KR20170045348A

KR20170045348A - 아미노피리딜옥시피라졸 화합물

Info

Publication number: KR20170045348A
Application number: KR1020177009123A
Authority: KR
Inventors: 더글라스 더블유. 베이트; 데이빗 에이. 코티즈; 사잔 조셉; 윌리엄 티. 맥밀렌; 사라바난 파타사라티; 화싱 페이; 제이슨 스콧 소이어; 크레이그 디. 울판젤; 가잉 챠오
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2014-10-07
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2017-04-26
Also published as: MA41038B1; NZ729800A; TR201816415T4; US9617243B2; EP3204377A1; CO2017002233A2; CY1120903T1; WO2016057278A1; BR112017005453A2; KR101921847B1; TWI582083B; BR112017005453A8; SV2017005411A; JP2016535745A; HRP20181797T1; AR102003A1; JP6043894B2; TW201623282A; TN2017000046A1; MA41038A

Abstract

본 발명은 형질전환 성장 인자 베타 수용체 1 (TGFβRI)의 활성을 억제하는 신규 아미노피리딜옥시피라졸 화합물, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물, 및 상기 화합물을 사용하여 암, 바람직하게는 결장암, 흑색종, 간세포 암종, 신장암, 교모세포종, 췌장암, 골수이형성 증후군, 폐암, 및 위암, 및/또는 섬유증, 바람직하게는 간 섬유증 및 만성 신장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

아미노피리딜옥시피라졸 화합물 {AMINOPYRIDYLOXYPYRAZOLE COMPOUNDS}

본 발명은 형질전환 성장 인자 베타 수용체 1 (TGFβR1)의 활성을 억제하는 신규 아미노피리딜옥시피라졸 화합물, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물, 및 상기 화합물을 사용하여 암, 바람직하게는 결장암, 흑색종, 간세포 암종 (HCC), 신장암, 교모세포종 (GBM), 췌장암, 골수이형성 증후군 (MDS), 폐암, 및 위암, 및/또는 섬유증, 바람직하게는 간 섬유증 및 만성 신장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

형질전환 성장 인자 베타 (TGF-베타 또는 TGFβ)는 TGF-베타 유형 I 및 유형 II 세린/트레오닌 키나제 수용체의 이형체성 복합체에 결합하여 상기 TGF-베타 수용체 복합체를 활성화시키는 다기능 시토카인이며, 상기 복합체는 SMAD2 및 SMAD3을 인산화시켜 활성화시키고, 그 다음에 SMAD2 및 SMAD3은 SMAD4와 회합하고 핵으로 이동하여 상이한 표적 유전자들의 발현을 조절한다. TGF-베타 수용체 신호 전달 경로의 핵심 요소(key player)는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, TGFβR1, TGFβR2, SMAD, SnoN, SARA, SKI, DAB, TRAP, TAK1, SMIF, E2F4, E2F5, RBL1, RBL2, RB1, TFDP1, TFDP2, SMURF1, SMURF2, P300, CBP, 및 JUN을 포함한다. SMAD 매개 TGF-베타 수용체 경로는 다양한 세포 및 생리학적 과정, 예컨대 증식, 분화, 성장, 이동, 수초형성, 세포 주기 정지, 아폽토시스 및 발생을 조절한다.

TGFβR1의 소 분자 억제제는 암 및/또는 섬유증의 치료를 위해 관련 기술분야에 이미 공지되어 있다. 예를 들어, WO2012/002680, WO2009/022171, WO2004/048382, 및 WO2002/094833을 참조한다. 유감스럽게도, 많은 유형의 암 또는 섬유증에 대해 어떤 공지된 치유적 치료는 없다. 암, 바람직하게는 결장암, 흑색종, 간세포 암종 (HCC), 신장암, 교모세포종 (GBM), 췌장암, 골수이형성 증후군 (MDS), 폐암, 및 위암, 및/또는 섬유증, 바람직하게는 간 섬유증 및 만성 신장 질환의 치료를 위한 TGFβR1의 추가의 소분자 억제제, 특히 TGFβR1에 대해 보다 선택적인 화합물을 갖는 것이 바람직할 것이다.

본 발명은 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:

상기 식에서,

R¹은 수소, 이소프로필, 디플루오로메틸, 디플루오로에틸, 또는 시클로프로필이고;

R²는 에틸, tert-부틸, 피리딘-2-일, 테트라히드로피란-4-일, 테트라히드로푸란-3-일, 시클로프로필, 또는 시클로부틸이고;

R³은 카르바모일페닐, 피리딘-2-일, (1-히드록시-1-메틸에틸)피리디닐, 1-메틸-2-옥소-1H-피리딘-4-일, 1-메틸피라졸릴, 피라진-2-일, 2-메톡시피리미딘-4-일, 1-메틸-2-옥소-1H-피리미딘-4-일, 피리다진-3-일, 6-클로로피리다진-3-일, 6-메틸피리다진-3-일, 또는 6-메톡시피리다진-3-일이다.

본 발명은 또한 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 또한 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 -4-메틸벤젠술포네이트를 제공한다.

본 발명은 또한 결정질 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 4-메틸벤젠술포네이트를 제공한다. 본 발명은 19.7°, 18.4°, 및 22.0° (2θ±0.2°)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 함께 17.8°에서 피크를 포함하는 X-선 분말 회절 패턴 (Cu 방사선, λ-1.54060 Å)을 특징으로 하는, 결정질 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 4-메틸벤젠술포네이트를 추가로 제공한다.

본 발명은 또한 암, 바람직하게는 결장암, 흑색종, 간세포 암종 (HCC), 신장암, 교모세포종 (GBM), 췌장암, 골수이형성 증후군 (MDS), 폐암, 및 위암의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물 또는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암, 바람직하게는 결장암, 흑색종, 간세포 암종 (HCC), 신장암, 교모세포종 (GBM), 췌장암, 골수이형성 증후군 (MDS), 폐암, 및 위암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 섬유증, 바람직하게는 간 섬유증 및 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물 또는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 섬유증, 바람직하게는 간 섬유증 및 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 화합물 또는 염, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 요법에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 염을 제공한다. 게다가, 본 발명은 암, 바람직하게는 결장암, 흑색종, 간세포 암종 (HCC), 신장암, 교모세포종 (GBM), 췌장암, 골수이형성 증후군 (MDS), 폐암, 및 위암 및/또는 섬유증, 바람직하게는 간 섬유증 및 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 염을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 암, 바람직하게는 결장암, 흑색종, 간세포 암종 (HCC), 신장암, 교모세포종 (GBM), 췌장암, 골수이형성 증후군 (MDS), 폐암, 및 위암 및/또는 섬유증, 바람직하게는 간 섬유증 및 만성 신장 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 화합물 또는 염의 용도를 제공한다.

하기 단락은 본 발명의 바람직한 부류를 기재한다:

a) R¹은 디플루오로메틸, 디플루오로에틸, 또는 시클로프로필이고;

b) R²는 피리딘-2-일, 테트라히드로피란-4-일, 또는 시클로프로필이고;

c) R³은 카르바모일페닐 또는 (1-히드록시-1-메틸에틸)피리디닐이고;

d) R¹은 시클로프로필이고 R²는 테트라히드로피란-4-일이고;

e) R¹은 시클로프로필이고 R²는 시클로프로필이고;

f) R¹은 디플루오로에틸이고 R²는 테트라히드로피란-4-일이고;

g) R¹은 디플루오로메틸이고 R²는 피리드-2-일이고;

h) R¹은 시클로프로필, R²는 테트라히드로피란-4-일이고, R³은 (1-히드록시-1-메틸에틸)피리디닐이고;

i) R¹은 시클로프로필이고, R²는 시클로프로필이고, R³은 (1-히드록시-1-메틸에틸)피리디닐이고;

j) R¹은 디플루오로에틸이고, R²는 테트라히드로피란-4-일이고, R³은 (1-히드록시-1-메틸에틸)피리디닐이고;

k) R¹은 디플루오로메틸이고, R²는 피리딘-2-일이고, R³은 카르바모일페닐이다.

통상의 독자는 본 발명의 화합물의 유리 염기 형태가 염을 형성할 수 있고 이러한 염이 본 발명의 일부로 고려된다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 유리 염기 화합물은 아민이며, 따라서 다수의 무기 및 유기 산 중 어느 하나의 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가 염을 형성한다. 이러한 제약상 허용되는 산 부가 염 및 이들을 제조하기 위한 통상적인 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008)]; [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977]을 참조한다. 통상의 기술자는 염 화학량론이 쉽게 결정될 수 있다는 것을 이해한다. 예를 들어, 문헌 [D. Risley, et al., Simultaneous Determination of Positive and Negative Counterions Using a Hydrophilic Interaction Chromatography Method, LCGC NORTH AMERICA, Vol 24, No. 8, August 2006 pages 776-785]을 참조한다.

본 발명의 화합물 중 특정의 것은 결정질이다. 임의의 주어진 결정 형태에 대해, 회절 피크의 상대 강도는 결정 형태 및 성질과 같은 인자들로부터 기인한 바람직한 배향으로 인해 다를 수 있다는 것이 결정학 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 배향의 영향이 존재하는 경우, 피크 강도는 변경되지만, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995]을 참조한다. 더욱이, 임의의 주어진 결정 형태에 대해, 각 피크 위치는 약간 다를 수 있다는 것은 결정학 분야에 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도 또는 습도의 변화, 샘플 변위, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인해 이동할 수 있다. 본 경우에, 2θ로 ± 0.2의 피크 위치 가변성은 명시된 결정 형태의 명백한 동정을 방해하지 않으면서 이들 잠재적 변화를 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 구별되는 피크 (°2θ의 단위로), 전형적으로는 보다 두드러진 피크의 임의의 특유의 조합을 기준으로 이루어질 수 있다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집된 결정 형태의 회절 패턴은 8.853 및 26.774도 2-세타에서 NIST 675 표준 피크를 기준으로 조정된다.

