EA031830B1 - АМИНОПИРИДИЛОКСИПИРАЗОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ АКТИВНОСТИ РЕЦЕПТОРА 1 ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА БЕТА (TGFβR1) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к новым аминопиридилоксипиразольным соединениям, которые ингибируют активность рецептора 1 трансформирующего фактора роста бета (TGFβR1) и имеют формулуИзобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, а также к способам применения указанных соединений для лечения рака, предпочтительно рака толстой кишки, меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака почки, глиобластомы, рака поджелудочной железы, миелодиспластического синдрома, рака легких и рака желудка и/или фиброза, предпочтительно фиброза печени и хронического заболевания почек.

Description

Изобретение относится к новым аминопиридилоксипиразольным соединениям, которые ингибируют активность рецептора 1 трансформирующего фактора роста бета (TGFpRl) и имеют формулу

031830 Bl

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, а также к способам применения указанных соединений для лечения рака, предпочтительно рака толстой кишки, меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака почки, глиобластомы, рака поджелудочной железы, мнелодиспластического синдрома, рака легких и рака желудка и/или фиброза, предпочтительно фиброза печени и хронического заболевания почек.

Изобретение относится к новым аминопиридилоксипиразольным соединениям, которые ингибируют активность рецептора 1 трансформирующего фактора роста бета (TGF3R1), к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, а также к способам применения указанных соединений для лечения рака, предпочтительно рака толстой кишки, меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы (НСС), рака почки, глиобластомы (GBM), рака поджелудочной железы, миелодиспластического синдрома (MDS), рака легких и рака желудка и/или фиброза, предпочтительно фиброза печени и хронического заболевания почек.

Трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета или TGF3) представляет собой многофункциональный цитокин, который связывается с гетеромерными комплексами серин/треонинкиназных рецепторов типа I и типа II TGF-бета и активирует указанный рецепторный комплекс TGF-бета, который фосфорилирует и активирует SMAD2 и SMAD3, которые далее связываются с SMAD4 и перемещаются в ядро, и регулируют экспрессию различных генов-мишеней. Основные участники пути передачи сигнала рецептора TGF-бета включают TGF31, TGF32, TGF33, TGF3R1, TGF3R2, SMAD, SnoN, SARA, SKI, DAB, TRAP, TAK1, SMIF, E2F4, E2F5, RBL1, RBL2, RB1, TFDP1, TFDP2, SMURF1, SMURF2, P300, СВР и JUN. SMAD-опосредованный путь рецептора TGF-бета регулирует различные кле'точные и физиологические процессы, такие как пролиферацию, дифференцировку, рост, миграцию, миелинизацию, арест клеточного цикла, апоптоз и развитие.

В данной области техники уже известны низкомолекулярные ингибиторы TGF3R1 для лечения рака и/или фиброза. См., например, публикации WO 2012/002680, WO 2009/022171, WO 2004/048382 и WO 2002/094833. К сожалению, известных радикальных средств для лечения многих типов рака или фиброза не существует. Было бы желательно располагать дополнительными низкомолекулярными ингибиторами TGF3R1 для лечения рака, предпочтительно рака толстой кишки, меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы (НСС), рака почки, глиобластомы (GBM), рака поджелудочной железы, миелодиспластического синдрома (MDS), рака легких и рака желудка и/или фиброза, предпочтительно фиброза печени и хронического заболевания почек, в частности, соединениями, которые более селективны в отношении TGF3R1. В настоящем изобретении предложено соединение формулы

R² представляет собой этил, трет-бутил, пиридин-2-ил, тетрагидропиран-4-ил, тетрагидрофуран-3ил, циклопропил или циклобутил; и

R³ представляет собой карбамоилфенил, пиридин-2-ил, (1-гидрокси-1-метилэтил)пиридинил, 1метил-2-оксо-1Н-пиридин-4-ил, 1-метилпиразолил, пиразин-2-ил, 2-метоксипиримидин-4-ил, 1-метил-2оксо-1Н-пиримидин-4-ил, пиридазин-3-ил, 6-хлорпиридазин-3-ил, 6-метилпиридазин-3-ил или 6метоксипиридазин-3-ил; или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении также предложен 2-{4-[(4-{[1-циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4ил)-1Н-пиразол-4-ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении также предложен 2-{4-[(4-{[1-циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4ил)-1Н-пиразол-4-ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол 4-метилбензолсульфонат.

В настоящем изобретении также предложен кристаллический 2-{4-[(4-{[1-циклопропил-3(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4-ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол 4метилбензолсульфонат. В настоящем изобретении также предложен кристаллический 2-{4-[(4-{[1циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4-ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2ил}пропан-2-ол 4-метилбензолсульфонат, характеризующийся дифрактограммой рентгеновской порошковой дифракции (излучение меди, λ-1,54060 А), содержащей пик при 17,8° с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 19,7°, 18,4° и 22,0° (2θ ± 0,2°).

В настоящем изобретении также предложен способ лечения рака, предпочтительно рака толстой кишки, меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы (НСС), рака почки, глиобластомы (GBM), рака поджелудочной железы, миелодиспластического синдрома (MDS), рака легких и рака желудка, у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества соединения или соли согласно настоящему изобретению.

В изобретении также предложен способ лечения фиброза, предпочтительно фиброза печени и хронического заболевания почек у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества соединения или соли согласно настоящему изобретению.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая соедине

- 1 031830 ние или соль согласно настоящему изобретению и одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, носителей или разбавителей.

В данном изобретении также предложено соединению или соль согласно настоящему изобретению для применения в терапии. Кроме того, в данном изобретении предложено соединение или соль согласно настоящему изобретению для применения для лечения рака, предпочтительно рака толстой кишки, меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы (НСС), рака почки, глиобластомы (GBM), рака поджелудочной железы, миелодиспластического синдрома (MDS), рака легких и рака желудка и/или фиброза, предпочтительно фиброза печени и хронического заболевания почек. Кроме того, в данном изобретении предложено применение соединения или соли согласно настоящему изобретению в производстве лекарственного средства для лечения рака, предпочтительно рака толстой кишки, меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы (НСС), рака почки, глиобластомы (GBM), рака поджелудочной железы, миелодиспластического синдрома (MDS), рака легких и рака желудка и/или фиброза, предпочтительно фиброза печени и хронического заболевания почек.

В следующих пунктах описаны предпочтительные классы согласно настоящему изобретению:

a) R¹ представляет собой дифторметил, дифторэтил или циклопропил;

b) R² представляет собой пиридин-2-ил, тетрагидропиран-4-ил или циклопропил;

c) R³ представляет собой карбамоилфенил или (1-гидрокси-1-метилэтил)пиридинил;

d) R¹ представляет собой циклопропил, и R² представляет собой тетрагидропиран-4-ил;

e) R¹ представляет собой циклопропил и R² представляет собой циклопропил;

f) R¹ представляет собой дифторэтил и R² представляет собой тетрагидропиран-4-ил;

g) R¹ представляет собой дифторметил и R² представляет собой пиридин-2-ил;

h) R¹ представляет собой циклопропил, R² представляет собой тетрагидропиран-4-ил и R³ представляет собой (1-гидрокси-1-метилэтил)пиридинил;

i) R¹ представляет собой циклопропил, R² представляет собой циклопропил и R³ представляет собой (1-гидрокси-1-метилэтил)пиридинил;

j) R¹ представляет собой дифторэтил, R² представляет собой тетрагидропиран-4-ил и R³ представляет собой (1-гидрокси-1-метилэтил)пиридинил; и

k) R¹ представляет собой дифторметил, R² представляет собой пиридин-2-ил и R³ представляет собой карбамоилфенил.

Читателю-специалисту в данной области техники будет понятно, что формы указанных соединений в виде свободных оснований согласно настоящему изобретению способны образовывать соли, и такие соли рассматриваются как часть настоящего изобретения. Соединения в форме свободных оснований согласно настоящему изобретению представляют собой амины, и соответственно реагируют с любой из числа неорганических и органических кислот с образованием фармацевтически приемлемых кислотноаддитивных солей. Такие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли и общая методология для их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, P.Stahl и др., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008); S.M.Berge и др., «Pharmaceutical Salts», Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977. Специалисту в данной области техники понятно, что стехиометрию соли можно легко определить. См., например, D. Risley и др., Simultaneous Determination of Positive and Negative Counterions Using a Hydrophilic Interaction Chromatography Method, LCGC NORTH AMERICA, Vol. 24, No. 8, August 2006, pages 776-785.

Некоторые из указанных соединений согласно настоящему изобретению являются кристаллическими. В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы относительные интенсивности дифракционных пиков могут варьироваться в зависимости от преимущественной ориентации из-за таких факторов, как морфология кристалла и гибитус. Там, где присутствуют эффекты предпочтительной ориентации, интенсивности пиков изменяются, однако не меняются характерные позиции пиков полиморфа. См., например, Фармакопея США № 23, Национальный формуляр № 18, стр. 1843-1844, 1995. Кроме того, в области кристаллографии также хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы угловые положения пиков могут слегка отличаться. Например, положения пиков могут смещаться из-за изменения температуры или влажности, при которых анализируется образец, смещения образца, или присутствия или отсутствия внутреннего стандарта. В данном случае варьирование положение пика ± 0,2 в 2Θ будет учитывать эти потенциальные изменения, не препятствуя однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы можно произвести на основе любой уникальной комбинации различающихся пиков (в единицах °2Θ), обычно более крупных пиков. Рентгеновские дифрактограммы кристаллических форм, полученные при температуре окружающей среды и относительной влажности, корректируют на основании стандартных пиков NIST 675 при 8,853 и 26,774 градусов 2-тета.

Указанные соединения согласно настоящему изобретению можно получить согласно следующим схемам синтеза при помощи способов, хорошо известных и признанных в данной области техники. Подходящие условия реакций для стадий данных схем хорошо известны в данной области техники и соот

- 2 031830 ветствующие замены для растворителей и сопутствующих реагентов известны специалистам в данной области техники. Подобным же образом специалистам в данной области техники будет понятно, что синтетические промежуточные соединения можно выделить и/или очистить путем различных хорошо известных методик при необходимости или при желании, и зачастую возможно применение различных промежуточных соединений непосредственно в последующих стадиях синтеза с небольшой очисткой или без нее. Более того, специалисту в данной области будет понятно, что в некоторых случаях порядок, в котором вводятся фрагменты, не имеет решающего значения. Конкретный порядок стадий, необходимый для получения указанных соединений согласно настоящему изобретению, зависит от конкретного синтезируемого соединения, исходного соединения и относительной лабильности замещенных остатков, что хорошо понятно специалисту в области химии. Все заместители, если не указано иное, представляют собой определенные выше заместители, и все реагенты хорошо известны и признаны в данной области техники.

Некоторые промежуточные соединения или соединения согласно настоящему изобретению могут иметь один или более хиральных центров. Настоящее изобретение включает все индивидуальные энантиомеры или диастереомеры, также как и смеси энантиомеров и диастереомеров указанных соединений, включая рацематы. Предпочтительно, чтобы соединения согласно настоящему изобретению, содержащие по меньшей мере один хиральный центр, существовали в виде одиночных энантиомеров или диастереомеров. Указанные одиночные энантиомеры или диастереомеры можно получить, начиная с хиральных реагентов или путем стереоселективных или стереоспецифичных синтетических методов. В качестве альтернативы указанные одиночные энантиомеры или диастереомеры можно выделить из смесей при помощи стандартных хиральных хроматографических методов или методами кристаллизации. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в некоторых случаях порядок элюирования энантиомеров или диастереомеров может быть различным вследствие различных хроматографических колонок и подвижных фаз.

Указание изомер 1 в названии соединения обозначает, что соответствующий интермедиат или соединение согласно настоящему изобретению является первым из двух элюированных энантиомеров, когда смесь пары энантиомеров разделяют при помощи хиральной хроматографии. Указание изомер 2 в названии соединения обозначает, что соответствующий интермедиат или соединение согласно настоящему изобретению является вторым из двух элюированных энантиомеров, когда смесь пары энантиомеров разделяют при помощи хиральной хроматографии.

Соединения согласно настоящему изобретению можно синтезировать так, как представлено на следующих схемах, где R¹, R² и R³ определены ранее.

