CN106795139A - 氨基吡啶基氧基吡唑化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制转化生长因子β受体1(TGFβR1)的活性的新的氨基吡啶基氧基吡唑化合物、包含所述化合物的药物组合物和采用所述化合物来治疗癌症、优选结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、肾癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、骨髓发育不良综合征、肺癌和胃癌和/或纤维化、优选肝纤维化和慢性肾脏疾病的方法。

Description

氨基吡啶基氧基吡唑化合物
本发明涉及抑制转化生长因子β受体1(TGFβR1)的活性的新的氨基吡啶基氧基吡唑化合物、包含所述化合物的药物组合物以及使用所述化合物来治疗癌症、优选结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌(HCC)、肾癌、成胶质细胞瘤(GBM)、胰腺癌、骨髓发育不良综合征(MDS)、肺癌和胃癌和/或纤维化、优选肝纤维化和慢性肾脏疾病的方法。
转化生长因子β(TGF-β或TGFβ)是多功能细胞因子，其结合TGF-βI型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的杂聚络合物和激活TGF-β受体复合物，后者使SMAD2和SMAD3磷酸化和激活，所述SMAD2和SMAD3然后与SMAD4结合和迁移入细胞核中并调节不同靶基因的表达。TGF-β受体信号转导途径的关键参与者包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβR1、TGFβR2、SMADs、SnoN、SARA、SKI、DAB、TRAP、TAK1、SMIF、E2F4、E2F5、RBL1、RBL2、RB1、TFDP1、TFDP2、SMURF1、SMURF2、P300、CBP和JUN。SMAD介导的TGF-β受体途径调控各种细胞过程和生理过程如增殖、分化、生长、迁移、髓鞘形成、细胞周期停滞、细胞凋亡和发育。
TGFβR1的小分子抑制剂在本领域已知用于治疗癌症和/或纤维化。例如参见WO2012/002680、WO2009/022171、WO2004/048382和WO2002/094833。不幸的是，尚未知晓用于治疗多种类型的癌症或纤维化的根治疗法。期望具有TGFβR1的另外的小分子抑制剂用于治疗癌症、优选结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌(HCC)、肾癌、成胶质细胞瘤(GBM)、胰腺癌、骨髓发育不良综合征(MDS)、肺癌和胃癌和/或纤维化、优选肝纤维化和慢性肾脏疾病，特别是对TGFβR1更具有选择性的化合物。
本发明提供了下式化合物：
其中：
R1是氢、异丙基、二氟甲基、二氟乙基或环丙基；
R2是乙基、叔丁基、吡啶-2-基、四氢吡喃-4-基、四氢呋喃-3-基、环丙基或环丁基；且
R3是氨甲酰基苯基、吡啶-2-基、(1-羟基-1-甲基乙基)吡啶基、1-甲基-2-氧代基-1H-吡啶-4-基、1-甲基吡唑基、吡嗪-2-基、2-甲氧基嘧啶-4-基、1-甲基-2-氧代基-1H-嘧啶-4-基、哒嗪-3-基、6-氯哒嗪-3-基、6-甲基哒嗪-3-基或6-甲氧基哒嗪-3-基；
或其可药用盐。
本发明还提供了2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇或其可药用盐。
本发明还提供了2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇4-甲基苯磺酸盐。
本发明还提供了结晶的2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇4-甲基苯磺酸盐。本发明进一步提供了结晶的2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇4-甲基苯磺酸盐，其特征在于包含处于17.8°的峰以及一个或多个选自19.7°、18.4°和22.0°(2θ±0.2°)的峰的X-射线粉末衍射谱(Cu放射,)。
本发明还提供了在需要该治疗的患者中治疗癌症、优选结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌(HCC)、肾癌、成胶质细胞瘤(GBM)、胰腺癌、骨髓发育不良综合征(MDS)、肺癌和胃癌的方法，该方法包括给所述患者施用有效量的本发明的化合物或其盐。
本发明还提供了在需要该治疗的患者中治疗纤维化、优选肝纤维化和慢性肾脏疾病的方法，该方法包括给所述患者施用有效量的本发明的化合物或其盐。
本发明还提供了药物组合物，包含本发明的化合物或其盐和一种或多种可药用赋形剂、载体或稀释剂。
本发明还提供了用于在治疗中使用的本发明的化合物或盐。另外，本发明提供了用于在治疗癌症、优选结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌(HCC)、肾癌、成胶质细胞瘤(GBM)、胰腺癌、骨髓发育不良综合征(MDS)、肺癌和胃癌和/或纤维化、优选肝纤维化和慢性肾脏疾病中使用的本发明的化合物或盐。而且，本发明提供了本发明的化合物或盐在制备用于治疗癌症、优选结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌(HCC)、肾癌、成胶质细胞瘤(GBM)、胰腺癌、骨髓发育不良综合征(MDS)、肺癌和胃癌和/或纤维化、优选肝纤维化和慢性肾脏疾病的药物中的用途。
以下段落描述了本发明的优选类别：
a)R1是二氟甲基、二氟乙基或环丙基；
b)R2是吡啶-2-基、四氢吡喃-4-基或环丙基；
c)R3是氨甲酰基苯基或(1-羟基-1-甲基乙基)吡啶基；
d)R1是环丙基和R2是四氢吡喃-4-基；
e)R1是环丙基和R2是环丙基；
f)R1是二氟乙基和R2是四氢吡喃-4-基；
g)R1是二氟甲基和R2是吡啶-2-基；
h)R1是环丙基、R2是四氢吡喃-4-基且R3是(1-羟基-1-甲基乙基)吡啶基；
i)R1是环丙基、R2是环丙基且R3是(1-羟基-1-甲基乙基)吡啶基；
j)R1是二氟乙基、R2是四氢吡喃-4-基且R3是(1-羟基-1-甲基乙基)吡啶基；和
k)R1是二氟甲基、R2是吡啶-2-基且R3是氨甲酰基苯基。
熟练技术阅读者将可以理解，本发明的化合物的游离碱形式能够形成盐，这类盐被视为本发明的一部分。本发明的化合物的游离碱是胺，因此与多种无机酸和有机酸中的任一种反应形成可药用酸加成盐。这类可药用酸加成盐和用于制备它们的常规方法是本领域熟知的。参见例如P.Stahl等人,HAND BOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS:PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2008)；S.M.Berge等人,“Pharmaceutical Salts”,Journal of Pharmaceutical Sciences,第66卷,第1期,1977年1月。熟练技术人员理解，盐立体化学可以容易地确定。参见例如D.Risley等人,Simultaneous Determination ofPositive and Negative Counterions Using a Hydrophilic InteractionChromatography Method,LCGC NORTH AMERICA,第24卷,第8期,2006年8月,第776-785页。
本发明的化合物中的一些是晶体。在晶体学领域熟知的是，对于任意的给定晶体形式而言，衍射峰的相对强度可以由于由诸如结晶形态学和结晶习性的因素产生的择优取向而不同。当存在择优取向的影响时，峰强度被改变，但是多晶型物的特征峰位置不变。参见例如美国药典#23,National Formulary#18,第1843-1844页,1995。而且，在晶体学领域还熟知，对于任意的给定晶体形式而言，角度峰位置可以略微变化。例如，峰位置由于分析样品所处的温度和湿度的变化、样品移位或存在或不存在内标物而偏移。在本案中，±0.22θ的峰位变化将考虑这些可能的变化，同时不妨碍所指结晶形式的明确识别。结晶形式的确认可以基于区别峰(单位为°2θ)、典型地是更突出的峰的任意独特组合来进行。在环境温度和相对湿度下收集的结晶形式衍射图可以根据处于8.853和26.774度2-θ的NIST 675标准峰进行调整。
