BR112015032529B1 - Composto de glicosaminoglicano e seu método de preparação, bem como sua aplicação - Google Patents

Composto de glicosaminoglicano e seu método de preparação, bem como sua aplicação Download PDF

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Abstract

COMPOSTO DE GLICOSAMINOGLICANO E SEU MÉTODO DE PREPARAÇÃO, BEM COMO SUA APLICAÇÃO. do presente pedido de patente de invenção refere-se a um composto, conjugando um medicamento com um glicosaminoglicano, tal como ácido hialurônico (HA), onde o medicamento é útil para o tratamento de doenças, tais como inflamação, doença autoimune, alergia, infecção e preferivelmente câncer; o composto conjugado do presente pedido de patente de invenção pode aumentar a concentração do medicamento em um local específico da doença por uma interação do glicosaminoglicano utilizado como transportador de distribuição de medicamento alvo e o receptor de superfície da célula CD44, aumentando, então, a eficácia terapêutica e reduzindo os efeitos colaterais sistêmicos do medicamento fornecido ao local.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA
[0001] O presente pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano com N° de Série 61/871.352, depositado em 29 de agosto de 2013, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DE APLICAÇÃO
[0002] O presente pedido de patente de invenção refere-se a um composto, consistindo em um glicosaminoglicano conjugado com um medicamento e a uma preparação respectiva.
DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA
[0003] A matriz extracelular (ECM| extracellular matrix) é uma montagem dinâmica de moléculas de interação que regulam as funções da célula e interações em resposta à estimulação. Uma classe de macromoléculas da matriz extracelular, os glicosaminoglicanos, são moléculas conhecidas para serem envolvidas em uma ampla gama de ambos os processos biológico e normal, incluindo migração celular, diferenciação celular, proliferação celular, resposta imune e organização citoesqueleto.
[0004] Os glicosaminoglicanos (GAGs | glycosaminoglycans) são cadeias não ramificadas compostas por unidades de dissacarídeos de repetição. Essas unidades de dissacarídeos sempre contêm um amino açúcar (N- acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), que na maioria dos casos é sulfatado, como segundo açúcar geralmente sendo um ácido urônico (glucurônico ou idurônico). Os GAGs são altamente carregados negativamente, devido à presença dos grupos de carbóxilos ou de sulfato sobre a maioria dos seus resíduos de açúcar. Como tal, eles são fortemente hidrofílicos. Os GAGs tendem a adotar conformações altamente estendidas e a formar matrizes que são preenchedoras de espaço e resistentes à força de compressão. Quatro grupos principais de GAGs foram distinguidos por seus resíduos de açúcar, o tipo de ligação entre esses resíduos, e o número e localização dos grupos de sulfato. Eles incluem: (1) ácido hialurônico, (2) sulfato de crondoitina e sulfato de dermatan, (3) sulfato de heparan e heparina, e (4) sulfato de queratan.
[0005] O hialurônico (também chamado de ácido hialurônico ou hialurônico ou HA) é o mais simples dos GAGs. Consistem em uma sequência de repetição de unidades de dissacarídeos não sulfatados, especificamente N- acetilglucosamina e ácido glucurônico. Seu peso molecular pode variar de 400 daltons (o dissacarídeo) até mais de milhões de daltons. É encontrado em quantidades variáveis em todos os tecidos, como pele, cartilagem, e olho, e na maioria, se não em todos, os fluídos em animais adultos. É especialmente abundante em embriões prematuros. Na cartilagem articular, o HA pode formar um grande agregado que é importante para a função de cartilagem. Além disso, a motilidade da célula e a adesão da célula imune são mediadas pelo receptor da superfície da célula RHAMM (Receptor for Hyaluronan-Mediated Motility | Receptor para Motilidade Mediada pelo Ácido Hialurônico) e CD44.
[0006] O HA é sintetizado diretamente na membrana interna da superfície da célula com o polímero em crescimento extrudido através da membrana até a parte externa da célula, visto que está sendo sintetizado. A síntese é mediada por uma única enzima de proteína, sintetase de hialurônico (HAS). Por contraste, outros GAGs são sintetizados dentro da célula no aparelho de Golgi, possivelmente na associação com algumas proteínas de núcleo, e então liberados por exocitose. A degradação do HA em tecidos vertebrados in vivo é mediada pela hialuronidase, e exoglicosidases que removem açúcares sequencialmente. A hialuronidase do tipo mamífero tem ambas as atividades hidrolítica e transglicosidase e pode degradas o HA e crondoitina. No tecido conjuntivo, a água de hidratação associada ao HA cria espaços entre tecidos, criando, assim, um ambiente conducente para o movimento e a proliferação celular. O HA desempenha uma função importante no fenômeno biológico associado à motilidade da célula incluindo o desenvolvimento rápido, regeneração, reparo, embriogênese, desenvolvimento embriológico, cicatrização de feridas, angiogênese e tumorigênese.
[0007] O CD44 (também conhecido como Pgp- 1, Hermes-3, HCAM, ECMR III) é uma glicoproteína amplamente expressa com um peso molecular de 85 a 90 kDa. O CD44 é um receptor principal da superfície da célula para o glicosaminoglicano, o ácido hialurônico (HA). O CD44 liga o HA especificamente, embora certo sulfato de condroitina contendo proteoglicanos possa também ser reconhecido. O CD44 desempenha uma função em várias funções celulares e psicológicas, incluindo adesão a e migração sobre HA, degradação de HA e metástase de tumor. O CD44 também foi mostrado para desempenhar uma função na ligação da matriz extracelular, migração celular, ativação de linfócitos, migração de linfócitos, e proliferação de células do músculo brônquico liso (Gunthert et al., 1991, A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells, 5;65(1):13-24). O receptor de CD44 mostra um padrão complexo de união alternativa em sua região variável do domínio extracelular. O CD44 parece ser particularmente importante para o receptor de leucócitos para HA e pode, portanto, ter uma função na patogênese de asma. Além disso, os níveis de HA, que foram elevados durante a asma em ratos de controle foram significantemente atenuados nos ratos tratados por anticorpos, suportando uma função para CD44 no metabolismo de HA (especificamente na desagregação do peso molecular alto do HA para formas de peso molecular baixo pró- inflamatórias). Isso pode ser particularmente importante, pois os oligossacarídeos de HA-derivado podem ligar e ativar o receptor do tipo Toll. Claramente, o aspecto mais impressivo dos resultados é a magnitude profunda dos efeitos de benefício do tratamento anti-CD44.
[0008] As interações de HA-CD44 podem desempenhar uma função importante no desenvolvimento, inflamação, recrutamento e ativação da célula T, inflamação do pulmão, e crescimento e metástase de tumor.
[0009] Os ratos com uma eliminação esquemática de o CD44 padrão e todas as isoformas se desenvolvem naturalmente. Estudos sugeriram uma função importante para o CD44 em estados inflamatórios, como artrite reumatoide e o extravasamento de células T para locais de inflamação de tecidos. O CD44 pode ter uma função importante no recrutamento de células inflamatórias em inflamações das vias aéreas induzida pelo alérgeno em ratos. O CD44 foi sugerido para desempenhar uma função crítica no controle da inflamação crônica, sugerindo que o CD44 pode ter uma função crítica no controle da ativação de macrófagos independente das interações com o HA (Dianhua Jiang, Hyaluronan in Tissue Injury and Repair, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007; 23:435-61) .
[00010] A habilidade para controlar respostas inflamatórias e imunes é central para a terapia de um amplo espectro de doenças. O CD44 suporta a adesão de linfócitos ativados para células do endotélio e de músculo liso. Além disso, a ligação de CD44 induz a ativação de ambas as células inflamatórias e vasculares. O HA, o ligante principal para CD44, é aumentado nas lesões aterosclerótica de ratos deficiência em apoE e as formas pró-inflamatórias de peso molecular baixo de HA estimulam o VCAM-1(molécula-1 de adesão da célula vascular), a expressão e a proliferação de células de músculo aórtico liso primário cultivado, enquanto as formas de peso molecular alto de HA inibem a proliferação de células de músculo liso. A Gal-9 (Galectina-9) pode reduzir a AHR (hiperresponsividade das vias respiratórias) bem como a inflamação das vias respiratórias de Th2-associado. Além disso, a administração da Gal-9, bem como o anticorpo monoclonal anti-CD44 monoclonal, inibiu a inflamação de células Th2 de sangue periférico nas vias aéreas. Interessantemente, a Gal- 9 limita diretamente a molécula de adesão de CD44 e inibiu interações com o HA. Consistente como conceito de que as interações CD44-HA mediaram a migração de células T no pulmão, a Gal-9 bloqueou a adesão dependente de CD44 de células T do rato BW5147 ao HA. Foi concluído que a Gal-9 inibe inflamações alérgicas das vias aéreas e AHR modulando o reconhecimento de leucócitos dependente de CD44 da matriz extracelular (Shigeki Katoh, et al., Galectin-9 Inhibits CD44-Hyaluronan Interaction and Suppresses a Murine Model of Allergic Asthma, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2007 Jul 1;176(1):27-35).