Схема 1. Синтез соединений формулы I

На схеме 1 представлен общий синтез соединений формулы I. Соединение 1 подвергают взаимодействию с 2-хлорпиридин-4-олом в подходящем растворителе, таком как диметилформамид (ДМФА) или ацетон, с подходящим основанием, таким как карбонат цезия или карбонат калия, при комнатной температуре или при повышенной температуре с получением соединения 2. Соединение 2 подвергают взаимодействию с Щ-диметокси-Ыф-диметилметанамином при повышенной температуре с образованием соединения 3. Можно произвести очистку соединения 3 или применять его без дополнительной очистки для осуществления взаимодействия с гидразином в уксусной кислоте с получением соединения 4. Соединение 4 можно подвергать взаимодействию с подходящим для алкилирования реагентом, таким как алкилтрифторборат калия или алкилбороновая кислота, в условиях реакции сочетания Чана-Лама (Chan-Lam coupling) с образованием соединения 5. Более конкретно, суспензию 2,2'-бипиридина и ацетата меди (II) в подходящем растворителе, таком как 1,2-дихлорэтан, изначально нагревают до повышенной температуры и продувают азотом, и далее указанную реакционную смесь фильтруют и указанный фильтрат добавляют к смеси соединения 4, подходящего бороната, такого как алкилтрифторборат калия или алкилбороновая кислота, и подходящего основания, такого как карбонат натрия, в подходящем рас

- 3 031830 творителе, таком как 1,2-дихлорэтан. Указанную реакционную смесь нагревают до повышенной температуры с получением соединения 5. Соединение 4 также можно подвергать взаимодействию с подходящим алкилгалогенидом, таким как алкилиодидом, алкилбромидом или алкилхлоридом, с подходящим основанием, таким как гидрид натрия, в подходящем растворителе, таком как ДМФА или тетрагидрофуран (ТГФ), с получением соединения 5. Соединение 5 подвергают взаимодействию с подходящим амином в известных условиях реакции сочетания Бухвальда (Buchwald coupling) с получением соединения формулы I. Более конкретно соединение 5 подвергают взаимодействию с подходящим амином при повышенной температуре в присутствии подходящего основания, такого как карбонат цезия, подходящего лигандного реагента, такого как 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен, и подходящего катализатора, такого как ацетат палладия (II), в подходящем растворителе, таком как 1,4-диоксан, с получением соединения формулы I.

Схема 2. Синтез соединений формулы I, когда R¹ представляет собой Н

показано на стадии 4 схемы 1, когда алкилирующим реагентом является 2-(триметилсилил)этоксиметилхлорид, соединение 6 может быть получено при помощи алкилирования в соответствии со стадией 4 и реакцией сочетания Бухвальда в соответствии со стадией 5. Соединение 6 можно подвергать взаимодействию с триэтилсиланом в трифторуксусной кислоте с получением соединения формулы I, в которой R¹ представляет собой Н. Когда R¹ представляет собой Н, специалистам в данной области техники известно, что соединение формулы I может существовать в виде пары таутомеров, в которых водород может перемещаться между двумя атомами азота на пиразольном кольце.

Схема 3. Синтез соединений формулы I, когда R³ представляет собой (карбамоил)фенил

‘ Формула I

R³ представляет собой (карбамоил)фенил

На схеме 3 представлен общий синтез соединений формулы I, когда R³ представляет собой (карбамоил)фенильную группу. Соединение 7 можно получить при помощи способа, представленного на стадии 5 схемы 1, когда R³ представляет собой подходящим образом замещенный бензонитрил. Соединение 7 подвергают взаимодействию с пероксидом водорода и подходящим основанием, таким как карбонат калия, в диметилсульфоксиде (ДМСО) с получением соединения формулы I, когда R³ представляет собой (карбамоил)фенильную группу.

В контексте настоящего описания следующие термины имеют следующие значения: ACN относится к ацетонитрилу; БСА относится к бычьему сывороточному альбумину; ДХМ относится к дихлорметану; ДМФА обозначает К^диметидформамид; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; ДТТ относится к дитиотреитолу; EDTA относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; EGTA относится к этиленгликольтетрауксусной кислоте; ИФА относится к иммуноферментному анализу; EtOAc относится к этилацетату; EtOH относится к этанолу; ФБС относится к фетальной бычьей сыворотке; ГЭЦ относится к гидроксиэтилцеллюлозе; ВЭЖХ относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии; IVTI относится к целевому ингибированию in vivo; MC относится к массспектроскопии; МеОН относится к метанолу; ЯМР обозначает ядерный магнитный резонанс; ТГФ относится к тетрагидрофурану; TBS относится к Трис-буферному солевому раствору; TED относится к пороговой эффективной дозе; УФВ относится к длине волны ультрафиолетовой области и XRD относится к рентгеновской порошковой дифракции.

Если не указано иное, то соединения, представленные в данном описании, названы и пронумерованы с применением либо ACDLABS, либо Accelrys Draw 4.1.

Пример получения 1. 2-(4-Бром-2-пиридил)пропан-2-ол

- 4 031830

Трехлитровую трехгорлую круглодонную колбу оснащают капельной воронкой, обратным холодильником, входным отверстием для азота и датчиком температуры. Вносят метилмагнийбромид (3,2М в 2-метилтетрагидрофуране, 239,07 мл, 765,01 ммоль) и охлаждают на ледяной бане. В капельную воронку добавляют раствор этил-4-бромпиридин-2-карбоксилата (80,0 г, 347,73 ммоль) в ТГФ (800,0 мл). Указанный раствор добавляют по каплям к раствору метилмагнийбромида, поддерживая при этом внутреннюю температуру ниже 25°С. Охлаждающую баню удаляют и осуществляют перемешивание при 25°С в течение 30 мин. Указанную реакционную смесь охлаждают до 5°С и реакцию осторожно гасят добавлением по каплям водного раствора соляной кислоты (1М), поддерживая при этом внутреннюю температуру ниже 30°С. Дополнительный водный раствор соляной кислоты (1М) добавляют до тех пор, пока значение рН указанной смеси не достигнет порядка 7. Охлаждающую баню удаляют и разбавляют этилацетатом (EtOAc, 200 мл). Органический слой отделяют, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют через слой CELITE® и промывают EtOAc. Указанный фильтрат концентрируют с получением масла оранжевого цвета. Очищают при помощи слоя силикагеля путем элюирования смесью гексан/EtOAc (3/1) с получением указанного в заголовке соединения (63,15 г, выход 84,0%) в виде бесцветного масла. МС (m/z): 216/218 (М+1/М+3).

Следующее соединение получают, по существу, при помощи способа согласно примеру получения 1.

Таблица 1

№ примера получения	Химическое наименование	Структура	Физические данные
2	2-(5-бром-2- пиридил)пропан-2-ол	но^]	МС (m/z): 216/218 (М+1/М+3)

Пример получения 3. 2-(4-Амино-2-пиридил)пропан-2-ол

В двухлитровый реактор Парра вносят стержень магнитной мешалки, медь (просеянный порошок, 12,6 г, 198,6 ммоль), 2-(4-бром-2-пиридил)пропан-2-ол (63,1 г, 292,0 ммоль) и гидроксид аммония (28 мас./мас.% в воде, 757,2 мл). Указанную реакционную смесь перемешивают под открытым воздухом в течение 30 мин, пока она не станет темно-синей. Стержень магнитной мешалки удаляют, сверху прикрепляют устройство для механического перемешивания, герметично закрывают и размещают на мешалке. Указанную смесь нагревают до 100°С (внутренняя нагревающая баня при 120°С) и перемешивают в течение ночи. Указанную реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют 2метилтетрагидрофуран (600 мл). Фильтруют через слой CELITE® и промывают 2метилтетрагидрофураном. Органический слой отделяют и водный слой подвергают экстракции посредством 2-метилтетрагидрофурана (200 мл). Органические слои объединяют и сушат над безводным сульфатом натрия. Фильтруют, концентрируют и сушат под вакуумом в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (31,3 г, выход 70,4%) в виде желтого масла. МС (m/z): 153 (М+1).

Следующее соединение получают, по существу, при помощи способа согласно примеру получения 3.

Таблица 2

№ примера получения	Химическое наименование	Структура	Физические данные
4	2-(5-амино-2- пиридил)пропан-2-ол	Ηθη	МС (m/z): 153 (М+1)

Пример получения 5. 2-Бром-1-тетрагидропиран-4-илэтанон

Способ 1. К смеси тетрагидропиран-4-карбоновой кислоты (39,13 г, 300,67 ммоль) в ДХМ (250 мл) и ДМФА (15 капель) добавляют оксалилхлорид (28,69 мл, 330,73 ммоль). Указанную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 ч в атмосфере азота. Концентрируют при пониженном давлении и остаток растворяют в ДХМ (250 мл). Полученный раствор по каплям добавляют к (триметил

- 5 031830 силил)диазометану (2М в гексане, 450 мл, 900,00 ммоль) при -10°С и указанную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь охлаждают до 0°С и по каплям добавляют бромистоводородную кислоту (48 мас./мас.% в воде, 52 мл, 462,73 ммоль). Указанную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение двух часов. Смесь охлаждают до 0°С и по каплям добавляют бромистоводородную кислоту (48 мас./мас.% в воде, 26 мл, 231,36 ммоль). Указанную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение двух часов. Добавляют воду (250 мл), ДХМ (250 мл) и отделяют органический слой. Водный слой подвергают экстракции посредством ДХМ (2x250 мл). Органические слои объединяют и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (58,2 г, выход 93,48%) в виде коричневого твердого вещества. ¹И-ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 4,00 (m, 2H), 3,95 (s, 2H), 3,45 (m, 2H), 2,98 (m, 1H), 1,78 (m, 4H).

Способ 2. Раствор 1-тетрагидропиран-4-илэтанона (10 г, 78,02 ммоль) в метаноле (МеОН, 50 мл) охлаждают до температуры -10°С. По каплям добавляют бром (4,01 мл, 78,02 ммоль). Указанную смесь перемешивают при 0°С в течение 45 мин и далее при 10°С в течение 45 мин. Добавляют водный раствор серной кислоты (11M, 27,5 мл, 302,50 ммоль) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Добавляют воду и три раза подвергают экстракции посредством диэтилового эфира. Указанные органические слои объединяют. Промывают водным раствором бикарбоната натрия и водой. Сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (12 г, выход 74,28%) в виде белого твердого вещества. Ή-ЯМР (400,13 МГц, CDCl₃) δ 4,00 (m, 2H), 3,95 (s, 2H), 3,45 (m, 2Н), 2,98 (m, 1H), 1,78 (m, 4H).

Пример получения 6. 2-[(2-Хлор-4-пиридил)окси]-1-тетрагидропиран-4-илэтанон

Способ 1. К перемешиваемой смеси 2-хлорпиридин-4-ола (13,85 г, 106,91 ммоль) и карбоната цезия (69,67 г, 213,82 ммоль) в ДМФА (380 мл) по каплям добавляют раствор 2-бром-1-тетрагидропиран-4илэтанона (24,35 г, 117,60 ммоль) в ДМФА (50 мл) при комнатной температуре. Указанную полученную смесь перемешивают при 90°С в течение 2,5 ч. Охлаждают до комнатной температуры с получением неочищенной смеси. Объединяют с неочищенной смесью, полученной при проведении реакции в другом масштабе (2,85 г 2-хлорпиридин-4-ола), как указано выше. Указанную комбинированную смесь разводят водой (200 мл) и EtOAc (300 мл). Органический слой отделяют и водный слой подвергают экстракции посредством EtOAc (3x250 мл). Указанные органические слои объединяют и промывают водой (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (100 мл). Сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и указанный фильтрат концентрируют при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (29,32 г, выход 88,96%) в виде коричневого масла. МС (m/z): 256 (М+1).

Способ 2. К раствору 2-хлорпиридин-4-ола (6,40 г, 48,42 ммоль) в ацетоне (150 мл) добавляют 2бром-1 -тетрагидропиран-4-илэтанон (10,03 г, 48,42 ммоль) и карбонат калия (10,14 г, 72,62 ммоль) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Фильтруют для удаления твердого вещества и указанное твердое вещество промывают ДХМ. Указанный фильтрат концентрируют при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в количественном отношении. МС (m/z): 256 (М+1).

Следующие соединения получают, по существу, при помощи способа 2 согласно примеру получения 6.

Таблица 3

- 6 031830

№ примера получения	Химическое наименование	Структура	Физические данные МС (m/z)
7	1-[(2-хлор-4- пиридил)окси] бутан-2-он	о о	200 (М+1)
8	2- [(2-хлор-4-пиридил)окси] 1-таетрагидрофуран-Зилэтанон	г-° ΟγΟ	242 (М+1)
9	1 - [(2-хлор-4-пиридил)окси] - 3,3 -диметилбутан-2-он	о о	228 (М+1)
10	2- [(2-хлор-4-пиридил)окси] - 1 -циклобутилэтанон	0°^ О о	226 (М+1)
И	2- [(2-хлор-4-пиридил)окси] - 1 -циклопропилэтанон	о о	212 (М +1)
12	2- [(2-хлор-4-пиридил)окси] - 1 -(2-пир идил)этанон	О о	249 (М+1)

Пример получения 13. 2-Хлор-4-[(3-тетрагидропиран-4-ил-1Н-пиразол-4-ил)окси]пиридин

Смесь 2-[(2-хлор-4-пиридил)окси]-1-тетрагидропиран-4-илэтанона (29,3 г, 114,59 ммоль) и 1,1диметокси-Х.Х-диметилметанамина (65 мл, 486,83 ммоль) перемешивают при 100°С в течение двух часов. Охлаждают до комнатной температуры, концентрируют при пониженном давлении и указанный остаток растворяют в EtOAc (400 мл). Промывают водой (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (100 мл). Сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении с получением коричневого твердого вещества. Растворяют в уксусной кислоте (350 мл) и охлаждают до 0°С. Добавляют моногидрат гидразина (16,8 мл, 345,66 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи в атмосфере азота. Указанную смесь наливают в смесь лед/вода (250 мл) и подвергают экстракции посредством EtOAc (4x200 мл). Органические слои объединяют и промывают водой (200 мл), насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (100 мл). Сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и указанный фильтрат концентрируют при пониженном давлении с получением масла коричневого цвета. Указанное коричневое масло очищают с применением слоя силикагеля путем элюирования EtOAc. Соответствующие фракции объединяют и концентрируют при пониженном давлении. Сушат в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (24,43 г, выход 76,22%) в виде желтого твердого вещества. МС (m/z): 280 (М+1).

