMAD2 e SMAD3, que em seguida associado com SMAD4 e migra no núcleo e regula a expressão de diferentes genes alvos. Participantes chave da via de transdução sinal do receptor TGF-beta incluem: TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, TGFβR1, TGFβR2, SMADs, SnoN, SARA, SKI, DAB, TRAP, TAK1, SMIF, E2F4, E2F5, RBL1, RBL2, RB1, TFDP1, TFDP2, SMURF1, SMURF2, P300, CBP, e JUN. A via do receptor TGF-beta mediada por SMAD regula vários processos fisiológicos e celulares tais como proliferação, diferenciação, crescimento, migração, mielinação, interrupção do ciclo celular, apoptose e desenvolvimento.

[003] Os inibidores de molécula pequena de TGFβR1 são já co nhecidos na técnica para o tratamento de câncer e/ou fibrose. Veja, por exemplo, WO2012/002680, WO2009/022171, WO2004/048382, e WO2002/094833. Infelizmente, não existe tratamentos curativos conhecidos para muitos tipos de cânceres ou fibrose. Seria desejável ter inibidores de molécula pequena adicionais de TGFβR1 para o trata- mento de câncer, preferivelmente câncer de cólon, melanoma, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer renal, glioblastoma (GBM), câncer pancreático, síndrome mielodisplásica (MDS), câncer de pulmão, e câncer gástrico, e/ou fibrose, preferivelmente fibrose do fígado e doença renal crônica, em particular compostos que são mais seletivos para TGFβR1.

[004] A presente invenção fornece um composto da fórmula:

em que: R1 é hidrogênio, isopropila, difluorometila, difluoroetila, ou ciclopropila; R2 é etila, terc-butila, piridin-2-ila, tetra-hidropiran-4-ila, te- tra-hidrofuran-3-ila, ciclopropila, ou ciclobutila; e R3 é carbamoilfenila, piridin-2-ila, (1-hidróxi-1-metiletil)piri dinila, 1-metil-2-oxo-1H-piridin-4-ila, 1-metilpirazolila, pirazin-2-ila, 2- metoxipirimidin-4-ila, 1-metil-2-oxo-1H-pirimidin-4-ila, piridazin-3-ila, 6- cloropiridazin-3-ila, 6-metilpiridazin-3-ila, ou 6-metoxipiridazin-3-ila; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[005] A presente invenção também fornece 2-{4-[(4-{[1-ciclopro pil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piri din-2-il}propan-2-ol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[006] A presente invenção também fornece 4-metilbenzenossulfo nato de 2-{4-[(4-{[1-ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4- il]óxi}piridin-2-il)amino] piridin-2-il}propan-2-ol.

[007] A presente invenção também fornece 4-metilbenzenossul fonato de 2-{4-[(4-{[1-ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol- 4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol cristalino. A presente invenção também fornece 4-metilbenzenossulfonato de 2-{4-[(4-{[1- ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2- il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol cristalino caracterizado pelo padrão de difração de pó de raio-X (radiação de Cu, À-1,54060 Á) compreendendo um pico a 17,8° com um ou mais picos selecionados do grupo consistindo em 19,7°, 18,4°, e 22,0° (2θ±0,2°).

[008] A presente invenção também fornece um método de tratar câncer, preferivelmente câncer de cólon, melanoma, carcinoma hepa- tocelular (HCC), câncer renal, glioblastoma (GBM), câncer pancreático, síndrome mielodisplásica (MDS), câncer de pulmão, e câncer gástrico, em um paciente em necessidade de tal tratamento compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um composto ou sal, da presente invenção.

[009] A presente invenção também fornece um método de tratar fibrose, preferivelmente fibrose do fígado e doença renal crônica, em um paciente em necessidade de tal tratamento compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um composto ou sal, da presente invenção.

[0010] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto ou sal, da presente invenção, e um ou mais diluentes, veículos ou excipientes farmaceutica- mente aceitáveis.

[0011] Esta invenção também fornece um composto ou sal, da presente invenção para o uso na terapia. Adicionalmente, esta invenção fornece um composto ou sal, da presente invenção para o uso no tratamento de câncer, preferivelmente câncer de cólon, melanoma, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer renal, glioblastoma (GBM), câncer pancreático, síndrome mielodisplásica (MDS), câncer de pulmão, e câncer gástrico e/ou fibrose, preferivelmente fibrose do fígado e doença renal crônica. Além disso, esta invenção fornece o uso de um composto ou um sal da presente invenção na fabricação de um medicamento para tratar câncer, preferivelmente câncer de cólon, melanoma, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer renal, glioblastoma (GBM), câncer pancreático, síndrome mielodisplásica (MDS), câncer de pulmão, e câncer gástrico e/ou fibrose, preferivelmente fibrose do fígado e doença renal crônica.

[0012] Os seguintes parágrafos descrevem as classes preferidas da presente invenção: a) R1 é difluorometila, difluoroetila, ou ciclopropila; b) R2 é piridin-2-ila, tetra-hidropiran-4-ila, ou ciclopropila; c) R3 é carbamoilfenila ou (1-hidróxi-1-metiletil)piridinila; d) R1 é ciclopropila e R2 é tetra-hidropiran-4-ila; e) R1 é ciclopropila e R2 é ciclopropila; f) R1 é difluoroetila e R2 é tetra-hidropiran-4-ila; g) R1 é difluorometila e R2 é piridin-2-ila; h) R1 é ciclopropila, R2 é tetra-hidropiran-4-ila, e R3 é (1- hidróxi-1-metiletil)piridinila; i) R1 é ciclopropila, R2 é ciclopropila, e R3 é (1-hidróxi-1- metiletil)piridinila; j) R1 é difluoroetila, R2 é tetra-hidropiran-4-ila, e R3 é (1- hidróxi-1-metiletil)piridinila; e k) R1 é difluorometila, R2 é piridin-2-ila, e R3 é carbamoilfenila.

[0013] Será entendido pelo versado na técnica que as formas de base livre dos compostos da presente invenção são capazes de formar sais e tais sais são contemplados para serem parte da presente invenção. Os compostos de base livre da presente invenção são aminas, e consequentemente reagem com qualquer um dos diversos ácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais de adição de ácido farmaceu- ticamente aceitáveis. Tais sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e metodologia comum para prepara-los são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, P. Stahl, e outro(s), HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION E USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008); S.M. Berge, e outro(s), "Pharmaceutical Salts, " Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, N° 1, janeiro de 1977. É entendido pelo versado na técnica que a estequiometria de sal pode ser facilmente determinada. Veja, por exemplo, D. Risley, e outro(s), Simultaneous Determination of Positive and Negative Counterions Using a Hydrophilic Interaction Chromatography Method, LCGC NORTH AMERICA, Vol 24, N° 8, agosto de 2006 páginas 776-785.

[0014] Certos compostos da presente invenção são cristalinos. É bem conhecido na técnica de cristalografia que, para qualquer forma de cristal fornecida, as intensidades relativas dos picos de difração podem variar devido à orientação preferida resultante de fatores tais como morfologia de cristal e hábito. Onde os efeitos da orientação preferida estão presentes, as intensidades de pico são alteradas, porém as posições de pico características do polimorfo são inalteradas. Ver, por exemplo, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995. Além disso, é também bem conhecido na técnica de cristalografia que para qualquer forma de cristal fornecida as posições de pico angular podem variar levemente. Por exemplo, as posições de pico podem mudar devido a uma variação na temperatura ou umidade em que uma amostra é analisada, deslocamento de amostra, ou a presença ou ausência de um padrão interno. Nos presentes casos, a variabilidade da posição de pico de ± 0,2 em 2θ levará em consideração estas variações potenciais sem dificultar a identificação inequívoca da forma de cristal indicada. A confirmação de uma forma de cristal pode ser feita com base em qualquer combinação única dos picos distintos (em unidades de ° 2θ), tipicamente os picos mais proeminentes. Os padrões de difração da forma de cristal, cole- tados em temperatura ambiente e umidade relativa, são ajustados com base nos picos padrão NIST 675 a 8.853 e 26.774 graus 2-teta.

[0015] Os compostos da presente invenção podem ser preparados de acordo com os seguintes esquemas sintéticos por métodos bem conhecidos e apreciados na técnica. As condições de reação adequadas para as etapas destes esquemas são bem conhecidas na técnica e as substituições apropriadas de solventes e correagentes estão dentro do conhecimento da técnica. Também, será apreciado por aqueles versados na técnica que os intermediários sintéticos podem ser isolados e/ou purificados por várias técnicas bem conhecidas como necessário ou desejado, e que frequentemente, será possível usar vários intermediários diretamente nas etapas sintéticas subsequentes com pouca ou nenhuma purificação. Além disso, o técnico versado apreciará que em algumas circunstâncias, a ordem em que as porções são introduzidas não é crítica. A ordem particular das etapas requeridas para produzir os compostos da presente invenção é dependente do composto particular sendo sintetizado, o composto de partida, e a responsabilidade relativa das porções substituídas, como é bem apreciado peloversado na técnica. Todos os substituintes, a não ser que de outro modo indicado, são como previamente definidos, e todos os reagentes são bem conhecidos e apreciados na técnica.

[0016] Alguns intermediários ou compostos da presente invenção podem ter um ou mais centros quirais. A presente invenção contempla todos enantiômeros ou diastereômeros individuais, bem como misturas dos enantiômeros e diastereômeros dos referidos compostos incluindo racematos. É preferido que os compostos da presente invenção contendo pelo menos um centro quiral existem como enantiômeros ou di- astereômeros simples. Os enantiômeros ou diastereômeros simples podem ser preparados iniciando com reagentes quirais ou por técnicas sintéticas estereoespecíficas ou estereosseletivas. Alternativamente, os enantiômeros ou diastereômeros simples podem ser isolados a partir de misturas por técnicas de cristalização ou cromatográficas quirais padrão. O versado na técnica apreciará que em algumas circunstân- cias a ordem de eluição dos enantiômeros ou diastereômeros pode ser diferente devido às diferentes colunas cromatográficas e fases móveis.