[00011] O CD44 será a expressão na doença autoimune, como Lúpus Eritematoso Sistêmico (SLE), Artrite Reumatoide, Síndrome de Sjogren, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), Espondilite Anquilosante, Artrite Psoriática, Psoríase, Dermatomiosite, Vasculite, e doença de Behcet. O Lúpus Eritematoso Sistêmico é uma doença de protótipo autoimune que afeta os sistemas de múltiplos órgãos. Acumular evidências sugere que o ácido hialurônico e sua interação com seu receptor da superfície da célula CD44 desempenha uma função importante em mediar mecanismos patogênicos em SLE (Yung S e Chan TM, 2012, The Role of Hyaluronan and CD44 in the Pathogenesis of Lupus Nephritis, Autoimmune Dis. Volume 2012 (2012), ID do Artigo 207190, 9 páginas). A Artrite Reumatoide (RA) é uma desordem autoimune comum que resulta na inflamação das articulações sinoviais de pacientes. Embora a RA afete aproximadamente 1% da população e seja classificada como uma desordem autoimune, o(s) evento(s) molecular(es) que inicia(m) a evasão de tolerância permanece(m) especulativo(s) e não confirmado(s) (Patrick J. Mott, CD44 Antibodies and Immune Thrombocytopenia in the Amelioration of Murine Inflammatory Arthritis, PLoS One, 2013, 8(6) : e65805) . Enquanto a Síndrome de Sjogren (SS) é mais comum que as desordens autoimunes relatadas, como Lúpus Eritematoso Sistêmico (SLE) e a Artrite Reumatoide (RA), pesquisas científicas e médicas sobre a SS se atrasaram significantemente. Isso é especialmente verdade no campo da genética de SS, onde os esforços válidos dependeram totalmente das abordagens do gene do candidato (John A. Ice, Genetics of Sjogren’s syndrome in the genome-wide association era, J Autoimmun. 2012 Aug;39(1-2):57-63). A Espondilite Anquilosante (AS) é uma doença reumática inflamatória comum com uma predileção para o esqueleto axial, afetando 0,2% da população. Os critérios de diagnóstico atuais dependem do compósito de alterações clínicas e radiológicas, com um tempo médio para diagnóstico de 5 a 10 anos (Roman Fischer, 2011, Discovery of Candidate Serum Proteomic and Metabolomic Biomarkers in Ankylosing Spondylitis, Mol Cell Proteomics, 2012 Feb;11(2):M111.013904). Os resultados sugerem que os linfócitos de circulação T suportando o CD44 ativado são elevados sobre a condição de inflamação crônica e que esses podem representar uma subpopulação patogenicamente importante de células de circulação ativadas que podem fornecer um marcador confiável para a atividade de doenças inflamatórias autoimunes ou crônicas (Estess P, et al., 1998, Functional activation of lymphocyte CD44 in peripheral blood is a marker of autoimmune disease activity, J Clin Invest. 1998 Sep 15;102(6):1173-82). A doença inflamatória intestinal (IBD), incluindo a Doença de Crohn (CD) e Colite Ulcerosa (UC), compartilha recursos clínicos e imunológicos com psoríase. Estudos de associação de genoma amplo encontraram genes de susceptibilidade comum. Entretanto, dados epidemiológicos avaliaram que a associação entre a psoríase, a Artrite Psoriática e o risco de IBD são escassos. Essa pesquisa tinha como o objetivo avaliar a associação entre a psoríase, a Artrite Psoriática e CD e UC incidentes entre mulheres nos EUA. A Psoríase com a Artrite Psoriática concomitante está associada a um risco elevado de CD incidente (Wen-Qing Li, 2013, Psoriasis, psoriatic arthritis and increased risk of incident Crohn’s disease in US women, Ann Rheum Dis. 2013 Jul;72(7):1200-5). A Dermatomiosite (DM) é uma doença do tecido conjuntivo relacionada à Polimiosite (PM) que é caracterizada pela inflamação dos músculos e da pele. Enquanto a DM afeta mais frequentemente a pele e os músculos, é uma desordem sistêmica que pode também afetar as juntas, o esôfago, os pulmões, e, menos comumente, o coração. A Vasculite é um grupo de desordens que destrói vasos sanguíneos por inflamação. Ambas as artérias e veias são afetadas. A patofisiologia de vasculite não é bem entendida, mas a resposta inflamatória garantida tem sido em geral bem descrita (Henry S. Su, 2012, Vasculitis: Molecular Imaging by Targeting the Inflammatory Enzyme Myeloperoxidase, Radiology, 2012 Jan;262(1):181-90). A Doença de Behcet (BD) é a única vasculite sistêmica envolvendo ambas as artérias e veias em quaisquer tamanhos. É frequentemente encontrada em clínicas de reumatologia. Tem algumas morbidades principais e mesmo consequências fatais em alguns casos. (M. B. Owlia, 2012, Behcet's Disease: New Concepts in Cardiovascular Involvements and Future Direction for Treatment, ISRN Pharmacol, 2012: 760484).
[00012] Interferão Alfa (IFNα) conjugado com o polietileno glicol (PEG) foi amplamente utilizado para o tratamento da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) como uma fórmula de injeção uma vez por semana. Entretanto, o IFNα peguilado tem uma baixa eficácia de 39% e um efeito colateral depois de repedidas injeções possivelmente devido à administração não específica com PEGylation. Portanto, o ácido interafrão alfa (HA-IFNα) conjugado alvo de ação prolongada específica do ácido hialurônico foi desenvolvido para o tratamento da infecção por HCV. O HA-IFNα conjugado foi sintetizado pela reação de acoplamento entre o aldeído modificado HA e o grupo N-terminal de IFNα. O conteúdo IFNα poderia ser controlado no intervalo de 2-9 moléculas por cadeia de HA única com uma eficácia de mais alta que 95%.
[00013] Vários estudos envolveram o CD44 nas interações diretas entre a bactéria e as células hospedeiras, bem como em eventos de sinalização que alteram as células hospedeiras e as tornam mais susceptíveis à infecção. O Streptococcus pyogenes, por exemplo, fixa-se às células através de sua cápsula de polissacarídeo rica em ácido hialurônico (ou parede da célula). O HA se liga ao CD44, que, por sua vez, desencadeia a fosforilação da tirosina de várias proteínas das células hospedeiras, bem como a redisposição citoesquelética que causa irritação e a extensão de lamelipódios. Como um resultado, a adesão intercelular é afrouxada devido ao número reduzido de junções apertadas e de caderina-E, um processo que permite a entrada de bactérias no tecido subepitelial.
[00014] O WO94/09811 descreve o uso de CD44 no tratamento de inflamação ou na detecção de metástase de câncer. Os autores mostram que o CD44 é aumentado nas condições inflamatórias e os peptídeos de CD44 são capazes da inibição da ativação da célula T. Nenhum dado ou reivindicação é apresentado na inibição da metástase pelo CD44 e nenhuma reivindicação é feita em relação ao uso de CD44 para inibir o crescimento de tumores ou angiogênese. O WO 99/45942 revela o uso de proteínas de ligação de peptídeos do HA incluindo CD44 para inibir o câncer a as doenças dependentes da angiogênese. Essa publicação utiliza metastatina, um fragmento de 38 kDa da proteína de ligação da cartilagem, bem como um peptídeo de ligação do HA derivado desse fragmento para inibir a metástase pulmonar de melanomas em ratos B16 e carcinoma de Lewis do pulmão. No caso do peptídeo de ligação do HA, o crescimento do melanoma B16 em frangos CAM e a migração da célula endotelial no HA foram inibidos. Em ambas as publicações, o uso de peptídeo de ligação do HA está diretamente relacionado à sua habilidade para ligar o ácido.