Следующие соединения получают, по существу, при помощи способа согласно примеру получения 13.

- 7 031830

Таблица 4

№ получения	Химическое наименование	Структура	Физические данные МС (m/z)
14	2-хлор-4-[(3 -этил-1Нпиразол-4ил)окси]пиридин	с 1 NH Λ	224 (М+1)
15	2-хлор-4-[(3тетрагидрофуран-3 -ил1Н-пиразол-4ил)окси]пиридин	0XNH	266 (М+1)
16	4- [(3 -т/?еот-бути л-1Нпиразол-4-ил)окси] -2хлорпиридин	0ΧΝΗ α-ό	252 (М+1)
17	2-хлор-4-[(3-циклобутил1Н-пиразол-4ил)окси]пиридин	% / N Η	250 (М+1)
18	2-хлор-4-[(3циклопропил- 1Нпиразол-4ил)окси]пиридин	οΧνη	236 (М+1)
19	2-хлор-4-[[3-(2- пирид ил)-1 Н-пиразол-4ил]окси]пиридин	G οΧατ5	273 (М+1)

Пример получения 20. 2-Хлор-4-(1-циклопропил-3-тетрагидропиран-4-илпиразол-4-ил)оксипиридин

Способ 1. Смесь 2,2'-бипиридина (13,73 г, 87,90 ммоль) и ацетата меди (II) (15,97 г, 87,90 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (244,3 мл) нагревают с обратным холодильником при 75°С в течение 25 мин и далее охлаждают до комнатной температуры. Добавляют раствор 2-хлор-4-[(3-тетрагидропиран-4-ил-1Н-пиразол4-ил)окси]пиридина (24,43 г, 79,91 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (335,30 мл), далее добавляют циклопропилбороновую кислоту (13,73 г, 159,82 ммоль) и карбонат натрия (16,94 г, 159,82 ммоль). Указанную реакционную смесь нагревают при 75°С в течение двух часов в атмосфере кислорода и охлаждают до комнатной температуры. Разбавляют EtOAc (200 мл), фильтруют через слой силикагеля и промывают EtOAc (250 мл). Указанный фильтрат промывают водой (200 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (200 мл). Сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и указанный фильтрат концентрируют при пониженном давлении, и указанный остаток высушивают в вакууме при комнатной температуре в течение ночи. Очищают при помощи колоночной хроматографии на силикагеле с 6-27% EtOAc в ДХМ с получением указанного в заголовке соединения (20,75 г, выход 81,2%) в виде желтого твердого вещества. МС (m/z): 320 (М+1).

Способ 2. Суспензию 2,2'-бипиридина (28,8 г, 56,5 ммоль) и ацетата меди (II) (8,2 г, 45,2 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (50 мл) нагревают до 70°С и продувают азотом в течение 3 мин. Фильтруют и указанный фильтрат добавляют к смеси 2-хлор-4-[(3-тетрагидропиран-4-ил-1И-пиразол-4-ил)окси]пиридина (8 г, 22,6 ммоль), циклопропил(трифтор)бората калия (6,7 г, 45,2 ммоль) и карбоната натрия (4,8 г, 45,2 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (50 мл). Указанную реакционную смесь нагревают при 70°С в течение четырех дней. Охлаждают до комнатной температуры. Фильтруют и промывают ДХМ. Указанный фильтрат промывают насыщенным водным раствором хлорида аммония и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и указанный фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Очищают при помощи колоночной хроматографии на силикагеле с 1-10%

- 8 031830

МеОН в ДХМ с получением указанного в заголовке соединения (6,0 г, выход 82,2%). МС (m/z): 320 (М+1).

Следующие соединения получают, по существу, при помощи способа 1 согласно примеру получения 20. Указано изменение в процедуре выделения продукта реакции.

Таблица 5

№ примера получения	Химическое наименование	Структура	Физические данные МС (m/z)	Примечание
21	2-хлор-4-(3 -циклобутил- 1 -циклопропилпиразол- 4-ил)оксипиридин	.7	290 (М+1)
22	2-хлор-4-(1,3- дициклопропилпиразол- 4-ил)оксипиридин	Cl^lA	276 (М+1)

23

2-хлор-4-[1циклопропил-3 -(2пиридил)пиразол-4ил] оксипиридин

О oX'N^ 01х4 ГГ

313 (М+1)

Применяют 23% гидроксид аммония в воде, чтобы погасить указанную реакцию.

Следующие соединения получают, по существу, при помощи способа 2 согласно примеру получения 20.

Таблица 6

№ примера получения	Химическое наименование	Структура	Физические данные МС (m/z)
24	2-хлор-4-(1-циклопропил- 3 -этилпиразол-4ил)оксипиридин	oVN-<l c+SA	264 (М+1)
25	2-хлор-4-(1-циклопропил- 3 -тетрагидрофуран-3 илпиразол-4ил)оксипиридин		306 (М+1)
26	4-(3 -/77/ХТМ-буТИЛ-1 циклопропилпиразол-4ил)окси-2-хлорпиридин		292 (М+1)

Пример получения 27. 2-Хлор-4-(1-циклопропил-3-тетрагидрофуран-3-илпиразол-4-ил)оксипиридин, изомер 1

Рацемическую смесь 2-хлор-4-(1-циклопропил-3-тетрагидрофуран-3-илпиразол-4-ил)оксипиридина (пример получения 25) очищают при помощи хиральной хроматографии с получением первого элюирующего энантиомера в качестве указанного в заголовке соединения. МС (m/z): 306 (М+1).

Условия очистки: CHIRALPAK® IC; подвижная фаза: 20% этанола (EtOH) в диоксиде углерода; скорость потока: 300 г/мин; УФВ: 240 нм; время удерживания: 2,44 мин.

Пример получения 28. 2-Хлор-4-(1-циклопропил-3-тетрагидрофуран-3-илпиразол-4-ил)оксипиридин, изомер 2

- 9 031830

Рацемическую смесь 2-хлор-4-(1-циклопропил-3-тетрагидрофуран-3-илпиразол-4-ил)оксипиридина (пример получения 25) очищают при помощи хиральной хроматографии с получением второго элюирующего энантиомера в качестве указанного в заголовке соединения. МС (m/z): 306 (М+1).

Условия очистки: CHIRALPAK® IC; подвижная фаза: 20% этанола (EtOH) в диоксиде углерода; скорость потока: 300 г/мин; УФВ: 240 нм; время удерживания: 2,93 мин.

Пример получения 29. 2-Хлор-4-[1-(дифторметил)-3-(2-пиридил)пиразол-4-ил]оксипиридин

На ледяной бане охлаждают раствор 2-хлор-4-[[3-(2-пиридил)-Ш-пиразол-4-ил]окси]пиридина (2,0 г, 7,33 ммоль) в ДМФА (73,34 мл) и порционно добавляют гидрид натрия (60% в минеральном масле, 880,02 мг, 22,00 ммоль). Указанную смесь перемешивают при 0°С в течение 10 мин, позволяют ей нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 10 мин. Добавляют дифториодметан (10 мас.% в ТГФ, 27,19 мл, 36,67 ммоль) и указанную реакционную смесь перемешивают при 45°С в течение ночи. Охлаждают до комнатной температуры и разбавляют EtOAc. Промывают 5% водным раствором хлорида лития и далее промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия. Сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и указанный фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Указанный остаток очищают при помощи колоночной хроматографии на силикагеле с 0-50% EtOAc в ДХМ. Соответствующие фракции объединяют и концентрируют при пониженном давлении. Указанный остаток очищают при помощи колоночной хроматографией на силикагеле с 0-10% EtOAc в ДХМ с получением указанного в заголовке соединения (1,56 г, выход 65,9%). МС (m/z): 323 (М+1).

Следующие соединения получают, по существу, при помощи способа согласно примеру получения 29. Указаны изменения в растворителе, основании и/или температуре реакции.

Таблица 7

№ примера получения	Химическое наименование	Структура	Физические данные	Примечание
30	2-хлор-4-[3циклопропил-1 (дифторметил)пиразол4-ил] оксипиридин	F А	МС (m/z): 286 (М+1)	ТГФ, mpemбутоксид калия
31	2-хлор-4-[1(дифторметил)-З тетрагидропиран-4илпиразол-4ил ] оксипиридин	+.. . Хч А	Ή-ήμρ (399,83 МГц, ДМС0-7Д δ 8,42 (s, 1Н), 8,30 (d, J=5,6 Гц, 1H), 7,71 (t, J=59,2 Гц, 1H), 7,15 (d, >2,4 Гц, 1H), 7,04 (dd, >2,4 Гц, >5,6 Гц, 1H), 3,81 (m, 2H), 3,33 (m, 2H), 2,80 (m, 1H), 1,64 (m, 4H).

- 10 031830

32	2-хлор-4-[1- (дифторметил)-Зтетрагидрофуран-3илпиразол-4ил] оксипиридин	Ч-., /5	Ή-ЯМР (399,83 МГц, ДМСО-Je) δ 8,46 (s, 1H), 8,30 (d, J=5,6 Гц, 1H), 7,71 (t, J=59,2 Гц, 1H), 7,16 (d, J=2,4 Гц, 1H), 7,05 (dd, J=2,4 Гц, J=5,6 ГЦ, 1H), 3,89 (t, J= 6,0 Гц, 1H), 3,68 (m, 3H), 3,26 (m, 1H), 2,12 (m, 1H), 1,99 (m, 1H).
33	2-хлор-4-[3циклобутил-1 (дифторметил)пиразол4-ил] оксипиридин	4»“, F	MC (m/z): 300 (M+1)
34	2-хлор-4-[ 1 -изопропил- 3 -(2-пир ид ил)пиразол- 4-ил] оксипиридин	о	MC (m/z): 315 (M+1)	ТГФ, mpemбутоксид калия, нагревание с обратным холодильником в течение ночи
35	2-хлор-4-(3циклопропил-1изопропилпиразол-4ил)оксипиридин	Y ч	MC (m/z): 278 (M+1)	комнатная температура
36	2-хлор-4-( 1 -изопропил- 3 -тетрагидропиран-4илпиразол-4ил)оксипиридин	Ч-~< Ч	MC (m/z): 322 (M+1)	комнатная температура
37	2-хлор-4-(3циклобутил-1изопропилпиразол-4ил)оксипиридин	Ч-ч .4	MC (m/z): 292 (M+1)	комнатная температура
38	2-хлор-4-[ 1-(2,2дифторэтил)-3 -(2пиридил)пиразол-4- ил] оксипиридин	Q N F b cian^	MC (m/z): 337 (M+1)	ТГФ, третбутоксид калия, 50°С
39	2-хлор-4-[3циклопропил-1-(2,2дифторэтил)пиразол-4ил] оксипиридин	Ч-+ Cl	MC (m/z): 300 (M+1)	карбонат цезия, 50°С
40	2-хл ор-4-[ 1-(2,2- дифторэтил)-3тетрагидропиран-4илпиразол-4ил] оксипиридин	Cl-^rr	MC (m/z): 344 (M+1)	карбонат цезия, 50°С

- 11 031830

Пример получения 41. 2-Хлор-4-{[3-(пиридин-2-ил)-1-{[2-(триметилсилил)этокси]метил}-1Н-пиразол-4-ил]окси}пиридин

К раствору 2-хлор-4-[[3-(2-пиридил)-Ш-пиразол-4-ил]окси]пиридина (3,0 г, 11,00 ммоль) в ТГФ (110 мл) добавляют гидрид натрия (60% суспензия в минеральном масле, 484 мг, 12,10 ммоль) при 0°С. Перемешивают в течение 15 мин при 0°С и добавляют 2-(триметилсилил)этоксиметилхлорид (2,02 г, 12,10 ммоль). Указанную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Указанную смесь концентрируют. Указанный остаток распределяют между ДХМ и водой. Органический слой отделяют и сушат над сульфатом натрия. Указанную смесь фильтруют и указанный фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Указанный остаток очищают при помощи колоночной хроматографией на силикагеле с 0-30% EtOAc в гексане с получением указанного в заголовке соединения (3,64 г, выход 82,1%). МС (m/z): 403 (М+1).

Пример получения 42. 4-[[4-(1-Циклопропил-3-тетрагидропиран-4-ил-пиразол-4-ил)окси-2-пиридил] амино]бензонитрил

Раствор 2-хлор-4-(1-циклопропил-3-тетрагидропиран-4-илпиразол-4-ил)оксипиридина (400 мг, 1,2 ммоль), n-аминобензонитрила (219,9 мг, 1,9 ммоль), карбоната цезия (568,5 мг, 1,7 ммоль), 4,5бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантена (134,6 мг, 0,23 ммоль) в 1,4-диоксане (15 мл) продувают азотом в течение 5 мин. Полученную смесь обрабатывают ацетатом палладия (II) (26,1 мг, 0,12 ммоль) и продувают азотом в течение 5 мин. Флакон закрывают и перемешивают при 100°С в течение двух часов и далее при 80°С в течение выходных. Охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через слой

CELITE® и промывают 5% МеОН в ДХМ. Указанный фильтрат концентрируют с получением указанного в заголовке соединения (467 мг, выход 100%). МС (m/z): 402 (М+1).