可以通过本领域熟知和理解的以下合成流程制备本发明的化合物。适于这些流程的反应条件是本领域熟知的，溶剂和共试剂的适当替换是本领域技术领域内。同样，本领域技术人员将理解，可以按需或酌情通过各种熟知的技术分离和/或纯化合成中间体，并且经常地，能够在随后的合成步骤中经略微纯化或不经纯化直接使用各种中间体。而且，本领域技术人员将理解，在一些情况中，引入各结构部分的顺序不是关键的。制备本发明的化合物的特定步骤顺序取决于所合成的具体化合物、起始化合物和被取代结构部分的相对倾向，如熟练化学家所理解的那样。除非另有指出，否则所有取代基如前面所定义，并且所有试剂是本领域熟知的和理解的。
本发明的化合物的一些中间体可以具有一个或多个手性中心。本发明包括所有的单独对映体或非对映异构体以及所述化合物的对映体和非对映异构体的混合物、包括外消旋物。优选的是，含有至少一个手性中心的本发明的化合物作为单一对映体或非对映异构体存在。单一对映体或非对映异构体可以以手性试剂为原料制备或通过立体选择性或立体特异性合成技术来制备。或者，单一对映体或非对映异构体可以通过标准手性色谱法或结晶技术从混合物中分离出。本领域技术人员将理解，在一些情况中，对映体或非对映异构体的洗脱顺序可能因为不同的色谱柱和流动相而不同。
化合物名称中的指示“异构体1”表示：当通过手性色谱法分离对映异构体对的混合物时，本发明的相应中间体或化合物是两个所洗脱的对映异构体中的第一个。化合物名称中的指示“异构体2”表示：当通过手性色谱法分离对映异构体对的混合物时，本发明的相应中间体或化合物是两个所洗脱的对映异构体中的第二个。
本发明的化合物可以如下述流程中解释的那样进行合成，其中R1、R2和R3如前面所定义。
流程1：式I化合物的合成
流程1解释了式I化合物的通用合成。化合物1与2-氯吡啶-4-醇在适宜的溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)或丙酮中用适宜的碱如碳酸铯或碳酸钾于室温或升高温度下进行反应，得到化合物2。化合物2与1,1-二甲氧基-N,N-二甲基-甲胺在升高温度下反应，形成化合物3。化合物3可以进行纯化或未经纯化用于与肼在乙酸中反应，得到化合物4。化合物4可以与适宜的烷基化试剂如烷基三氟硼酸钾或烷基硼酸在Chan-Lam偶联条件下反应，形成化合物5。更特别地，首先将2,2'-联吡啶和乙酸铜(II)在适宜的溶剂如1,2-二氯乙烷中的混悬液加热至升高温度并用氮气净化，然后将反应混合物过滤并将滤液加入化合物4、适宜硼酸如烷基三氟硼酸钾或烷基硼酸和适宜的碱如碳酸钠在适宜的溶剂如1,2-二氯乙烷中的混合物中。将反应混合物加热至升高温度，得到化合物5。化合物4还可以与适宜的烷基卤如烷基碘化物、烷基溴化物或烷基氯化物用适宜的碱如氢化钠在适当的溶剂如DMF或四氢呋喃(THF)中反应，得到化合物5。化合物5与适宜的胺在熟知的Buchwald偶联条件下反应，得到式I化合物。更特别地，化合物5与适宜的胺在升高温度下、在适宜的碱如碳酸铯、适宜的配体试剂如4,5-双(二苯膦基)-9,9-二甲基呫吨和适宜的催化剂如乙酸钯(II)在适当的溶剂如1,4-二噁烷中反应，得到式I化合物。
流程2：当R1是H时的式I化合物的合成
流程2说明了其中R1是H的式I化合物的通用合成。如流程1步骤4所解释的那样，当烷基化试剂是2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯时，通过经由步骤4的烷基化和经由步骤5的Buchwald偶联可以获得化合物6。化合物6可以与三乙基甲硅烷在三氟乙酸中反应，得到其中R1是H的式I化合物。当R1是H时，本领域技术人员熟知，式I化合物可以作为其中氢可以在吡唑基环上的两个氮之间迁移的一对互变异构体存在。
流程3：当R3是(氨甲酰基)苯基时的式I化合物的合成
流程3解释了当R3是(氨甲酰基)苯基基团时的式I化合物的通用合成。当R3是适宜取代的苄腈时，通过流程1步骤5所解释的方法可以制得化合物7。当R3是(氨甲酰基)苯基基团时，化合物7与过氧化氢和适宜的碱如碳酸钾在二甲基亚砜(DMSO)中反应，得到式I化合物。
如本文所用的下述术语具有所示的含义：“ACN”指乙腈；“BSA”指牛血清白蛋白；“DCM”指二氯甲烷；“DMF”代表N,N-二甲基甲酰胺；“DMSO”指二甲基亚砜；“DTT”指二硫苏糖醇；“EDTA”指乙二胺四乙酸；“EGTA”指乙二醇四乙酸；“ELISA”指酶联免疫吸附剂测定；“EtOAc”指乙酸乙酯；“EtOH”指乙醇；“FBS”指胎牛血清；“HEC”指羟乙基纤维素；“HPLC”指高效液相色谱法；“IVTI”指体内靶抑制；“MS”指质谱法；“MeOH”指甲醇；“NMR”指核磁共振；“THF”指四氢呋喃；“TBS”指tris缓冲盐水；“TED”指阈有效剂量；“UVW”指紫外线波长，且“XRD”指X-射线衍射。
除非有相反指示，否则采用ACDLABS或Accelrys Draw 4.1对本发明所阐述的化合物进行命名和编号。
制备例1
2-(4-溴-2-吡啶基)丙烷-2-醇
向3升3颈圆底烧瓶装配添加漏斗、回流冷凝器、氮气入口和温度探针。装入甲基溴化镁(3.2M,在2-甲基四氢呋喃中,239.07mL,765.01mmol)，在冰浴中冷却。向添加漏斗中加入4-溴吡啶-2-甲酸乙基酯(80.0g,347.73mmol)在THF(800.0mL)中的溶液。将溶液滴加至甲基溴化镁溶液中，同时保持内温低于25℃。除去冷却浴，于25℃搅拌30分钟。冷却反应混合物至5℃，滴加氯化氢水溶液(1M)小心淬灭，同时保持内温低于30℃。加入另外的氯化氢水溶液(1M)直至混合物达到约7的pH。除去冷却浴，用乙酸乙酯(EtOAc；200mL)稀释。分离有机层，经无水硫酸镁干燥，经短柱过滤，用EtOAc冲洗。将滤液浓缩，得到橙色油。通过采用硅胶短柱用己烷/EtOAc(3/1)洗脱进行纯化，得到标题化合物(63.15g；84.0％产率)，为无色油。MS(m/z):216/218(M+1/M+3)。
基本通过制备例1的方法制备如下化合物。
表1：
制备例3
2-(4-氨基-2-吡啶基)丙烷-2-醇
向2升Parr反应器中加入搅拌棒、铜(粉末筛目,12.6g,198.6mmol)、2-(4-溴-2-吡啶基)丙烷-2-醇(63.1g,292.0mmol)和氢氧化铵(28wt/wt％,在水中,757.2mL)。在开放空气下搅拌反应混合物30分钟，直至其为深蓝色。除去搅拌棒，连接机械搅拌顶，密封，放置在搅拌器上。将混合物加热至100℃(内温,120℃加热浴)，搅拌过夜。冷却反应混合物至室温，加入2-甲基四氢呋喃(600mL)。经短柱过滤，用2-甲基四氢呋喃冲洗。分离有机层，用2-甲基四氢呋喃(200mL)萃取水层。合并有机层，经无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，真空干燥过夜，得到标题化合物(31.3g；70.4％产率)，为黄色油。MS(m/z):153(M+1)。
基本通过制备例3的方法制备如下化合物。
表2:
制备例5
2-溴-1-四氢吡喃-4-基-乙酮
方法1:
将草酰氯(28.69mL,330.73mmol)滴加至四氢吡喃-4-甲酸(39.13g,300.67mmol)在DCM(250mL)和DMF(15滴)中的混合物中。将混合物于室温在氮气下搅拌2.5小时。在减压下浓缩，将残余物溶于DCM(250mL)中。于-10℃将所得溶液滴加至(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(2M在己烷中,450mL,900.00mmol)中，将混合物于室温搅拌过夜。将混合物冷却至0℃，滴加氢溴酸(48wt/wt％,在水中,52mL,462.73mmol)。将混合物于室温搅拌2小时。将混合物冷却至0℃，滴加氢溴酸(48wt/wt％,在水中,26mL,231.36mmol)。将混合物于室温搅拌2小时。加入水(250mL)、DCM(250mL)，分离有机层。用DCM(2x250mL)萃取水层。合并有机层，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤。经无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩，得到标题化合物(58.2g；93.48％产率)，为棕色固体。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.00(m,2H),3.95(s,2H),3.45(m,2H),2.98(m,1H),1.78(m,4H)。