[00015] A Patente Americana n° 8.192.744 mostra que o domínio de ligação do ácido hialurônico do CD44 recombinante solúvel (CD44HABD) inibe a angiogênese in vivo em frangos e ratos e, assim, inibe o crescimento de tumores humanos de várias origens. A invenção revela proteínas recombinantes de CD44 solúveis não glicosadas como uma classe nova de inibidores de angiogênese baseados no direcionamento do receptor de superfície da célula vascular.
[00016] Assim, o estado da técnica revela o uso potencial de CD44 para especificar que quaisquer efeitos são dependentes da interação por HA-CD44. Consequentemente, toda a utilidade descrita anteriormente para o conjugado de CD44-HA é diretamente dependente da sua capacidade de ligar o ácido hialurônico.
[00017] Entretanto, alguns medicamentos ainda não são conjugados com sucesso em HA e adicionalmente os experimentos deveriam ser realizados para confirmar a inutilidade potencial de HA como liberação local do composto ativo. Em particular, o estado da técnica não mostro que as interações entre o receptor CD44 da célula da superfície e um conjugado de HA com um composto ativo pode ser explorado de forma lucrativa para uma liberação alvo de tal composto ativo em doenças caracterizadas por uma sobrecarga de CD44 que obtém uma melhoria terapêutica efetiva do mesmo.
SUMÁRIO
[00018] A finalidade do presente pedido de patente de invenção é fornecer novo composto com base na conjugação de HA com composto ativo adequado para uma liberação local de tal composto ativo em doenças que sobrecarregam o receptor CD44 da célula da superfície.
[00019] O presente pedido de patente de invenção, assim, fornece um composto que conjuga o glicosaminoglicano com um medicamento, em que o medicamento é utilizado para tratar doenças de inflamação que são altamente relacionadas com a expressão de CD44.
[00020] Em um primeiro aspecto, é um objeto do presente pedido de patente de invenção um composto que consiste em um conjugado de um glicosaminoglicano e um composto ativo, em que o composto ativo é conjugado por meios de um grupo funcional a um grupo carboxílico do glicosaminoglicano, seu derivado, ou um sal desse para formar uma conjugação covalente, e em que o composto ativo inclui medicamento anti-inflamatório, medicamento antialérgico e esteroide.
[00021] O glicosaminoglicano do conjugado de acordo com o presente pedido de patente de invenção é preferivelmente ácido hialurônico.
[00022] Além disso, o glicosaminoglicano conjugado de acordo com o presente pedido de patente de invenção é preferivelmente para uso para tratar doenças inflamatórias.
[00023] Assim, em um segundo aspecto é ainda um objeto do presente pedido de patente de invenção o uso de um composto que consiste em um conjugado de um glicosaminoglicano e um composto ativo, em que o composto ativo é conjugado por meios de um grupo funcional a um grupo carboxílico do glicosaminoglicano, seu derivado, ou um sal desse para formar uma conjugação covalente, e em que o composto ativo consiste em Celecoxibe, Fexofenadina, Budesonida e Prednisolona para o tratamento de inflamação e para a preparação de composições farmacêuticas para o referido tratamento terapêutico.
[00024] Ainda em um aspecto adicional, é um objeto do presente pedido de patente de invenção o método para preparar um composto que consiste em um conjugado de um glicosaminoglicano e um composto ativo, em que o composto ativo é conjugado por meios de um grupo funcional em um grupo carboxílico do glicosaminoglicano, seu derivado, ou um sal desse para formar uma conjugação covalente, e em que o composto ativo consiste em Celecoxibe, Fexofenadina, Budesonida e Prednisolona.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00025] Para adequadamente descrever o presente pedido de patente de invenção, as referências às aplicações dessas são ilustradas nos desenhos anexos. Esses desenhos formam uma parte do relatório descritivo. Entretanto, os desenhos anexos não são considerados limitativos no seu escopo.
[00026] A figura 1 mostra a afinidade de ácidos hialurônicos (HAs) pelo índice de fluorescência em tecidos de cólon normais e lesionados.
[00027] A figura 2 mostra os resultados de fluorescência de composto de corante de HÁ que trabalha na linha celular HCT 15 e linha celular HCT29 com diferente curso temporal, em que a figura 2A representa a linha celular HCT 15 em 6 horas; a figura2B representa a linha celular HCT 15 em 12 horas; a figura 2C representa a linha celular HCT29 em 6 horas; a figura2D representa a linha celular HCT29 em 12 horas.
[00028] A figura 3 mostra a estrutura de conjugado de HA-Celecoxibe.
[00029] A figura 4 mostra o efeito anti- inflamação de Controle, lipopolissacarídeo (LPS), HA, Celecoxibe (Cele), e conjugado de HA-Celecoxibe (HA-cele) na linha celular pura de 264.7. O índice de inflamação aqui é mudar a porcentagem da quantidade de prostaglandina E2 (PGE2).
[00030] A figura 5 mostra a estrutura de HA-ADH-Budesonida conjugada.
[00031] A figura 6 mostra o efeito anti- inflamação de Controle (ctrl), LPS, HA, HA mais LPS (HA+LPS), Budesonida (bude.), Budesonida mais LPS (bude+LPS), HA- Budesonida conjugado (HA-bude, “HA-bude” significa “HA-ADH- Budesonida”) e HA-Budesonida conjugado mais LPS (HA-bude+LPS) na linha celular pura de 264.7. O índice de inflamação aqui é mudança de concentração de nitrito (NO).
[00032] A figura 7 mostra a estrutura de HA-ADH-Fexofenadina conjugado.
[00033] A figura 8 mostra o efeito anti- inflamação de Controle, LPS, HA, Fexofenadina (Fexo), e HA- Fexofenadina conjugado (HA-fexo, “HA-fexo” significa “HA-ADH- Fexofenadina”) na linha celular pura de 264.7. O índice de inflamação aqui é a mudança de porcentagem de quantidade prostaglandina E2 (PGE2).
[00034] A figura 9 mostra a estrutura de HA-ADH-Prednisolona conjugado.
[00035] A figura 10 mostra o efeito anti- inflamação de Controle, LPS, HA, Prednisolona (Pred), e HA- Prednisolona conjugado (HA-pred, “HA-pred” significa “HA-ADH- Prednisolona”) na linha celular pura de 264.7. O índice de inflamação aqui é mudança de porcentagem da quantidade de prostaglandina E2 (PGE2).
[00036] A figura 11 mostra o efeito de tratamento de Artrite reumática (RA) pelo controle (veículo), Prednisolona (Pred), HA conjugado com Prednisolona (HA-ADH- Pred), e HA. O índice de tratamento aqui é mudança de porcentagem de espessura da pata (média±SE). Os ratos foram alimentados para induzir RA durante D1 a D13, e dosagem em D14. Os dados foram calculados pela estatística não paramétrica, *p<0,05 vs. Grupo do veículo; #p<0,05 vs. Grupo Prep e &p<0,05 vs. Grupo HA.
[00037] A figura 12 mostra o efeito de tratamento de Artrite reumática (RA) pelo controle (veículo), Prednisolona (Pred), HA conjugado com Prednisolona (HA-ADH- Pred), e HA. O índice de tratamento aqui é a mudança de porcentagem de circunferência do tornozelo (média±SE). Os ratos foram alimentados para induzir RA durante D1 a D13, e dosagem em D14. Os dados foram calculados pela estatística não paramétrica, *p<0,05 vs. Grupo de veículo; #p<0,05 vs. Grupo Prep e & p<0,05 vs. Grupo HA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS APLICAÇÕES PREFERIDAS
[00038] Outros objetivos, vantagens e recursos inovadores do presente pedido de patente de invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada quando em conjunto com os desenhos anexos.
[00039] No geral, um medicamento administrado oralmente ou injetado ao sistema de circulação deve chegar diretamente na sua área de tratamento alvo, e assim o efeito do medicamento na doença alvo e órgão normal é muito similar, pois a concentração e especificidade não são muito altas no local alvo, limitadas pelo perfil de segurança.
[00040] A fim de melhorar a eficácia da terapia combinando a mesma com o bom perfil de segurança, uma estratégia é modificar o medicamento para ser mais seletivo por alvo na área de doenças através do covalente que liga o medicamento com um veículo. Essa é uma necessidade particularmente sentida no campo de terapia anti-inflamatória conforme previamente antecipado.