Следующие соединения получают, по существу, при помощи способа согласно примеру получения 42. Указаны изменения в катализаторе и/или растворителе.

Таблица 8

№ пример а получе НИЯ

Химическое наименование

Структура

Физичес кие данные МС (m/z)

Примечание

- 12 031830

43	2-[5-[[4-[3-(2пиридил)-1-(2триметилсилилэтокси метил)пиразол-4ил]окси-2пирид ил] амино] -2пирид ил] пропан-2-ол	L \ OH 0 H	519 (M+l)	трис(дибензи лиденацетон) дипалладий (0), толуол
44	Метил-4-[[4-(3циклопропил-1изопропилпиразол-4ил)окси-2пиридил] амино] пир ид ин-2-карбоксилат	° Ji #3 J H	394 (M+l)	трис(дибензи лиденацетон) дипалладий (0), толуол
45	4-[[4-[1-изопропил-3(2-пиридил)пиразол-4ил]окси-2пиридил] амино] бензо нитрил	if^N J4 lii H	397 (M+l)
46	3 -[ [4-( 1 -циклопропил- 3 -тетрагидропиран-4илпиразол-4-ил)окси2пиридил] амино] бензо нитрил	4”	402 (M+l)
47	4-((4-(1 -циклопропил- 3 -этил-пиразол-4ил)окси-2пиридил] амино] бензо нитрил	H	346 (M+l)
48	4-[[4-[1- (дифторметил)-З тетрагидропиран-4илпиразол-4-ил] окси2пиридил] амино] бензо нитрил	. H	412 (M+l)
49	N-[4-[l- (дифторметил)-З тетрагидрофуран-3илпиразол-4-ил] окси2-пиридил] пиридазин3-амин	u H	375 (M+l)	трис(дибензи лиденацетон) дипалладий (0)
50	2-(4-((4-(1циклопропил-3тетрагидрофуран-3илпиразол-4-ил)окси2-пиридил] амино] -2пирид ил] пропан-2-ол	CU C+n HO^| h	422 (M+l)
51	4-[[4-[3-циклобутил-1(дифторметил)пиразо л-4-ил]окси-2пиридил] амино] бензо нитрил	N °>^/ F H	382 (M+l)
52	3-((4-(1- (д ифторметил)-3 -(2пиридил)пиразол-4ил]окси-2пиридил] амино] бензо нитрил	ib F N \ 'N—( III F oU H	405 (M+l)
53	4-((4-(1,3дициклопропилпиразо л-4-ил)окси-2пиридил] амино] бензо нитрил	. u H	358 (M+l)

Пример 1. 2-{4-[(4-{[1-Циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4-ил]окси}пири

- 13 031830 дин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол

Способ 1. Раствор 2-хлор-4-(1-циклопропил-3-тетрагидропиран-4-илпиразол-4-ил)оксипиридина (45,6 г, 142,6 ммоль), 2-(4-амино-2-пиридил)пропан-2-ола (26,0 г, 171,1 ммоль) и фенолята натрия (26,5 г, 228,2 ммоль) в 1,4-диоксане (456 мл) продувают азотом в течение 20 мин. Полученную смесь обрабатывают 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантеном (8,25 г, 14,3 ммоль) и бис(дибензилиденацетон)палладием (4,10 г, 7,13 ммоль). Нагревают с обратным холодильником в течение 21 ч. Указанную реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Смесь фильтруют через слой CELITE® и промывают ДХМ (500 мл). Указанный фильтрат концентрируют на силикагеле. Очищают при помощи колоночной хроматографии на силикагеле с 0-10% МеОН в EtOAc. Соответствующие фракции концентрируют и сушат под вакуумом в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (58,7 г, выход 91,7%). МС (m/z): 436 (М+1). С применением описанного выше способа получают несколько порций указанного продукта. Объединенные порции указанного в заголовке соединения (92,4 г) растворяют в EtOH (1 л). Указанный раствор обрабатывают QUADRASIL® МР (100 г, 1,0-1,5 ммоль/г) и перемешивают при 60°С в течение одного часа. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют, чтобы удалить твердые вещества. Концентрируют для удаления растворителя. Указанный остаток растворяют в EtOH (500 мл) при нагревании при 100°С. Далее указанную смесь медленно охлаждают до комнатной температуры и медленно добавляют воду (500 мл). Указанную смесь при перемешивании охлаждают до 5°С. Твердое вещество отбирают путем фильтрования и сушат под вакуумом при 45°С в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (81,8 г). МС (m/z): 436 (М+1).

Способ 2. Во флаконе с 1,4-диоксаном (15 мл) растворяют 2-хлор-4-(1-циклопропил-3-тетрагидропиран-4-илпиразол-4-ил)оксипиридин (400 мг, 1,2 ммоль). Добавляют 2-(4-амино-2-пиридил)пропан-2ол (266,5 мг, 1,6 ммоль), карбонат цезия (568,5 мг, 1,7 ммоль), 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен (134,6 мг, 0,23 ммоль) и продувают азотом в течение 5 мин. Добавляют ацетат палладия (II) (26,1 мг, 0,12 ммоль) и продувают азотом в течение 5 мин. Флакон герметично закрывают и перемешивают при 100°С в течение ночи. Указанную реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, филь труют через слой CELITE® и промывают 5% МеОН в ДХМ. Концентрируют и очищают при помощи хроматографии с обращенной фазой (высокопроизводительная колонка С18 Redisep Rf Gold с обращенной фазой, 0-100% муравьиная кислота/ацетонитрил (ACN) в смеси муравьиная кислота/вода). Соответствующие фракции концентрируют и сушат по вакуумом с получением указанного в заголовке соединения (341 мг, выход 67,3%). МС (m/z): 436 (М+1).

Следующие соединения получают, по существу, при помощи способа 2 согласно примеру 1. Указаны изменения в основании, катализаторе, лиганде и/или растворителе.

Таблица 9

№ прим ера

Химическое наименование

Структура

Физичес кие данные

Примечание

- 14 031830

			MC (m/z)
2	Ν-(4-{[1- (д ифторметил)-3 (пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)-6метоксипиридазин-3 амин	F Хм ^0 % Yss Η	412 (M+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й
3	Ν-(4-{[1- (д ифторметил)-3 (пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)-2метоксипиримидин-4амин	MMn F LX '''O F n+n As, H	412 (M+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й
4	4- {[ 1 -(д ифторметил)-3 (пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4-ил] окси } -N(пиридин-2ил)пиридин-2-амин	ex %+A^n f O^7 F (j* ό h	381 (M+1)
5	6-χπορ-Ν-(4-{[1циклопропил-3 (тетрагидро-2Н-пиран4-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2 ил)пиридазин-3 -амин	О \=z IZ 1—0 Z'Z A	413 (M+1)
6	N-(4- {[ 1 -циклопропил3 -(тетрагидро-2Нпиран-4-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)-6метоксипиридазин-3 амин	Ca Xn-< Ύχ Λ H	409 (M+1)
7	N-(4- {[ 1 -циклопропил- 3 -(тетрагидро-2Нпиран-4-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)-6-метилпиридазин3-амин	YN Λ H	393 (M+1)

- 15 031830

8	N-(4- {[ 1 -циклопропил3 -(тетрагидро-2Нпиран-4-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2 ил)пиразин-2-амин	Си oXN-< ιί^7 Λ Η	379 (M+1)
9	2-{2-[(4-{[1циклопропил-3 (тетрагидро-2Н-пиран4-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пиридин-2ил)aминo]πиpидин-4ил}пропан-2-ол	Си. οΧΝ-<	436 (M+1)
10	4-{[1-(2,2- дифторэтил)-3(пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4-ил] окси } -N(1 -метил-1 Н-пиразол3 -ил)пирид ин-2-амин	y_F Η	398 (M+1)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й
11	4-{[1-(2,2- дифторэтил)-3(пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4-ил] окси } -N(1 -метил-1 Н-пиразол4-ил)пиридин-2-амин	Q F r= )-F H	398 (M+1)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й
12	2-{5-[(4-{[1-(2,2- дифторэтил)-3(пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	H	453 (M+1)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й
13	4- {[ 1 -(д ифторметил)-3 (пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4-ил] окси } -N(1 -метил-1 Н-пиразол5-ил)пиридин-2-амин	pN F F 1 h	384 (M+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й
14	4- {[ 1 -(д ифторметил)-3 (пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4-ил] окси } -N(1 -метил-1 Н-пиразол4-ил)пиридин-2-амин	CX N F Хч F xxxb H	384 (M+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й

- 16 031830

15	Ν-(4-{[1- (д ифторметил)-3 (пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2 ил)пиридазин-3 -амин		,ώ н	F Μ F	382 (M+l)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й
	2-{6-[(4-{[1-
	циклопропил-3-			-N
	(пиридин-2-ил)-1Н-			429
16	пиразол-4- ил] окси } пиридин-2-	но 1	1 А		(M+l)
	ил)амино]пир идин-3 -		Н
	ил}пропан-2-ол
	2-{5-[(4-{[1циклопропил-3-		Q
	(пиридин-2-ил)-1Н-		0^		429
17	пиразол-4- ил] окси } пиридин-2-	но 1	1 А		(M+l)
	ил)амино]пиридин-2-	Н
	ил}пропан-2-ол
	2-{4-[(4-{[1-		О
	циклопропил-3 -			N
	(пиридин-2-ил)-1Н-		0^		429
18	пиразол-4- ил] окси } пиридин-2-		L А		(M+l)
	ил)амино]пиридин-2-	он	н
	ил}пропан-2-ол
	2- { 6- [(4- {[ 1 -(пропан-2-		о
	ил)-3 -(пир ид ин-2-ил)-					фенолят натрия,
19	1Н-пиразол-4-	но 1	0	431	бис(дибензилиде
ил] окси } пиридин-2-		А г		(M+l)	нацетон)паллади
	ил)амино]пир идин-3 -		II 1	l|		й
	ил}пропан-2-ол		н
	1-метил-4-[(4-{[1-
	(пропан-2-ил)-3-		LA N .
	(пиридин-2-ил)-1Н-		А	ZNX	403
20	пиразол-4- ил] окси } пиридин-2-	о А	O<ίίΊ		(M+l)
	ил)амино] пиридин-		II J
	2(1Н)-он		Η
	N-(4- {[ 1 -(пропан-2-		о
	ил)-3 -(пир ид ин-2-ил)-		1 '	0	374
21	1Н-пиразол-4- ил] окси } пиридин-2-	Сд	О-''4'-/ Λ	(M+l)
	ил)пиридазин-3 -амин		Η

- 17 031830

22	N-{4-[(3-m/?em-6yTHn- 1 -циклопропил-1Hпиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } пир ид азин-3 -амин	Η	351 (M+1)
23	2-[5-({4-[(3-m/?emбутил-1 -циклопропил1Н-пиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } амино)пиридин-2ил]пропан-2-ол	Χ-Ν он Η	408 (M+1)
24	2-[4-({4-[(3-m/?emбутил-1 -циклопропил1Н-пиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } амино)пиридин-2ил]пропан-2-ол	ноф Η	408 (M+1)
25	2-[4-({4-[(1- циклопропил-3 -этил1Н-пиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } амино)пиридин-2ил]пропан-2-ол		380 (M+1)
26	4- {[3 -циклопропил-1 (дифторметил)-1Нпиразол-4-ил] окси } -N(1 -метил-1 Н-пиразол4-ил)пиридин-2-амин	'Vn F Α Λ Η	347 (M+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й
27	2-{4-[(4-{[3циклопропил-1-(2,2д ифторэтил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)амино]пиридин-2ил}пропан-2-ол	y>:	416 (M+1)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й
28	N-(4- {[3 -циклопропил1 -(дифторметил)- 1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2 ил)пиридазин-3 -амин	ν F (a xS H	345 (M+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й

- 18 031830

29	4-({4-[(1,3дициклопропил-1Нпиразол-4ил)окси]пиридин-2ил} амино)-1метилпиримидин2(1Н)-он	н	365 (Μ+1)
30	4-[(1,3дициклопропил-1Нпиразол-4-ил)окси]-М(1 -метил-1 Н-пиразол3 -ил)пирид ин-2-амин	^л. Η	337 (Μ+1)
31	2-[6-({4-[(1,3дициклопропил-1Нпиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } амино)пир идин-3 ил]пропан-2-ол	но ii Δ Η	392 (Μ+1)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й
32	4-[(1,3дициклопропил-1Нпиразол-4-ил)окси]-М(1 -метил-1 Н-пиразол4-ил)пиридин-2-амин	Η	337 (Μ+1)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й
33	4-({4-[(1,3дициклопропил-1Нпиразол-4ил)окси]пиридин-2ил} амино)-1метилпирид ин-2( 1Н)он	Υ Ζ /	364 (Μ+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й, толуол/Nметилпирролидо и
34	Ν-{4-[(1,3- дициклопропил-1Нпиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } пир ид азин-3 -амин	<χό Η	335 (Μ+1)
35	2-{4-[(4-{[1-(2,2дифторэтил)-3(тетрагидро-2Н-пиран4-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)амино]пиридин-2ил}пропан-2-ол	Ή- Xjl Λ	460 (Μ+1)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й