方法2:
将1-四氢吡喃-4-基乙酮(10g,78.02mmol)在甲醇(MeOH；50mL)中的溶液冷却至-10℃。滴加溴(4.01mL,78.02mmol)。将混合物于0℃搅拌45分钟，然后于10℃搅拌45分钟。加入硫酸水溶液(11M,27.5mL,302.50mmol)，将所得混合物于室温搅拌过夜。加入水，用二乙醚萃取三次。合并有机层。用碳酸氢钠水溶液和水洗涤。经无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩，得到标题化合物(12g；74.28％产率)，为白色固体。1H NMR(400.13MHz,CDCl3)δ4.00(m,2H),3.95(s,2H),3.45(m,2H),2.98(m,1H),1.78(m,4H)。
制备例6
2-[(2-氯-4-吡啶基)氧基]-1-四氢吡喃-4-基-乙酮
方法1:
于室温将2-溴-1-四氢吡喃-4-基-乙酮(24.35g,117.60mmol)在DMF(50mL)中的溶液滴加至2-氯吡啶-4-醇(13.85g,106.91mmol)和碳酸铯(69.67g,213.82mmol)在DMF(380mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物于90℃搅拌2.5小时。冷却至室温，得到粗混合物。与另一批2.85g(2-氯吡啶-4-醇)规模的粗混合物合并，如上所述运行反应。将所合并的混合物用水(200mL)和EtOAc(300mL)稀释。分离有机层，用EtOAc(3x250mL)萃取水层。合并有机层，用水(100mL)和饱和氯化钠水溶液(100mL)洗涤。经无水硫酸钠干燥,过滤，将滤液在减压下浓缩，得到标题化合物(29.32g；88.96％产率)，为棕色油。MS(m/z):256(M+1)。
方法2:
将2-溴-1-四氢吡喃-4-基-乙酮(10.03g,48.42mmol)和碳酸钾(10.14g,72.62mmol)加入2-氯吡啶-4-醇(6.40g,48.42mmol)在丙酮(150mL)中的溶液中，将所得混合物于室温搅拌过夜。过滤除去固体，将固体用DCM洗涤。将滤液在减压下浓缩，定量地得到标题化合物。MS(m/z):256(M+1)。
基本通过制备例6的方法2制得以下化合物。
表3:
制备例13
2-氯-4-[(3-四氢吡喃-4-基-1H-吡唑-4-基)氧基]吡啶
将2-[(2-氯-4-吡啶基)氧基]-1-四氢吡喃-4-基-乙酮(29.3g,114.59mmol)和1,1-二甲氧基-N,N-二甲基-甲胺(65mL,486.83mmol)的混合物于100℃搅拌2小时。冷却至室温，在减压下浓缩，将残余物溶于EtOAc(400mL)中。用水(100mL)和饱和氯化钠水溶液(100mL)洗涤。经无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩，得到棕色固体。溶于乙酸(350mL)中，冷却至0℃。加入肼一水合物(16.8mL,345.66mmol)，于室温在氮气下搅拌过夜。将混合物倒入冰/水混合物(250mL)中，用EtOAc(4x200mL)萃取。合并有机层，用水(200mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)和饱和氯化钠水溶液(100mL)洗涤。经无水硫酸钠干燥,过滤，将滤液在减压下浓缩，得到棕色油。将棕色油通过采用硅胶短柱用EtOAc洗脱进行纯化。合并适当的级分，在减压下浓缩。在真空下干燥，得到标题化合物(24.43g；76.22％产率)，为黄色固体。MS(m/z):280(M+1)。
基本通过制备例13的方法制得以下化合物。
表4:
制备例20
2-氯-4-(1-环丙基-3-四氢吡喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶
方法1:
将2,2'-联吡啶(13.73g,87.90mmol)和乙酸铜(II)(15.97g,87.90mmol)在1,2-二氯乙烷(244.3mL)中的混合物于75℃回流25分钟，然后冷却至室温。加入2-氯-4-[(3-四氢吡喃-4-基-1H-吡唑-4-基)氧基]吡啶(24.43g,79.91mmol)在1,2-二氯乙烷(335.30mL)中的溶液，然后加入环丙基硼酸(13.73g,159.82mmol)和碳酸钠(16.94g,159.82mmol)。将反应混合物于75℃在氧气气氛下加热2小时，冷却至室温。用EtOAc(200mL)稀释，经硅胶短柱过滤，用EtOAc(250mL)冲洗。将滤液用水(200mL)和饱和氯化钠水溶液(200mL)洗涤。经无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液在减压下浓缩，将残余物在真空下于室温干燥过夜。通过硅胶柱色谱法用EtOAc在DCM中的6-27％溶液进行纯化，得到标题化合物(20.75g；81.2％产率)，为黄色固体。MS(m/z):320(M+1)。
方法2:
将2,2'-联吡啶(28.8g,56.5mmol)和乙酸铜(II)(8.2g,45.2mmol)在1,2-二氯乙烷(50mL)中的混悬液加热至70℃，用氮气净化3分钟。过滤，将滤液加入2-氯-4-[(3-四氢吡喃-4-基-1H-吡唑-4-基)氧基]吡啶(8g,22.6mmol)、环丙基(三氟)硼酸钾(6.7g,45.2mmol)和碳酸钠(4.8g,45.2mmol)在1,2-二氯乙烷(50mL)中的混合物中。将反应混合物于70℃加热4天。冷却至室温。过滤，用DCM冲洗。将滤液用饱和氯化铵水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。经无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法用MeOH在DCM中的1-10％溶液进行纯化，得到标题化合物(6.0g；82.2％产率)。MS(m/z):320(M+1)。
基本通过制备例20的方法1制得以下化合物。指出了后处理操作中的改变。
表5:
基本通过制备例20的方法2制得以下化合物。
表6:
制备例27
2-氯-4-(1-环丙基-3-四氢呋喃-3-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶,异构体1
采用手性色谱法将2-氯-4-(1-环丙基-3-四氢呋喃-3-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶的外消旋混合物(制备例25)进行纯化，得到第一个洗脱的对映异构体，为标题化合物。MS(m/z):306(M+1)。
纯化条件:IC；流动相:20％乙醇(EtOH),在二氧化碳中；流速:300g/min；UVW:240nm；保留时间:2.44分钟。
制备例28
2-氯-4-(1-环丙基-3-四氢呋喃-3-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶,异构体2
采用手性色谱法将2-氯-4-(1-环丙基-3-四氢呋喃-3-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶的外消旋混合物(制备例25)进行纯化，得到第二个洗脱的对映异构体，为标题化合物。MS(m/z):306(M+1)。
纯化条件:IC；流动相:20％EtOH,在二氧化碳中；流速:300g/分钟；UVW:240nm；保留时间:2.93分钟。
制备例29
2-氯-4-[1-(二氟甲基)-3-(2-吡啶基)吡唑-4-基]氧基-吡啶
将2-氯-4-[[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]氧基]吡啶(2.0g,7.33mmol)在DMF(73.34mL)中的溶液在冰浴中冷却，分批加入氢化钠(60％,在矿物油中,880.02mg,22.00mmol)。将混合物于0℃搅拌10分钟，使其温热至室温，搅拌10分钟。加入二氟碘甲烷(10wt％,在THF中,27.19mL,36.67mmol)，于45℃搅拌反应混合物过夜。冷却至室温，用EtOAc稀释。首先用5％氯化钾水溶液洗涤，然后用饱和氯化钠水溶液洗涤。经无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液在减压下浓缩。将残余物经硅胶柱色谱法用EtOAc在DCM中的0-50％溶液纯化。合并适当的级分，在减压下浓缩。残余物经硅胶柱色谱法用EtOAc在DCM中的0-10％溶液纯化，得到标题化合物(1.56g；65.9％产率)。MS(m/z):323(M+1)。