[0017] A designação de "isômero 1" em um nome de composto re presenta que o correspondente intermediário ou composto da presente invenção é o primeiro dos dois enantiômeros de eluição quando uma mistura de um par de enantiômeros é separada por cromatografia quiral. A designação de "isômero 2" em um nome de composto representa que o correspondente intermediário ou composto da presente invenção que é o segundo dos dois enantiômeros de eluição quando a mistura de um par de enantiômeros é separada por cromatografia quiral.

[0018] Os compostos da presente invenção podem ser sintetiza dos como ilustrado nos seguintes Esquemas, onde R1, R2, e R3 são como previamente definidos.

Esquema 1: Síntese dos compostos de Fórmula I

[0019] O Esquema 1 ilustra a síntese geral dos compostos de Fórmula I. O Composto 1 é reagido com 2-cloropiridin-4-ol em um sol-vente adequado tal como dimetilformamida (DMF) ou acetona com uma base adequada tal como carbonato de césio ou carbonato de po-tássio em temperatura ambiente ou temperatura elevada para fornecer o Composto 2. O Composto 2 é reagido com 1,1-dimetóxi-N,N-dimetil- metanamina em temperatura elevada para formar o Composto 3. O Composto 3 pode ser purificado ou empregado sem outra purificação para reagir com a hidrazina em ácido acético para fornecer o composto 4. O composto 4 pode reagir com um reagente de alquilação adequado tal como alquiltrifluoroborato de potássio ou ácido alquiborônico sob condições de acoplamento Chan-Lam para formar o Composto 5. Mais especificamente, primeiro aquecer uma suspensão de 2,2'- bipiridina e acetato de cobre(II) em um solvente adequado tal como 1,2-dicloroetano a temperatura elevada e purgar com nitrogênio, e em seguida filtrar a mistura reacional e adicionar o filtrado a uma mistura do composto 4, um boronato adequado tal como alquiltrifluoroborato de potássio ou um ácido alquilborônico, e uma base adequada tal como carbonato de sódio em um solvente adequado tal como 1,2- dicloroetano. Aquecer a mistura reacional a uma temperatura elevada para fornecer o composto 5. O composto 4 pode também reagir com um haleto de alquila adequado tal como iodeto de alquila, brometo de alquila ou cloreto de alquila com uma base adequada tal como hidreto de sódio em um solvente apropriado tal como DMF ou tetra- hidrofurano (THF) para fornecer o Composto 5. O composto 5 é reagido com uma amina adequada sob condições de acoplamento Bu- chwald bem conhecidas para fornecer um composto de Fórmula I. Mais especificamente, o composto 5 é reagido com uma amina adequada em temperatura elevada na presença de uma base adequada tal como carbonato de césio, um reagente de ligante adequado tal como 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno, e um catalisador adequado tal como acetato de paládio(II) em um solvente apropriado tal como 1,4-dioxano para fornecer um composto de Fórmula I.

Esquema 2: Síntese dos compostos de Fórmula I quando R1 for H

[0020] O Esquema 2 ilustra a Síntese geral dos compostos de Fórmula I quando R1 for H. Como ilustrado na Etapa 4 do Esquema 1, quando o reagente de alquilação for cloreto de 2- (trimetilsilil)etoximetila, o Composto 6 pode ser obtido por alquilação através da Etapa 4 e a reação de acoplamento Buchwald através da Etapa 5. O Composto 6 pode reagir com trietilsilano em ácido trifuoro- acético para fornecer um composto de Fórmula I em que R1 seja H. Quando R1 for H, é sabido pelos versados na técnica que um composto de Fórmula I pode existir como um par de tautômeros em que o hi-drogênio pode migrar entre dois nitrogênios no anel de pirazolila.

Esquema 3: Síntese dos compostos de Fórmula I quando R3 for (carbamoil)fenila

[0021] O Esquema 3 ilustra a Síntese geral dos compostos de Fórmula I quando R3 for um grupo (carbamoil)fenila. O Composto 7 pode ser feito pelo método ilustrado na Etapa 5 do Esquema 1 quando R3 for uma benzonitrila adequadamente substituída. O Composto 7 é reagido com peróxido de hidrogênio e uma base adequada tal como carbonato de potássio em sulfóxido de dimetila (DMSO) para fornecer um composto de Fórmula I quando R3 for um grupo (carbamoil)fenila.

[0022] Como empregado aqui, os seguintes termos possuem os significados indicados: "ACN" se refere à acetonitrila; "BSA" se refere à albumina de soro bovino; "DCM" se refere a diclorometano; "DMF" re-presenta N,N-dimetilformamida; "DMSO" se refere a sulfóxido de dime- tila; "DTT" se refere a ditiotreitol; "EDTA" se refere a ácido etilenodia- minatetraacético; "EGTA" se refere a ácido etileno glicol tetra-acético; "ELISA" se refere a ensaio de imunoabsorção enzimática; "EtOAc" se refere a acetato de etila; "EtOH" se refere a etanol; "FBS" se refere a soro bovino fetal; "HEC" se refere à hidroxietilcelulose; "HPLC" se refere à cromatografia líquida de alta performance; "IVTI" se refere a inibição de alvo in vivo; "MS" se refere à espectroscopia de massa; "MeOH" se refere a metanol; "RMN" se refere à ressonância magnética nuclear; "THF" se refere a tetra-hidrofurano; "TBS" se refere à salina tamponada por Tris; "TED" se refere à dose eficaz de entrada; "UVW" se refere a comprimento de onda ultra-violeta, e "XRD" se refere à difração de raio-X.

[0023] A menos que estabelecido ao contrário, os compostos ilus trados aqui são nomeados e numerados empregando-se ACDLABS ou Accelrys Draw 4,1. Preparação 1 2-(4-Bromo-2-piridil)propan-2-ol

[0024] Equipar um frasco de base circular de três litros com três gargalos com um funil de adição, um condensador de refluxo, uma entrada de ni-trogênio, e uma sonda de temperatura. Carregar com brometo de metil- magnésio (3,2M em 2-metiltetra-hidrofurano, 239,07 mL, 765,01 mmol) e resfriar em um banho de gelo. Ao funil de adição, adicionar uma solução de 4-bromopiridina-2-carboxilato de etila (80,0 g, 347,73 mmol) em THF (800,0 mL). Adicionar a solução gota a gota à solução de brometo de metilmagnésio ao mesmo tempo que mantendo a temperatura interna abaixo de 25°C. Remover o banho de resfriamento e permitir agitar a 25 °C durante 30 minutos. Resfriar a mistura reacional a 5 °C e saciar cui-dadosamente com a adição gota a gota de solução de ácido clorídrico aquosa (1M) ao mesmo tempo que mantendo a temperatura interna abaixo de 30°C. Adicionar solução de ácido clorídrico aquosa adicional (1M) até a mistura alcançar um pH de cerca de 7. Remover o banho de resfriamento e diluir com acetato de etila (EtOAc; 200 mL). Isolar a camada orgânica, secar sobre sulfato de sódio anidroso, filtrar através de um tampão de CELITE® e enxaguar com EtOAc. Concentrar o filtrado para fornecer um óleo alaranjado. Purificar empregando-se um tampão de sílica-gel eluindo com hexano/EtOAc (3/1) para fornecer o composto do título (63,15 g; 84,0% de produção) como um óleo incolor. MS (m/z): 216/218 (M+1/M+3).

[0025] Preparar o seguinte composto essencialmente pelo método de Preparação 1. Tabela 1:

Preparação 3 2-(4-Amino-2-piridil)propan-2-ol

[0026] Carregar um reator Parr de dois litros com uma barra agita dora, cobre (malha em pó, 12,6 g, 198,6 mmol), 2-(4-bromo-2- piridil)propan-2-ol (63,1 g, 292,0 mmol) e hidróxido de amônio (28 pe- so/peso% em água, 757,2 mL). Agitar a mistura reacional ao ar livre durante 30 minutos até ficar azul escuro. Remover a barra agitadora, fixar uma agitação mecânica no topo, selar, e colocar em um agitador. Aquecer a mistura a 100°C (banho de aquecimento interno a 120°C) e agitar durante a noite. Resfriar a mistura reacional à temperatura ambiente e adicionar 2-metiltetra-hidrofurano (600 mL). Filtrar através de um tampão de CELITE® e enxaguar com 2-metiltetra-hidrofurano. Isolar a camada orgânica e extrair a camada aquosa com 2-metiltetra- hidrofurano (200 mL). Combinar as camadas orgânicas e secar sobre sulfato de sódio anidroso. Filtrar, concentrar e secar sob vácuo durante a noite para fornecer o composto do título (31,3 g; 70,4% de produção) como um óleo amarelo. MS (m/z): 153 (M+1).

[0027] Preparar o seguinte composto essencialmente pelo método de Preparação 3. Tabela 2:

Preparação 5 2-Bromo-1-tetra-hidropiran-4-il-etanona

Método 1:

[0028] Adicionar cloreto de oxalila (28,69 mL, 330,73 mmol) gota a gota a uma mistura de ácido tetra-hidropiran-4-carboxílico (39,13 g, 300,67 mmol) em DCM ( 250 mL) e DMF (15 gotas). Agitar a mistura em temperatura ambiente durante 2,5 horas sob nitrogênio. Concentrar sob pressão reduzida e dissolver o resíduo em DCM (250 mL). Adicionar a solução resultante gota a gota a (trimetilsilil)diazometano (2M em hexanos, 450 mL, 900,00 mmol) a - 10°C e agitar a mistura em temperatura ambiente durante a noite. Resfriar a mistura a 0°C e adicionar o ácido bromídrico (48 peso/peso% em água, 52 mL, 462,73 mmol) gota a gota. Agitar a mistura em temperatura ambiente durante duas horas. Resfriar a mistura a 0°C e adicionar ácido bromídrico (48 peso/peso% em água, 26 mL, 231,36 mmol) gota a gota. Agitar a mistura em temperatura ambiente durante duas horas. Adicionar água (250 mL), DCM (250 mL) e isolar a camada orgânica. Extrair a camada aquosa com DCM (2 x 250 mL). Combinar as camadas orgânicas e lavar com solução de bicarbonato de sódio aquoso saturado e cloreto de sódio aquoso saturado. Secar sobre sulfato de sódio anidroso e concentrar sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (58,2 g; 93,48% de produção) como um sólido marrom. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 4,00 (m, 2H), 3,95 (s, 2H), 3,45 (m, 2H), 2,98 (m, 1H), 1,78 (m, 4H).