- 19 031830

36	Ν-(4-{[1- (д ифторметил)-3 (тетрагидро-2Н-пиран4-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2 ил)пиридазин-3 -амин	.0x4 н	389 (Μ+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й
37	4- {[ 1 -циклопропил-3 (тетрагидро-2Н-пиран4-ил)-1 Н-пиразол-4ил ] окси } -N-( 1 -метил1Н-пиразол-5ил)пиридин-2-амин	А 1 н	381 (Μ+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й
38	4- {[ 1 -циклопропил-3 (тетрагидро-2Н-пиран4-ил)-1 Н-пиразол-4ил ] окси } -N-( 1 -метил1Н-пиразол-4ил)пиридин-2-амин	Αχ Λ Η	381 (Μ+1)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й
39	4- [(4- {[ 1 -циклопропил3 -(тетрагидро-2Нпиран-4-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пиридин-2ил)амино]-1метилпирид ин-2( 1Н)он	ο οΧΝ^ Η	408 (Μ+1)
40	N-(4- {[ 1 -циклопропил3 -(тетрагидро-2Нпиран-4-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2 ил)пиридазин-3 -амин	Сф οΧΝ~< Α Η	379 (Μ+1)
41	4- [(4- {[ 1 -циклопропил3 -(тетрагидрофуран-3 ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пиридин-2ил)амино]-1метилпирид ин-2( 1Н)он	ο Η	394 (Μ+1)
42	N-[4-({ 1-циклопропил3 -(тетрагидрофуран-3 ил)-1 Н-пиразол-4ил } окси)пир идин-2 ил] пирид азин-3 -амин, изомер 2	0^, Η	365 (Μ+1)

- 20 031830

43	N-[4-({ 1-циклопропил3 -(тетрагидрофуран-3 ил)-1 Н-пиразол-4ил } окси)пир идин-2 ил] пирид азин-3 -амин, изомер 1	<χΝ Η	365 (M+l)
44	2-{5-[(4-{[1циклопропил-3(тетрагидрофуран-3 ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	θ-, Η	422 (M+l)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й
45	2-{5-[(4-{[3циклобутил-1(дифтор метил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	Ν 0ΧΝ4 Η	416 (M+l)
46	2-[5-({4-[(3циклобутил-1циклопропил-1Нпиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } амино)пиридин-2ил]пропан-2-ол	N θΆτΝ A A-V Η	406 (M+l)
47	2-{5-[(4-{[1- (д ифторметил)-3 (пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	F jX,N~( OH 0 ^7 F H	439 (M+l)
48	2-{4-[(4-{[1- (д ифторметил)-3 (пиридин-2-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	f O^7 F hoV^ n	439 (M+l)
49	2-{5-[(4-{[1-(пропан-2ил)-3 -(пирид ин-2-ил)1Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	О Ji/N4 H(\l^ o^^7 ' NF H	431 (M+l)

- 21 031830

50	2- {4- [(4- {[ 1 -(пропан-2 ил)-3 -(пир ид ин-2-ил)1Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	О / ноЦ н	431 (M+l)
51	2-{5-[(4-{[3циклопропил-1 (дифтор метил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	он Η	402 (M+l)
52	2-{4-[(4-{[3циклопропил-1(дифтор метил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	ApN F HoV^H	402 (M+l)
53	2-[5-({4-[(1,3дициклопропил-1Нпиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } амино)пиридин-2ил]пропан-2-ол	Η	392 (M+l)
54	2-[4-({4-[(1,3дициклопропил-1Нпиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } амино)пиридин-2ил]пропан-2-ол	,, но^] H	392 (M+l)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й
55	2-{5-[(4-{[3циклопропил-1(пропан-2-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	/ H	394 (M+l)	фенолят натрия, бис(дибензилиде нацетон)паллади й
56	2-{5-[(4-{[1- (д ифторметил)-3 (тетрагидро-2Н-пиран4-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	Cu, F OH N H	446 (M+l)

- 22 031830

57	2-{4-[(4-{[1- (д ифторметил)-3 (тетрагидро-2Н-пиран4-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	Ον» ₽ [fl ноу H	446 (M+l)
58	2-{5-[(4-{[1циклопропил-3(тетрагидро-2Н-пиран4-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	°Oy он „ON-< H	436 (M+l)
59	2- {4- [(4- {[ 1 -(пропан-2 ил)-3 -(тетрагидро-2Нпиран-4-ил)-1Нпиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	Oh N·^ OOl OAAJ I^OH H	438 (M+l)
60	2-[4-({4-[(3циклобутил-1циклопропил-1Нпиразол-4ил)окси]пиридин-2ил } амино)пиридин-2ил]пропан-2-ол	ί%» rjAs 00+(0:+ nq H	406 (M+l)	бис(дибензилиде нацетон)паллади й
61	2-{4-[(4-{[3циклобутил-1 -(пропан2-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2ил)aминo]πиpидин-2ил}пропан-2-ол	Ун OS ho4 H	408 (M+l)

Пример 62. 4-[(4-{[1-Циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4-ил]окси}пиридин2-ил)амино]бензамид

К раствору 4-[[4-(1-циклопропил-3-тетрагидропиран-4-илпиразол-4-ил)окси-2-пиридил]амино]бензонитрила (467 мг, 1,16 ммоль) в ДМСО (5 мл) добавляют карбонат калия (80,4 мг, 0,58 ммоль). Добавляют 30% перекиси водорода (1,77 мл, 17,45 ммоль) и указанную реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение ночи. Разбавляют водой и четыре раза подвергают экстракции посредством ДХМ. Органические слои объединяют и промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия. Сушат над безводным сульфатом натрия. Указанную смесь фильтруют и указанный фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Указанный остаток очищают при помощи хроматографии с обращенной фазой (высокопроизводительная колонка С18 Redisep Rf Gold с обращенной фазой, 0100% муравьиная кислота/ACN в смеси муравьиная кислота/вода) с получением указанного в заголовке соединения (220 мг, выход 45,9%). МС (m/z): 420 (М+1).

Следующие соединения получают, по существу, при помощи способа согласно примеру 62.

Таблица 10

- 23 031830

№ примера	Химическое наименование	Структура	Физические данные МС (m/z)
63	3 -[(4- {[ 1 -циклопропил-3 (тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)- 1Нпиразол-4-ил] окси } пиридин-2 ил)амино]бензамид	°Си nh2 н	420 (М+1)
64	3 - [(4- {[ 1 -(пропан-2-ил)-3 (пиридин-2-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2 ил)амино]бензамид	хн о о Η2Ν [fS н	415 (М+1)
65	4-({4-[( 1 -циклопропил-3 -этил- 1 Н-пиразол-4-ил)окси] пиридин- 2-ил } амино)бензамид	ннг Ха н	364 (М+1)
66	4-[(4-{[1-(дифторметил)-3(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)- 1Нпиразол-4-ил] окси } пиридин-2 ил)амино]бензамид	О F н+ фА ([η Η	430 (М+1)
67	4-[(4- {[3 -циклобутил-1 (дифторметил)-1Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2 ил)амино] бензамид	F о H2NXA^ A H	400 (М+1)
68	3 - [(4- {[ 1 -(д ифторметил)-3 (пиридин-2-ил)-1 Н-пиразол-4ил] окси } пир идин-2 ил)амино] бензамид	XA^N f h2n О 0XnAf ιχό H	423 (М+1)
69	4-({4-[( 1,3 -дициклопропил-1Нпиразол-4-ил)окси] пирид ин-2ил } амино)бензамид	A, о oA Η2Ν'Λγ% <4 H	376 (М+1)

Пример 70. 2-{4-[(4-{[3-Циклопропил-1-(пропан-2-ил)-1И-пиразол-4-ил]окси}пиридин-2-ил)амино] пиридин-2-ил} пропан-2 - ол

Раствор метил-4-[[4-(3-циклопропил-1 -изопропилпиразол-4-ил)окси-2-пиридил]амино]пиридин-2карбоксилата (298 мг, 0,76 ммоль) в ТГФ (6 мл) в герметично закрытом сосуде продувают азотом. По каплям добавляют метилмагнийбромид (3M в диэтиловом эфире, 1,01 мл, 3,03 ммоль) и указанную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение двух часов. Указанную смесь концентрируют при пониженном давлении и указанный остаток разбавляют с помощью ДХМ и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделяют и водный слой подвергают экстракции посредством ДХМ. Органические слои объединяют и промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия. Сушат над сульфатом натрия, фильтруют и указанный фильтрат концентрируют. Очищают при помощи колоночной хроматографии на силикагеле с 5-10% МеОН в ДХМ с получением указанного в заголовке соединения (160 мг, выход 53,69%). МС (m/z): 394 (М+1).

Пример 71. 2-{5-[(4-{[3-(Пиридин-2-ил)-1И-пиразол-4-ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2- 24 031830 ил}пропан-2-ол

Раствор 2-[5-[[4-[3-(2-пиридил)-1-(2-триметилсилилэтоксиметил)пиразол-4-ил]окси-2-пиридил]амино]-2-пиридил]пропан-2-ола (500 мг, 0,96 ммоль) в трифторуксусной кислоте (3 мл) охлаждают до 0°С на ледяной бане. Добавляют триэтилсилан (1 мл, 6,24 ммоль). Указанную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Концентрируют и указанный остаток очищают при помощи хроматографии с обращенной фазой (высокопроизводительная колонка С18 Redisep Rf Gold с обращенной фазой, 0-100% 10 мМ бикарбоната аммония в ACN). Соответствующие фракции концентрируют для удаления ACN. Указанную оставшуюся водную смесь подвергают экстракции посредством ДХМ, органический слой отделяют и сушат над сульфатом натрия. Фильтруют и указанный фильтрат концентрируют при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (168 мг, выход 44,9%). МС (m/z): 389 (М+1).

Пример 72. N-[4-({ 1-(Дифторметил)-3-(тетрагидрофуран-3-ил)-1Н-пиразол-4-ил}окси)пиридин-2ил]пиридазин-3-амин, изомер 1

Рацемическую смесь №[4-[1-(дифторметил)-3-тетрагидрофуран-3-ил-пиразол-4-ил]окси-2-пиридил]пиридазин-3-амина (пример получения 49) очищают при помощи хиральной хроматографии с получением первого элюирующего энантиомера в качестве указанного в заголовке соединения. МС (m/z): 375 (М+1).

Условия очистки: CHIRALPAK® IC; подвижная фаза: 30% изопропанола, содержащего изопропиламин в диоксиде углерода; скорость потока: 70 г/мин; УФВ: 280 нм; время удерживания: 3,93 мин.

Следующие соединения получают, по существу, при помощи способа согласно примеру 72. Указаны альтернативные условия очистки.

Таблица 11

- 25 031830

№ примера	Химическое наименование	Структура	У СЛОВИЯ	Физические данные
73	2-(5-{[4-({1циклопропил-3(тетрагидрофуран3 -ил)-1 Н-пиразол4ил } окси)пиридин2- ил] амино}пиридин2-ил)пропан-2-ол, изомер 1	°-1 Η0·^λ-0 н	CHIRALCEL® OJ-H; Подвижная фаза: 20% EtOH в гептане; Скорость потока: 425 мл/мин; УФВ: 280 нм; Время удерживания: 17,39 минут	МС (m/z): 422 (М+1)
74	2-(5-{[4-({1циклопропил-3 (тетрагидрофуран3 -ил)-1 Н-пиразол4ил } окси)пиридин2ил] амино}пиридин2-ил)пропан-2-ол, изомер 2	с+« Η	CHIRALCEL® OJ-H; Подвижная фаза: 20% EtOH в гептане; Скорость потока: 425 мл/мин; УФВ: 280 нм; Время удерживания: 21,55 минута	МС (m/z): 422 (М+1)
75	2-(4-{[4-({1циклопропил-3 (тетрагидрофуран3 -ил)-1 Н-пиразол4ил } окси)пиридин2ил] амино}пиридин2-ил)пропан-2-ол, изомер 1	ο-,	CHIRALCEL® OJ-H; Подвижная фаза: 20% изопропанола, содержащего 0,2% изопропиламина в диоксиде углерода; Скорость потока: 70	МС (m/z): 422 (М+1)
			г/мин; УФВ: 225 нм; Время удерживания: 2,67 минуты
76	2-(4-{[4-({1циклопропил-3(тетрагидрофуран3 -ил)-1 Н-пиразол4ил } окси)пиридин2ил] амино}пиридин2-ил)пропан-2-ол, изомер 2	ο-, ΧΝ-<ι ,,γΟ,Ο	CHIRALCEL® OJ-H; Подвижная фаза: 20% изопропанола, содержащего 0,2% изопропиламина в диоксиде углерода; Скорость потока: 70 г/мин; УФВ: 225 нм; Время удерживания: 3,59 минуты	МС (m/z): 422 (М+1)

Процедура получения рентгеновских порошковых дифрактограмм примеров 77-79.

Дифрактограммы рентгеновской порошковой дифракции (XRD) твердых кристаллических веществ получают на рентгеновском порошковом дифрактометре Bruker D4 Endeavor, оснащенном CuKa источником (λ=1,54060 А) и детектором Vantec, работающем при 35 кВ и 50 мА. Образец сканируют от 4 до 40° в 2Θ с размером шага 0,009° в 2Θ и скоростью сканирования 0,5 с/шаг и с 0,6 мм щелью расходимости, 5,28 мм фиксированной противорассеивающей щелью и 9,5 мм приемной щелью. Сухой порошок помещают в кварцевый держатель образца и получают гладкую поверхность при помощи предметного стекла. Рентгеновские дифрактограммы кристаллических форм получают при температуре окружающей среды и относительной влажности.