[00041] Nessa finalidade, o inventor projetou a ideia para explorar as interações entre o ácido hialurônico (HA) e seu receptor CD44 para uma substância ativa de liberação alvo.
[00042] A ideia de manter a concentração relativa mais alta do medicamento no local alvo versus tecido normal ou órgão foi estabelecida pelo inventor seguindo o estudo a longo prazo e experimento em HA.
[00043] Os resultados, dos quais o presente pedido de patente de invenção se origina, são completamente descritos nos exemplos e são a seguir brevemente resumidos.
[00044] De fato, o presente pedido de patente de invenção encontra suporte no resultado que mostra que ácidos hialurônicos tendo diferentes pesos moleculares médios (MW) têm um índice de adesão mais alto no tecido lesionado do que no tecido normal e que o HA com peso molecular médio baixo executa melhor que os HAs com altos pesos moleculares médios. Em particular, conforme mostrado na figura 1, que compara as diferenças entre os HAs de três pesos moleculares médios aderidos nos tecidos de cólon lesionados, o índice de fluorescência de adesão de 350 KDa HA pelos tecidos de cólon lesionados estava mais alto que os HAs de outros dois pesos moleculares médios (2000 KDa = 2 MDa) e (1000 KDa = 1 MDa). Adicionalmente, o índice de fluorescência de adesão de 1 MDa HA por tecidos de cólon lesionados ou ainda normais estava mais alto que 2 MDa HA. Esse resultado confirmou que o HÁ pode aderir mais especificamente no local da inflamação, que induz o inventor a inventar o presente pedido de patente de invenção e verificar se esse recurso peculiar de adesão do tecido de ácido hialurônico, supostamente devido a uma interação de HA com seu receptor CD44 da célula da superfície, pode ser mantido quando esse glicosaminoglicano é conjugado com outros compostos. Assim, o inventor adicionalmente conjuga um medicamento com HA a fim de verificar se HA pode ser utilizado como um veículo de liberação alvo para conduzir o medicamento no local de abundância de CD44. Conforme previamente mencionado, quando CD44 é sobrecarregado durante a situação de existência de inflamação, infecção ou um câncer, um medicamento relacionado pode chegar facilmente e reter a alta concentração relativa no local alvo pertencente ao ligante HA fixa novamente no receptor CD44. Junto com o efeito de aderência de HA no local da inflamação ou local de abundância de CD44, o medicamento conjugado deveria especialmente agregar na parte alvo para melhorar a eficácia da terapia pertencente à concentração relativa mais alta do medicamento no local, e assim reduzindo de acordo com a quantidade do medicamento utilizado com o melhor perfil de segurança. A fim de confirmar o medicamento ou corante foi conjugado com sucesso com HA e adicionalmente confirmar o efeito de fixação de HA, o inventor do presente pedido de patente de invenção conduziu um experimento incluindo o corante de conjugação no HA (corante de HA) e tratando com as linhas celulares e ratos separadamente. A figura 2A e a figura 2B mostram os experimentos em diferentes momentos operacionais na linha celular HCT15 (um adenocarcinoma colorretal com menos CD44), e a figura 2C e a figura 2D mostram os experimentos em diferentes momentos operacionais na linha celular HT29 (um adenocarcinoma colorretal com CD44 rico). Os resultados de HT29 (figura 2C e figura 2D) mostram o corante de HA que foi conjugado com sucesso e fixado na área abundante CD44 de HT29 (figura 2C), e mesmo entram nas células HT29 (figura 2D). Isso significa que a ideia do presente pedido de patente de invenção é correta e efetiva e ainda significa um medicamento ou corante que pode ser conjugado em HA e que HA retém sua capacidade de ligar CD44.
[00045] A condição de fixação sem corante e corante de HA nas linhas celulares de HT29 e HCT15 de ratos por 4 semanas foi conduzida. O corante isento foi injetado na veia do rabo do camundongo. O resultado mostrou as duas células cancerígenas de expressão CD44 diferentes sem qualquer diferença resultado de fixação. A razão da área de fixação de HT29 é 50,15%, enquanto que HCT15 é 49,86%. Entretanto, quando o corante de HA conjugado foi injetado na veia do rabo camundongo, mais células cancerígenas da expressão CD44 HT 29 mostrou concentração significante de corante de HA conjugado, mas menos expressão CD44 HCT15 mostrou resultado muito limitado. A razão da área de fixação de HT29 é 74,15%, enquanto que HCT15 é 25,85%. O resultado pode mostrar que quando o corante conjugado com HA, a concentração de corante foi aumentada devido ao HA fixado no local abundante de CD44.
[00046] Doenças altamente relacionadas a CD44 incluem câncer, infecção e inflamação. Patógenos de infecção incluem, mas não se limitam a, alguns vírus, bactérias, fungos, protozoários, parasitas multicelulares, e proteínas aberrantes conhecidas como priões. Esses patógenos são a causa das epidemias de doença, no sentido que sem o patógeno, nenhuma epidemia infecciosa ocorre. Em uma aplicação preferida, a doença de infecção inclui infecções respiratórias inferiores, HIV/AIDS, doenças com ciarréia, tuberculose, malária, sarampo, coqueluche, tétano, meningite, sífilis, hepatite B, sepse, e doenças tropicais. Anormalidades inflamatórias são um grande grupo de doenças que estão na base de uma grande variedade de doenças humanas. Em uma aplicação preferida, a doença por inflamação inclui acne, doenças alérgicas, asma, doenças autoimunes, doença celíaca, prostatite crônica, glomerulonefrite, hipersensibilidades, doenças inflamatórias do intestino, doença pélvica, inflamatória, lesão de reperfusão, artrite reumatoide, sarcoidose, rejeição de transplante, vasculite, e cistite intersticial.
[00047] No relatório descritivo e nas reivindicações o termo “medicamento” ou “composto” ou “agente” para uso no presente pedido de patente de invenção pode compreender medicamento antiasmático, anti-histamina, anti- infecção, anti-inflamatório, antialérgico, antiviral, imunosupressante, NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drug |medicamento anti-inflamatório não esteroide), e esteroide. Entre eles, o medicamento antialérgico, anti-infecção, anti- inflamatório, e esteroide são preferidos. A maioria dos medicamentos antialérgicos podem ser divididos em anti- histamina, agentes anti-inflamatórios, descongestionantes e esteroide como Fexofenadina, cetirizina, maleato de clorfeniramina, pseudoededrina e Budesonida. A maioria dos medicamentos anti-infecção pode ser dividida em meios anti- infecção locais que são utilizados externamente na pele ou membranas mucosas sem entrar na corrente sanguínea e metabolizando no fígado; e meios de anti-infecção sistêmicos que são utilizados para meios de infecção através da administração oral ou injetada. A maioria dos medicamentos anti-inflamatórios pode ser dividia em anti-inflamatórios não esteroidais ou NSAIDs, antagonista COX-2 e esteroide.
[00048] Em outra aplicação, exemplos de medicamentos apropriados são medicamento antiasmático, antifúngicos, anti-histamina, anti-inflamatório, antiviral, NSAID e esteroide desses. Em uma aplicação preferida, a conjugação de medicamento antiasmático incluindo Salbutamol; NSAID incluindo Nimesulide, Celecoxibe, Meloxicam, Diclofenac e Piroxicam; medicamento antialérgico incluindo Fexofenadina; medicamento antifúngico incluindo Anfotericina B; medicamento antiviral incluindo Ribavarina; e esteroide incluindo Budesonida e Prednisolona para HA foram preferidos. Adicionalmente, antagonista COX-2 inclui Celecoxibe.
[00049] O objetivo do presente pedido de patente de invenção é ligar ou conjugar o HA com um medicamento previamente mencionado, com ou sem um ligante ou espaçador, pelo grupo carboxílico, grupo hidroxílico, ou grupo amino de HA para realizar o efeito na localização específica e tempo específico. Assim, o HA como um veículo de liberação alvo para carregar o medicamento ao local específico que tem CD44 abundante pode produzir melhor eficácia de tratamento e segurança.