Método 2:

[0029] Uma solução fria de 1-tetra-hidropiran-4-iletanona (10 g, 78,02 mmol) em metanol (MeOH; 50 mL) a -10°C. Adicionar bromo (4,01 mL, 78,02 mmol) gota a gota. Agitar a mistura a 0°C durante 45 minutos e em seguida a 10°C durante 45 minutos. Adicionar uma solução aquosa de ácido sulfúrico (11M, 27,5 mL, 302,50 mmol) e agitar a mistura resultante em temperatura ambiente durante a noite. Adicionar água e extrair com éter de dietila três vezes. Combinar as camadas orgânicas. Lavar com uma solução aquosa de bicarbonato de sódio e água. Secar sobre sulfato de sódio anidroso e concentrar sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (12 g; 74,28% de produção) como um sólido branco. 1H RMN (400,13 MHz, CDCl3) δ 4,00 (m, 2H), 3,95 (s, 2H), 3,45 (m, 2H), 2,98 (m, 1H), 1,78 (m, 4H). Preparação 6 2-[(2-Cloro-4-piridil)óxi]-1-tetra-hidropiran-4-il-etanona

Método 1:

[0030] Adicionar uma solução de 2-bromo-1-tetra-hidropiran-4-il- etanona (24,35 g, 117,60 mmol) em DMF (50 mL) gota a gota a uma mistura agitada de 2-cloropiridin-4-ol (13,85 g, 106,91 mmol) e carbonato de césio (69,67 g, 213,82 mmol) em DMF (380 mL) em temperatura ambiente. Agitar a mistura resultante a 90°C durante 2,5 horas. Resfriar à temperatura ambiente para fornecer a mistura crua. Combinar com uma mistura crua de outros 2,85 g de ciclo de reação de escala de (2-cloropiridin-4-ol) como acima indicado. Diluir a mistura combinada com água (200 mL) e EtOAc (300 mL). Isolar a camada orgânica e extrair a camada aquosa com EtOAc (3 x 250 mL). Combinar as camadas orgânicas e lavar com água (100 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (100 mL). Secar sobre sulfato de sódio anidroso, filtrar e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (29,32 g; 88,96% de produção) como um óleo marrom. MS (m/z): 256 (M+1).

Método 2:

[0031] Adicionar 2-bromo-1-tetra-hidropiran-4-il-etanona (10,03 g, 48,42 mmol) e carbonato de potássio (10,14 g, 72,62 mmol) a uma solução de 2-cloropiridin-4-ol (6,40 g, 48,42 mmol) em acetona (150 mL) e agitar a mistura resultante em temperatura ambiente durante a noite. Filtrar para remover o sólido e lavar o sólido com DCM. Concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título quantitativamente. MS (m/z): 256 (M+1).

[0032] Preparar os seguintes compostos essencialmente pelo Mé- todo 2 de Preparação 6. Tabela 3:

Preparação 13 2-Cloro-4-[(3-tetra-hidropiran-4-il-1H-pirazol-4-il)óxi]piridina

[0033] Agitar uma mistura de 2-[(2-cloro-4-piridil)óxi]-1-tetra- hidropiran-4-il-etanona (29,3 g, 114,59 mmol) e 1,1-dimetóxi-N,N- dimetil-metanamina (65 mL, 486,83 mmol) a 100°C durante duas horas. Resfriar à temperatura ambiente, concentrar sob pressão reduzida e dissolver o resíduo em EtOAc (400 mL). Lavar com água (100 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (100 mL). Secar sobre sulfato de sódio anidroso e concentrar sob pressão reduzida para fornecer um sólido marrom. Dissolver em ácido acético (350 mL) e resfriar a 0°C. Adicionar monoidrato de hidrazina (16,8 mL, 345,66 mmol) e agitar em temperatura ambiente durante a noite sob nitrogênio. Derramar a mistura em uma mistura de gelo/água (250 mL) e extrair com EtOAc (4 x 200 mL). Combinar as camadas orgânicas e lavar com água (200 mL), solução de bicarbonato de sódio aquoso saturado (100 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (100 mL). Secar sobre sulfato de sódio anidroso, filtrar e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer um óleo marrom. Purificar o óleo marrom empregando-se um tampão de sílica-gel eluindo com EtOAc. Combinar as frações apropriadas e concentrar sob pressão reduzida. Secar sob vácuo para fornecer o composto do título (24,43 g; 76,22% de produção) como um sólido amarelo. MS (m/z): 280 (M+1).

[0034] Preparar os seguintes compostos essencialmente pelo mé todo de Preparação 13. Tabela 4:

Preparação 20 2-Cloro-4-(1-ciclopropil-3-tetra-hidropiran-4-il-pirazol-4-il)óxi-piridina

Método 1:

[0035] Refluxar uma mistura de 2,2'-bipiridina (13,73 g, 87,90 mmol) e acetato de cobre(II) (15,97 g, 87,90 mmol) em 1,2- dicloroetano (244,3 mL) a 75°C durante 25 minutos e em seguida resfriar à temperatura ambiente. Adicionar uma solução de 2-cloro-4-[(3- tetra-hidropiran-4-il-1H-pirazol-4-il)óxi]piridina (24,43 g, 79,91 mmol) em 1,2-dicloroetano (335,30 mL), em seguida adicionar ácido ciclopro- pilborônico (13,73 g, 159,82 mmol) e carbonato de sódio (16,94 g, 159,82 mmol). Aquecer a mistura reacional a 75°C durante duas horas sob uma atmosfera de oxigênio e resfriar à temperatura ambiente. Diluir com EtOAc (200 mL), filtrar através de um tampão de sílica-gel e enxaguar com EtOAc (250 mL). Lavar o filtrado com água (200 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (200 mL). Secar sobre sulfato de sódio anidroso, filtrar e concentrar o filtrado sob pressão reduzida e secar o resíduo sob vácuo em temperatura ambiente durante a noite. Purificar por cromatografia de coluna em sílica-gel com 6-27% de EtOAc em DCM para fornecer o composto do título (20,75 g; 81,2% de produção) como um sólido amarelo. MS (m/z): 320 (M+1).

Método 2:

[0036] Aquecer uma suspensão de 2,2'-bipiridina (28,8 g, 56,5 mmol) e acetato de cobre (II) (8,2 g, 45,2 mmol) em 1,2-dicloroetano (50 mL) a 70°C e purgar com nitrogênio durante 3 minutos. Filtrar e adicionar o filtrado a uma mistura de 2-cloro-4-[(3-tetra-hidropiran-4- il-1H-pirazol-4-il)óxi]piridina (8 g, 22,6 mmol), ciclopro- pil(trifluoro)borato de potássio (6,7 g, 45,2 mmol) e carbonato de sódio (4,8 g, 45,2 mmol) em 1,2-dicloroetano (50 mL). Aquecer a mistura reacional a 70°C durante quatro dias. Resfriar a temperatura ambiente. Filtrar e enxaguar com DCM. Lavar o filtrado com solução de cloreto de amônio aquoso saturado e solução de bicarbonato de sódio aquoso saturado. Secar sobre sulfato de sódio anidroso, filtrar e concentrar o filtrado sob pressão reduzida. Purificar por cromatografia de coluna em sílica-gel com 1-10% de MeOH em DCM para fornecer o composto do título (6,0 g; 82,2% de produção). MS (m/z): 320 (M+1).

[0037] Preparar os seguintes compostos essencialmente pelo Mé todo 1 de Preparação 20.

[0038] Alteração do procedimento de preparação é indicado. Tabela 5:

[0039] Preparar os seguintes compostos essencialmente pelo Mé todo 2 de Preparação 20. Tabela 6:

Preparação 27 2-Cloro-4-(1-ciclopropil-3-tetra-hidrofuran-3-il-pirazol-4-il)óxi-piridina, isômero 1

[0040] Purificar a mistura racêmica de 2-cloro-4-(1-ciclopropil-3- tetra-hidrofuran-3-il-pirazol-4-il)óxi-piridina (Preparação 25) com cro- matografia quiral para fornecer o primeiro enantiômero de eluição como o composto do título. MS (m/z): 306 (M+1).

[0041] Condição de purificação: CHIRALPAK® IC; Fase móvel: 20% de etanol (EtOH) em dióxido de carbono; Taxa de fluxo: 300 g/min; UVW: 240 nm; Tempo de retenção: 2,44 minutos. Preparação 28 2-Cloro-4-(1-ciclopropil-3-tetra-hidrofuran-3-il-pirazol-4-il)óxi-piridina, isômero 2

[0042] Purificar a mistura racêmica de 2-cloro-4-(1-ciclopropil-3- tetra-hidrofuran-3-il-pirazol-4-il)óxi-piridina (Preparação 25) com cro- matografia quiral para fornecer o segundo enantiômero de eluição como o composto do título. MS (m/z): 306 (M+1).