基本通过制备例29的方法制得以下化合物。指出了溶剂、碱和/或反应温度的变化。
表7:
制备例41
2-氯-4-{[3-(吡啶-2-基)-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶
于0℃将氢化钠(在矿物油中的60％混悬液,484mg,12.10mmol)加入2-氯-4-[[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]氧基]吡啶(3.0g,11.00mmol)在THF(110mL)中的溶液中。于0℃搅拌15分钟，加入2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(2.02g,12.10mmol)。于室温搅拌反应混合物过夜。浓缩混合物。将残余物在DCM和水之间分配。分离有机层，经硫酸钠干燥。过滤混合物，将滤液在减压下浓缩。残余物经硅胶柱色谱法用EtOAc在己烷中的0-30％溶液纯化，得到标题化合物(3.64g；82.1％产率)。MS(m/z):403(M+1)。
制备例42
4-[[4-(1-环丙基-3-四氢吡喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-2-吡啶基]氨基]苄腈
将2-氯-4-(1-环丙基-3-四氢吡喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶(400mg,1.2mmol)、对氨基苄腈(219.9mg,1.9mmol)、碳酸铯(568.5mg,1.7mmol)、4,5-双(二苯膦基)-9,9-二甲基呫吨(134.6mg,0.23mmol)在1,4-二噁烷(15mL)中的溶液用氮气净化5分钟。将所得混合物用乙酸钯(II)(26.1mg,0.12mmol)处理，用氮气净化5分钟。封闭小瓶，于100℃搅拌2小时，然后于80℃搅拌过周末。冷却至室温，经短柱过滤，用MeOH在DCM中的5％溶液洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物(467mg；100％产率)。MS(m/z):402(M+1)。
基本通过制备例42的方法制得以下化合物。指出了催化剂和/或溶剂的改变。
表8:
实施例1
2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇
方法1:
将2-氯-4-(1-环丙基-3-四氢吡喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶(45.6g,142.6mmol)、2-(4-氨基-2-吡啶基)丙烷-2-醇(26.0g,171.1mmol)和苯酚钠(26.5g,228.2mmol)在1,4-二噁烷(456mL)中的溶液用氮气净化20分钟。将所得混合物用4,5-双(二苯膦基)-9,9-二甲基呫吨(8.25g,14.3mmol)和二(双苯亚甲基丙酮)钯(4.10g,7.13mmol)处理。回流21小时。将反应物冷却至室温，搅拌过夜。经短柱过滤，用DCM(500mL)洗涤。将滤液浓缩在硅胶上。通过硅胶柱色谱法用MeOH在EtOAc中的0-10％溶液进行纯化。浓缩适当的级分，真空干燥过夜，得到标题化合物(58.7g；91.7％产率)。MS(m/z):436(M+1)。采用上述方法产生了数批产物。将合并的标题化合物批次(92.4g)溶解在EtOH(1L)中。用MP(100g,1.0-1.5mmol/g)处理溶液，于60℃搅拌1小时。冷却至室温，过滤除去固体。浓缩除去溶剂。将残余物溶于EtOH(500mL)中，同时于100℃加热。然后将混合物缓慢冷却至室温，缓慢加入水(500mL)。将混合物在搅拌下冷却至5℃。过滤收集固体，于45℃真空干燥过夜，得到标题化合物(81.8g)。MS(m/z):436(M+1)。
方法2:
在小瓶中将2-氯-4-(1-环丙基-3-四氢吡喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶(400mg,1.2mmol)溶于1,4-二噁烷(15mL)中。加入2-(4-氨基-2-吡啶基)丙烷-2-醇(266.5mg,1.6mmol)、碳酸铯(568.5mg,1.7mmol)、4,5-双(二苯膦基)-9,9-二甲基呫吨(134.6mg,0.23mmol)，用氮气净化5分钟。加入乙酸钯(II)(26.1mg,0.12mmol)，用氮气净化5分钟。密封小瓶，于100℃搅拌过夜。冷却反应物至室温，经短柱过滤，用MeOH在DCM中的5％溶液洗涤。浓缩，经反相色谱法(Redisep Rf Gold High Performance C18反相柱,0-100％甲酸/乙腈(ACN)在甲酸/水中)纯化。浓缩适当的级分，真空干燥，得到标题化合物(341mg；67.3％产率)。MS(m/z):436(M+1)。
基本通过实施例1的方法2制得以下化合物。指出了碱、催化剂、配体和/或溶剂的改变。
表9:
实施例62
4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]苯甲酰胺
将碳酸钾(80.4mg,0.58mmol)加入4-[[4-(1-环丙基-3-四氢吡喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-2-吡啶基]氨基]苄腈(467mg,1.16mmol)在DMSO(5mL)中的溶液中。加入30％过氧化氢(1.77mL,17.45mmol)，反应混合物于环境温度搅拌过夜。用水稀释，用DCM萃取4次。合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤。经无水硫酸镁干燥。过滤混合物，将滤液在减压下浓缩。经反相色谱法(Redisep Rf Gold High Performance C18反相柱,0-100％甲酸/CAN在甲酸/水中)纯化残余物，得到标题化合物(220mg；45.9％产率)。MS(m/z):420(M+1)。
基本通过实施例62的方法制得如下化合物。
表10:
实施例70
2-{4-[(4-{[3-环丙基-1-(丙烷-2-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇
将4-[[4-(3-环丙基-1-异丙基-吡唑-4-基)氧基-2-吡啶基]氨基]吡啶-2-甲酸甲基酯(298mg,0.76mmol)在THF(6mL)中的溶液在密闭小瓶中用氮气净化。滴加甲基溴化镁(3M,在二乙醚中,1.01mL,3.03mmol)，将混合物于室温搅拌2小时。在减压下浓缩混合物，将残余物用DCM和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。分离有机层，用DCM萃取水层。合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤。经硫酸钠干燥，过滤，将滤液浓缩。通过硅胶柱色谱法用MeOH在DCM中的5-10％溶液进行纯化，得到标题化合物(160mg；53.69％产率)。MS(m/z):394(M+1)。
实施例71
2-{5-[(4-{[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇
将2-[5-[[4-[3-(2-吡啶基)-1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基-甲基)吡唑-4-基]氧基-2-吡啶基]氨基]-2-吡啶基]丙烷-2-醇(500mg,0.96mmol)在三氟乙酸(3mL)中的溶液在冰浴中冷却至0℃。加入三乙基甲硅烷(1mL,6.24mmol)。反应混合物于室温搅拌过夜。浓缩，将残余物经反相色谱法(Redisep Rf Gold High Performance C18反相柱,0-100％10mM碳酸氢铵,在CAN中)纯化。浓缩适当的级分以除去ACN。将剩余的水性混合物用DCM萃取，分离有机层，经硫酸钠干燥。过滤，将滤液在减压下浓缩，得到标题化合物(168mg；44.9％产率)。MS(m/z):389(M+1)。