[00050] Conforme utilizado aqui, no geral, o termo “ligante” ou “espaçador” significa uma parte orgânica que conecta duas partes de um composto. Ligantes compreendem tipicamente uma ligação direta ou um átomo como oxigênio ou enxofre, uma unidade como SS, NH, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ou uma cadeia de átomos, como alquila substituído ou não substituído onde um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por O, S, S(O), SO2, NH, NH2, C(O). O termo “ligante” ou “espaçador” do presente pedido de patente de invenção pode estar ausente e denotar qualquer composto químico presente entre o medicamento e o HA que pode ser removido quimicamente, enzimaticamente ou pode decompor espontaneamente; ainda contém pelo menos um outro grupo útil para ligar o medicamento, por exemplo, amino, tiol, outros grupos carboxílicos, etc. O ligante ou espaçador pode ser um polipeptídio, um peptídeo, ou um lipídio.
[00051] Ligantes ou espaçadores adequados são, por exemplo, uma dihidrazida, adípico dihidrazido, polipeptídio, um peptídeo, lipídio, aminoácido e ácidos dicarboxílicos de C2-C20 alifáticos, aromáticos ou aralifáticos, lineares ou ramificados.
[00052] A função do ligante, sempre que presente, consiste em criar um braço ou um espaçador entre o ácido hialurônico e o medicamento. O ligante engata em um lado do HA através do amido, grupo carboxílico, grupo hidroxílico, ou ligação de grupo amino e, no outro lado, o medicamento através de qualquer possível ligação do tipo covalente.
[00053] Quando o ligante ou espaçador é um ácido dicarboxílico, o grupo carboxílico que forma a ligação de éster com o medicamento pode ser o grupo hidroxílico do composto. Quando o ligante ou o espaçador é uma dihidrazida, o grupo amino que forma a ligação de amido com HA pode ser o grupo carboxílico livre do HA. Ligantes ou espaçadores preferidos são: ácido succínico para medicamento, adípico dihidrazido para HA.
[00054] Na aplicação preferida, o presente pedido de patente de invenção fornece um composto que consiste em um conjugado de um glicosaminoglicano, preferivelmente ácido hialurônico, e um composto ativo, em que o composto ativo é conjugado por meios de um grupo funcional para um grupo carboxílico do glicosaminoglicano, seu derivado, ou um sal do mesmo para formar uma conjugação covalente, e em que o composto ativo consiste em medicamento anti-inflamatório, medicamento antialérgico e esteroide.
[00055] O medicamento anti-inflamatório de composto ativo incluindo Celecoxibe que é um antagonista de COX-2, medicamento antialérgico incluindo Fexofenadina, e o esteroide incluindo Budesonida e Prednisolona pode ser ligado preferivelmente diretamente ou indiretamente através de um ligante por meios do grupo carboxílico funcional do HA e o grupo NH2 dos compostos ativos.
[00056] Em uma aplicação preferida do presente pedido de patente de invenção, a conjugação covalente, tanto direta quanto indireta através de um ligante, entre um dos grupos carboxílicos funcionais de HA e do composto ativo pode ser uma ligação amídica ou uma ligação de éster.
[00057] Em caso de conjugação indireta por meios de um ligante, os referidos ligantes são selecionados de uma dihidrazida, adípico dihidrazido, polipeptídio, um peptídeo, lipídio, aminoácido e ácidos dicarboxílicos de C2C20 alifáticos, aromáticos ou aralifáticos, lineares ou ramificados.
[00058] O HA preferido para a conjugação tem um peso molecular médio na faixa compreendida de 5 kDa a 2000 kDa e a conjugação envolve pelo menos 40% do grupo carboxil de HA.
[00059] A fim de tratar a inflamação aguda ou crônica, onde a inflamação aguda ou crônica é induzida ou causada pela infecção, lesão, doença autoimune, ou alergia e a doença autoimune incluindo Artrite reumática, a aplicação preferida da formulação ou dosagem do presente pedido de patente de invenção incluindo um excipiente e/ou diluente para formular uma forma de dosagem de administração para uso de sistema oral ou circulação. A aplicação mais preferida da forma de dosagem oral é selecionada do grupo que consiste em forma de dosagem sólida, solução incluindo, mas não se limitam a, suspensão, comprimido incluindo, mas não se limitam a comprimido de liberação controlada, e cápsula incluindo, mas não se limitam a, cápsula revestida por entérico. A aplicação mais preferida do sistema de circulação ou forma de administração sistêmica é selecionada do grupo que consiste em intravenosa (IV | intravenous), intramuscular (IM | intramuscle) e subcutânea (SC | subcutaneous).
[00060] Os seguintes exemplos são dados para a finalidade de ilustração das várias aplicações do presente pedido de patente de invenção e não são direcionadas para limitar o presente pedido de patente de invenção em qualquer forma. EXEMPLO EXEMPLO 1: A ADESÃO DE HA NO TECIDO DO CÓLON (SISTEMA DE IMAGIOLOGIA IVIS-VERSÃO 3) PROCEDIMENTO: 1. 0,25 g de hialuronato de sódio em pó de alto peso molecular (HHA; Mw: 2 MDa; Freda) e 0,25 g de hialuronato de sódio em pó de baixo peso molecular (LHA; Mw: 0,35 MDa; Freda) foram adicionados a 50 ml PBS de tampão (salina tamponada com fosfato), respectivamente, para formar 0,5% de solução, e, então, agitados por 6 horas até que o pó fosse totalmente dissolvido. 0,25 g de hialuronato de sódio em pó de média peso molecular (MHA; Mw: 1 MDa; Freda) foram adicionados a 50 ml PBS de tampão, e, então, agitados por 6 horas até que o fosse totalmente dissolvido e estivesse pronto para o uso nas etapas seguintes. 2. HA fluorescente (HA-f) foi preparado por (1) 0,39 g de MES de ácido livre (ácido etanosulfônico 2-(N-morfolino), Calbiochem) e foi dissolvido em 100 ml de água DD. (2) A solução A: 65 mg de fluroresceinamina em pó, (isômero I, Fluka) foram dissolvidos em 9 ml, 95% de solução de EtOH e, então, agitados por 10 minutos sobre uma condição em que a luz foi proibida. (3) A solução B: 359 mg de EDC em pó (N-(3- Dimetilamino propil)-N-etil de hidrocloreto de carbodiimida, Sigma) foram dissolvidos em 9 ml de tampão de MES e, então, agitados por 10 minutos. (4) A solução C: 216 mg de NHS em pó (N-Hidroxisuccinimida, Sigma) foram dissolvidos em 9 ml de tampão de MES e, então, agitados por 10 minutos. (5) 3 ml da solução A foram lentamente colocados em 50 ml de 0,5% da solução de HA e, então, agitados por 10 minutos sob uma condição que em que a luz foi proibida. (6) 3 ml da solução B e 5 ml da solução C foram separadamente colocados em uma solução da etapa (5) e, então, agitados por 10 minutos uma condição em que a luz foi proibida. (7) 0,02 M de tampão de MES foram lentamente adicionados na solução da etapa (6) até o volume alcançado de 100 ml e foram então agitados por 24 horas em temperatura ambiente sob uma condição em que a luz foi proibida. (8) O produto após a reação foi despejado em um tubo de diálise (MW: 12000~14000) em 5 L de água como uma solução de diálise e, então, agitado por 5 dias a 4°C sob uma condição em que a luz foi proibida com a solução de diálise sendo alterada a cada 12 horas até a solução de diálise não ter fluorescência. (9) O líquido após a diálise foi alocado em tubos centrífugos de plástico de 50 c.c. e, então, reservados em um refrigerador a -20°C durante a noite, seguido pela secagem em uma máquina de liofilização sob uma condição em que a luz foi proibida. (10) O HA-f em pó seco foi reservado em um refrigerador a -20°C. (11) 50 mg de HA-f em pó foram lentamente adicionados a 10 ml de tampão de PBS e, então, agitado por 6 horas até que o pó fosse totalmente dissolvido. 3. Tecido de cólon de ratos SD (Rato Sprague-Dawley) com 7-8 semanas de vida foi cortado por bisturi e, então, lavado por tampão de PBS, seguido por sendo cortado a 3-4 cm de comprimento com imersão no tampão de PBS finalmente. 4. Tecido de cólon lesionado foi preparado escovando com escova de dente por 20 vezes longitudinalmente e, então, imergindo no tampão de PBS. 5. Tecidos de cólon normais e lesionados foram colocados em uma lâmina de 12 furos e, então, 1 ml de 0,5 % da solução de HA-f foi adicionado em cada furo e movimentado por 2 horas em temperatura ambiente. A solução de HA-f excedente foi sugada pela ponta 2 horas depois, e, então, imergida no tampão de PBS por 10 minutos seguido pela remoção do tampão de PBS repetidamente por 3 vezes. 6. Tecido de cólon limpo foi colocado em uma lâmina de 12 furos com tecidos de revestimento virado para cima e, então, colocado sobre a base do IVIS (sistema de imagem in vivo, XENOGEN). O parâmetro padrão foi definido como GFP (proteína fluorescente verde) enquanto a excitação era 465 nm e a emissão era de 500 nm e, então, a imagem foi capturada pelo software. 7. Todos os valores são calculados como forma de n observações. O índice histológico foi analisado por testes t dos estudantes.