[0043] Condição de purificação: CHIRALPAK® IC; Fase móvel: 20% EtOH em dióxido de carbono; Taxa de fluxo: 300 g/minuto; UVW: 240 nm; Tempo de retenção: 2,93 minutos. Preparação 29 2-Cloro-4-[1-(difluorometil)-3-(2-piridil)pirazol-4-il]óxi-piridina

[0044] Resfriar uma solução de 2-cloro-4-[[3-(2-piridil)-1H-pirazol- 4-il]óxi]piridina (2,0 g, 7,33 mmol) em DMF (73,34 mL) em um banho de gelo e adicionar hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 880,02 mg, 22,00 mmol) em porções. Agitar a mistura a 0°C durante 10 minutos, deixa-la aquecer a temperatura ambiente e agitar durante 10 minutos. Adicionar difluoroiodometano (10% em peso em THF, 27,19 mL, 36,67 mmol) e agitar a mistura reacional a 45°C durante a noite. Resfriar a temperatura ambiente e diluir com EtOAc. Lavar com 5% de solução de cloreto de lítio aquosa primeiro e em seguida lavar com cloreto de sódio aquoso saturado. Secar sobre sulfato de sódio anidroso, filtrar e concentrar o filtrado sob pressão reduzida. Purificar o resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel com 0-50% de EtOAc em DCM. Combinar as frações apropriadas e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel com 010% de EtOAc em DCM para fornecer o composto do título (1,56 g; 65,9% de produção). MS (m/z): 323 (M+1).

[0045] Preparar os seguintes compostos essencialmente pelo mé- todo de Preparação 29.

[0046] Alterações em solvente, base, e/ou temperatura de reação são indicadas. Tabela 7:

Preparação 41 2-Cloro-4-{[3-(piridin-2-il)-1-{[2-(trimetilsilil)etóxi]metil}-1H-pirazol-4- il]óxi}piridina

[0047] Adicionar hidreto de sódio (60% de suspensão em óleo mi neral, 484 mg, 12,10 mmol) a uma solução de 2-cloro-4-[[3-(2-piridil)- 1H-pirazol-4-il]óxi]piridina (3,0 g, 11,00 mmol) em THF (110 mL) a 0°C. Agitar durante 15 minutos a 0°C e adicionar cloreto de 2- (trimetilsilil)etóximetila (2,02 g, 12,10 mmol). Agitar a mistura reacional em temperatura ambiente durante a noite. Concentrar a mistura. Dividir o resíduo entre DCM e água. Isolar a camada orgânica e secar sobre sulfato de sódio. Filtrar a mistura e concentrar o filtrado sob pressão reduzida. Purificar o resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel com 0-30% de EtOAc em hexano para fornecer o composto do título (3,64 g; 82,1% de produção). MS (m/z): 403 (M+1). Preparação 42 4-[[4-(1-Ciclopropil-3-tetra-hidropiran-4-il-pirazol-4-il)óxi-2- piridil]amino]benzonitrila

[0048] Purgar uma solução de 2-cloro-4-(1-ciclopropil-3-tetra- hidropiran-4-il-pirazol-4-il)óxi-piridina (400 mg, 1,2 mmol), p- aminobenzonitrila (219,9 mg, 1,9 mmol), carbonato de césio (568,5 mg, 1,7 mmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (134,6 mg, 0,23 mmol) em 1,4-dioxano (15 mL) com nitrogênio durante cinco minutos. Tratar a mistura resultante com acetato de paládio(II) (26,1 mg, 0,12 mmol) e purgar com nitrogênio durante 5 minutos. Fechar o fras- conete e agitar a 100°C durante duas horas, em seguida a 80°C du rante o fim de semana. Resfriar a temperatura ambiente, filtrar através de um tampão de CELITE® e lavar com 5% de MeOH em DCM. Concentrar o filtrado para fornecer o composto do título (467 mg; 100% de produção). MS (m/z): 402 (M+1).

[0049] Preparar os seguintes compostos essencialmente pelo mé todo de Preparação 42.

[0050] Alterações no catalisador, e/ou solvente são indicadas. Tabela 8:

Exemplo 1 2-{4-[(4-{[1-Ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4- il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol

Método 1:

[0051] Purgar uma solução de 2-cloro-4-(1-ciclopropil-3-tetra- hidropiran-4-il-pirazol-4-il)óxi-piridina (45,6 g, 142,6 mmol), 2-(4-amino- 2-piridil)propan-2-ol (26,0 g, 171,1 mmol) e fenato de sódio (26,5 g, 228,2 mmol) em 1,4-dioxano (456 mL) com nitrogênio durante 20 minutos. Tratar a mistura resultante com 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9- dimetilxanteno (8,25 g, 14,3 mmol) e bis(dibenzilidenoacetona)paládio (4,10 g, 7,13 mmol). Refluxar durante 21 horas. Resfriar a reação à temperatura ambiente e agitar durante a noite. Filtrar através de um tampão de CELITE® e lavar com DCM (500 mL). Concentrar o filtrado em sílica-gel. Purificar por cromatografia de coluna em sílica-gel com 0-10% de MeOH em EtOAc. Concentrar as frações apropriadas e secar sob vácuo durante a noite para fornecer o composto do título (58,7 g; 91,7% de produção). MS (m/z): 436 (M+1). Várias bateladas do produto são produzidas empregando-se o método acima. Dissolver as bateladas combinadas dos compostos títulos (92,4 g) em EtOH (1 L). Tratar a solução com QUADRASIL® MP (100 g, 1,0-1,5 mmol/g) e agitar a 60°C durante uma hora. Resfriar a temperatura ambiente e filtrar para remover os sólidos. Concentrar para remover o solvente. Dissolver o resíduo em EtOH (500 mL) ao mesmo tempo que aquecendo a 100°C. Em seguida, resfriar a mistura vagarosamente à temperatura ambiente e adicionar água (500 mL) vagarosamente. Resfriar a mistura a 5°C ao mesmo tempo que agitando. Coletar o sólido por filtração e secar sob vácuo a 45°C durante a noite para fornecer o composto do título (81,8 g). MS (m/z): 436 (M+1).

Método 2:

[0052] Dissolver 2-cloro-4-(1-ciclopropil-3-tetra-hidropiran-4-il- pirazol-4-il)óxi-piridina (400 mg, 1,2 mmol) em 1,4-dioxano (15 mL) em um frasconete. Adicionar 2-(4-amino-2-piridil)propan-2-ol (266,5 mg, 1,6 mmol), carbonato de césio (568,5 mg, 1,7 mmol), 4,5- bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (134,6 mg, 0,23 mmol) e purgar com nitrogênio durante 5 minutos. Adicionar acetato de paládio(II) (26,1 mg, 0,12 mmol) e purgar com nitrogênio durante 5 minutos. Selar o frasconete e agitar a 100°C durante a noite. Resfriar a reação à temperatura ambiente, filtrar através de um tampão de CELITE® e lavar com 5% de MeOH em DCM. Concentrar e purificar por Cromato- grafia de fase reversa (Coluna de Fase Reversa de Alta performance C18 Redisep Rf Gold, 0-100% de ácido fórmico/acetonitrila (ACN) em ácido fórmico/água). Concentrar as frações apropriadas e secar sob vácuo para fornecer o composto do título (341 mg; 67,3% de produção). MS (m/z): 436 (M+1).

[0053] Preparar os seguintes compostos essencialmente pelo Mé todo 2 do Exemplo 1.

[0054] Alterações na base, catalisador, ligante, e/ou solvente são indicados. Tabela 9:

Exemplo 62 4-[(4-{[1-Ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piri din-2-il)amino]benzamida

[0055] Adicionar carbonato de potássio (80,4 mg, 0,58 mmol) a uma solução de 4-[[4-(1-ciclopropil-3-tetra-hidropiran-4-il-pirazol-4- il)óxi-2-piridil]amino]benzonitrila (467 mg, 1,16 mmol) em DMSO (5 mL). Adicionar 30% de peróxido de hidrogênio (1,77 mL, 17,45 mmol) e agitar a mistura reacional em temperatura ambiente durante a noite. Diluir com água e extrair com DCM quatro vezes. Combinar as camadas orgânicas e lavar com cloreto de sódio aquoso saturado. Secar sobre sulfato de sódio anidroso. Filtrar a mistura e concentrar o filtrado sob pressão reduzida. Purificar o resíduo por Cromatografia de fase reversa (Coluna de Fase Reversa C18 de alta performance Redisep Rf Gold, 0-100% de ácido fórmico/ACN em ácido fórmico/água) para fornecer o composto do título (220 mg; 45,9% de produção). MS (m/z): 420 (M+1).

[0056] Preparar os seguintes compostos essencialmente pelo mé todo do Exemplo 62. Tabela 10:

Exemplo 70 2-{4-[(4-{[3-Ciclopropil-1-(propan-2-il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2- il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol

[0057] Purgar uma solução de 4-[[4-(3-ciclopropil-1-isopropil- pirazol-4-il)óxi-2-piridil]amino]piridina-2-carboxilato de metila (298 mg, 0,76 mmol) em THF (6 mL) em um frasconete selado com nitrogênio. Adicionar brometo de metilmagnésio (3M eméter de dietila, 1,01 mL, 3,03 mmol) gota a gota e agitar a mistura em temperatura ambiente durante duas horas. Concentrar a mistura sob pressão reduzida e diluir o resíduo com DCM e bicarbonato de sódio aquoso saturado. Isolar a camada orgânica e extrair a camada aquosa com DCM. Combinar as camadas orgânicas e lavar com cloreto de sódio aquoso satu- rado. Secar sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar o filtrado. Purificar por cromatografia de coluna em sílica-gel com 5-10% de MeOH em DCM para fornecer o composto do título (160 mg; 53,69% de produção). MS (m/z): 394 (M+1). Exemplo 71 2-{5-[(4-{[3-(Piridin-2-il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2- il}propan-2-ol

[0058] Resfriar uma solução de 2-[5-[[4-[3-(2-Piridil)-1-(2- trimetilsililetóxi-metil)pirazol-4-il]óxi-2-piridil]amino]-2-piridil]propan-2-ol (500 mg, 0,96 mmol) em ácido trifluoroacético (3 mL) a 0°C em um banho de gelo. Adicionar trietilsilano (1 mL, 6,24 mmol). Agitar a mistura reaci- onal em temperatura ambiente durante a noite. Concentrar e purificar o resíduo por Cromatografia de fase reversa (Coluna de Fase Reversa C18 de alta performance Redisep Rf Gold, 0-100% de 10 mM de bicarbonato de amônio em ACN). Concentrar as frações apropriadas para remover ACN. Extrair a mistura aquosa remanescente com DCM, isolar a camada orgânica, e secar sobre sulfato de sódio. Filtrar e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (168 mg; 44,9% de produção). MS (m/z): 389 (M+1). Exemplo 72 N-[4-({1-(Difluorometil)-3-(tetra-hidrofuran-3-il)-1H-pirazol-4- il}óxi)piridin-2-il]piridazin-3-amina, isômero 1

[0059] Purificar a mistura racêmica de N-[4-[1-(difluorometil)-3-tetra- hidrofuran-3-il-pirazol-4-il]óxi-2-piridil]piridazin-3-amina (Preparação 49) com cromatografia quiral para fornecer o primeiro enantiômero de eluição como o composto do título. MS (m/z): 375 (M+1).