Пример 77. 2-{4-[(4-{[1-Циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4-ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол, (22)-бут-2-ендиоат (1:1)

- 26 031830

В ACN (2 мл) вносят 2-{4-[(4-{[1-циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол (142 мг). Указанное твердое вещество полностью растворяется при перемешивании при 80°С/1000 оборотов в минуту. К полученному раствору добавляют малеиновую кислоту (48 мг, 1,20 эквивалента в 1 мл ACN при 80°С). Изначально указанная смесь является мутной, однако быстро становится прозрачным раствором. Нагревание и перемешивание прекращают. Указанный раствор охлаждают до комнатной температуры. Добавляют дополнительные 2 мл ACN для суспендирования твердого вещества. Указанное белое твердое вещество отделяют при помощи вакуумной фильтрации и твердое вещество сушат прямо на месте на фильтре в течение 15 мин в потоке воздуха. Полученное твердое вещество сушат в вакуумной печи при 65°С в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (132 мг, выход 73,4%). Теоретическое значение процентного содержания иона малеиновой кислоты в образовавшейся соли для моносоли составляет 21,0%. Анализ на содержание противоиона при помощи ВЭЖХ показывает, что фактическое значение процентного содержания иона малеиновой кислоты в образовавшейся соли составляет 17,2%. Анализ на содержание противоиона определяет моносоль.

Рентгеновская порошковая дифракция примера 77.

Подготовленный образец из примера 77 характеризуется дифрактограммой рентгеновской порошковой дифракции (XRD), полученной с применением CuKa излучения, как имеющий дифракционные пики (значения в градусах 2-тета), описанные ниже в табл. 12, и, в частности, имеющий пики при 9,6° в сочетании с одним или более пиков, выбранных из группы, состоящей из 12,5, 17,5 и 16,9° с допустимым отклонением для углов дифракции 0,2°.

Таблица 12. Пики рентгеновской порошковой дифракции из примера 77

Пример 78. 2-{4-[(4-{[ 1 -Циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-111-ι 1иразол-4-ил|окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол, метансульфонат (1:1)

В ацетон (2 мл) вносят 2-{4-[(4-{[1-циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол (113 мг).

Указанное твердое вещество полностью растворяется при перемешивании при 60°С/1000 оборотов в минуту. К полученному раствору добавляют метансульфоновую кислоту (21 мкл, 1,24 эквивалента). Нагревание и перемешивание прекращают. Указанный раствор охлаждают до комнатной температуры. Добавляют дополнительные 3 мл ацетона для суспендирования твердого вещества. Указанное белое твердое вещество отделяют при помощи вакуумной фильтрации и твердое вещество сушат прямо на месте на фильтре в течение 15 мин в потоке воздуха. Полученное твердое вещество сушат в вакуумной печи при 65°С в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (87 мг, выход 63,08%). Теоретическое значение процентного содержания иона метансульфоновой кислоты в образовавшейся соли для моносоли составляет 18,1%. Анализ на содержание противоиона при помощи ВЭЖХ показывает, что фактическое значение процентного содержания иона метансульфоновой кислоты в образовавшейся соли составляет 16,2%. Анализ на содержание противоиона определяет моносоль.

Рентгеновская порошковая дифракция примера 78.

- 27 031830

Подготовленный образец из примера 78 характеризуется дифрактограммой рентгеновской порошковой дифракции (XRD), полученной с применением CuKa излучения, как имеющий дифракционные пики (значения в градусах 2-тета), описанные ниже в табл. 13, и, в частности, имеющий пики при 7,0° в сочетании с одним или более пиков, выбранных из группы, состоящей из 14,1, 10,8 и 18,6° с допустимым отклонением для углов дифракции 0,2°.

Таблица 13. Пики рентгеновской порошковой дифракции из примера 78

Пи к	Угол (°2-тета)+/- 0,2°	Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика)
1	7,0	100,0
2	14,1	93,2
3	10,8	73,6
4	18,6	66,1
5	15,9	61,4
6	19,7	60,7
7	5,4	49,2
8	7,9	49,1
9	4,5	48,1
10	17,8	47,6

Пример 79. 2-{4-[(4-{[1 -Циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1 Н-пиразол-4-ил]окси} пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол 4-метилбензолсульфонат (1:1)

В EtOAc (2 мл) вносят 2-{4-[(4-{[1-циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол (122 мг). Указанное твердое вещество полностью растворяется при перемешивании при 80°С/1000 оборотов в минуту. К полученному раствору добавляют моногидрат п-толуолсульфоновой кислоты (1,23 эквивалента в 1 мл EtOAc при 80°С). Указанную смесь перемешивают при 80°С/1000 оборотов в минуту в течение 30 мин. Нагрев отключают и указанную смесь продолжают перемешивать при 1000 оборотах в минуту, чтобы она остыла до комнатной температуры. Полученное белое твердое вещество отделяют при помощи вакуумной фильтрации и твердое вещество сушат прямо на месте на фильтре в течение 15 мин в потоке воздуха. Полученное твердое вещество сушат в вакуумной печи при 65°С в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (159 мг, выход 93,40%). Теоретическое значение процентного содержания иона птолуолсульфоновой кислоты в образовавшейся соли для моносоли составляет 29,3%. Анализ на содержание противоиона при помощи ВЭЖХ показывает, что фактическое значение процентного содержания иона п-толуолсульфоновой кислоты в образовавшейся соли составляет 28,3%. Анализ на содержание противоиона определяет моносоль.

Рентгеновская порошковая дифракция примера 79.

Подготовленный образец из примера 79 характеризуется дифрактограммой рентгеновской порошковой дифракции (XRD), полученной с применением CuKa излучения, как имеющий дифракционные пики (значения в градусах 2-тета), описанные ниже в табл. 14, и, в частности, имеющий пики при 17,8° в сочетании с одним или более пиков, выбранных из группы, состоящей из 19,7, 18,4 и 22,0° с допустимым отклонением для углов дифракции 0,2°.

Таблица 14. Пики рентгеновской порошковой дифракции из примера 79

В нескольких случаях передачу сигналов посредством TGFP-пути связывали с прогрессированием рака и опухоли (Elliott и др. (2005) J. Clin. Oncol. 23:2078; Levy и др. (2006) Cytokine & Growth Factor Rev. 17:41-58). Существует несколько типов рака, при которых лиганды для TGF3, образуемые опухолью или стромой в микроокружении указанной опухоли, могут участвовать в прогрессировании опухоли. Клетки рака предстательной железы крысы MATLyLu (Steiner и Barrack (1992) Mol. Endocrinol. 6:15-25) и клетки

- 28 031830 рака молочной железы человека MCF-7 (Arteaga и др. (1993) Cell Growth and Differ. 4:193-201) становились более онкогенными и метастатическими после трансфекции вектором, экспрессирующим TGFJ31 мыши. При раке предстательной железы человека и раке желудка поздней стадии уровень TGF31 был связан с ангиогенезом, метастазированием и неблагоприятным прогнозом (Wikstrom P. и др. (1998) Prostate 37:19-29; Saito H. и др. (1999) Cancer 86:1455-1462). При раке молочной железы неблагоприятный прогноз связывают с повышенным уровнем TGF[t (Dickson и др. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:837841; Kasid и др. (1987) Cancer Res. 47:5733-5738; Daly и др. (1990) J. Cell Biochem. 43:199-211; Barrett-Lee и др. (1990) Br. J. Cancer 61:612-617; King и др. (1989) J. Steroid Biochem. 34:133-138; Welch и др. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7678-7682; Walker и др. (1992) Eur. J. Cancer 238:641-644), а индукцию TGF[t1 при лечении тамоксифеном (Butta и др. (1992) Cancer Res. 52:4261-4264) связывали с неудачной попыткой лечения тамоксифеном при раке молочной железы (Thompson и др. (1991) Br. J. Cancer 63:609614). Антитела по отношению к TGF[t 1 ингибируют рост клеток рака молочной железы человека MDA231 у бестимусных мышей (Arteaga и др. (1993) J. Clin. Invest. 92:2569-2576), лечение которых коррелирует с увеличением в селезенке активности естественных клеток-киллеров. Клетки СНО, трансфицированные латентным TGF[t1. также показали пониженную активность КК и повышенный рост опухоли у голых мышей (Wallick и др. (1990) J. Exp. Med. 172:1777-1784). Таким образом TGF3, секретируемый опухолями молочных желез, может вызвать супрессию эндокринного иммунитета. Было показано, что высокие концентрации TGF[t 1 в плазме указывают на неблагоприятный прогноз в отношении пациентов с раком молочной железы поздней стадии (Anscher и др. (1993) N. Engl. J. Med. 328:1592-1598). Пациенты с высоким циркулирующим уровнем TGF3 до высокой дозы химиотерапии и аутологичной трансплантации костного мозга подвержены высокому риску возникновения веноокклюзионной болезни печени (от 15 до 50% от числа всех пациентов с уровнем смертности до 50%) и идиопатического интерстициального пневмонита (от 40 до 60% от числа всех пациентов). Данные факты подразумевают, что 1) повышенные уровни TGF[i в плазме можно применять для выявления пациентов с риском и 2) снижение в передаче сигналов TGF[i может понизить заболеваемость и смертность при распространенных средствах для лечения пациентов с раком молочной железы.

В недавних публикациях также было предположено, что передача сигналов TGF[i может иметь важное значение в стимулировании невосприимчивости опухолей к стандартным способам лечения, включая химиотерапии и рецепторные тирозинкиназы (WO 2012138783). В частности, при раке толстой кишки было показано, что специфичный профиль экспрессии генов выделяет группу пациентов, которые невосприимчивы к распространенной терапии первой линии. Данные опухолевые клетки восстанавливают восприимчивость к терапии в том случае, когда специфичный к TGF[iR1 низкомолекулярный ингибитор блокирует TGFe-путь (Huang и др. (2012) Cell 151:937-950; Sadanandam и др. (2013) Nat. Med. 19:619625; Vermeulen и др. (2013) Nat. Med. 19:614-618; Roepman и др. (2014) 134:552-562).

Миелодиспластические синдромы (MDS) представляют собой расстройства кроветворной системы в миелоидном отделе и характеризуются неэффективным образованием миелоидных клеток. MDS связан с изменениями в TGFe-пути, представленными пониженными уровнями SMAD7. SMAD7 представляет собой ингибирующий SMAD, который функционирует для ингибирования опосредованной TGF3 передачи сигнала SMAD и расположен по ходу лиганд-активированной передачи сигнала посредством TGF3R1 и TGF3R2. Таким образом полагают, что гиперэкспрессия SMAD7 приводит к чрезмерной активации передачи сигнала TGF[i при MDS, и реверсию данного фенотипа можно осуществить при помощи лечения низкомолекулярным ингибитором TGF[iR1 (Zhou и др. (2011) Cancer Res. 71:955-963). Аналогичным образом в глиобластоме (GBM) уровни лиганда для TGF[i повышены, и их связывают с прогрессированием заболевания. Было показано, что терапевтическое средство с антисмысловым олигонуклеотидом, АР1002, являлось потенциально активным в подгруппе пациентов с GBM (Bogdahn и др. (2011). Curr. Pharm. Biotechnol.). В меланоме активация сигнального пути TGF3 также была связана с невосприимчивостью к ингибиторам BRAF и MEK (Sun и др. (2014) Nature. 508:118-122).

Многие злокачественные клетки секретируют трансформирующий фактор роста β (TGF3), мощный иммунодепрессант, тем самым предполагается, что выработка TGF[i может представлять собой значимый механизм ухода опухоли от иммунного надзора хозяина (Flavell и др. (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:554-567; Kast и др. (1999) Leukemia 13:1188-1199). Образование субпопуляции лейкоцитов с нарушенной передачей сигнала TGF[i в хозяине с опухолью предлагает перспективное средство для иммунотерапии рака по отдельности или в комбинации с одним или более другими видами иммунотерапии, например, в комбинации с одним или более ингибиторами PD-1, такими как ниволумаб, пембролизумаб, ингибиторы PD-L1, противораковые вакцины и биспецифичные молекулы, вовлеченные в иммунные процессы, такие как IMCgp100. Доклинически было показано, что лиганд TGFe, образуемый лимфоцитами, противодействует иммунному надзору опухоли (Donkor и др. (2012) Development. Oncoimmunology 1:162-171, Donkor и др. (2011) Cytokine Immunity 35:123-134); доклинически было показано, что нарушение данного канала обеспечивает противоопухолевое преимущество на мышиных моделях и in vitro (Zhong и др. (2010) Cancer Res. 16:1191-1205; Petrausch и др (2009) J. Immunol. 183:3682-3689); Wakefield

- 29 031830 и др. (2013) Nat. Rev. Cancer 13:328-341). Трансгенная животная модель с нарушенной передачей сигнала TGF3 в Т-клетках способна к полному избавлению от обычно летальной опухоли лимфотической ткани, гиперэкспрессирующей TGF3, EL4 (Gorelik и Flavell, (2001) Nature Medicine 7(10): 1118-1122). Понижающая регуляция секреции TGF[i в опухолевых клетках приводит к восстановлению иммуногенности у хозяина, в то время как Т-клеточная нечувствительность к TGF3 приводит к ускоренной дифференциации и аутоиммунитету, элементы которого могут быть необходимы для борьбы с аутоантигенэкспрессирующими опухолями в организме толерантного хозяина. Иммунодепрессивные эффекты TGF3 также наблюдались в субпопуляции пациентов с ВИЧ с более низким, нежели чем прогнозным, иммунным ответом в зависимости от числа их CD4/CD8 Т-клеток (Garba и др. J. Immunology (2002) 168:22472254). Нейтрализующее TGF3 антитело было способно к реверсивным эффектам в культуре, указывая на то, что ингибиторы передачи сигналов TGF[i. могут быть ценны при реверсии супресссии иммунного ответа, присутствующей в данной подгруппе пациентов с ВИЧ.