[00061] Resultado: O índice de fluorescência foi quantificado e disposto como na Figura 1. O índice de fluorescência de tecido de cólon normal foi definido como 1. Os outros testes de tecidos de cólon foram calibrados pelo valor definido. O resultado mostrou que os HAs com a mesma média de Mw foram aderidos aos tecidos de cólon lesionado com índice de fluorescência obviamente mais alto que nos tecidos de cólon normais (P<0,01). Comparando a diferença entre os HAs de três pesos moleculares médios diferentes aderidos aos tecidos de cólon lesionado, o índice de fluorescência de adesão de 350 KDa de HA pelos tecidos de cólon lesionado foi obviamente maior que os HAs de outros dois pesos moleculares médios (2 MDa e 1 MDa). Ainda, o índice de fluorescência de adesão de 1 MDa de HA tanto por tecidos de cólon normais quanto por lesionados foi mais alto que 2 MDa de HA.
EXEMPLO 2: PROCESSO DE CONJUGAÇÃO DE CORANTE HA E IMAGEM DO CORANTE HA IN VITRO
[00062] O seguinte processo inteiro de conjugação de corante HA deve ser mantido no escuro. A síntese de HA-ADH: 1. O HA (0,34 MDa, 50 mg) foi dissolvido em água para dar uma concentração de 4 mg/ml. 2. 5 vezes o excesso (114,8 mg) de ADH foi adicionado à solução. 3. O pH da mistura da reação foi ajustado para 4,75 pela adição de 0,1 N de HCl. 4. Então, 1 equivalente (25,1 mg) de EDC foi adicionado na forma sólida. O pH da mistura da reação foi mantido a 4,75 pela adição de 0,1 N de HCl. 5. Após 15 minutos reagindo, a reação foi extinta pela adição de 0,1 N de NaOH para ajustar o pH mistura de reação a 7,0. 6. A mistura da reação foi então transferida para o tubo de diálise pré-tratado (corte de Mw de 3500) e exaustivamente dialisada contra 100 mM de NaCl, então 25% de EtOH/água de 4 ciclos e, finalmente, água. A solução foi então filtrada através de 0,2 μm da membrana de acetato de celulose, de congelamento rápido, e liofilizada. 7. O grau de substituição de ADH foi medido por 1 H de NMR. A síntese de HA-ADH-FITC 8. 88 mg de HA-ADH (DS=36%) foram dissolvidos em 35 ml de água. 9. 9,5 mg de FITC foram dissolvidos em 10 ml de DMSO. 10. Misturar a solução de HA-ADH e a solução de FITC. 11. Após agitado por 48 h em temperatura ambiente, a solução foi dialisada por 3 dias com 0,3 M de NaCl e água pura alternadamente utilizando uma bolsa de diálise de 12000-14000 de MWCO. 12. A solução foi então liofilizada por 2 dias. 13. Finalmente, o grau de substituição foi determinado pelo espectro de UV. Imagem de corante HA in vitro (1) Células de 1x105 HT29 e células de HCT15 (câncer de cólon humano, uma célula CD44 positiva) foram cultivadas em uma lâmina de microscópio de placa de 3,5 cm. (2) Concentrações de corantes indicadas, 1 μM de corante HA (HA: 0,34 MDa), foram adicionadas às células por tempo indicado, respectivamente. (3) Após a incubação, as células foram lavadas em PBS, e, então, fixadas em 3,7% de formaldeído. (4) Observação da interação entre corante HA e as células foi realizada pela microscopia confocal.
[00063] Resultado: A vista fluorescente pode mostrar o local de fixação e a quantidade de corante em HCT15 (Figura 2A e Figura 2B) e HT29 (Figura 2C e Figura 2D). Os resultados revelam que o corante foi conjugado de maneira bem-sucedida com HA e HA aumenta a concentração de corante HA no local abundante de CD44 em HT29, enquanto HT29 tem fluorescência mais forte que combina com CD44 mais abundante que o HCT15 tem. Mesmo provado que o corante HA pode entrar nas células (Figura 2D). O corante HA foi acumulado após um tratamento de 6 horas e internalizado após um tratamento de 12 horas em HT29 (mais CD44). Tal fenômeno não é observado em HCT15 (menos CD44) após um tratamento de 6 horas ou de 12 horas de corante HA. EXEMPLO 3: SÍNTESE DE HA-CELECOXIBE CONJUGADO PROCEDIMENTO: 1. 100 mg de HA (10K-700KDa) foram dissolvidos em 25 ml DD de água. 2. Hidróxido de tetrabutilamônio (TBA-OH) 0,8 e foi adicionado à solução de HA e agitado por 16 horas. 3. Seca a solução e o HA-TBA sólido branco foi alcançado. 4. 40 mg de HA-TBA foram dissolvidas em 1 ml DD de água e, então, 30 mg de EDC e 18 mg de NHS em pó foram adicionados na solução e agitados em temperatura ambiente por 5 minutos. 5. 4 mg de Celecoxibe foram dissolvidos em 2 ml da solução de dimetilsulfóxido (DMSO). 6. A mistura (HA-TBA, EDC, NHS e Celecoxibe) foi agitada em temperatura ambiente por 72 horas. 7. A mistura foi dialisada por 1 dia contra a razão de DMSO e água DD é de 2 para 1 utilizando a bolsa de diálise (MWCO: 1200~1400) e a solução foi alterada três vezes. 8. A mistura foi então dialisada por 2 dias contra 0,3 M de NaCl utilizando uma bolsa de diálise (MWCO: 1200~1400) e a solução foi alterada duas vezes ao dia. 9. O HA-Celecoxibe em pó foi alcançado pela desidratação através de liofilização a partir da solução de HA-Celecoxibe.
[00064] Resultado: A Figura 3 mostra a estrutura de HA-Celecoxibe conjugado.EXEMPLO 4: EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIOS IN VITRO DE HA- CELECOXIBE EM CÉLULAS PURAS DE 264,7 PROCEDIMENTO
[00065] As células puras de 264,7 (1x106 células/furo, 1000 μL) foram incubadas em uma lâmina de cultura de 24 furos na presença de 5% de CO2 a 37°C por 24 horas.
[00066] O meio foi alterado para DMEM contendo 10% de FBS, e as células foram tratadas com várias concentrações de compostos (100 μM de Celecoxibe, HA- Celecoxibe (igual a 100 μM de Celecoxibe), e 4,9 mg/ml de HA) por 4 horas seguido pelo tratamento de 1 μg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) por 24h.
[00067] Os meios da célula foram colocados, e utilizados para medir PGE2.
[00068] Placas de 96 alvéolos Nunc-Immuno foram revestidas com anticorpo secundário IgG antirrato policlonal de cabra.
[00069] As alíquotas de meio celular foram adicionadas à lâmina imune com anticorpo monoclonal PGE2 e um marcador de PGE2-acetilcolinesterase durante a noite em temperatura ambiente no escuro.
[00070] No dia seguinte, os furos foram aspirados, lavados com 100 μL do tampão de lavagem (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA) por cinco vezes.
[00071] 200 μL de reagente do Elman foram adicionados em cada furo, e incubados por 60-90 minutos em temperatura ambiente fora de luz direta.
[00072] O giro/movimentação suave foi utilizado para diminuir o tempo exigido para o desenvolvimento de cor.
[00073] A absorção foi lida a 412 nm.
[00074] A concentração de PGE2 de cada amostra foi calculada a partir de uma curva de PGE2 padrão.
[00075] A quantidade percentual de PGE2 foi como uma função do nível de PGE2 de cada amostra dividido por um dos grupos de controle que foi tratado por LPS, e, então, multiplicou esse valor por 100.
[00076] A quantidade real de PGE2 foi estimada para ser 1370 ng/ml para o grupo de controle que foi tratado por LPS.