[0060] Condições de purificação: CHIRALPAK® IC; Fase móvel: 30% de isopropanol contendo 0,2% de isopropila amina em dióxido de carbono; Taxa de fluxo: 70 g/minuto; UVW: 280 nm; Tempo de retenção: 3,93 minutos.

[0061] Preparar o seguinte composto essencialmente pelo método do Exemplo 72.

[0062] Alternar as condições de purificação é indicado. Tabela 11:

Procedimento de Coleção de Difração de Pó de raio-X para os Exemplos 77-79

[0063] Obter os padrões de XRD de sólidos cristalinos em um di- fractômetro de pó de raio-X Bruker D4 Endeavor, equipado com uma fonte de CuKa (À = 1,54060 Â) e um detector Vantec, operando a 35 kV e 50 mA. Examinar a amostra entre 4 e 40° em 2θ, com um tamanho de etapa de 0,009° em 2θ e uma taxa de varredura de 0,5 segun- do/etapa, e com divergência de 0,6 mm, antidispersão fixa em 5,28, e fendas de detector de 9,5 mm. Embalar o pó seco em um portador de amostra de quartzo e obter uma superfície lisa empregando-se uma corrediça de vidro. Coletar os padrões de difração de forma de cristal em temperatura ambiente e umidade relativa. Exemplo 77 2-{4-[(4-{[1-Ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4- il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol, (2Z)-but-2-enedioato (1:1)

[0064] Adicionar 2-{4-[(4-{[1-ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)- 1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol (142 mg) em ACN (2 mL). O sólido dissolve completamente ao mesmo tempo que agitando a 80°C/1000 rpm. Adicionar ácido maleico (48 mg, 1,20 equivalentes, em 1 mL de ACN a 80°C) à solução resultante. A mistura é inicialmente turva, porém rapidamente torna-se uma solução clara. Interromper o aquecimento e a agitação. Resfriar a solução à temperatura ambiente. Adicionar outros 2 mL de CAN para suspender o sólido. Isolar o sólido branco por filtração a vácuo e secar o sólido no lugar de filtrar durante 15 minutos sob uma corrente de ar. Secar o sólido resultante em um forno a vácuo a 65°C durante a noite para fornecer o composto do título (132 mg, 73,4% de produção). A porcentagem teórica de íon de ácido maléico no sal formado para um mono sal é de 21,0%. A análise de contraíon por HPLC determina que a porcentagem real de íon de ácido maleico no sal formado é de 17,2%. A análise de contraíon indica um mono sal.

Difração de Pó de raio-X do Exemplo 77

[0065] Uma amostra preparada do Exemplo 77 é caracterizada por um padrão de XRD empregando-se radiação de CuKa como tendo picos de difração (valores 2-teta) como descrito na Tabela 13 abaixo, e em particular tendo picos a 9,6° em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 12,5°, 17,5°, e 16,9°; com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 graus. Tabela 12: Picos de difração de pó de raio-X do Exemplo 77

Exemplo 78 2-{4-[(4-{[1-Ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4- il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol, metanossulfonato (1:1)

[0066] Adicionar 2-{4-[(4-{[1-ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)- 1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol (113 mg) em acetona (2 mL). O sólido dissolve completamente ao mesmo tempo que agitando a 60°C/1000 rpm. Adicionar ácido metanossulfônico (21 μL, 1,24 equivalentes) à solução resultante. Interromper o aquecimento e a agitação. Resfriar a solução à temperatura ambiente. Adicionar outros 3 mL de acetona para suspender o sólido. Isolar o sólido branco por filtração a vácuo e secar o sólido no lugar de filtrar durante 15 minutos sob corrente de ar. Secar o sólido resultante em um forno a vácuo a 65°C durante a noite para fornecer o composto do título (87 mg, 63,08% de produção). A porcentagem teórica de íon de ácido me- tanossulfônico no sal formado para um mono sal é de 18,1%. A análise de contraíon por HPLC determina que a porcentagem real de íon de ácido metanossulfônico no sal formado é de 16,2 %. Análise de con- traíon indica um mono sal.

Difração de Pó de raio-X do Exemplo 78

[0067] Uma amostra preparada do Exemplo 78 é caracterizada por um padrão de XRD empregando-se radiação de CuKa como tendo picos de difração (valores 2-teta) como descrito na Tabela 14 abaixo, e em particular tendo picos a 7,0° em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 14,1°, 10,8°, e 18,6°; com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 grau. Tabela 13: Picos de difração de pó de raio-X do Exemplo 78

Exemplo 79 4-metilbenzenossulfonato de 2-{4-[(4-{[1-Ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H- piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol (1:1)

[0068] Adicionar 2-{4-[(4-{[1-ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)- 1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol (122 mg) em EtOAc (2 mL). Dissolver completamente o sólido ao mesmo tempo que agitando a 80°C/1000 rpm. Adicionar mono-hidrato de ácido p- toluenossulfônico (1,23 equivalentes, em 1 mL de EtOAc a 80°C) à solução resultante. Suspender a mistura a 80°C/1000 rpm durante 30 minutos. Desligar o calor e manter agitando a mistura a 1000 rpm enquanto ela resfria à temperatura ambiente. Isolar o sólido branco re- sultante por filtração a vácuo e secar o sólido no lugar de filtrar durante 15 minutos sob corrente de ar. Secar o sólido resultante em um forno a vácuo a 65°C durante a noite para fornecer o composto do título (159 mg, 93,40% de produção). A porcentagem teórica de íon de ácido p- toluenossulfônico no sal formado para um mono sal é de 29,3%. A análise de contraíon por HPLC determina que a porcentagem real de íon de ácido p-toluenossulfônico no sal formado é de 28,3%. Análise de contraíon indica um mono sal.

Difração de Pó de raio-X do Exemplo 79

[0069] Uma amostra preparada do Exemplo 79 é caracterizada por um padrão de XRD empregando-se radiação de CuKa como tendo picos de difração (valores de 2-teta) como descrito na Tabela 15 abaixo, e em particular tendo picos a 17,8° em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 19,7°, 18,4°, e 22,0°; com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 grau. Tabela 14: Picos de difração de pó de raio-X do Exemplo 79

[0070] A sinalização por meio da via de TGFβ estava associada com câncer e progressão de tumor em várias indicações (Elliott e ou- tro(s) (2005) J Clin Oncol 23:2078; Levy e outro(s) (2006) Cytokine & Growth Factor Rev 17:41-58). Existem vários tipos de câncer onde os ligantes de TGFβ produzidos pelo tumor ou pelo estroma no microam- biente do tumor podem participar na progressão de tumor. As células de câncer de próstata de ratos MATLyLu (Steiner e Barrack (1992) Mol. Endocrinol 6:15-25) e as células de câncer de mama de humanos MCF-7 (Arteaga, e outro(s) (1993) Cell Growth e Differ. 4:193-201) tornaram-se mais tumorigênicas e metastáticas após a transfecção com um vetor expressando o TGFβ1 de camundongo. TGF-β1 estava associado com a angiogênese, metástase e prognóstico pobre na próstata humana e avançado câncer gástrico (Wikstrom, P., e outro(s) (1998) Prostate 37: 19-29; Saito, H. e outro(s) (1999) Câncer 86: 1455 1462). No câncer de mama, o pobre prognóstico está associado com TGF-β elevado (Dickson, e outro(s) (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:837-841; Kasid, e outro(s) (1987) Câncer Res. 47:5733-5738; Daly, e outro(s) (1990) J. Cell Biochem. 43:199-211; Barrett-Lee, e outro(s) (1990) Br. J câncer 61:612-617; King, e outro(s) (1989) J. Steroid Bio- chem. 34:133-138; Welch, e outro(s) (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7678-7682; Walker, e outro(s) (1992) Eur. J. câncer 238:641-644) e indução de TGF-β1 por tratamento de tamoxifeno (Butta, e outro(s) (1992) câncer Res. 52:4261- 4264) estava associado com insuficiência de tratamento de tamoxifeno para o câncer de mama (Thompson, e outro(s) (1991) Br. J. câncer 63:609-614). Os anticorpos anti TGFβ1 inibem o crescimento das células de câncer de mama humano MDA- 231 em camundongos atímicos (Arteaga, e outro(s) (1993) J. Clin. Invest. 92:2569-2576), um tratamento que é correlacionado com um aumento na atividade da célula natural killer de baço. As células CHO transfectadas com TGFβ1 latente também mostraram atividade de NK diminuída e desenvolvimento de tumor aumentado em camundongos nus (Wallick, e outro(s) (1990) J. Exp. Med. 172:1777-1784). Desse modo, TGF-β secretado por tumores de mama pode causar uma supressão imune endócrina. Altas concentrações de TGFβ1no plasma mostraram indicar prognóstico pobre para pacientes de câncer de mama avançado (Anscher, e outro(s) (1993) N. Engl. J. Med. 328:1592-1598). Os pacientes com alta circulação de antes da qui-mioterapia de dose elevada e transplante de medula óssea autólogo estão em alto risco para doença veno-oclusiva hepática (15-50% de todos os pacientes com uma taxa de mortalidade até 50%) e pneumonite intersticial idiopática (40-60% de todos os pacientes). A implicação destes resultados é 1) que os níveis elevados de plasma de TGFβ podem ser empregados para identificar os pacientes em risco e 2) que a redução da sinalização de TGFβ pode diminuir a morbidade e a mortalidade destes tratamentos comuns para os pacientes de câncer de mama.