Во время самых ранних стадий канцерогенеза TGF[i 1 может выступать в качестве мощного супрессора опухоли и может опосредовать действия некоторых химиопрофилактических агентов. Тем не менее в какой-то момент в ходе развития и прогрессирования злокачественных новообразований опухолевые клетки по всей видимости избегают зависимого от TGF[i ингибирования роста параллельно с появлением в микроокружении биологически активного TGF[i. Двойная роль TGF3 вида супрессия опухоли/активация опухоли была наиболее ясно изучена на трансгенной системе гиперэкспрессии TGF3 в кератиноцитах. В то время как трансгены были более устойчивы к образованию доброкачественных поражений кожи, скорость метастатического преобразования у трансгенов резко возрастала (Cui и др. (1996) Cell 86(4):531-42). Выработка TGFJ31 злокачественными клетками в первичных опухолях по всей видимости возрастает с усилением стадий прогрессирования опухоли. Исследования многих из основных типов эпителиальных раков позволяют предположить, что увеличенная выработка TGF[i раковыми клетками человека происходит в относительно позднем случае во время прогрессирования опухоли. Кроме того, этот связанный с опухолью TGF[i обеспечивает опухолевые клетки селективным преимуществом и способствует прогрессрованию опухоли. Эффекты TGF3 на взаимодействия вида клетка/клетка и клетка/строма приводят к более значительной способности к инвазии и метастазированию. Связанный с опухолью TGF3 может позволить опухолевым клеткам уйти от иммунного надзора, так как он является мощным ингибитором клональной экспансии активированных лимфоцитов. Также было показано, что TGF3 ингибирует выработку ангиостатина. Методы терапевтического воздействия на рак, такие как лучевая терапия и химиотерапия, индуцируют выработку активированного TGF[i в опухоли, тем самым селектируя разрастание злокачественных клеток, невосприимчивых к ингибирующим эффектам роста TGFp. Таким образом, данные противораковые средства для лечения повышают риск и ускоряют развитие опухолей с усиленным ростом и инвазивностью. В данной ситуации агенты, нацеливающиеся на TGF3-опосредованную передачу сигнала, могут представлять собой очень эффективную терапевтическую стратегию. Было показано, что невосприимчивость опухолевых клеток к TGF[i нивелирует большую часть цитотоксических эффектов лучевой терапии и химиотерапии, и зависимая от лечения активация TGF3 в строме может даже быть вредной, так как это может сделать микроокружение более благоприятным для прогрессирования опухоли и способствовать повреждению тканей, приводящему к фиброзу. Вероятнее всего то, что разработка ингибиторов передачи сигнала TGF[i будет благоприятствовать лечению прогрессивного рака отдельно и в сочетании с другими методами лечения.

Кроме того, в данной области техники известно, что передача сигнала TGF[i участвует в фиброзных состояниях, таких как фиброз печени и хроническое заболевание почек. См., например, Ueha S. и др. 2012. Front. Immunol. 3:71. Cellular and molecular mechanisms of chronic inflammation-associated organ fibrosis; Bottinger и др. 2002. J. Amer. Soc. Nephrol. 13:2600. TGF-β Signaling in Renal Disease; Trachtman H. и др. 2011. Kidney International 79:1236. A phase 1, single-dose study of fresolimumab, an anti-TGF-β antibody, in treatment-resistant primary focal segmental glomerulosclerosis; и Rosenbloom J. и др. 2010. Narrative review: fibrotic diseases: cellular and molecular mechanisms and novel therapies. Ann. Intern. Med. 152:159166.

Следующие анализы показывают, что приведенные в качестве примеров соединения ингибируют TGF[iR1 при биохимическом анализе на клеточном уровне и в животной модели.

Биохимический анализ на определение активности TGF[iR1.

Целью данного анализа in vitro является идентификация соединений, которые ингибируют TGF[iR1. Очистка и экспрессия белка.

Вставку нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты от 200 до 503 TGF[iR1 человека (NM_004612,2), с аминокислотой Thr, замененной на Asp в положении 204, осуществляют в вектор PFASTBAC™1 (Invitrogen, № по каталогу 10360-014) с N-концевой гистидиновой (HIS) меткой. Бакуловирус формируют согласно протоколу Системы Экспрессии Бакуловируса ВАС-ТО-ВАС® (Invitrogen, № по каталогу 10359-016). Инфицируют клетки Sf9 в количестве 1,5х10⁶ клеток/мл с применением

- 30 031830 мл вируса Р1 на литр культуры и инкубируют при 28°С в течение 48 ч. Проводят сбор клеток и хранение при -80°С для последующей очистки белка. Очистку белка проводят при 4°С. Осадки из 2 л культуры суспендируют в 100 мл буфера А (50 мМ Трис-HCl, рН 8, 200 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 5 мМ имидазола, 10% глицерина), содержащего 0,2% Тритона Х-100 и полностью свободную от EDTA смесь ингибиторов протеаз Roche, и гомогенизируют. Указанные клеточные лизаты осветляют при помощи центрифугирования в роторе Bechman JA-18 в течение 45 мин при 16500 оборотах в минуту. Указанный супернатант инкубируют с 5 мл обладающей сродством к металлу смолы Ni-NTA (Qiagen) в течение трех часов. Указанную смолу упаковывают на колонке и промывают буфером А. Белок HIS-TGF3R1 (200-503)(T204D) элюируют градиентом 0-400 мМ имидазола в буфере А. Накапливают и концентрируют HIS-TGF[1R1 (200-503)(T204D), содержащий фракции, и загружают в колонку HiLoad в 16,600 Superdex 200 (GE Healthcare Bioscience). Указанную колонку элюируют буфером для хранения (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ). Накапливают и концентрируют HIS-TGF[1R1 (200-503)(T204D), содержащий фракции. Концентрацию указанного белка определяют при УФ280. Указанный белок распределяют аликвотами и хранят при -80°С.

Условия проведения TR-FRET анализа.

Осуществляют предварительную инкубацию соединений с рекомбинантным His-TGFpR1 (200503)(T204D) и детекторным антителом Eu-анти-HIS (Invitrogen, № по каталогу PV5597) в черных планшетах с половинным объемом лунок. Из 1 мМ исходного раствора исследуемых соединений подготавливают серийные разведения соединений в ДМСО. Проводят 3-кратные серийные разведения указанного маточного раствора в ДМСО, чтобы получить кривую разведения по десяти точкам с конечными значениями концентрации соединений, находящихся в пределах от 2 мкМ до 0,1 нМ. Конечная концентрация ДМСО в указанном анализе составляет 4%. Указанную реакцию инициируют добавлением киназного трейсера (Kinase Tracer 178, Life Technologies PR9080A, Invitrogen). После 45-60 мин снимают показания флуоресценции на планшете-ридере.

Подсчитывают процент ингибирования обработанных групп соединений по отношению к группе с минимальным ингибированием (исключительно ДМСО, необработанная). Вычисляют абсолютное значение IC₅₀, применяя 4-параметрическое нелинейное логистическое уравнение, где абсолютная IC₅₀ равна концентрации, вызывающей 50% ингибирование, с применением программного обеспечения для анализа данных ActivityBase. Результаты данных анализов показывают, что приведенные в качестве примеров соединения являются эффективными ингибиторами TGF[1R1. Например, все приведенные в качестве примеров соединения демонстрируют значения IC50 меньшие, чем 1 мкМ. В частности IC50 для примера 1 составляет 0,027 мкМ.

Анализ репортерного гена люциферазы в клетках для определения активности TGFPR1.

Целью данного анализа является идентификация соединений, которые селективно воздействуют на SMAD 2,3-зависимую экспрессию генов при проведении анализов в клетках, демонстрирующих ингибирование ими TGF[1R1 на клеточном уровне.

Конструируют клетки HEK293 (АТСС, CRL-1573), чтобы осуществить экспрессию люциферазы светлячка из чувствительного к SMAD 2,3 промотора в ответ на стимуляцию TGFp. Такую клеточную линию можно образовать путем инфицирования лентивирусными частицами (SA Biosciences) и селекции на устойчивость к пуромицину. Указанные клетки HEK_293SMAD 2/3 из готовых для анализа замороженных запасов высевали в количестве 15000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в среду OPTIMEM®, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки. Через 72 ч среду заменяли на OPTI-MEM®, содержащую 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Исследуемые соединения получают в ДМСО, чтобы образовать 10 мМ маточные растворы. Проводят 3-кратные серийные разведения указанного маточного раствора в ДМСО, чтобы получить кривую разведения по десяти точкам с конечными значениями концентрации соединений, находящейся в пределах от 20 мкМ до 1 нМ с конечной концентрацией ДМСО в 0,5%. Добавляют указанные исследуемые соединения и после одного часа равновесного состояния добавляют TGF[i (конечная концентрация = 2 нм, R&D Systems).

Через 24 ч добавляют буфер для лизиса [Glo Lysis Buffer (№ по каталогу Е2661)] и люциферазный реагент [Promega Bright Glo Luciferase Reagent (№ по каталогу Е2620)] в каждую лунку, чтобы удвоить объем лунки. Аликвоты (80 мкл) переносят в планшеты с белым твердым дном для снятия показаний люминесценции на планшете-ридере (Эмиссионный фильтр: Luminescence 700, 1 с снятия показаний). Подсчитывают процент ингибирования обработанных групп соединений по отношению к группе с минимальным ингибированием (исключительно ДМСО, необработанная). Вычисляют абсолютное значение IC₅₀ для каждого соединения по результатам исследования зависимости доза-ответ и концентрацию, необходимую для достижения 50% ингибирования. Данные, полученные по результатам исследований зависимости доза-ответ, подставляют в 4-параметрическое логистическое уравнение с применением программного обеспечения для анализа данных ActivityBase. Результаты данных анализов показывают, что приведенные в качестве примеров соединения являются эффективными ингибиторами активности репортерного гена люциферазы в клетках HEK293_SMAD2/3, стимулированных TGF[i. Например, все приведенные в качестве примеров соединения демонстрируют значения IC 50меньшие, чем 1 мкМ. В частно

- 31 031830 сти IC₅₀ для примера 1 составляет 0,0824 мкМ (± 0,005, n=2).

Анализ IVTI.

Целью данного анализа является измерение способности исследуемого соединения ингибировать экспрессию pSMAD2 в опухолях у сингенной животной модели EMT6-LM2, другими словами, в указанном анализе измеряется способность исследуемого соединения ингибировать передачу сигнала TGF3R1 в солидной опухоли животной модели.

Образование клеток EMT6-LM2.

Клетки ЕМТ-6 (АТСС, CRL-2755) подкожно имплантируют (5х10⁵/животное) в боковую область иммунокомпетентных мышей BALB/cAnNHsd (Harlan Laboratories). Когда размер опухолей достигает приблизительно 3000 мм³, животных умерщвляют посредством асфиксии СО₂. У животных с опухолью отделяют легкие и помещают в культуру. Легкие осторожно гомогенизируют для создания суспензии одиночных клеток. Клетки выращивают на культуральной среде (IMDM, 10% ФБС) и указанные опухолевые клетки выделяют с получением клеток EMT6-LM1. Описанную выше процедуру повторяют с применением клеток EMT6-LM1 для проведения имплантации, чтобы получить клетки EMT-LM2.

Очищенный фосфо-HIS-SMAD2 (pSMAD2).