实施例72
N-[4-({1-(二氟甲基)-3-(四氢呋喃-3-基)-1H-吡唑-4-基}氧基)吡啶-2-基]哒嗪-3-胺,异构体1
将N-[4-[1-(二氟甲基)-3-四氢呋喃-3-基-吡唑-4-基]氧基-2-吡啶基]哒嗪-3-胺的外消旋混合物(制备例49)用手性色谱法进行纯化，得到第一个洗脱的对映异构体，为标题化合物。MS(m/z):375(M+1)。
纯化条件:IC；流动相:含0.2％异丙基胺的异丙醇在二氧化碳中的30％溶液；流速:70g/分钟；UVW:280nm；保留时间:3.93分钟。
基本通过实施例72的方法制得以下化合物。指出了纯化条件的改变。
表11:
用于实施例77-79的X-射线粉末衍射采集操作
在装配有CuKa光源和Vantec检测器、于35kV和50mA操作的Bruker D4Endeavor X-射线粉末衍射计上获得结晶固体的XRD图。在4-40°的2θ扫描样品，2θ步长为0.009°，扫描速率为0.5秒/步，并且具有0.6mm的发散狭缝、5.28固定反散射和9.5mm检测器狭缝。将干燥粉末装填在石英试样架上，采用载玻片获得光滑表面。于环境温度和相对湿度下采集结晶形式的衍射图。
实施例77
2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇,(2Z)-丁-2-烯二酸盐(1:1)
将2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇(142mg)加入ACN(2mL)中。使固体完全溶解，同时于80℃/1000rpm搅拌。向所得溶液中加入马来酸(48mg,1.20当量,在1mL CAN中,于80℃)。混合物最初是浑浊的，但是很快变为澄清溶液。停止加热和搅拌。将溶液冷却至室温。加入另一份2mLACN以混悬固体。通过真空过滤分离白色固体，将固体放在过滤器上在空气流下干燥15分钟。将所得固体在65℃真空烘箱中干燥过夜，得到标题化合物(132mg,73.4％产率)。对于单盐而言所形成的盐中的马来酸的理论百分比为21.0％。HPLC反离子分析确定所形成的盐中的马来酸的实际百分比为17.2％。反离子分析指示是单盐。
实施例77的X-射线粉末衍射
通过采用CuKa放射的XRD图对实施例77的所制备的样品进行表征，其具有如下表13所述的衍射峰(2-θ值)，特别是具有9.6°处的峰联合选自12.5°,17.5°和16.9°的一个或多个峰；衍射角的容许值为0.2度。
表12:实施例77的X-射线粉末衍射峰
实施例78
2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇,甲磺酸盐(1:1)
将2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇(113mg)加入丙酮(2mL)中。将固体完全溶解同时于60℃/1000rpm搅拌。将甲磺酸(21μL,1.24当量)加入所得溶液中。终止加热和搅拌。将溶液冷却至室温。加入另外3mL丙酮以混悬固体。通过真空过滤分离出白色固体，将固体在过滤器上在空气流下放置15分钟干燥。将所得固体在65℃真空烘箱中干燥过夜，得到标题化合物(87mg,63.08％产率)。对于单盐而言所形成的盐中的甲磺酸离子的理论百分比为18.1％。HPLC反离子分析确定所形成的盐中的甲磺酸离子的实际百分比为16.2％。反离子分析指示为单盐。
实施例78的X-射线粉末衍射
通过采用CuKa放射的XRD图对实施例78的所制备的样品进行表征，其具有如下表14所述的衍射峰(2-θ值)，特别是具有7.0°处的峰联合选自14.1°、10.8°和18.6°的一个或多个峰；衍射角的容许值为0.2度。
表13:实施例78的X-射线粉末衍射峰
实施例79
2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇4-甲基苯磺酸盐(1:1)
将2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇(122mg)加入EtOAc(2mL)中。将固体完全溶解并于80℃/1000rpm搅拌。将对甲苯磺酸一水合物(1.23当量,在1mL EtOAc中,于80℃)加入所得溶液中。将混合物于80℃/1000rpm制浆30分钟。关掉热源，当混合物冷却至室温时将混合物于1000rpm保持搅拌。通过真空过滤分离所得白色固体，将固体在过滤器上在空气流下放置15分钟干燥。将所得固体在65℃真空烘箱中干燥过夜，得到标题化合物(159mg,93.40％产率)。对于单盐而言所形成的盐中的对甲苯磺酸离子的理论百分比为29.3％。HPLC反离子分析确定所形成的盐中的对甲苯磺酸离子的实际百分比为28.3％。反离子分析指示为单盐。
实施例79的X-射线粉末衍射
通过采用CuKa放射的XRD图对实施例79的所制备的样品进行表征，其具有如下表15所述的衍射峰(2-θ值)，特别是具有17.8°处的峰联合选自19.7°、18.4°和22.0°的一个或多个峰；衍射角的容许值为0.2度。
表14:实施例79的X-射线粉末衍射峰
峰 角度(°2-θ)+/-0.2° 相对强度(占最强峰的％)
1 17.8 100.0
2 19.7 78.0
3 18.4 65.8
4 22.0 53.0
5 20.3 50.5
6 10.1 48.0
7 16.4 46.5
8 11.5 24.6
9 7.4 14.2
10 7.8 13.1
经由TGFβ途径的信号传导已经在多种适应症中与癌症和肿瘤进程相关(Elliott等人,(2005)J Clin Oncol 23:2078；Levy等人,(2006)Cytokine&Growth Factor Rev 17:41-58)。存在多种类型的其中肿瘤产生的或肿瘤微环境中的间质产生的TGFβ配体可以参与肿瘤进程的癌症。MATLyLu大鼠前列腺癌细胞(Steiner和Barrack(1992)Mol.Endocrinol6:15-25)和MCF-7人乳癌细胞(Arteaga等人(1993)Cell Growth and Differ.4:193-201)在用表达小鼠TGFβ1的载体转染后变得更加致肿瘤性和转移性。TGF-β1已经与人前列腺癌和晚期胃癌中的血管发生、转移和预后不良相关(Wikstrom,P.等人(1998)Prostate 37:19–29；Saito,H等人.(1999)Cancer 86:1455–1462)。在乳癌中，预后不良与TGF-β增加相关(Dickson等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:837-841；Kasid等人(1987)CancerRes.47:5733-5738；Daly等人(1990)J.Cell Biochem.43:199-211；Barrett-Lee等人(1990)Br.J Cancer61:612-617；King等人(1989)J.Steroid Biochem.34:133-138；Welch等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7678-7682；Walker等人(1992)Eur.J.Cancer238:641-644)，并且他莫昔芬治疗诱导的TGF-β1(Butta等人(1992)Cancer Res.52:4261-4264)已经与他莫昔芬治疗在乳癌中的失败相关(Thompson等人(1991)Br.J.Cancer 63:609-614)。抗TGFβ1抗体抑制无胸腺小鼠中MDA-231人乳癌细胞的生长(Arteaga等人(1993)J.Clin.Invest.92:2569-2576)，这是一种与脾天然杀伤细胞活性的增加相关的治疗。用潜在TGFβ1转染的CHO细胞在裸鼠中也显示出降低的NK活性和增加的肿瘤生长(Wallick等人(1990)J.Exp.Med.172:1777-1784)。因此，乳肿瘤分泌的TGF-β可引起内分泌免疫抑制。已经证明，高的TGFβ1血浆浓度表示晚期乳癌患者预后不良(Anscher等人(1993)N.Engl.J.Med.328:1592-1598)。在高剂量化学治疗和自体骨髓移植之前具有高循环TGFβ的患者处于肝静脉梗阻症(所有患者中有15-50％，死亡率高达50％)和特发性间质性肺炎(所有患者中有40-60％)的高风险中。这些发现意味着：1)升高的TGFβ血浆水平可用于识别处危患者，和2)TGFβ信号传导的减少可降低用于乳癌患者的这些常见治疗的致病率和死亡率。