[0071] Publicações recentes também sugeriram que a sinalização de TGFβ pode ser importante em levar a resistência dos tumores ao padrão das terapias de cuidado, incluindo quimioterapias e receptores de tirosina quinases (WO2012138783). Especificamente, no câncer de cólon, uma assinatura de expressão de gene específica mostrou isolar um grupo de pacientes que são resistentes aos tratamentos de primeira linha comuns. Estas células tumorais recuperam a sensibilidade à terapia quando a via de TGFβ é bloqueada com um inibidor de molécula pequena específico de TGFβRI (Huang, e outro(s) (2012) Cell 151:937-950; Sadanandam e outro(s) (2013) Nat Med 19:619-625; Vermeulen e outro(s) (2013) Nat Ned 19:614-618; Roepman e outro(s) (2014) 134:552-562).

[0072] Síndromes mielodisplásicas (MDS) são distúrbios do siste ma hematopoiético no compartimento mielóide e são caracterizadas pela produção ineficaz de células mielóides. MDS está ligado às alterações da via de TGFβ representada por níveis reduzidos de SMAD7. SMAD7 é um SMAD inibitório que funciona para inibir a sinalização de SMAD mediada por TGFβ e é a jusante da sinalização ativada por li- gante através de TGFβRI e TGFβRII. A superexpressão de SMAD7 é, desse modo, suposta a conduzira super ativação da sinalização de TGFβ em MDS, e este fenótipo pode ser revertido pelo tratamento com um inibidor de molécula pequena de TGFβRI (Zhou e outro(s) (2011) Cancer Res. 71:955-963). Similarmente, em glioblastoma (GBM), os níveis de ligante de TGFβ são elevados e relacionados à progressão da doença. Um oligonucleotídeo antissenso terapêutico de, AP1002, mostrou ser potencialmente ativo em um subgrupo de pacientes GBM (Bogdahn e outro(s) (2011). Curr Pharm Biotechnol). Em melanoma, a ativação da sinalização da via de TGFβ estava também ligada à resistência aos inibidores de BRAF e MEK (Sun e outro(s) (2014) Nature. 508:118-122).

[0073] Muitas células malignas segregam o fator de transformação de crescimento β(TGF-β), um potente imunossupressor, sugerindo que a produção de TGFβ pode representar um mecanismo de escape de tumor significante da imunovigilância do hospedeiro (Flavell e outro(s) (2010) Nat Rev Immunol 10:554-567; Kast e outro(s) (1999) Leukemia 13:1188-1199). O estabelecimento de uma subpopulação de leucócito com a sinalização de TGFβ interrompida no hospedeiro portador de tumor oferece um potencial método para a imunoterapia de câncer, sozinho ou em combinação com uma ou mais outras imunoterapias, por exemplo, em combinação com um ou mais inibidor de PD-1 tal como nivolumabe, pembrolizumabe, inibidores de PD-L1, vacinas de câncer, e imunobiespecíficos empregando moléculas tal como IMCgp100. O ligante TGFβ produzido por linfócitos mostrou pré- clinicamente antagonizar a vigilância imune do tumor (Donkor e outro(s) (2012) Development. Oncoimmunology 1:162-171, Donkor e outro(s) (2011) Cytokine Immunity 35:123-134); interrompendo este eixo pré-clinicamente mostrou fornecer benefício anti-tumor em modelos de murino e in vitro (Zhong e outro(s) (2010) câncer Res 16:1191-1205; Petrausch e outro(s) (2009) J Immunol 183:36823689); Wakefield e outro(s) (2013) Nat. Rev Cancer 13:328-341). Um modelo animal transgênico com a sinalização de TGFβ interrompida em células T é capaz de erradicar um tumor de linfoma superexpressando o TGFβ normalmente letal, EL4 (Gorelik e Flavell, (2001) Nature Medicine 7(10): 1118-1122). A regulação negativa da secreção de TGFβ em células tumorais resulta na restauração da imunogenicidade no hospedeiro, ao mesmo tempo que a insensibilidade da célula T ao TGFβ resulta na diferenciação acelerada e autoimunidade, os elementos dos quais podem ser requeridos a fim de combater os tumores expressando autoantígeno em um hospedeiro tolerado. Os efeitos imunossupressivos do TGFβ também têm sido implicados em uma subpopulação de pacientes com HIV com resposta imune mais baixa do que a resposta imune prevista com base em suas contagens de célula T CD4/CD8 (Garba, e outro(s) J. Immunology (2002) 168: 2247-2254). Um anticorpo de neutralização de TGFβ foi capaz de reverter o efeito na cultura, indicando que os inibidores da sinalização de TGFβ podem ter utilidade em reverter a supressão da imunidade presente neste subgrupo de pacientes com HIV.

[0074] Durante os primeiros estágios da carcinogênese, o TGFβ1 pode agir como um supressor de tumor potente e pode mediar as ações de alguns agentes quimiopreventivos. Entretanto, em algum ponto durante o desenvolvimento e progressão de neoplasmas malignos, as células tumorais parecem escapar da inibição do crescimento dependente de TGFβ em paralelo com o aparecimento de TGFβ bioa- tivo no microambiente. Os papéis duais de promoção/supressão de tumor de TGFβ foram mais claramente elucidados em um sistema transgênico superexpressando TGFβ em queratinócitos. Ao mesmo tempo que os transgênicos foram mais resistentes à formação de lesões da pele benignas, a taxa de conversão mestastática nos transgê- nicos foi dramaticamente aumentada (Cui, e outro(s) (1996) Cell 86(4):531-42). A produção de TGFβ1 por células malignas em tumo- res primários parece aumentar com os estágios avançados da progressão de tumor. Estudos em muitos dos principais cânceres epiteli- ais sugerem que a produção aumentada de TGFβ por cânceres humanos ocorre como um evento relativamente tardio durante a progressão de tumor. Também, este TGFβ associado ao tumor fornece as células tumoraiscom uma vantagem seletiva e promove a progressão do tumor. Os efeitos de TGFβ sobre as interações célula/célula e célu- la/estroma resultam em uma maior propensão para invasão e metás- tase. O TGFβ associado ao tumor pode permitir que as células tumo- rais escapem da imunovigilância, visto que é um potente inibidor da expansão clonal dos linfócitos ativados. O TGFβ também mostrou inibir a produção de angioestatina. As modalidades terapêuticas de câncer tais como terapia de radiação e quimioterapia induzem a produção de TGFβ ativado no tumor, desse modo selecionando o crescimento de células malignas que são resistentes aos efeitos inibitórios de crescimento de TGFβ. Desse modo, estes tratamentos anticâncer aumentam o risco e aceleram o desenvolvimento de tumores com invasão e crescimento aumentados. Nesta situação, agentes direcionados à transdução sinal mediada por TGFβ devem ser uma estratégia terapêutica muito eficaz. A resistência de células tumorais ao TGFβ mostrou negar muitos dos efeitos citotóxicos de terapia de radiação e quimioterapia e a ativação de TGFβ no estroma dependente do tratamen-to pode ainda ser prejudicial como pode tornar o microambiente mais propício à progressão de tumor e contribui para lesão de tecido induzindo a fibrose. O desenvolvimento de inibidores de transdução sinal de TGFβ é provável que beneficie o tratamento de câncer que progrediu por si só e em combinação com outras terapias.

[0075] Adicionalmente, é conhecido na técnica que a sinalização de TGFβ está envolvida nas condições fibróticas tais como fibrose do fígado e doença renal crônica. Veja, por exemplo, Ueha S, e outro(s) 2012. Front Immunol. 3:71. Cellular e molecular mechanisms of chronic inflammation-associated organ fibrose; Bottinger e outro(s) 2002. J Amer Soc Nephrol. 13:2600. TGF-β Signaling in Renal Disease; Trachtman H., e outro(s) 2011. Kidney International 79:1236. A fase 1, estudo de dose única de fresolimumabe, um anticorpo anti-TGF-β, em glomeruloesclerose segmental focal primária resistente ao tratamento; e Rosenbloom J, e outro(s) 2010. Narrative review: fibrotic diseases: cellular e molecular mechanisms e novel therapies. Ann Intern Med 152: 159-166.

[0076] Os seguintes ensaios demonstram que os compostos exemplificados inibem TGFβR1 em um ensaio bioquímico, no nível celular e em um modelo animal.

Ensaio Bioquímico para atividade de TGFβRI

[0077] O propósito deste ensaio in vitro é identificar compostos que inibam TGFβR1.

Purificação e Expressão de Proteína

[0078] Inserir os aminoácidos codificando a sequência de nucleo- tídeo 200-503 de TGFβR1 humano (NM_004612,2) com aminoácido Thr na posição 204 alterado para Asp em vetor PFASTBAC™1 (Invi- trogen, Cat. # 10360-014) com um tag HIS no N-terminal. Gerar bacu- lovírus de acordo com o protocolo do Sistema de Expressão de Bacu- lovírus BAC-TO-BAC® (Invitrogen, Cat. # 10359-016). As células Sf9 infectadas a 1,5 x 106 células/mL empregando-se 15 mL de vírus P1 por litro de cultura e incubar a 28°C durante 48 horas. Colher as células e armazenar a -80°C para a purificação de proteína subsequente. Conduzir a purificação de proteína a 4°C. Os pellets ressuspensos a partir de 2L de cultura em 100 mL de tampão A (50 mM de Tris-HCl, pH 8, 200 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 5mM de imidazol, 10% de glice- rol) contendo 0,2% de Triton X-100 e coquetel de inibidor de protease livre de EDTA completo Roche e homogeneizar. Clarificar os lisados de célula por centrifugação em um rotor Beckman JA-18 durante 45 minutos a 16.500 rpm. Incubar o sobrenadante com 5 mL de resina de afinidade de metal Ni-NTA (Qiagen) durante três horas. Embalar a resina em uma coluna e lavar com tampão A. Eluir a proteína HIS- TGFβR1(200-503)(T204D) com 0 a 400 mM de gradiente de imidazol em um tampão A. Misturar e concentrar o HIS-TGFβR1(200- 503)(T204D) contendo as frações e carregar em uma coluna HiLoad 16,600 Superdex 200 (GE Healthcare Bioscience). Eluir a coluna com tampão de armazenagem (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1mM de DTT). Misturar e concentrar as frações contendo HIS- TGFβR1(200-503)(T204D). Determinar a concentração de proteína por UV280. Aliquotar a proteína e armazenar a -80 °C.