[00077] Resultado: Como mostrado na Figura 4, a inflamação foi induzida de maneira bem-sucedida pelo LPS visto que o índice é a quantidade de PGE2. O grupo de somente medicamento (Celecoxibe) tem efeito de tratamento; entretanto, conjugado o HA com Celecoxibe (HA-cele), tem um efeito de tratamento melhor que somente o medicamento. EXEMPLO 5: SÍNTESE DE HA-ADH-BUDESONIDA CONJUGADO PROCEDIMENTO SÍNTESE DE HA-ADH: 1. HA (50 mg) foi dissolvido em água para dar uma concentração de 4 mg/ml. 2. 5 vezes o excesso (114,8 mg) de ADH foi adicionado à solução. 3. O pH da mistura de reação foi ajustado a 4,75 pela adição de 0,1 N de HCl. 4. Então, 1 equivalente (25,1 mg) de EDC foi adicionado em forma sólida. O pH da mistura da reação foi mantido a 4,75 pela adição de 0,1 N de HCl. 5. Após 15 minutos reagindo, a reação foi extinta pela adição de 0,1 N de NaOH para ajustar o pH mistura de reação a 7,0. 6. A mistura da reação foi então transferida para o tubo de diálise pré-tratado (corte de MW 3500) e exaustivamente dialisada contra 100 mM de NaCl, então 25% de EtOH /água de 4 ciclos e finalmente água. A solução foi então filtrada através de 0,2 μm de membrana de acetato de celulose, de congelamento rápido, e liofilizada. 7. O grau de substituição de ADH foi medido por 1 H de NMR. SÍNETSE DE HA-ADH-BUDESONIDA: 1. O succinato de HA-ADH-Budesonida foi formado pela conjugação química do grupo carbóxilo de succinato de Budesonida com o grupo amina de HA-ADH utilizando EDC e NHS. 2. 7,4 mg de Succinato de Budesonida foi dissolvido em 1 ml de DMSO e reagido com 1 ml de água pura contendo 14,5 μmol de EDC e 14,5 μmol de NHS por 5 minutos. 3. Após 5 minutos, a solução misturada foi adicionada gota a gota em 8 ml de água: DMSO=1:1(v/v) de cossolvente contendo 20 mg de HA-ADH. 4. A solução misturada foi agitada por 24 horas em temperatura ambiente (aproximadamente 30°C). 5. Após 24 horas, a solução foi dialisada por 3 dias com 0,3 M de NaCl e água pura alternadamente utilizando uma bolsa de diálise de 12000-14000 de MWCO. 6. A solução foi então liofilizada por 2 dias e armazenada a 4°C. 7. Finalmente, o grau de distribuição foi determinado por 1H- NMR.
[00078] Resultado: A Figura 5 mostra a estrutura de HA-ADH- Budesonida conjugado. EXEMPLO 6: EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIOS IN VITRO DE HA-ADH- BUDESONIDA EM CÉLULAS PURAS DE 264,7 PROCEDIMENTO 1. Células puras de 264,7 foram suspensas em cultura media sem vermelho de fenol (Gibco-BRL, Vienna, Áustria) e ajustadas para 106 células/ml, e tratadas com 10 μM de Budesonida, 378μg/ml de HA e HA-ADH-Budesonida (igual a 10 μM de Budesonida). 2. Após o tratamento com medicamento por 4 horas, 1 μg/mL de LPS foi adicionado ao meio por 24 horas. 3. As células tratadas com o meio servido somente como um grupo de controle negativo e tratadas com LPS (1 μg/mL) como um grupo de controle positivo. 4. Os sobrenadantes de cultura foram removidos subsequentemente e o óxido nítrico foi acumulado para a medição da atividade de iNOS pela reação de Griess. 5. 100 μl de reagente de Griess (1% de sulfanilamida, 0,1% de dicloridrato de naftil-etilenodiamina em 2,5% de ácido fosfórico) foram adicionados em 100 μl de sobrenadantes de cultura e o desenvolvimento da cor foi avaliado em 550 nm com um leitor de microlâminas ELISA (SpectraMax® M2e Multimode Plate Reader, Molecular Devices, EUA). 6. Curvas padrão foram geradas com uma diluição em série de nitrito de sódio dissolvido em meio de cultura que é livre de vermelho de fenol.
[00079] Resultado: Como mostrado na Figura 6, ao comparar com grupos LPS somente, HA+LPS, bude+LPS, e HA- bude+LPS (“HA-bude” significa “HA-ADH-Budesonida”), grupos HA+LPS e HA-bude+LPS tem efeito de tratamento. O índice de inflamação aqui é nitrito. EXEMPLO 7: SÍNTESE DE HA-ADH-FEXOFENADINA CONJUGADO PROCEDIMENTO 1. HA-ADH-Fexofenadina foi sintetizado por conjugação química do grupo carbóxilo de Fexofenadina com o grupo amina de HA-ADH utilizando EDC e NHS. 2. 7,8 mg de Fexofenadina foi dissolvido em 1 ml de DMSO e reagido com 1 ml de água puta contendo 73,3 μmol de EDC e 73,9 μmol de NHS por 5 minutos. 3. Após 5 minutos, a solução misturada foi adicionada gota a gota em 8 ml de água: DMSO=1:1(v/v) de cossolvente contendo 20 mg de HA-ADH. 4. A solução misturada foi agitada por 24 horas em temperatura ambiente (aproximadamente 30°C). 5. Após 24 horas, a solução foi dialisada por 3 dias com 0,3 M de NaCl e água alternadamente utilizando uma bolsa de diálise de 12000-14000 de MWCO em série. 6. A solução foi então liofilizada por 2 dias e armazenada a 4°C. 7. Finalmente, o grau de substituição foi determinado por 1H- NMR.
[00080] Resultado: A Figura 7 mostra a estrutura de HA- ADH-Fexofenadina conjugado. EXEMPLO 8: EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIOS IN VITRO DE HA-ADH- FEXOFENADINA EM CÉLULAS PURAS DE 264,7 PROCEDIMENTO 1. As células puras de 264,7 (1x106 células/furo, 1000 μL) foram incubadas em uma lâmina de cultura de 24 furos na presença de 5% de CO2 a 37°C por 24 horas. 2. O meio foi alterado para DMEM contendo 10% de FBS, e as células foram tratadas com várias concentrações de compostos (100 μM de Fexofenadina, HA-ADH-Fexofenadina (igual a 100 μM de Fexofenadina), e 2,96 mg/ml de HA) por 4 horas seguido pelo tratamento de 1 μg/mL de LPS por 24h. 3. Os meios da célula foram coletados, e utilizados para medir PGE2. 4. Placas de 96 alvéolos Nunc-Immuno foram revestidas com anticorpo secundário IgG antirrato policlonal de cabra. 5. As alíquotas de meio celular foram adicionadas à lâmina imune com anticorpo monoclonal PGE2 e um marcador de PGE2- acetilcolinesterase durante a noite em temperatura ambiente no escuro. 6. No dia seguinte, os furos foram aspirados, lavados com 100 μL do tampão de lavagem por cinco minutos. 7. 200 μL de reagente do Elman foram adicionados em cada furo, e incubados por 60-90 minutos em temperatura ambiente fora de luz direta. 8. O giro/movimentação suave foi utilizado para diminuir o tempo exigido para o desenvolvimento de cor. 9. A absorção foi lida a 412 nm. 10. A concentração de PGE2 de cada amostra foi calculada a partir de uma curva de PGE2 padrão. 11. A quantidade percentual de PGE2 foi como uma função do nível de PGE2 de cada amostra dividido por um dos grupos de controle que foi tratado por LPS, e, então, multiplicou esse valor por 100. 12. A quantidade real de PGE2 foi estimada para ser 1370 ng/ml para o grupo de controle que foi tratado por LPS.