본 발명의 화합물은 관련 기술분야에 널리 공지되고 인식된 방법에 의해 하기 합성 반응식에 따라 제조될 수 있다. 이들 반응식의 단계에 적합한 반응 조건은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 용매 및 공-시약의 적절한 치환은 관련 기술분야의 기술 범위 내에 있다. 마찬가지로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 합성 중간체가 필요 또는 요구에 따라 다양한 널리 공지된 기술에 의해 단리 및/또는 정제될 수 있으며, 빈번하게, 거의 또는 전혀 정제하지 않고 후속 합성 단계에서 다양한 중간체를 직접 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 더욱이, 통상의 기술자는 일부 환경에서, 모이어티가 도입되는 순서가 중대하지 않다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 화합물을 제조하는 데 필요한 단계의 특정한 순서는 통상의 화학자가 잘 인식하는 바와 같이, 합성되는 특정한 화합물, 출발 화합물, 및 치환 모이어티의 상대적 경향에 따라 달라진다. 모든 치환체는 달리 명시되지 않는 한, 앞서 정의된 바와 같고, 모든 시약은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 인식되어 있다.

본 발명의 일부 중간체 또는 화합물은 1개 이상의 키랄 중심을 가질 수 있다. 본 발명은 모든 개개의 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체, 뿐만 아니라 라세미체를 포함한 상기 화합물의 거울상이성질체 및 부분입체이성질체의 혼합물을 고려한다. 적어도 1개의 키랄 중심을 함유하는 본 발명의 화합물은 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서 존재하는 것이 바람직하다. 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 키랄 시약으로 시작하여 또는 입체선택적 또는 입체 특이적 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 대안으로, 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 표준 키랄 크로마토그래피 또는 결정화 기술에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있다. 통상의 기술자는 일부 상황에서 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체의 용리 순서가 상이한 크로마토그래피 칼럼 및 이동상으로 인해 상이할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

화합물명에서 "이성질체 1"의 지정은 한 쌍의 거울상이성질체의 혼합물이 키랄 크로마토그래피에 의해 분리될 때 본 발명의 상응하는 중간체 또는 화합물이 2개의 용리 거울상이성질체 중 첫 번째인 것을 나타낸다. 화합물명에서 "이성질체 2"의 지정은 한 쌍의 거울상이성질체의 혼합물이 키랄 크로마토그래피에 의해 분리될 때 본 발명의 상응하는 중간체 또는 화합물이 2개의 용리 거울상이성질체 중 두 번째인 것을 나타낸다.

본 발명의 화합물은 하기 반응식에 예시된 바와 같이 합성될 수 있으며, 여기서 R¹, R², 및 R³은 앞서 정의된 바와 같다.

<반응식 1>

화학식 I의 화합물의 합성

반응식 1은 화학식 I의 화합물의 일반 합성을 예시한다. 화합물 1을 실온에서 또는 승온에서 적합한 염기, 예컨대 탄산세슘 또는 탄산칼륨과 함께 적합한 용매, 예컨대 디메틸포름아미드 (DMF) 또는 아세톤 중에서 2-클로로피리딘-4-올과 반응시켜 화합물 2를 수득한다. 화합물 2를 승온에서 1,1-디메톡시-N,N-디메틸-메탄아민과 반응시켜 화합물 3을 형성시킨다. 화합물 3을 정제하거나 추가 정제 없이 사용하여 아세트산 중 히드라진과 반응시켜 화합물 4를 수득할 수 있다. 화합물 4를 찬-람(Chan-Lam) 커플링 조건하에 적합한 알킬화 시약, 예컨대 포타슘 알킬트리플루오로보레이트 또는 알킬보론산과 반응시켜 화합물 5를 형성시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 맨 먼저 적합한 용매, 예컨대 1,2-디클로로에탄 중 2,2'-비피리딘 및 아세트산구리(II)의 현탁액을 승온으로 가열하고 질소로 퍼지한 다음에, 반응 혼합물을 여과하고 여액을 적합한 용매, 예컨대 1,2-디클로로에탄 중 화합물 4, 적합한 보로네이트, 예컨대 포타슘 알킬트리플루오로보레이트 또는 알킬보론산, 및 적합한 염기, 예컨대 탄산나트륨의 혼합물에 첨가한다. 반응 혼합물을 승온으로 가열하여 화합물 5를 수득한다. 화합물 4를 또한 적절한 용매, 예컨대 DMF 또는 테트라히드로푸란 (THF) 중 적합한 염기, 예컨대 수소화나트륨과 함께 적합한 알킬 할라이드, 예컨대 알킬 아이오다이드, 알킬 브로마이드 또는 알킬 클로라이드와 반응시켜 화합물 5를 수득할 수 있다. 화합물 5를 널리 공지된 부흐발트(Buchwald) 커플링 조건하에 적합한 아민과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득한다. 보다 구체적으로, 화합물 5를 적절한 용매, 예컨대 1,4-디옥산 중 적합한 염기, 예컨대 탄산세슘, 적합한 리간드 시약, 예컨대 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐, 및 적합한 촉매, 예컨대 아세트산팔라듐(II)의 존재하에 승온에서 적합한 아민과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득한다.

<반응식 2>

R ¹ 이 H인 경우의 화학식 I의 화합물의 합성

반응식 2는 R¹이 H인 경우의 화학식 I의 화합물의 일반 합성을 예시한다. 반응식 1의 단계 4에 예시된 바와 같이, 알킬화 시약이 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 클로라이드인 경우, 단계 4를 통한 알킬화 및 단계 5를 통한 부흐발트 커플링 반응에 의해 화합물 6을 수득할 수 있다. 화합물 6을 트리플루오로아세트산 중 트리에틸실란과 반응시켜 R¹이 H인 화학식 I의 화합물을 수득할 수 있다. R¹이 H인 경우, 화학식 I의 화합물은 수소가 피라졸릴 고리상의 2개의 질소 사이를 이동할 수 있는 한 쌍의 호변이성질체로서 존재할 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

<반응식 3>

R ³ 이 ( 카르바모일 ) 페닐인 경우의 화학식 I의 화합물의 합성

반응식 3은 R³이 (카르바모일)페닐 기인 경우의 화학식 I의 화합물의 일반 합성을 예시한다. R³이 적합하게 치환된 벤조니트릴인 경우 반응식 1의 단계 5에 예시된 방법에 의해 화합물 7을 제조할 수 있다. 화합물 7을 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 과산화수소 및 적합한 염기, 예컨대 탄산칼륨과 반응시켜 R³이 (카르바모일)페닐 기인 경우의 화학식 I의 화합물을 수득한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 하기 용어는 명시된 의미를 갖는다: "ACN"은 아세토니트릴을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고; "DMF"는 N,N-디메틸포름아미드를 나타내고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "DTT"는 디티오트레이톨을 지칭하고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 지칭하고; "EGTA"는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산을 지칭하고; "ELISA"는 효소-결합 면역흡착 검정을 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "EtOH"는 에탄올을 지칭하고; "FBS"는 태아 소 혈청을 지칭하고; "HEC"는 히드록시에틸셀룰로스를 지칭하고; "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭하고; "IVTI"는 생체내 표적 억제를 지칭하고; "MS"는 질량 분광학을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "NMR"은 핵 자기 공명을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "TBS"는 트리스 완충 염수를 지칭하고; "TED"는 역치 유효 용량을 지칭하고; "UVW"는 자외선 파장을 지칭하고, "XRD"는 X-선 회절을 지칭한다.

달리 언급하지 않는 한, 본원에 예시된 화합물은 ACDLABS 또는 엑설리스(Accelrys) 드로우(Draw) 4.1을 사용하여 명명되고 넘버링된다.

제조예 1

2-(4-브로모-2-피리딜)프로판-2-올

3 리터의 3구 환저 플라스크에 첨가 깔때기, 환류 응축기, 질소 주입구 및 온도 탐침을 장착하였다. 메틸마그네슘 브로마이드 (2-메틸테트라히드로푸란 중 3.2M, 239.07 mL, 765.01 mmol)로 충전하고 얼음조에서 냉각하였다. 첨가 깔대기에, THF (800.0 mL) 중 에틸 4-브로모피리딘-2-카르복실레이트 (80.0 g, 347.73 mmol)의 용액을 첨가하였다. 용액을 내부 온도를 25℃ 미만으로 유지하면서 메틸마그네슘 브로마이드 용액에 첨가하였다. 냉각조를 제거하고 30분 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 5℃로 냉각하고 염산 수용액 (1M)을 내부 온도를 30℃ 미만으로 유지하면서 적가하여 신중히 켄칭하였다. 혼합물이 pH 약 7에 이를 때까지 추가의 염산 수용액 (1M)을 첨가하였다. 냉각조를 제거하고 에틸 아세테이트 (EtOAc; 200 mL)로 희석하였다. 유기 층을 단리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 셀라이트(CELITE)® 플러그를 통해 여과하고 EtOAc로 세정하였다. 여액을 농축하여 오렌지색 오일을 수득하였다. 헥산/EtOAc (3/1)으로 용리시키면서 실리카겔 플러그를 사용함으로써 정제하여 표제 화합물 (63.15 g; 84.0% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다. MS (m/z): 216/218 (M+1/M+3).

본질적으로 제조예 1의 방법에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

<표 1>

제조예 3

2-(4-아미노-2-피리딜)프로판-2-올

2 리터의 파르(Parr) 반응기를 교반 막대기, 구리 (분말 메시, 12.6 g, 198.6 mmol), 2-(4-브로모-2-피리딜)프로판-2-올 (63.1 g, 292.0 mmol) 및 수산화암모늄 (물 중 28 wt/wt%, 757.2 mL)으로 충전하였다. 반응 혼합물을 그것이 암청색일 때까지 30분 동안 외기에서 교반하였다. 교반 막대기를 제거하고, 기계적 교반 탑(stirring top)을 부착하고, 밀봉하고, 교반기 상에 배치하였다. 혼합물을 100℃로 가열하고 (내부, 120℃에서 조를 가열) 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 2-메틸테트라히드로푸란 (600 mL)을 첨가하였다. 셀라이트® 플러그를 통해 여과하고 2-메틸테트라히드로푸란으로 세정하였다. 유기 층을 단리하고 수성 층을 2-메틸테트라히드로푸란 (200 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 합하고 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고, 농축하고 밤새 진공하에 건조시켜 표제 화합물 (31.3 g; 70.4% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다. MS (m/z): 153 (M+1).