Condições de Ensaio de TR-FRET

[0079] Os compostos pré-incubados com His-TGFβR1(200- 503)(T204D) recombinante, e anticorpos de detecção de Eu-anti-HIS (InVitrogen, Cat# PV5597) na metade das em placas escuras. Preparar as diluições seriadas dos composto a partir de 1mM dos compostos teste estoque em DMSO. Diluir serialmente a solução estoque 3 vezes em DMSO para obter uma curva de diluição de dez pontos com as concentrações finais do composto variando de 2 μM a 0,1 nM. A con-centração final de DMSO no ensaio é de 4%. Iniciar a reação com a adição de traçador de quinase (Kinase Tracer 178, Life Technologies PR9080A, InVitrogen). Após 45-60 minutos, ler a fluorescência em um leitor de placa.

[0080] Calcular a porcentagem de inibição dos grupos tratados com composto relativos ao grupo de inibição mínimo (DMSO sozinho, não tratado). Calcular IC50 absoluto empregando-se uma equação logística não linear de 4 parâmetros onde o IC50 absoluto = concentração causando 50% de inibição empregando-se o software de análise de dados ActivityBase. Os resultados destes ensaios demonstraram que os compostos exemplificados são efetivos inibidores de TGFβR1. Por exemplo, todos os compostos exemplificados demonstram valores de IC50 menores do que 1 μM. Especificamente, o IC50 para o Exemplo 1 é 0,027 μM.

Ensaio de base celular do Repórter de Luciferase para atividade de TGFβRI

[0081] O propósito deste ensaio é identificar os compostos que seletivamente interferem com a expressão dependente do gene de SMAD 2,3 nos ensaios de base celular demonstrando que eles inibem TGFβR1 no nível celular.

[0082] Construir as células HEK293 (ATCC, CRL-1573) para ex pressar luciferase de vaga-lume a partir de um promotor responsivo de SMAD 2,3 em resposta ao estímulo de TGFβ. Tal linhagem celular pode ser gerada por meio da infecção com partículas lentivirais (SA Biosciences) e seleção para resistência a puromicina. Semear as células HEK293_SMAD 2/3 estoque congeladas prontas para o ensaio a 15.000 células por poço em placas de 96 poços em meio OPTI-MEM® contendo 10% de soro bovino fetal. Após 72 horas, mudar o meio para OPTI-MEM® contendo 0,1% de albumina de soro bovino. Preparar os compostos testes em DMSO para preparar soluções estoque a 10 mM. Diluir serialmente as soluções estoque 3 vezes em DMSO para obter uma curva de diluição de dez pontos com concentrações de composto final variando de 20 μM a 1 nM com a concentração final de DMSO no ensaio de 0,5%. Adicionar os compostos teste e após um equilíbrio de uma hora, adicionar TGFβ (concentração final = 2 nM, R&D Systems).

[0083] Após 24 horas, adicionar tampão de lise [Glo Lysis Buffer (Cat #E2661)] e o reagente luciferase [Promega Bright Glo Luciferase Reagent (Cat #E2620)] a cada poço para dobrar o volume do poço. Transferir as alíquotas (80 μL) às placas de base sólida branca para leitura da luminescência em um leitor de placa (filtro de emissão: Lu-minescence 700, 1 segunda leitura). Calcular a porcentagem de inibição dos grupos tratados por composto relativo ao grupo de inibição mínima (DMSO sozinho, não tratado). Calcular o IC50 relativo para cada composto de um estudo de dose-resposta e a concentração necessária para alcançar 50% de inibição. Ajustar os dados gerados dos estudos de dose-resposta a uma equação logística de quatro parâmetros empregando-se o software de análise de dados ActivityBase. Os resultados destes ensaios demonstraram que os compostos exemplificados são inibidores eficazes da atividade repórter de luciferase de células HEK293_SMAD2/3 estimuladas por TGFβ. Por exemplo, todos os compostos exemplificados demonstraram os valores IC50 menores do que 1 μM. Especificamente, o IC50, para o Exemplo 1 é 0,0824 μM (±0,005, n=2).

Ensaio IVTI

[0084] O propósito deste ensaio é medir a capacidade de um composto teste inibir a expressão de pSMAD2 em tumores em um modelo animal singeneico EMT6-LM2, em outras palavras, o ensaio mede a capacidade de um composto teste inibir a sinalização de TGFβR1 em um modelo animal de tumor sólido.

Geração de Célula EMT6-LM2

[0085] Implantar as células EMT-6 (ATCC, CRL-2755) subcutane- amente (5 x 105/animal) ao flanco de camundongos BALB/cAnNHsd imuno-competentes (Harlan Laboritories). Quando os tumores alcançarem aproximadamente 3000 mm3, sacrificar os animais por asfixia por CO2. Isolar os pulmões dos animais portando tumor e colocar em cultura. Suavemente, homogeneizar os pulmões para criar uma suspensão de células isoladas. Crescer as células em meios de cultura (IMDM, 10% de FBS) e isolar as células tumorais para fornecer as células EMT6-LM1. Repetir o processo acima empregando-se as células EMT6-LM1 para implantação para gerar as células EMT-LM2.

HIS-SMAD2 fosfo purificado (pSMAD2)

[0086] Inserir SMAD2 humano de comprimento total codificando a sequência de nucleotídeo (NM_005901,5) no vetor PFASTBACHTA™ (Invitrogen, Cat # 10584-027), resultando na construção de baculoví- rus para expressar a proteína HIS-SMAD2. Inserir os aminoácidos 148-503 codificando a sequência de nucleotídeo de TGFβR1 humano (NM_004612,2) como o aminoácido Thr na posição 204 alterado para Asp no vetor PFASTBACHTA™ (Invitrogen, Cat # 10584-027), resultando na construção de baculovírus para expressar a proteína HIS- TGFβR1(148-503)(T204D). Gerar o baculovírus de acordo com o protocolo do Sistema de Expressão de Baculovírus BAC-TO-BAC® (Invi- trogen). Infectar as células Sf9 a 1,5 x 106 células/mL empregando-se 10 mL de vírus P1 de HIS-SMAD2 e vírus P1 de HIS-TGFβR1(148- 503)(T204D) por litro de cultura e incubar a 28°C por 45 horas. Adicionar o ácido ocadaico a uma concentração final de 0,1 μM. Após um adicional de três horas de incubação, colher as células e armazenar a -80°C para a subsequente purificação de proteína. Conduzir a purificação de proteína a 4°C. Os pellets de células Lys congeladas a partir de 6 L de cultura por incubação com agitação em 300 mL de tampão frio A (50 mM de fosfato de sódio, pH 7,5, 300 mM de NaCl, 2mM de β-mercaptoetanol, 5 mM de imidazol, 10% de glicerol, 0,1 μM de ácido ocadaico) contendo 0,1% de TRITON® X-100 e coquetel de inibidor de protease livre de EDTA completo Roche e homogeneização. Clarificar os lisados de células por centrifugação em um rotor Beckman JA-18 durante 45 minutos a 16.500 rpm. Incubar o sobrenadante com 10 mL de resina de afinidade de metal TALON (Clontech, Cat. # 635504) durante duas horas. Lavar a batelada com 100 mL de tampão A contendo 0,1% de TRITON® X-100. Embalar a resina em uma coluna e lavar com o tampão A. Eluir a proteína HIS-SMAD2 com 0-100 mM de gra- diente de imidazol no tampão A. Misturar as frações contendo fosfo HIS-SMAD2 e suplementar com 0,1 μM de ácido ocadaico e 5 mM de EDTA. Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de proteína BioRad (kit BioRad DC Protein Assay #500-0116) empregando-se BSA como padrão. Aliquotar a proteína e armazenar a -80°C.

Fase Viva

[0087] Cultivar as células EMT6-LM2 em meios Iscoves Modified Dulbecco's (MDM) suplementado com 10% de FBS, 2 mM de Gluta- max e 0,1 mM de aminoácidos não essenciais e incubar a 37°C em 5% de CO2. Tripsinizar e isolar as células da cultura. Ressuspender as células em solução de sal balanceada de Hank (HBSS), em seguida misturar com MATRIGEL® (1:1). Implantar as células (5 x 105/animal) subcutaneamente no flanco traseiro dos camundongos (camundongos fêmeas BALB/c, Harlan). Medir o volume de tumor com uma pinça e o peso corporal duas vezes por semana. Após o volume do tumor alcançar aproximadamente 200-250 mm3, aleatorizar os animais e agrupá-los em controle de veículo e grupos de tratamento pelo composto. Administrar o composto (formulado em 1% de hidroxietilcelulose (HEC) e 0,25% de TWEEN® 80 e 0,05% de Antiespuma) e controle de veículo (1% de HEC e 0,25% de TWEEN® 80 e 0,05% de Antiespuma) por gavagem oral. Gerar a dose-resposta testando-se os compostos em um único ponto de tempo (2 horas) após a dose única de: 2,7, 8,3, 25, 75, ou 150 mg/kg. Executar um curso de tempo na dose calculada TED50 ou TED80 (método abaixo detalhado) de um estudo de dose- resposta sacrificando os camundongos em múltiplos pontos de tempo entre 1 hora e 16 horas após uma dose única.