[00081] Resultado: Como mostrado na Figura 13. o grupo de somente medicamento (Fexofenadina) tem efeito de tratamento; entretanto, conjugado o HA com Fexofenadina (HA-fexo, “HA-fexo” significa “HA-ADH-Fexofenadina”), tem melhor efeito de tratamento do que somente medicamento. EXEMPLO 9: SÍNTESE DE HA-ADH-PREDNISOLONA CONJUGADO PROCEDIMENTO 1. Síntese de 21-hemi-éster de Prednisolona: 2. Uma solução de Prednisolona (1 g; 2,77 mmols) e anidrido succínico (1,125 g; 12,55 mmols) em piridina (8 mL) foi agitada em temperatura ambiente. 3. Após 24 h, a mistura da reação foi despejada em uma mistura de gelo (25 g), água (25 mL) e concentração de HCl (10 mL). 4. Os cristais separados foram coletados por filtração, lavados com água, secos, recristalizados a partir de tolueno e secos novamente durante toda a noite. 5. O hemi-éster preparado foi caracterizado por espectroscopia de 1H-NMR. SÍNTESE DE HEMI-ÉSTER DE HA-ADH-PREDNISOLONA: 1. SOLUÇÃO 1: EDC 73,3 μmol (14 mg) e NHS 73,9 μmol (8,5 mg) foram adicionados em 1 ml de água. 2. SOLUÇÃO 2: Hemi-éster de Prednisolona 14,5 μmol (6,4 mg) foi dissolvido em 1 ml de DMSO. 3. SOLUÇÃO 3: HA-ADH (D.S=31%) 20 mg (ADH:14,5 μmol) foi dissolvido em 8 ml de cossolvente (água: DMSO=1:1). 4. Misturar SOLUÇÃO 1 & 2, e agitar 5 minutos para ativar o grupo carbóxilo no hemi-éster de Prednisolona. 5. Após 5 minutos, a mistura foi adicionada gota a gota (1ml/min) à SOLUÇÃO 3 sob a mixagem por agitação. 6. A solução misturada foi agitada por 24 horas em temperatura ambiente (aproximadamente 30°C). 7. Após 24 horas, a solução foi dialisada por 3 dias com 0,3 M NaCl/água pura alternadamente utilizando a bolsa de diálise de 12000-14000 de MWCO. 8. A solução foi então liofilizada por 2 dias. 9. Finalmente, o grau de distribuição de HA-ADH-Pred foi determinado por 1H-NMR.
[00082] Resultado: A Figura 9 mostra a estrutura de HA-ADH-Prednisolona conjugado. EXEMPLO 10: EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIOS IN VITRO DE HA-ADH- PREDNISOLONA EM CÉLULAS PURAS DE 264,7 1. As células puras de 264,7 (1x106 células/furo, 1000 μL) foram incubadas em uma lâmina de cultura de 24 furos na presença de 5% CO2 a 37°C por 24 horas. 2. O meio foi alterado para DMEM contendo 10% de FBS, e as células foram tratadas com várias concentrações de compostos (86,7 μM de Prednisolona, HA-ADH-Prednisolona (igual a 86,7 μM de Prednisolona), e 70 μg/ml de HA) por 4 horas seguido pelo tratamento de 1 μg/mL de LPS por 24 horas. 3. Os meios da célula foram coletados, e utilizados para medir o PGE2. 4. Placas de 96 alvéolos Nunc-Immuno foram revestidas com anticorpo secundário IgG antirrato policlonal de cabra. 5. As alíquotas do meio da célula foram adicionadas à lâmina imune com anticorpo monoclonal de PGE2 primário e um marcador de PGE2-acetilcolinesterase durante a noite em temperatura ambiente no escuro. 6. No dia seguinte, os furos foram aspirados, lavados com 100 μL do tampão de lavagem por cinco vezes. 7. 200 μL de reagente do Elman foram adicionados em cada furo, e incubados por 60-90 minutos em temperatura ambiente fora de luz direta. 8. O giro/movimentação suave foi utilizado para diminuir o tempo exigido para o desenvolvimento de cor. 9. A absorção foi lida a 412 nm. 10. A concentração de PGE2 de cada amostra foi calculada a partir de uma curva do PGE2 padrão. 11. A quantidade percentual de PGE2 foi como uma função do nível de PGE2 de cada amostra dividido por um dos grupos de controle que foi tratado por LPS, e, então, multiplicou esse valor por 100. 12. A quantidade real de PGE2 foi estimada para ser 1370 ng/ml para o grupo de controle que foi tratado por LPS.
[00083] Resultado: Como mostrado na Figura 13. o grupo de somente medicamento (Prednisolona) tem efeito de tratamento; entretanto, conjugado HA com Prednisolona (HA- pred, “HA-pred” significa “HA-ADH-Prednisolona”), tem um melhor efeito de tratamento do que somente medicamento. EXEMPLO 11: EFEITO DE TRATAMENTO IN VIVO TREATMENT PARA ARTRITE REUMATÓIDE (RA) POR HA-ADH-PREDNISOLONA PROCEDIMENTO 1. 30 de 80 semanas, os ratos Sprague-Dawely machos (BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) foram preparados. Os ratos foram divididos em 4 grupos aleatoriamente (n=9 para grupo de veículo e Prednisolona, n=6 para grupo de HA-ADH-Prednisolona e HA). Cada dois ratos foram colocados em uma gaiola em instalações de animais roedores no Instituto da Tecnologia Animal de Taiwan (Institute of Taiwan Animal Technology). 2. Injetar 0,1 mL de CFA (Adjuvante de Freund Completo, 10 mg/mL, Chondrex Inc.) contendo 10 mg/mL de micobactéria morta por calor de maneira subcutânea na planta do pé dos membros posteriores direito. 3. A agulha deve ser inserida somente sob a pele da planta do pé apontando em direção ao tornozelo: isso maximiza a entrega do adjuvante aos gânglios linfáticos poplíteos de drenagem. 4. Inflamação severa e grave é observada dentro de 30 minutos da injeção, piscos dentro de 3 a 4 dias, e geralmente persiste por 20 a 25 dias.
[00084] Os ratos foram tratados 14 dias após a indução da Artrite Induzida por Adjuvante (AIA) por injeção intravenosa de Prednisolona ou HA-Prednisolona (ambos 10 mg/kg), ou salina como um controle.
[00085] Os ratos foram sacrificados 20 dias após o tratamento e os problemas foram isolados a partir daí.
MEDIÇÕES DE ARTRITE:
[00086] A espessura da pata e a circunferência do tornozelo: A espessura da pata determinada pela medição o diâmetro da pata utilizando um compasso, como o compasso Mitsutoyo Digimatic. A circunferência do tornozelo determinada pela medição de 2 diâmetros perpendiculares, o diâmetro de lateral a lateral (a) e o diâmetro anteroposterior compasso digital e utilizando a seguinte fórmula:
Figure img0001
circunferência =
[00087] Resultado: Como mostrado na Figura 11, RA foi induzido de maneira bem-sucedida. No início da data de administração de medicamento (dia 14), o grupo de somente HA tem quase a mesma tendência comparando ao grupo de controle (veículo) no tipo de índice, como a mudança de espessura da pata. O grupo de somente medicamentos (Prednisolona) mostrou o efeito de tratamento. Entretanto, quando o medicamento conjugado com o HA (grupo HA-ADH-Pred), seu efeito de tratamento foi, ainda, melhor que somente com o medicamento, e tem estatisticamente significância. Também, como mostrado na Figura 12, HA somente melhora o sintoma de RA nesse tipo de índice (mudança na circunferência do tornozelo); entretanto, conjugado o medicamento com HA (grupo HA-ADH-Pred), seu efeito de tratamento foi melhor que somente com medicamento, e tem estatisticamente significância.

Claims (10)

1. Composto consistindo em um conjugado de glicosaminoglicano e um composto ativo caracterizado pelo fato de que o composto ativo é conjugado por meio de um grupo funcional a um grupo carboxílico do glicosaminoglicano ou um sal deste para formar uma conjugação covalente, e em que o composto ativo é fexofenadina, succinato de budesonida ou succinato de prednisolona, o composto ativo é indiretamente conjugado ao grupo carboxilico do glicosaminoglicano através de um ligante e o ligante é dihidrazida adipica.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o glicosaminoglicano é ácido hialurônico.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ácido hialurônico possui um peso molecular médio compreendido na faixa de 5 kDa a 2000 kDa.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de inflamação grave ou crônica.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a inflamação é induzida ou causada por infecção, lesão, doença autoimune ou alergia.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é artrite Reumatoide.
7. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um conjugado de glicosaminoglicano e um composto ativo, conforme definido pela reivindicação 1, em combinação com pelo menos um excipiente e/ou diluente.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição é para tratamento de inflamação.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a inflamação é induzida ou causada por infecção, lesão, doença autoimune ou alergia.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição é elaborada para administração oral ou injetável.
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