近期的出版物还已经提议，TGFβ信号传导可能在驱使肿瘤对护理治疗的标准、包括化学治疗和受体酪氨酸激酶的抗性中是重要的(WO2012138783)。具体而言，在结肠癌中，特定的基因表达标记已经被证明分离出对常见一线治疗有抗性的患者组。当用TGFβRI特异性小分子抑制剂阻断TGFβ途径时，这些肿瘤细胞重新获得对治疗的敏感性(Huang,等人,(2012)Cell 151:937-950；Sadanandam等人,(2013)Nat Med 19:619-625；Vermeulen等人,(2013)Nat Ned 19:614-618；Roepman等人,(2014)134:552-562)。
骨髓发育不良综合征(MDS)是骨髓隔室中的造血系统的疾病，其特征是骨髓细胞无效产生。MDS与通过SMAD7水平降低所表现的TGFβ途径的改变相关。SMAD7是抑制性SMAD，其发挥抑制TGFβ介导的SMAD信号传导的功能，是经由TGFβRI和TGFβRII的配体激活信号传导的下游。因此，SMAD7的过表达被认为导致MDS中的TGFβ信号传导的过激活，这种表型可以被用TGFβRI小分子抑制剂进行的治疗逆转(Zhou等人,(2011)Cancer Res.71:955-963)。类似地，在成胶质细胞瘤(GBM)中，TGFβ配体水平增加并且与疾病进程相关。已经证明反义寡核苷酸治疗性AP1002在一组GBM患者中具有潜在活性(Bogdahn等人,(2011).Curr PharmBiotechnol)。在黑素瘤中，TGFβ途径信号传导激活还已经与对BRAF和MEK抑制剂的抗性相关联(Sun等人,(2014)Nature.508:118-122)。
很多恶性细胞分泌转化生长因子-β(TGF-β)，TGF-β是一种强效的免疫抑制剂，这表明TGFβ产生可以代表有意义的肿瘤从人免疫监视逃避的机制(Flavell等人,(2010)NatRev Immunol 10:554-567；Kast等人,(1999)Leukemia 13:1188-1199)。在负荷有肿瘤的宿主中用断裂的TGFβ信号传导达到的白细胞亚群的建立提供了癌症免疫疗法的可能方式，单独或与一种或多种其它免疫疗法联合，例如与一种或多种PD-1抑制剂如nivolumab、pembrolizumab、PD-L1抑制剂、癌症疫苗和双特异性免疫接合分子如IMCgp100联合。已经在临床前证明，淋巴细胞所产生的TGFβ配体拮抗肿瘤免疫监视(Donkor等人,(2012)Development.Oncoimmunology 1:162-171,Donkor等人,(2011)Cytokine Immunity 35:123-134)；已经在鼠科模型和体外证明了这种轴的破坏提供了抗肿瘤益处(Zhong等人,(2010)Cancer Res16:1191-1205；Petrausch等人,(2009)J Immunol 183:3682-3689)；Wakefield等人,(2013)Nat.Rev Cancer 13:328-341)。在T细胞中具有破坏的TGFβ信号传导的转基因动物模型能够根除通常是致死性的TGFβ过表达淋巴瘤肿瘤EL4(Gorelik和Flavell,(2001)Nature Medicine 7(10):1118-1122)。肿瘤细胞中TGFβ分泌的下调导致宿主中免疫原性的恢复，而T细胞对TGFβ的无敏感性导致分化和自身免疫性加速，可能需要它们的元素来对抗耐受宿主中的自抗原表达肿瘤。TGFβ的免疫抑制效应还已经牵连在基于他们的CD4/CD8T细胞计数具有低于预期的免疫应答的HIV患者亚群中(Garba等人,J.Immunology(2002)168:2247-2254)。TGFβ中和抗体在培养物中能够逆转作用，表明TGFβ信号传导抑制剂在逆转该HIV患者亚群中存在的免疫抑制中可以具有功效。
在癌发生的最早阶段，TGFβ1可以作为强效肿瘤抑制剂发挥作用，并且可以接到一些化学预防剂的作用。但是，在恶性新生物发生和发展期间的一些点，肿瘤细胞显示逃脱了TGFβ-依赖性生长抑制，平行地在微环境中出现生物活性TGFβ。TGF的肿瘤抑制/肿瘤促进双重作用已经在角质形成细胞中在过表达TGF的转基因系统中进行了阐述。当转基因对良性皮肤损伤的形成更具有抗性时，转基因中转移转换的速率引人注目地增加(Cui等人,(1996)Cell 86(4):531-42)。在原发性肿瘤中恶性细胞产生的TGFβ1显示随着肿瘤进程的前进阶段而增加。在很多主要的上皮癌症中的研究提示，由于人癌症而增加的TGFβ产生在肿瘤进程期间作为相对较晚的事件发生。而且，这种肿瘤相关的TGFβ提供了具有选择优势的肿瘤细胞和促进了肿瘤进程。TGFβ对细胞/细胞和细胞/间质相互作用的作用导致对侵入和转移的更大倾向。肿瘤相关的TGFβ可以运行肿瘤细胞逃脱免疫监视，因为它是活化淋巴细胞的克隆扩增的强效抑制剂。还已经证明TGFβ抑制血管抑素的产生。癌症治疗方式如放射疗法和化学疗法引起肿瘤中活化TGFβ的产生，由此选择了对TGFβ生长抑制作用有抗性的恶性细胞的生长晕。因此，这些抗癌治疗增加了风险和促进了具有增强的生长和侵入的肿瘤的发展。在这种情况中，靶向TGFβ-介导的信号传导的物质可能是非常有效的治疗策略。已经证明肿瘤细胞对TGFβ的抗性打消了放射疗法和化学疗法的大多数细胞毒性作用，间质中TGFβ的治疗依赖性活化甚至可能是有害的，因为它使得微环境更有益于肿瘤发展和促成导致纤维化的组织损伤。TGFβ信号传导抑制剂的发展可能有益于已发生癌症(progressedcancer)的单独或与其它疗法联合的治疗。
另外，在本领域已知，TGFβ信号传导牵涉在纤维化病症如肝纤维化和慢性肾脏疾病中。参见例如Ueha S等人,2012.Front Immunol.3:71.Cellular and molecularmechanisms of chronic inflammation-associated organ fibrosis；Bottinger等人,2002.J Amer Soc Nephrol.13:2600.TGF-βSignaling in Renal Disease；Trachtman H.等人2011.Kidney International79:1236.A phase 1,single-dose study offresolimumab,an anti-TGF-βantibody,in treatment-resistant primary focalsegmental glomerulosclerosis；和Rosenbloom J等人,2010.Narrative review:fibrotic diseases:cellular and molecular mechanisms and novel therapies.AnnIntern Med 152:159-166。
以下分析证明，实施例的化合物在生物化学分析中、在细胞水平上和在动物模型中抑制TGFβR1。
TGFβR1活性的生物化学分析
本体外分析的目的是鉴别出抑制TGFβR1的化合物。
蛋白质表达和纯化
将编码人TGFβR1(NM_004612.2)的氨基酸200-503的、在204位的氨基酸Thr改变为Asp的核苷酸序列插入具有N-末端HIS标签的PFASTBACTM1(Invitrogen,Cat#10360-014)载体中。按照杆状病毒表达系统(Invitrogen,Cat#10359-016)的方案产生杆状病毒。用15mL P1病毒/升培养物以1.5x106个细胞/mL传染Sf9细胞，于28℃培养48小时。收集细胞，于-80℃储存用于随后的蛋白质纯化。于4℃进行蛋白质纯化。将来自2L培养物的片状沉淀物混悬于含0.2％Triton X-100和Roche不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂合剂的100mL缓冲液A(50mM Tris-HCl,pH8,200mM NaCl,1mM DTT,5mM咪唑,10％甘油)中并匀化。在Bechman JA-18旋转器中于16,500rpm离心45分钟使细胞裂解液澄清。将上清液与5mLNi-NTA金属亲和树脂(Qiagen)一起孵育3小时。将树脂上柱，用缓冲液A洗涤。用在缓冲液A中的0-400mM咪唑梯度洗脱HIS-TGFβR1(200-503)(T204D)蛋白质。汇合并浓缩含HIS-TGFβR1(200-503)(T204D)的级分，上样到HiLoad 16.600Superdex 200柱(GE HealthcareBioscience)上。用储备缓冲液(50mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl,1mM DTT)洗脱柱子。汇合并浓缩含HIS-TGFβR1(200-503)(T204D)的级分。通过UV280测定蛋白质浓度。将蛋白质分成等分试样，于-80℃储存。