Processamento de tecido

[0088] Colher os tecidos de tumor e homogeneizar como abaixo descrito. Congelar os tecidos de tumor (~100 mg cada) em nitrogênio líquido e pulverizar com pilão. Colocar o tecido pulverizado em um tubo (Lysing Matrix A tube, MPBio # 6910-100) sobre gelo seco e ho-mogeneizar em um tampão de lise (0,6 mL cada) (150 mM de NaCl; 20 mM de Tris, pH 7,5; 1 mM de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA); 1 mM de ácido tetra-acético de etileno glicol (EGTA); 1% de TRITON® X-100; coquetel de inibidor de protease (Sigma P8340); coquetel II de inibidor de Fosfatase (Sigma P5726); Coquetel III de inibidor de Fosfa- tase (Sigma P0044)) durante 25 segundos empregando-se um homo- geneizador Bio101 FASTPREP® FP120 (ajustamento 4,5). Peletizar debris celulares e contas por centrifugação a 14.000 x g durante 10 minutos a 4oC. Transferir o lisado a um novo tubo de microcentrífuga e centrifugar novamente a 14.000 x g durante 10 minutos a 4oC. Transferir o lisado centrifugado a uma placa de 96 poços de poços profundos e manter sobre gelo. Determinar a concentração de proteína para cada lisado empregando-se um ensaio de proteína BioRad (kit de Ensaio de Proteína BioRad DC #500-0116) como segue. Preparar o reagente de trabalho adicionando-se o kit de reagente S (20 μL) a cada 1 mL de kit de reagente A necessário para o ensaio. Preparar 35 diluições de um padrão de proteína de 0,2 mg/mL a 1,5 mg/mL de proteína e gerar uma curva padrão. Pipetar 5 μL de padrões e amostras em uma placa de microtitulação seca e limpa. Adicionar 25 μL de reagente de trabalho a cada poço. Adicionar 200 μL de reagente B em cada poço e agitar durante 5 segundos. Após 15 minutos, ler a absor- bância de cada poço a 750 nM. Os níveis de proteína para cada poço são determinados comparando-se a absorbância das amostras dos poços à curva padrão derivada dos poços padrões. Normalizar os li- sados de tumor a 10 mg/mL com tampão de lise na preparação para a análise de pSMAD2 e SMAD2/3 total por ELISA como o método descrito abaixo.

SMAD ELISA

[0089] Os lisados de tumor são testados empregando-se placas de ELISA independentes, onde uma placa é empregada para determinar os níveis totais de SMAD 2/3 e a outra placa é empregada para determinar os níveis de fosfo SMAD 2. Ao mesmo tempo que, o anticorpo de revestimento é o mesmo para ambas as placas, o anticorpo secundário é específico para o SMAD 2/3 total ou fosfo SMAD 2. Estas placas são referidas coletivamente como "placas de ELISA" e separadamente como "placa de ELISA Total" ou "placa de fosfo ELISA", respectivamente. Preparar o anticorpo de revestimento a 2,5 μg/mL em tampão de carbonato-bicarbonato BupH (anticorpo monoclonal anti-SMAD 2/3, BD Biosciences #610843; BupH carbonato-bicarbonato da Pierce #28382) e adicionar a 100 μL por poço a imunoplacas de 96 poços (Thermo Scientific #439454) e incubar durante a noite a 4oC em uma plataforma agitadora para gerar as placas de ELISA. A seguir, lavar as placas de ELISA quarto vezes com tampão de lavagem (0,5% de TWEEN® 20 em salina tamponada tris (TBS), pH 8,0 de Sigma #T- 9039) e subsequentemente bloquear com 200 μL por poço de tampão de bloqueio (1% de albumina de soro bovino (BSA) em 1x TBS) em temperatura ambiente em uma plataforma agitadora durante duas horas. Lavar quatro vezes com tampão de lavagem. À placa de fosfo SMAD ELISA, adicionar 100 μL por poço de lisado de tumor ou lisado de veículo a 10 mg/mL aos poços apropriados. À placa de ELISA Total, adicionar 98 μL por poços de tampão de lise e 2 ul por poço de 10 mg/mL de lisado de tumor ou lisado de veículo aos poços apropriados (0,02 mg de lisado de proteína final). Uma curva padrão é também adicionada a cada placa de ELISA (fosfo e total igualmente) empregando-se pSMAD2 purificado. Incubar durante a noite. Lavar as pla-cas de ELISA novamente quatro vezes com tampão de lavagem. Preparar os anticorpos secundários (anticorpo monoclonal de coelho anti- fosfo SMAD2 Milipore #04-953; anticorpo policlonal de coelho anti- SMAD2/3 Milipore #07-408) a 1:500 de diluição em tampão de lise su- plementado com 1% de BSA e adicionar 100 μL por poço à placa apropriada. Incubar as placas em temperatura ambiente durante duas a três horas. Lavar quatro vezes com tampão de lavagem e adicionar 100 μL por poço de anticorpo repórter (HRP anti-coelho, GE Healthcare #NAV934V, diluído 1:10.000 em tampão de bloqueio) às placas. Incubar durante uma hora a temperatura ambiente e lavar as placas quatro vezes com tampão de lavagem e adicionar 100 μL por poço a temperatura ambiente de 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB; Surmo- dics/BioFX #TMBW-0100-01). Incubar as placas a 37oC até trinta minutos. Interromper a reação com a adição de 100 μL de solução de interrupção (1N de H2SO4). Ler a absorbância (OD) a 450 nm em uma leitora de placa.

[0090] Empregar a relação de SMAD total (tSMAD) para fosfo SMAD (pSMAD) para o grupo de veículo para determinar a inibição mínima (0%) de pSMAD sinal. Calcular a porcentagem de inibição para os grupos tratados com o composto em relação à inibição mínima de pSMAD do grupo veículo. Calcular TED50 e TED80 de um estudo de dose-resposta (dose necessária para alcançar 50% e 80% de inibição neste ponto, respectivamente) empregando-se o procedimento de NLIN em SAS (Versão 9,3, Cary, NC). Este ensaio demonstra que o Exemplo 1 possui um valor de TED50 de 10,8 mg/kg 2 horas após 1 dose e um TED80 de 24,1 mg/kg. No período de estudo da dose de TED50 (11 pmk), o Exemplo 1 demonstra 48% de inibição em uma hora e 39% de inibição em duas horas após a dosagem. No período de estudo a (25 mpk), o Exemplo 1 demonstra 71% de inibição em uma hora e 70% de inibição em duas horas após a dosagem.

[0091] Os compostos da presente invenção são geralmente efica zes sobre uma ampla faixa de dosagem. Por exemplo, as dosagens por dia normalmente estão dentro da faixa diária de cerca de 1-2.000 mg. Preferivelmente, tais doses estão dentro da faixa diária de 10- 1.000 mg. Mais preferivelmente, tais doses estão dentro da faixa diária de 10-100 mg. Ainda mais preferivelmente, tais doses estão dentro da faixa diária de 10-80 mg. Mais preferivelmente, tais doses estão dentro da faixa diária de 10-50 mg. Em muitos casos, os níveis de dosagem abaixo do limite inferior das faixas acima mencionadas podem ser mais do que adequados, ao mesmo tempo que em outros casos doses ainda maiores podem ser empregadas, e portanto as faixas de dosagens acima não são pretendidas limitar o escopo da invenção de qualquer forma. Será entendido que a quantidade do composto realmente administrada será determinada por um médico, na luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a rotina escolhida de administração, o composto real ou compostos administrados, a idade, peso, e resposta do paciente individual, e a severidade dos sintomas do paciente.

Claims (8)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a formula:

na qual R1 é hidrogênio, isopropila, difluormetila, difluoretila, ou ci- clopropila; R2 é etila, terc-butila, piridin-2-ila, tetra-hidropiran-4-ila, te- tra-hidrofuran-3-ila, ciclopropila, ou ciclobutila; e R3 é carbamoilfenila, piridin-2-ila, (1-hidróxi-1-metiletil)piridi nila, 1-metil-2-oxo-1H-piridin-4-ila, 1-metilpirazolila, pirazin-2-ila, 2-me toxipirimidin-4-ila, 1-metil-2-oxo-1H-pirimidin-4-ila, piridazin-3-ila, 6-clo ropiridazin-3-ila, 6-metilpiridazin-3-ila, ou 6-metoxipirida zin-3-ila; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo fato de que é 2-{4-[(4-{[1-ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4- il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Composto ou sal, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é 4-metilbenzenossulfonato de 2-{4-[(4- {[1-ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2- il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol.

4. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é 4-metilbenzenos sulfonato de 2-{4-[(4-{[1-ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H-pirano-4-il)-1H- pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propano-2-ol cristalino.

5. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é 4- metilbenzenossulfonato de 2-{4-[(4-{[1-ciclopropil-3-(tetra-hidro-2H- pirano-4-il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propano-2-ol cristalino, definido por um padrão de difração de raios X em pó (radiação Cu, À-1,54060 Á) compreendendo pelo menos um pico em 17,8° em combinação com um ou mais desses picos selecionados a partir de um grupo consistindo em 19,7°, 18,4°, e 22,0° (2θ ± 0,2°).

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto ou sal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um ou mais excipientes, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

7. Uso de uma quantidade eficaz de 2-{4-[(4-{[1-ciclopropil- 3-(tetra-hidro-2H-pirano-4-il)-1H-pirazol-4-il]óxi}piridin-2-il)amino]piridin- 2-il}propan-2-ol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ca-racterizado pelo fato de que é para manufatura de um medicamento para tratar câncer em um paciente necessitado de tal tratamento, em que o câncer é selecionado a partir de um grupo consistindo em câncer de cólon, melanoma, carcinoma hepatocelular, câncer renal, glioblastoma, câncer pancreático, síndrome mielodisplásica, câncer de pulmão, e câncer gástrico; e/ou para tratar fibrose em um paciente necessitado de tal tratamento, em que a fibrose é selecionada a partir de um grupo consistindo em fibrose hepática e doença renal crônica.

8. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso no trata-mento de câncer em que o câncer é selecionado a partir de um grupo consistindo em câncer de cólon, melanoma, carcinoma hepatocelular, câncer renal, glioblastoma, câncer pancreático, síndrome mielodisplá- sica, câncer de pulmão, e câncer gástrico, e/ou no tratamento de fibrose, em que a fibrose é selecionada a partir de um grupo consistindo em fibrose hepática e doença renal crônica.