본질적으로 제조예 3의 방법에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

<표 2>

제조예 5

2-브로모-1-테트라히드로피란-4-일-에타논

방법 1:

옥살릴 클로라이드 (28.69 mL, 330.73 mmol)를 DCM (250 mL) 및 DMF (15 방울) 중 테트라히드로피란-4-카르복실산 (39.13 g, 300.67 mmol)의 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 질소하에 2.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 감압하에 농축하고 잔류물을 DCM (250 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 -10℃에서 (트리메틸실릴)디아조메탄 (헥산 중 2M, 450 mL, 900.00 mmol)에서 적가하고 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 브로민화수소산 (물 중 48 wt/wt%, 52 mL, 462.73 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 브로민화수소산 (물 중 48 wt/wt%, 26 mL, 231.36 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 물 (250 mL), DCM (250 mL)을 첨가하고 유기 층을 단리하였다. 수성 층을 DCM (2 x 250 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 합하고 포화 중탄산나트륨 수용액 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압하에 농축하여 표제 화합물 (58.2 g; 93.48% 수율)을 갈색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.00 (m, 2H), 3.95 (s, 2H), 3.45 (m, 2H), 2.98 (m, 1H), 1.78 (m, 4H).

방법 2:

메탄올 (MeOH; 50 mL) 중 1-테트라히드로피란-4-일에타논 (10 g, 78.02 mmol)의 용액을 -10℃로 냉각하였다. 브로민 (4.01 mL, 78.02 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 45분 동안 0℃에서 교반한 다음에 45분 동안 10℃에서 교반하였다. 황산의 수용액 (11M, 27.5 mL, 302.50 mmol)을 첨가하고 생성된 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 물을 첨가하고 디에틸 에테르로 3회 추출하였다. 유기 층을 합하였다. 물 및 중탄산나트륨의 수용액으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압하에 농축하여 표제 화합물 (12 g; 74.28% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400.13 MHz, CDCl₃) δ 4.00 (m, 2H), 3.95 (s, 2H), 3.45 (m, 2H), 2.98 (m, 1H), 1.78 (m, 4H).

제조예 6

2-[(2-클로로-4-피리딜)옥시]-1-테트라히드로피란-4-일-에타논

방법 1:

DMF (50 mL) 중 2-브로모-1-테트라히드로피란-4-일-에타논 (24.35 g, 117.60 mmol)의 용액을 실온에서 DMF (380 mL) 중 2-클로로피리딘-4-올 (13.85 g, 106.91 mmol) 및 탄산세슘 (69.67 g, 213.82 mmol)의 교반 혼합물에 적가하였다. 생성된 혼합물을 2.5시간 동안 90℃에서 교반하였다. 실온으로 냉각하여 조 혼합물을 수득하였다. 상기 명시된 바와 같이 시행된 또 다른 2.85 g (2-클로로피리딘-4-올)규모 반응의 조 혼합물과 합하였다. 합해진 혼합물을 물 (200 mL) 및 EtOAc (300 mL)로 희석하였다. 유기 층을 단리하고 수성 층을 EtOAc (3 x 250 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고 물 (100 mL) 및 포화 수성 염화나트륨 (100 mL)으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 여액을 감압하에 농축하여 표제 화합물 (29.32 g; 88.96% 수율)을 갈색 오일로서 수득하였다. MS (m/z): 256 (M+1).

방법 2 :

2-브로모-1-테트라히드로피란-4-일-에타논 (10.03 g, 48.42 mmol) 및 탄산칼륨 (10.14 g, 72.62 mmol)을 아세톤 (150 mL) 중 2-클로로피리딘-4-올 (6.40 g, 48.42 mmol)의 용액에 첨가하고 생성된 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 여과하여 고체를 제거하고 고체를 DCM으로 세척하였다. 여액을 감압하에 농축하여 표제 화합물을 정량적으로 수득하였다. MS (m/z): 256 (M+1).

본질적으로 제조예 6의 방법 2 에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

<표 3>

제조예 13

2-클로로-4-[(3-테트라히드로피란-4-일-1H-피라졸-4-일)옥시]피리딘

2시간 동안 100℃에서 2-[(2-클로로-4-피리딜)옥시]-1-테트라히드로피란-4-일-에타논 (29.3 g, 114.59 mmol)과 1,1-디메톡시-N,N-디메틸-메탄아민 (65 mL, 486.83 mmol)의 혼합물을 교반하였다. 실온으로 냉각하고, 감압하에 농축하고 잔류물을 EtOAc (400 mL)에 용해시켰다. 물 (100 mL) 및 포화 수성 염화나트륨 (100 mL)으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압하에 농축하여 갈색 고체를 수득하였다. 아세트산 (350 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각하였다. 히드라진 일수화물 (16.8 mL, 345.66 mmol)을 첨가하고 질소하에 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 얼음/물 혼합물 (250 mL)에 붓고 EtOAc (4 x 200 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고 물 (200 mL), 포화 중탄산나트륨 수용액 (100 mL) 및 포화 수성 염화나트륨 (100 mL)으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 여액을 감압하에 농축하여 갈색 오일을 수득하였다. 갈색 오일을 EtOAc로 용리시키면서 실리카겔 플러그를 사용함으로써 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 감압하에 농축하였다. 진공하에 건조시켜 표제 화합물 (24.43 g; 76.22% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다. MS (m/z): 280 (M+1).

본질적으로 제조예 13의 방법에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

<표 4>

제조예 20

2-클로로-4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로피란-4-일-피라졸-4-일)옥시-피리딘

방법 1 :

25분 동안 75℃에서 1,2-디클로로에탄 (244.3 mL) 중 2,2'-비피리딘 (13.73 g, 87.90 mmol)과 아세트산구리(II) (15.97 g, 87.90 mmol)의 혼합물을 환류시킨 다음에 실온으로 냉각하였다. 1,2-디클로로에탄 (335.30 mL) 중 2-클로로-4-[(3-테트라히드로피란-4-일-1H-피라졸-4-일)옥시]피리딘 (24.43 g, 79.91 mmol)의 용액을 첨가한 다음에, 시클로프로필보론산 (13.73 g, 159.82 mmol) 및 탄산나트륨 (16.94 g, 159.82 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 산소 분위기 하에 2시간 동안 75℃에서 가열하고 실온으로 냉각하였다. EtOAc (200 mL)로 희석하고, 실리카겔 플러그를 통해 여과하고 EtOAc (250 mL)로 세정하였다. 여액을 물 (200 mL) 및 포화 수성 염화나트륨 (200 mL)으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 여액을 감압하에 농축하고 잔류물을 밤새 실온에서 진공 하에 건조시켰다. DCM 중 6-27% EtOAc로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (20.75 g; 81.2% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다. MS (m/z): 320 (M+1).

방법 2 :

1,2-디클로로에탄 (50 mL) 중 2,2'-비피리딘 (28.8 g, 56.5 mmol) 및 아세트산구리(II) (8.2 g, 45.2 mmol)의 현탁액을 70℃로 가열하고 3분 동안 질소로 퍼지하였다. 여과하고 여액을 1,2-디클로로에탄 (50 mL) 중 2-클로로-4-[(3-테트라히드로피란-4-일-1H-피라졸-4-일)옥시]피리딘 (8 g, 22.6 mmol), 포타슘 시클로프로필(트리플루오로)보레이트 (6.7 g, 45.2 mmol) 및 탄산나트륨 (4.8 g, 45.2 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4일 동안 70℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각하였다. 여과하고 DCM으로 세정하였다. 여액을 포화 염화암모늄 수용액 및 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 여액을 감압하에 농축하였다. DCM 중 1-10% MeOH로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (6.0 g; 82.2% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 320 (M+1).

본질적으로 제조예 20의 방법 1 에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

후처리 절차에서의 변경을 명시하였다.

<표 5>

본질적으로 제조예 20의 방법 2 에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

<표 6>

제조예 27

2-클로로-4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로푸란-3-일-피라졸-4-일)옥시-피리딘, 이성질체 1

키랄 크로마토그래피로 2-클로로-4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로푸란-3-일-피라졸-4-일)옥시-피리딘 (제조예 25)의 라세미 혼합물을 정제하여 제1 용리 거울상이성질체를 표제 화합물로서 수득하였다. MS (m/z): 306 (M+1).

정제 조건: 키랄팩(CHIRALPAK)® IC; 이동상: 이산화탄소 중 20% 에탄올 (EtOH); 유량: 300 g/분; UVW: 240 nm; 체류 시간: 2.44분.

제조예 28

2-클로로-4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로푸란-3-일-피라졸-4-일)옥시-피리딘, 이성질체 2

키랄 크로마토그래피로 2-클로로-4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로푸란-3-일-피라졸-4-일)옥시-피리딘 (제조예 25)의 라세미 혼합물을 정제하여 제2 용리 거울상이성질체를 표제 화합물로서 수득하였다. MS (m/z): 306 (M+1).

정제 조건: 키랄팩® IC; 이동상: 이산화탄소 중 20% EtOH; 유량: 300 g/분; UVW: 240 nm; 체류 시간: 2.93분.

제조예 29

2-클로로-4-[1-(디플루오로메틸)-3-(2-피리딜)피라졸-4-일]옥시-피리딘

DMF (73.34 mL) 중 2-클로로-4-[[3-(2-피리딜)-1H-피라졸-4-일]옥시]피리딘 (2.0 g, 7.33 mmol)의 용액을 얼음조에서 냉각하고 수소화나트륨 (광유 중 60%, 880.02 mg, 22.00 mmol)을 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 0℃에서 교반하고, 이를 실온으로 가온하고 10분 동안 교반하였다. 디플루오로아이오도메탄 (THF 중 10 wt%, 27.19 mL, 36.67 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 45℃에서 교반하였다. 실온으로 냉각하고 EtOAc로 희석하였다. 5% 염화리튬 수용액으로 맨 먼저 세척한 다음에 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 여액을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 DCM 중 0-50% EtOAc로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 감압하에 농축하였다. 잔류물을 DCM 중 0-10% EtOAc로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (1.56 g; 65.9% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 323 (M+1).