TR-FRET分析条件
将化合物与重组His-TGFβR1(200-503)(T204D)和Eu-抗-HIS检测抗体(InVitrogen,Cat#PV5597)一起在半区黑色板中预培养。在DMSO中由1mM储备测试化合物制备化合物系列稀释液。将储备液在DMSO中3-倍系列稀释以获得10-点稀释曲线，最终化合物浓度为2μM至0.1nM。分析中的最终DMSO浓度为4％。加入激酶示踪剂(Kinase Tracer 178,Life Technologies PR9080A,InVitrogen)引发反应。45-60分钟后，在板读数器上读取荧光。
计算化合物处置组相对于最小抑制组(单独的DMSO,未经处置)的抑制百分数。采用ActivityBase数据分析软件采用4-参数非线性逻辑方程计算绝对IC50，其中绝对IC50＝引起50％抑制的浓度。这些分析的结果证明，实施例的化合物是有效的TGFβR1抑制剂。例如，所有的实施例的化合物显示低于1μM的IC50值。具体而言，实施例1的IC50为0.027μM。
用于TGFβR1活性的基于细胞的荧光素酶报道分子分析
本分析的目的是在基于细胞的分析中识别出选择性地干扰SMAD 2,3-依赖性基因表达的化合物，表明它们在细胞水平上抑制TGFβR1。
将HEK293细胞(ATCC,CRL-1573)进行工程化以表达来自SMAD 2,3-响应性启动子响应于TGFβ刺激的萤火虫荧光素酶。这类细胞系可以经由用慢病毒颗粒(SA Biosciences)传染和选择嘌罗霉素抗性而产生。将来自即可用于分析的冷冻储备物的HEK293_SMAD 2/3细胞以15,000个细胞/孔铺在96-孔板的含10％胎牛血清的培养基中。72小时后，将培养基换为含0.1％牛血清白蛋白的在DMSO中制备测试化合物以制成10mM储备液。将储备液在DMSO中3-倍系列稀释以获得10-点稀释曲线，最终化合物浓度为20μM至1nM，分析中的最终DMSO浓度为0.5％。加入测试化合物，平衡1小时后加入TGFβ(最终浓度＝2nM,R&D Systems)。
24小时后，向每孔加入溶解缓冲液[Glo Lysis Buffer(Cat#E2661)]和荧光素酶试剂[Promega Bright Glo荧光素酶试剂(Cat#E2620)]以使孔体积加倍。转移等分试样(80μL)至白色实底板，在板读数器上读取发光(发射过滤:Luminescence 700,1秒读数)。计算化合物处置组相对于最小抑制组(单独的DMSO,未经处置)的抑制百分数。由剂量响应研究计算每种化合物的相对IC50，其为达到50％抑制所需的浓度。采用ActivityBase数据分析软件将由剂量响应研究所产生的数据拟合为4-参数逻辑方程。这些分析的结果证明，实施例的化合物是来自TGFβ-刺激的HEK293_SMAD2/3细胞的荧光素酶报道分子活性的有效抑制剂。例如，所有的实施例的化合物显示低于1μM的IC50值。具体而言，实施例1的IC50为0.0824μM(±0.005,n＝2)。
IVTI分析
本分析的目的是在EMT6-LM2同系动物模型中测定测试化合物抑制肿瘤中pSMAD2表达的能力，换言之，该分析测定了测试化合物在实体瘤动物模型中抑制TGFβR1信号传导的能力。
EMT6-LM2细胞生殖
将EMT-6细胞(ATCC,CRL-2755)皮下(5x105/动物)植入免疫活性BALB/cAnNHsd小鼠(Harlan Laboritories)的侧腹。当肿瘤达到约3000mm3时，通过CO2窒息处死动物。从负荷有肿瘤的动物分离出肺，放入培养物中。温和匀化肺以产生单细胞混悬液。使细胞在培养基(IMDM,10％FBS)中生长，分离肿瘤细胞，得到EMT6-LM1细胞。采用EMT6-LM1细胞用于植入，重复上述操作，产生EMT-LM2细胞。
纯化的磷酸HIS-SMAD2(pSMAD2)
将编码全长人SMAD2(NM_005901.5)的核苷酸序列插入PFASTBACHTATM(Invitrogen,Cat#10584-027)载体，产生杆状病毒构建体用于表达HIS-SMAD2蛋白质。将编码人TGFβR1(NM_004612.2)的氨基酸148-503的、在204位的氨基酸Thr改变为Asp的核苷酸序列插入PFASTBACHTATM(Invitrogen,Cat#10584-027)载体中，产生杆状病毒构建体用于表达HIS-TGFβR1(148-503)(T204D)蛋白质。按照杆状病毒表达系统(Invitrogen)的方案产生杆状病毒。用10mL HIS-SMAD2的P1病毒和HIS-TGFβR1(148-503)(T204D)的P1病毒/升培养物以1.5x106个细胞/mL传染Sf9细胞，于28℃培养45小时。加入冈田酸至最终浓度为0.1μM。孵育另外3小时后，收集细胞，于-80℃储存用于随后的蛋白质纯化。于4℃进行蛋白质纯化。通过在300mL冷的缓冲液A(50mM磷酸钠,pH7.5,300mM NaCl,2mMβ-巯基乙醇,5mM咪唑,10％甘油,0.1μM冈田酸)中搅拌孵育将来自6L培养物的冷冻细胞片状沉淀物裂解并匀化，所述缓冲液A含有含0.1％X-100和Roche不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂合剂。在Bechman JA-18旋转器中于16,500rpm离心45分钟使细胞裂解液澄清。将上清液与10mL TALON金属亲和树脂(Clontech,Cat#635504)一起孵育2小时。用100mL含0.1％X-100的缓冲液A洗涤批次。将树脂上柱，用缓冲液A洗涤。用在缓冲液A中的0-100mM咪唑梯度洗脱HIS-SMAD2蛋白质。汇合含磷酸HIS-SMAD2的级分，补充0.1μM冈田酸和5mM EDTA。采用BSA作为标准通过BioRad蛋白质分析(BioRad DC蛋白质分析试剂盒#500-0116)确定蛋白质浓度。将蛋白质分成等分试样，于-80℃储存。
肝期
将EMT6-LM2细胞在补充有10％FBS、2mM Glutamax和0.1mM非必需氨基酸的Iscoves改良的Dulbecco's培养基(MDM)中培养和于37℃在5％CO2中孵育。进行胰蛋白酶作用，从培养物中分离细胞。将细胞重新混悬于Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中，然后与(1:1)混合。将细胞(5x105/动物)皮下植入小鼠(雌性BALB/c小鼠,Harlan)的侧后部。每周两次采用卡尺测定肿瘤体积和称体重。当肿瘤体积达到约200-250mm3时，将动物随机化并分入赋形剂对照组和化合物处置组。通过口服管饲施用化合物(配制在1％羟基乙基纤维素(HEC)和0.25％80和0.05％Antifoam中)和赋形剂对照(1％HEC和0.25％80和0.05％Antifoam)。通过在单时间点(2小时)按照如下单剂量产生剂量响应：2.7、8.3、25、75或150mg/kg。在由剂量响应研究计算(方法细节如下)的TED50或TED80处进行时间过程，所述剂量响应研究通过在单剂量后在1小时和16小时之间的多个时间点处死小鼠进行。
组织加工