Вставку нуклеотидной последовательности, кодирующей полноразмерный SMAD2 человека (NM_005901,5), осуществляют в вектор PFASTBACHTA™ (Invitrogen, № по каталогу 10584-027), что приводит к конструкции бакуловируса для экспрессии белка HIS-SMAD2. Вставку нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты от 148 до 503 TGF[iR1 человека (NM_004612,2), с аминокислотой Thr, замененной на Asp в положении 204, осуществляют в вектор PFASTBACHTA™ (Invitrogen, № по каталогу 10584-027), что приводит к конструкции бакуловируса для экспрессии белка HIS-TGF3R1 (148-503)(T204D). Бакуловирус формируют согласно протоколу Системы Экспрессии Бакуловируса ВАС-ТО-ВАС®. Инфицируют клетки Sf9 в количестве 1,5х10⁶ клеток/мл с применением 15 мл вируса P1 HIS-SMAD2 и вируса P1 HIS-TGF3R1 (148-503)(T204D) на литр культуры и инкубируют при 28°С в течение 45 ч. Добавляют окадаевую кислоту до значения конечной концентрации в 0,1 мкМ. После дополнительных трех часов инкубации указанные клетки собирают и хранят при -80°С для последующей очистки белка. Очистку белка проводят при 4°С. Замороженный осадок указанных клеток из 6 л культуры лизируют путем инкубации при перемешивании в 300 мл холодного буфера А (50 мМ фосфата натрия, рН 7,5, 300 мМ NaCl, 2 мМ β-меркаптоэтанола, 5 мМ имидазола, 10% глицерина, 0,1 мкМ окадаевой кислоты), содержащем 0,1% TRITON® Х-100 и полностью свободную от EDTA смесь ингибиторов протеаз Roche, и гомогенизируют. Клеточные лизаты осветляют при помощи центрифугирования в роторе Bechman JA-18 в течение 45 мин при 16500 оборотах в минуту. Указанный супернатант инкубируют с 10 мл обладающей сродством к металлу смолы TALON (Clontech, № по каталогу 635504) в течение двух часов. Указанную порцию промывают 100 мл буфера А, содержащем 0,1% TRITON® Х-100. Указанную смолу упаковывают на колонке и промывают буфером А. Указанный белок HIS-SMAD2 элюируют градиентом 0-100 мМ имидазола в буфере А. Накапливают указанные фракции, содержащие фосфо-HISSMAD2, и дополняют 0,1 мкМ окадаевой кислоты и 5 мМ EDTA. Концентрацию белка определяют при помощи анализа на содержание белка BioRad (Набор BioRad DC Protein Assay № 500-0116) с применением БСА в качестве стандарта. Указанный белок распределяют аликвотами и хранят при -80°С.

Живая фаза.

Клетки EMT6-LM2 культивируют в среде Дульбекко, модицифированной по способу Искова (IMDM), дополненной 10% ФБС, 2 мМ Glutamax и 0,1 мМ заменимых аминокислот, и инкубируют при 37°С в 5% CO2. Трипсинизируют и выделяют указанные клетки из культуры. Указанные клетки повторно суспендируют в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS), далее смешивают с MATRIGEL® (1:1). Указанные клетки (5х10⁵/животное) подкожно имплантируют в заднюю боковую область мышей (самки мышей BALB/c, Harlan). Объем опухоли при помощи штангенциркуля и массу тела измеряют два раза в неделю. После того как объем опухоли достигает приблизительно 200-250 мм³, животных случайным образом распределяют и группируют по группам с носителем, представляющим контроль, и с соединением для лечения. Указанное соединение (приготовленное в 1% гидроксиэтилцеллюлозы (ГЭЦ) и 0,25% TWEEN® 80 и 0,05% пеногасителя) и носитель в качестве контроля (1% ГЭЦ и 0,25% TWEEN® 80 и 0,05% пеногасителя) вводят через пероральный зонд. Ответ на дозу формируют путем исследования соединений в одной точке времени (2 ч) после однократной дозы в 2,7, 8,3, 25, 75 или 150 мг/кг. Проводят анализ временной динамики при рассчитанной дозе TED₅₀ или TED₈₀ (метод подробно изложен ниже) по результатам исследования зависимости доза-ответ, путем умерщвления мышей в различные моменты времени от 1 до 16 ч после однократной дозы.

Обработка ткани.

Опухолевые ткани собирают и гомогенизируют так, как описано ниже. Опухолевые ткани (~ 100 мг каждая) замораживают в жидком азоте и измельчают при помощи пестика. Измельченную ткань помещают в пробирку (пробирка Lysing Matrix A, MPBio № 6910-100) на сухом льду и гомогенизируют в буфере для лизиса (0,6 мл каждый) (150 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 7,5; 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA); 1 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты (EGTA); 1% TRITON® Х-100; Смесь ин

- 32 031830 гибиторов протеаз (Sigma P8340); Смесь ингибиторов фосфатаз II (Sigma P5726); Смесь ингибиторов фосфатаз III (Sigma P0044)) в течение 25 с, применяя гомогенизатор BIO101 FASTPREP® FP120 (настройка 4,5). Клеточный дебрис и гранулы осаждают при помощи центрифугирования при 14000 х g в течение 10 мин при 4°С. Указанный лизат перемещают в новую микроцентрифужную пробирку и заново центрифугируют при 14000 х g в течение 10 мин при 4°С. Центрифугированный лизат перемещают в 96луночный планшет с глубокими лунками и держат на льду. Концентрацию указанного белка для каждого лизата определяют при помощи анализа на содержание белка BioRad (Набор BioRad DC Protein Assay № 500-0116) следующим образом. Рабочий реагент получают путем добавления реагента S и набора (20 мкл) к каждому 1 мл реагента А из набора, необходимого для указанного анализа. Готовят 3-5 разведений стандарта белка от 0,2 до 1,5 мг/мл белка и получают калибровочную кривую. Пипеткой отбирают 5 мкл стандартов и образцов в чистый сухой микротитрационный планшет. В каждую лунку добавляют 25 мкл указанного рабочего реагента. В каждую лунку добавляют 200 мкл реагента В и перемешивают в течение 5 с. Через 15 мин снимают показания оптической плотности для каждой лунки при 750 нМ. Уровни белка для каждой лунки определяют путем сравнения значений оптической плотности лунок с образцами со значениями калибровочной кривой, полученными из лунок со стандартами. При подготовке к анализу на содержание pSMAD2 и общего уровня SMAD2/3 при помощи ИФА в качестве метода, описанного ниже, лизаты опухолевых клеток нормализуют до 10 мг/мл буфером для лизиса.

ИФА SMAD.

Лизаты опухолевых клеток анализируют, применяя независимые планшеты для ИФА, где один планшет применяют для определения общего уровня SMAD 2/3, а другой планшет применяют для определения уровней фосфоSМАD2. В то время как покрывающее антитело одинаково для обоих планшетов, вторичное антитело является специфичным по отношению к общему SMAD 2/3 или фосфоSМАD2. Данные планшеты совместно относятся к Планшетам для ИФА и по отдельности к Планшету для общего ИФА и Планшету для фосфо ИФА соответственно. Покрыващее антитело получают в количестве 2,5 мкг/мл в BupH карбонатно-бикарбонатном буфере (моноклональное антитело по отношению к SMAD 2/3, BD Biosciences № 610843; BupH карбонат-бикарбонат от Pierce № 28382) и добавляют в количестве 100 мкл на лунку в 96-луночные иммунопланшеты (Thermo Scientific № 439454), и инкубируют в течение ночи при 4°С на качалке с платформой, чтобы получить планшеты для ИФА. Далее указанные планшеты для ИФА четыре раза промывают промывочным буфером (0,5% TWEEN® 20 в Трис-буферном солевом растворе (TBS), рН 8,0, получен от Sigma, № Т-9039) и далее блокируют при помощи блокирующего буфера в количестве 200 мкл на лунку (1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 1 х TBS) при комнатной температуре на шейкере с платформой в течение двух часов. Промывают четыре раза промывочным буфером. К планшету для ИФА фосфоSМАD добавляют в количестве 100 мкл на лунку лизата опухолевых клеток или лизата носителя в количестве 10 мг/мл в соответствующие лунки. К планшету для общего ИФА добавляют буфер для лизиса в количестве 98 мкл на лунку и 10 мг/мл лизата опухолевых клеток или лизата носителя в количестве 2 мкл на лунку в соответствующие лунки (0,02 мг конечного лизата белка). Калибровочную кривую также добавляют к каждому планшету для ИФА (как к фосфо, так и общему), применяя очищенный pSMAD2. Инкубируют в течение ночи. Указанные планшеты для ИФА заново промывают четыре раза промывочным буфером. Вторичные антитела (моноклональное антитело по отношению к фосфоSМАD2 кролика, Millipore, № 04-953; поликлональное антитело по отношению к SMAD 2/3 кролика, Millipore, № 07-408) подготавливают в разведении 1:500 в буфере для лизиса с добавлением 1% БСА и добавляют в количестве 100 мкл на лунку в соответствующий планшет. Указанные планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение двух-трех часов. Промывают четыре раза промывочным буфером и к планшетам добавляют репортерное антитело в количестве 100 мкл на лунку (антитело по отношению к HRP кролика, GE Healthcare № NAV934V, разведенное 1:10000 в блокирующем буфере). Инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре и указанные планшеты промывают последние четыре раза промывочным буфером, и добавляют 3,3',5,5'-тетраметилбензидин в количестве 100 мкл на лунку при комнатной температуре (ТМБ; Surmodics/BioFX № TMBW-0100-01). Планшеты инкубируют при 37°С в течение тридцати мин. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл стоп-раствора (1Н H₂SO₄). Снимают показания значений оптической плотности (ОП) при 450 нм на планшете-ридере.

Соотношение общего SMAD (tSMAD) к фосфоSМАD (pSMAD) применяют для группы с носителем для определения минимального ингибирования (0%) сигнала pSMAD. Рассчитывают процент ингибирования для групп, получавших лечение соединениями, по отношению к минимальному ингибированию pSMAD для группы с носителем. Вычисляют TED₅₀ и TED₈₀ по результатам исследования зависимости доза-ответ (доза, необходимая для достижения 50 и 80% ингибирования в данный момент времени соответственно), применяя процедуру NLIN в SAS (версия 9,3, Cary, NC). Данный анализ показывает, что пример 1 обладает значением TED₅₀ в 10,8 мг/кг через 2 ч после 1-й дозы и TED₈₀ в 24,1 мг/кг. В ходе проведения анализа временной динамики при дозе TED₅₀ (11 pmk) пример 1 демонстрирует 48% ингибирование через один час и 39% ингибирование через два часа после дозирования. В ходе проведении анализа временной динамики при TED₈₀ (25 pmk) пример 1 демонстрирует 71% ингибирование через один

- 33 031830 час и 70% ингибирование через два часа после дозирования.

Указанные соединения согласно настоящему изобретению являются в целом эффективными в широком диапазоне дозировок. Например, значения дозировок на день обычно находятся в дневном диапазоне приблизительно от 1 до 2000 мг. Предпочтительно такие дозы находятся в пределах дневного диапазона от 10 до 1000 мг. Более предпочтительно такие дозы находятся в дневном диапазоне от 10 до 100 мг. Еще более предпочтительно такие дозы находятся в дневном диапазоне от 10 до 80 мг. Наиболее предпочтительно такие дозы находятся в дневном диапазоне от 10 до 50 мг. В некоторых случаях уровни дозировки, находящиеся ниже нижнего предела вышеуказанных диапазонов, могут быть более чем достаточными, в то время как в других случаях могут быть использованы еще более высокие дозы, и, следовательно, вышеуказанные диапазоны дозировок не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом. Следует понимать, что фактически вводимое количество указанного соединения будет определяться лечащим врачом в свете соответствующих обстоятельств, включая состояния, подлежащие лечению, выбранный способ введения, фактически вводимое соединение или соединения, возраст, массу и реакцию конкретного пациента и тяжесть симптомов пациента.

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы где R¹ представляет собой водород, изопропил, дифторметил, дифторэтил или циклопропил;

   R² представляет собой этил, трет-бутил, пиридин-2-ил, тетрагидропиран-4-ил, тетрагидрофуран-3ил, циклопропил или циклобутил; и

   R³ представляет собой карбамоилфенил, пиридин-2-ил, (1-гидрокси-1-метилэтил)пиридинил, 1метил-2-оксо-1Н-пиридин-4-ил, 1-метилпиразолил, пиразин-2-ил, 2-метоксипиримидин-4-ил, 1-метил-2оксо-1Н-пиримидин-4-ил, пиридазин-3-ил, 6-хлорпиридазин-3-ил, 6-метилпиридазин-3-ил или 6-метоксипиридазин-3-ил;

   или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где соединение представляет собой 2- {4- [(4- {[ 1 -циклопропил-3 -(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1 Н-пиразол-4-ил] окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол.
3. 3. Соединение по п.1 или 2 или его фармацевтически приемлемая соль, где соль представляет собой 2-{4- [(4- {[ 1 -циклопропил-3 -(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1 Н-пиразол-4-ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол 4-метилбензолсульфонат.
4. 4. Соединение по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемая соль, где соль представляет собой кристаллический 2-{4-[(4-{[1-циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол 4-метилбензолсульфонат.
5. 5. Соединение по любому из пп.1-4 или его фармацевтически приемлемая соль, где соль представляет собой кристаллический 2-{4-[(4-{[1-циклопропил-3-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-1Н-пиразол-4ил]окси}пиридин-2-ил)амино]пиридин-2-ил}пропан-2-ол 4-метилбензолсульфонат, характеризующийся дифрактограммой рентгеновской порошковой дифракции (излучение меди, λ-1,54060 А), содержащей пик при 17,8° с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 19,7, 18,4 и 22,0° (2θ ± 0,2°).
6. 6. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-5 или его фармацевтически приемлемую соль и одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, носителей или разбавителей.
7. 7. Применение соединения по любому из пп.1-5 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака.
8. 8. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак выбран из группы, состоящей из рака толстой кишки, меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака почки, глиобластомы, рака поджелудочной железы, миелодиспластического синдрома, рака легких и рака желудка.
9. 9. Применение соединения по любому из пп.1-5 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения фиброза.
10. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что фиброз выбран из группы, состоящей из фиброза печени и хронического заболевания почек.