본질적으로 제조예 29의 방법에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

용매, 염기, 및/또는 반응 온도에서의 변경을 명시하였다.

<표 7>

제조예 41

2-클로로-4-{[3-(피리딘-2-일)-1-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘

수소화나트륨 (광유 중 60% 현탁액, 484 mg, 12.10 mmol)을 0℃에서 THF (110 mL) 중 2-클로로-4-[[3-(2-피리딜)-1H-피라졸-4-일]옥시]피리딘 (3.0 g, 11.00 mmol)의 용액에 첨가하였다. 0℃에서 15분 동안 교반하고 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 클로라이드 (2.02 g, 12.10 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 DCM 및 물에 분배하였다. 유기 층을 단리하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 여액을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 헥산 중 0-30% EtOAc로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (3.64 g; 82.1% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 403 (M+1).

제조예 42

4-[[4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로피란-4-일-피라졸-4-일)옥시-2-피리딜]아미노]벤조니트릴

1,4-디옥산 (15 mL) 중 2-클로로-4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로피란-4-일-피라졸-4-일)옥시-피리딘 (400 mg, 1.2 mmol), p-아미노벤조니트릴 (219.9 mg, 1.9 mmol), 탄산세슘 (568.5 mg, 1.7 mmol), 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐 (134.6 mg, 0.23 mmol)의 용액을 5분 동안 질소로 퍼지하였다. 생성된 혼합물을 아세트산팔라듐(II) (26.1 mg, 0.12 mmol)으로 처리하고 5분 동안 질소로 퍼지하였다. 바이알을 밀폐하고 2시간 동안 100℃에서 그 다음에 주말에 걸쳐 80℃에서 교반하였다. 실온으로 냉각하고, 셀라이트® 플러그를 통해 여과하고 DCM 중 5% MeOH로 세척하였다. 여액을 농축하여 표제 화합물 (467 mg; 100% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 402 (M+1).

본질적으로 제조예 42의 방법에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

촉매, 및/또는 용매에서의 변경을 명시하였다.

<표 8>

실시예 1

2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올

방법 1:

1,4-디옥산 (456 mL) 중 2-클로로-4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로피란-4-일-피라졸-4-일)옥시-피리딘 (45.6 g, 142.6 mmol), 2-(4-아미노-2-피리딜)프로판-2-올 (26.0 g, 171.1 mmol) 및 소듐 페네이트 (26.5 g, 228.2 mmol)의 용액을 20분 동안 질소로 퍼지하였다. 생성된 혼합물을 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐 (8.25 g, 14.3 mmol) 및 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐 (4.10 g, 7.13 mmol)으로 처리하였다. 21시간 동안 환류시켰다. 반응물을 실온으로 냉각하고 밤새 교반하였다. 셀라이트® 플러그를 통해 여과하고 DCM (500 mL)으로 세척하였다. 여액을 실리카겔 상으로 농축하였다. EtOAc 중 0-10% MeOH로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축하고 밤새 진공하에 건조시켜 표제 화합물 (58.7 g; 91.7% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 436 (M+1). 상기 방법을 사용하여 생성물의 수개의 배치를 제조하였다. 표제 화합물 (92.4 g)의 합해진 배치를 EtOH (1 L)에 용해시켰다. 용액을 쿼드라실(QUADRASIL)® MP (100 g, 1.0-1.5 mmol/g)로 처리하고 1시간 동안 60℃에서 교반하였다. 실온으로 냉각하고 여과하여 고체를 제거하였다. 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 100℃에서 가열하면서 EtOH (500 mL)에 용해시켰다. 그 다음에 혼합물을 실온으로 서서히 냉각하고 물 (500 mL)을 서서히 첨가하였다. 혼합물을 교반하면서 5℃로 냉각하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고 밤새 45℃에서 진공하에 건조시켜 표제 화합물 (81.8 g)을 수득하였다. MS (m/z): 436 (M+1).

방법 2:

2-클로로-4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로피란-4-일-피라졸-4-일)옥시-피리딘 (400 mg, 1.2 mmol)을 바이알에서 1,4-디옥산 (15 mL)에 용해시켰다. 2-(4-아미노-2-피리딜)프로판-2-올 (266.5 mg, 1.6 mmol), 탄산세슘 (568.5 mg, 1.7 mmol), 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐 (134.6 mg, 0.23 mmol)을 첨가하고 5분 동안 질소로 퍼지하였다. 아세트산팔라듐(II) (26.1 mg, 0.12 mmol)을 첨가하고 5분 동안 질소로 퍼지하였다. 바이알을 밀봉하고 밤새 100℃에서 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 셀라이트® 플러그를 통해 여과하고 DCM 중 5% MeOH로 세척하였다. 농축하고 역상 크로마토그래피 (레디셉(Redisep) Rf 골드 고성능 C18 역상 칼럼, 포름산/물 중 0-100% 포름산/아세토니트릴 (ACN))에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축하고 진공하에 건조시켜 표제 화합물 (341 mg; 67.3% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 436 (M+1).

본질적으로 실시예 1의 방법 2 에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

염기, 촉매, 리간드, 및/또는 용매에서의 변경을 명시하였다.

<표 9>

실시예 62

4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]벤즈아미드

탄산칼륨 (80.4 mg, 0.58 mmol)을 DMSO (5 mL) 중 4-[[4-(1-시클로프로필-3-테트라히드로피란-4-일-피라졸-4-일)옥시-2-피리딜]아미노]벤조니트릴 (467 mg, 1.16 mmol)의 용액에 첨가하였다. 30% 과산화수소 (1.77 mL, 17.45 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 주위 온도에서 교반하였다. 물로 희석하고 DCM으로 4회 추출하였다. 유기 층을 합하고 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 여액을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 역상 크로마토그래피 (레디셉 Rf 골드 고성능 C18 역상 칼럼, 포름산/물 중 0-100% 포름산/ACN)에 의해 정제하여 표제 화합물 (220 mg; 45.9% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 420 (M+1).

본질적으로 실시예 62의 방법에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

<표 10>

실시예 70

2-{4-[(4-{[3-시클로프로필-1-(프로판-2-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올

밀봉된 바이알에서 THF (6 mL) 중 메틸 4-[[4-(3-시클로프로필-1-이소프로필-피라졸-4-일)옥시-2-피리딜]아미노]피리딘-2-카르복실레이트 (298 mg, 0.76 mmol)의 용액을 질소로 퍼지하였다. 메틸마그네슘 브로마이드 (디에틸 에테르 중 3M, 1.01 mL, 3.03 mmol)를 적가하고 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 감압하에 농축하고 잔류물을 DCM 및 포화 수성 중탄산나트륨으로 희석하였다. 유기 층을 단리하고 수성 층을 DCM으로 추출하였다. 유기 층을 합하고 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 여액을 농축하였다. DCM 중 5-10% MeOH로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (160 mg; 53.69% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 394 (M+1).

실시예 71

2-{5-[(4-{[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올

얼음조에서 트리플루오로아세트산 (3 mL) 중 2-[5-[[4-[3-(2-피리딜)-1-(2-트리메틸실릴에톡시-메틸)피라졸-4-일]옥시-2-피리딜]아미노]-2-피리딜]프로판-2-올 (500 mg, 0.96 mmol)의 용액을 0℃로 냉각하였다. 트리에틸실란 (1 mL, 6.24 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 농축하고 잔류물을 역상 크로마토그래피 (레디셉 Rf 골드 고성능 C18 역상 칼럼, ACN 중 0-100% 10 mM 중탄산암모늄)에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축하여 ACN을 제거하였다. 잔류 수성 혼합물을 DCM으로 추출하고, 유기 층을 단리하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고 여액을 감압하에 농축하여 표제 화합물 (168 mg; 44.9% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 389 (M+1).

실시예 72

N-[4-({1-(디플루오로메틸)-3-(테트라히드로푸란-3-일)-1H-피라졸-4-일}옥시)피리딘-2-일]피리다진-3-아민, 이성질체 1

N-[4-[1-(디플루오로메틸)-3-테트라히드로푸란-3-일-피라졸-4-일]옥시-2-피리딜]피리다진-3-아민 (제조예 49)의 라세미 혼합물을 키랄 크로마토그래피로 정제하여 제1 용리 거울상이성질체를 표제 화합물로서 수득하였다. MS (m/z): 375 (M+1).

정제 조건: 키랄팩® IC; 이동상: 이산화탄소 중 0.2% 이소프로필 아민 함유 30% 이소프로판올; 유량: 70 g/분; UVW: 280 nm; 체류 시간: 3.93분.

본질적으로 실시예 72의 방법에 의해 하기 화합물을 제조하였다.

대안적 정제 조건을 명시하였다.

<표 11>

실시예 77-79에 대한 X-선 분말 회절 수집 절차

35 kV 및 50 mA에서 작동하는, CuKa 공급원 (λ = 1.54060 Å) 및 반텍(Vantec) 검출기가 장착된 브루커(Bruker) D4 인데버(Endeavour) X-선 분말 회절계에서 결정질 고체의 XRD 패턴을 수득하였다. 샘플을 2θ에서 0.009°의 스텝 크기 및 0.5초/스텝의 스캔 속도, 그리고 0.6 mm 발산, 5.28 고정 산란방지, 및 9.5 mm 검출 슬릿을 이용하여, 2θ에서 4 내지 40°로 스캔하였다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더 상에 패킹하고 유리 슬라이드를 사용하여 평활 표면을 수득하였다. 주위 온도 및 상대 습도에서 결정 형태의 회절 패턴을 수집하였다.