收获肿瘤组织，如下所述进行匀化。将肿瘤组织在液氮中冷冻(每份～100mg)，用研棒粉碎。将粉碎的组织放入在干冰上的试管(Lysing Matrix A试管,MPBio#6910-100)中，采用Bio101FP120匀化仪(设置4.5)在裂解缓冲液(每份0.6mL)(150mMNaCl；20mM Tris,pH7.5；1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；1mM乙二醇四乙酸(EGTA)；1％X-100；蛋白酶抑制剂合剂(Sigma P8340)；磷酸酶抑制剂合剂II(SigmaP5726)；磷酸酶抑制剂合剂III(Sigma P0044))中匀化25秒。将细胞碎片和珠沉淀物于4℃以14,000xg离心10分钟。将裂解物转入新的微量离心机试管中，于4℃以14,000xg再次离心10分钟。将离心的裂解物转移至深孔96-孔板中并放置在冰上。如下采用BioRad蛋白质分析(BioRad DC蛋白质分析试剂盒#500-0116)测定每份裂解物的蛋白质浓度。通过向每1mL试剂盒试剂A中加入试剂盒试剂S(20μL)制备分析所需的工作试剂。制备蛋白质标准的从0.2mg/mL至1.5mg/mL蛋白质的3-5份稀释，产生标准曲线。移取5μL标准和样品置入干净干燥微孔滴定板中。向每孔加入25μL工作试剂。向每孔加入200μL试剂B，振摇5秒。15分钟后，于750nM读取每孔的吸光度。通过将样品孔的吸光度与来自标准孔的标准曲线比较确定了每孔的蛋白质水平。在制备中用裂解缓冲液将肿瘤裂解物标准化为10mg/mL，用于通过如下所述的ELISA方法分析pSMAD2和总SMAD2/3。
SMAD ELISA
采用独立的ELISA板分析肿瘤裂解物，其中一块板用于测定总SMAD 2/3水平，另一块用于测定磷酸SMAD 2水平。虽然两块板的包涂抗体是相同的，但是二级抗体是对总SMAD2/3或磷酸SMAD 2特异性的。这些板统称为“ELISA板”，单独地分别称为“总ELISA板”或“磷酸ELISA板”。在BupH Carbonate-Bicarbonate缓冲液(抗-SMAD 2/3单克隆抗体,BDBiosciences#610843；BupH Carbonate-Bicarbonate，来自Pierce#28382)中以2.5μg/mL制备包涂抗体，向96-孔immunoplates(Thermo Scientific#439454)中每孔加入100μL，在台式振摇器上于4℃孵育过夜，产生ELISA板。接下来，将ELISA板用洗涤缓冲液(0.5％20在来自Sigma#T-9039的tris缓冲盐水(TBS),pH 8.0中)洗涤4次，随后于室温在台式振摇器上用阻断缓冲液(1％牛血清白蛋白(BSA)在1xTBS中)阻断2小时。用洗涤缓冲液洗涤4次。向磷酸SMAD ELISA板中以10mg/ml向适当的孔中加入100μL/孔的肿瘤裂解物或赋形剂裂解物。向总ELISA板中向适当的孔中加入98μL/孔的裂解缓冲液和2ul/孔的10mg/ml肿瘤裂解液或赋形剂裂解液(最终0.02mg蛋白质裂解液)。还向各ELISA板(磷酸和总两者)采用纯化的pSMAD2加入标准曲线。孵育过夜。再次用洗涤缓冲液洗涤ELISA板。在补充有1％BSA的裂解缓冲液中以1:500稀释制备二级抗体(Millipore抗磷酸SMAD2兔单克隆抗体#04-953；Millipore抗-SMAD2/3兔多克隆抗体#07-408)，向适当的板中加入100μL/孔。将板于室温孵育2至3小时。用洗涤缓冲液洗涤4次，向板中加入100μL/孔的报道分子抗体(抗-兔HRP,GE Healthcare#NAV934V,在阻断缓冲液中以1:10,000稀释)。于室温孵育1小时，将板用洗涤缓冲液洗涤最后4次，加入100μL/孔的室温3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB；Surmodics/BioFX#TMBW-0100-01)。将板于37℃孵育直到30分钟。添加100μL终止溶液(1NH2SO4)终止反应。在板读数器上于450nm读取吸光度(OD)。
采用总SMAD(tSMAD)比磷酸SMAD(pSMAD)的比例用于赋形剂组以确定pSMAD信号的最小抑制。计算化合物处置组相对于赋形剂组的最小pSMAD抑制的抑制百分比。通过在SAS中采用NLIN操作(Version 9.3,Cary,NC)由剂量响应研究计算TED50和TED80(在此时间点分别获得50％和80％抑制所需的剂量)。该分析证明，实施例1在1个剂量后2小时时具有10.8mg/kg的TED50和24.1mg/kg的TED80。在TED50剂量(11pmk)的时间进程研究中，在给药后实施例1显示了在1小时的48％抑制和在2小时的39％抑制。在(25mpk)的时间进程研究中，在给药后实施例1显示了在1小时的71％抑制和在2小时的70％抑制。
本发明的化合物在宽的剂量范围通常是有效的。例如，每日剂量正常地落入约1-2000mg的日范围。优选地，这类剂量落入10-1000mg的日范围。更优选地，这类剂量落入10-100mg的日范围。甚至更优选地，这类剂量落入10-80mg的日范围。最优选地，这类剂量落入10-50mg的日范围。在一些情况中，低于前述范围的下限的剂量水平可以是多于适当的，而在其它情况中可以采用更大的剂量，因此上述剂量范围不意欲以任何方式限制本发明的范围。可以理解，实际施用的化合物的量将由医师考虑相关的情况、包括待治疗的病症、所选的施用途径、实际施用的一种或多种化合物、个体患者的年龄、体重和响应以及患者症状的严重性来确定。

Claims (17)

1.下式化合物:
其中：
R1是氢、异丙基、二氟甲基、二氟乙基或环丙基；
R2是乙基、叔丁基、吡啶-2-基、四氢吡喃-4-基、四氢呋喃-3-基、环丙基或环丁基；且
R3是氨甲酰基苯基、吡啶-2-基、(1-羟基-1-甲基乙基)吡啶基、1-甲基-2-氧代基-1H-吡啶-4-基、1-甲基吡唑基、吡嗪-2-基、2-甲氧基嘧啶-4-基、1-甲基-2-氧代基-1H-嘧啶-4-基、哒嗪-3-基、6-氯哒嗪-3-基、6-甲基哒嗪-3-基或6-甲氧基哒嗪-3-基；
或其可药用盐。
2.根据权利要求1的化合物，所述化合物为2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇，或其可药用盐。
3.根据权利要求1或2的化合物或盐，其为2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇4-甲基苯磺酸盐。
4.根据权利要求1-3任一项的化合物或盐，其为结晶的2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇4-甲基苯磺酸盐。
5.根据权利要求1-4任一项的化合物或盐，其为结晶的2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇4-甲基苯磺酸盐，包含处于17.8°的至少一个峰联合选自19.7°、18.4°和22.0°(2θ±0.2°)的一个或多个峰。
6.药物组合物，包含权利要求1-5任一项的化合物或盐和一种或多种可药用赋形剂、载体或稀释剂。
7.在需要该治疗的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给患者施用有效量的2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇或其可药用盐。
8.根据权利要求7的方法，其中所述盐是4-甲基苯磺酸盐。
9.根据权利要求7或8的方法，其中癌症选自结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、肾癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、骨髓发育不良综合征、肺癌和胃癌。
10.在需要该治疗的患者中治疗纤维化的方法，该方法包括给患者施用有效量的2-{4-[(4-{[1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)氨基]吡啶-2-基}丙烷-2-醇或其可药用盐。
11.根据权利要求10的方法，其中所述盐是4-甲基苯磺酸盐。
12.根据权利要求10或11的方法，其中纤维化选自肝纤维化和慢性肾脏疾病。
13.用于疗法的权利要求1-5任一项的化合物或盐。
14.用于治疗癌症的权利要求1-5任一项的化合物或盐。
15.根据权利要求14的化合物或盐，其中癌症选自结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、肾癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、骨髓发育不良综合征、肺癌和胃癌。
16.用于治疗纤维化的权利要求1-5任一项的化合物或盐。
17.根据权利要求16的用于用途的化合物或盐，其中纤维化选自肝纤维化和慢性肾脏疾病。
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