실시예 77

2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올, (2Z)-부트-2-엔디오에이트 (1:1)

ACN (2 mL) 중 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 (142 mg)을 첨가하였다. 고체를 80℃/1000 rpm으로 교반하면서 완전히 용해시켰다. 생성된 용액에 말레산 (48 mg, 1.20 당량, 80℃에서 1 mL의 ACN 중)을 첨가하였다. 혼합물은 초기에는 탁하지만 신속하게 투명 용액이 되었다. 가열 및 교반을 정지시켰다. 용액을 실온으로 냉각하였다. 또 다른 2 mL의 ACN을 첨가하고 고체를 현탁시켰다. 진공 여과에 의해 백색 고체를 단리시키고 고체를 기류하에 15분 동안 필터상에서 제자리에서 건조시켰다. 생성된 고체를 밤새 65℃ 진공 오븐에서 건조시켜 표제 화합물 (132 mg, 73.4% 수율)을 수득하였다. 모노 염에 대해 형성된 염 중의 말레산 이온의 이론상 백분율은 21.0%이었다. HPLC에 의한 반대이온 분석에 의하면 형성된 염 중의 말레산 이온의 실제 백분율은 17.2%인 것으로 밝혀졌다. 반대이온 분석은 모노 염임을 나타내는 것이다.

실시예 77의 X-선 분말 회절

실시예 77의 제조된 샘플은 이하 표 13에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것으로서, 특히 12.5°, 17.5°, 및 16.9°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 함께 9.6°에서 피크를 갖는 것으로서 (0.2도의 회절 각에 대한 공차를 가짐) CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴을 특징으로 한다.

<표 12>

실시예 77의 X-선 분말 회절 피크

실시예 78

2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올, 메탄술포네이트 (1:1)

아세톤 (2 mL) 중 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 (113 mg)을 첨가하였다. 고체는 60℃/1000 rpm으로 교반하면서 완전히 용해시켰다. 생성된 용액에 메탄술폰산 (21 μL, 1.24 당량)을 첨가하였다. 가열 및 교반을 정지시켰다. 용액을 실온으로 냉각하였다. 또 다른 3 mL의 아세톤을 첨가하고 고체를 현탁시켰다. 진공 여과에 의해 백색 고체를 단리시키고 고체를 기류하에 15분 동안 필터상에서 제자리에서 건조시켰다. 생성된 고체를 밤새 65℃ 진공 오븐에서 건조시켜 표제 화합물 (87 mg, 63.08% 수율)을 수득하였다. 모노 염에 대해 형성된 염 중의 메탄술폰산 이온의 이론상 백분율은 18.1%이었다. HPLC에 의한 반대이온 분석에 의하면 형성된 염 중의 메탄술폰산 이온의 실제 백분율은 16.2%인 것으로 밝혀졌다. 반대이온 분석은 모노 염임을 나타내는 것이다.

실시예 78의 X-선 분말 회절

실시예 78의 제조된 샘플은 이하 표 14에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것으로서, 특히 14.1°, 10.8°, 및 18.6°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 함께 7.0°에서 피크를 갖는 것으로서 (0.2도의 회절 각에 대한 공차를 가짐) CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴을 특징으로 한다.

<표 13>

실시예 78의 X-선 분말 회절 피크

실시예 79

2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 4-메틸벤젠술포네이트 (1:1)

EtOAc (2 mL) 중 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 (122 mg) 을 첨가하였다. 고체를 80℃/1000 rpm으로 교반하면서 완전히 용해시켰다. 생성된 용액에 p-톨루엔술폰산 일수화물 (1.23 당량, 80℃에서 1 mL의 EtOAc 중)을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 80℃/1000 rpm으로 슬러리화하였다. 혼합물이 실온으로 냉각됨에 따라 열을 끄고 혼합물을 1000 rpm으로 계속 교반하였다. 진공 여과에 의해 생성된 백색 고체를 단리시키고 고체를 기류하에 15분 동안 필터상에서 제자리에서 건조시켰다. 생성된 고체를 밤새 65℃ 진공 오븐에서 건조시켜 표제 화합물 (159 mg, 93.40% 수율)을 수득하였다. 모노 염에 대해 형성된 염 중의 p-톨루엔술폰산 이온의 이론상 백분율은 29.3%이었다. HPLC에 의한 반대이온 분석에 의하면 형성된 염 중의 p-톨루엔술폰산 이온의 실제 백분율은 28.3%인 것으로 밝혀졌다. 반대이온 분석은 모노 염임을 나타내는 것이다.

실시예 79의 X-선 분말 회절

실시예 79의 제조된 샘플은 이하 표 15에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것으로서, 특히 19.7°, 18.4°, 및 22.0°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 함께 17.8°에서 피크를 갖는 것으로서 (0.2도의 회절 각에 대한 공차를 가짐) CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴을 특징으로 한다.

<표 14>

실시예 79의 X-선 분말 회절 피크

TGFβ 경로를 통한 신호 전달은 여러 적응증에서 암 및 종양의 진행과 연관되어 있다 (Elliott et. al. (2005) J Clin Oncol 23:2078; Levy et. al. (2006) Cytokine & Growth Factor Rev 17:41-58). 종양에 의해 또는 종양 미세 환경에서 간질에 의해 생성된 TGFβ 리간드가 종양 진행에 참여할 수 있는 여러 유형의 암이 있다. MATLyLu 래트 전립선암 세포 (Steiner and Barrack (1992) Mol. Endocrinol 6: 15-25) 및 MCF-7 인간 유방암 세포 (Arteaga, et al. (1993) Cell Growth and Differ. 4:193-201)는 마우스 TGFβ1을 발현하는 벡터로 형질감염 후에 보다 종양 형성성 및 전이성이 되었다. TGF-β1은 인간 전립선 및 진행성 위암에서의 혈관 신생, 전이 및 불량한 예후와 연관되어 있다 (Wikstrom, P., et al. (1998) Prostate 37: 19-29; Saito, H. et al. (1999) Cancer 86: 1455-1462). 유방암에서, 불량한 예후는 상승된 TGF-β와 연관되고 (Dickson, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:837-841; Kasid, et al. (1987) Cancer Res. 47:5733-5738; Daly, et al. (1990) J. Cell Biochem. 43: 199-211; Barrett-Lee, et al. (1990) Br. J Cancer 61:612-617; King, et al. (1989) J. Steroid Biochem. 34:133-138; Welch, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7678-7682; Walker, et al. (1992) Eur. J. Cancer 238:641-644) 타목시펜 치료에 의한 TGF-β1의 유도 (Butta, et al. (1992) Cancer Res. 52:4261-4264)는 유방암에 대한 타목시펜 치료의 실패와 연관되어 있다 (Thompson, et al. (1991) Br. J. Cancer 63:609-614). 항 TGFβ1 항체는 비장 자연 살상 세포 활성의 증가와 상관관계가 있는 치료인, 무흉선 마우스에서 MDA-231 인간 유방암 세포의 성장을 억제한다 (Arteaga, et al. (1993) J. Clin. Invest. 92:2569-2576). 잠복해 있는 TGFβ1로 형질감염된 CHO 세포는 또한 누드 마우스에서 감소된 NK 활성 및 증가된 종양 성장을 나타냈다 (Wallick, et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1777-1784). 따라서, 유방 종양에 의해 분비된 TGF-β는 내분비 면역 억제를 유발할 수 있다. TGFβ1의 높은 혈장 농도는 진행성 유방암 환자에 대해 불량한 예후를 나타내는 것으로 확인되었다 (Anscher, et al. (1993) N. Engl. J. Med. 328:1592-1598). 고용량 화학 요법 및 자가 골수 이식 전에 높은 순환 TGFβ를 가진 환자는 간정맥 폐색성 질환 (전체 환자의 15-50%이며 사망률이 최대 50%임) 및 특발성 간질성 폐렴 (전체 환자의 40-60%)에 대한 높은 위험성이 있다. 이들 연구 결과의 의미는 1) TGFβ의 상승된 혈장 농도가 위험 환자를 식별하는 데 사용될 수 있고 2) TGFβ 신호 전달의 감소가 유방암 환자에 대한 이들 통상의 치료의 이환율과 사망률을 감소시킬 수 있다는 것이다.

최근 간행물은 또한 TGFβ 신호 전달이 화학요법 및 수용체 티로신 키나제를 포함한 치료 요법의 표준에 종양의 저항성을 유도하는 데 중요할 수 있다고 시사하고 있다 (WO2012138783). 구체적으로, 결장암에서, 특이적 유전자 발현 시그너처는 통상의 1차 치료에 내성이 있는 환자의 군을 단리하는 것으로 나타났다. 이들 종양 세포는 TGFβ 경로가 TGFβRI 특이적 소분자 억제제로 차단되는 경우 요법에 대한 감수성을 다시 얻는다 (Huang, et. al. (2012) Cell 151:937-950; Sadanandam et. al. (2013) Nat Med 19:619-625; Vermeulen et. al. (2013) Nat Ned 19:614-618; Roepman et. al. (2014) 134:552-562).

골수이형성 증후군 (MDS)은 골수성 구획에서 조혈계의 장애이며 골수성 세포의 비효율적 생성을 특징으로 한다. MDS는 감소된 SMAD7 수준에 의해 나타나는 TGFβ 경로의 변경과 관계된다. SMAD7은 TGFβ 매개 SMAD 신호 전달을 억제하는 기능을 하는 억제성 SMAD이며, TGFβRI 및 TGFβRII를 통한 리간드 활성화 신호 전달의 하류이다. 따라서 SMAD7의 과발현은 MDS에서 TGFβ 신호 전달의 과다-활성화를 야기하는 것으로 여겨지고, 이 표현형은 TGFβRI 소분자 억제제로 치료함으로써 역전될 수 있다 (Zhou et. al. (2011) Cancer Res. 71:955-963). 유사하게, 교모세포종 (GBM)에서, TGFβ 리간드 수준은 상승되고 질환 진행과 관련이 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 치료제인 AP1002는 GBM 환자의 하위 집합에서 잠재적으로 활성이 있는 것으로 나타났다 (Bogdahn et. al. (2011). Curr Pharm Biotechnol). 흑색종에서, TGFβ 경로 신호 전달 활성화는 또한 BRAF 및 MEK 억제제에 대한 내성과 관계가 있다 (Sun et. al. (2014) Nature. 508:118-122).

많은 악성 세포는 강력한 면역억제제인 형질전환 성장 인자-β (TGF-β)를 분비하며, 이는 TGFβ 생성이 숙주 면역감시로부터의 중요한 종양 도피 메커니즘을 나타낼 수 있음을 시사한다 (Flavell et. al. (2010) Nat Rev Immunol 10:554-567; Kast et. al. (1999) Leukemia 13:1188-1199). 종양-보유 숙주에서 TGFβ 신호 전달이 파괴된 백혈구 하위-집단의 수립은 단독으로 또는 1종 이상의 다른 면역 요법, 예를 들어 1종 이상의 PD-1 억제제, 예컨대 니볼루맙, 펨브롤리주맙, PD-L1 억제제, 암 백신, 및 이중 특이적 면역 관여 분자, 예컨대 IMCgp100과 조합되어 암 면역요법에 대한 잠재적 수단을 제공한다. 림프구에 의해 생성된 TGFβ 리간드는 전임상적으로 종양 면역 감시를 길항하는 것으로 나타났고 (Donkor et. al. (2012) Development. Oncoimmunology 1:162-171, Donkor et. al. (2011) Cytokine Immunity 35:123-134); 이러한 축을 파괴하면 전임상적으로 뮤린 모델 및 시험관 내에서 항종양 이익을 제공하는 것으로 나타났다 (Zhong et. al. (2010) Cancer Res 16:1191-1205; Petrausch et. al. (2009) J Immunol 183:3682-3689); Wakefield et. al. (2013) Nat. Rev Cancer 13:328-341). T 세포에서의 TGFβ 신호 전달이 파괴된 트랜스제닉 동물 모델은 보통 치명적인 TGFβ 과발현 림프종 종양인 EL4를 근절할 수 있다 (Gorelik and Flavell, (2001) Nature Medicine 7(10): 1118-1122). 종양 세포에서의 TGFβ 분비의 하향 조절은 숙주에서 면역원성의 회복을 결과하며, 한편 TGFβ에 대한 T-세포 불감응성은 가속화된 분화 및 자가 면역을 결과하고, 이러한 요소는 면역관용화된 숙주(tolerized host)에서 자기 항원-발현 종양을 퇴치하기 위해 필요할 수 있다. TGFβ의 면역억제 효과는, 또한 HIV 환자의 하위 집단에 연루된 바 있는데 그의 CD4/CD8 T 세포 수에 기초하여 예측된 면역 반응보다 더 낮았다 (Garba, et al. J. Immunology (2002) 168: 2247-2254). TGFβ 중화 항체는 배양물에서 효과를 역전시킬 수 있었으며, 이는 TGFβ 신호 전달 억제제가 HIV 환자의 이 하위 집합에 존재하는 면역 억제를 역전시키는데 유용할 수 있음을 나타내는 것이다.

암발생의 초기 단계 동안에, TGFβ1은 강력한 종양 억제 인자로서 작용할 수 있으며 일부 화학예방제의 작용을 매개할 수 있다. 그러나, 악성 신생물의 발생 및 진행 동안에 어느 시점에서, 종양 세포는 미세 환경에서 생체 활성 TGFβ의 출현과 병행하여 TGFβ-의존적 성장 억제로부터 벗어나는 것으로 보인다. TGFβ의 이중 종양 억제/종양 촉진 역할은 케라틴세포에서 TGFβ를 과발현하는 트랜스제닉 체계에서 가장 명확하게 밝혀졌다. 트랜스제닉이 양성 피부 병변의 형성에 보다 내성이지만, 트랜스제닉에서 전이 전환율은 급격히 증가되었다 (Cui, et al (1996) Cell 86(4):531-42). 원발성 종양에서 악성 세포에 의한 TGFβ1의 생성은 종양 진행의 진행 단계에 따라 증가하는 것으로 보인다. 많은 주요 상피 암의 연구는 인간 암에 의한 TGFβ의 증가된 생성이 종양 진행 동안에 비교적 늦은 사건으로서 일어남을 시사한다. 추가로, 이 종양-연관 TGFβ는 종양 세포에 선택적 이점을 제공하고 종양 진행을 촉진한다. TGFβ가 세포/세포 및 세포/간질 상호작용에 미치는 영향은 더 큰 침습 및 전이 경향을 초래한다. 종양-연관 TGFβ는 그것이 활성화된 림프구의 클론성 팽창의 강력한 억제제이기 때문에 종양 세포가 면역 감시로부터 벗어나게 할 수 있다. TGFβ는 또한 안지오스타틴의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 암 치료 방식, 예컨대 방사선 요법 및 화학요법은 종양에서의 활성화된 TGFβ의 생성을 유도하고, 그로 인해 TGFβ 성장 억제 효과에 저항성인 악성 세포의 증식물을 선택한다. 따라서, 이들 항암 치료는 위험을 증가시키고 성장 및 침습성이 향상된 종양의 발달을 촉진한다. 이 상황에서, TGFβ-매개 신호 전달을 표적으로 하는 작용제는 매우 효과적인 치료 전략이 될 수 있다. TGFβ에 대한 종양 세포의 저항성은 방사선 요법 및 화학요법의 세포독성 효과의 상당 부분을 무효화하는 것으로 나타났고 간질에서의 TGFβ의 치료-의존적 활성화는 그것이 미세 환경을 종양 진행에 보다 도움이 되고 조직 손상에 원인이 되어 섬유증을 야기할 수 있기 때문에 심지어 해로울 수도 있다. TGFβ 신호 전달 억제제의 개발은 단독 치료 및 다른 요법과 조합하여 진행성 암의 치료에 유익할 것으로 보인다.

게다가, TGFβ 신호 전달이 섬유증 병태, 예컨대 간 섬유증 및 만성 신장 질환에 관여된다는 것은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Ueha S, et. al. 2012. Front Immunol. 3:71. Cellular and molecular mechanisms of chronic inflammation-associated organ fibrosis]; [Bottinger et al. 2002. J Amer Soc Nephrol. 13:2600.　TGF-β Signaling in Renal Disease]; [Trachtman H., et al. 2011. Kidney International 79:1236.　 A phase 1, single-dose study of fresolimumab, an anti-TGF-β antibody, in treatment-resistant primary focal segmental glomerulosclerosis]; 및 [Rosenbloom J, et. al. 2010. Narrative review: fibrotic diseases: cellular and molecular mechanisms and novel therapies. Ann Intern Med 152: 159-166]을 참조한다.

하기 검정은 예시된 화합물이 생화학적 검정에서, 세포 수준에서, 및 동물 모델에서 TGFβR1을 억제한다는 것을 입증한다.

TGFβR1 활성에 대한 생화학적 검정

이 시험관내 검정의 목적은 TGFβR1을 억제하는 화합물을 동정하는 것이다.

단백질 발현 및 정제

인간 TGFβR1 (NM_004612.2)의 아미노산 200-503을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 204번 위치의 아미노산 Thr을 Asp로 바꾸어 N-말단 HIS 태그가 있는 PFASTBAC™1 (인비트로겐(Invitrogen), 카탈로그 번호 10360-014) 벡터에 삽입하였다. BAC-TO-BAC® 바큘로바이러스 발현 시스템(Baculovirus Expression System) (인비트로겐, 카탈로그 번호 10359-016)의 프로토콜에 따라 바큘로바이러스를 생성시켰다. 배양물 리터당 15 mL P1 바이러스를 사용하여 1.5 x 10⁶개 세포/mL에서 Sf9 세포를 감염시키고 48시간 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 수확하고 후속 단백질 정제를 위해 -80℃에서 저장하였다. 4℃에서 단백질 정제를 수행하였다. 로슈(Roche) 완전 EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일 및 0.2% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 100 mL 완충제 A (50 mM 트리스(Tris)-HCl, pH8, 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM 이미다졸, 10% 글리세롤) 중 2L 배양물로부터 펠렛을 현탁시키고 균질화하였다. 16,500 rpm으로 45분 동안 베크만(Bechman) JA-18 로터에서 원심분리하여 세포 용해물을 청정화하였다. 상청액을 3시간 동안 5 mL의 Ni-NTA 금속 친화성 수지 (퀴아젠(Qiagen))와 함께 인큐베이션하였다. 수지를 칼럼 상에 패킹하고 완충제 A로 세척하였다. 완충제 A 중 0-400 mM 이미다졸 구배로 HIS-TGFβR1(200-503)(T204D) 단백질을 용리시켰다. HIS-TGFβR1(200-503)(T204D) 함유 분획을 풀링하고 농축하고 하이로드(HiLoad) 16.600 슈퍼덱스(Superdex) 200 칼럼 (지이 헬쓰케어 바이오사이언스(GE Healthcare Bioscience)) 상으로 로딩하였다. 칼럼을 저장 완충제 (50 mM 트리스-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT)로 용리시켰다. HIS-TGFβR1(200-503)(T204D) 함유 분획을 풀링하고 농축하였다. 단백질 농도를 UV280에 의해 측정하였다. 단백질을 분취하고 -80℃에서 저장하였다.

TR-FRET 검정 조건

화합물을 절반-면적의(half-area) 흑색 플레이트에서 재조합 His-TGFR1(200-503)(T204D) 및 Eu-항-HIS 검출 항체 (인비트로겐, 카탈로그 번호 PV5597)와 함께 미리 인큐베이션하였다. DMSO 중 1 mM의 스톡 시험 화합물로부터의 화합물 연속 희석액을 제조하였다. DMSO 중 스톡 용액을 3배로 연속적으로 희석하여 최종 화합물 농도가 2 μM 내지 0.1 nM의 범위로 10점 희석 곡선을 수득하였다. 검정에서 최종 DMSO 농도는 4%이었다. 키나제 트레이서 (키나제 트레이서(Kinase Tracer) 178, 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies) PR9080A, 인비트로겐)를 첨가하여 반응을 개시하였다. 45-60분 후에, 플레이트 판독기 상에서 형광을 판독하였다.

최소 억제 군 (DMSO 단독, 미처리)에 상대적인 화합물 처리 군의 억제 백분율을 계산하였다. 4-파라미터 비선형 로지스틱 방정식을 사용하여 절대 IC₅₀을 계산하고 여기서 절대 IC₅₀ = 액티버티베이스(ActivityBase) 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 50% 억제를 유발하는 농도이다. 이들 검정의 결과는 예시된 화합물이 TGFβR1의 효과적인 억제제라는 것을 입증하였다. 예를 들어, 모든 예시된 화합물은 1 μM 미만의 IC₅₀ 값을 나타냈다. 구체적으로, 실시예 1에 대한 IC₅₀은 0.027 μM이었다.

TGFβR1 활성에 대한 세포-기반 루시페라제 리포터 검정

이 검정의 목적은 세포-기반 검정에서 SMAD 2,3-의존적 유전자 발현을 선택적으로 방해하는 화합물을 동정하여, 화합물이 세포 수준에서 TGFβR1을 억제한다는 것을 입증하는 것이다.

HEK293 세포 (ATCC, CRL-1573)를, TGFβ 자극에 반응하여 SMAD 2,3-반응성 프로모터로부터 반딧불이 루시페라제를 발현하도록 조작하였다. 이러한 세포주는 렌티바이러스 입자 (에스에이 바이오사이언시즈(SA Biosciences))를 이용한 감염 및 퓨로마이신 저항에 대한 선택을 통해 생성될 수 있다. 10% 태아 소 혈청을 함유하는 옵티-멤(OPTI-MEM)® 배지에서 96-웰 플레이트에서 웰당 15,000개의 세포로, 검정-준비된 동결된 스톡으로부터 HEK293_SMAD 2/3 세포를 플레이팅하였다. 72시간 후에, 배지를 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 옵티-멤®으로 바꾸었다. 시험 화합물을 DMSO 중에 준비하여 10 mM 스톡 용액을 제조하였다. 스톡 용액을 DMSO 중에서 3배로 연속적으로 희석하여 최종 화합물 농도를 20 μM 내지 1 nM의 범위하여 10점 희석 곡선을 수득하고 검정에서 최종 DMSO 농도는 0.5%이었다. 시험 화합물을 첨가하고 1시간 평형 후에, TGFβ (최종 농도 = 2 nM, 알엔디 시스템즈(R&D Systems))를 첨가하였다.

24시간 후에, 용해 완충제 [글로 용해 완충제 (Glo Lysis Buffer) (카탈로그 번호 E2661)] 및 루시페라제 시약 [프로메가(Promega) 브라이트 글로(Bright Glo) 루시페라제 시약 (카탈로그 번호 E2620)]을 각각의 웰에 첨가하여 웰 부피를 두배로 하였다. 분취액 (80 μL)을 플레이트 판독기 (발광 필터: 발광 700, 1초 판독)상에서 발광 판독을 위해 백색의 솔리드 바닥 플레이트로 옮겼다. 최소 억제 군 (DMSO 단독, 미처리)에 상대적인 화합물 처리 군의 억제 백분율을 계산하였다. 용량 반응 연구로부터 각각의 화합물에 대한 상대 IC₅₀을 계산하였고, 이는 50% 억제를 달성하는 데 필요한 농도이다. 액티버티베이스 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 비선형 로지스틱 방정식에 용량-반응 연구로부터 생성된 데이터를 피팅하였다. 이들 검정의 결과는 예시된 화합물이 TGFβ-자극된 HEK293_SMAD2/3 세포로부터의 루시페라제 리포터 활성의 효과적인 억제제라는 것을 입증하였다. 예를 들어, 모든 예시된 화합물은 1 μM 미만의 IC₅₀ 값을 나타냈다. 구체적으로, 실시예 1에 대한 IC₅₀은 0.0824 μM (±0.005, n = 2)이었다.

IVTI 검정

이 검정의 목적은 EMT6-LM2 동계 동물 모델에서 종양에서의 pSMAD2 발현을 억제하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것이고, 환언하면, 상기 검정은 시험 화합물이 고형 종양 동물 모델에서 TGFβR1 신호 전달을 억제하는 능력을 측정하는 것이다.

EMT6 -LM2 세포 생성

EMT-6 세포 (ATCC, CRL-2755)를 피하로 (5 x 10⁵개/동물) 면역 적격 BALB/cAnNHsd 마우스 (할란 라보라토리즈(Harlan Laboratories))의 옆구리에 이식하였다. 종양이 대략 3000 mm³에 이르렀을 때, CO₂ 질식에 의해 동물을 희생시켰다. 종양 보유 동물로부터 폐를 단리하고 배양물에 위치시켰다. 폐를 부드럽게 균질화하여 단일 세포 현탁액을 생성시켰다. 배양 배지 (IMDM, 10% FBS)에서 세포를 성장시키고 종양 세포를 단리하여 EMT6-LM1 세포를 수득하였다. 이식을 위해 EMT6-LM1 세포를 사용함으로써 상기 공정을 반복하여 EMT-LM2 세포를 생성시켰다.

정제된 포스포 HIS- SMAD2 ( pSMAD2 )

전장 인간 SMAD2 (NM_005901.5)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 PFASTBACHTA™ (인비트로겐, 카탈로그 번호 10584-027) 벡터에 삽입하여, HIS-SMAD2 단백질 발현을 위한 바큘로바이러스 구축물을 생성하였다. 인간 TGFβR1 (NM_004612.2)의 아미노산 148-503을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 204번 위치의 아미노산 Thr을 Asp로 바꾸어 PFASTBACHTA™ (인비트로겐, 카탈로그 번호 10584-027) 벡터에 삽입하여, HIS-TGFβR1(148-503)(T204D) 단백질을 발현하기 위한 바큘로바이러스 구축물을 생성하였다. BAC-TO-BAC® 바큘로바이러스 발현 시스템 (인비트로겐)의 프로토콜에 따라 바큘로바이러스를 생성시켰다. 배양물 리터당 HIS-TGFβR1(148-503)(T204D)의 P1 바이러스 및 HIS-SMAD2의 10 mL P1 바이러스를 사용하여 1.5 x 10⁶개 세포/mL에서 Sf9 세포를 감염시키고 45시간 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 0.1 μM의 최종 농도로 오카다산을 첨가하였다. 추가 3시간의 인큐베이션 후에, 후속 단백질 정제를 위해 세포를 수확하고 -80℃에서 저장하였다. 4℃에서 단백질 정제를 수행하였다. 로슈 완전 EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일 및 0.1% 트리톤® X-100을 함유하는 300 mL의 냉 완충제 A (50 mM 인산나트륨, pH7.5, 300 mM NaCl, 2 mM β-메르캅토에탄올, 5 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0.1 μM 오카다산) 중에서 교반하면서 인큐베이션에 의한 6 L 배양물로부터 세포 펠렛을 Lys 동결시키고 균질화하였다. 16,500 rpm으로 45분 동안 베크만 JA-18 로터에서 원심분리하여 세포 용해물을 청정화하였다. 상청액을 2시간 동안 10 mL의 탈론(TALON) 금속 친화성 수지 (클론테크(Clontech), 카탈로그 번호 635504)와 함께 인큐베이션하였다. 배치를 0.1% 트리톤® X-100을 함유하는 100 mL의 완충제 A로 세척하였다. 수지를 칼럼 상에 패킹하고 완충제 A로 세척하였다. 완충제 A 중 0-100 mM 이미다졸 구배로 HIS-SMAD2 단백질을 용리시켰다. 포스포 HIS-SMAD2 함유 분획을 풀링하고 0.1 μM 오카다산 및 5 mM EDTA로 보충하였다. 단백질 농도를 표준으로서 BSA를 사용하여 바이오라드(BioRad) 단백질 검정 (바이오라드 DC 단백질 검정 키트 #500-0116)에 의해 측정하였다. 단백질을 분취하고 -80℃에서 저장하였다.

생 단계(Live Phase)

EMT6-LM2 세포를 10% FBS, 2 mM 글루타맥스 및 0.1 mM 비필수 아미노산으로 보충된 이스코베스(Iscoves) 변형 둘베코 배지(Modified Dulbecco's Media) (MDM)에서 배양하고 5% CO₂에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 트립신처리하고 배양물로부터 단리하였다. 항크스(Hank's) 평형 염류 용액 (HBSS)에 세포를 재현탁시킨 다음에, 매트리겔(MATRIGEL)®과 (1:1) 혼합하였다. 세포 (5 x 10⁵개/동물)를 마우스 (암컷 BALB/c 마우스, 할란)의 뒤옆구리에 피하로 주입하였다. 종양 부피를 캘리퍼스로 측정하고 체중을 1주 2회 측정하였다. 종양 부피가 대략 200-250 mm³에 이른 후에, 동물을 무작위로 나누어서 비히클 대조군 및 화합물 처리 군으로 분류하였다. 화합물 (1% 히드록시에틸셀룰로스 (HEC) 및 0.25% 트윈(TWEEN)® 80 및 0.05% 소포제에서 제제화됨) 및 비히클 대조군 (1% HEC 및 0.25% 트윈® 80 및 0.05% 소포제)을 경구 위관영양법에 의해 투여하였다. 2.7, 8.3, 25, 75, 또는 150 mg/kg의 단일 용량 후에 단일 시점 (2시간)에서 화합물을 검사하여 용량 반응을 생성시켰다. 단일회 용량 후 1시간 내지 16시간 사이의 여러 시점에서 마우스를 희생시킴으로써 용량 반응 연구로부터 계산된 (이하에 상세히 설명된 방법) TED₅₀ 또는 TED₈₀ 용량에서 시간 과정(time course)을 수행하였다.

조직 처리

종양 조직을 수확하고 이하에 기재된 바와 같이 균질화하였다. 액체 질소 중에서 종양 조직 (각각 ~100 mg)을 동결시키고 막자로 분쇄하였다. 드라이아이스 상에서 튜브 (용해 매트릭스 A 튜브, MPBio # 6910-100)에 분쇄된 조직을 배치하고 Bio101 패스트프렙(FASTPREP)® FP120 균질화기 (4.5로 설정)를 사용하여 25초 동안 용해 완충제 (각각 0.6 mL) (150 mM NaCl; 20 mM 트리스, pH 7.5; 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 1 mM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA); 1% 트리톤® X-100; 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마(Sigma) P8340); 포스파타제 억제제 칵테일 II (시그마 P5726); 포스파타제 억제제 칵테일 III (시그마 P0044))중에서 균질화하였다. 4℃에서 10분 동안 14,000 x g으로 원심분리에 의해 세포 잔해 및 비드를 펠렛화하였다. 용해물을 새로운 마이크로원심분리관으로 옮기고 4℃에서 10분 동안 14,000 x g으로 다시 원심분리하였다. 원심분리된 용해물을 딥-웰(deep-well) 96-웰 플레이트에 옮기고 얼음 위에 유지시켰다. 다음과 같이 바이오라드 단백질 검정 (바이오라드 DC 단백질 분석 키트 #500-0116)을 사용하여 각각의 용해물에 대한 단백질 농도를 측정하였다. 검정에 필요한 1 mL의 키트 시약 A마다 키트 시약 S (20 μL)를 첨가함으로써 작업 시약을 제조하였다. 0.2 mg/mL 내지 1.5 mg/mL 단백질로부터의 단백질 표준의 3-5 희석액을 제조하고 표준 곡선을 생성시켰다. 깨끗하고 건조한 미량적정 플레이트에 5 μL의 표준 및 샘플을 피펫팅하였다. 25 μL의 작업 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. 200 μL의 시약 B를 각각의 웰에 첨가하고 5초 동안 교반하였다. 15분 후에, 750 nM에서 각각의 웰의 흡광도를 판독하였다. 각각의 웰의 단백질 수준은 샘플 웰의 흡광도를 표준 웰로부터 유래된 표준 곡선과 비교함으로써 측정하였다. 이하에 기재된 방법과 같이 ELISA에 의한 총 SMAD2/3 및 pSMAD2의 분석을 위한 제제에서 종양 용해물을 용해 완충제로 10 mg/mL로 정규화하였다.

SMAD ELISA

종양 용해물을 독립적인 ELISA 플레이트를 사용하여 검정하였고, 여기서 하나의 플레이트를 사용하여 총 SMAD 2/3 수준을 측정하고 다른 하나의 플레이트를 사용하여 포스포 SMAD 2 수준을 측정하였다. 코팅 항체는 플레이트 둘 다에 대해 동일하지만, 2차 항체는 총 SMAD 2/3 또는 포스포 SMAD 2에 특이적이다. 이들 플레이트는 집합적으로 "ELISA 플레이트"로 언급되고 개별적으로 "총 ELISA 플레이트" 또는 "포스포ELISA 플레이트" 각각으로 언급된다. 코팅 항체를 BupH 탄산염-중탄산염 완충제 (항-SMAD 2/3 모노클로날 항체, 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences) #610843; 피어스(Pierce) #28382로부터의 BupH 탄산염-중탄산염)에서 2.5 μg/mL로 제조하고 96-웰 면역플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific) # 439454)에 웰당 100 μL로 첨가하고 플랫폼 진탕기 상에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 ELISA 플레이트를 생성시켰다. 그 다음에, ELISA 플레이트를 세척 완충제 (트리스 완충 염수 (TBS), pH 8.0 중 0.5% 트윈® 20, 시그마 #T-9039로부터)로 4회 세척한 후에 2시간 동안 플랫폼 진탕기 상에서 실온에서 웰당 200 μL의 차단 완충제 (1x TBS 중 1% 소 혈청 알부민 (BSA))로 차단하였다. 세척 완충제로 4회 세척하였다. 포스포 SMAD ELISA 플레이트에, 10 mg/ml에서 웰당 100 μL의 종양 용해물 또는 비히클 용해물을 적합한 웰에 첨가하였다. 총 ELISA 플레이트에, 웰당 98 μL의 용해 완충제 및 웰당 2 ul의 10 mg/ml의 종양 용해물 또는 비히클 용해물을 적절한 웰 (0.02 mg 단백질 용해물 최종)에 첨가하였다. 또한, 표준 곡선을 정제된 pSMAD2를 사용하여 각각의 ELISA 플레이트 (포스포 및 총 둘 다)에 첨가하였다. 밤새 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충제로 다시 4회 세척하였다. 2차 항체 (밀리포어(Millipore) 항-포스포 SMAD2 토끼 모노클로날 항체 #04-953; 밀리포어 항-SMAD2/3 토끼 폴리클로날 항체 #07-408)를 1% BSA로 보충된 용해 완충제 중 1:500 희석으로 제조하고 웰당 100 μL를 적절한 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 2 내지 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 완충제로 4회 세척하고 웰당 100 μL의 리포터 항체 (항-토끼 HRP, GE 헬스케어(Healthcare) #NAV934V, 차단 완충제 중 1:10,000로 희석됨)를 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 플레이트를 세척 완충제로 최종 4회 세척하고 웰당 100 μL의 실온 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB; 수르모딕스(Surmodics)/BioFX #TMBW-0100-01)를 첨가하였다. 최대 30분 동안 37℃에서 플레이트를 인큐베이션하였다. 100 μL의 정지액 (1N H₂SO₄)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트 판독기 상에서 450 nm에서 흡광도 (OD)를 판독하였다.

비히클 군에 대해 포스포 SMAD (pSMAD)에 대한 총 SMAD (tSMAD)의 비를 사용하여 pSMAD 신호의 최소 억제 (0%)를 결정하였다. 비히클 군의 최소 pSMAD 억제에 대해 화합물 처리 군에 대한 억제 백분율을 계산하였다. SAS (버전 9.3, 노스캐롤라이나주 캐리)에서 NLIN 절차를 사용함으로써 용량 반응 연구 (이 시점에서 각각 50% 및 80% 억제를 달성하는 데 필요한 용량)로부터 TED₅₀ 및 TED₈₀을 계산하였다. 이 검정은 실시예 1이 1회 용량 후 2시간에서 10.8 mg/kg TED₅₀의 값 및 24.1 mg/kg의 TED₈₀을 가짐을 입증하였다. TED₅₀ 용량 (11 pmk)에서의 시간 경로 연구에서, 실시예 1은 투여 후 1시간에서 48% 억제 및 2시간에서 39% 억제를 나타냈다. (25 mpk)에서의 시간 경로 연구에서, 실시예 1은 투여 후 1시간에서 71% 억제 및 2시간에서 70% 억제를 나타냈다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1일 투여량은 통상 약 1-2000 mg의 1일 범위 내에 포함된다. 바람직하게는 이러한 용량은 10-1000 mg의 1일 범위 내에 포함된다. 보다 바람직하게는 이러한 용량은 10-100 mg의 1일 범위 내에 포함된다. 훨씬 보다 바람직하게는 이러한 용량은 10-80 mg의 1일 범위 내에 포함된다. 가장 바람직하게는 이러한 용량은 10-50 mg의 1일 범위 내에 포함된다. 일부 경우에 전술한 범위의 하한선 미만의 투여량 수준이 적당한 것을 초과할 수 있으며, 한편 다른 경우에 여전히 보다 많은 용량이 사용될 수 있고, 따라서 상기 투여량 범위는 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하지 않는다. 실제 투여되는 상기 화합물의 양은 치료될 상태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물 또는 화합물들, 개개 환자의 연령, 체중, 및 반응, 및 환자의 증상의 중증도를 포함한, 관련 상황에 비추어, 의사에 의해 결정될 것이라는 점이 이해될 것이다.

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

상기 식에서,
R¹은 수소, 이소프로필, 디플루오로메틸, 디플루오로에틸, 또는 시클로프로필이고;
R²는 에틸, tert-부틸, 피리딘-2-일, 테트라히드로피란-4-일, 테트라히드로푸란-3-일, 시클로프로필, 또는 시클로부틸이고;
R³은 카르바모일페닐, 피리딘-2-일, (1-히드록시-1-메틸에틸)피리디닐, 1-메틸-2-옥소-1H-피리딘-4-일, 1-메틸피라졸릴, 피라진-2-일, 2-메톡시피리미딘-4-일, 1-메틸-2-옥소-1H-피리미딘-4-일, 피리다진-3-일, 6-클로로피리다진-3-일, 6-메틸피리다진-3-일, 또는 6-메톡시피리다진-3-일이다.
제1항에 있어서, 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 4-메틸벤젠술포네이트인 화합물 또는 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 결정질 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 4-메틸벤젠술포네이트인 화합물 또는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 19.7°, 18.4°, 및 22.0° (2θ±0.2°)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 함께 17.8°에서 적어도 1개의 피크를 포함하는, 결정질 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 4-메틸벤젠술포네이트인 화합물 또는 염.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
암의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 염이 4-메틸벤젠술포네이트인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 암이 결장암, 흑색종, 간세포 암종, 신장암, 교모세포종, 췌장암, 골수이형성 증후군, 폐암, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
섬유증의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 2-{4-[(4-{[1-시클로프로필-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-1H-피라졸-4-일]옥시}피리딘-2-일)아미노]피리딘-2-일}프로판-2-올 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 섬유증을 치료하는 방법.
제10항에 있어서, 염이 4-메틸벤젠술포네이트인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 섬유증이 간 섬유증 및 만성 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한 화합물 또는 염.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에서 사용하기 위한 화합물 또는 염.
제14항에 있어서, 암이 결장암, 흑색종, 간세포 암종, 신장암, 교모세포종, 췌장암, 골수이형성 증후군, 폐암, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물 또는 염.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증의 치료에서 사용하기 위한 화합물 또는 염.
제16항에 있어서, 섬유증이 간 섬유증 및 만성 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물 또는 염.